JP2674643B2 - モノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はＴ細胞増殖分化因子（T cell−replacing fa
ctor以下、TRFと称す）に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体に関するものである。本発明のモノクローナル
抗体はTRF（IL−５と命名された）の測定に有用であ
る。また、精製に用いる免疫吸着剤として有用である。
免疫吸着剤の具体的な用途として、体液中のTRFの定量
測定及びTRFの精製が挙げられる。体液中のTRF測定はTR
F過剰分泌による自己免疫疾患及びTRF分泌不良による免
疫不全の診断に不可欠なものである。本発明のモノクロ
ーナル抗体により精製したTRFはTRF分泌不良による免疫
不全の治療及び患者自身の体内に抗TRF抗体が産出され
ることにより誘発される自己免疫疾患の治療薬等に適用
される。 さらには、本発明のモノクローナル抗体及び精製した
TRFを用いることにより未だ解決されていない免疫機構
のネットワークを解明することができるであろう。 〔従来の技術〕 未熟Ｂ細胞は抗IgM抗体で抗原レセプター同士が架橋
され活性化される。活性化されたＢ細胞表面のレセプタ
ーにTRFが結合して、Ｂ細胞の増殖や免疫グロブリン分
泌細胞への分化を促進する。 （Howard,M.,Nakanishi,K.＆paul,W.E.Immunol.Rev.78,
185−210（1984）． Kishimoto,T.Ann.Rev.Immunol.,３,133−157（1985） Dutton,R.W.,Folkoff,R.,Hirst,J.A.et al.Prog.Immuno
l.,１,355−368（1971）Swain,L.L.,Howard,M.,Kapple
r.J.W.,et al.J.Exp.Med.,158,822−835（1983）参照）
TRFはＴ細胞が分泌する因子であり、抗体を産生する成
熟したＢ細胞の分化をも促進する。 （Schimp.1, A.and E.Wecker. Nature,237,NB,15−17
（1972） Takatsu,K.,Tominaga,A.＆ Hamaoka,T.J.Immunol.,124,
2414−2422（1980） Takatsu,K.,Tanaka,K.,Tominaga,A.et al.J.Immunol.,1
25,2646−2653（1980）Nakanishi,K.et al.,J.Immuno
l.,130,2219−2224（1983）参照） ネズミのＴ細胞融合細胞B151K12（Takatsu,K.et al.,
J.Immunol.,125,2646−2653（1980）参照）から分泌さ
れるネズミTRFは以下の２つの特徴を持つ。 （１）BCL1白血病Ｂ細胞株（テキサス大学より入手）に
よるIgM分泌の誘導及びジニトロフェニル（DNP）−卵白
アルブミン（OA）複合物で一次刺激されたＢ細胞による
in vitroでのIgGクラスの抗DNP抗体産生応答の誘導。 （Takatsu,K.,Tanaka,K.,Tominaga,A.et al.J.Immuno
l.,125,2646−2653（1980）Takatsu,K.,Harada,N.,Har
a,T.et al.J.Immunol.,134,382−389（1985） Harada,N.,Kikuchi,T.,Tominaga,A.et al.J.Immunol.,1
34,3944−3951（1985）参照） （２）BCL1白血病Ｂセルラインの増殖活性。（１）をTR
F活性，（２）をＢ細胞増殖因子II型（BCGF II）活性と
区別する場合もあるが、以降本明細書中では上記
（１），（２）で示された活性をTRFが有するので上記
（１），（２）の活性を総称してTRF活性と云うことに
する。ネズミのTRFは還元剤無添加の条件で分子量45,00
0〜60,000（on gel filtration）．等電点（pI値）4.7
〜4.9で、Ｂ細胞刺激因子１（BSF−１），インターロイ
キン２（IL−２），インターロイキン３（IL−３），免
疫インターフェロン活性と異なるものであった。 （Takatsu,K.,Harada,N.,Hara,T.et al.J.Immunol.,13
4,382−389（1985） Harada,N.,Kikuchi,T.,Tominaga,A.et al.J.Immunol.,1
34,3944−3951（1985）参照） 最近TRFをインターロイキン５（IL−５）と呼ぶこと
が提唱されている。しかし、本明細書中ではTRFとして
統一して記載する。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従来の技術においては、抗TRFモノクローナル抗体が
なかったのでTRFの精製が困難であった。また、自己免
疫疾患患者のTRFの血中濃度の測定ができなかった。 本発明は、このような問題点に着目してなされたもの
で、抗TRFモノクローナル抗体を提供することを目的と
する。 〔問題点を解決するための手段及び作用〕 本発明のモノクローナル抗体は、マウスTRFの抗原部
分に特異的に結合し、IL−１、IL−２、IL−３およびBS
F−１には結合しないことを特徴とするものである。TRF
の抗原部分としては、細胞由来のTRFが挙げられる。 本発明のモノクローナル抗体は、例えば、融合細胞を
in vivo,in vitroで培養することで製造される。融合細
胞は、例えば、哺乳類動物をTRFで免疫して取り出した
脾臓細胞とマウス骨髄細胞とをケーラー及びミルスタイ
ンの細胞融合技術（Kahler and Milstein,Nature,256,4
95−497（1975）参照）により細胞融合して製造するこ
とができる。 〔実施例〕 本発明を実施例に基づいて説明する。 実施例１ TRFの調製 Ｔ細胞ハイブリドーマB151K12セルライン（Takatsu,
K.et al.,J.Immunot.,125,2646−2653（1980）参照）を
PMA（４β−phor−bol 12 β−myristate 12α−acetat
e シグマ社製）3ng/ml中48時間無血清培養してTRFを含
む培養上清225を用意した。次に、この培養上清から
硫酸アンモニウム分画，陰イオン交換クロマトグラフ
（DEAE−セルロース），ブルー・セファロースカラムク
ロマトグラフ，モノＰカラム（Pharmacia社製）クロマ
トグラフ，プロテインC4（Vydac社製）を用いた逆相HPL
C（LKB社製）によるゲルクロマトグラフにより比活性が
140万倍に上昇した精製TRFを得た。なお、TRF活性は、B
CL1細胞を用いたIgMプラーク形成細胞試験（以下PFC試
験と称す。）で測定した。 IgM PFC試験は以下の手順で行った。 培養したBCL1細胞浮遊液50〜100μとプロテインＡ
結合ヒツジ赤血球10％浮遊液50μとMEM培地を含むア
ガロース0.5％溶液400μを45℃で混和し、スライドガ
ラス上に注積し室温放置してゲル化させた。このゲルに
抗マウスIgM血清を加え37℃２時間30分インキュベート
した。モルモット補体を加え37℃１時間インキュベート
した後プラーク数をカウントした。抗DNP IgM PFC試験
はDNP−OA複合物で刺激したＢ細胞浮遊液50〜100μを
用い同様に行った。（Ｂ細胞がIgMを分泌するので上記
の抗マウスIgM血清に代えて抗マウスIgG血清の添加操作
を行なう。） TRF活性は精製TRFを用いた際のhalf−maximal respon
sesを与える量を１単位（Ｕ）として、培養液当たりの
単位（U/cultureまたはPFC/culture）で表現した。 脾臓細胞の調製 完全フロインドアジュバントに乳化させた精製TRF 3.
