WO2001038527A1 - Nouvelle proteine tab2 - Google Patents

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Kunihiro Matsumoto
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Kunihiro Matsumoto
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Definitions

  • TAB2 translocated from the membrane to the cytoplasm upon IL-1 stimulation, where it mediated the IL-1-dependent binding of TRAF6 and TAK1.
  • IL-1 activates TAK1 through its autophosphorylation.
  • TAB2 mediates IL-1 signaling, it does not appear to be involved in another signaling pathway involving TAK1, the TGF-; 5 signaling pathway. Therefore, the use of compounds that regulate signal transduction via TAB2 enables specific control of biological responses in response to IL-1 stimulation and specific treatment or prevention of IL-1 related diseases. It is thought to be. For example, by identifying compounds that inhibit the binding of TAB2 to TAK1 and TRAF6, we will develop inhibitors that suppress IL-1 signaling A new approach is provided for These inhibitors are important candidates for new anti-inflammatory drugs that play new and auxiliary roles. In fact, the present inventors have found that a partial peptide of TAB2 has an activity of inhibiting signal transduction from IL-1.
  • the isolated human TAB2 gene encodes a protein of 693 amino acids and has significant homology to known proteins, except that it has a structure expected to form an amphipathic helix near the C-terminus. Not found.
  • the TAB2 protein has the activity to simultaneously bind to both TRAF6 and TAK1, indicating that the formation of this complex causes the signal of TRAF6 to be transmitted to TAK1, resulting in TAK1 autophosphorylation and activation of kinase activity.
  • TAB2 expression induced the activation of NF-B and JM, which are known to be located downstream of IL-1 signaling.
  • a fusion protein can be prepared by fusing a commercially available DNA encoding the peptide or the protein with a DNA encoding the protein of the present invention, and expressing the fusion DNA prepared thereby.
  • a protein encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA encoding the human “TAB2” protein, and a protein functionally equivalent to the human “TAB2” protein is also a protein of the present invention.
  • Such proteins include, for example, homologs of non-human mammals.
  • the protein is a natural protein, a method known to those skilled in the art, for example, an affinity in which an antibody that binds to the protein of the present invention described below is bound to a tissue or cell extract expressing the protein of the present invention, as described below. Isolation can be achieved by purifying the reaction with one column.
  • Antibodies can be polyclonal or monoclonal.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is used for the in vivo and in vitro production of the protein of the present invention as described above, and also includes, for example, diseases and the like caused by abnormalities of the gene encoding the protein of the present invention.
  • Application to gene therapy of diseases treatable by the protein of the present invention is also conceivable.
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the protein of the present invention. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic MA, or chemically synthesized DNA. Further, as long as it can encode the protein of the present invention, a DNA having an arbitrary nucleotide sequence based on the degeneracy of the genetic code is included.
  • promoters that can be efficiently expressed in Escherichia coli such as lacZ promoter Yuichi (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427), the araB promoter (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), or the T7 promoter.
  • lacZ promoter Yuichi Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427
  • the araB promoter Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043
  • T7 promoter include PGEX-5X-1 (Pharmacia), QIAexpress systemj (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase in addition to the above vectors) BL21 is preferred).
  • tobacco when using a plant, for example, tobacco can be used.
  • the DNA encoding the desired protein is inserted into a plant expression vector, for example, MON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. .
  • This bacterium is infected to tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired polypeptide can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K. -C. Ma et a 1 Li Eur. J. Immunol. (1994) 24, 13 138).
  • the obtained hybridomas are transplanted into a mouse intraperitoneal cavity, ascites is recovered from the mice, and the obtained monoclonal antibody is subjected to, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, and the present invention.
  • Power of protein can be prepared by purification using a coupled affinity column or the like.
  • the antibody of the present invention is used for purification and detection of the protein of the present invention, and is also a candidate for an agonist and an angoniist of the protein of the present invention. It is also conceivable to apply this antibody to antibody therapy for diseases involving the protein of the present invention.
  • a human antibody or a humanized antibody is preferable in order to reduce immunogenicity.
  • the column used for affinity chromatography is Protein A And protein G columns.
  • columns using Protein A column include Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia), etc.
  • Chromatography other than affinity chromatography is, for example, ion exchange chromatography, hydrophobicity Examples include chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatographys can be performed using liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • Methods for measuring the antigen-binding activity of the antibody of the present invention include, for example, measurement of absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), EIA (enzyme-linked immunosorbent assay), and RIA (radioimmunoassay). Immunoassay) or a fluorescent antibody method can be used.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • Immunoassay or a fluorescent antibody method can be used.
  • the protein of the present invention is added to a plate on which the antibody of the present invention is immobilized, and then a sample containing the target antibody, for example, a culture supernatant of antibody-producing cells or a purified antibody is added.
  • modified product for example, a modified lower alkyl phosphonate such as a methylphosphonate type or an ethyl phosphonate type, or a phosphorothioate modified product Or a modified phosphoramidate.
  • excipients may be added to tablets, splinters, granules, capsules, ribosome capsules, It can be a lyophilized agent such as a propellant, a liquid, a nasal drop and the like. These can be prepared according to a conventional method.
  • polyhistidine His-tag
  • influenza agglutinin HA human c-myc
  • FLAG Vesicular stom atitis virus glycoprotein
  • VSV-GP Vesicular stom atitis virus glycoprotein
  • T7-tag human simplex virus saccharide Epitopes such as proteins (HSV-tag) and E-tag (epitopes on monoclonal phage) and monoclonal antibodies recognizing them
  • HSV-tag proteins
  • E-tag epitopepitopes on monoclonal phage
  • monoclonal antibodies recognizing them can be used as an ebitope-antibody system for screening proteins that bind to the protein of the present invention.
  • the protein used in the present invention can be used by binding to a support.
  • any one of the purified or crudely purified TRAF6, TAB2, or TAK1 is bound to the support.
  • the protein may be immobilized on the support by a standard method.
  • the support to which the protein is bound for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, cellulose, synthetic resin, for example, polystyrene, polyacrylamide, silicon and the like can be mentioned. More specifically, commercially available beads and plates manufactured using them as raw materials are used. In the case of beads, a column or the like filled with these may be used. In the case of a plate, a multiwell plate (eg, a 96-well multiwell plate) or a single biosensor chip can be used.
  • a solution containing any protein is added to the plate and left overnight. After washing the plate, remove the protein Block with, for example, BSA to prevent specific binding. After washing again, the test sample and another protein fused with another peptide are added to the plate. At the same time, place a negative control group and / or positive control that does not contain the test sample, and incubate them.
  • the screening method using the kinase activity of TAK1 as an index can also be used for high-throughput screening (HTS).
  • HTS high-throughput screening
  • the addition and mixing of each sample and each reaction are automated using a robot, and the degree of phosphorylation of the substrate protein is determined by the Scintillation proximity assay (Bothworth, N. and Towers, P., Nature, 341: 167-168, to detect in 1989), namely it is possible to realize a high-throughput screening, in addition TAK1 prepared from the cells to each well of a 96-well microplate, 3 2 P-ATP
  • a substrate protein for example, MKK6, is added to perform a kinase reaction.
  • an anti-MKK6 antibody is added to each well, and then SPA beads (Amersham) coated with protein A or a species-specific antibody are added to each well. After the incubation, the radioactivity incorporated into the substrate protein is measured using a MicroBeta scintillation counter (Wallac). In addition, when a biotinylated substrate protein is used, it can be measured by using streptavidin-coated SPA beads. The results obtained by these methods By comparing with the obtained values, a test sample containing a compound that inhibits the kinase activity of TAK1 can be identified.
  • Activation of NF-B can be detected, for example, by introducing a vector containing a reporter gene linked downstream of an Ig-promoter into a cell, and using the expression of the reporter gene in the cell as an index.
  • Additives that can be incorporated into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, acacia, crystalline cell openings Excipients such as sesame, swelling agents such as corn starch, gelatin, alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, peppermint, cocoa oil or tea. Flavoring agents are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above-mentioned materials may further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • a sterile composition for injection can be formulated using a vehicle such as distilled water for injection according to normal pharmaceutical practice.
  • the present inventors screened a protein that binds to TAK1 using a single yeast hybrid to identify an adapter protein that acts to bring about the specificity of the TAK1 response.
  • TAB1 and TAB2 Two types of TAK1-binding proteins, TAB1 and TAB2 (Shibuya, H. et al., (1996) Science, 272, 1179-1182).
  • TAB1 has been found to function as a direct activator of TAKl (Shibuya, H. et al., (1996) Science, 272, 1179-1182).
  • a 250 bp fragment was combined with a 5, -oligonucleotide (5, -TATAACATTCAGAATATTTCAACAGGACCT-3 '/ SEQ ID NO: 3) containing an Sspl restriction site, and a termination codon and a Sail restriction site.
  • Including 3, -oligonucleotides PCR amplification was carried out using 5'-CAGGTCGACTCACTGTTCATCTCCTGTGGC-3 '/ SEQ ID NO: 4).
  • the resulting 250 base pair Sspl-Sall fragment and the 950 base pair EcoRI-SspI fragment obtained from pCMVT7-TAB2 were inserted into the EcoRI-Sall gearbox of CMVT7.
  • a 330 base pair fragment was prepared by combining a 5'-oligonucleotide (5, -CGCGMTTCATGCGGAATCAGCCCACACTC-3, / SEQ ID NO: 5) containing an EcoRI restriction site, and a 3,- PCR amplification was carried out using oligonucleotides (5, -CCCCTGGTGAAACTGCAGGGGGCTTATTGG-3 '/ SEQ ID NO: 6).
  • the obtained 330 base pair EcoRI-Pstl fragment and the 1 kb Pstl-Sail fragment obtained from PCMVT7-TAB2 were inserted into the EcoRI-SalI gap of pCMVT7. All constructs were confirmed by MA sequencing. ⁇ Antibodies and immunoprecipitation>
  • a rabbit heron polyclonal antibody against TAB2 (anti-TAB2 antibody) was raised against a peptide corresponding to amino acid group 20 of TAB2.
