WO2001048478A1

WO2001048478A1 - Peptide du type cytokine

Info

Publication number: WO2001048478A1
Application number: PCT/JP2000/009278
Authority: WO
Inventors: Atsushi Sato; Saburo Sone
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 1999-12-27
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2001-07-05
Also published as: KR20020070469A; AU2226701A; CA2395715A1; CN1425135A; EP1245955A1; EP1245955A4; US20030086902A1

Description

サイトカイン様ペプチド技術分野

本発明は、サイトカインに対する中和抗体に結合し、そのサイトカインの生物学的活性を発現しうるペプチドに関するものであり、更に詳しくはウィルス疾患の治療等に用いることができるペプ明チド及びそのスクリーニング方法に関する。

田

背景技術

動物細胞の増殖と分化は、種々の細胞間シグナル伝達分子により制御されている。このシグナル伝達を担う蛋白質性分子には、いわゆる増殖因子、リンホカイン、モノ力イン、インタ一フエロン、ケモカイン、造血因子、神経栄養因子等と呼ばれる蛋白質群が含まれる。

サイトカインとは、これらの蛋白質性シグナル伝達分子の総称である。サイト力インは多様な生理活性を示す。サイトカインの生理活性としては、例えばインターフェロン（IFN)の抗ウィルス活性ゃ抗腫瘍活性、顆粒球コロニー刺激因子 (G - CSF)の顆粒球コロニーの形成、エリスロポエチン（EP0)の赤血球の産生、トロンボポェチン（TP0)の巨核球の増殖等を挙げることができ、その生理活性を利用して、これらのサイト力インの多くは実際の疾患治療に用いられている。これらのサイトカインは高分子の蛋白質であるため、その生産は、サイトカインを産生する細胞を大量に培養したり、サイトカインを産生するように遺伝子組換えを行つた細胞、あるいは微生物を大量に培養することにより行われている。更に、単一分子種のサイト力インを得るためには、細胞の培養上清、あるいは細胞ゃ微生物の破砕液から目的とするサイトカインを精製するという煩雑な操作が必要である。このようにして得られる精製サイトカインは、高分子の蛋白質であるためにその安定性は一般に高くない。したがって、これらの生産、精製工程の煩雑化、あるいは目的物質の安定性の欠如といった問題を克服するためには、サイトカインの生理活性を低分子ペプチドでミミックする方法が有効である。低分子べプチドなら化学合成で調製することができ、安定性も優れている。このような例としては、ファージペプチドライブラリ一法を用いてエリスロポエチン（EP0) (Wrighton, N. C. et al. , Science, 273, 458-463 (1996) )やトロンボポェチン (TPO) (Cwirla, S. E. et al. , Science, 276, 1696-1699 (1997)、 Kimura, T. et al. , J. Biochem. , 122, 1046-1051 (1997) )をミミックする低分子ペプチドに関する報告がある。

しかし、いずれの方法もサイト力インレセプターを標的分子として、ファージぺプチドライブラリ一をスクリ一二ングすることで目的の低分子べプチドを得ており、この場合、サイト力インレセプ夕一の調製が煩雑であるという欠点がある。そこで、レセプ夕一分子を使用しないで、サイトカインをミミックする低分子ペプチドを創製する方法が開発できれば、汎用性が高いと考えられる。発明の開示

本発明の目的は、前記問題点を克服したサイトカイン低分子べプチドミミックの創製方法の提供であり、具体的には、サイ卜力インに対する中和抗体に結合する配列をランダムなアミノ酸配列から選択することによって、サイトカインをミミックする低分子べプチドを創製する方法を提供するものである。

本発明は、以下の発明を包含する。

( 1 )サイ卜力インの生物学的活性を有することが確認されていないべプチドから、サイ卜力インに対して中和活性を有する抗体に結合し、かつそのサイトカインの生物学的活性を発現しうるべプチドを探索することを特徴とするサイ卜力イン様ペプチドのスクリーニング方法。

(2) サイトカインがィンターフェロンである前記（ 1 ) に記載のスクリ一ニング方法。

(3) 前記（1) 又は（2) に記載のスクリーニング方法により取得されるサイトカイン様ぺプチド。

(4) 前記（3) に記載のサイ卜力イン様ペプチドのアミノ酸配列に 1もしくは

2以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含み、かつサイ卜力インの生物学的活性を発現しうるサイ卜カイン搽ぺプチド。

(5)サイトカイン様ぺプチドのアミノ酸配列が配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列であり、サイトカインがィンターフェロンである前記（4) に記載のサイトカイン様ぺプチド。