5×105Uでウィスターラットを免疫した。さらにウィス
ターラットを精製TRF2×105Uで20日間毎に２度ブースト
した。最終免疫から３日後にウィスターラットから脾臓
細胞をとり出し以下の操作により脾臓細胞を調製した。 Eagle'S MEM培養液5mlに脾臓を入れた。次に、10ml用
注射筒内に上記培養液4mlをとり、脾臓内に注入した。
ピンセットを用いて脾細胞をほぐした。その後、細胞浮
遊液を注射筒に入れ３回注射筒内に出し入れして細胞塊
を細かくした。単個化した細胞をとり出し1000〜1200r.
p.mで遠心し洗浄した。洗浄した細胞をEagl's MEM培養
液2mlに浮遊させた。 細胞融合 上記調整によりとり出したラットの脾臓細胞とマウス
骨髄腫細胞P3X63−Ag8.653（ATCC受託番号 CRL−158
0）とをケーラーとミルスタインの細胞融合技術により
融合した。 調製した脾臓細胞６×108個とマウス骨髄腫細胞P3X63
−Ag8.653 ３×108個を混合した後、遠心し細胞をペレ
ットにした。そのペレットに50％PEG−1500を含むRPMI
−1640培養液を1ml撹拌しながら徐々に加えた。次にRPM
I−1640培養液を撹拌しながら徐々に加え希釈した。そ
の後遠心にて上澄を除去し10％FCSを含むRPMI−1640培
養液にて１×106cells/mlになるように懸濁させ24穴マ
イクロプレートに1ml/ウェルずつ分注した。翌日、500
μ／ウェルの培養液をとりのぞき500μ／ウェルのH
AT培地を加えた。その後２日毎に同様の操作を繰り返し
14日間培養した。さらにHAT培地に替えヒポキサンチ
ン，チミジンを含むHT培地を２日毎に500μ／ウェル
交換した。７日〜10日後さらにHT培地に替え10％FCSを
含むRPMI−1640培養液を２日毎に500μ／ウェル交換
した。 スクリーニング 上記細胞融合により得たハイブリドーマ培養上清の抗
TRF活性をTRF活性阻害及びTRF活性吸収テストで調べ
た。TRF活性阻害テストは、IgM PFC試験及び3Hチミジ
ン（3H−thymidine）取り込み量の測定により行った。
ここで、3Hチミジン取り込み量の測定は、TRF 2U及び
抗TRFモノクローナル抗体を含む培養液0.2ml中でBCL1細
胞1.5×105個培養し、培養終了６時間前に3Hチミジン0.
2μCi/ウェル添加した。遠心操作により細胞を洗浄した
後、細胞内に取り込まれた3Hを液体シンチレーションで
測定した。 また、TRF活性吸収テストはウサギ抗ラットIg抗体を
吸着処理したマイクロプレートに培養上清を加え37℃４
時間インキュベートした後、洗浄し一定量のTRFを加え
更に37℃４時間インキュベートした。上清液の残存TRF
活性を測定した。その結果、ハイブリドーマを吸容する
479ウェルのうち61ウェルが抗TRF活性を示した。さらに
61ウェルの中から再現性のある阻害及び吸収活性を示し
た１ウェルを選択した。 クローニング 選択した１ウェル中に含まれたハイブリドーマを限界
希釈法でクローン化し、ハイブリドーマTB13及びNC17を
得た。 モノクローナル抗体の精製 ハイブリドーマTB13,NC17から抗TRFモノクローナル抗
体を以下の操作で得た。 ハイブリドーマTB13の培養上清をヤギ抗ラットIgG抗
体結合アガロースによるアフィティーカラムにアプライ
した。吸着画分を3MKSCNを含むホウ酸緩衝液pH＝8.0に
て溶出させて抗TRFモノクローナル抗体TB13を精製し
た。 なお、大量精製は次の操作により行った。BALB/C nu
/nuマウス腹腔内にハイブリドーマTB13 １×107個を注
射後、約15〜20日後に腹水を採取し逆相HPLCを用いたゲ
ル濾過によりIgG画分を得ることで抗TRFモノクローナル
抗体TB13を精製した。 抗TRFモノクローナル抗体NC17もハイブリドーマNC17
を用いて同様の操作により精製した。 実施例２ （モノクローナル抗体TB13,NC17の理化学性質及び免疫
学的性質） 免疫グロブリンクラスの固定 抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17の免疫グロブリン
クラスをオクタロニー法で決定した。抗TRFモノクロー
ナル抗体TB13,NC17はともにIgG1であった。 分子量 抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17の分子量を以下の
表に示す。 特異性 抗TRFモノクローナル抗体の特異性を検討するため
に、抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17がTRF,BSF−1,I
L−1,IL−2,IL−３の各リンホカインの活性を阻害する
かどうか調べた。結果を表２に示す。 TB13,NC17の各抗TRFモノクローナル抗体は、BSF−1,I
L−1,IL−2,IL−３活性は阻害せず、TRF活性のみを阻害
した。注:a）TRF（2U/ml）に対するBCL1細胞の応答は、２日培
養後のIgMPFCの細胞数で判定した。 ｂ）3Hチミジン（3H−thymidine）の取り込み量を３
日培養後に放射線量で測定した。 ｃ）3Hチミジンの取り込み量を１日培養後に放射線量
で測定した。 PC61（スイス癌研究所より入手）（Lowenthal,J.W.,Z
ubler,R.H.,Nabholz,M.＆ MacDonald,R.H.Nature（Lond
on）315,669−672（1985）参照）は抗インターロイキン
２レセプター（α−IL−2 receptor）に対するラットモ
ノクローナル抗体である。18F10（NIHより入手）（Ohar
a,J.＆Paul.W.E.Nature（London）315,333−336.（198
5）参照）はBSF−１に対するIgG1クラスのラットモノク
ローナル抗体である。WEHI−３（WEHI（オーストラリ
ア）より入手）はIL−３を産生するＴセルラインであ
る。PC61 50ng/mlはＴセルラインGY−１（Takatsu,K.,H
ara,a,N.,HaradT.et al.J.Immunol.,134,382−389（198
5）参照）のIL−２による増殖反応を阻害する。３万倍
希釈で18F10は抗IgM抗体の存在下でのBSF−１による休
止Ｂ細胞の増殖を阻害する。特異性の検討は、TRFによ