  • a egret polyclonal antibody against TRAF6 (anti-TRA F6C antibody) was raised against a peptide corresponding to amino acids 497-522 of TRAF6.
  • a goat polyclonal antibody to TRAF6, TRAF6 (C20) (Santa Cruz) was used for immunoprecipitation of endogenous TRAF6 described below.
  • 293 IL-1 RI cells were either left untreated or treated with IL-1 (10 ng / ml) for the indicated times.
  • 293 cells (1 ⁇ 10 6 ) were seeded on a 10 cm dish, transfected by calcium phosphate precipitation with a total of 10 g DNA containing various expression vectors, and incubated for 24 to 36 hours. I did .
  • Proteins from cell lysates formed immunocomplexes with various antibodies l ⁇ g and Protein G-Sepharose (Pharmacia) 20/1.
  • the immune complex 20mM HEPES (pH7.4), 500mM NaCl, and LOMM MgC 1 2 and washed 3 times with wash buffer one containing, 20mM HEPES (pH7.4), 150mM NaCl, and LOMM MgCl 2
  • wash buffer one containing, 20mM HEPES (pH7.4), 150mM NaCl, and LOMM MgCl 2
  • the rinsing buffer contained was suspended in 40 ⁇ 1.
  • the immunoprecipitate or whole cell lysate was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to a Hybond-P membrane (Amersham).
  • TAK1 and TAK1 (S192D) which are TAK1 mutants having substitution of a serine residue in the activation loop, were prepared by PCR.
  • 5 -oligonucleotide (TTGTGGAGCTCCGGCAGTTG / SEQ ID NO: 7) containing a Sad restriction site, and 3′-oligonucleotide (TTCAGGCGCCATCCAAG) containing a Narl restriction site for TAK1 (S1992A)
  • a TAK1 mutant fragment was prepared using CAGC CCC / SEQ ID NO: 8) together with TAK1 (S192D) together with (TTCAGGCGCCATCCAAG CAGCA1 SCCC / SEQ ID NO: 9).
  • the present invention has shown that TAB2 functions as an adapter that bridges between TRAF6 and TAK1 in IL-1 signaling.
  • the C-terminal partial peptide of TAB2 functions as an inhibitor of IL-1 signaling.
  • the screening method of the present invention makes it possible to isolate a compound for specifically inhibiting IL-1 signaling through inhibition of signal transmission via TRAF6, TAK1, or TAB2. These compounds inhibit IL-1 signaling Thus, it is considered possible to exhibit an anti-inflammatory effect. Therefore, it is an important candidate for new medicines for various diseases and injuries involving inflammation.

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Description

明細 i 新規 TAB2蛋白質 技術分野
本発明は、炎症性サイ トカイン IL-1のシグナル伝達に関与する新規なシグナル 伝達蛋白質に関する。 また、 本発明は、 該蛋白質の活性を阻害する化合物をスク リーニングする方法に関する。 本発明はまた、 該蛋白質の活性の阻害剤を有効成 分として含有する医薬組成物に関する。 背景技術 ィン夕ーロイキン- 1(IL- 1)は、 炎症過程において様々な作用を有する炎症性サ ィ トカインである。細胞を IL- 1で刺激するとシグナル伝達のカスケ一ドが起動し 、 c-Jun N-末端キナーゼ（JNK)および核内転写因子 B(NF- B)の活性化などが起 こり、 結果として核内の多くの炎症性遺伝子の発現を上昇させる （Dinarello,C. A.(1996) Blood, 87, 2095- 2147)。刺激をしていない細胞においては、 NF- Bは 、 抑制蛋白である ΙΑΓΒと複合体を形成し、細胞質中に隔離されている。サイ トカ ィン類ゃ他の細胞外刺激による刺激を受けると、 I cB蛋白質の特定のセリン残基 がリン酸化され、ュビキチン化とそれに続くプロテアソーム経路による I Bの分 解が起こる。 I Bが分解されると NF- A:Bが放出され、 それが核内に移行し特定 の標的遺伝子の転写を刺激する （Thanos,D.， and ManiatisJ. (1995) Cell, 80 , 529-532; Verma, I.M. et al.， (1995) Genes Dev., 9, 2723-2735; Baeuerle, P. A. and Baltimore, D. (1996) Cell, 87, 13-20)。
最近の研究により、 IL- 1シグナル伝達経路がどのようにして制御されているか を説明するモデルが提供されている。 IL- 1の最初のシグナル伝達は、 リガンドに より誘発されるタイプ I受容体（IL-1RI)および受容体アクセサリ一蛋白質（IL-1R AcP)の複合体形成である (Greenfeder,S.A. et al., (1995) J.Biol.Chem., 270 , 13757-13765; Huang, J. et al., (1997) Proc. atl. Acad. Sci. USA, 94, 12829 -12832; Korherr'C. et al., (1997) Eur. J. Immunol. , 7, 262-267; Wesche,H. et al., (1997) J.Biol.Chem., 272, 7727- 7731)。その後、細胞質の骨髄細胞分 化蛋白質 MyD88がこの複合体へと動員され （Cao,Z. et al., (1996) Science, 2 71, 1128-1131; Muzio'M. et al., (1997) Science, 278, 1612-1615; Wesche,
H. et al., (1997) Immunity, 7, 837-847; Burns, K. et al., (1998) J. Biol. C hem., 273, 12203-12209)、 これによりセリン/スレオニン IL-1受容体結合キナ ーゼ（IRAK)の結合が可能になる。 IRAKは高度にリン酸化され、 受容体複合体から 解離し、 IL-1による JNKおよび NF- Bの活性化に必要な TRAF6(TNF受容体結合 因子 6)と相互作用する（Cao，Z. et al., (1996) Nature, 383， 443-446; Yamin, T.T. and Miller, D.K. (1997) J.Biol.Chem" 272, 21540-21547; Lomaga,M.A. et al., (1999) Genes Dev., 13， 1015-1024)。別のセリン/スレオニンキナ一ゼ である NF- ΑΓΒ誘導キナーゼ（NIK)は、 JNKの活性化は起こさないが、 IL- 1応答で の NF-A:B活性化において下流に位置する成分と考えられている （Malinin，N.L. et al., (1997) Nature, 385, 540- 544)。最近になって、 2種の I cBキナーゼ （ IKKひ/ IKK1および IKK 5/IKK2) が、 シグナルにより誘導される ΙΑΓΒ蛋白質のリ ン酸化へ関与していることが示唆された （DiDonato，J.A. et al., (1997) Natur e, 388， 548-554; Mercurio,F. et al., (1997) Science, 278, 860-866; Regni er，C.H. et al., (1997) Cell, 90, 373-383; Woronicz, J.D. et al., (1997) S cience, 278, 866-869; Zandi'E. et al., (1997) Cell, 91， 243-252)。 これら の IKKは大きな複合体の成分であり、 NEMO (NF- B必須モジユレ一夕） /IKKァを 含む (Rothwarf,D.M. et al., (1998) Nature, 395， 297-300; Yamaoka,S. et a
I.， (1998) Cell, 93, 1231-1240)。 本発明者らは最近、 蛋白質キナーゼ TAK1が 、 IL-1シグナル伝達経路に関与していることを明らかにした （Ninomiya- Tsuji，J . et al.3 (1999) Nature, 398， 252-256)。細胞が IL-1に曝されると、 内因性 T AK1が TRAF6複合体に動員され、 そこで活性化される。 活性化された TAK1は、 次 に MAPキナーゼカスケ一ドを刺激し JNK活性化をもたらし、 かつ NIK-IKKカスケ ードを刺激し NF- Bの活性化をもたらす。 従って、 TAK1は、 IL-1で活性化され るシグナル伝達経路において、 TRAF6 の下流に位置している。 このことは、 IL- 1 により誘導される JNKおよび NF-zcBの 2つの活性化経路の分岐が、 TAK1 レベル で生じることを示唆している。
TAK1 は、 当初はトランスフォーミング増殖因子 -/5(TGF- 5)ファミリーリガン ドによって活性化される MAPキナーゼキナーゼキナーゼ（MAPKKK)として同定され た。本発明者らは先に、 TAK1は、 哺乳動物細胞において TGF- ?シグナル伝達経路 において機能することを明らかにしている (Yamaguchi,K. et al.， (1995) Scie nce, 270, 2008-2011; Shibuya,H. et al.， (1996) Science, 272, 1179-1182) 。初期のァフリカツメガエル胚においても、 TAK1は、 同じく TGF-/5フアミリ一リ ガンドである骨形成因子（BMP)によって媒介される中胚葉誘導およびパターン形 成に関与している (Shibuya,H. et al.， （1998) EMBO Jリ 17, 1019-1028; Yama guchi, K. et al.， (1999) EMBO J., 18, 179-187)。 更に、 本発明者らは最近に なって、 TAK1が、 Wntシグナル伝達経路を負に制御している MAPキナーゼ様経路 に関与していることを見出した （Ishitani,T. et al.， (1999) Nature, 399, 79 8-802)。 このように、 TAK1は別々の違った経路を活性化する能力があるという事 実は、 シグナル伝達経路における特異性がどのようにして達成されるかという問 題を新たに生じる。 異なるシグナル伝達経路における特異的成分を同定すること により、様々なことなる刺激に対する反応における TAK1の選択的活性化に関する メカニズムを解明できることが期待される。
MAPKKKには、 Raf フアミ リ -(Raf-1および B - Raf )、 MEKKファミ リ -(MEKKK M EKK2および MEKK3)、 MLKファミリ一 (MLK1、 MLK2 MLK3および DLK)、 更には MTK 1/MEKK4および ASK1を含むいくつかのグループが知られている（Fanger,G.IL et al.， (1997) Curr.Opin. Genet. Dev., 7, 67-74; Robinson, M.J. and Cobb'M.H. , (1997) Curr.Opin.Cell Biol., 9, 180-186)。 MAPKKKの活性化には、 いくつか の異なるメカニズムがあることも報告されている。 MEKK1、 および出芽酵母の MAP KKKである SSK2の活性化には、分子内の反応によって媒介される自己リン酸化が 関与していることが示唆されている (Deak,J.C. and Templeton,D. J. , (1997) B iochem.J., 322, 185-192; Siow .L. et al.， (1997) J.Biol.Chem. , 272, 758 6-7594; PosasJ. and Saito，Hリ (1998) EMBO J., 17, 1385-1394)。 ASK1 およ び MLK3は、上流の刺激に応答して二量体を形成し、 この二量体化がそれらの触媒 活性にとって重要であることが示されている （Gotoh,Y. and Cooper,J.A. (1998 ) J.Biol.Chem., 273, 17477-17482; Leung, I. W. and Lassam,N. (1998) J.Biol .Chem., 273, 32408- 32415)。この二量体化は、受容体チロシンキナーゼの場合と 同様に、 活性化につながる分子内の自己リン酸化を促進するのだと思われる。 一 部のシグナル伝達経路においては、 MAPKKKキナーゼ （MAPKKKK)が MAPKKKの上流 で機能する。 例えば、 出芽酵母の Ste20 MAPKKKKは、 接合フヱロモン経路の Ste 11 MAPKKKの活性化に機能する (Herskowitz,L, (1995) Cell, 80， 187-197)。 同様に Ste20-様キナーゼは、 哺乳動物細胞における MAPKKKの活性化に関わって いることが示唆されている。 Raf-1は、 p21(Rac/Cdc42)活性化キナーゼ（PAK)によ りリン酸化され活性化される (King,A.J. et al.， (1998) Nature, 396， 180-18 3)o胚中心キナーゼ（GCK)は、 TNF-ひシグナル伝達経路において MEKK1で上流に機 能し、 JNKの活性化をもたらす。 しかしながら、 IL- 1が TAK1を活性化する分子メ 力ニズムは、 いまだ解明されていない。 発明の開示
本発明は、 IL- 1のシグナル伝達に関与する新規なシグナル伝達蛋白質を提供す る。 また、 本発明は、 該蛋白質を利用した IL-1のシグナル伝達を阻害する化合物 のスクリーニング方法を提供する。 本発明はまた、 該スクリーニングにより単離 しうる化合物を有効成分として含有す.る IL-1のシグナル伝達阻害剤を提供する。 本発明者らは、 IL-1シグナルがいかにして TAK-1活性化の誘導へと統合される かを解明するため、 TAK1に結合する新規な蛋白因子を見出すべく鋭意研究を行な つた結果、 TAK1と TRAF6とを橋渡しする新規なシグナル伝達分子「TAB2」 を同定 することに成功した。 TAB2の発現は、 IL- 1のシグナル伝達経路の下流に位置する JNKおよび NF- κ Bの活性化を誘導した。また、 TAB2のドミナントネガティブ変異 体は、 IL- 1 によるそれらの活性化を阻害した。 TAB2は、 IL-1刺激により膜から 細胞質へ移行し、 そこで TRAF6と TAK1の IL- 1依存的な結合を媒介した。 さらに 本発明者らは、 IL- 1が TAK1 をその自己リン酸化を通して活性化することを見出 した。
これらの結果は、 TAB2が TAK1および TRAF6を連結するアダプタ一としての役 割を有しており、 IL-1 シグナル伝達経路における TAK1活性化を媒介しているこ とを示している。 このように、 TAB2は IL- 1のシグナルを TAK1に伝達する機能を 有していることから、 TAB2が関連したこのようなシグナル伝達を標的として、 こ れを制御する化合物をスクリーニングすることにより、 IL-1による種々の生体反 応を制御する化合物を単離することが可能になる。
また、 TRAF6は IL- 1のシグナル伝達に加え、 IL-18、 LPSのシグナル伝達にも関 与していることが示されており (Cl inical Immnology, 32(3), 269- 276( 1999))、 T ΑΒ2の阻害剤は、 IL- 1、 IL- 18、 LPSなどの刺激に対する阻害作用により、 炎症や アレルギー性疾患の治療剤になりうる。
特に、 TAB2は IL-1のシグナル伝達は媒介するものの、 TAK1が関与している別 のシグナル伝達経路である TGF- ;5シグナル伝達経路には関与していないと考え られる。 このことから、 TAB2を介したシグナル伝達を制御する化合物を利用すれ ば、 IL-1刺激に応答した生体反応の特異的な制御や IL-1 に関連する疾患の特異 的な治療や予防が可能になると考えられる。 例えば、 TAB2と TAK1や TRAF6 との 結合を阻害する化合物の同定により、 IL- 1シグナル伝達を抑制する阻害剤の開発 のための新たなアプローチが提供される。 これらの阻害剤は、 新規かつ補助的な 役割を果たす新たな抗炎症薬の重要な候補となる。 実際、 本発明者等は、 TAB2の 部分べプチドが、 IL- 1からのシグナル伝達を阻害する活性を有することを見出し た。
本発明は、 以上のような知見に基づいてなされたものであり、 IL-1のシグナル 伝達に関与する新規なシグナル伝達蛋白質 TAB2を提供するものである。また、本 発明は、 TAB2を介した IL- 1のシグナル伝達の阻害剤のスクリーニング方法を提 供する。 本発明は、 さらに、 該スクリーニングにより単離し得る化合物を有効成 分とする IL-1のシグナル伝達阻害剤を提供する。
より具体的には、 本発明は、 下記 1から 2 8に記載の発明を提供するものであ る。
1 . AK1および TRAF6に結合する活性を有する蛋白質またはべプチドをコ一ド する、 下記 （a ) から （e ) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする MA。
( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる MAとハイブリダイズする DNA。
( d ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコー ドする腿。
( e ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコー ドする DNAo
2 . IL-1刺激に応答してシグナル伝達を行なう活性を有する蛋白質またはぺプ チドをコードする、 下記 （a ) から （e ) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする MA。
( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとハイブリダイズする DNA。 (d) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコ一 ドする DNA。
(e) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコー ドする DNA。
3. TAK1または TRAF6に結合する活性を有する蛋白質またはべプチドをコ一ド する、 下記 （a) または （b) に記載の DNA。
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸 が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコ ードする DNA。
(b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコ —ドする DNA。
4. IL-1刺激に応答したシグナル伝達を阻害する活性を有する蛋白質またはべ プチドをコードする、 下記 （a) または （b) に記載の DNA。
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸 が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコ —ドする DNA。
(b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコ —ドする DNA。
5. ( 1) から （4) のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質また はべプチド。
6. ( 1) から （4) のいずれかに記載の DNAが挿入されたべクタ一。
7. (6) に記載のベクターを保持する宿主細胞。
8. (7) に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から発 現させた蛋白質またはべプチドを回収する工程を含む、 （5)に記載の蛋白質また はべプチドの製造方法。 9. (5) に記載の蛋白質またはペプチドに結合する抗体。
10. 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖に相補的 な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
1 1. IL-1のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
(a)被検試料の存在下、 （1) または （3) に記載の DNAによりコードされる蛋 白質またはべプチドと TAK1蛋白質および/または TRAF6蛋白質とを接触させるェ 程、
(b) ( 1) または（3)に記載の DNAによりコードされる蛋白質またはペプチド と TAK1蛋白質および または TRAF6蛋白質との結合を検出する工程、 および
(c) 該結合を阻害する活性を有する化合物を選択する工程、 を含む方法。
12. 工程（b) における検出が免疫沈降法により行なわれる、 （ 10)に記載 の方法。
13. IL-1のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
( a)被検試料の存在下、 （ 2 )に記載の DNAによりコ一ドされる蛋白質を発現す る哺乳動物細胞に、 IL-1を接触させる工程、
(b) (2)に記載の DNAによりコードされる蛋白質を介して伝達される生物学的 活性を検出する工程、 および
(c) 該生物学的活性を減少させる化合物を選択する工程、 を含む方法。
14. 生物学的活性が TAK1の活性化である、 （ 13) に記載の方法。
15. TAK1の活性化を MKK6のリン酸化により検出する、 （ 14) に記載の方法。
16. 生物学的活性が NF- Bの活性化である、 （ 13) に記載の方法。
17.Ig- プロモーターの下流に結合したレポ一夕一遺伝子を含むベクタ一を細 胞内に導入し、 該細胞内におけるレポ一夕一遺伝子の発現を検出することにより 、 NF- Bの活性化を検出する、 （ 16) に記載の方法。
18. 生物学的活性が JMの活性化である、 （ 13) に記載の方法。
19. JNKの活性化を Junのリン酸化により検出する、 （ 18) に記載の方法。 20. 生物学的活性が （2) に記載の MAによりコードされる蛋白質の細胞膜か ら細胞質への移行である、 （ 13) に記載の方法。
2 1. 生物学的活性が TAK1の自己リン酸化である、 （ 13) に記載の方法。
22. (2)に記載の DNAを発現するベクターが導入された哺乳動物細胞を用いる
、 （ 13) から （2 1) のいずれかに記載の方法。
23. ( 1 1) から （22) に記載の方法により単離しうる化合物を有効成分 とする、 IL- 1のシグナル伝達の阻害剤。
24. ( 1) に記載の DNA によりコードされる蛋白質またはペプチドと TAK1 蛋白質および/または TRAF6蛋白質との結合を阻害する化合物を有効成分とする 、 IL-1のシグナル伝達の阻害剤。
25. (4) に記載の DNAまたは該 DNAによりコードされる蛋白質若しくはべ プチドを有効成分とする、 IL- 1、 IL-18、 または LPSのシグナル伝達の阻害剤。 26. 化合物が TAB2- Nまたは TAB2- Cである、 （25) に記載の IL-1、 IL- 18、 または LPSのシグナル伝達の阻害剤。
27. 炎症が関与する疾病または傷害を予防または治療するために用いられる 、 (23) から （26) のいずれかに記載の IL- 1、 IL- 18、 または LPSのシグナル 伝達の阻害剤。
28. ( 1 1 ) または （ 12) に記載の方法により単離しうる TAB2阻害剤を有 効成分とする、 抗炎症剤または抗アレルギー剤。
なお、 本発明において 「ペプチド」 とは、 アミノ酸同士がペプチド結合により 結合した化合物を指す。 従って、 アミノ酸が長鎖の、 いわゆるポリペプチドゃ蛋 白質もまた本発明のぺプチドに含まれる。
本発明は、 IL- 1のシグナル伝達に関与する新規なシグナル伝達蛋白質をコ一ド する DNAを提供する。 本発明者らにより単離されたヒト TAB2の cDNAの塩基配列 を配列番号： 1に、該 cDNAによりコードされる蛋白質のァミノ酸配列を配列番号 ： 2に示す。該蛋白質は、 TRAF6と TAK1を橋渡しするアダプタ一分子として機能 し、 炎症性サイ トカインである IL-1のシグナルを伝達する。
単離されたヒト TAB2遺伝子は 693アミノ酸の蛋白質をコードしており、 C末付 近に両親媒性のひヘリックスを形成すると予想される構造を有する以外は、 既知 の蛋白質と有意な相同性は見出されない。 TAB2蛋白質は TRAF6および TAK1の両 者に同時に結合する活性を有しており、 この複合体形成により TRAF6のシグナル が TAK1 に伝達され、 TAK1の自己リン酸化とキナーゼ活性の活性化が起こること が示された。 さらに、 TAB2の発現は、 IL-1シグナル伝達の下流に位置することが 知られている NF- Bおよび JMの活性化を誘導した。 また、 TAB2のドミナント ネガティブ変異体は、 TAB2におけるシグナル伝達を阻害する分子として働き、 IL - 1によるシグナル伝達を阻害することが判明した。これらの結果は、 IL-1のシグ ナル伝達において、 TAB2が TRAF6 と TAK1のアダプタ一分子として機能している ことを示している。
