KR20020070469A

KR20020070469A - 사이토카인형 펩티드

Info

Publication number: KR20020070469A
Application number: KR1020027008390A
Authority: KR
Inventors: 사토아츠시; 소네사브로
Original assignee: 도레이 가부시끼가이샤
Priority date: 1999-12-27
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2002-09-09
Also published as: AU2226701A; EP1245955A4; CA2395715A1; EP1245955A1; WO2001048478A1; CN1425135A; US20030086902A1

Abstract

본 발명은, 사이토카인의 생물학적 활성을 갖는 것이 확인되지 않은 펩티드 중에서, 사이토카인에 대하여 중화활성을 갖는 항체에 결합하고, 또한 그 사이토카인의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 펩티드를 탐색하는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드의 스크리닝방법, 이 스크리닝방법에 의해 취득되는 사이토카인형 펩티드, 및 이 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약에 관한 것이다.

Description

사이토카인형 펩티드{CYTOKINE-LIKE PEPTIDE}

동물세포의 증식 및 분화는 여러가지의 세포간 신호전달분자에 의해 제어된다. 이 신호전달을 담당하는 단백질성 분자에는, 이른바 증식인자, 림포카인, 모노카인, 인터페론, 케모카인, 조혈인자, 신경영양인자(neurotrophic factor) 등으로 불리는 단백질군이 포함된다.

사이토카인이란, 이들 단백질성 신호전달분자의 총칭이다. 사이토카인은 다양한 생리활성을 나타낸다. 사이토인의 생리활성으로서는, 예컨데 인터페론(IFN)의 항바이러스활성이나 항종양활성, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)의 과립구 콜로니의 형성, 에리트로포이에틴(EPO)의 적혈구의 생산, 트롬보포이에틴(TPO)의 거핵구의 증식 등을 예시할 수 있고, 그 생리활성을 이용하여, 이들 사이토카인의 대부분은 실제의 질환치료에 사용되고 있다. 이들 사이토카인은 고분자의 단백질이기 때문에, 그 생산은, 사이토카인을 생산하는 세포를 대량으로 배양하거나, 사이토카인을 생산하도록 유전자 재결합을 행한 세포 또는 미생물을 대량으로 배양함으로써 행해지고 있다. 또한, 단일 분자종의 사이토카인을 얻기 위해서는, 세포의 배양상청 또는 세포나 미생물의 파쇄액으로부터 목적으로 하는 사이토카인을 정제한다라는 번잡한 조작이 필요하다. 이와 같이 하여 얻어지는 정제 사이토카인은, 고분자의 단백질이기 때문에 그 안정성은 일반적으로 높지 않다. 따라서, 이들 생산 및 정제공정의 번잡화, 또는 목적물질의 안정성의 결실라는 문제를 극복하기 위해서는, 사이토카인의 생리활성을 저분자 펩티드로 모방하는 방법이 유효하다. 저분자 펩티드는 화학합성으로 조제할 수 있고, 안정성도 우수하게 된다. 이와 같은 예로서는, 파아지 펩티드 라이브러리법(phage peptide library technique)을 사용하여 에리트로포이에틴(EPO)(Wrighton, N. C. et al., Science,273, 458-463(1996))이나 트롬보포이에틴(TPO)(Cwirla, S. E. et al., Science,276, 1696-1699(1997); Kimura, T. et al., J. Biochem.,122, 1046-1051(1997))을 모방하는 저분자 펩티드에 관한 보고가 있다.

그러나, 이들 방법 중 어느 하나의 방법도 사이토카인 리셉터(receptor)를 표적분자로서, 파아지 펩티드 라이브러리를 선별함으로써 목적의 저분자 펩티드를 얻게 된다. 이 경우, 사이토카인 리셉터의 조제가 번잡하다는 결점이 있다. 그래서, 리셉터분자를 사용하지 않고, 사이토카인을 모방하는 저분자 펩티드를 창제하는 방법이 개발된다면 범용성이 높을 거라고 여겨진다.

본 발명은 사이토카인에 대한 중화항체에 결합하고, 그 사이토카인의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 펩티드에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 바이러스 질환의 치료 등에 사용할 수 있는 펩티드 및 그 스크리닝방법(screening method)에 관한 것이다.

도 1은, 스크리닝으로 얻어진 파아지의 반응성을 ELISA법으로 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중에서, 가로축은 파아지의 클론명(파아지(6)는 배열표의 배열번호1에 나타낸 배열을 갖는 클론, 퓨즈2는 랜덤한 배열을 유지하지 않는 컨트롤 파아지), 세로축은 450㎚의 흡광도를 나타내고 있다.

도 2는, 얻어진 파아지 클론의 아미노산 배열을 나타낸다. 아미노산 잔기는 1문자표기로 나타내었다.

도 3은, 합성펩티드의 항바이러스활성 측정결과를 나타낸다. 도 2의 배열에 따라서 합성한 펩티드는, 파아지1, 2, 6의 배열에 대응하여 펩티드SYR1, 2, 6로 명칭하였다. SYR6은 역상HPLC로 정제할 때 2개의 피크가 검출되었으므로, 각 피크의 펩티드를 SYR6A, 6B로 나누어 측정하였다. SYR6에 활성이 확인되고, SYR6A와 6B에 활성의 차이는 확인되지 않았다. 컨트롤로서, 인터페론β의 결과도 나타내었다.