るBCL1細胞のIgM分泌,BSF−１＋抗IgM抗体による休止Ｂ
細胞刺激作用（Ohara,J.＆ Paul,W.E.Nature（London）
315,333−336（1985）参照）,IL−１＋PHAによる胸線細
胞刺激作用（Mizel,S.B.Immunol.Rev.63,51−72（197
9）参照）,IL−２によるGY−１細胞の増殖,IL−３によ
るＴセルラインFDCP−１刺激作用（Kikuchi,Y.,Kato,
R.,Sano,Y.,Takahashi,H.et al.J.Immunol.136,3553−3
560（1986）参照）を各種モノクローナル抗体が阻害す
るかどうか実験した。 力 価 Ｔ細胞ハイブリドーマB151K12より得られたTRFはBCL1
細胞をIgM分泌細胞へ分化させ、増殖を高める作用を持
つので、BCL1細胞を用いたIgM PFC試験および増殖試験
を行った。 第１図A,Bは抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17をBCL
1細胞培養液に加えた時のTRF活性阻害能を示すグラフで
ある。 試験は、in vivoラインで増殖させたBCL1細胞1.5×10
5個/0.2mlをTRF2Uと、種々の濃度の抗TRFモノクローナ
ル抗体TB13またはNC17または抗BSF−モノクローナル抗
体18F10を含む培養液200μ中でインキュベートした後
行われた。 第１図Ａでは、２日培養後に逆IgM PFC試験によりIg
M産生細胞数を求めた。 図中、 記号▲はBCL1細胞のみを培養した培地中のIgMPFC測定
値 ○はTRF添加での測定値 △はTRF＋TB13での測定値 ●はTRF＋NC17での測定値 □はTRF＋18F10（in vivo培養腹水抽出）での測定値 ■はTRF＋TB13（in vivo培養腹水抽出）での測定値を
それぞれ表わす。 第１図Ｂでは、２日培養後に3Hチミジン取り込み量を
測定した。 図中、 記号▲はBCL1細胞のみを培養した場合の放射線測定値 ○はTRF添加での測定値 △はTRF＋TB13での測定値 ●はTRF＋NC17での測定値 □はTRF＋18F10（in vivo培養腹水抽出）での測定値
をそれぞれ表わす。 比較のために行ったラットIgG1クラスの抗BSF−１モ
ノクローナル抗体18F10はIgM分泌阻害（第１図Ａ）およ
びBCL1細胞の増殖阻害（第１図Ｂ）を有しなかった。 抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17はどちらも40ngで
強いIgM分泌阻害（第１図Ａ）およびBCL1細胞の増殖阻
害（第１図Ｂ）を示した。 次に抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17がTRFで誘導
される抗DNPIgG産生応答を阻害するか検討した。DNP−O
A複合物で刺激されたＢ細胞は抗DNP IgG PFC試験の結
果TRF無添加で98PFC/cultureを示し、精製TRF3U/ml添加
で638PFC/cultureを示した。 抗TRFモノクローナル抗体TB13 50ng/mlを培養初日に
添加で、抗DNP IgGPFC試験結果は126PFC/cultureであ
り抗DNP IgG産生応答を明らかに阻害していた。NC17で
も同様の結果が得られた。これはDNPで感作されたＢ細
胞を用いた実験でも、抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC
17がTRF活性を阻害することを示す。 実施例３（抗TRFモノクローナル抗体の応用例） 免疫吸着剤への応用 抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17の混合物2.9mgを
シアン化臭素活性化セファロースCL−4B 3gに結合させ
たものを免疫吸着剤として用いた。 逆相HPLC（Parmacia社製）ゲル濾過により得られたハ
イブリドーマ細胞B151K12培養上清10ml（サンプル1.2×
104U）を上記のアフィニティーカラム（3ml packed vol
ume）に流した流出液を回収した後、1M Nacl 溶液50m
l,PBS100ml,水20mlでアフィニティーカラムを洗浄し
た。その後、0.8M酢酸溶液20mlを流してアフィニティー
カラムに結合しているTRFを溶出させた。溶出液は凍結
乾燥後、水0.8mlで再溶解させた、なお、TRF活性はBCL1
細胞を用いたIgM PFC試験で測定した。測定結果を表３
に示す。 表３から明らかなように粗精製したハイブリドーマB1
51K12産生TRFをアフィニティーカラムに適用した結果、
138UのTRFが流出したが、0.8M酢酸溶液で10.8×103UのT
RFが溶出した。コントロールカラムとして正常ラットIg
をセファロースCL−4Bに結合したものを用意して同様の
試験を行なった結果、全てのTRFが流出した。 TRFの物理化学的性質解明への応用 クロラミンＴ法により精製B151K12産生TRF1×105Uを
125Iで標識した。125I標識TRFよりセファデックスＧ−2
5（Pharmacia社製）を用いて未結合125Iを除去した。次
に、125I標識TRFを抗TRFモノクローナル抗体TB13結合CL
−4Bビーズに結合させた。CL−4Bビーズ上の125I標識TR
Fと抗TRFモノクローナル抗体TB13との複合物は２−メル
カプトエタノール（以下2MEと称する）存在（＋）及び
非存在下（−）で２％SDSを含む緩衝液により125I標識T
RFを解離させた。溶出した画分でSDS−PAGEを行った。
125I標識TRFはオートラジオグラフィーにて検出した。
第３図Ａにその結果を示す。 図中番号１は2ME非存在下（−2ME）でCL−4Bビーズよ
り125I標識TRFを解離させた画分のオートラジオグラフ
を示す。番号２は−2MEで抗TRFモノクローナル抗体TB13
結合CL−4Bビーズの代わりに正常ラットIg結合CL−4Bビ
ーズを用いた際のオートラジオグラフを示す。番号３は
2ME存在下（＋2ME）で抗TRFモノクローナル抗体TB13結
合CL−4Bビーズより125I標識TRFを解難させた画分のオ
ートラジオグラフを示す。番号４は、＋2MEで正常ラッ
トIg結合CL−4Bビーズを用いた際のオートラジオグラフ