特に、 TAB2は IL- 1のシグナル伝達は媒介するものの、 TAK1が関与している別 のシグナル伝達経路である TGF- ?シグナル伝達経路には関与していないと考え られるため、 IL- 1のシグナル伝達に特異的な阻害剤の開発のための標的分子とし て重要であり、 このような阻害剤は新たな抗炎症剤の開発のための重要な候補で ある。 TAB2におけるシグナル伝達を阻害する分子は、 炎症が関与するさまざまな 疾病や傷害の予防または治療への応用が期待される。
本発明は、 また、 ヒト TAB2蛋白質 （配列番号： 2 ) と機能的に同等な蛋白質 （ またはペプチド） を包含する。 このような蛋白質には、 例えば、 ヒト 「TAB2」 蛋 白質に対応する他の生物由来のホモログ蛋白質ゃヒト TAB2 蛋白質の変異体が含 まれる。 本発明において 「機能的に同等」 とは、 対象となる蛋白質が、 TRAF6 お よび TAK1に結合活性を有し、 IL1刺激に応答したシグナル伝達において、 これら 蛋白質のアダプター分子として機能することを指す。
ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製するための、 当業者によく知られた 方法としては、 蛋白質に変異を導入する方法が知られている。 例えば、 当業者で あれば、 部位特異的変異誘発法 (Hashimoto-Gotoh, T. et al . ( 1995 ) Gene 152 , 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. ( 1983) Methods Enzymol . 100, 468-500 、 Kramer, W. et al . ( 1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、 Kramer W， a nd Fritz HJ( 1987) Methods. Enzymol . 154, 350-367、 Kunkel ,TA( 1985 ) Proc N atl Acad Sci U S A. 82, 488-492、 Kunkel ( 1988) Methods Enzymol . 85， 2763 -2766) などを用いて、 ヒト 「TAB2」蛋白質 （配列番号： 2 ) のアミノ酸に適宜変 異を導入することにより、 該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製することがで きる。 また、 アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。 このように、 ヒト 「T AB2j蛋白質（配列番号： 2 )のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸 が変異したアミノ酸配列を有し、 該蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明 の蛋白質に含まれる。 このような変異体における、 変異するアミノ酸数は、 通常 、 100アミノ酸以内であり、 好ましくは、 50アミノ酸以内であり、 さらに好まし くは 20アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 10アミノ酸以内であり、 さらに 好ましくは 5アミノ酸以内、 さらに好ましくは 3アミノ酸以内であると考えられ る 。
変異するアミノ酸残基においては、 アミノ酸側鎖の性質が保存されている別の アミノ酸に変異されることが望ましい。 例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎 水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Ys V)、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 C、 E 、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、 脂肪族側鎖を有するアミノ酸 （G、 A、 V、 L、 I、 P)、 水酸 基含有側鎖を有するアミノ酸（S、 Τ、 Υ)、 硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 （C 、 M カルボン酸及びアミ ド含有側鎖を有するアミノ酸 （D、 N、 E、 Q)、 塩基含有 側鎖を有するアミノ離 （ K、 Η)、 芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 （H、 F、 Y 、 W) を挙げることができる （括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。 あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、 付加及び/又 は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその 生物学的活性を維持することはすでに知られている （Mark, D. F . et al . , Proc . Natl . Acad. Sci . USA ( 1984) 81， 5662-5666 、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research ( 1982) 10, 6487-6500 、 Wang, A. et al . , Science 2 24, 1431-1433 、 Dalbadie-McFarland, G. et al . , Proc . Natl . Acad. Sci. US A ( 1982) 79, 6409-6413 )。
ヒト 「TAB2」 蛋白質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された蛋白 質には、 ヒト 「TAB2」 蛋白質を含む融合蛋白質が含まれる。 融合蛋白質は、 ヒト 「TAB2」 蛋白質と他のペプチド又は蛋白質とが融合したものであり、 本発明に含 まれる。 融合蛋白質を作製する方法は、 ヒト 「TAB2」 蛋白質 （配列番号： 2 ) を コードする DNAと他のぺプチド又は蛋白質をコ一ドする DNAをフレームが一致す るように連結してこれを発現ベクターに導入し、 宿主で発現させればよく、 当業 者に公知の手法を用いることができる。 本発明の蛋白質との融合に付される他の ペプチド又は蛋白質としては、 特に限定されない。
本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチドとしては、 例えば、 FLAG (Ho pp, T. P. et al . , BioTechnology ( 1988) 6， 1204-1210 )、 6 個の His (ヒス チジン） 残基からなる 6 xHis、 lO x HiSs インフルエンザ凝集素 （HA)、 ヒ ト c- m yc の断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7-tag、 HSV-tag 、 E-tag 、 SV40T 抗原の断片、 lck tag 、 ひ- tubulinの断片、 B-tag 、 Protein C の断片等の公知 のペプチドを使用することができる。 また、 本発明の蛋白質との融合に付される 他の蛋白質としては、 例えば、 GST (グル夕チオン一 S—トランスフェラ一ゼ）、 H A (インフルエンザ凝集素）、 ィムノグロブリン定常領域、 ガラクトシダーゼ s MBP (マルト一ス結合蛋白質） 等が挙げられる。
市販されているこれらべプチドまたは蛋白質をコードする DNAを本発明の蛋白 質をコードする DNAと融合させ、 これにより調製された融合 DNAを発現させるこ とにより、 融合蛋白質を調製することができる。
また、 ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製する当業者によく知られた他 の方法としては、 ハイブリダィゼ一シヨン技術 （Sambrook，J et al . , Molecular Cloning 2nd ed.， 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989) を利用 する方法が挙げられる。 即ち、 当業者であれば、 ヒト 「TAB2」 蛋白質をコードす る DNA配列 （配列番号： 1 ) もしくはその一部を基に、 これと相同性の高い DNA を単離して、 該 DNAからヒト 「TAB2」 蛋白質と機能的に同等な蛋白質を単離する ことも通常行いうることである。 このように、 ヒト 「TAB2」 蛋白質をコードする DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAがコードする蛋白質 であって、 ヒト 「TAB2」 蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明の蛋白質に 含まれる。 このような蛋白質としては、 例えば、 ヒト以外の哺乳動物のホモログ
(例えば、 マウス、 サル、 ラット、 ゥサギ、 ゥシ、 ブ夕、 ィヌ、 ネコの遺伝子が コードする蛋白質が挙げられる。 ヒト 「TAB2」 蛋白質をコードする DNAと相同性 の高い cDNAを、 動物から単離する場合、 例えば、 脾臓、 胸腺、 心臓、 卵巣、 精巣 、 腎臓、 肝臓などの組織） を用いることが好ましいと考えられる。
ヒト 「TAB2」 蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする DNAを単離するため のハイブリダイゼ一ションの条件としては、 当業者であれば適宜選択することが できる。 ハイブリダィゼーシヨンの条件は、 例えば低ストリンジェン卜な条件が 挙げられる。 低ストリンジエンシーな条件としては、 例えば 42°C、 5 X SSC 、 0.1 。 sodium dodecyl sulfate, 50°ホルムアミ ドにより与えられる洗浄条件である。 より好ましくは、 高ストリンジエンシーな条件である。 高ストリンジエンシーな 条件としては、 例えば 60°C、 0.1 SSCs 0. 1¾ sodium dodecyl sulfateにより与 えられる洗浄条件である。 ある蛋白質をコードする塩基配列に対し、 適度なスト リンジエンシー条件でハイブリダィズする DNAがコードする蛋白質がその蛋白質 と同じ生物学的活性を有することはすでに知られている。 これらの条件において 、 温度を上げる程に高い相同性を有する DNAを得ることができる。 但し、 ハイブ リダィゼ—シヨンのストリンジエンシーに影響する要素としては温度や塩濃度な ど複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様 のストリンジエンシーを実現することが可能である。 また、 ハイブリダィゼーシヨンにかえて、 ヒト 「TAB2」蛋白質をコードする DN A (配列番号： 1 ) の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、 例えば、 ポリメラ一ゼ連鎖反応 （PCR) 法を利用して、 ヒト 「TAB2」蛋白質と機能 的に同等な蛋白質をコ一ドする DNAを単離することも可能である。
これらハイプリダイゼーシヨン技術や遺伝子増幅技術により単離される DNAが コードする、 ヒト 「TAB2」 蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、 通常、 ヒト 「TAB2 」 蛋白質 （配列番号： 2 ) とアミノ酸配列において高い相同性を有する。 本発明 の蛋白質には、 ヒト 「TAB2」 蛋白質と機能的に同等であり、 かつ配列番号： 2に 示されるアミノ酸配列と高い相同性を有する蛋白質も含まれる。 高い相同性とは 、 通常、 60%以上、 好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 さらに好 ましくは 95 %以上 （例えば、 98%以上） の配列の同一性を指す。 蛋白質の相同性 を決定するには、 文献 （Wi lbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc . Natl . Acad. Sci . USA ( 1983 ) 80, 726-730) に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
また、 本発明には、 TRAF6および TAK1に結合活性を有するが、 IL1刺激に応答 したシグナル伝達を阻害する活性を有する、 TAB2蛋白質の変異体や部分べプチド が含まれる。 このようなペプチドとしては、 例えば、 TAB2蛋白質の N末端側のぺ プチドが挙げられる （実施例 2参照）。 また、 本発明には、 TRAF6 と TAK1のいず れか一方に結合する活性を有する、 TAB2蛋白質の変異体や部分べプチドが含まれ る。 これら蛋白質やペプチドは、 内因性の TAB2蛋白質と競合し、 IL1刺激に応答 したシグナル伝達を阻害する活性を有しうる。 また、 本発明には、 TRAF6と TAK1 のいずれにも結合せず、 かつ、 IL1 刺激に応答したシグナル伝達を阻害する活性 を有する、 TAB2蛋白質の変異体や部分ペプチドが含まれる。 これら蛋白質やべプ チドは、 炎症に関連した疾患の治療や予防のための薬剤の重要な候補である。 本発明の蛋白質は、 後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法によ り、 アミノ酸配列、 分子量、 等電点又は糖鎖の有無や糖鎖付加の位置、 糖鎖の構 造、 リン酸化状態及び/又はジスルフイ ド結合の有無などが異なり得る。 しかし ながら、 得られた蛋白質が、 ヒト 「TAB2」 蛋白質と同等の機能を有している限り 、 本発明に含まれる。 例えば、 本発明の蛋白質を原核細胞、 例えば大腸菌で発現 させた場合、 本来の蛋白質のアミノ酸配列の N末端にメチォニン残基が付加され るが、 本発明はこのような蛋白質をも包含する。
本発明の蛋白質は、 当業者に公知の方法により、 組み換え蛋白質として、 また 天然の蛋白質として調製することが可能である。 組み換え蛋白質であれば、 本発 明の蛋白質をコードする DNA (例えば配列番号： 1に記載の塩基配列を有する DNA )を、適当な発現ベクターに組み込み、 これを適当な宿主細胞に導入して得た形質 転換体を回収し、 抽出物を得た後、 イオン交換、 逆相、 ゲル濾過などのクロマト グラフィー、 あるいは本発明の蛋白質に対する抗体をカラムに固定したァフィ二 ティ一クロマトグラフィーにかけることにより、 または、 さらにこれらのカラム を複数組み合わせることにより精製し、 調製することが可能である。
また、 本発明の蛋白質をグル夕チオン S トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋 白質として、 あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換え蛋白質として宿主細 胞 （例えば、 動物細胞や大腸菌など） 内で発現させた場合には、 発現させた組み 換え蛋白質はグル夕チオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製すること ができる。
融合蛋白質の精製後、 必要に応じて融合蛋白質のうち、 目的の蛋白質以外の領 域を、 トロンビンまたはファクター Xaなどにより切断し、 除去することも可能で ある。
天然の蛋白質であれば、 当業者に周知の方法、 例えば、 本発明の蛋白質を発現 している組織や細胞の抽出物に対し、 後述する本発明の蛋白質に結合する抗体が 結合したァフィ二ティ一カラムを作用させて精製することにより単離することが できる。 抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよ レ
本 ¾明は、 また、 本発明の蛋白質の部分ペプチドを包含する。 本発明の部分べ プチドは、 少なくとも 7アミノ酸以上、 好ましくは 8アミノ酸以上、 さらに好ま しくは 9アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。 該部分ペプチドは、 上記したよ うに IL- 1のシグナル伝達の阻害剤としての利用の他、例えば、本発明の蛋白質に 対する抗体の作製、本発明の蛋白質と TAK1や TRAF6との結合の阻害剤のスクリ一 ニングなどへの利用が考えられる。 本発明の部分ペプチドは、 遺伝子工学的手法 、 公知のペプチド合成法、 あるいは本発明の蛋白質を適切なぺプチダ一ゼで切断 することによって製造することができる。 ペプチドの合成は、 例えば、 固相合成 法、 液相合成法のいずれによってもよい。
本発明の蛋白質をコードする DNAは、 上述したような本発明の蛋白質の in vi vo や in vitro における生産に利用される他、例えば、本発明の蛋白質をコード する遺伝子の異常に起因する疾患や本発明の蛋白質により治療可能な疾患の遺伝 子治療などへの応用も考えられる。 本発明の DNAは、 本発明の蛋白質をコードし うるものであればいかなる形態でもよい。 即ち、 mRNAから合成された cDNAであ るか、 ゲノム MAであるか、 化学合成 DNAであるかなどを問わない。 また、 本発 明の蛋白質をコードしうる限り、 遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有す る DNAが含まれる。
本発明の MAは、 当業者に公知の方法により調製することができる。 例えば、 本発明の蛋白質を発現している細胞より cDNAライブラリーを作製し、本発明の D NAの配列 （例えば、 配列番号： 1 ) の一部をプローブにしてハイブリダィゼ一シ ヨンを行うことにより調製できる。 cDNAライブラリ一は、 例えば Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989)に言己 載の方法により調製してもよいし、 市販の DNAライブラリ一を用いてもよい。 ま た、 本発明の蛋白質を発現している細胞より RNAを調製し、 逆転写酵素により cD NAを合成した後、 本発明の DNAの配列 （例えば、 配列番号： 1 ) に基づいてオリ ゴ DNAを合成し、 これをプライマ一として用いて PCR反応を行い、 本発明の蛋白 質をコードする cDNAを増幅させることにより調製することも可能である。 また、得られた cDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳 領域を決定でき、 本発明の蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。 また、 得 られた cDNAをプローブとしてゲノム DNA ライブラリ一をスクリ一ニングするこ とにより、 ゲノム DNAを単離することができる。
具体的には、 次のようにすればよい。 まず、 本発明の蛋白質を発現する細胞、 組織、 臓器 (例えば、 白血球等の血球細胞、 あるいは脾臓、 肝臓、 腎臓などの組織 ) から、 mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠 心法（Chirgwin, J. M. et al. , Biochemistry ( 1979) 18， 5294-5299 )、 AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N.， Anal. Biochem. ( 1987) 162， 156-159) 等 により全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia) 等を使用して全 RN Aから mRNAを精製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) を用いることにより mRNAを直接調製することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 層 Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業） 等を 用いて行うこともできる。 また、 本明細書に記載されたプライマー等を用いて、 M arathon DNA Amplification Kit (Clontech製）およびポリメラ一ゼ連鎖反応 （p olymerase chain reaction ； PCR) を用いた 5' - RACE法 (Frohman, M. A. et al. ， Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A. ( 1988) 85， 8998-9002 ； Belyavsky, A. et al . , Nucleic Acids Res. ( 1989) 17， 2919-2932) にしたがい、 cDNAの合成およ び増幅を行うことができる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を調製し、 ベクター DNAと連結する 。 さらに、 これより組換えべクタ一を作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選 択して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、 公知の 方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェイン夕一ミネ一シヨン法により確認 することができる。
また、 本発明の DNAにおいては、 発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮 して、 より発現効率の高い塩基配列を設計することができる （Grantham, R. et al .， Nucel ic Ac ids Research ( 1981 ) 9， r43-74 )。 また、 本発明の MAは、 巿 販のキットや公知の方法によって改変することができる。 改変としては、 例えば 、 制限酵素による消化、 合成オリゴヌクレオチドや適当な DNAフラグメントの揷 入、 リンカ一の付加、 開始.コドン （ATG)及び/又は終止コドン （TAA、 TGA、 又は TAG) の挿入等が挙げられる。
本発明の DNAは、 具体的には、 配列番号： 1の塩基配列において 81位の塩基 A から 2159位の塩基 Cからなる DNAを包含する。
本発明の DNAはまた、 配列番号： 1に示す塩基配列からなる DMとハイプリダ ィズする DNAであり、 且つ上記本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコード する DNAを含む。 ハイブリダィゼ一シヨンにおける条件は、 当業者であれば適宜 選択することができるが、 具体的には上記した条件を用いることができる。 これ らの条件において、 温度を上げる程に高い相同性を有する DNAを得ることができ る。 上記のハイブリダィズする DNAは、 好ましくは天然由来の DNA、 例えば cDNA 又は染色体 DNAである。
本発明は、 また、 本発明の DNAが挿入されたベクターを提供する。 本発明のベ クタ一としては、 宿主細胞内において本発明の DNAを保持したり、 本発明の蛋白 質を発現させるために有用である。
ベクタ一としては、 例えば、 大腸菌を宿主とする場合には、 ベクターを大腸菌 (例えば、 扁9、 DH5ひ、 隱 1、 XLlBlue) などで大量に増幅させ大量調製する ために「ori」 をもち、 さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、 なん らかの薬剤 （アンピシリンやテトラサイクリン、 カナマイシン、 クロラムフエ二 コール） により判別できるような薬剤耐性遺伝子） を有すれば特に制限はない。 ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript 、 pCR-Scriptなどが挙げられる。 また、 cDNAのサブクロ一ニング、 切り出しを目 的とした場合、 上記ベクターの他に、 例えば、 pGEM- T、 pDIRECT, pT7などが挙げ られる。 本発明の蛋白質を生産する目的においてべクタ一を使用する場合には、 特に、 発現ベクターが有用である。 発現べクタ一としては、 例えば、 大腸菌での 発現を目的とした場合は、 べク夕一が大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つ ほかに、 宿主を JM109、 DH5ひ、 HB10K XU- Blueなどの大腸菌とした場合におい ては、 大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、 例えば、 lacZプロモー 夕一 (Ward ら， Nature ( 1989) 341, 544-546； FASEB J. ( 1992) 6， 2422-2427) 、 araBプロモーター （Betterら， Science ( 1988) 240, 1041-1043 )、 または T7 プロモーターなどを持っていることが不可欠である。 このようなベクターとして は、 上記ベクターの他に PGEX-5X- 1 (Pharmacia社製）、 「QIAexpress systemj (Q iagen社製)、 pEGFP、 または pET (この場合、 宿主は T7 RNAポリメラ一ゼを発現し ている BL21が好ましい）などが挙げられる。
また、 ベクタ一には、 ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていて もよい。 蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズムに産 生させる場合、 pelBシグナル配列 (Lei, S. P. et al J. Bacteriol . ( 1987) 16 9， 4379 ) を使用すればよい。 宿主細胞へのベクタ一の導入は、 例えば塩化カル シゥム法、 エレクトロポレーシヨン法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、 例えば、 本発明の蛋白質を製造するためのベクタ一としては 、 哺乳動物由来の発現ベクター (例えば、 pcDNA3 ( Invitrogen社製) や、 pEF-BO S (Nucleic Acids. Res.1990, 18( 17) , p5322), pEF 、 pCDM8 )、 昆虫細胞由来の 発現べクタ一 (例えば 「Bac - to - BAC baculovairus expression systemj (GIBC0 BRL社製)、 PBacPAK8)、 植物由来の発現ベクター （例えば ρΜΗ1、 pMH2)、 動物ウイ ルス由来の発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw )、 レトロウィルス由来 の発現べクタ一 （例えば、 pZIPneo)、 酵母由来の発現べクタ一 （例えば、 「Pichi a Expression Kitj ( In vitrogen 社製）、 pNVll 、 SP-Q01), 枯草菌由来の発現 ベクタ一 （例えば、 pPL608、 pKTH50) が挙げられる。
CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、 細胞内で発現させるために必要なプロモーター、 例えば SV40プロモーター （M ull iganら， Nature ( 1979 ) 277, 108)、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1ひプロモー 夕一 （Mizushimaら， Nucleic Acids Res. ( 1990) 18, 5322)、 CMVプロモーター などを持っていることが不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための遺伝 子 （例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など） により判別できるような薬剤耐性 遺伝子） を有すればさらに好ましい。 このような特性を有するベクターとしては 、 例えば、 p匪、 pDR2、 pBK-RSV, pBK- CMV、 pOPRSV、 p0P13などが挙げられる。 さらに、 遺伝子を安定的に発現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の増 幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する DH FR遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メ トトレキセート (MTX)により増幅させる方法が挙げられ、 また、遺伝子の一過性の発現を目的と する場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点を持つベクタ一 （pcDなど） で形質転換する方法が挙げられる。 複製開始点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ口 一マウィルス （BPV)等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞系 で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べクタ一は選択マーカ一として、 アミノグリ コシドトランスフェラ一ゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸 菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラ一ゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジ ヒドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の DNA を適当なベクターに組み込み、 例えば、 レトロウイルス法、 リボソーム法、 カチ ォニックリボソーム法、 アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法など が挙げられる。 これにより、 本発明の 「YS68」 遺伝子の変異に起因する疾患に対 する遺伝子治療を行うことが可能である。 用いられるベクターとしては、 例えば 、 アデノウイルスベクター （例えば pAdexlcw) やレトロウイルスベクター（例え ば pZ IPneo) などが挙げられるが、 これらに制限されない。 ベクタ一への本発明 の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、 常法に従って行うことが可能である (Molecular Cloning ，5.6卜 5.63)。 生体内への投与は、 ex vivo 法であっても、 in vivo法であってもよい。
また、 本発明は、 本発明のベクターが導入された宿主細胞に関する。 本発明の ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 例えば、 大腸菌や種々 の動物細胞などを用いることが可能である。 本発明の宿主細胞は、 例えば、 本発 明の蛋白質の製造や発現のための産生系として使用することができる。 蛋白質製 造のための産生系は、 in vitroおよび in vivo の産生系がある。 in vitroの産 生系としては、 真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げら れる。
真核細胞を使用する場合、 例えば、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を宿主に用 いることができる。 動物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J. Exp. Med . ( 1995) 108， 945)、 COS、 3T3、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney )、 H eLa、 Vero、 両生類細胞、 例えばアフリカッメガエル卵母細胞 （Val le， et al .， Nature ( 1981 ) 291， 358-340 )、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 Sf9 、 Sf21、 Tn5 が知られている。 CHO 細胞としては、 特に、 DHFR遺伝子を欠損した CH0 細胞であ る dhfr-CHO (Pro Natl . Acad. Sci . USA ( 1980 ) 77, 4216-4220 ) や CHO K-l
(Proc. Natl . Acad. Sci . USA ( 1968) 60, 1275)を好適に使用することができ る。 動物細胞において、 大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい 。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキスト ラン法、 カチォニックリボソーム D0TAP (ベーリンガーマンハイム社製） を用い た方法、 エレク ト口ポーレーシヨン法、 リボフヱクシヨンなどの方法で行うこと が可能である。
植物細胞としては、 例えば、 ニコチアナ ·夕バカム （Nicotiana tabacum ) 由 来の細胞が蛋白質生産系として知られており、 これをカルス培養すればよい。 真 菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス （Saccharomyces ) 属、 例えば 、 サッカロミセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae )、 糸状菌、 例えば 、 ァスペルギルス （Aspergillus ) 属、 例えば、 ァスペルギルス '二ガー （Aspe rgi llus niger ) が知られている。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌細胞としては 、 大腸菌 （E. coli )、 例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB101 等が挙げられ、 その他、 枯 草菌が知られている。
これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、形質転換された細胞を in V itroで培養することにより蛋白質が得られる。培養は、 公知の方法に従い行うこ とができる。 例えば、 動物細胞の培養液として、 例えば、 DMEM、 MEM、 RPMI1640 、 IMDM を使用することができる。 その際、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併 用することもできるし、 無血清培養してもよい。 培養時の pHは、 約 6〜8である のが好ましい。 培養は、 通常、 約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、 必要に応じて 培地の交換、 通気、 攪拌を加える。
一方、 in vivo で蛋白質を産生させる系としては、 例えば、 動物を使用する産 生系や植物を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に目的とする DNA を導入し、 動物又は植物の体内で蛋白質を産生させ、 回収する。 本発明にお ける 「宿主」 とは、 これらの動物、 植物を包含する。
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用いることができる （Vicki Glas er, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993 )。また、哺乳類動物を用いる 場合、 トランスジエニック動物を用いることができる。
例えば、 目的とする DNAを、 ャギ カゼインのような乳汁中に固有に産生され る蛋白質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。 次いで、 この融合 遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ移植する。 胚を 受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁 から、 目的の蛋白質を得ることができる。 トランスジエニックャギから産生され る蛋白質を含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンをトランスジヱニック ャギに使用してもよい (Ebert, K.M. et al .， Bio/Technology ( 1994) 12, 699- 702 ) o
また、 昆虫としては、 例えばカイコを用いることができる。 カイコを用いる場 合、 目的の蛋白質をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染 させることにより、 このカイコの体液から目的の蛋白質を得ることができる （Su sumu, M. et al .， Nature ( 1985 ) 315, 592-594 )。
さらに、 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。 タバコを 用いる場合、 目的とする蛋白質をコードする DNAを植物発現用ベクター、 例えば MON 530に挿入し、 このべクタ一をァグロバクテリゥム 'ッメファシエンス （Ag robacterium tumefaciens ) のようなバクテリアに導入する。 このバクテリアを タバコ、 例えば、 ニコチアナ ·夕バカム （Nicotiana tabacum ) に感染させ、 本 タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる （Jul ian K. -C. Ma et a 1リ Eur. J. Immunol . ( 1994) 24, 13卜 138)。
これにより得られた本発明の蛋白質は、 宿主細胞内または細胞外 （培地など） から単離し、 実質的に純粋で均一な蛋白質として精製することができる。 蛋白質 の分離、 精製は、 通常の蛋白質の精製で使用されている分離、 精製方法を使用す ればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマトグラフィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留、 免疫沈降、 SDS-ポリ アクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再結晶等を適宜選択、 組み合わせれば蛋白質を分離、 精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、 ィ オン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆相クロ マトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる （Strategies for Pro tein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual . Ed D aniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これ らのクロマトグラフィーは、 液相クロマトグラフィー、 例えば HPLC、 FPLC等の液 相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 本発明は、 これらの精製方法 を用い、 高度に精製された蛋白質も包含する。
なお、 蛋白質を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることに より、 任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。 蛋白質 修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリプシン、 リシルェンドぺプチ ダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明は、 また、 本発明の蛋白質と結合する抗体を提供する。 本発明の抗体の 形態には、 特に制限はなく、 ポリクローナル抗体の他、 モノクローナル抗体も含 まれる。 また、 ゥサギなどの免疫動物に本発明の蛋白質を免疫して得た抗血清、 すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、 さらにヒト抗 体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明の蛋白質は、 その由来となる動物 種に制限されないが哺乳動物、 例えばヒト、 マウス又はラッ ト由来の蛋白質が好 ましく、 特にヒ卜由来の蛋白質が好ましい。 ヒト由来の蛋白質は、 本明細書に開 示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、 感作抗原として使用される蛋白質は、 完全な蛋白質であって もよいし、 また、 蛋白質の部分ペプチドであってもよい。 蛋白質の部分ペプチド としては、 例えば、 蛋 S質のアミノ基 （N) 末端断片やカルボキシ （C) 末端断片 が挙げられる。 本明細書で述べる 「抗体」 とは蛋白質の全長又は断片に反応する 抗体を意味する。
本発明の蛋白質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現べクタ一系に挿 入し、 該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、 該宿主細胞内外 から目的の蛋白質又はその断片を公知の方法で得て、 これらを感作抗原として用 いればよい。 また、 蛋白質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成 した本発明の蛋白質を感作抗原として使用してもよい。 短いペプチドは、 キーホ —ルリンペッ トへモシァニン、 ゥシ血清アルブミン、 卵白アルブミンなどのキヤ リァ蛋白質と適宜結合させて抗原とすることが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に は、 げっ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター等が使用され る。 ゥサギ目の動物としては、 例えば、 ゥサギが使用される。 霊長目の動物とし ては、 例えば、 サルが使用される。 サルとしては、 狭鼻下目のサル （旧世界ザル )、 例えば、 力二クイザル、 ァカゲザル、 マントヒヒ、 チンパンジー等が使用され る。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 一般的方 法としては、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。 具体的には、 感 作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Sal ine) や生理食塩水等で適当量に希釈、懸 濁したものに対し、 所望により通常のアジュバント、 例えば、 フロイント完全ァ ジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に投与する。 さらに、 その後、 フロ イント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、 4〜21 日毎に数回投与す ることが好ましい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる 。 このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認 する。
ここで、 本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体を得るには、 血清中の所 望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、 抗原を感作した哺乳動物の血液を 取り出す。 この血液から公知の方法により血清を分離する。 ポリクロ一ナル抗体 としては、 ポリクロ一ナル抗体を含む血清を使用してもよいし、 必要に応じこの 血清からポリクロ一ナル抗体を含む画分をさらに単離して、 これを使用してもよ い。 例えば、 本発明の蛋白質をカップリングさせたァフィ二ティーカラムを用い て、 本発明の蛋白質のみを認識する画分を得て、 さらにこの画分をプロテイン A あるいはプロティン Gカラムを利用して精製することにより、 免疫グロプリン G あるいは Mを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望 の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物から免疫細胞を取り出し、 細胞融合に付せばよい。 この際、 細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として 、 特に脾細胞が挙げられる。 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、 好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、 より好ましくは、 薬剤による融合細胞選 別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、 例えば、 ミルスティンらの方法（Galfre, G. and Milstein, C , Methods Enzymol . ( 1981 ) 73, 3-46 ) 等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養 することにより選択される。 当該 HAT培養液での培養は、 目的とするハイブリ ド 一マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間、 通常、 数日〜数週間 継続して行う。 次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生する ハイプリ ドーマのスクリ一ニングおよびクローニングを行う。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得る他に、 ヒト リンパ球、 例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroで蛋白質、 蛋 白質発現細胞又はその溶解物で感作し、 感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を 有するミエローマ細胞、例えば U266と融合させ、蛋白質への結合活性を有する所 望のヒト抗体を産生するハイブリ ド一マを得ることもできる （特開昭 63-17688 号公報)。
次いで、 得られたハイプリ ドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水 を回収し、 得られたモノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロティン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明の蛋白質を力 ップリングしたァフィ二ティ一カラムなどにより精製することで調製することが 可能である。 本発明の抗体は、 本発明の蛋白質の精製、 検出に用いられる他、 本 発明の蛋白質のァゴニストやアン夕ゴニストの候補になる。 また、 この抗体を本 発明の蛋白質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。 得られた 抗体を人体に投与する目的 （抗体治療） で使用する場合には、 免疫原性を低下さ せるため、 ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、 ヒト抗体遺伝子のレバートリーを有するトランスジエニック動物に抗 原となる蛋白質、 蛋白質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得 し、 これをミエローマ細胞と融合させたハイプリ ドーマを用いて蛋白質に対する ヒト抗体を取得することができる （国際公開番号 W092-03918、 W093- 2227、 W094- 02602、 W094- 25585、 W096- 33735および W096- 34096参照）。
ハイプリ ドーマを用いて抗体を産生する以外に、 抗体を産生する感作リンパ球 等の免疫細胞を癌遺伝子 （oncogene ) により不死化させた細胞を用いてもよい。 このように得られたモノクローナル抗体はまた、 遺伝子組換え技術を用いて産 生させた組換え型抗体として得ることができる （例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publ ished in the United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。 組換え型抗体は、 それをコ一ドする DNAをハイプリ ドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免 疫細胞からクローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し 産生させる。 本発明は、 この組換え型抗体を包含する。
さらに、 本発明の抗体は、 本発明の蛋白質に結合する限り、 その抗体断片ゃ抗 体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片としては、 Fab、 F( ab' )2、 Fv又は H鎖 と L鎖の Fvを適当なリンカーで連結させたシングルチエイン Fv( scFv) (Huston, J. S. et al . , Proc . Natl . Acad. Sci . U. S. A. ( 1988) 85， 5879-5883 ) が挙 げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンで処理し抗体 断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これ を発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co， M. S . et al .， J. Immunol . ( 1994) 152， 2968-2976 ； Better, M. and Horwitz, A. H.， Methods Enzymol . ( 1989) 178, 476-496 ； Pluckthun, A. and Skerra, A. ， Methods Enzymol . ( 1989 ) 178, 497-515 ； Lamoyi, E.， Methods Enzymol. ( 1 986 ) 121 , 652-663 ； Rousseaux, J. et ah , Methods Enzymol . ( 1986) 121， 6 63-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W. , Trends Biotechnol . ( 1991 ) 9， 132 - 137参照）。
抗体修飾物として、 ポリエチレングリコール（PEG)等の各種分子と結合した抗 体を使用することもできる。 本発明の 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含さ れる。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すこ とによって得ることができる。 これらの方法はこの分野において既に確立されて いる。
また、 本発明の抗体は、 公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒ ト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来の CDR (相補性決 定領域） とヒト抗体由来の FR (フレームワーク領域） 及び定常領域からなるヒト 型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 本発明で使 用される抗体の分離、 精製は通常の蛋白質で使用されている分離、 精製方法を使 用すればよい。 例えば、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー等のクロマトグラフ ィーカラム、 フィルタ一、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDS ポリアクリルアミ ドゲル 電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精製す ることができる (Antibodies ： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lan e, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) が、 これらに限定されるものではな い。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着檢定法（ Enzyme-l inked immunosorbent assay； EL ISA) 等により行うことができる。