도 4는, 합성펩티드SYR6의 항바이러스활성 측정결과를 나타낸다. 사람 양막세포인 FL세포와 수포성구내염 바이러스(VSV)를 사용한 생물검정법으로 조사하였다. 컨트롤로서, 인터페론β의 결과도 나타내었다.

도 5는, 합성펩티드SYR6의 각종 인터페론 중화항체 존재하에서의 항바이러스활성 측정결과를 나타낸다. 컨트롤로서, 인터페론β의 결과도 나타내었다.

도 6은, 펩티드SYR6의 CD스펙트럼을 나타낸다. 213㎚정도에서 음의 극대값이관찰되고, 펩티드SYR6은 주로 β-시트구조로 이루어져 있다고 생각된다.

도 7은, 알라닌 잔기로 치환한 SYR6펩티드의 항바이러스활성을 상단에, 아미노산 배열을 하단에 나타낸다.

도 8은, 가용성 인터페론 리셉터를 사용한 고상 리간드결합 검정(Solid-phase ligand binding assay)의 결과를 나타낸다. 인터페론β와 가용성 인터페론 리셉터의 결합이 농도의존적으로 관찰되었다.

도 9는, 비교결합 검정(Competitive binding assay)을 사용한 펩티드SYR1, 2, 6의 가용성 인터페론 리셉터로의 결합해석의 결과를 나타낸다. SYR1, 2는 100μM을 가하여도 결합저해를 나타내지 않았지만, SYR6은 25μM로부터 100μM에 걸쳐서 농도의존적으로 결합을 저해하였다.

본 발명의 목적은, 상기 문제점을 극복한 사이토카인 저분자 펩티드 모방의창제방법의 제공이고, 구체적으로는, 사이토카인에 대한 중화항체에 결합하는 배열을 랜덤 아미노산 배열로부터 선택함으로써, 사이토카인을 모방하는 저분자 펩티드를 창제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, 이하의 발명을 포함한다.

(1) 사이토카인의 생물학적 활성을 갖는 것이 확인되지 않은 펩티드로부터, 사이토카인에 대해서 중화활성을 갖는 항체에 결합하고, 또한 그 사이토카인의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 펩티드를 탐색하는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드의 스크리닝방법.

(2) 제1항에 있어서, 사이토카인이 인터페론인 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드의 스크리닝방법.

(3) 제1항 또는 제2항에 기재된 스크리닝방법에 의해 취득되는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드.

(4) 제3항에 기재된 사이토카인형 펩티드의 아미노산 배열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가, 또는 수식(修飾)에 의해 얻어지는 아미노산 배열을 포함하고, 또한 사이토카인의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드.

(5) 제4항에 있어서, 사이토카인형 펩티드의 아미노산 배열이 배열표의 배열번호1에 기재된 아미노산 배열이고, 사이토카인이 인터페론인 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드.

(6) 사이토카인형 펩티드의 아미노산 배열이 배열표의 배열번호1에 기재된아미노산 배열을 포함하고, 인터페론의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드.

(7) 제1항 또는 제2항에 기재된 스크리닝방법에 의해 취득된 사이토카인형 펩티드를 리드화합물로 하고, 여기에, 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가, 또는 수식을 실시하여, 사이토카인의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 펩티드를 얻는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드의 제조방법.

(8) 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 사이토카인형 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.

본 발명의 펩티드는 사이토카인과 동일한 생물학적 활성을 갖는다. 여기서 말하는 "사이토카인"으로서는, 예컨데 인터페론(α,β,γ등), 증식인자, 림포카인, 모노카인, 케모카인, 조혈인자, 신경영양인자, 종양괴사인자, 림포톡신이 예시된다.

본 발명에 있어서, 사이토카인에 대해서 중화활성을 갖는 항체로서는, 폴리크로날 항체를 사용할 수 있지만, 모노크로날 항체가 바람직하다.

사이토카인에 대한 모노크로날 항체의 작용은, Kohler과 Milstein에 의해 개발된 하이브리도마를 사용하는 방법이 일반적이다(Kohler and Milstein, Nature,256, 495-497(1975)). 항체생산 하이브리도마는, 자립증식 능력이 없는 항체생산세포(비장 및 림프절의 B 림프구)와 무한하게 증식하는 마이엘로마 세포를in vitro으로 세포융합하는 것에 의해 제작된다. 그후, 적당한 검정계를 사용하여, 하이브리도마가 얻어진다(실험의약 별책, 신유전자공학 핸드북, p.162-165, 요도샤사).얻어진 균일한 항체생산 하이브리도마는 대량 배양을 행하고, 배양 상청 중에 분비되는 모노크로날 항체는 IgG의 경우, 단백질 A 칼럼으로 용이하게 정제된다. 이 방법으로 확립된 모노크로날 항체가, 사이토카인의 활성에 대해서 중화능력을 갖고 있는지는 사이토카인에 따라 여러가지의 방법으로 판정된다. 예컨데 인터페론의 경우에는, 사람 양막세포인 FL세포와 신드비스 바이러스, 또는 수포성구내염 바이러스(VSV:vesicular stomatitis virus)를 조합시킨 생물검정법을 사용할 수 있다. 그 방법은, 예컨데 Kawade et al.(Kawade Y. and Watanabe, Y. J., IFN Res. 4, 571-584(1984))에 기록되어 있다.