(6 )サイ卜カイン様ぺプチドのアミノ酸配列が配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列を含み、ィンターフェロンの生物学的活性を発現しうるサイ卜力イン様ペプチド。

(7) 前記（1) 又は（2) に記載のスクリーニング方法により取得されたサイ卜力イン様ペプチドをリード化合物とし、これに、 1もしくは 2以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施し、サイ卜力インの生物学的活性を発現しうるべプチドを得ることを特徴とするサイトカイン様ぺプチドの製造方法。

(8) 前記（3) 〜 (6) のいずれかに記載のサイト力イン様ペプチドを有効成分として含有する医薬。

本発明のぺプチドはサイ卜力インと同様の生物学的活性を有するものであるが、ここでいうサイ卜力インとしては、例えばイン夕一フエロン（ひ、 β、 Ύ等）、増殖因子、リンホカイン、モノ力イン、ケモカイン、造血因子、神経栄養因子、腫瘍壊死因子、リンホトキシンが挙げられる。

本発明において、サイト力インに対して中和活性を有する抗体としては、ポリクローナル抗体を用いることもできるが、モノクローナル抗体が好ましい。

サイトカインに対するモノクローナル抗体の作製は、 Kohlerと Milsteinによつて開発されたハイプリドーマを用いる方法が一般的である（Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975))。抗体産生ハイプリドーマは、自立増殖能がない抗体産生細胞（脾臓及びリンパ節の Bリンパ球）と無限に増殖するミエローマ細胞を in vitroで細胞融合させることにより作製される。その後、適当なアツセィ系を用いて、ハイプリドーマ培養上清中の抗体の検出と、細胞のクローニングを繰り返すことにより均一な抗体産生ハイプリドーマが得られる（実験医学別冊、新遺伝子工学ハンドブック、 p.162-165、羊土社）。得られた均一な抗体産生ハイプリドーマは大量培養を行い、培養上清中に分泌されるモノクロ一ナル抗体は IgGの場合、プロテイン Aカラムで容易に精製される。この方法で確立されたモノクローナル抗体が、サイトカインの活性に対して中和能を有しているかはサイトカインによって種々の方法がある力例えばィンターフェロンの場合には、ヒト羊膜細胞である FL細胞とシンドビス（sindbis) ウィルス、あるいは水疱性口内炎（vesicular stomatitis) ウィルス（VSV)を組み合わせたバイオアッセィ法を用いることで判定できる。その方法は、例えば Kawade らが報告している（Kawade. Y. and Watanabe, Y, J.， IFN Res. 4, 571-584 (1984)に

本発明のぺプチドを得るための方法としては、例えば以下に述べるぺプチドライブラリー法が挙げられる。更に、ペプチドライブラリ一法は、バクテリオファージを用いる方法と、化学合成でライブラリーを作製する方法に分けられる。ファージランダムべプチドライブラリーを構築する方法は、例えば M13系ファ —ジのコートプロテイン（例えば genelll蛋白や IIIV蛋白）の遺伝子にランダムな配列を有する合成遺伝子を連結し、作製すればよい。その方法としては、 Science, 249- 386 (1990), Pro Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378 (1990)等に記載された方法を用いることができる。挿入する遺伝子の大きさは、発現されるべプチドが安定であれば特に制限はないが、作製したライブラリ一がより多くのランダムな配列を網羅し、更に標的分子に結合能を有するためには 6 から 15 アミノ酸が好ましい。目的のモノクローナル抗体に結合するファージを選択するためには、カラムやマイクロ夕イタ一プレート上に精製したモノクローナル抗体を直接あるいは抗 IgG抗体等を介して固定化し、前記ライブラリーを接触させる。その後、非結合ファージは洗浄操作で洗い流す。洗浄後、結合しているファージを酸で溶出し、中和した後、大腸菌に感染させ増幅させる。この操作（パニング）を 3回か 4回繰り返すと、モノクローナル抗体に親和性のあるファージが濃縮される。ここで単一なクローンを得るためには、再度大腸菌にファージを感染させ、抗生物質を含んだ寒天培地上でシングルコロニーを形成させる。個々のコロニーを液体培地で培養した後、上清中のファージをポリエチレングリコール等で沈殿濃縮し、その塩基配列を決定すれば、ペプチドの構造を知ることができる。

ランダムなァミノ酸配列を有するペプチドライブラリ一は、前記のファージを用いる方法のほか、化学合成で作製することも可能である。その方法としては、ビーズを用いる方法（Nature, 354. 82 (1991))、液相フォーカシング法（Nature, 354, 84 (1991))、マイクロプレー卜法（Sc ience, 251, 767 (1991))等が挙げられる。