ァフィ二ティークロマトグラフィ一に用いるカラムとしては、 プロテイン A力 ラム、 プロテイン Gカラムが挙げられる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いた カラムとして、 Hyper D， POROS, Sepharose F . F. (Pharmacia) 等が挙げられる ァフィ二ティークロマトグラフィ一以外のクロマトグラフィ一としては、 例え ば、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆 相クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies fo r Protein Purification and Characterization ： A Laboratory Course Manual . Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 )。 これらのクロマトグラフィーは HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用 いて行うことができる。
また、 本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 例えば、 吸光度の 測定、酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme-linked immunosorbent assay； ELISA)、 E IA (酵素免疫測定法）、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いること ができる。 ELISA を用いる場合、 本発明の抗体を固相化したプレートに本発明の 蛋白質を添加し、 次いで目的の抗体を含む試料、 例えば、 抗体産生細胞の培養上 清や精製抗体を加える。 酵素、 例えば、 アルカリフォスファターゼ等で標識した 抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレートをインキュベーションし、 次いで洗 浄した後、 p-ニトロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定すること で抗原結合活性を評価することができる。 この方法には、 蛋白質の断片、 例えば その C 末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、 BIAc ore (Pharmacia製） を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、 本発明の抗体と試料中に含まれる本発明の 蛋白質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、 該抗体と該蛋白質との免疫 複合体を検出又は測定することからなる、 本発明の蛋白質の検出又は測定方法を 実施することができる。 本発明の蛋白質の検出又は測定方法は、 蛋白質を特異的 に検出又は測定することができるため、 蛋白質を用いた種々の実験等に有用であ る。
本発明はまた、 ヒ卜 「TAB2」 蛋白質をコードする DNA (配列番号： 1 ) または その相補鎖に相補的な少なくとも 15 ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提 供する。
ここで 「相補鎖」 とは、 A:T、 G:Cの塩基対からなる 2本鎖核酸の一方の鎖に対 する他方の鎖を指す。 また、 「相補的」 とは、 少なくとも 15個の連続したヌクレ ォチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、 少なくとも 70% 以上、 好ま しくは 80 以上 、 より好ましくは 90%以上 、 さらに好ましくは 95% 以上の塩基 配列上の相同性を有すればよい。 相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細 書に記載したものを使用すればよい。
このような核酸には、 本発明の蛋白質をコ一ドする DNAの検出や増幅に用いる プローブやプライマ一、 本発明の蛋白質の発現を抑制するためのヌクレオチド又 はヌクレオチド誘導体 （例えば、 アンチセンスオリゴヌクレオチドゃリボザィム 、 またはこれらをコードする MA等） が含まれる。 また、 このような核酸は、 DN Aチップの作製に利用することもできる。
プライマ一として用いる場合、 3'側の領域は相補的とし、 5'側には制限酵素認 識配列やタグなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 例えば、 配列番号： 1の塩基配列 中の 、ずれかの箇所にハイブリダィズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含 まれる。 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 好ましくは配列番号： 1の塩 基配列中の連続する少なくとも 15 個以上のヌクレオチドに対するアンチセンス オリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも 15個以上の ヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 それらの誘導体や修飾体を使用す ることができる。 修飾体として、 例えばメチルホスホネート型又はェチルホスホ ネー卜型のような低級アルキルホスホネー卜修飾体、 ホスホロチォェ一卜修飾体 又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA又は mRNAの所定の領域を構成するヌ クレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、 DNA または mRNAとオリゴヌクレオチドとが配列番号： 1に示される塩基配列に特異的 にハイブリダィズできる限り、 1 又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在 していてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 本発明の蛋白質の産生細 胞に作用して、 該蛋白質をコードする MA 又は mRNAに結合することにより、 そ の転写又は翻訳を阻害したり、 mRNA の分解を促進したりして、本発明の蛋白質の 発現を抑制することにより、 結果的に本発明の蛋白質の作用を抑制する効果を有 する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 それらに対して不活性な 適当な基剤と混和して塗布剤、 パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、 必要に応じて、 賦形剤、 等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 防腐剤、 無 痛化剤等を加えて錠剤、 散財、 顆粒剤、 カプセル剤、 リボソームカプセル剤、 注 射剤、 液剤、 点鼻剤など、 さらに凍結乾燥剤とすることができる。 これらは常法 にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用する か、 又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用 する。 さらには、 持続性、 膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いること もできる。 例えば、 リボソーム、 ポリ- L- リジン、 リビッド、 コレステロール、 リポフエクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスォリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、 患者の状態に応 じて適宜調整し、 好ましい量を用いることができる。 例えば、 0. 1 〜： I00mg/kg、 好ましくは 0.1 〜50mg/kg の範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスォリゴヌクレオチドは本発明の蛋白質の発現を阻害し、 従って本発明の蛋白質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。 また 、 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、 本発明の 蛋白質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
また本発明は、 TAB2を利用した iL-1のシグナル伝達を阻害する化合物のスク リーニング方法を提供する。 本発明のスクリーニング方法の 1つの態様は、 TAB2 と TAK1および/または TRAF6との結合活性の阻害を指標とする方法である。スク リーニングの標的となる化合物には、 TRAF6 と TAB2 との結合を阻害する化合物、 TAK1 と TAB2との結合を阻害する化合物、 および TRAF6、 TAB2、 TAKlの複合体形 成を阻害する化合物が含まれる。
これらの化合物のスクリーニング方法は、 （a ) 被検試料の存在下、 TAB2 蛋白 質と TAK1蛋白質および/または TRAF6蛋白質とを接触させる工程、 （b ) TAB2蛋 白質と TAK1蛋白質および/または TRAF6蛋白質との結合を検出する工程、および ( c ) 該結合を阻害する活性を有する化合物を選択する工程、 を含む方法である o
被検試料としては特に制限はなく、 例えば、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物 、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 原核細胞紬出物、 真核単細胞抽出物又は動物細 胞抽出物あるいはそれらのライブラリー、 精製若しくは粗精製蛋白質、 ペプチド 、 非ペプチド性化合物、 合成低分子化合物、 天然化合物が挙げられる。 被検試料 を接触させる本発明の蛋白質は、 例えば、 精製した蛋白質として、 可溶型蛋白質 として、 担体に結合させた形態として、 他の蛋白質との融合蛋白質として、 細胞 膜上に発現させた形態として、 膜画分として被検試料に接触させることができる 上記スクリーニングに用いられる各蛋白質は、 結合能あるいは複合体の形成能 を有する限りその形態に制限はなく、 蛋白質全長でなくとも、 変異体、 または部 分ペプチドであってもよい。 また、 他のペプチドとの融合蛋白質であってもよい
。 TAB2蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 2に記載の全長ヒト TAB2蛋白質は もちろんのこと、 例えばィン夕クトな蛋白質が持つアダプター蛋白質としての機 能を失った （または恒常的に活性化された） 蛋白質であってもよい。 例えば、 ヒ ト TAB2蛋白質の 401- 693位のアミノ酸からなる C半側の部分ペプチドは、 TRAF6 および TAK1に結合することが示された。 よって、 この TAB2部分ペプチドを用い て、 TRAF6との結合を阻害する化合物のスクリーニングを行ったり、 あるいは TA K1 との結合を阻害する化合物のスクリーニングを行うことが可能である。 TRAF6 蛋白質や TAK1蛋白質も同様に、全長蛋白質のみならず、部分べプチドゃシグナル 伝達機能を失った （または恒常的に活性化された） 変異蛋白質などであってもよ い。
これらの蛋白質を組換え蛋白質として生成させるためには、 具体的には、 以下 のように行うことができる。 目的蛋白質をコードする遺伝子を、 pSV2neo， pcDNA
I， PCD8 などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで 当該遺伝子を発現させる。 発現に用いるプロモーターとしては SV40 early prom oter (Rigby In Williamson (ed.), Genetic Engineering, Vol.3. Academic Pr ess, London, p.83-141(1982)), EF-1 promoter (Kim ら Gene , p.217-22 3 (1990)), CAG promoter (Niwa et al. Gene 108, p.193-200 (1991)), RSV LT R promoter (Cullen Methods in Enzymology 152, p.684-704 (1987), SR pr omoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p.466 (1988)), CMV i麵 ediate e arly promoter (Seed and Aruffo Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, p.3365-33 69 (1987)), SV40 late promoter (Gheysen and Fiers J. Mol. Appl. Genet. 1, p.385-394 (1982))， Adenovirus late promoter (Kaufman et al. Mol. Cell . Biol. 9, p. 946 (1989)), HSV TK promoter等の一般的に使用できるプロモ 一夕一であれば何を用いてもよい。 動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝 子を発現させるためには、 エレクトロボレ一シヨン法 （Chu， G. et al. Nucl. A cid Res. 15, 1311-1326 (1987))、 リン酸カルシウム法 （Chen, C and Okayama,
H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987))、 DEAEデキストラン法 (Lopata, M . A. et al . Nucl . Acids Res. 12, 5707-5717 ( 1984) ; Sussman, D. J. and Mi lman, G. Mol . Cel l . Biol . 4, 1642-1643 ( 1985) )、 リポフエクチン法 (Derija rd, B. Cell 7, 1025-1037 ( 1994) ; Lamb, B. T. et al . Nature Genetics 5, 2 2-30 ( 1993 ) ; Rabindran, S. K. et al . Science 259, 230-234 ( 1993) )等の方 法があるが、 いずれの方法によってもよい。 特異性の明らかとなっているモノク ローナル抗体の認識部位（ェピトープ）を本発明の蛋白質の N 末または C末に導 入することにより、 モノクローナル抗体の認識部位を有する融合蛋白質として本 発明の蛋白質を発現させることができる。 用いるェピトープ一抗体系としては巿 販されているものを利用することができる （実験医学 85-90 ( 1995 ) )。 マル チクロ一二ングサイ トを介して、 ?—ガラクトシダーゼ、 マルトース結合蛋白質 、 グル夕チオン S-トランスフェラ一ゼ、 緑色蛍光蛋白質 （GFP) などとの融合蛋 白質を発現することができるベクターが市販されている。
融合蛋白質にすることにより本発明の蛋白質の性質をできるだけ変化させない ようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなェピトープ部分のみ を導入して、 融合蛋白質を調製する方法も報告されている。 例えば、 ポリヒスチ ジン （His- tag)、 インフルエンザ凝集素 HA、 ヒト c- myc、 FLAG、 Vesicular stom atitis ウィルス糖蛋白質 （VSV-GP)、 T7 genelO 蛋白質（T7- tag)、 ヒト単純ヘル ぺスウィルス糖蛋白質（HSV- tag)、 E-tag (モノクローナルファージ上のェピトー プ） などのェピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、 本発明の蛋白質 に結合する蛋白質のスクリーニングのためのェビトープ一抗体系として利用でき る （実験医学 13, 85-90 ( 1995) )。
本発明において提供されるスクリーニング系は、 in vitroのアツセィ系として 行われうる。 in vitroのアツセィ系の一つの具体例は、 非細胞系において行われ る。 具体的には、 上記蛋白質の結合を指標するスクリーニングにおいては、 その 蛋白質の組み合わせにおいて、 いずれか 1つを支持体に結合させ、 ここに他の 1 または 2の蛋白質と被験試料を加え、 ィンキュペートをした後洗浄して支持体に 結合した蛋白質に対する残りの蛋白質の結合を検出又は測定すればよい。
本発明に使用される蛋白質は、 それらを固有に発現する細胞、 それらをコード する DNAを導入した細胞、 それらをコードする DNAを導入した動物又は植物から 産生される蛋白質を、 精製した状態であるいは粗精製の状態で使用することがで ぎる。
本発明に使用される蛋白質は、 支持体に結合させて用いることができる。 はじ めに精製された又は粗精製された TRAF6、 TAB2、 または TAK1のいずれか一つを支 持体に結合させる。 該蛋白質を支持体に結合させるには、 標準的な方法で該蛋白 質を支持体に固相化すればよい。 蛋白質を結合させる支持体としては、 例えば不 溶性の多糖類、 例えばァガロース、 デキストラン、 セルロース、 合成樹脂、 例え ばポリスチレン、 ポリアクリルアミ ド、 シリコン等が挙げられる。 より具体的に はそれらを原料として製造される市販のビーズ、 プレートが用いられる。 ビーズ の場合、 これらが充填されたカラム等を用いてもよい。 プレートの場合、 マルチ ゥエルプレート （96穴マルチウエルプレート等）やバイオセンサ一チップが挙げ られる。
蛋白質と支持体を結合させるには、 化学結合、 物理的な吸着等を利用する、 通 常用いられる方法を用いればよい。 また、 蛋白質を特異的に認識する抗体を予め 支持体に結合せしめ、 この抗体と蛋白質とを結合させることもできる。 さらに、 アビジン/ピオチンを介して結合させることができる。
蛋白質同士の結合は、 通常、 緩衝液中で行われる。 緩衝液としては、 例えばリ ン酸緩衝液、 Tris緩衝液等が使用される。 また、 インキュベートの条件としては 、 すでによく用いられている条件、 例えば 4°C〜室温にて 1時間〜 24時間のイン キュベ一シヨンが挙げられる。 インキュベート後の洗浄は、 蛋白質の結合を妨げ ないものであれば何でもよく、 例えば界面活性剤を含む緩衝液が使用される。 界 面活性剤としては、 例えば 0.05¾Tween 20が使用される。
目的の化合物を選択するには、 各蛋白質及び被験試料を適切な条件下でインキ ュペートし、 次いで洗浄することにより、 特異的な結合と非特異的な結合を分離 することができる。 そして、 上記のスクリーニング方法に応じて、 TRAF6と TAB2 との結合、 TAB2と TAK1との結合、 または TRAF6、 TAB2、 および TAK1を含む複合 体の形成の状態を評価すればよい。
目的の化合物を選択する際に、 支持体に結合させる蛋白質は各蛋白質のいずれ でもよい。例えば、 TRAF6を支持体に結合させる場合には、 TRAF6.を固相化後、 残 りの蛋白質と被験試料をあらかじめ混合したもの、 または被験試料添加後に残り の蛋白質を添加しても良い。 また、 TAB1を支持体に固相化する場合には、 同様に 残りの蛋白質と被験試料とをあらかじめ混合したもの、 または被験試料添加後に 残りの蛋白質を添加しても良い。 TAK1 の支持体に固相化する場合も同様である。 以上の順序で添加した各蛋白質及び被験試料を適切な条件下でィンキュベーショ ンし、 TRAF6と TAB2との結合、 TAB2と TAK1 との結合、 または TRAF6、 TAB2、 お よび TAK1を含む複合体の形成の状態を評価することができる。
本発明のスクリーニング方法において、 被験試料を蛋白質に接触させる群と共 にコントロール群を設置してもよい。 コントロール群としては、 被験試料を含ま ない陰性コントロール群又は陽性コントロール群あるいはその両群をおくことが できる。
本発明において結合した蛋白質を検出又は測定する際、 単に結合した蛋白質を 検出するだけでもよいし、 又は結合した蛋白質を定量的に測定してもよい。 これ らの場合、 被験試料を含まない陰性コントロール群で得られた結果、 被験試料を 含む群で得られた結果及び/又は陽性コントロール群で得られた結果を比較する ことにより、 目的の化合物を検出することができる。
また、 これらの結果を数値として得、 それらの数値を比較することにより、 目 的の化合物の活性を定量的に測定することもできる。 定量的に測定する場合、 被 験試料を含まない陰性コントロール群で得られた数値と被験試料を適用した群で 得られた数値を比較することにより、 目的の化合物を検出することができる。 陰 性対照と比較して、 得られた数値が減少していれば、 被験試料が目的の化合物を 含むと判定することができる。
また、 定量的に測定する場合、 TRAF6と TAB2との結合、 TAB2と TAK1との結合 、 または TRAF6、 TAB2、 および TAK1を含む複合体の形成を阻害することがわかつ ている化合物を既知量含む陽性コントロール群で得られた数値により作成された 標準曲線を元に定量することができる。 結合した蛋白質が多い場合、 蛋白質の結 合を阻害する化合物の活性が低く、 一方結合した蛋白質が少ない場合、 その蛋白 質の結合を阻害する化合物の結合阻害活性が強いことが推測される。
本発明において、 結合した蛋白質を検出又は測定する手段として表面ブラズモ ン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することができる。 表面プラズモン 共鳴現象を利用したバイオセンサーは蛋白質一蛋白質間の相互作用を微量の蛋白 質を用いてかつ標識することなく、 表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアル夕 ィムに観察することが可能である （例えば BIAcore、 Pharmacia製）。 したがって 、 BIAcore 等のバイオセンサーを用いることにより本発明で使用される蛋白質の 結合を評価することが可能である。
すなわち、 スクリーニングに用いる蛋白質の 1つを固定化したセンサーチップ に、 もう一方の蛋白質を接触させ、 固定化した一方の蛋白質に結合する蛋白質を 共鳴シグナルの変化として検出しょうとするものである。
具体的には以下のように行えばよい。 初めにセンサ一チップ CM5 (Biosensor 製） を活性化して TAK1と TAB1 との組み合わせの一方をセンサ一チップ上に固定 化する。 すなわち、 EDC I NHS水溶液 (200mM EDC (N-ethyl-N' -( 3-dimethylamin opropyl ) carbonate hydrochloride)， 50mM NHS (N-hydroxysuccinimide； ) によ りセンサーチップを活性化した後、 HBSバッファー（10mM HEPES pH7.4， 150mM N aCl , 3.4mM EDTA, 0.05¾Tween20) によりセンサ一チヅプを洗浄する。
次に HBS バッファーに溶解した適量の相互作用を有する蛋白質をセンサーチ ヅプに接触させ、 固定化する。 HBS バッファ一によりセンサーチップを洗浄後、 エタノールァミン溶液 （1M ethanolamine hydrochloride, pH8.5) によりセンサ
—チップ上の残存活性基をブロックする。再び HBSバッファ一によりセンサーチ ップを洗浄し結合評価に用いる。
次に HBSバッファーに溶解した適量の蛋白質を注入する。 このときにセンサー チップに固定化された蛋白質に結合する相互作用を有する蛋白質の量は共鳴シグ ナル値の増加として観察される。
さらに、 上記結合評価系において、 一方の蛋白質に相互作用を有するもう一方 の蛋白質 （3種の蛋白質の複合体の場合は残り 2つの蛋白質） に引き続いて被験 試料を注入する。 また被験試料を注入する群と共に、 コントロール群を設置して もよい。 コントロール群としては被験試料を含まない陰性コントロール群又は陽 性コントロール群あるいはその両群をおくことができる。
結合した蛋白質は共鳴シグナル値の変化量として定量的に測定することができ る。 この場合、 被験試料を含まない陰性コントロール群で得られた結果、 被験試 料を含む群で得られた結果及び/又は陽性コントロール群で得られた結果を比較 することにより、 目的の化合物を検出、 決定することができる。
本発明において、 結合した蛋白質を検出又は測定する手段として、 いずれかの 蛋白質を標識し、 結合した蛋白質の標識を利用することができる。
例えば、 前述のスクリーニング方法において、 被験試料とともに一方の蛋白質 に接触させるもう一方の蛋白質をあらかじめ標識しておき、 被験試料とともにィ ンキュベ一トした後、 洗浄して結合している蛋白質をその標識により検出又は測 定する。 すなわち、 好ましくは支持体に結合させた一方の蛋白質に被験試料と標 識したもう一方の蛋白質を接触させる。 インキュベートした後、 洗浄して、 結合 している蛋白質の標識を検出又は測定すればよい。
本発明で使用される蛋白質は、 通常知られる方法により標識されることができ る。 標識物質としては、 例えば放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 ピオチン/ァ ビジン等が挙げられる。 これらの標識物質は市販の標識物質を使用することがで きる。 放射性同位元素しては、 例えば32 P、 33Ps 131 Is 125κ ¾、 14c、 35sが挙げられ る。 酵素としては、 例えばアルカリフォスファタ一ゼ、 ホースラディッシュパー ォキシダ一ゼ、 ガラクトシダ一ゼ、 グルコシダ一ゼ等が挙げられる。 蛍光 物質としては、 例えばフロォロセインイソチオシァネ一ト （F ITC)、 ローダミンが 挙げられる。 これらは市販のものを入手することができ、 公知の方法によって標 れる。
具体的には、 次のようにして行うことができる。 すなわち、 いずれかの蛋白質 を含む溶液をプレートに加え、 一夜放置する。 プレートを洗浄の後、 蛋白質の非 特異的な結合を防ぐため例えば BSAでブロッキングする。 再び洗浄し、 被験試料 ともう一方の標識された蛋白質をプレートに加える。 同時に被験試料を含まない 陰性コントロール群及び/又は陽性コントロール群を置き、 これらをィンキュぺ 一卜する。 インキュベートの後、 洗浄し結合した蛋白質を検出又は測定する。 検 出又は測定には、 放射性同位元素の場合液体シンチレーシヨンにより検出又は測 定する。 酵素の場合その基質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計 により検出又は測定する。 蛍光物質の場合蛍光光度計により検出又は測定する。 これらの結果を、 コント口一ル群で得られた数値と比較すれば目的の化合物を決 定することができる。
本発明において、 結合した蛋白質を検出又は測定する手段として、 各蛋白質の 組み合わせにて、 いずれかの蛋白質を特異的に認識する抗体を用いることができ る
例えば、 一方の蛋白質に被験試料とともにもう一方の蛋白質を接触させ、 被験 試料とともにィンキュペートした後、 洗浄して結合している蛋白質をその蛋白質 を特異的に認識する一次抗体により検出又は測定する。 すなわち、 好ましくは支 持体に結合させた一方の蛋白質に被験試料ともう一方の蛋白質を接触させる。 ィ ンキュペートした後、 洗浄して、 結合している蛋白質を、 その蛋白質を特異的に 認識する一次抗体により検出又は測定すればよい。 一次抗体は、 好ましくは標識 物質により標識されている。