본 발명의 펩티드를 얻기 위한 방법으로서는, 예컨데 이하에 기술하는 펩티드 라이브러리법이 예시된다. 또한, 펩티드 라이브러리법은, 박테리오파아지를 사용하는 방법과, 화학합성으로 라이브러리를 제작하는 방법으로 분류된다.

파아지 랜덤 펩티드 라이브러리를 구축하는 방법은, 예컨데 M13계 파아지의 외피단백질(예컨데, 유전자 III 단백질 또는 IIIV 단백질)의 유전자에 랜덤한 배열을 갖는 합성유전자를 연결함으로써 실시할 수 있다. 그 방법으로서는, Science,249, 386(1990) 또는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 6378(1990) 등에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 삽입하는 유전자의 크기는, 발현되는 펩티드가 안정하면 특히 제한은 없지만, 제작한 라이브러리가 보다 다수의 랜덤한 배열을 망라하고, 또한 표적분자에 결합능력을 갖기 위해서는 6∼15 아미노산이 바람직하다. 목적의 모노크로날 항체에 결합하는 파아지를 선택하기 위해서는, 칼럼 또는 마이크로타이터 플레이트 상에 정제한 모노크로날 항체를 직접 또는 IgG항체 등을 통하여 고정화하고, 세정후, 결합하고 있는 파아지를 산으로 용출하고, 중화한 후, 대장균에 감염시켜 증폭시킨다. 이 조작(패닝:panning)을 3회 또는 4회 반복하면, 모노크로날 항체에 친화성을 갖는 파아지가 농축된다. 여기서 단일한 클론을 얻기 위해서는, 재차 대장균에 파아지를 감염시키고, 항생물질을 포함한 한천배지 상에서 단일 콜로니를 형성시킨다. 개개의 콜로니를 액체배지에서 배양한 후, 상청 중의 파아지를 폴리에틸렌글리콜 등으로 침전농축하고, 그 염기배열을 결정하면, 펩티드의 구조를 알 수 있다.

랜덤한 아미노산 배열을 갖는 펩티드 라이브러리는, 상기 파아지를 사용하는 방법 이외에, 화학합성으로 제작하는 것도 가능하다. 그 방법으로서는, 비드(bead)를 사용하는 방법(Nature,354, 82(1991)), 액상 초점맞춤법(Nature,354, 84(1991)), 마이크로플레이트법(Science,251, 767(1991)) 등이 예시된다.

라이브러리로부터 얻어진 배열을 갖는 펩티드를 대량으로 조제하기 위해서는, 인공적으로 펩티드를 합성하는 방법이나, 유전자 재결합 기술을 이용하여 대장균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등으로 발현시키는 방법이 예시된다.

인공적으로 펩티드를 합성하는 방법은, 일반적인 펩티드 합성법에 의해 용이하게 행할 수 있고, 예컨데 고상합성법(Solid-phase synthesis method)으로 행하는 것이 간단하고, 목적의 배열에, 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 실시한 변이체를 제작하는 것도 용이하다(세포공학별책, 항펩티드항체 실험 프로토콜, p.26-p.46, SHUJUNSHA). 또한, 비천연형 아미노산의 도입, 각 아미노산 잔기의 화학수식이나 시스테인 잔기를 도입하는 것에 의해 분자내를 고리화시켜서 제조를 안정화시키는등의 수식을 실시하여도 좋다.

유전자 재결합 기술을 이용하는 경우, 얻어진 아미노산 배열에서, 코돈의 사용방식(codon usage)에 따라서 DNA배열을 설정하고(Molecular Cloning, Appendix D1 참조, Maniatis et al.; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), 숙주의 세포에 도입하는 것은, 기술적으로 확립되어 있다. 또한, 염기배열에 변이를 도입함으로써, 아미노산을 다른 잔기로 변환하는 것도 가능하다. 예컨데 대장균으로 발현시키는 경우는, 얻어진 DNA배열을 프리모터 배열, 예컨데 트립토판 합성효소 오페론(Trp), 락토스 오페론(lac) 프로모터에 결합하고, 리보솜결합 배열, 예컨데 샤인-달가르노(SD) 배열, 또는 전사종결인자의 인식부위를 부가하는 것이 바람직하다. 제작한 발현벡터를 대장균에 도입하는 방법 등은 분자클론화(Molecular Cloning)(Maniatis et al.; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 발현산물을 정제하는 방법은, 예컨데 각종 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

얻어진 펩티드가 사이토카인의 생리활성을 갖는지 여부를 조사하는 방법은, 사이토카인에 따라 다르지만, 예컨데, 인터페론의 경우에는 항바이러스 활성을 측정하는 것으로 판정할 수 있다. 구체적으로는, 사람 양막세포인 FL세포와 신드비스 바이러스, 또는 수포성구내염 바이러스(VSV)를 조합시킨 생물검정법(bioassay method)을 사용하는 것으로 판정한다(Armstrong, J.A., Methods in Enzymology,78, 381-387(1981)).