ライブラリーより得られた配列を有するぺプチドを大量に調製するためには、人工的にぺプチドを合成する方法や、遺伝子組換え技術を利用して大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等で発現させる方法が挙げられる。

人工的にぺプチドを合成する方法は、一般的なぺプチド合成法により容易に行うことができ、例えば固相合成法で行うことが簡便であり、目的の配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である（細胞工学別冊、抗ペプチド抗体実験プロトコール、 p.26-p.46、秀潤社）。また、非天然型ァミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシスティン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。

遺伝子組換え技術を利用する場合、得られたアミノ酸配列から、 codon usage に従って DNA配列を設定し（Molecular Cloning, Appendix D1参照，マニアティスら； Cold Spring Habor Laboratory社、 1989)、宿主の細胞に導入することは、技術的に確立されている。更に、塩基配列に変異を導入することで、アミノ酸を他の残基に変換することも可能である。例えば大腸菌で発現させる場合は、得られた DNA 配列をプロモーター配列、例えばトリブトファン合成酵素オペロン (Trp)、ラク卜ースオペロン（lac)プロモーターに結合し、リボゾーム結合配列、例えばシャインダルガルノ（SD)配列や転写終結因子認識部位を付加することが望ましい。作製した発現ベクターを大腸菌に導入する方法等は Molecular Cloning (マニアテイスら； Cold Spring Habor Laboratory 社、 1989)記載の方法が使用できる。発現産物を精製する方法は、例えば各種クロマトグラフィーを用いることができる。

得られたペプチドがサイト力インの生理活性を有するかどうかを調べる方法は、サイト力インによって異なるが、例えば、インターフェロンの場合には抗ゥィルス活性を測定することで判定することができる。具体的には、ヒ卜羊膜細胞である FL 細胞とシンドビス（sindbis) ウィルス、あるいは水疱性口内炎 (vesicular stomatitis)ウィルス（VSV)を組み合わせたバイオアツセィ法を用い

0 ることで判定する（Arms t rong, J. A. , Me t hods i n Enzymo l ogy, 78, 38 1-387 ( 198 1) )

本発明のスクリーニング方法に従ってサイトカイン様活性が確認されたぺプチドは、該ペプチドをリード化合物とし、これに、 1もしくは 2以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施し、サイト力インの生物学的活性を発現しうるペプチドを得ることにより、類縁のサイトカイン様ぺプチドを製造することができる。このペプチドがサイトカインの生理活性を有するかどうかは前記の方法と同様にして調べることができる。

本発明は、また、前記スクリーニング方法により取得されるサイト力イン様べプチド、及び該ぺプチドを有効成分として含有する医薬を提供する。ここで、「前記スクリーニング方法により取得される」とは、前記スクリーニング方法により実際にサイ卜カイン様活性が確認されたペプチドをいう。

本発明のペプチドのアミノ酸残基数は、通常 6〜4 0、好ましくは 6〜 1 5である。

本発明のペプチドとしては、例えば、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列に 1もしくは 2以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含み、かつィンターフェロンの生物学的活性を発現しうるべプチドが挙げられる。該ぺプチドは、抗ウィルス活性、抗腫瘍活性又は免疫調節活性を有する。

本発明のサイトカイン様ペプチドは、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体、賦形剤等と混合した医薬組成物として経口又は非経口的に投与することができる。

経口投与のための剤形としては、具体的には錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。かかる剤形は、自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体もしくは賦形剤を含有するものである。例えば錠剤用の担体、賦形剤としては、ラク卜一ス、マルトース、ショ糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。

非経口投与のための剤形としては、例えば、点眼剤、軟膏剤、注射剤、湿布剤、坐薬、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤、局所徐放剤等が挙げられる。溶液製剤は自体公知の方法、例えば、サイトカイン様ペプチドを通常、注射剤に用いられる無菌の水溶液に溶解、更には乳化して、リボソームに包埋させた状態で調製されうる。固体製剤は、自体公知の方法、例えば、サイト力イン様ペプチドにマンニトール、卜レハロース、ソルビトール、ラク卜ース、グルコース等を賦形剤として加え、そのまま凍結乾燥することにより調製されうる。更にこれを粉体化して用いることもできる。また、これら粉体をポリ乳酸ゃグリコール酸等と混合し固体化して用いることもできる。ゲル化剤は、自体公知の方法、例えば、サィトカイン様ぺプチドをグリセリン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等の増粘剤や多糖に溶解した状態で調製されうる。