を示す。 上記−2ME下で抗TRFモノクローナル抗体TB13結合CL−
4Bビーズから溶出した画分のSDS−PAGE後のゲルを泳動
方向に沿って2mm毎にスライスし、各スライスしたゲル
中の含有物質を電気泳動的に溶出させた。その溶出物の
TRF活性をIgM PFC試験で測定した。第３図Ｂにその結
果を示す。 第３図Ａ中、番号１及びコントロールとして示した番
号２から明らかに、非還元下で主画分は分子量44,000〜
48,000であった。番号3,4から還元下で分子量44,000〜4
8,000（−2ME下）の主画分は分子量23,000〜26,000（＋
2ME下）に移動していることから、TRFは分子量23,000〜
26,000の物質の２量体であると認められた。第３図Ｂで
分子量44,000〜48,000特に46,000の画分に強いTRF活性
が認められ、抗TRFモノクローナル抗体TB13がTRF活性を
持つ分子量44,000〜48,000のタンパク質と特異的に結合
することが証明された。 第１図および表２の試験結果はTRFと数種のリンホカ
インとの関係を示すものでもある。抗TRFモノクローナ
ル抗体TB13,NC17は50ng/mlでTRF活性を著しく阻害する
にもかかわらず、IL−1,IL−2,IL−3,BSF−１の各リン
ホカインの活性を10μg/mlの濃度でも阻害しない。 以上の結果から、TRFはBSF−1,IL−1,IL−2,IL−３と
異なり、かつ、早期に作用することが明らかとなった。
これは、TRF標品にはインターフェロン活性が無いこと
を示したこれ迄の報告（Takatsu,K.etal.,J.Immunol.13
4,382−389（1985））とあわせて考えるとTRFがユニー
クなリンホカインであることを示している。 実施例４ 今までの実施例で使用したTRFはハイブリドーマB151K
12セルラインより得られたものであるため、本発明の抗
TRFモノクローナル抗体が異なる細胞系列を起源とするT
RF活性を阻害するかどうか検討した。 最近、発明者らはTRF活性を持つcDNAの単離に成功し
た。単離したPSP6K−mTRF23をSal Iで切断し直線のプラ
スミドDNAを得た。次に、SP6 RNAポリメラーゼでmRNA
を合成した。合成されたRNAをアフリカツメガエル卵母
細胞（Xenopus oocytes）に注入し、20℃36時間インキ
ュベートした。組み換えTRF（rTRF）、すなわち卵母細
胞にPSP6K−mTRF23を翻訳させた生成物質は、BCL1細胞
の増殖およびIgM分泌細胞への分化を刺激する。rTRFのT
RF活性に対する抗TRFモノクローナル抗体NC17の阻害効
果を検討するために、抗TRFモノクローナル抗体NC17の
存在下および不存在下でBCL1細胞1.5×105/0.2mlをrTRF
と一緒に培養した。培養２日後、プロテインＡを用いた
IgM PFC試験を行いIgM分泌細胞数を決定した。結果を
第２図に示す。 第２図は抗TRFモノクローナル抗体NC17がrTRFのTRF活
性阻害能を示すグラフである。 図中、 記号▼はBCL1細胞のみを培養したIgM PFC測定値 ○はrTRF（1U/ml）添加での測定値 ●はrTRF（3U/ml）添加での測定値 □はrTRF（1U/ml）＋NC17添加での測定値 ■はrTRF（3U/ml）＋NC17添加での測定値 をそれぞれ示す。 第２図から明らかに抗TRFモノクローナル抗体NC17はr
TRFのTRF活性を添加量に依存して阻害する。同様に、抗
DNP IgG PFC試験を行い、抗TRFモノクローナル抗体NC
17がrTRFで誘導されるIgG分泌を阻害するか検討した。 DNP−OA複合物で刺激されたＢ細胞はrTRF無添加で169
PFC/cultureを示し、rTRF3U/ml添加で1003 PFC/cultur
eを示した。抗TRFモノクローナル抗体NC17 １μg/mlを
培養初日に添加で、328PFC/cultureを示し、明らかに抗
DNP IgG分泌を阻害した。 以上の結果は、抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17が
由来の異なるTRFに特異的に作用しそのTRF活性を再現性
よく阻害することを示す。 上述した如く、本発明のモノクローナル抗体は、TRF
活性を持つすべての物質と反応する。従って、TRFの精
製およびTRFの分子的性質の解明のためのプローブとし
て有用である。 〔発明の効果〕 本発明のモノクローナル抗体はTRFの測定への応用
や、免疫吸着剤として有用である。
ctor以下、TRFと称す）に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体に関するものである。本発明のモノクローナル
抗体はTRF（IL−５と命名された）の測定に有用であ
る。また、精製に用いる免疫吸着剤として有用である。
免疫吸着剤の具体的な用途として、体液中のTRFの定量
測定及びTRFの精製が挙げられる。体液中のTRF測定はTR
F過剰分泌による自己免疫疾患及びTRF分泌不良による免
疫不全の診断に不可欠なものである。本発明のモノクロ
ーナル抗体により精製したTRFはTRF分泌不良による免疫
不全の治療及び患者自身の体内に抗TRF抗体が産出され
ることにより誘発される自己免疫疾患の治療薬等に適用
される。 さらには、本発明のモノクローナル抗体及び精製した
TRFを用いることにより未だ解決されていない免疫機構
のネットワークを解明することができるであろう。 〔従来の技術〕 未熟Ｂ細胞は抗IgM抗体で抗原レセプター同士が架橋
され活性化される。活性化されたＢ細胞表面のレセプタ
ーにTRFが結合して、Ｂ細胞の増殖や免疫グロブリン分
泌細胞への分化を促進する。 （Howard,M.,Nakanishi,K.＆paul,W.E.Immunol.Rev.78,
185−210（1984）． Kishimoto,T.Ann.Rev.Immunol.,３,133−157（1985） Dutton,R.W.,Folkoff,R.,Hirst,J.A.et al.Prog.Immuno
l.,１,355−368（1971）Swain,L.L.,Howard,M.,Kapple
r.J.W.,et al.J.Exp.Med.,158,822−835（1983）参照）
TRFはＴ細胞が分泌する因子であり、抗体を産生する成