본 발명의 스크리닝방법에 따라서 사이토카인형 활성이 확인된 펩티드는, 이펩티드를 리드화합물로 하고, 이들에 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가, 또는 수식을 실시하고, 사이토카인의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 펩티드를 얻음으로써, 유연의 사이토카인형 펩티드를 제조할 수 있다. 이 펩티드가 사이토카인의 생리활성을 갖는지 여부는 상기 방법과 동일하게 하여 조사할 수 있다.

본 발명은, 또한, 상기 스크리닝방법에 의해 취득되는 사이토카인형 펩티드, 및 상기 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약을 제공한다. 여기서, 「상기 스크리닝방법에 의해 취득된다」란, 상기 스크리닝방법에 의해 실제로 사이토카인형 활성이 확인된 펩티드를 말한다.

본 발명의 펩티드의 아미노산 잔기는, 통상 6∼40, 바람직하게는 6∼15이다.

본 발명의 펩티드로서는, 예컨데, 배열표의 배열번호1에 기재한 아미노산 배열, 또는 상기 아미노산 배열에 적어도 하나의 아미노산잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가, 또는 수식을 실시하는 것에 의해 아미노산 배열을 포함하고, 또한 인터페론의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 펩티드가 예시된다. 이 펩티드는, 항바이러스활성, 항종양활성 또는 면역조절활성을 갖는다.

본 발명의 사이토카인형 펩티드는, 그대로 또는 종래의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합한 의약조성물로서 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다.

경구투여를 위한 약제형상으로서는, 구체적으로는 정제(錠劑), 필(pill), 캅셀, 과립제, 세립제, 산제(散劑), 시럽제, 유제(乳劑), 현탁제 등이 예시된다. 이러한 약제형상은, 종래의 방법에 의해 제조되고, 제제분야에 있어서 통상 사용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 것이다. 예컨데 정제용의 담체 또는 부형제로서는, 락토스, 말토스, 자당(蔗糖), 전분(澱粉), 스테아린산마그네슘 등이 예시된다.

비경구투여를 위한 약제형상으로서는, 예컨데, 점안제, 연고제, 주사제, 습포제, 좌약, 경비흡수제(transnasal preparation), 경폐흡수제(transpulmonary preparation), 경피흡수제(transdermal preparation), 국소서방제(徐放劑) 등이 예시된다. 용액제제는 종래의 방법, 예컨데, 사이토카인형 펩티드를 통상, 주사제로 사용되는 무균의 수용액에 용해, 또는 유화하여, 리포솜에 캡슐로 싼 상태로 조제될 수 있다. 고체제제는, 종래의 방법, 예컨데, 사이토카인형 펩티드에 만니톨, 트레할로스, 소르비톨, 락토스, 글루코스 등을 부형제로서 첨가하고, 그대로 동결건조하는 것에 의해 조제될 수 있다. 또한 이들을 분체화하여 사용할 수도 있다. 또한 이들 분체를 폴리유산이나 글리콜산 등과 혼합하여 고체화하여 사용할 수도 있다. 겔화제는, 종래의 방법, 예컨데, 사이토카인형 펩티드를 글리세린, 폴리에틸렌글리콜, 메틸셀루로스, 카르복시메틸셀루로스, 히알루론산, 콘드로이틴 황산 등의 증점제나 다당에 용해한 상태로 조제될 수 있다.

이들 중 어느 하나의 제제에 있어서도, 안정화제로서 사람 혈청알부민, 사람 면역글로불린, α₂마크로글로불린, 아미노산 등을 첨가할 수 있고, 또한 분산제 또는 흡수촉진제로서 사이토카인형 펩티드의 생리활성을 손상시키지 않는 범위에서 알코올, 당알코올, 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 등을 첨가할 수 있다.또한, 미량금속이나 유기산염도 필요에 따라서 첨가할 수 있다.

본 발명의 사이토카인형 펩티드는, 상술한 약제형상으로 제제화되고, 여러가지의 질환의 치료에 사용할 수 있다. 인터페론의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 펩티드의 경우에는, 예컨데, B형 만성활동성 간염, C형 만성 간염 및 그외 바이러스성 질환, 교아종, 수아종, 성세포종, 피부악성 흑색종 등 여러가지의 악성 신생물, 다발성 경화증 등의 자기면역 질환 등의 치료에 사용할 수 있다. 또한, 혈관신생을 따르는 질환, 예컨데, 류마티스성 관절염, 건선 등의 염증성 질환, 당뇨병 망막증, 미숙아 망막증, 혈관신생 녹내장, 스티븐 존슨(Stevens-Johnson) 증후군 및 그 유사질환, 안류천구창 및 그 유사질환, 각막부식 또는 트라코마 등의 안질환 및 암(유방암, 전립선암, 악성흑색암, 신장암, 뇌종양, 카포시육종)의 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 의약에 있어서, 유효성분인 펩티드로서의 투여량은, 해당 펩티드의 활성, 환자의 연령, 체중, 질환의 종류 및 정도에 따라 다르지만, 일반적으로는, 경구투여시는, 통상 1일 0.001∼1,000㎎/㎏체중이고, 정맥내, 근육내 또는 피하투여에서는, 통상 1일 0.001∼1,000㎎/㎏체중이다. 투여회수는, 통상 경구투여시에는 1일 1∼3회, 주사제에서는 1일 1∼2회이다.