具体的には、 次のようにして行うことができる。 すなわち、 いずれかの蛋白質 を含む溶液をプレートに加え、 一夜放置する。 プレートを洗浄の後、 蛋白質の非 特異的な結合を防ぐため例えば BSAでブロッキングする。 再び洗浄し、 被験試料 ともう一方の蛋白質をプレートに加える。 同時に被験試料を含まない陰性コント ロール群及び/又は陽性コントロール群を置き、 これらをィンキュベ一卜する。 ィンキュペートの後、 洗浄し被験試料と共に加えた蛋白質に対する抗体を加え る。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗浄しその蛋白質を特異的に認 識する一次抗体により蛋白質を検出又は測定する。 検出又は測定には、 放射性同 位元素の場合、 液体シンチレ一シヨンにより検出又は測定する。 酵素の場合その 基質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計により検出又は測定する 。 蛍光物質の場合蛍光光度計より検出又は測定する。 これらの結果を、 コント口 ール群で得られた数値と比較すれば目的の化合物を決定することができる。 本発明において、 結合した蛋白質を検出又は測定する手段として、 本発明に使 用される蛋白質と融合した他のベプチドを特異的に認識する一次抗体を用いるこ とができる。
例えば、 前述のスクリーニング方法において、 いずれかの蛋白質に被験試料と ともにもう一方の蛋白質を接触させ、 被験試料とともにィンキュベ一トした後、 洗浄して結合している蛋白質をその蛋白質と融合した他のぺプチドを特異的に認 識する一次抗体により検出又は測定する。 すなわち、 好ましくは支持体に結合さ せた一方の蛋白質に被験試料ともう一方の蛋白質を接触させる。 ィンキュベート した後、 洗浄して、 結合している蛋白質をその蛋白質と融合した他のペプチドを 特異的に認識する一次抗体により検出又は測定すればよい。 一次抗体は、 好まし くは標識物質により標識されている。
具体的には、 次のようにして行うことができる。 すなわち、 いずれかの蛋白質 を含む溶液をプレートに加え、 一夜放置する。 プレー卜を洗浄の後、 蛋白質の非 特異的な結合を防ぐため例えば BSAでブロッキングする。 再び洗净し、 被験試料 と他のベプチドと融合した別の蛋白質をプレートに加える。 同時に被験試料を含 まない陰性コントロール群及び/又は陽性コントロールを置き、 これらをインキ ュペートする。
ィンキュペートの後、 洗浄し被験試料と共に加えた蛋白質と融合した他のぺプ チドに対する抗体を加える。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗浄し その蛋白質と融合した他のぺプチドを特異的に認識する一次抗体により蛋白質を 検出又は測定する。 検出又は測定には、 放射性同位元素の場合液体シンチレーシ ヨンにより検出又は測定する。 酵素の場合その基質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計により検出又は測定する。 蛍光物質の場合蛍光光度計によ り検出又は測定する。 これらの結果を、 コントロール群で得られた数値と比較す れば目的の化合物を決定することができる。
本発明において、 結合した蛋白質を検出又は測定する手段として、 本発明で使 用される蛋白質を特異的に認識する一次抗体及び該一次抗体を特異的に認識する 二次抗体を用いることができる。
例えば、 いずれかの蛋白質に被験試料とともにもう一方の蛋白質を接触させ、 被験試料とともにィンキュベートした後、 洗浄して結合している蛋白質をその蛋 白質を特異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体によ り検出又は測定する。 すなわち、 好ましくは支持体に結合させたいずれかの蛋白 質に被験試料ともう一方の蛋白質を接触させる。 インキュベートした後、 洗浄し て、 結合している蛋白質を、 その蛋白質を特異的に認識する一次抗体及び一次抗 体を特異的に認識する二次抗体により検出又は測定すればよい。 二次抗体は、 好 ましくは標識物質により標識されている。
具体的には、 次のようにして行うことができる。 すなわち、 いずれかの蛋白質 を含む溶液をプレートに加え、 一夜放置する。 プレートを洗浄の後、 蛋白質の非 特異的な結合を防ぐため、 例えば、 BSA でブロッキングする。 再び洗浄し、 被験 試料ともう一方の蛋白質をプレートに加える。 同時に被験試料を含まない陰性コ ントロール群及び/又は陽性コントロール群を置き、 これらをィンキュペートす る。
ィンキュペートの後、 洗浄し被験試料と共に加えた蛋白質と融合した他のべプ チドに対する一次抗体を加える。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗 浄し、 次いで一次抗体を特異的に認識する二次抗体を加える。 適度なインキュべ ーシヨンの後、 洗浄して、 その蛋白質を特異的に認識する一次抗体を特異的に認 識する二次抗体により蛋白質を検出又は測定する。 検出又は測定には、 放射性同 位元素の場合、 液体シンチレーシヨンにより検出又は測定する。 酵素の場合その 基質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計により検出又は測定する 。 蛍光物質の場合、 蛍光光度計により検出又は測定する。 これらの結果を、 コン 卜口ール群で得られた数値と比較すれば目的の化合物を選択することができる。 本発明において、 結合した蛋白質を検出又は測定する手段として、 蛋白質と融 合した他のベプチドを特異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識す る二次抗体を用いることができる。
例えば、 前述のスクリーニング方法において、 いずれかの蛋白質に被験試料と ともにもう一方の蛋白質を接触させ、 被験試料とともにィンキュベ一トした後、 洗浄して結合している蛋白質をその蛋白質と融合した他のぺプチドを特異的に認 識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出又は測定す る。 すなわち、 好ましくは支持体に結合させた一方の蛋白質に被験試料ともう一 方の蛋白質を接触させる。 インキュベートした後、 洗浄して、 結合している蛋白 質をその蛋白質と融合した他のぺプチドを特異的に認識する一次抗体及び一次抗 体を特異的に認識する二次抗体により検出又は測定すればよい。 二次抗体は、 好 ましくは標識物質により標識されている。
具体的には、 次のようにして行うことができる。 すなわち、 いずれかの蛋白質 を含む溶液をプレートに加え、 一夜放置する。 プレートを洗浄の後、 蛋白質の非 特異的な結合を防ぐため例えば BSAでブロッキングする。 再び洗浄し、 被験試料 と他のベプチドと融合したもう一方の蛋白質をプレートに加える。 同時に被験試 料を含まない陰性コントロール群及び/又は陽性コントロール群を置き、 これら をィンキュベ一卜する。
ィンキュペートの後、 洗浄し被験試料と共に加えた蛋白質と融合した他のぺプ チドに対する一次抗体を加える。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗 浄し、 次いで一次抗体を特異的に認識する二次抗体を加える。 適度なインキュべ ーシヨンの後、 洗浄して、 その蛋白質と融合した他のペプチドを特異的に認識す る一次抗体を特異的に認識する二次抗体により蛋白質を検出又は測定する。 検出 又は測定には、 放射性同位元素の場合液体シンチレーシヨンにより検出又は測定 する。 酵素の場合その基質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計に より検出又は測定する。 蛍光物質の場合蛍光光度計により検出又は測定する。 こ れらの結果を、 コント口ール群で得られた数値と比較すれば目的の化合物を決定 することができる。
特に好ましくは、 ELISA (Enzyme- l inked Immunosorbent Assay) により次のよ うにして行うことができる。すなわち、他のぺプチド、例えば 6 xHisと融合した いずれかの蛋白質を固相化バッファー （0. 1 M NaHC03、 0.02% NaN3、 pH9.6) によ り希釈する。 96穴のィムノプレート （Nunc製）の各穴に希釈したこの水溶液を適 量加え 4°Cでー晚ィンキュベー卜する。
洗浄バッファ一 （PBS に 0.05% Tween20 となるよう調製したもの） で 3回各穴 を洗浄後、 PBSに溶解した 5 BSA (SIGMA 製） 溶液 200// 1 を加え、 4°Cで一晩 ブロッキングする。
次に洗浄バッファーで 3回各穴を洗浄し、 希釈バッファー （1% BSA、 0. 5¾ Twe en20、 PBS) で希釈した他のペプチド、 例えば FLAGと融合した他方の蛋白質と被 験試料を適量加え、 室温で 1時間インキュベートする。 洗浄バッファーで各穴を 3回洗浄し、 希釈バッファーで 3 〃g/mlに希釈したマウス抗 FLAG M2抗体 （IB I 製） を 100 z l各穴に加え、 室温で 1時間インキュベートする。
洗浄バッファ一で各穴を 3回洗浄し、 希釈バッファーで 1000 倍に希釈したァ ルカリフォスファターゼ標識ャギ抗マウス IgG抗体（ZYMED製）を 100〃1各穴に 加え、 室温で 1時間インキュベートする。 洗浄バッファーで 5回各穴を洗浄し、 発色溶液 （基質バッファ一； 50 mM NaHC03、 lOmM MgCl2、 pH9.8 に 1 mg/ml の濃 度に溶解した P-フエニルフォスフヱ一ト ； SIGMA製） を 100〃1 各穴に加え、 室 温で反応させた後に 405 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダ一（Model3550 、 BIO- RAD 製） を用いて測定する。 これらの結果を、 陰性コントロール群及び/ 又は陽性コントロール群で得られた数値と比較すれば目的の化合物を決定するこ とができる。
なお、 本発明の抗体を利用した検出または測定においては、 二次抗体に代えて プロテイン Gやプロティン Aを用いることも可能である。
本発明のスクリーニング方法は、 High Throughput Screening (HTS) を使用す ることができる。 具体的には、 ブロッキングまでを手作業で行い、 その後の反応 はロボットによって ί亍うことでオートメーションィ匕し、 High Throughput screen ingを実現することができる。
すなわち、他のぺプチド、例えば 6 xHisと融合したいずれかの蛋白質を固相化 バッファ一 （0.1 M NaHC03、 0.02% NaN3、 pH9.6) により希釈する。 96穴のィムノ プレート （Nunc製） の各穴に希釈したこの水溶液を適量加え 4°Cでー晚インキュ ベードする。
洗浄バッファー（PBS に 0.05 Tween20 となるよう調製したもの）で 3回各穴 を洗浄後、 PBSに溶解した 5% BSA (SIGMA製） 溶液 200〃1 を加え、 4°Cで一晩 ブロッキングする。
次に、例えば Biomek2000 HTS system(Beckman製）にブロッキング済みのィムノ プレ一トをセッ トしてシステムのコントロールプログラムを実行する。 この際、 分注機としては Biomek 2000分注機（Beckman製）あるいは Multipipette96穴同時 分注器（Sagian 製）を用いることでィムノプレート各穴への溶液の分注や溶液の 除去を行うことができる。 また、 ィムノプレー卜の各穴の洗浄には EL404マイク 口プレートウォッシャー（Bio Tek製）を用いることができる。 また、 吸光度の測 定には SPECTRAmax250プレートリーダ一 (Molecular Devices製）を用いることが できる。
プログラムは以下の操作をおこなうよう設定する。 すなわち洗浄バッファ一で 3回各穴を洗浄し、 被験試料と希釈バッファ一 ( 1% BSA、 0.5% Tween20、 PBS) で 希釈した他のペプチド、 例えば MBP (マルトース結合蛋白質） と融合した他方の 蛋白質を適量加える。 同時に被験試料を含まない陰性コントロール群及び陽性コ ントロールを置き、 これらを室温で 1時間ィンキュペートする。
洗浄ノ ッファーで各穴を 3回洗浄し、希釈ノ ッファーで 5000倍に希釈したゥサ ギ抗 MBP抗血清 （New England Biolabs製） を 100 z l各穴に加え、 室温で 1時間 インキュベートする。 洗浄バッファーで各穴を 3回洗浄し、 希釈バッファーで 5 000 倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ャギ抗ゥサギ IgG抗体（TAG0製 ) を 100〃1 各穴に加え、 室温で 1時間インキュベートする。
洗浄バッファーで 5回各穴を洗浄し、 発色溶液 （基質バッファ一； 50 mM NaHC 03、 10mM MgCl2s pH9.8に 1 mg/mlの濃度に溶解した p-ニトロフエニルフォスフ エート； SIGMA製） を 100〃1 各穴に加え、 室温で反応させた後に 405 nmでの吸 光度をマイク口プレートリ一ダ一、 Biomekプレートリ一夕'一 ( Beckman / Molecul ar Devices 製）を用いて測定する。 これらの結果を、 コントロール群で得られた 数値と比較すれば目的の化合物を同定することができる。
本発明において使用される抗体として、 市販の抗体や市販のキットに含まれる 抗体を用いることもできるし、 公知の手段を用いて得られるモノクローナル抗体 またはポリクローナル抗体を用いることもできる。抗体の作製方法は、 上記の TA B2に対する抗体の作製方法と同様である。
上記のように得られた一次抗体又は二次抗体は、 通常知られる方法により標識 されることができる。 標識物質としては、 例えば放射性同位元素、 酵素、 蛍光物 質等が挙げられる。 これらの標識物質は市販の標識物質を使用することができる 。 放射性同位元素としては、 例えば32 Ρ、 33Ρ、 131Κ 125Ι、 ¾、 14C、 35Sが挙げられる 。 酵素としては、 例えばアルカリフォスファターゼ、 ホースラディッシュパ一ォ キシダーゼ、 ガラクトシダ一ゼ、 ? -グルコシダーゼ等が挙げられる。 蛍光物 質としては、 例えばフロォロセインイソチオシァネート （FITC)、 ローダミンが挙 げられる。 これらの標識物質として市販のものを入手して、 公知の方法によって 標識化を行えばよい。
また、 蛋白質の結合の検出は、 これら蛋白質の結合に応答して活性化するレポ 一夕一遺伝子の発現量の変化によって検出及び/又は測定することができる。 こ のようなレポ一夕一遺伝子としては、 ルシフェラーゼ、 ガラクトシダーゼ、 H IS3 遺伝子、 クロラムフエ二コール 'ァセチルトランスフェラーゼ （CAT)、 グリ —ンフルォレヅセンスプロテイン （GFP) 遺伝子等を用いることができる。
細胞で発現される蛋白質は他のぺプチドとの融合蛋白質であってよい。 これら の蛋白質と融合に付される他のぺプチドとは、 本発明のスクリーニング方法で使 用されうる限りいかなるべプチドであってよいが、 好ましくは転写調節因子であ o
例えば、 DNA に結合してあるレポーター遺伝子の転写を活性化することが知ら れているヘテロダイマーからなる転写調節因子の各々のサブュニットと結合を測 定する 2種の蛋白質のそれそれに融合させた DNAを構築し、 それらを発現べクタ 一に含めて細胞に導入する（3種の蛋白質の複合体の場合は、例えば TAB2はその まま発現させる）。蛋白質の結合を阻害する化合物が被験試料に含まれていない場 合、 2つの蛋白質 （3種の蛋白質の複合体の場合は 3者） がへテロマ一を形成し 、 そしてそのへテロマーからなる転写調節因子が DNAに結合してレポーター遺伝 子が活性化する。
また、 蛋白質の結合を阻害する化合物が被験試料に含まれている場合、 蛋白質 同士の結合が阻害され、 その結果転写調節因子のサブュニッ 卜がヘテロマ一を形 成できず、 レポ一ター遺伝子の転写が誘導されない。 レポ一夕一遺伝子の発現量 の変化を調べることにより、 目的の化合物を検出又は測定することができる。 こ のような系においてレポ一夕一遺伝子の発現量の変化を調べる場合、 2ハイプリ ヅド系 (two hybrid system Fields, S and Sternglanz, R. , Trenas. Genet . ( 1994) 10, 286-292) あるいは 3ハイブリッ ド系を用いることができる。
ハイプリッド系は通常用いられている方法により構築してもよいし、 市販のキ ットを用いてもよい。 市販の 2ハイブリツ ド系のキッ トとしては、 MATCHMARKER Two-Hybrid System, Mammalian MATCHMARKER Two-Hybrid Assay Kit (いずれも C LONTECH製）、 HybriZAP Two-Hybrid Vector System (Stratagene製) が挙げられ る。
具体的には、 次のようにすればよい。 すなわち、 いずれかの蛋白質をコードす る遺伝子と LexAの DNA結合ドメインをコ一ドする遺伝子とを連結し発現ベクター を作製する。 このとき、 酵母ツーハイブリッド発現プラスミ ド PBTM116 (Vojtek, A. B. , et al . Cell ( 1993) 74, 205-214) に目的の遺伝子断片を挿入し、 発現 プラスミ ドを構築する。
次に、他方を GAL4転写活性化ドメインをコ一ドする遺伝子とを連結せしめるこ とにより発現ベクターを作製する。 発現べクタ一は、 例えば、 酵母ツーハイプリ ッド発現プラスミ ド pGADIO (CL0NTECH製） を用いることができる。
LexA結合モチーフが存在するプロモー夕一により転写が調節される HIS3遺伝 子を組み込んだ酵母 L40株を各 2ハイプリッド発現ブラスミ ドを用いて形質転換 した後、 ヒスチジン不含合成培地上でインキュベートすると蛋白質の相互作用が 認められたときのみ酵母の生育が観察される。 このように、 形質転換体の生育程 度によりレポーター遺伝子の発現量の増加を調べることができ、 目的の化合物を スクリーニングすることができる。
また、 IL- 1 のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニングの他の態様は、 TAB2蛋白質を介して伝達される生物学的活性の阻害を指標にした方法である。具 体的には、 （a ) 被検試料の存在下、 TAB2蛋白質を発現する哺乳動物細胞に、 IL - 1を接触させる工程、 （b )TAB2蛋白質を介して伝達される生物学的活性を検出す る工程、 および （c ) 該生物学的活性を減少させる化合物を選択する工程、 を含 む方法である。
被検試料としては特に制限はなく、 例えば、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物 、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 原核細胞紬出物、 真核単細胞抽出物又は動物細 胞抽出物あるいはそれらのライブラリー、 精製若しくは粗精製蛋白質、 ペプチド 、 非ペプチド性化合物、 合成低分子化合物、 天然化合物が挙げられる。
スクリーニングに用いる細胞としては、 IL-1刺激に応答したシグナル伝達を行 なうことができる哺乳動物細胞であれば特に制限はない。例えば、 IL- 1レセプ夕 —を発現させた 293細胞を好適に用いることができる。 細胞には、 必要に応じて 外来性の TAB2を発現するベクターを挿入する。 細胞が IL- 1のシグナル伝達に関 与する蛋白質を保有していない場合には、 外来性の遺伝子を導入して、 人工的に シグナル伝達系を作製することも可能である。
スクリーニングの指標となる生物学的活性としては、 例えば、 TAK1 の活性化、
NF- Bの活性化、 JNKの活性化、 TAB2蛋白質の細胞膜から細胞質への移行、 TAK1 の自己リン酸化などが挙げられる。
TAK1は活性化状態において、 そのキナーゼ活性により MAPKK 、 例えば MKK3 (M origuchi, T. et al .， J. Biol . Chem. ( 1996 ) 271， 13675-13679), MKK6 (Mori guchi , T. et al .， J. Biol. Chem. ( 1996 ) 271 , 13675-13679)、又は XMEK2/SEK KShibuya, H. et al . , Science( 1996 )272, 1179- 1182 )をリン酸化することによ り MAPKK のキナーゼ活性を活性化する活性であることが明らかになつている。 TA K1 のリン酸化の基質としては、 これらの蛋白質を用いることができる。 例えば、 MMK6のリン酸化を検出することによって、 TAK1のリン酸化活性を検出することが 可能である。 TAK1 のリン酸化活性の反応は、 細胞内で行わせることもできれば、 細胞から蛋白質を抽出し、 インビトロで行わせてもよい。
TAK1のキナーゼ活性を指標としてスクリーニングを実施するには、 例えば TAK 1を用いた in vitroキナーゼ測定系を用いることができる。被験試料と作用させ た TAK1 を、 細胞抽出液から抗 TAK1抗体等を用いて分離し、 32P- ATP と共に MKK6 等の TAK1の基質タンパクを加え、 キナーゼ反応を行い、その活性を検出又は測定 する。 キナーゼ反応後基質タンパクのリン酸化に伴い取り込まれた 32Ρ-ΑΤΡ の量 を測定することで TAK1のキナーゼ活性を評価することができ、被験試料を含まな い陰性コントロールの値と比較することで、 TAK1のキナーゼ活性を直接阻害する 化合物を同定できる。 TAK1の in vitroキナーゼ測定系としては、 文献「Moriguc hi, T.， et al .， J. Biol. Chem. 271 : 13675-13679 ( 1996 )」 に記載されている 方法等が挙げられる。
TAK1のキナーゼ活性を指標としたスクリーニング方法は、ハイスループットス クリーニング （High Throughput Screening; HTS) にも使用することができる。 具体的には、 各試料の添加 ·混合並びに各反応を、 ロボットを用いて行うことで オートメーション化し、 基質タンパクのリン酸化の程度を Scintillation proxi mity assay 法 （Bothworth, N. and Towers, P. , Nature, 341 : 167-168, 1989 ) で検出することで、 ハイスループッ トスクリーニングを実現することができる すなわち、 細胞から調製した TAK1を 96穴のマイクロプレートの各穴に加え、 3 2P-ATP と共に基質タンパク、 例えば MKK6 を加え、 キナーゼ反応を行う。 次に、 抗 MKK6 抗体を各穴に加え、 続いてプロテイン A又は種特異的な抗体をコ一ティ ングした SPAビーズ （Amersham社製） を各穴に加える。 インキュベーションの後 、 MicroBeta scintillation counter (Wallac 社製） を用いて基質タンパクに取 り込まれた放射活性を測定する。 また、 ピオチン化した基質タンパクを用いた場 合には、 ストレブトアビジンをコーティングした SPAビーズを用いることで測定 することが可能となる。 これらの方法により得られた結果を、 コントロール群で 得られた数値と比較すれば、 TAK1のキナーゼ活性を阻害する化合物を含む被験試 料を同定することができる。
実施例において、 TAB2の発現は NF- Bや JNKの活性化を誘導することが示さ れた。そして、 TAB2のドミナントネガティブ変異体によって、 NF- cBや JNKの活 性化が阻害されることが実証された。 従って、 これらの生物学的活性を指標に本 発明のスクリーニングを行うこともできる。
NF- B の活性化は、 例えば、 Ig- プロモーターの下流に結合したレポーター 遺伝子を含むベクターを細胞内に導入し、 該細胞内におけるレポーター遺伝子の 発現を指標として検出することができる。
具体的には、 例えば、 IL- 1レセプターを発現させた 293細胞に各遺伝子の発現 プラスミ ドを導入した細胞及び挿入遺伝子を含まない発現ベクターを導入したコ ントロール細胞に IFN- ?遺伝子由来の NF- A: B応答性エレメン卜によって制御さ れるルシフェラ一ゼ遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物 （p55IgkLuc ； Fujita, T.， et al .， Gene, Dev. , ( 1993) 7， 1354-1363) を導入し、 各々 10ng/mlの IL - 1を含む培地中または IL- 1 を含まない培地中で培養する。 その細胞抽出物中の ルシフェラーゼ活性を測定する。
その結果、 被験試料を加えない細胞におけるルシフヱラーゼ活性と比較して、 被験試料を加えた細胞においてルシフェラーゼ活性が少なければ、 該被験試料に 含まれる化合物が IL- 1のシグナル伝達を阻害すると判定される。このようにレポ —夕一遺伝子の発現量を対照と比較することにより、 目的の化合物をスクリー二 ングすることができる。
一方、 JNKの活性化は、 例えば、 実施例に記載のように、 Jimのリン酸化により 検出することができる。 具体的には、 例えば、 JNK をコードする発現ベクターと 、 TAB2をコードする発現ベクターを、 IL-1レセプ夕一を発現させた 293細胞に共 トランスフヱク卜し、 該細胞に、 IL- 1を作用させる。 該細胞抽出物から JNKを免 疫沈降し、 この免疫沈降物を用いて、 Junを基質として用いて、 in vitroリン酸 化アツセィを行なう。 その結果、 被験試料を加えない細胞における、 基質のリン 酸化の程度と比較して、 被験試料を加えた細胞において基質におけるリン酸化の 程度が少なければ、該被験試料に含まれる化合物が IL- 1のシグナル伝達を阻害す ると判定される。
また、 実施例において、 I 21刺激に応答して、 細胞膜に存在する TAB2蛋白質 が細胞質へ移行することが示された。従って、 TAB2蛋白質の細胞膜から細胞質へ の移行を指標として、 本発明のスクリ一ニングを行なうことができる。
TAB2蛋白質の膜から細胞質への移行を検出するには、 例えば、 実施例に記載さ れたように、膜画分と細胞質画分を分離して、それら試料中に含まれる TAB2蛋白 質を検出することにより行うことができる。 また、 TAB2に対する抗体を利用して 、 細胞免疫化学的手法を用いて in situ で TAB2の細胞内局在を検出することも 可能である。 また、 TAB2と他のペプチド （例えば適当なェビトープゃ GFPなどの 蛍光蛋白質など） との融合蛋白質として発現させることにより標識しておき、 こ れを基に細胞内分布を測定することもできる。 その結果、 被験試料を加えない細 胞における、 TAB2蛋白質の細胞質へ移行量と比較して、 被験試料を加えた細胞に おける TAB2蛋白質の細胞質へ移行量が少なければ、該被験試料に含まれる化合物 が IL-1のシグナル伝達を阻害すると判定される。