いずれの製剤においても、安定化剤としてヒト血清アルブミン、ヒ卜免疫グロブリン、 Q! ₂マクログロブリン、アミノ酸等を添加することができ、また分散剤あるいは吸収促進剤としてサイトカイン様ぺプチドの生理活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコール、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等を添加することができる。また、微量金属や有機酸塩も必要に応じて加えることができる。

本発明のサイト力イン様ペプチドは、前述した剤形に製剤化され、種々の疾患の治療に用いることができる。ィンターフェロンの生物学的活性を発現しうるべプチドの場合には、例えば、 B型慢性活動性肝炎、 C型慢性肝炎及びその他ウイルス性疾患、膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、皮膚悪性黒色腫等種々の悪性新生物、多発性硬化症等の自己免疫疾患等の治療に用いることができる。更に、血管新生を伴う疾患、例えば、リウマチ性関節炎、乾癬等の炎症性疾患、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障、 S t evens- Johnson症候群及びその類縁疾患、眼類天疱瘡及びその類縁疾患、角膜腐蝕あるいはトラコーマ等等の眼疾患及び癌 (乳癌、前立腺癌、悪性黒色腫、腎癌、脳腫瘍、力ポジ肉腫等）の治療に用いることができる。

本発明の医薬において、有効成分であるペプチドとしての投与量は、当該ぺプチドの活性、患者の年令、体重、疾患の種類又は程度により異なるが、一般には、経口投与では、通常 1 日 0 . 0 0 1〜 1 0 0 O mg/kg体重であり、静脈内、筋肉内又は皮下投与では、通常 1 日 0. 00 1〜 1 00 Omg/kg体重である。投与回数は、通常経口投与では〖日 1〜 3回、注射剤では 1日 1〜 2回である

ペプチドの 2次構造形成は、円偏光二色性（Circular dichroism. CD)を測定することにより知ることができる。一般に低分子のペプチド（長さが 15 アミノ酸残基前後）は、特定の 2次構造をとらない不規則構造を示すことが多い。仮にべプチドが 2次構造を形成する場合には、 NMRを用いることによって溶液中の構造を解析することが可能である。更に、ペプチドの構造を参考にして、化学合成により安定な低分子化合物をデザィンすることも可能である。図面の簡単な説明

図 1は、スクリーニングで得られたファージの反応性を ELISA法で調べた結果を示す。図中横軸はファージのクロ一ン名（ファージ 6は配列表の配列番号 1で示した配列を有するクローン、 iuse2はランダムな配列を持たないコントロールファージ）、縦軸は 450 nmの吸光度を示している。

図 2は、得られたファージクローンのアミノ酸配列を示す。アミノ酸残基は 1 文字表記で示した。

図 3は、合成ペプチドの抗ウィルス活性測定結果を示す。図 2の配列に従って合成したペプチドは、ファージ 1、 2、 6の配列に対応してペプチド SYR1、 2、 6と命名した。 SYR6 は逆相 HPLCで精製する際 2つのピークが検出されたので、各ピークのペプチドを SYR6A、 6B と分けて測定した。 SYR6 に活性が認められ、 SYR6A と 6B に活性の違いは認められなかった。コントロールとして、インタ一フエロン /3の結果も示した。

図 4は、合成ペプチド SYR6の抗ウィルス活性測定結果を示す。ヒ卜羊膜細胞である FL細胞と水疱性口内炎（vesicular stomatitis) ウィルス（VSV)を用いたバイオアツセィ法で調べた。コントロールとして、インターフェロン 3の結果も示した。

図 5は、合成ペプチド SYR6の各種イン夕一フエロン中和抗体存在下での抗ゥィルス活性測定の結果を示す。コントロールとして、インターフェロン /3の結果も示した。図 6は、ペプチド SYR6の CDスペクトルを示す。 213 nm あたりに負の極大が観察され、ぺプチド SYR6は主に 3—シー卜構造からなっていると考えられる。図 7は、ァラニン残基で置換した SYR6ペプチドの抗ウィルス活性を上段に、ァミノ酸配列を下段に示す。

図 8は、可溶性インターフェロンレセプターを用いた Solid- phase ligand binding assayの結果を示す。インターフェロン 3と可溶性ィンターフェロンレセプ夕一との結合が濃度依存的に観察された。

図 9は、 Co即 etitive binding assayを用いたペプチド SYR1、 2、 6の可溶性ィンターフェロンレセプ夕一への結合解析の結果を示す。 SYR1、 2は lOOwMを加えても結合阻害を示さなかったが、 SYR6は 25 iMから IOO Mにかけて濃度依存的に結合を阻害した。本明細書は、本願の優先権の基礎である特願平 1 1一 36 9 9 9 0号の明細書に記載された内容を包含する。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。