펩티드의 2차구조형성은, 원편광이색성(CD:Circular dichroism)을 측정함으로써 알 수 있다. 일반적으로 저분자의 펩티드(길이가 15아미노산 잔기 정도)는, 특정 2차구조를 취하지 않는 불규칙구조를 나타내는 것이 많다. 만약 펩티드가 2차구조를 형성하는 경우에는, NMR을 사용함으로써 용액 중의 구조를 해석하는 것이가능하다. 또한, 펩티드의 구조를 참고로 하여, 화학합성에 의해 안정한 저분자화합물을 디자인하는 것도 가능하다.

이하, 실시예를 들면서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예1:사람 인터페론β중화항체인 YSB-2의 조제)

사람 인터페론β에 대해서, 중화활성을 갖는 모노크로날 항체인 YSB-2(Sugi, M. et al., Hybridoma,6, 313-320(1987))를 생산하는 하이브리도마를 무혈청배지(Hybridoma SFM, Gibco BRL)에 배양하였다. 약 1주간 배양한 후, 원심분리에 의해 세포를 침전시키고, 항체를 포함하는 배지상청을 얻었다. 배지상청은 0.45μM의 필터에 걸쳐서 세포의 잔해를 제거한 후, 단백질A 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 정제하였다. 얻어진 정제부분은, PBS(-)에 투석하여 버퍼교환을 행하였다.

(실시예2:모노크로날 항체 YSB-2에 결합하는 파아지의 선택)

15아미노산 잔기의 랜덤한 배열을 갖는 파아지 라이브러리는 Biochemistry,35, 10441(1996)에 기재된 방법을 사용하여 제작하였다. 모노크로날 항체 YSB-2를 96웰 마이크로플레이트(Nunc)의 웰에 고상화하기 위해, 우선 모노크로날 항체를 PBS(-)로 희석하고, 1웰당 2㎍의 항체를 가하고, 4℃에서 하루종일 반응시켰다. 항체가 고상화된 플레이트를, 완충액(1% 소 혈청알부민과 0.05% Tween20을 포함하는 PBS(-))을 사용하여 실온에서 1시간 블로킹하였다. 블로킹 후, 완충액(1% 소 혈청알부민과 0.05% Tween20을 포함하는 PBS(-)) 100㎕로 파아지라이브러리를 약 10¹²비리온 가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정액(0.05% Tween20을 포함하는 PBS(-))으로 10회 세정하여 비결합 파아지를 제거하였다. 글리신 완충액(pH2.2)으로 결합 파아지를 용출하고, 즉각 1M Tris-HCL(pH9.5)으로 중화하였다. 용출 파아지는 즉각 대장균 K91kan에 감염시키고, 테트라사이클린을 포함하는 LB배지에서 하루종일 배양하고, 파아지를 증폭하였다. 배지상청 중에 나오는 파아지를 폴리에틸렌글리콜로 침전농축 후, 이 파아지를 2회째의 패닝에 사용하였다. 이 조작을 전부 2회 행하고, YSB-2에 결합하는 파아지를 선택하였다.

(실시예3:ELISA에 의한 YSB-2결합 파아지의 선택)

실시예2에서 선택한 파아지를 다시 한번 대장균K9kan에 감염시키고, 테트라사이클린을 포함하는 LB한천배지 상에서 단일 콜로니를 형성시켰다. 각 콜로니는테트라사이클린을 포함하는 LB배지에서 하루종일 배양하고, 익일, 상청 중에 나오는 파아지를 폴리에틸렌글리콜로 침전정제하였다. 이 얻어진 파아지액을, 미리 YSB-2가 고상화된 96웰 마이크로플레이트(실시예2)의 각 웰에 약 10¹⁰비리온 가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정액(0.05% Tween20을 포함하는 PBS(-))에서 4회 세정한 후, 500배 희석한 고추냉이의 퍼옥시다아제 표식 항M13 파아지 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 가하고, 실온에서 30분 반응시켰다. 4회 세정 후, 기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 가하고, 실온에서 5분간 발색시켰다. 1M황산으로 반응을 정지 후, 마이크로플레이트리더로 450㎚ 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다. 다른 배열을 갖는 3종류의 파아지에 대해서, ELISA의 결과를 나타내었다. 각 파아지는 YSB-2만으로 결합하고, 인터페론β에 대한 다른 중화항체 YSB-2(Sugi, M. et al., Hybridoma,6, 313-320(1987)), BSA으로 블로킹만 행한 웰에는 결합하지 않았다. 또한, 파아지와 YSB-2의 결합은, 40㎚의 인터페론β(페론, 도레이사 제품)를 가함으로써 소실하고 나서, 각 파아지는 YSB-2의 항원 결합부위를 인식하고 있다고 생각된다.