本発明は、 また、 本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物を有効成分 とする、 IL-1のシグナル伝達の阻害剤を提供する。本発明において「IL- 1のシグ ナル伝達の阻害剤」 とは、 IL-1のシグナル伝達を阻害するための試薬及び医薬の 双方が含まれる。 IL-1のシグナル伝達を阻害するための試薬は、 例えば、 JNKや NF- Bなどの IL- 1刺激に応答したシグナル伝達に関与する分子の阻害剤であり うる。 また、 IL- 1は、 炎症やアレルギー性疾患、 例えば、 敗血症、 関節リウマチ 、 喘息、 腎炎、 肝炎、 肺炎、 など様々な病態の進行に関与していると考えられる ことから、 TAB2を介した IL- 1のシグナル伝達を阻害する化合物は、 これら疾患 の治療や予防を目的とした医薬として利用することが考えられる。 本発明の IL-1のシグナル伝達の阻害剤の 1つの態様は、 TAB2蛋白質またはべ プチドと TAK1蛋白質および/または TRAF6蛋白質との結合を阻害する化合物を有 効成分とする。 本発明の IL-1のシグナル伝達の阻害剤の他の 1つの態様は、 TAB 2 の変異体または部分ペプチドである。 例えば、 配列番号： 2に示されるァミノ 酸配列において 401から 693までからなるァミノ酸配列を有する TAB2のドミナン 卜ネガティブが挙げられる。このドミナン卜ネガティブは TRAF6および TA 1との 結合能は有するが、 3者の複合体を形成する能力はなく、 TAK1のキナーゼ活性を 活性化させない。 そのため、 TAB2のドミナントネガティブは TAK1下流のシグナ ル伝達をおこさない。 そして、 正常な TAB2が TRAF6や TAK1と結合することを阻 害する。
上記のような IL-1のシグナル伝達を阻害する活性を有する化合物を、 例えば、 ヒ卜、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーなどの医薬として使用する場合に は、 蛋白質や単離された化合物自体を直接投与する以外に、 公知の製剤学的方法 により製剤化して投与を行うことも可能である。
例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイク 口カプセル剤として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得 る液との無菌性溶液、 又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例え ば、 薬理学上許容される担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防 腐剤、 結合剤などと適宜組み合わせて、 一般に認められた製薬実施に要求される 単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。 これら製剤 における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするもので ある。
錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油又はチヱリーのような香味剤が用いられる 。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液 状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のよう なぺヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナトリ ゥムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノール 、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 非 イオン性界面活性剤、 例えばポリソルべ一ト 80 (TM)、 HC0-50と併用してもよい 油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばべンジルアルコール、 フヱノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻 腔内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法によ り行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当 業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が DNAによりコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用べクタ一に組込 み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年 齢、 症状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である 本発明の蛋白質の投与量は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 成人（体重 60kgとし て） においては、 1日あたり約 100〃gから 20m であると考えられる。
本発明の TAB2を介したシグナル伝達を阻害する化合物の投与量は、症状により 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 成人 （体重 60kgとして） においては 、 1日あたり約 0.1から 100mg、 好ましくは約 1.0から 50mg、 より好ましくは約 1 .0から 20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） においては、 1 日あたり約 0.01から 30mg、 好ましくは約 0.1から 20mg、 より好 ましくは約 0.1から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考え られる。他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは体表面積あ たりに換算した量を投与することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 TAB2の単離を示す図である。
(A) TAB2のアミノ酸配列を示す。 TAK1を用いた酵母のツーハイプリッドスクリー ニングにより得られた配列を枠で囲って示した。 コイルドコィル領域には下線を つけてた。
(B)哺乳動物細胞における TAK1と TAB2の結合を示す。記載したように、空のべク ター（- )、 もしくは T7-TAB2全長 (Full )、 T7- TAB2C(C)、 または T7-TAB2N(N)の発 現ベクターと組み合わせ、 HA-TAK1発現ベクターを 293細胞に一過性にトランス フエク卜した。細胞抽出物は、 抗 T7抗体 (7)またはマウスの IgG(C)と免疫沈降（I P)した。共沈降した HA- TAK1を、抗 HA抗体によるィムノブロヅティング（IB)によ り検出した （上パネル、 左）。 免疫沈降した T7-TAB2蛋白質の量を、 抗 T7抗体に より測定した （下パネル）。 全細胞抽出物を、 抗 HA抗体でィムノブロッテイング し、 HA-TAK1の総量を決定した （上パネル、 右）。 様々な TAB2構築物の該略図を 、 下側に示している。 コイルドコイル領域は、 黒く塗って示した。
(C)酵母細胞における TAK1に対する TAB1および TAB2の作用を示す。酵母株 SY19 84を、 記載したように ΤΑΠ-ΗΑコードする発現ベクターと、 TAB1または TAB2の いずれかをコードする発現ベクターとで形質転換した。各細胞抽出物から TAK1-H Aを免疫沈降（IP)し、 免疫沈降物に、 細菌によって発現された MKK6を外来基質と して用いて in vitro リン酸化アツセィを行った （上パネル）。 「N/E」 （抽出物な し）は、 酵母抽出物非含有で実施したリン酸化アツセィを示し、 これは MKK6の自 己リン酸化に相当する。 各免疫複合体中の TAK1、 TABK および TAB2の量は、 そ れそれ、 抗- HA抗体 （中パネル)、 抗 -TAB1抗体および抗- TAB2抗体 （下パネル） によるィムノブロッテイング（IB )で測定した。
図 2は、 IL- 1および TGF- ?か媒介する経路における TAB2の作用を示す図であ る。
(A) NF- B活性化に対する TAB2の作用を示す。 空のベクタ一（- )もしくは記載し た量の全長 TAB2 [Full (卜 693) ]、 TAB2C [C(401-693 )]、 または TAB2N [N( l-400) ]の発現べクタ一と組み合わせた、レポー夕一ベクタ一 Ig- -ルシフェラ一ゼおよ び pAct- Gal を、 293細胞に一過性にトランスフエク卜した。 細胞は、 未処理 のまま放置するか、 もしくは、 IL- l( 10ng/ml )で 24時間処理した（ + IL- 1 )。ルシフ エラーゼ活性を測定し、 /5-ガラクトシダーゼ活性レベルで標準化した。空のべク 夕一でトランスフヱク卜された細胞に対するルシフヱラーゼ活性の上昇倍率を示 した。
(B) JNK活性化における TAB2の作用。 HA-JNKをコードする発現ベクターと、 TAB2 または TAB2Cのいずれかをコードする発現ベクターを、 記載したように、 293細 胞に一過的に共トランスフエク卜した。 トランスフエクシヨン 24時間後、細胞は 、 未処理のまま放置するか、 もしくは、 IL- l( 10ng/ml )で 30分間処理した（+ )。各 細胞抽出物から HA- JNKを免疫沈降し、 細菌で発現させた GST- cJunを外来基質と して用いて、 免疫沈降物の in vitro リン酸化アツセィを行った （上パネル）。 そ れそれの免疫複合体中の HA- JNK量を、 抗 HA抗体とのィムノブロッティングによ り決定した （下パネル）。
(C)3TP活性化における TAB2の作用を示す。 レポ一夕一ベクター 3TP-ルシフェラ ーゼおよび pAct- ?-Gal、 そして恒常的活性型の TGF- ?タイプ I受容体 [+T 5RI (T204D)] の発現ベクターおよび記載した量の全長 TAB2 [Full (卜 693)]、 TAB2C [ C(401-693)]または TAB2N [N (卜 400)]の発現ベクターを組み合わせて、 293細胞に 一過的にトランスフ クトした。 T ?RI(T204D)により誘導される 3TP活性を阻害 する陽性対照として Smad7を用いた。ルシフェラ一ゼ活性を測定し、 ?-ガラク ト シダーゼ活性レベルを標準化した。 空のベクターでトランスフヱク卜された細胞 に対するルシフェラーゼ活性の上昇倍率を示した。
図 3は、 TRAF6と TAB2の相互作用を示す図である。
(A)哺乳動物細胞における TRAF6 と TAB2の結合を示す。 2Flag-TRAF6の発現べク ターと、 空のベクター（-）または T7- TAB2全長 (Full)、 T7- TAB2C(C)もしくは T7-T AB2N(N)の発現ベクターとを記載したように組み合わせ、 293細胞に一過的にトラ ンスフヱクトした。細胞抽出物を、 抗 T7抗体 (7)またはマウス IgG(C)で免疫沈降 した（IP)。 共沈降した Flag- TRAF6は、 抗 Flag抗体によるィムノブロッテイング により検出した（IB) (上パネル、 左）。 免疫沈降した T7- TAB2蛋白質の量は、 抗 T 7抗体で測定した （下パネル）。 全細胞抽出物は、 抗 Flag抗体でィムノブロッテ イングし、 Flag-TRAF6の総量を決定した （上パネル、 右）。
(B)内因性 TRAF6、 TAB2、 TAK1および TAB1の結合を示す。 293IL-1RI細胞を、 未 処理のままか（0分)、 もしくは、 IL- l(10ng/ml)で記載した時間処理した。細胞抽 出物を、 抗 TRAF6で免疫沈降した（IP)。 共沈降した TAB2、 TAKU および TAB1を 、 それそれ、 抗 TAB2抗体 （上パネル、 左)、 抗 TAK1抗体および抗 TAB1抗体 （中 パネル、 左） を用いたィムノブロッテイングにより検出した（IB)。 免疫沈降した TRAF6の量は、 抗 TRAF6抗体を用いたィムノブロッテイングにより決定した （下 パネル）。 全細胞抽出物を、 抗 TAB2抗体 （上パネル、 右）、 抗 TAK1抗体および抗 TAB1 抗体 （中パネル、 右） を用いてィムノブロッテイングし、 それそれ、 TAB2、 TAK1および TAB1の総量を決定した。
図 4は、 IL- 1により誘導される TAB2の移行を示す図である。
(A) IL-l刺激の存在または非存在下での 293IL- 1RI細胞の細胞内画分を示す。 293 IL-1RI細胞を、 未処理のままか（0分)、 もしくは、 IL- 1で記載した時間処理した 。 細胞を膜 (P100 )および細胞質（S100)画分に分け、 抗 TAB2抗体 （上パネル)、 抗 TAK1抗体および抗 TAB1抗体 （第二パネル）、 抗 TRAF6C抗体 （第三パネル） でィ ムノブロッティングした（IB)。 ァス夕リクス （* ) は、 抗 TRAF6Cにより検出され た非特異的バンドを示す。 更に各画分は、 膜および細胞質画分の対照として、 そ れそれ、 抗 ? -カテニン抗体 （第四パネル） および抗ひ -チューブリン抗体 （下パ ネル） によりィムノブロッテイングした。
(B)細胞質における TAB2の、 TAK1、 TAB1、 および TRAF6との結合を示す。 293IL- 1RI細胞を、 未処理のまま放置するか (- )、 もしくは、 IL- l ( + ) ( 10ng/ml )で 15分 間処理した。 これらの細胞の S100画分を、抗 TAB2抗体またはゥサギ IgG (対照 I gG)で免疫沈降した （IP)。免疫沈降した TAB2の量は、 抗 TAB2抗体によるィムノ ブロッテイング（IB )により測定した （上パネル、 左）。 共沈降した TAK1、 TABU および TRAF6は、 それそれ、 抗 TAK1抗体および抗 TAB1抗体 （中パネル、 左)、 お よび抗 TRAF6C抗体 （下パネル、 左） によりィムノブロッテイングして検出した。 S100画分中の TAB2、 TAKK TAB1、 および TRAF6の総量（S100合計）を、 抗 TAB2抗 体 （上パネル、 右）、 抗 TAK1抗体および抗 TAB1抗体 （中パネル、 右）、 および抗 TRAF6C抗体 （下パネル、 右） によりィムノブロッテイングして測定した。 ァス夕 リクス （* ) は、 抗 TRAF6C抗体により検出された非特異的バンドを示す。
図 5は、 TAK1と TRAF6との相互作用への TAB2の作用を示す図である。
Flag- TRAF6および HA- TAK1の発現べクタ一を、 空のベクタ一（ - )、 または T7-T AB2全長 （Ful l )もしくは T7-TAB2C (C) の発現べクタ一と組みあわせて、 記載し たように 293細胞にトランスフヱク卜した。 細胞抽出物を、 抗 HA抗体 (H)または マウス IgG(C)で免疫沈降した（IP)。 共沈降した Flag-TRAF6、 T7 - TAB2および T7- TAB2Cが、 それそれ、 抗 Flag抗体 （上パネル、 左） および抗 T7抗体 （中パネル 、 左） によるィムノブ口ヅティングにより検出された（IB )。 各免疫複合体中の HA - TAK1の量を、 抗 HA抗体により測定した （下パネル）。 全細胞抽出物は、 抗 Flag 抗体および抗 T7抗体によりィムノブロッテイングし、 各々、 Flag- TRAF6、 T7-TA B2および T7- TAB2Cの総量を測定した （右パネル）。
図 6は、 自己リン酸化による、 IL-1 により誘発される TAK1の活性化を示す図 である。
(A) IL-lにより誘発される TAK1のリン酸化および活性化を示す。 293IL-1RI細胞 を、 IL- l ( + ) ( 10ng/ml )で 10分間処理するか、 もしくは、 未処理のまま放置 ( -）し た。細胞抽出物を、 抗 TAK1抗体で免疫沈降した。 この免疫沈降物は、放置するか
(レーン 1，2)、 もしくは、 え蛋白質ホスファタ一ゼと共にインキュベートした （ レーン 3および 4； PPase処理）。 全ての試料を、 抗 TAX 1抗体および抗 TAB 1抗体 でィムノブロッテイング（IB)し （上パネル）、 細菌で発現させた MKK6を外来基質 として用いて in vitroのリン酸化アツセィを行った （下パネル）。
(B) IL-lにより誘発される TAK1の自己リン酸化を示す。 293IL- 1RI細胞に、 HA-T AK HA-TAKl(K63W) または HA- TAK1(S192A)の発現ベクターを記載したように一 過的にトランスフエクトした。 細胞を、 IL- l( + ) ( 10ng/ml )で 10分間処理するか、 もしくは、 未処理のまま放置 ( -）した。 HA-ェピトープで標識した野生型および変 異 TAK1を、 抗 HA抗体を用いたィムノブロッテイング （IB) によって検出した。 (OTAK1および他の MAPKKK類の活性化ループのアミノ酸配列を並置した。ァス夕 リクス （* ) は、 リン酸化され、 これらのキナーゼの活性化に関わっていること が示された残基を意味する。
(D)野生型および変異 TAK1のキナーゼ活性。 293細胞に、 HA- TAK1 (WT)、 HA-TAKK S192A)(SA)、 または HA- TAK1 (S192D)(SD)、 および TAB1の発現ベクターを記載し たようにトランスフヱクトした。抗 HA抗体による免疫沈降物に対し、外来基質と して細菌で発現させた MKK6を用いて in vitroのリン酸化アツセィを行った （上 パネル）。各々の免疫複合体中の HA-標識した野生型および変異 TAK1の量を、抗 T AK1抗体によるィムノブ口ッティングにより決定した （下パネル）。
図 7は、 IL-1シグナル伝達に TAB2がどのように関与するかを示すモデル図で ある。
IL-1受容体から JNKおよび NF- ΑΓ Βへとつながる主要なシグナル伝達経路を示 した。 詳細は本文を参照のこと。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例および参考例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれ らに限定されるものではない。
[実施例 1 ] TAB2の単離
本発明者らは、 TAK1応答の特異性をもたらすように作用するアダプター蛋白質 を同定するため、酵母のヅ一ハイブリツ ドにより TAK1と結合する蛋白質のスクリ 一二ングを行った。 これにより本発明者らは、 2種の TAK1結合蛋白質、 TAB1およ び TAB2を単離した（Shibuya，H. et al .， ( 1996 ) Science, 272, 1179-1182)。こ のうち TAB1は、 TAKlの直接的な活性化因子として機能することが見出されてい る (Shibuya,H. et al .， ( 1996 ) Science, 272， 1179-1182)。
一方、 TAB2断片をコードするプラスミ ド pGAD- TAB2( 394- 693)は、 TAB2のアミ ノ酸 394- 693 [TAB2( 394- 693 ) ]をコードしている。続いて、 TAB2( 394- 693 )をプロ ープとしてヒト腎 cDNAライブラリー（Clontech社）をスクリーニングし、 TAB 2の N -末端が欠失した 3.3kbのクローンを単離した。 TAB2 cDNAの 5，末端は、 5' -RAC E - Ready cDNA(Clontech社）にを用いた cDNA- 5，末端迅速増殖法（5， -RACE )で単離 した。 TAB2の全長 cDNAは、 5， -RACE産物から得られた 270-塩基対の EcoRI-NcoI 断片、 およびヒト腎 cDNAライブラリ一からの 3. 3 kbクローンの 2.2 kbの Ncol -Hindi I I断片の連結により再構築した。 ノーザン（RNA)ブロット分析により、 cMAとサイズが一致する約 5bpの TAB2転 写物が、 様々な組織において発現されていることが明らかになった （デ一夕省略 )。 シークェンス分析から、 TAB2蛋白質は、 693個のアミノ酸からなる分子量 77 kDa の蛋白質であることが予想された （図 1A)。 TAB2配列のひとつの際立った特 長は、 両親媒性のひ-ヘリックスを形成する可能性のあるアミノ酸 （535-609) が 存在することである。他の点では、 TAB2と他の公知の蛋白質との間に明らかでか つ顕著な類似性は認められず、このことは TAB2が新たなクラスの蛋白質であるこ とを示している。
[実施例 2 ] TAK1と TAB2の間の相互作用
く細胞培養および発現べクタ一〉
以下の実験で用いた 293および 293IL- 1 RI細胞は、 ゥシ胎仔血清（10%)を補 充したダルベッコ改変イーグル培地で、 37°Cおよび 5%C02で培養した。 TRAF6、 T ABU TAKK および後述の TAK1(K63W)をコードしている哺乳動物発現べクタ一に ついては先に記載されている (Yamaguchi,K. et al.， (1995) Science, 270, 20 08-2011; Cao,Z. et al.， (1996) Nature, 383, 443-446; ShirakabeJ. et al. ， (1997) J.Biol.Chem., 272, 8141-8144; Ninomiya-Tsuji, J. et al., (1999) Nature, 398， 252-256)。 pCMVT7ベクタ一は、 CMVの Clal- EcoRIギヤヅプへ T7 ェビトープ配列（MASMTGGQQMG)をコードする DNA断片を挿入することによって構 築し、 CMVプロモーターの制御下で、 N-末端に T7ェピトープタグが付加された蛋 白質を発現させた。 PCMVT7-TAB2は、 常法を用いて、 pCMVT7へ TAB2 の 0RFをサ ブクロ一二ングすることによつて作製した。 TAB2のアミノ酸 1-400および 40卜 6 93をそれそれコードしている欠失変異体 TAB2Nおよび TAB2Cは下記のように作製 した。 TAB2N変異体を作製するためには、 250塩基対断片を、 Sspl制限部位を含 む 5， -オリゴヌクレオチド（5， -TATAACATTCAGAATATTTCAACAGGACCT-3' /配列番号 ： 3)、ならびに終結コドンおよび Sail制限部位を含む 3，-オリゴヌクレオチド（ 5' -CAGGTCGACTCACTGTTCATCTCCTGTGGC-3' /配列番号： 4 )により PCR増幅した。得 られた 250塩基対の Sspl-Sal l断片、 および pCMVT7-TAB2から得られた 950塩基 対の EcoRI-SspI断片を、 CMVT7の EcoRI-Sal lギヤッブに挿入した。 TAB2C変異 体を作製するためには、 330塩基対断片を、 EcoRI制限部位を含む 5' -オリゴヌク レオチド（5，-CGCGMTTCATGCGGAATCAGCCCACACTC- 3，/配列番号： 5 )、 および Pstl 制限部位を含む 3， -ォリゴヌクレオチド（5， -CCCCTGGTGAAACTGCAGGGGGCTTATTGG-3 ' /配列番号： 6 )により PCR増幅した。 得られた 330塩基対の EcoRI-Pstl断片、 および PCMVT7-TAB2から得られた lkbの Pstl- Sai l断片を、 pCMVT7の EcoRI-Sal Iギャップへ挿入した。 全ての構築物は、 MAシークェンシングにより確認した。 <抗体および免疫沈降法 >
ここで、 実施例で用いた抗体おとび免疫沈降について記載する。 TAB2に対する ゥサギのポリクローナル抗体 (抗 TAB2抗体）を、 TAB2のアミノ酸卜 20に相当する ぺプチドに対して作製した。 TRAF6に対するゥサギのポリクロ一ナル抗体 (抗 TRA F6C抗体）は、 TRAF6のアミノ酸 497- 522に相当するべプチドに対して作製した。 T RAF6に対するャギのポリクロ一ナル抗体である TRAF6(C20) ( Santa Cruz社）を、 後述の内因性 TRAF6の免疫沈降に使用した。 TAK1 に対するポリクローナル抗体（ 抗 TAK1抗体）および TRAF6に対するポリクロ一ナル抗血清（抗 TRAF6抗血清）につ いては先に記載されている (Lomaga, .A. et al .， ( 1999 ) Genes Dev. , 13, 101 5-1024; Ninomiya- Tsuji ,J. et al .， ( 1999 ) Nature, 398, 252- 256)。 HAに対す るモノクローナル抗体 HA. 11 (Babco社）、 T7に対するモノクローナル抗体 (Novage n社)、 および Flagに対するモノクローナル抗体 M2(Kodak社）を使用した。 精製 したゥサギおよびマウスの IgG( Sigma社）を、 対照の抗体として使用した。
293 IL-1 RI細胞は、 未処理のまま放置するか、 もしくは、 記載された時間 IL- l ( 10ng/ml )で処理した。 トランスフエクシヨン試験のために、 293 細胞（l x lO6 ) を 10cmディッシュに播種し、 リン酸カルシウム沈殿法により、様々な発現べクタ —を含む合計 10 g DNAでトランスフエクトし、 24〜36時間ィンキュベ一トした 。 細胞を氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水 (PBS)で 1回洗浄し、 20mM HEPES(pH7. 4)、 150mM NaClヽ 12.5mM グリセ口リン酸、 1. 5mM MgCl2、 2mM EGTA、 lOmM Na F、 2mM DTT、 ImM オルトバナジン酸ナトリウム、 lmM PMSF、 および 20 iMァプロ チニンを含有する 0.5%Triton X- 100溶解バッファ一 0.3mlで溶菌した。 細胞破 片を、 10，000gで 5.分間遠心分離除去した。 細胞溶解物からの蛋白質は、 様々な 抗体 l〃gおよび Protein G-Sepharose( Pharmacia社） 20 / 1で免疫複合体を形成 させた。 この免疫複合体を、 20mM HEPES(pH7.4)、 500mM NaCl、 および lOmM MgC 12を含有する洗浄バッファ一で 3 回洗浄し、 20mM HEPES( pH7.4)、 150mM NaCl、 および lOmM MgCl2を含有するリンスバッファ一 40〃1中に懸濁した。 ィムノブ口 ッティングのためには、 この免疫沈降物または全細胞溶解物を、 SDS-ポリアクリ ルアミ ドゲル電気泳動（SDS- PAGE )により分離し、 Hybond- P膜 (Amersham社）に転写 した。 これらの膜を、 様々な抗体でィムノブロッテイングし、 結合した抗体を、 増強化学発光（ ECL)によるウエスタンプロットシステム（Amersham社）を用いて、 ホースラディッシュペルォキシダーゼを結合した抗ゥサギまたは抗マウス IgG抗 体により可視化した。
<結果>
TAK1と TAB2 との間の相互作用を、 哺乳動物細胞における in vivo共沈降実験 法を用いて調べた。 293細胞に、 それそれ、 T7タグを付加した TAB2蛋白質および HAタグを付加した TAK1蛋白質を発現する上記プラスミ ドを共トランスフエクト した。細胞抽出物を、 抗 T7モノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、共沈降した HA-TAK1を、抗 HAモノクローナル抗体によるィムノプロッティングにより検出し た （図 1 B)。 その結果、 TAK1 は TAB2に結合していることが判明した （レーン 4 )。 本発明者らはさらに、 内因性の TAB2および TAK1の結合を示すことによって、 TAB2の TAK1との相互作用が生理的なものであることを確認した （下記参照）。