熟したＢ細胞の分化をも促進する。 （Schimp.1, A.and E.Wecker. Nature,237,NB,15−17
（1972） Takatsu,K.,Tominaga,A.＆ Hamaoka,T.J.Immunol.,124,
2414−2422（1980） Takatsu,K.,Tanaka,K.,Tominaga,A.et al.J.Immunol.,1
25,2646−2653（1980）Nakanishi,K.et al.,J.Immuno
l.,130,2219−2224（1983）参照） ネズミのＴ細胞融合細胞B151K12（Takatsu,K.et al.,
J.Immunol.,125,2646−2653（1980）参照）から分泌さ
れるネズミTRFは以下の２つの特徴を持つ。 （１）BCL1白血病Ｂ細胞株（テキサス大学より入手）に
よるIgM分泌の誘導及びジニトロフェニル（DNP）−卵白
アルブミン（OA）複合物で一次刺激されたＢ細胞による
in vitroでのIgGクラスの抗DNP抗体産生応答の誘導。 （Takatsu,K.,Tanaka,K.,Tominaga,A.et al.J.Immuno
l.,125,2646−2653（1980）Takatsu,K.,Harada,N.,Har
a,T.et al.J.Immunol.,134,382−389（1985） Harada,N.,Kikuchi,T.,Tominaga,A.et al.J.Immunol.,1
34,3944−3951（1985）参照） （２）BCL1白血病Ｂセルラインの増殖活性。（１）をTR
F活性，（２）をＢ細胞増殖因子II型（BCGF II）活性と
区別する場合もあるが、以降本明細書中では上記
（１），（２）で示された活性をTRFが有するので上記
（１），（２）の活性を総称してTRF活性と云うことに
する。ネズミのTRFは還元剤無添加の条件で分子量45,00
0〜60,000（on gel filtration）．等電点（pI値）4.7
〜4.9で、Ｂ細胞刺激因子１（BSF−１），インターロイ
キン２（IL−２），インターロイキン３（IL−３），免
疫インターフェロン活性と異なるものであった。 （Takatsu,K.,Harada,N.,Hara,T.et al.J.Immunol.,13
4,382−389（1985） Harada,N.,Kikuchi,T.,Tominaga,A.et al.J.Immunol.,1
34,3944−3951（1985）参照） 最近TRFをインターロイキン５（IL−５）と呼ぶこと
が提唱されている。しかし、本明細書中ではTRFとして
統一して記載する。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従来の技術においては、抗TRFモノクローナル抗体が
なかったのでTRFの精製が困難であった。また、自己免
疫疾患患者のTRFの血中濃度の測定ができなかった。 本発明は、このような問題点に着目してなされたもの
で、抗TRFモノクローナル抗体を提供することを目的と
する。 〔問題点を解決するための手段及び作用〕 本発明のモノクローナル抗体は、マウスTRFの抗原部
分に特異的に結合し、IL−１、IL−２、IL−３およびBS
F−１には結合しないことを特徴とするものである。TRF
の抗原部分としては、細胞由来のTRFが挙げられる。 本発明のモノクローナル抗体は、例えば、融合細胞を
in vivo,in vitroで培養することで製造される。融合細
胞は、例えば、哺乳類動物をTRFで免疫して取り出した
脾臓細胞とマウス骨髄細胞とをケーラー及びミルスタイ
ンの細胞融合技術（Kahler and Milstein,Nature,256,4
95−497（1975）参照）により細胞融合して製造するこ
とができる。 〔実施例〕 本発明を実施例に基づいて説明する。 実施例１ TRFの調製 Ｔ細胞ハイブリドーマB151K12セルライン（Takatsu,
K.et al.,J.Immunot.,125,2646−2653（1980）参照）を
PMA（４β−phor−bol 12 β−myristate 12α−acetat
e シグマ社製）3ng/ml中48時間無血清培養してTRFを含
む培養上清225を用意した。次に、この培養上清から
硫酸アンモニウム分画，陰イオン交換クロマトグラフ
（DEAE−セルロース），ブルー・セファロースカラムク
ロマトグラフ，モノＰカラム（Pharmacia社製）クロマ
トグラフ，プロテインC4（Vydac社製）を用いた逆相HPL
C（LKB社製）によるゲルクロマトグラフにより比活性が
140万倍に上昇した精製TRFを得た。なお、TRF活性は、B
CL1細胞を用いたIgMプラーク形成細胞試験（以下PFC試
験と称す。）で測定した。 IgM PFC試験は以下の手順で行った。 培養したBCL1細胞浮遊液50〜100μとプロテインＡ
結合ヒツジ赤血球10％浮遊液50μとMEM培地を含むア
ガロース0.5％溶液400μを45℃で混和し、スライドガ
ラス上に注積し室温放置してゲル化させた。このゲルに
抗マウスIgM血清を加え37℃２時間30分インキュベート
した。モルモット補体を加え37℃１時間インキュベート
した後プラーク数をカウントした。抗DNP IgM PFC試験
はDNP−OA複合物で刺激したＢ細胞浮遊液50〜100μを
用い同様に行った。（Ｂ細胞がIgMを分泌するので上記
の抗マウスIgM血清に代えて抗マウスIgG血清の添加操作
を行なう。） TRF活性は精製TRFを用いた際のhalf−maximal respon
sesを与える量を１単位（Ｕ）として、培養液当たりの
単位（U/cultureまたはPFC/culture）で表現した。 脾臓細胞の調製 完全フロインドアジュバントに乳化させた精製TRF 3.
5×105Uでウィスターラットを免疫した。さらにウィス
ターラットを精製TRF2×105Uで20日間毎に２度ブースト
した。最終免疫から３日後にウィスターラットから脾臓
細胞をとり出し以下の操作により脾臓細胞を調製した。 Eagle'S MEM培養液5mlに脾臓を入れた。次に、10ml用
注射筒内に上記培養液4mlをとり、脾臓内に注入した。
ピンセットを用いて脾細胞をほぐした。その後、細胞浮
遊液を注射筒に入れ３回注射筒内に出し入れして細胞塊
を細かくした。単個化した細胞をとり出し1000〜1200r.