実施例 1 ヒトインタ一フエロン /3中和抗体である YSB- 2の調製

ヒトインターフェロン 3に対して、中和活性を有するモノクローナル抗体である YSB-2 (Sugi, M. et al. , Hybridoma, 6, 313-320 (1987) )を産生するハイブリドーマを無血清培地（ハイプリドーマ SFM， Gibco BRL社製）で培養した。約 1週間培養した後、遠心分離により細胞を沈殿させ、抗体を含む培地上清を得た。培地上清は 0.45^Mのフィルターにかけて細胞のデブリを除いた後、プロティン Αカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いて精製した。得られた精製画分は、 PBS (-)に透析してバッファー交換を行った。

実施例 2 モノクローナル抗体 YSB- 2に結合するファージの選択

15 アミノ酸残基のランダムな配列を有するファージライブラリ一は Biochemistry, 35, 10441 (1996)記載の方法を用いて作製した。モノクローナル抗体 YSB-2を 96穴マイクロプレー卜（ヌンク社製）のゥエルに固相化するため、まずモノクローナル抗体を PBS (-)で希釈し、 1ゥエルあたり 2 g分の抗体を加えて、 4 °Cでー晚反応させた。抗体が固相化されたプレー卜を、緩衝液（1 % ゥシ血清アルブミンと 0. 05% Tween20 を含む PBS (-) ) を用いて室温で 1時間プロッキングした。ブロッキング後、緩衝液（1 % ゥシ血清アルブミンと 0. 05% Tween20を含む PBS (- ) ) 100 x 1 にファ一ジライブラリーを約 10¹²バイロン加え、室温で 1時間反応させた。洗浄液（0. 05% Tween20を含む PBS ( -) )で 10回洗浄して非結合ファージを除去した。グリシン緩衝液（PH2. 2)で結合ファージを溶出し、直ちに 1M Tr i s- HC 1 (pH9. 5)で中和した。溶出ファージは直ちに大腸菌 K 9 lkan に感染させ、テトラサイクリンを含む LB培地で一晩培養し、ファージを増幅した。培地上清中に出てくるファージをポリエチレングリコールで沈殿濃縮後、このファージを 2回目のバニングに用いた。この操作を全部で 3回行い、 YSB- 2に結合するファージを選択した。

実施例 3 ELISAによる YSB- 2結合ファージの選択

実施例 2で選択したファージをもう一度大腸菌 K91kan に感染させ、テトラサイクリンを含む LB 寒天培地上でシングルコロニーを形成させた。各コロニーはテトラサイクリンを含む LB 培地で一晩培養し、翌日、上清中に出てくるファージをポリエチレングリコールで沈殿精製した。この得られたファージ液を、予め YSB-2 が固相化された 96 穴マイクロプレート（実施例 2 ) の各ゥエルに約 10^ID バイロン加え、室温で 1時間反応させた。洗浄液（0. 05% Tween20を含む PBS (-) ) で 4回洗浄した後、 5000倍希釈した西洋わさびペルォキシダーゼ標識抗 M13 ファ一ジ抗体（アマシャムフアルマシアバイオテク社）を加えて、室温で 3 0分反応させた。 4回洗浄後、基質である 3, 3'， 5, 5' -テ卜ラメチルベンジジンを加え、室温で 5分間発色させた。 1M 硫酸で反応を停止後、マイクロプレートリーダーで 450nmの吸光度を測定した。その結果を図 1に示す。異なる配列を有する 3種類のファージについて、 ELISAの結果を示した。各ファージは YSB- 2のみに結合し、インターフェロン 3に対する別の中和抗体 YSB- 1 (Sugi, M. e t a l. , Hybr idoma, 6, 313-320 (1987) )、BSAでブロッキングのみ行ったゥエルには結合しなかった。更に、ファージと YSB-2 との結合は、 40 nMのインタ一フエロン 3 (フエロン、東レ社製）を加えることによって消失したことから、各ファージは YSB-2の抗原結合部位を認識していると考えられる。

実施例 4 塩基配列の決定

実施例 3で YSB-2 と結合したファージクローンについて塩基配列を決定した。各ファージをフエノール、クロ口ホルム処理して除蛋白した後、エタノール沈殿で DNAを精製し、塩基配列決定の錶型とした。ベクターである Fuse5ベクターの配列を基にしてプライマーを設定し、サイクルシークェンス法で決定した。その結果、 3種類の配列を確認した。塩基配列から推定されるアミノ酸配列を図 2に示す。