(실시예4:염기배열의 결정)

실시예3에서 YSB-2와 결합한 파아지클론에 대해서 염기배열을 결정하였다. 각 파아지를 페놀, 클로로포름처리하여 제(除)단백질화한 후, 에탄올침전으로 DNA를 정제하고, 염기배열 결정의 주형(鑄型)으로 하였다. 벡터인 퓨즈5 벡터의 배열을 기초하여 프라이머(primer)를 설정하고, 사이클배열법으로 결정하였다. 그 결과, 3종류의 배열을 확인하였다. 염기배열에서 추정되는 아미노산 배열을 도 2에 나타낸다.

(실시예5:펩티드의 합성)

염기배열에서 추정된 아미노산 배열(도 2 참조)을 기초하여, 펩티드 자동합성장치(도레이 리서치센터사 제품)로 15아미노산으로 이루어지는 3종류의 펩티드를 합성하였다. 합성한 펩티드는 파아지1, 2, 6의 배열에 대응하여, SYR1, 2, 6을 명칭하였다.

(실시예6:펩티드의 항바이러스활성의 검토(FL세포와 신드비스 바이러스를 사용한 생물검정법))

얻어진 합성펩티드의 항바이러스활성을, 사람 양막세포인 FL세포와 신드비스 바이러스를 사용한 생물검정법으로 조사하였다(Armstrong, J. A. Methods in Enzymology,78, 381-387(1981)). 96웰 마이크로타이터플레이트(이와키가라스사 제품)의 웰에, FL세포를 3.5×10⁵세포로 24시간 배양하였다. 그후, 각 펩티드를 도 3에 나타낸 농도(0.9μM∼120μM)로 가해서 24시간 배양하였다. 컨트롤로서, 인터페론β(페론, 도레이사 제품)를 0.2U/㎖∼25U/㎖ 가해서 24시간 배양하였다. 그후, 신드비스 바이러스를 각 웰에 가해서 15시간 배양하였다. 배양액을 버리고, 플레이트는 포르말린을 포함하는 크리스탈바이올렛액에 15분정도 담그고, 살아 있는 세포를 고정 염색하였다. 그결과, 펩티드SYR1, 2는 120μM까지 가해도 항바이러스활성은 얻어지지 않지만, SYR6은 30μM의 농도에서 항바이러스활성을 나타낸다(도 3).

(실시예7:펩티드SYR6의 항바이러스활성의 검토(FL세포와 수포성구내염 바이러스(VSV)를 사용한 생물검정법))

실시예6으로 얻어진 펩티드SYR6의 항바이러스활성이, FL세포와 신드비스 바이러스의 결합흡착을 저해함으로써 얻어지고 있을 가능성을 부정하기 위해, 바이러스를 수포성구내염 바이러스(VSV)로 바꿔서 생물검정을 행하였다. 방법은 실시예6기재의 방법을 따랐다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. VSV를 사용한 경우에도 신드비스 바이러스를 사용한 결과와 동일하게, 펩티드 SYR6은 30㎛의 농도에서 항바이러스활성을 나타내었다.

(실시예8:펩티드SYR6의 항바이러스활성의 검토(인터페론 중화항체 존재하에서의 항바이러스활성의 검토))

펩티드SYR6의 항바이러스활성이, 내인성의 인터페론 생산을 유도함으로써 얻어지고 있을 가능성을 부정하기 위해, 각종 인터페론 중화항체 존재하에서의 항바이러스활성을 검토하였다. 96웰 마이크로타이터플레이트(이와키가라스사 제품)의 웰에, FL세포를 3.5 ×10⁵세포/웰로 24시간 배양하였다. 그후, 펩티드SYR6을 도 5에 나타낸 농도(0.9㎛∼120㎛)로 가해서 24시간 배양하였다. 그때, 인터페론α에 대한 중화항체MIF-1(Hayashibara biochemical laboratories. Inc., 카달로그 No. MIF-1)를 1.2㎍/웰, 인터페론β에 대한 중화항체YSB-1(Sugi, M. et al., Hybridoma,6. 313-320(1987))를 15.8㎍/웰, 인터페론γ에 대한 중화항체(Genzyme R&D systems, 카달로그 No. 1598-00)를 1㎍/웰 가해서 배양하였다. 그후, 신드비스 바이러스를각 웰에 가해서 15시간 배양하였다. 그때도 상기와 동일한 조건으로 각종 중화항체를 가하여 배양하였다. 배양액을 버리고, 플레이트는 포르말린을 포함하는 크리스탈바이올렛액에 15분정도 담그고, 살아 있는 세포를 고정 염색하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 펩티드SYR6의 항바이러스활성은, 각종 인터페론 중화항체 존재하에서도 전혀 영향을 받지 않았다. 따라서, 펩티드SYR6의 항바이러스활성이, 내인성의 인터페론 생산을 유도함으로써 얻어지고 있다는 가능성은 부정되었다.