p.mで遠心し洗浄した。洗浄した細胞をEagl's MEM培養
液2mlに浮遊させた。 細胞融合 上記調整によりとり出したラットの脾臓細胞とマウス
骨髄腫細胞P3X63−Ag8.653（ATCC受託番号 CRL−158
0）とをケーラーとミルスタインの細胞融合技術により
融合した。 調製した脾臓細胞６×108個とマウス骨髄腫細胞P3X63
−Ag8.653 ３×108個を混合した後、遠心し細胞をペレ
ットにした。そのペレットに50％PEG−1500を含むRPMI
−1640培養液を1ml撹拌しながら徐々に加えた。次にRPM
I−1640培養液を撹拌しながら徐々に加え希釈した。そ
の後遠心にて上澄を除去し10％FCSを含むRPMI−1640培
養液にて１×106cells/mlになるように懸濁させ24穴マ
イクロプレートに1ml/ウェルずつ分注した。翌日、500
μ／ウェルの培養液をとりのぞき500μ／ウェルのH
AT培地を加えた。その後２日毎に同様の操作を繰り返し
14日間培養した。さらにHAT培地に替えヒポキサンチ
ン，チミジンを含むHT培地を２日毎に500μ／ウェル
交換した。７日〜10日後さらにHT培地に替え10％FCSを
含むRPMI−1640培養液を２日毎に500μ／ウェル交換
した。 スクリーニング 上記細胞融合により得たハイブリドーマ培養上清の抗
TRF活性をTRF活性阻害及びTRF活性吸収テストで調べ
た。TRF活性阻害テストは、IgM PFC試験及び3Hチミジ
ン（3H−thymidine）取り込み量の測定により行った。
ここで、3Hチミジン取り込み量の測定は、TRF 2U及び
抗TRFモノクローナル抗体を含む培養液0.2ml中でBCL1細
胞1.5×105個培養し、培養終了６時間前に3Hチミジン0.
2μCi/ウェル添加した。遠心操作により細胞を洗浄した
後、細胞内に取り込まれた3Hを液体シンチレーションで
測定した。 また、TRF活性吸収テストはウサギ抗ラットIg抗体を
吸着処理したマイクロプレートに培養上清を加え37℃４
時間インキュベートした後、洗浄し一定量のTRFを加え
更に37℃４時間インキュベートした。上清液の残存TRF
活性を測定した。その結果、ハイブリドーマを吸容する
479ウェルのうち61ウェルが抗TRF活性を示した。さらに
61ウェルの中から再現性のある阻害及び吸収活性を示し
た１ウェルを選択した。 クローニング 選択した１ウェル中に含まれたハイブリドーマを限界
希釈法でクローン化し、ハイブリドーマTB13及びNC17を
得た。 モノクローナル抗体の精製 ハイブリドーマTB13,NC17から抗TRFモノクローナル抗
体を以下の操作で得た。 ハイブリドーマTB13の培養上清をヤギ抗ラットIgG抗
体結合アガロースによるアフィティーカラムにアプライ
した。吸着画分を3MKSCNを含むホウ酸緩衝液pH＝8.0に
て溶出させて抗TRFモノクローナル抗体TB13を精製し
た。 なお、大量精製は次の操作により行った。BALB/C nu
/nuマウス腹腔内にハイブリドーマTB13 １×107個を注
射後、約15〜20日後に腹水を採取し逆相HPLCを用いたゲ
ル濾過によりIgG画分を得ることで抗TRFモノクローナル
抗体TB13を精製した。 抗TRFモノクローナル抗体NC17もハイブリドーマNC17
を用いて同様の操作により精製した。 実施例２ （モノクローナル抗体TB13,NC17の理化学性質及び免疫
学的性質） 免疫グロブリンクラスの固定 抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17の免疫グロブリン
クラスをオクタロニー法で決定した。抗TRFモノクロー
ナル抗体TB13,NC17はともにIgG1であった。 分子量 抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17の分子量を以下の
表に示す。 特異性 抗TRFモノクローナル抗体の特異性を検討するため
に、抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17がTRF,BSF−1,I
L−1,IL−2,IL−３の各リンホカインの活性を阻害する
かどうか調べた。結果を表２に示す。 TB13,NC17の各抗TRFモノクローナル抗体は、BSF−1,I
L−1,IL−2,IL−３活性は阻害せず、TRF活性のみを阻害
した。注:a）TRF（2U/ml）に対するBCL1細胞の応答は、２日培
養後のIgMPFCの細胞数で判定した。 ｂ）3Hチミジン（3H−thymidine）の取り込み量を３
日培養後に放射線量で測定した。 ｃ）3Hチミジンの取り込み量を１日培養後に放射線量
で測定した。 PC61（スイス癌研究所より入手）（Lowenthal,J.W.,Z
ubler,R.H.,Nabholz,M.＆ MacDonald,R.H.Nature（Lond
on）315,669−672（1985）参照）は抗インターロイキン
２レセプター（α−IL−2 receptor）に対するラットモ
ノクローナル抗体である。18F10（NIHより入手）（Ohar
a,J.＆Paul.W.E.Nature（London）315,333−336.（198
5）参照）はBSF−１に対するIgG1クラスのラットモノク
ローナル抗体である。WEHI−３（WEHI（オーストラリ
ア）より入手）はIL−３を産生するＴセルラインであ
る。PC61 50ng/mlはＴセルラインGY−１（Takatsu,K.,H
ara,a,N.,HaradT.et al.J.Immunol.,134,382−389（198
5）参照）のIL−２による増殖反応を阻害する。３万倍
希釈で18F10は抗IgM抗体の存在下でのBSF−１による休
止Ｂ細胞の増殖を阻害する。特異性の検討は、TRFによ
るBCL1細胞のIgM分泌,BSF−１＋抗IgM抗体による休止Ｂ
細胞刺激作用（Ohara,J.＆ Paul,W.E.Nature（London）
315,333−336（1985）参照）,IL−１＋PHAによる胸線細
胞刺激作用（Mizel,S.B.Immunol.Rev.63,51−72（197
9）参照）,IL−２によるGY−１細胞の増殖,IL−３によ
るＴセルラインFDCP−１刺激作用（Kikuchi,Y.,Kato,
R.,Sano,Y.,Takahashi,H.et al.J.Immunol.136,3553−3
560（1986）参照）を各種モノクローナル抗体が阻害す
るかどうか実験した。 力 価 Ｔ細胞ハイブリドーマB151K12より得られたTRFはBCL1
細胞をIgM分泌細胞へ分化させ、増殖を高める作用を持
つので、BCL1細胞を用いたIgM PFC試験および増殖試験
を行った。 第１図A,Bは抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17をBCL
1細胞培養液に加えた時のTRF活性阻害能を示すグラフで
ある。 試験は、in vivoラインで増殖させたBCL1細胞1.5×10
5個/0.2mlをTRF2Uと、種々の濃度の抗TRFモノクローナ
ル抗体TB13またはNC17または抗BSF−モノクローナル抗
体18F10を含む培養液200μ中でインキュベートした後
行われた。 第１図Ａでは、２日培養後に逆IgM PFC試験によりIg
M産生細胞数を求めた。 図中、 記号▲はBCL1細胞のみを培養した培地中のIgMPFC測定
値 ○はTRF添加での測定値 △はTRF＋TB13での測定値 ●はTRF＋NC17での測定値 □はTRF＋18F10（in vivo培養腹水抽出）での測定値 ■はTRF＋TB13（in vivo培養腹水抽出）での測定値を
それぞれ表わす。 第１図Ｂでは、２日培養後に3Hチミジン取り込み量を