実施例 5 ペプチドの合成

塩基配列から推定されるアミノ酸配列（図 2参照）を基にして、ペプチド自動合成装置（東レリサーチセン夕一社製）で 15 アミノ酸からなる 3種類のぺプチドを合成した。合成したペプチドはファージ 1、 2、 6の配列に対応して、 SYR1、 2、 6と命名した。

実施例 6 ペプチドの抗ウィルス活性の検討（FL細胞とシンドビス（sindbis) ウィルスを用いたバイオアツセィ法）

得られた合成ペプチドの抗ウィルス活性を、ヒ卜羊膜細胞である FL細胞とシンドビス（sindbis) ウィルスを用いたバイオアツセィ法で調べた（Anns trong, J. A.， Methods in Enzymology, 78, 381-387 (1981))。 96 穴マイクロタイ夕ープレート（岩城硝子社製）のゥエルに、 FL細胞を 3.5xl0⁵細胞うえて 24時間培養した。その後、各ペプチドを図 3に示した濃度（0.9AtMから 120^M)で加えて 24 時間培養した。コントロールとしては、インターフェロン /3 (フエロン、東レ社製）を 0.2U/mlから 25U/ml加えて 24時間培養した。その後、シンドビス（sindbis) ウィルスを各ゥエルに加えて 15時間培養した。培養液を捨てて、プレートはホルマリンを含むクリスタルバイオレット液に 15分ほど浸し、生存している細胞を固定染色した。その結果、ペプチド SYR1、 2 は、 120 iM まで加えても抗ウイルス活性は得られなかったが、 SYR6 はの濃度から抗ウィルス活性を示した（図 3)。

実施例 7 ペプチド SYR6 の抗ウィルス活性の検討（FL 細胞と水疱性口内炎 (vesicular stomatitis) ウィルス（VSV)を用いたバイオアツセィ法）実施例 6で得られたぺプチド SYR6の抗ウィルス活性が、 FL細胞とシンドビス (sindbis) ウィルスの結合吸着を阻害することにより得られている可能性を否定するために、ウィルスを水疱性口内炎（vesicular stomatUis) ウィルス（VSV) に変えてバイオアツセィを行った。方法は実施例 6記載の方法に従った。その結果を図 4に示す。 VSVを用いた場合にもシンドビス（sindbis) ウィルスを用いた場合と同様に、ペプチド SYR6は 30^Mの濃度から抗ウィルス活性を示した。

実施例 8 ペプチド SYR6 の抗ウィルス活性の検討（インターフェロン中和抗体存在下での抗ウィルス活性の検討）

ペプチド SYR6 の抗ウィルス活性が、内因性のイン夕一フエロン産生を誘導することによって得られている可能性を否定するために、各種ィンターフェロン中和抗体存在下での抗ウィルス活性を検討した。 96 穴マイクロタイ夕一プレート (岩城硝子社製）のゥエルに、 FL細胞を 3.5xl0⁵細胞うえて 24時間培養した。その後、ペプチド SYR6を図 5に示した濃度（0.9 Mから 120wM)で加えて 24時間培養した。この時、インターフェロン αに対する中和抗体 MIF-i (Hayashibara biochemical laboratories, Inc.製、カタログ No. MIF— 1)を 1.2 g/ゥェリレ、イン夕一フエロン j3に対する中和抗体 YSB - 1 (Sugi, M. et al. , Hybridoma, 6, 313-320 (1987))を 15.8 g/ゥエル、インターフェロンァに対する中和抗体（GenzymeR&D systems 社製、カタログ No.1598- 00)を 1 g/ゥエル加えて培養した。その後、シンドビス（sindbis) ウィルスを各ゥエルに加えて 15 時間培養した。この時も前記と同じ条件で各種中和抗体を加え培養した。培養液を捨てて、プレートはホルマリンを含むクリスタルバイオレット液に 15分ほど浸し、生存している細胞を固定染色した。その結果を図 5に示す。ペプチド SYR6 の抗ウィルス活性は、各種ィンターフェロン中和抗体存在下でも全く影響を受けなかった。したがって、ペプチド SYR6 の抗ウィルス活性が、内因性のインターフェロン産生を誘導することによって得られているという可能性は否定された。

実施例 9 ぺプチド SYR6の 2次構造

抗ウィルス活性を有していることが明らかとなったペプチド SYR6 の 2次構造解析を行うために、円偏光二色性（Circular cUchroism, CD)測定を行った。ぺプチド SYR6は、 PBS (-)に 0.25 mg/miの濃度で溶解した。 CDスぺクトラは、室温（約 24°C)で Jasco J-500Aを用いて測定した。ペプチド SYR6の平均残基分子量は、アミノ酸配列から算出した 117.47 を用いた。結果を図 6に示す。測定の結果、ぺプチド SYR6 の CDスべク卜ラは、典型的な β 一シー卜構造を示した。 Chen らの方法（Chen, Y. H. , et al. , Biochemistry, U, 4120-4131 (1972))に従って 2次構造解析を行ったところ、 2次構造の含量は]3—シート構造 49% 、ひヘリックス構造 18%であった。