(실시예9:펩티드SYR6의 2차구조)

항바이러스활성을 가지고 있는 것이 명백하게 된 펩티드SYR6의 2차구조 해석을 행하기 위해, 원편광이색성(CD) 측정을 행하였다. 펩티드SYR6은, PBS(-)에 0.25㎎/㎖의 농도로 용해하였다. CD스펙트럼은, 실온(약 24℃)에서 Jasco J-500A를 사용하여 측정하였다. 펩티드SYR6의 평균잔기 분자량은, 아미노산 배열에서 산출한 117.47을 사용하였다. 결과를 도 6에 나타낸다. 측정결과, 펩티드SYR6의 CD스펙트럼은, 전형적인 β-시트구조를 나타내었다. Chen의 방법(Chen, Y. H. et al., Biochemistry,11, 4120-4131(1972))에 따라서 2차구조 해석을 행하므로, 2차구조의 함량%은 β-시트구조 49%, α나선구조 18%이었다.

(실시예10:알라닌 잔기로 치환한 SYR6펩티드의 항바이러스활성 측정)

펩티드SYR6의 항바이러스활성 발현에, 중요한 작용을 하는 아미노산 잔기를 확인하기 위해, SYR6의 알라닌 이외의 모두의 아미노산 잔기의 각각을 알라닌으로 치환한 변이펩티드를 화학합성으로 12종류 제작하였다(N말단측으로부터 순서로, 알라닌으로 치환한 아미노산 잔기의 번호와 대응시켜서, 펩티드를 N1으로부터 N15로명칭하였다. 제4, 8, 9 잔기는 알라닌이므로, 이들 펩티드를 제외하는 12종류를 제작하였다). 배열은 도7의 하단에 나타내었다. 이들 펩티드의 항바이러스활성을, 실시예6으로 나타낸 사람 양막세포인 FL세포와 신드비스 바이러스를 사용한 생물검정법으로 조사하였다(Armstrong, J. A., Methods in Enzymology,78, 381-387(1981)). 96웰 마이크로타이터플레이트(이와키가라스사 제품)의 웰에, FL세포를 3.5×10⁵세포/웰로 24시간 배양하였다. 그후, 각 펩티드를 농도0.9μM∼120μM로 가해서 24시간 배양하였다. 컨트롤로서, 인터페론β(페론, 도레이사 제품)를 0.2U/㎖ 내지 25U/㎖ 가해서 24시간 배양하였다. 그후, 신드비스 바이러스를 각 웰에 가해서 15시간 배양하였다. 배양액을 버리고, 플레이트는 포르말린을 포함하는 크리스탈바이올렛액에 15분정도 담그고, 살아 있는 세포를 고정 염색하였다. 그결과, N2, N6, N11, N12는, SYR6과 같은 정도의 항바이러스활성을 나타내었지만, N1, N5, N10, N14의 활성은 거의 소실하였다. 알라닌으로의 치환에 의해 활성의 저하나 소실을 나타낸 아미노산 잔기는, 펩티드SYR6의 항바이러스활성 발현에 중요한 작용을 하고 있다고 생각된다.

(실시예11:가용성 인터페론리셉터를 사용한 고상 리간드결합 검정의 구축)

2 ×10⁶개의 FL세포로부터, Isogen(니폰진사 제품)을 사용하여 Total RNA를 추출하였다. 1㎍의 Total RNA와, 이하의 프라이머를 사용한 PCR법으로, 인터페론리셉터AR1, AR2쇄의 세포외영역의 유전자를 단리(單離)하였다.

AR1센스 5'-ggg gaa ttc gta act ggt ggg atc tgc ggc-3'

AR1안티센스 5'-ccc gga tcc tta gag gta ttt cct ggt tt-3'

AR2센스 5'-ggg gaa ttc gag aag act cta aaa ata gc-3'

AR2안티센스 5'-ccc gga tcc ttg gca gat tct gct gat tc-3'