測定した。 図中、 記号▲はBCL1細胞のみを培養した場合の放射線測定値 ○はTRF添加での測定値 △はTRF＋TB13での測定値 ●はTRF＋NC17での測定値 □はTRF＋18F10（in vivo培養腹水抽出）での測定値
をそれぞれ表わす。 比較のために行ったラットIgG1クラスの抗BSF−１モ
ノクローナル抗体18F10はIgM分泌阻害（第１図Ａ）およ
びBCL1細胞の増殖阻害（第１図Ｂ）を有しなかった。 抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17はどちらも40ngで
強いIgM分泌阻害（第１図Ａ）およびBCL1細胞の増殖阻
害（第１図Ｂ）を示した。 次に抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17がTRFで誘導
される抗DNPIgG産生応答を阻害するか検討した。DNP−O
A複合物で刺激されたＢ細胞は抗DNP IgG PFC試験の結
果TRF無添加で98PFC/cultureを示し、精製TRF3U/ml添加
で638PFC/cultureを示した。 抗TRFモノクローナル抗体TB13 50ng/mlを培養初日に
添加で、抗DNP IgGPFC試験結果は126PFC/cultureであ
り抗DNP IgG産生応答を明らかに阻害していた。NC17で
も同様の結果が得られた。これはDNPで感作されたＢ細
胞を用いた実験でも、抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC
17がTRF活性を阻害することを示す。 実施例３（抗TRFモノクローナル抗体の応用例） 免疫吸着剤への応用 抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17の混合物2.9mgを
シアン化臭素活性化セファロースCL−4B 3gに結合させ
たものを免疫吸着剤として用いた。 逆相HPLC（Parmacia社製）ゲル濾過により得られたハ
イブリドーマ細胞B151K12培養上清10ml（サンプル1.2×
104U）を上記のアフィニティーカラム（3ml packed vol
ume）に流した流出液を回収した後、1M Nacl 溶液50m
l,PBS100ml,水20mlでアフィニティーカラムを洗浄し
た。その後、0.8M酢酸溶液20mlを流してアフィニティー
カラムに結合しているTRFを溶出させた。溶出液は凍結
乾燥後、水0.8mlで再溶解させた、なお、TRF活性はBCL1
細胞を用いたIgM PFC試験で測定した。測定結果を表３
に示す。 表３から明らかなように粗精製したハイブリドーマB1
51K12産生TRFをアフィニティーカラムに適用した結果、
138UのTRFが流出したが、0.8M酢酸溶液で10.8×103UのT
RFが溶出した。コントロールカラムとして正常ラットIg
をセファロースCL−4Bに結合したものを用意して同様の
試験を行なった結果、全てのTRFが流出した。 TRFの物理化学的性質解明への応用 クロラミンＴ法により精製B151K12産生TRF1×105Uを
125Iで標識した。125I標識TRFよりセファデックスＧ−2
5（Pharmacia社製）を用いて未結合125Iを除去した。次
に、125I標識TRFを抗TRFモノクローナル抗体TB13結合CL
−4Bビーズに結合させた。CL−4Bビーズ上の125I標識TR
Fと抗TRFモノクローナル抗体TB13との複合物は２−メル
カプトエタノール（以下2MEと称する）存在（＋）及び
非存在下（−）で２％SDSを含む緩衝液により125I標識T
RFを解離させた。溶出した画分でSDS−PAGEを行った。
125I標識TRFはオートラジオグラフィーにて検出した。
第３図Ａにその結果を示す。 図中番号１は2ME非存在下（−2ME）でCL−4Bビーズよ
り125I標識TRFを解離させた画分のオートラジオグラフ
を示す。番号２は−2MEで抗TRFモノクローナル抗体TB13
結合CL−4Bビーズの代わりに正常ラットIg結合CL−4Bビ
ーズを用いた際のオートラジオグラフを示す。番号３は
2ME存在下（＋2ME）で抗TRFモノクローナル抗体TB13結
合CL−4Bビーズより125I標識TRFを解難させた画分のオ
ートラジオグラフを示す。番号４は、＋2MEで正常ラッ
トIg結合CL−4Bビーズを用いた際のオートラジオグラフ
を示す。 上記−2ME下で抗TRFモノクローナル抗体TB13結合CL−
4Bビーズから溶出した画分のSDS−PAGE後のゲルを泳動
方向に沿って2mm毎にスライスし、各スライスしたゲル
中の含有物質を電気泳動的に溶出させた。その溶出物の
TRF活性をIgM PFC試験で測定した。第３図Ｂにその結
果を示す。 第３図Ａ中、番号１及びコントロールとして示した番
号２から明らかに、非還元下で主画分は分子量44,000〜
48,000であった。番号3,4から還元下で分子量44,000〜4
8,000（−2ME下）の主画分は分子量23,000〜26,000（＋
2ME下）に移動していることから、TRFは分子量23,000〜
26,000の物質の２量体であると認められた。第３図Ｂで
分子量44,000〜48,000特に46,000の画分に強いTRF活性
が認められ、抗TRFモノクローナル抗体TB13がTRF活性を
持つ分子量44,000〜48,000のタンパク質と特異的に結合
することが証明された。 第１図および表２の試験結果はTRFと数種のリンホカ
インとの関係を示すものでもある。抗TRFモノクローナ
ル抗体TB13,NC17は50ng/mlでTRF活性を著しく阻害する
にもかかわらず、IL−1,IL−2,IL−3,BSF−１の各リン
ホカインの活性を10μg/mlの濃度でも阻害しない。 以上の結果から、TRFはBSF−1,IL−1,IL−2,IL−３と
異なり、かつ、早期に作用することが明らかとなった。
これは、TRF標品にはインターフェロン活性が無いこと
を示したこれ迄の報告（Takatsu,K.etal.,J.Immunol.13
4,382−389（1985））とあわせて考えるとTRFがユニー
クなリンホカインであることを示している。 実施例４ 今までの実施例で使用したTRFはハイブリドーマB151K
12セルラインより得られたものであるため、本発明の抗
TRFモノクローナル抗体が異なる細胞系列を起源とするT
RF活性を阻害するかどうか検討した。 最近、発明者らはTRF活性を持つcDNAの単離に成功し
た。単離したPSP6K−mTRF23をSal Iで切断し直線のプラ
スミドDNAを得た。次に、SP6 RNAポリメラーゼでmRNA
を合成した。合成されたRNAをアフリカツメガエル卵母
細胞（Xenopus oocytes）に注入し、20℃36時間インキ
ュベートした。組み換えTRF（rTRF）、すなわち卵母細
胞にPSP6K−mTRF23を翻訳させた生成物質は、BCL1細胞
の増殖およびIgM分泌細胞への分化を刺激する。rTRFのT
RF活性に対する抗TRFモノクローナル抗体NC17の阻害効
果を検討するために、抗TRFモノクローナル抗体NC17の
存在下および不存在下でBCL1細胞1.5×105/0.2mlをrTRF
と一緒に培養した。培養２日後、プロテインＡを用いた
IgM PFC試験を行いIgM分泌細胞数を決定した。結果を
第２図に示す。 第２図は抗TRFモノクローナル抗体NC17がrTRFのTRF活
性阻害能を示すグラフである。 図中、 記号▼はBCL1細胞のみを培養したIgM PFC測定値 ○はrTRF（1U/ml）添加での測定値 ●はrTRF（3U/ml）添加での測定値 □はrTRF（1U/ml）＋NC17添加での測定値 ■はrTRF（3U/ml）＋NC17添加での測定値 をそれぞれ示す。 第２図から明らかに抗TRFモノクローナル抗体NC17はr