実施例 10 ァラニン残基で置換した SYR6ぺプチドの抗ウイルス活性測定ペプチド SYR6の抗ウィルス活性発現に、重要な働きをするアミノ酸残基を同定するために、 SYR6のァラニン以外のすべてのアミノ酸残基のそれぞれをァラニンに置換した変異ペプチドを化学合成で 12種類作製した（N末端側から順に、ァラニンに変換したアミノ酸残基の番号と対応させて、ぺプチドを N1から N15と命名した。第 4 、 8、 9 残基はァラニンなので、これらペプチドを除く 12種類を作製した）。配列は図 7の下段に示した。これらペプチドの抗ウィルス活性を、実施例 6で示したヒト羊膜細胞である FL細胞とシンドビス（sindbis) ウィルスを用いたノイオアッセィ法で調べた（Armstrong, J. A., Methods in Enzymology, 78, 381-387 (1981))。 96穴マイクロタイ夕一プレート（岩城硝子社製）のゥエルに、 FL細胞を 3.5xl0⁵細胞うえて 24時間培養した。その後、各べプチドを濃度 0.9 M から 120μΜで加えて 24時間培養した。コントロールとしては、インターフエ口ン β (フエロン、東レ社製）を 0.2U/mlから 25U/ml加えて 24時間培養した。その後、シンドビスウィルスを各ゥエルに加えて 15時間培養した。培養液を捨てて、プレートはホルマリンを含むクリスタルバイオレツト液に 15分ほど浸し、生存している細胞を固定染色した。その結果、 N2、 N6、 NIK N12は、 SYR6と同程度の抗ウィルス活性を示したが、 Nl、 N5、 N10、 N14の活性はほぼ消失した。更に、 N3、 N7、 N13、 N15の活性は、 SYR6と比較すると低下した。ァラニンへの置換により活性の低下や消失を示したアミノ酸残基は、ペプチド SYR6の抗ウィルス活性発現に重要な働きをしていると考えられる。

実施例 11 可溶性インターフェロンレセプターを用いた Solid- phase ligand binding assayの構築 2 x 10^B個のヒト FL細胞より、 isogen (二ツボンジーン社製）を用いて Total RNA を抽出した。 1 X gの Total RNA と、以下のプライマーを用いた P C R法で、ィンターフェロンレセプ夕一 AR 1、 AR 2鎖の細胞外領域の遺伝子を単離した。 AR1センス 5 - ggg gaa ttc gta act ggt ggg ate tgc ggc-3

AR1アンチセンス 5' - ccc gga tec t ta gag gta ttt cct ggt tt-3'

AR2センス 5， -ggg gaa ttc gag aag act cta aaa ata gc-3'

AR2アンチセンス 5' -ccc gga tec t tg gca gat tct get gat tc-3'

AR1はアミノ酸残基 1から 436番目 (Uze, G. et al. , Cell, 60. 225-234 (1990)) , AR2はアミノ酸残基 1から 243番目（Domanski, P. et al. , J. Biol. Chem. , 270, 21606-21611 (1995))までの細胞外領域をコードするようにデザィンされている。得られた PCR 断片は、ヒト IgGlFc 領域との融合蛋白を発現するためのベクター HulgGl/SRひの EcoRI、 BamHI サイ卜に連結した。構築した発現べクタ一は DEAE-Dextran法を用いて COS- 1細胞に co- transfect ionして、一過性に蛋白発現を行った。培養液中に産生される可溶性インターフェロンレセプ夕一は、 Protein A Sepharose CL- 4Bカラム（Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いて精製した。 96穴マイクロプレート（Maxisorp, ヌンク社製）に、精製した可溶性インターフェロンレセプ夕一を l g/ml、 100 1/wellで 4で、ー晚反応させ固相化した。 1 % BSAと 0.05%Tween 20を含む PBS (-) でブロッキングした後、ヒトイン夕一フエロン /3 (フエロン）を 25pMから InMとなるように加えて、室温で振とう 2時間反応させた。 0.05%Tween 20を含む PBS (-) で 4回洗浄した後、西洋わさびペルォキシダ一ゼ標識の抗 IFN— /3抗体 YSB- 1 (Yamazaki, S. et al. , J. Immunoassay, 10, 57-73 (1989))を 50 1 加えて、室温で 1 時間反応させた。 0.05%Tween 20 を含む PBS (-) で 4回洗浄した後、 TMB基質（DAK0社製）を 100 1/wel 1加えて室温で 2分反応させて発色を行い、 450nDiの吸光度を測定した。この系において、ヒ卜イン夕一フエロン) 3と可溶性ィン夕一フエロンレセプ夕一との結合が濃度依存的に観察された（図 8)。ヒトインターフェロン ;3は、コントロールであるヒト IgGl には結合せず、更に、この系にヒ卜イン夕一フエロン ]3を加えない場合にはシグナルは検出されなかった。また、 0.5nMのヒ卜インターフェロン 3を加えた場合に得られるシグナルは、 27nMの可溶性ィンターフェロンレセプ夕一を加えることにより完全に消失した。以上より、本 Solid- phase ligand binding assay は、特異的なリガンドーレセプ夕一結合の検出系であることを確認した。この系では、 25pMのヒトインターフェロン 3 (22pg、約 4.4U) が検出可能であった。