AR1은 아미노산 잔기1∼436(Uze, G. et al., Cell,60, 225-234(1990)), AR2는 아미노산 잔기1∼243(Domanski, P. et al., J. Biol. Chem,270, 21606-21611(1995))까지의 세포외 영역을 코드화하도록 디자인되어 있다. 얻어진 PCR단편은, 사람 IgG1Fc 영역과의 융합 단백을 발현하기 위한 벡터 HuIgC1/SRα의 EcoRI, BamHI사이트에 연결하였다. 구축한 발현 벡터는 DEAE-Dextran법을 사용하여 COS-1세포에 함께 이입하여, 일시적으로 단백발현을 행하였다. 배양액 중에 생산되는 가용성 인터페론리셉터는, Protein A Sepharose CL-4B칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 정제하였다. 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp, Nunc)에, 정제한 가용성 인터페론리셉터(1㎍/㎖)를, 100㎖/웰로 4℃, 하루종일 반응시켜서 고상화하였다. 1%BSA와 0.05%Tween20을 포함하는 PBS(-)로 블로킹한 후, 사람 인터페론β(페론)을 25pM∼1nM으로 되도록 가하고, 실온에서 흔들어 움직임을 2시간 반응시켰다. 0.05% Tween20을 포함하는 PBS(-)로 4회 세정한 후, 고추냉이의 퍼옥시다아제 표식 항IFN-β항체 YSB-1(Yamazaki, S. et al., J. Immunoassay,10, 57-73(1989))를 50㎕가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(-)로 4회 세정한 후, TMB기질(다코사 제품)을 100㎕/웰 가해서 실온에서 2분 반응시켜서 발색을 행하고, 450㎚의 흡광도를 측정하였다. 이 계에 있어서, 사람 인터페론β와 가용성 인터페론리셉터의 결합이 농도의존적으로 관찰되었다(도 8).사람 인터페론β은, 컨트롤인 사람 IgGl에는 결합하지 않고, 또한, 이 계에 사람 인테페론β를 가하지 않은 경우에는 신호는 검출되지 않았다. 또한, 0.5㎚의 사람 인터페론β를 가한 경우에 얻어지는 신호는, 27μM의 가용성 인터페론리셉터를 가하는 것에 의해 완전히 소실하였다. 이상으로, 본 고상 리간드결합 검정은, 특이적인 리간드-리셉터 결합의 검출계인 것을 확인하였다. 이 계에서는, 25pM의 사람 인터페론β(22pg, 약 4.4U)가 검출가능하였다.

(실시예12:비교결합 검정을 사용한 펩티드SYR1, 2, 6의 가용성 인터페론리셉터로의 결합해석)

실시예11에서 구축한 고상 리간드결합 검정을 사용하여, 펩티드 SYR1, 2, 6이 사람 인터페론β와 가용성 인터페론리셉터의 결합을 저해할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 그결과, SYR1, 2는 100μM을 가하여도 결합저해를 나타내지 않았지만, SYR6은 25μM 내지 100μM에 걸쳐서 농도의존적으로 결합을 저해하였다(도 9). 이상의 결과는, SYR6이 사람 인터페론β를 모방하게 되고, 인터페론리셉터를 통하여 항바이러스활성을 발현하고 있는 것을 시사하고 있다.

(실시예13:분석용 초원심기를 사용한 펩티드SYR6의 용액 중에서의 분자량 해석)

분석용 초원심기를 사용한 침전평형법으로 용액 중의 펩티드SYR6의 분자량을 결정하였다. 펩티드SYR6을, 14μM의 농도로 되도록 PBS(-)에 현탁시켰다. 이 시료를 표에 나타낸 회전속도로, 4℃, 약 20시간 원심하고, 침전평형을 형성하였다. 펩티드의 부분비부피는, 각 아미노산의 부분비부피의 평균값인 0.72㎖/g을 사용하였다. 그 결과를 표에 나타낸다. 펩티드SYR6의 용액 중에서의 평균분자량은 1,562 ±49.2로 산출되고, 아미노산 배열에서 계산되는 분자량 1,784와 거의 일치하였다. 따라서, 펩티드SYR6은 용액 중에서는 단량체로서 존재하고, 항바이러스활성을 발현한다고 생각된다.

펩티드	로터 속도(rpm)	분자량	평균분자량
SYR-6	40,000	1,643	1,562 ±49.2
	50,000	1,473
	60,000	1,569

<배열표 프리테스트>

배열번호1:모노크로날 항체YSB-2에 결합하는 파아지의 DNA배열에 기초하여 합성한 펩티드

본 발명에 의해, 사이토카인을 모방하는 저분자 펩티드, 및 그 창제방법이 제공된다.

Claims

사이토카인의 생물학적 활성을 갖는 것이 확인되지 않은 펩티드로부터, 사이토카인에 대하여 중화활성을 갖는 항체에 결합하고, 또한 그 사이토카인의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 펩티드를 탐색하는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드의 스크리닝방법.
제1항에 있어서, 사이토카인이 인터페론인 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드의 스크리닝방법.
제1항에 기재된 스크리닝방법에 의해 취득되는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드.
제3항에 기재된 사이토카인형 펩티드의 아미노산 배열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가, 또는 수식(修飾)을 실시하는 것에 의해 얻어지는 아미노산 배열을 포함하고, 또한 사이토카인의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드.
제4항에 있어서, 사이토카인형 펩티드의 아미노산 배열이 배열표의 배열번호1에 나타낸 아미노산 배열이고, 사이토카인이 인터페론인 것을 특징으로하는 사이토카인형 펩티드.
사이토카인형 펩티드의 아미노산 배열이 배열표의 배열번호1에 나타낸 아미노산 배열을 포함하고, 인터페론의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드.
제1항에 기재된 스크리닝방법에 의해 취득된 사이토카인형 펩티드를 리드화합물로 하고, 여기에, 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가, 또는 수식을 실시하여, 사이토카인의 생물학적 활성을 발현할 수 있는 펩티드를 얻는 것을 특징으로 하는 사이토카인형 펩티드의 제조방법.
제3항에 기재된 사이토카인형 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.
제4항에 기재된 사이토카인형 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.
제6항에 기재된 사이토카인형 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.