TRFのTRF活性を添加量に依存して阻害する。同様に、抗
DNP IgG PFC試験を行い、抗TRFモノクローナル抗体NC
17がrTRFで誘導されるIgG分泌を阻害するか検討した。 DNP−OA複合物で刺激されたＢ細胞はrTRF無添加で169
PFC/cultureを示し、rTRF3U/ml添加で1003 PFC/cultur
eを示した。抗TRFモノクローナル抗体NC17 １μg/mlを
培養初日に添加で、328PFC/cultureを示し、明らかに抗
DNP IgG分泌を阻害した。 以上の結果は、抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17が
由来の異なるTRFに特異的に作用しそのTRF活性を再現性
よく阻害することを示す。 上述した如く、本発明のモノクローナル抗体は、TRF
活性を持つすべての物質と反応する。従って、TRFの精
製およびTRFの分子的性質の解明のためのプローブとし
て有用である。 〔発明の効果〕 本発明のモノクローナル抗体はTRFの測定への応用
や、免疫吸着剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図A,Bは抗TRFモノクローナル抗体TB13,NC17のTRF活
性阻害能を示すグラフ、 第２図は抗TRFモノクローナル抗体NC17がrTRFのTRF活性
阻害能を示すグラフ、 第３図Ａは125I標識TRFのオートラジオグラフを示す写
真、 第３図Ｂは第３図Ａ番号１に対応するSDS−PAGE後のゲ
ルの各位置におけるTRF活性能を示すグラフである。
性阻害能を示すグラフ、 第２図は抗TRFモノクローナル抗体NC17がrTRFのTRF活性
阻害能を示すグラフ、 第３図Ａは125I標識TRFのオートラジオグラフを示す写
真、 第３図Ｂは第３図Ａ番号１に対応するSDS−PAGE後のゲ
ルの各位置におけるTRF活性能を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，134［６］（1985）Ｐ．3944
−3951
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，134［１］（1985）Ｐ．382−
389
細胞工学，Ｌ［１］（1982）Ｐ．23−
29
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．マウスTRFの抗原部分に特異的に結合し、IL−１、I
L−２、IL−３およびBSF−１には結合しないことを特徴
とするモノクローナル抗体。 ２．前記TRFの抗原部分が細胞由来のTRFの抗原部分であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のモノク
ローナル抗体。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP61259957A JP2674643B2 (ja) | 1986-10-31 | 1986-10-31 | モノクローナル抗体 |
| EP87115515A EP0265847B1 (en) | 1986-10-31 | 1987-10-22 | Monoclonal antibody reacting with TRF (interleukin-5) |
| DE19873750534 DE3750534T2 (de) | 1986-10-31 | 1987-10-22 | Mit dem TRF (Interleukin-5) reagierender monoklonaler Antikörper. |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP61259957A JP2674643B2 (ja) | 1986-10-31 | 1986-10-31 | モノクローナル抗体 |
Related Child Applications (3)
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|---|---|---|---|
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| JP30749895A Division JP2596724B2 (ja) | 1995-11-27 | 1995-11-27 | モノクローナル抗体 |
| JP30749695A Division JP2744422B2 (ja) | 1995-11-27 | 1995-11-27 | モノクローナル抗体 |
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Family
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Family Applications (1)
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| JP61259957A Expired - Fee Related JP2674643B2 (ja) | 1986-10-31 | 1986-10-31 | モノクローナル抗体 |
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| DK195089A (da) * | 1989-04-20 | 1990-10-21 | Morten Bagge Hansen | Regulatoriske proteiner |
| KR20020070469A (ko) * | 1999-12-27 | 2002-09-09 | 도레이 가부시끼가이샤 | 사이토카인형 펩티드 |
-
1986
- 1986-10-31 JP JP61259957A patent/JP2674643B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-10-22 EP EP87115515A patent/EP0265847B1/en not_active Revoked
- 1987-10-22 DE DE19873750534 patent/DE3750534T2/de not_active Revoked
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３４［１］（１９８５）Ｐ．３８２−３８９ |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３４［６］（１９８５）Ｐ．３９４４−３９５１ |
| 細胞工学，Ｌ［１］（１９８２）Ｐ．２３−２９ |
Also Published As
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|---|---|
| EP0265847A3 (en) | 1989-07-19 |
| JPS63115898A (ja) | 1988-05-20 |
| EP0265847A2 (en) | 1988-05-04 |
| DE3750534D1 (de) | 1994-10-20 |
| EP0265847B1 (en) | 1994-09-14 |
| DE3750534T2 (de) | 1995-03-30 |
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|---|---|---|---|
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