実施例 12 Competitive binding assayを用いたペプチド SYR1、 2、 6の可溶性ィンターフェロンレセプ夕一への結合解析

実施例 11で構築した Solid- phase ligand binding assayを用いて、ペプチド SYRK 2、 6がヒトイン夕一フエロン /3と可溶性インタ一フエロンレセプ夕一との結合を阻害することができるかを調べた。その結果、 SYR1、 2は ΙΟΟμΜを加えても結合阻害を示さなかったが、 SYR6は 25^Μから 100 /Μにかけて濃度依存的に結合を阻害した（図 9)。以上の結果は、 SYR6がヒトインターフェロン /3をミミツクしており、ィンターフェロンレセプ夕一を介して抗ウィルス活性を発現していることを示唆している。

実施例 13 分析用超遠心器を用いたぺプチド SYR6の溶液中での分子量解析分析用超遠心器を用いた沈降平衡法で溶液中のペプチド SYR6の分子量を決定した。ペプチド SYR6を、 140 Mの濃度になるように PBS (-)に懸濁させた。この試料を表に示した回転速度で、 4 、約 20時間遠心して、沈降平衡を形成させた。ペプチドの偏比容は、各アミノ酸の偏比容の平均値である 0.72ml/g を使用した。その結果を表に示す。ペプチド SYR6の溶液中での平均分子量は 1562±49.2 と算出され、アミノ酸配列から計算される分子量 1784とほぼ一致した。従って、ぺプチド SYR6は溶液中では単量体（モノマー）として存在し、抗ウィルス活性を発現すると考えられる。

ド SYR6の溶液中での平均分子量

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。産業上の利用の可能性

本発明により、サイト力インをミミックする低分子ペプチド、及びその創製方法が提供される。配列表フリーテキスト

配列番号 1：モノクローナル抗体 YSB- 2に結合するファージの DNA配列に基づいて合成したぺプチド

Claims

請求の範囲

1 . サイトカインの生物学的活性を有することが確認されていないべプチドから. サイトカインに対して中和活性を有する抗体に結合し、かつそのサイ卜力インの生物学的活性を発現しうるべプチドを探索することを特徴とするサイトカイン様ぺプチドのスクリーニング方法。

2 . サイトカインがィンターフェロンである請求の範囲第 1項記載のスクリ一二ング方法。

3 . 請求の範囲第 1項記載のスクリーニング方法により取得されるサイトカイン様ペプチド。

4 . 請求の範囲第 3項記載のサイトカイン様ぺプチドのアミノ酸配列に 1もしくは 2以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含み、かつサイトカインの生物学的活性を発現しうるサイトカイン様ペプチド。

5 .サイトカイン様ペプチドのアミノ酸配列が配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列であり、サイトカインがィンターフェロンである請求の範囲第 4項記載のサイトカイン様ペプチド。

6 . サイトカイン様ペプチドのアミノ酸配列が配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含み、ィンターフェロンの生物学的活性を発現しうるサイ卜力イン様ペプチド。

7 .請求の範囲第 1項記載のスクリーニング方法により取得されたサイトカイン様ペプチドをリード化合物とし、これに、 1もしくは 2以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施し、サイ卜力インの生物学的活性を発現しうるべプチドを得ることを特徴とするサイトカイン様ぺプチドの製造方法。

8 . 請求の範囲第 3項記載のサイトカイン様ペプチドを有効成分として含有する医薬。

9 . 請求の範囲第 4項記載のサイトカイン様ペプチドを有効成分として含有する

1 0.請求の範囲第 6項記載のサイ卜力イン様ペプチドを有効成分として含有する医薬。