TAB2が TAK1 と相互作用するための構造的な必要要件を決定するために、 本発 明者らは 2種の欠失蛋白質である T7- TAB2Nおよび T7-TAB2Cを作製した （上述） 。 これらはそれそれ、 TAB2の N-末端 （アミノ酸卜 400) および C-末端 （アミノ酸 40卜最後まで） を含んでいる （図 1 B)。 293細胞において HA- TAK1 と共発現させ たところ、 TAK1は TAB2Cとは共沈降するが、 TAB2Nとはしないことが判明した （ レーン 6，8)。 この結果は、 コイルドコイル構造を含む TAB2の C-末端ドメインが 、 TAK1 との結合に寄与していることを示している。 一方で、 先行する研究では、 同じくコイルドコイルひヘリックスを含む TAK1の C-末端ドメインが、 TAB2との 相互作用に寄与していることが示されている （Shibuya,H. et al . , ( 1996 ) Scie nce, 272， 1179- 1182)。従って、 これらのコイリレドコイルモチーフは、 TAK1およ び TAK2 の間の接触を媒介する蛋白質間の相互作用ドメインとして機能している のかも知れない。
[実施例 3 ] TAB2は TAK1の直接の活性化因子として作用しない
く発現べクタ一および酵母培養 >
酵母株 SY1984を、 pNVl卜 TAIQ- HAと共に、 YEpGAP112ベクター、 YEpGAP112-TA Bl、 または YEpGAP112-TAB2を組み合わせて共形質転換した。 ブラスミ ド YEpGAPl 12 - TAB2は、 YEpGAPl 12ベクターへ TAB2の 0RF (コード領域） をサブクローニン グして構築した。発現プラスミ ド pNVll-ΤΑΐα-ΗΑおよび YEpGAP112- TAB1は、先に 記載されたものである ( Shibuya, H. et al . , ( 1996 ) Sc ience , 272, 1179-1182 ) o 全ての構築物は、 DNA シークェンシングにより確認した。 形質転換体（100ml 培養物）を、 600nmにおける光学濃度が 0.6になるまで増殖させた。 50mM Tris-H CI (pH 7.5 )、 lOOmM NaCl、 ImM Na4P207、 5mM NaF、 ImM EDTA、 1% Triton-X 100 、 50mM D0C、 ImM PMSF、 0.5¾ ァプロチニン、 および ImM DTT を含有する溶菌バ ッファーで細胞抽出物を調製し、 10，000gで 5分間微量遠心機により分離した。 1 0, 000gで 10分間再遠心分離した後、 上清を、 抗 HAモノクローナル抗体 (HA. 11 ) で免疫沈降し、 下記のようにキナーゼ活性をアツセィした。
く in vitroリン酸化アツセィおよびホスファタ一ゼ処理〉 TAK1または様々な異所的発現した HA-ェピトープ夕グを付加した蛋白質は、 先 に記したように、 それそれ、 抗 TAK1抗体または抗 HA抗体で免疫沈降した。 免疫 沈降物を、 20mM Tris- HC1、 および lOmM MgCl2を含有する A-mixバッファ一 40〃1 中で懸濁し、 細菌により発現された MKK6 (MoriguchiJ. et al .， ( 1996 ) J. Biol .Chemつ 271, 13675-13679) \ .g と共に、 lOmM HEPES(pH7.4)、 ImM DTTヽ 5mM M gCl2、 および 5〃Ciの [ァ- 32P]-ATP(3， 000 Ci/讓 ol )を含有するキナーゼバッファ 一 10〃1中で、 25°Cで 2分間インキュベートした。 試料は、 12%SDS- PAGE上で分 離し、 オートラジオグラフィ一により可視化した。 ホスファタ一ゼ処理について は、 免疫沈降物を、 50mM Tris- HCl (pH 7.5 )、 O. lmM EDTA、 5mM DTTヽ 0.01%Brij 35、および 2mM MgCl2を含有するホスファタ一ゼバッファ一中で入蛋白質ホスフ ァ夕ーゼ（New England Biolabs社）と共に、 30°Cで 30分間インキュベートした。 その後試料を、 前述の溶解バッファーで 2回、 PBSで 2回洗浄し、 全ての試料に ついて、 前述の in vitroリン酸化アツセィを行った。
<結果 >
TAK1活性は、 TAK1に特異的に結合する TAB1によって制御されると考えられる ので、 本発明者らは酵母細胞を用いて、 TAB2の TAK1 との相互作用が、 その酵素 活性を調節することができるかどうかを決定した。 酵母細胞に、 TAIQ- HA に加え 、 TAB1 または ΤΑΒ2のいずれかの発現プラスミ ドを共トランスフエクトした。 そ の後、 トランスフエク卜した酵母細胞から TAK1蛋白質を免疫沈降（IP )し、そのキ ナーゼ活性を、 特異的基質 MKK6 を用いて in vitro で測定した （図 1 C)。 空の ベクタ一プラスミ ドを共トランスフヱクトした場合、免疫沈降された TAK1はほと んど触媒活性がなかった （レーン 2)。 酵母細胞に TAB1発現プラスミ ドを共トラ ンスフェク トした場合、 TAK1キナーゼ活性の顕著な上昇が認められた （レーン 3 )。 この知見は、 TAB1は TAK1の活性化因子として機能するという先に公表された 結果と一致している (Shibuya,H. et al . 3 ( 1996) Science, 272, 1179-1182)。 他方で、 TAB2の共発現は TAK1を活性化しなかった （レーン 4)。 従って、 TAB1と は対照的に、 TAB2は TAK1の酵素活性に対する調節因子ではないことが判明した
[実施例 4] TAB2は IL- 1シグナル伝達分子として機能する
TAB2が IL-1 シグナル伝達に関与するかどうかを決定するために、 本発明者ら は、 IL-1刺激後の NF- B活性化に TAB2が及ぼす影響について調べた。 TAB2を発 現する哺乳動物用べクタ一を 293細胞にトランスフエクトし、 NF- B依存性のル シフェラーゼレポ一夕一を用いて NF-ΑΓΒ活性のアツセィを行った。
レポーター遺伝子アツセィのためには、 6ゥエル（35mm)プレートに、 293細胞（ 1.6X105細胞/ゥエル）を播種した。 播種して 24時間後、 記載したようにレポ一 ター遺伝子プラスミ ドおよび各発現プラスミ ドを細胞にトランスフエクトした。 I g- -ルシフェラ一ゼレポーターを用いて NF- A:B依存性の転写を測定した。 β- ァクチンプロモー夕一制御下の/?-ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するプラスミ ド（pAct- ?-Gal)を用いて、 トランスフエクシヨン効率を標準化した。レポーター 遺伝子アツセィは、 以前記載したように行った （Ninomiya-Tsuji,J. et al.， (1 999) Nature, 398， 252-256)。
図 2Aに示すように、 TAB2 は、 NF- B を用量依存的に活性化した。 TAB2の 2 種の欠失変異体である TAB2Nおよび TAB2C (図 1 B参照）は、 いずれもルシフェラ ーゼ活性を誘導しなかったことから、 TAB2全体が NF-A:Bを活性化する能力に必 須であることが示唆される。 野生型蛋白質および変異蛋白質の発現レベルが同等 であることは、 ウエスタンプロット法により確認した （デ一夕省略)。 IL-1 が媒 介する NF - Bの活性化における TAB2の役割を更に解明するために、 本発明者ら は、 これらの TAB2の欠失変異体が、 IL- 1が誘導する NF- B活性のドミナントネ ガティブインヒビ夕一として作用するかどうかを調べた。 TAB2Cは IL- 1による N F- B活性化を強力に阻害する一方で、 TAB2Nはこれを弱く阻害した （図 2A)。 こ れらの結果は、 TAB2が、 IL- 1による NF- A:Bの活性化に必要であることを示して いる。
NF-ΑΓΒの活性化に加え、 IL- 1は JNKの活性化を誘導する (Dinarello,C.A. (1 996) Blood, 87, 2095-2147)。 IL- 1が媒介する JNKの活性化に、 TAB2が関与して いるかを決定するために、 本発明者らは、 JNK活性に対する TAB2の発現の作用に ついて調べた （図 2B)。 HA-標識した JNKを、 野生型 TAB2または TAB2Cのいずれ かと共に 293細胞に共トランスフエクトした。 JNKを免疫沈降し、 GST- c-Jun蛋白 質を基質として in vitro キナーゼアツセィを行い、 JNK活性の程度を決定した 。 野生型 TAB2は、 JNKの活性化を著しく誘導した （レーン 1,2)。 TAB2Cの過剰発 現は、 IL- 1により誘発される JNK活性化を阻害した （レーン 3，4) ことから、 TA B2Cは、 IL- 1が媒介する JNKに対してもドミナントネガティブ作用を発揮するこ とが示された。 これらの結果を合わせて考慮すると、 TAB2は、 IL- 1による NF- C Bおよび JNKの両方の活性化に参画していることが示唆される。
本発明者らは次に、 3TP- Lux レポ一夕一を用いて、 TGF- ?が媒介するシグナル 伝達に対して TAB2が作用を及ぼす能力について試験した （図 2C)。 3TP-Luxレポ 一夕一は、 プラスミノ一ゲンァクチべ一夕一インヒビ夕一 1遺伝子に由来する TG Y-/3応答配列によって制御されるルシフヱラーゼ遺伝子を含む。
上記の Ig- -ルシフェラ一ゼレポ一夕一の代わりに 3TP-ルシフェラーゼレポ —夕一を用いて、 TGF- β依存性の転写を NF- c Β活性のアツセィと同様に測定した 。 ァクチンプロモー夕一制御下の^-ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するブラ スミ ド（pAct-5- Gal)を用いて、 トランスフエクシヨン効率を標準化した。
293細胞において、 TAB2のトランスフエクシヨンは、 3TP- Luxの基本的転写に 対しほとんど影響がなかった。 TGF- ?シグナル伝達は、 TGF- ?1 型受容体の恒常 的活性型 [T ?RI(T204D)]の発現により開始され、 リガンドゃ II型受容体が存在 しなくても TGF-5応答シグナルを伝達する。 T ?RI ( T204D )のトランスフエクショ ンは、 3TP- Luxレポ一夕一の基本発現を上昇させ、 これは負のレギユレ一夕一 Sma d7の共発現によって強力に阻害された。 他方で、 TAB2Cおよび TAB2Nはいずれも 、 T ?RI(T204D)により活性化された 3TP-Lux活性には全く作用しなかった。 これ らの結果は、 TAB2は、 TGF- ?シグナル伝達経路に関与していないことを示してい る。
[実施例 5 ] TAB2は TRAF6に結合する
TRAF6は、 IL-1シグナル伝達経路に関与し （Cao,Z. et al., (1996) Nature, 383， 443-446; Lomaga,M.A. et al., (1999) Genes Dev., 13, 1015-1024)、 TAK 1と複合体を形成することが示されている (Ninomiya-Tsuji,J. et al., (1999) Nature, 398, 252-256)。 従って本発明者らは、 TAB2が TRAF6 と相互作用するこ とができるかどうかを調べた （図 3A)。 293細胞において、 T7-TAB2と Flagタグ を付加した TRAF6 とを共発現させ、 抗- T7抗体で免疫沈降した。 これらの免疫複 合体を、抗 Flagモノクローナル抗体によるィムノブロティングに供した。その結 果、 TAB2は、 TRAF6により効果的に沈降した （レーン 4)。 TAB2のどのドメインが TRAF6との結合に関与しているかを決定するために、本発明者らは、 TAB2Nまたは TAB2Cが TRAF6 に結合することが可能であるかどうかを、 同じ実験方法を用いて 試験した。 その結果、 TRAF6は、 TAB2Cとは共沈降するが、 TAB2Nとはしないこと が判明した （レーン 6，8)。 これらの結果から、 TAB2の C-末端ドメインが、 TRAF6 との結合には必要である。
本発明者らは、 TRAF6と TAB2の相互作用が、 これらの蛋白質の生理的なレベル でも生じるかどうかを調べた （図 3B)。 293IL- 1RI細胞を、 IL- 1で処理するか、 もしくは未処理のまま放置し、 内因性 TRAF6を抗 TRAF6ポリクローナル抗体で免 疫沈降した。 これらの免疫沈降物を、 TAK1、 TAB1 または TAB2に対するポリクロ —ナル抗体によるィムノブロッテイングで分析した。 先に観察されたように （Ni nomiya-Tsuji,J. et al., (1999) Nature, 398, 252-256)、 内因性 TAKlおよび T AB1は、 IL- 1依存的に TRAF6と共沈降した （中央のパネル）。非刺激細胞において は、 内因性 TAB2の TRAF6 との結合はほとんどなかった。 しかし、 IL- 1刺激時に はこの結合は明らかになり、 TRAF6に対する TAB2の結合カイネテイクスは、 TRAF 6に対する TAK1および TAB1の結合力イネティクスと同等であった （上パネル）。 これらの結果は、 TRAF6に対する内因性の TAK1、 TAB1、 および TAB2の結合は、 リ ガンド依存性であることを示している。
TAK1および TAB2が、 IL-1依存的に TRAF6に対してどのように相互作用するか をさらに調べるために、 本発明者らは、 生理的条件下でのこれらの蛋白質の細胞 内分布を調べた （図 4 A)。
約 70%コンフレンシ一の 293IL-1RI細胞を、 未処理のまま放置するか、 もしく は、 IL-l ( 10ng/ml )で記載した時間処理し、 lOmM HEPES(pH7.4)、 1.5mM MgCl2N 1 OmM KC1、 0.2mM PMSF、 および 0.5mM DTTを含有する氷冷した低張バッファー 0.5 ml中に再懸濁し、 Dounceホモジナイザーを用いて、 氷上で 30ストロークでホモ ジナイズした。 溶解されない細胞、 核、 細胞破片を、 l , 000gで 5分間遠心分離し 、 ペレツト化した。 100, 000gで 1時間遠心分離し、 可溶物 [上清（S100) ] (細胞質 ) および顆粒分 [ペレツ ト（P100) ] (膜） 画分を得た。 各画分の試料は、 SDS- PAGE により分離し、 TAK1、 TAB TRAF6、 および TAB2蛋白質の存在を先に記した抗体 を用いてィムノブ口ッティングにより分析した。
ウエスタンブロッテイングにより、 TAK1および TAB1蛋白質の大部分が細胞質 画分に含まれる一方で、 TRAF6 蛋白質は膜および細胞質の両画分に存在すること が明らかになった。 IL- 1刺激は、 TAK1、 TAB1、 または TRAF6の局在化パターンを 変化させなかった。対照的に、 TAB2蛋白質は、 IL-1刺激がない場合は、 ほとんど 膜画分に存在した。 IL-1刺激により、 著しい量の TAB2蛋白質が細胞質移行した 抗- TAB2抗体を用いて細胞質抽出物の免疫沈降を行い、 内因性 TAK1および TRA F6蛋白質との共沈降を、 ィムノブロッ ト分析により調べた （図 4 B)。非刺激細胞 においては、 それそれ TAK1および TRAF6に対する TAB2の結合はわずかであるか 、 もしくは結合していなかった。 しかしながら、 これらの相互作用は IL-1刺激に より劇的に増加した。 総合すると、 これらの知見は、 IL-1は TAB2の細胞質への 蓄積を誘導し、 そこで TAB2が TRAF6および TAK1 と複合体を形成することを示唆 している。
細胞内画分により、 IL-1が存在しない場合は、 TAB2は主として膜に局在するこ とが明らかになった。 IL- 1の刺激は、 TAB2の細胞質への放出をもたらし、 TRAF6 および TAK1の間の相互作用を媒介することを可能にする （図 4 )。 TAB2は、 膜と 相互作用することが予想されるドメインを有さないので、 他の分子 (群）によって 膜につながれているのかも知れない。 IL- 1処理により、 TAB2はこれらの分子（群） から解離し、 細胞質において TAB2の蓄積が生じるのであろう。 従って、 TAB2を 過剰発現させると、膜が全てを保持することができない程過剰な TAB2が提供され ることによって、 IL- 1 リガンドの作用が模倣されると考えられる。実際に本発明 者らは、 TAB2を過剰発現させると、 IL-1刺激が存在しない場合であっても、 TAB 2が細胞質に蓄積することを見出した （データ省略）。 TAB2の過剰発現は、 TRAF6 および TAK1の動員を通じて、 JNKおよび NF- Bの活性化につながるシグナル伝 達経路を誘導する。 従って、 IL- 1刺激による TAB2蛋白質の再分布は、 TAK1を特 定化するのに関連した重要なステップである。 本発明者らのデータは、 膜から細 胞質への TAB2の移行が、蛋白質複合体の特異的かつダイナミックなアッセンプリ に関与しており、 IL-1 シグナルが TAK1の活性化へと翻訳されるための重要なス テツプになっていることを示唆している。
[実施例 6 ] TAB2は TAK1の TRAF6への結合のアダプター蛋白質として機能す る
前述の知見は、 TAB2が、 TAK1の TRAF6への結合のためのアダプター蛋白質とし て機能する可能性を示唆する。 TAB2が TRAF6と TAK1 との間のアダプター蛋白質 として機能するならば、 TRAF6および TAK1の過剰発現は、 細胞中の内因性 TAB2 の量には限界があるので、 TAK1と共沈降する TRAF6の量を減少させるはずである 。 この点を明らかにするために、 T7- TAB2 の存在下または非存在下、 Flag- TRAF6 を HA- TAK1と共に 293細胞に卜ランスフエク卜した （図 5 )。 Flag-TRAF6と HA- T AK1 との間には弱い相互作用が認められた （上パネル、 レーン 2)。 ここに TAB2 を共発現させると、 TAK1と TRAF6との共免疫沈降を増強した （上パネル、 レーン 4)。 これらの結果は、 TAB2が TAK1および TRAF6 と共に三重複合体 （夕一ナリ一 コンプレックス） を形成し、 これらの蛋白質の相互作用を促進するというモデル と一致している。
IL-1シグナル伝達に対する TAB2Cの顕著な阻害作用に関する生物学的な基盤を 更に調べるために、 本発明者らは、 TRAF6および TAK1の複合体形成におけるこの 領域の潜在的な役割について試験した。 T7-TAB2Cを、 Flag- TRAF6および HA-TAK1 と共発現させた。 TAB2の C-末端ドメインは、 TAK1または TRAF6のいずれかと相 互作用するのに十分であることが見出された （図 1 B および 3 A)。 これと一致す るように、 TAB2Cは TAK1と共沈降した （図 5、 中パネル、 レーン 6)。 しかしなが ら、 TAB2Cの過剰発現は、 TAK1の TRAF6への結合を増強しなかった （上パネル、 レーン 6)。従って、 TAB2C-TRAF6および TAB2C- TAK1の二量複合体は形成されるが 、 TRAF6-TAB2- ΤΑΠの三重複合体の形成には、 TAB2全体の構造が必要である。 IL - 1シグナル伝達アツセィにおける TAB2Cの際立った阻害作用は、 おそらく、 TRAF 6および TAK1の効果的なァセンブリを阻害する TAB2Cの能力に由来するものであ ろう。 これらの結果は、 TAB2が TRAF6および TAK1を連結する中間のシグナル伝 達分子であり、この結合が LI- 1シグナルを伝達するために必要であることを示唆 している。
[実施例 7 ] IL-1は自己リン酸化を介して TAK1を活性化する
IL-1刺激後に TAK1 がどのように活性化されるかを調べるために、 本発明者ら は、 IL- 1処理した細胞および未処理の細胞において内因性 TAK1複合体を分析し た （図 6 A)。 293IL-1RI細胞を IL-1で刺激すると、 先に観察されたように （Nino miya-Tsu i ,J. et al.， （1999 ) Nature, 398， 252-256)、内因性 TAKlが活性化さ れた （下パネル、 レーン 1，2)。 ィムノブロッテイングにより、 IL- 1処理細胞およ び未処理細胞の両方において、 TAB1は TAK1 と共沈降することが明らかになった (上パネル、 レーン 1, 2)。 このことは、 TAB1が恒常的に TAK1 と結合しているこ とを示唆している。 しかしながら、 IL- 1で処理された細胞では、 TAK1および TAB 1は、 SDS- PAGEにおいてよりゆっく りと移動することがわかった。 ホスファタ一 ゼ処理を行うと、 これらのゆっくり移動するバンドは消失した （上パネル、 レー ン 3, 4) ことから、 これらはリン酸化の結果であることが示唆される。 TAK1複合 体をホスファタ一ゼで前処理を行うと、 MKK6をリン酸化する TAK1の能力は失わ れた （下パネル、 レーン 4) ことから、 脱リン酸化が TAK1キナーゼ活性を失活さ せることか示唆される。従って、 TAK1のリン酸化は、 その触媒活性にとって必須 である。 これらの結果は、 IL- 1が、 予め形成された TAB1- TAK1複合体のリン酸化 を介して TAK1を活性化することを示唆している。
IL- 1により誘導される TAK1のリン酸化は、 別の蛋白質キナーゼにより、 また は自己リン酸化により媒介されうる。 これらの 2つの可能性は、 触媒的に不活性 な TAK1変異蛋白質が、 IL- 1処理によりリン酸化されるかどうかを試験すること により区別することができる。もし別のキナーゼが TAK1 リン酸化に寄与している ならば、 触媒的に不活性の TAK1でも、 依然として IL-1に反応してリン酸化され るはずである。 反対に、 自己リン酸化が TAK1のリン酸化に寄与しているならば、 触媒的に不活性な TAK1はリン酸化されないだろう。触媒的に不活性な変異キナー ゼである TAK K63W) (上述） を使用した結果は、 後者の可能性を裏付けるもので あった。 野生型 TAK1は IL- 1に応答してリン酸化されたが、 TAK1 (K63W)はリン酸 化されなかった （図 6 B、 レーン 1-4)。 これらの結果は、 TAK1が IL- 1処理により 自己リン酸化されることを示している。
MAPKKKを含む多くのプロティンキナーゼの活性化において、 サブドメイン VI I および VI I I の間のキナーゼ活性化ループ中のセリンおよび/またはスレオニン 残基のリン酸化は必須である ( Johnson, L.N. et al.， (1996) Cell, 85, 149-15 8)。 前記活性化ループ中に存在する TAK1 Ser- 192残基は、 MEKK1および酵母の S SK2 MAPKKK中にも存在する （図 6C)。 MEKK1 Thr- 1393および SSK2 Thr- 1460 は 、 自己リン酸化によるそれらの蛋白質の活性化に必須であることが知られている
(Deak,J.C. and Templeton,D. J. (1997) Biochem.J., 322,185-192)。 Ser- 192 残基が TAK1機能の制御に関わっているかどうかを調べるために、 本発明者らは、 Ser- 192がァラニンに置換された変異体 TAK1(S192A)を作製し実験に供した。その 結果、 TAK1(S192A)変異蛋白質は、 IL-1処理によりリン酸化されなかった （図 6B )。 更に野生型 TAK1 とは対照的に、 TAK1(S192A)変異体は、 TAB1 と共発現した場 合に、 キナーゼ活性を有さなかった （図 6D、 レーン 2,3)。 従って、 TAK1の Ser- 192残基は TAK1活性に必須である。 これらの結果は、 TAK1活性化ループ中の Ser -192が、おそらく自己リン酸化部位として、 TAK1の活性化に重要な役割を果たし ていることを示唆している。
いくつかのキナーゼにおいて、 この活性化ループの中の特定の残基を負電荷を 持つアミノ酸に置換すると恒常的な活性化を生じることが示されている （Yan, M. and Templeton'D.J. (1994) J.Biol.Chem. , 269, 19067-19073; Ling,L. et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3792-3797)。 従って本発明者らは、 Se r-192がァスパラギン酸に置換された TAK1(S192D)変異体を作製し、そのキナーゼ 活性を野生型 TAK1のものと比較した。 TAK S192D)変異体は、 TAB1と共に共発現 させた場合であってもキナーゼ活性を示さなかった （図 6D、 レーン 4)。 これら の結果は、 TAK1の Ser- 192のリン酸化によって達成される分子環境は、 負電荷を 持つ残基への置換によっては模倣できないことを示唆している。
なお、活性化ループ中のセリン残基の置換を有する TAK1変異体である TAK1(S1 92A)および TAK1(S192D) (後述） は PCRにより作製した。 まず、 Sad制限部位を 含む 5， -ォリゴヌクレ才チド（TTGTGGAGCTCCGGCAGTTG/配列番号： 7 )を、 TAK1(S1 92A)については Narl制限部位を含む 3' -ォリゴヌクレオチド（TTCAGGCGCCATCCAAG CAGC CCC/配列番号： 8)と共に、 TAK1(S192D)については（TTCAGGCGCCATCCAAG CAGCA1SCCC/配列番号： 9 ) と共に用いて、 TAK1変異体断片を作製した。得られ た Sacl-Narl断片を、ベクター pSP72(Promega社）の EcoRIおよび BamHI部位中に N-末端に HAェビトープ夕グを付加した全長 TAK1 cDNA断片を含む pSP72-HA- TAK 1の Saclおよび Narl部位にサブクローニングした。 次に、 この EcoRI- BamHI TA Kl変異体断片を、 pEF ベクタ一の EcoRI-BamHI ギャップにクローニングし、 pEF - HA- TAK1変異体を作製した。 全ての構築物は、 DNAシークェンシングにより確認 した。
多くの MAPKKKの活性化は、 リン酸化により調節されている（Herskowitz，I. (1 995) Cell, 80， 187-197; Deak，J,C. and Templeton,D. J. (1997) Biochem.J., 322, 185-192; Siow,Y.L. et al.， (1997) J.Biol.Chem.， 272, 7586-7594; Kin g,A.J. et al.， (1998) Nature, 396, 180-183; Leung, I. W. and Lassam,N. (19 98) J.Biol.Chem., 273, 32408-32415; PosasJ. and Saito,H. (1998) EMBO J. , 17, 1385-1394)。 いくつかの MAPKKKのリン酸化は、 Ste20様 ΜΑΡΚΠΚなどの他 の蛋白質キナーゼによって媒介される。他のケースでは、 自己リン酸化が MAPKKK の活性化に関与している。 ここで示された結果から、 TAK1の自己リン酸化が、 IL -1により誘発される TAK1の活性化に重要であることが明らかにされた。 サプド メイン VIIおよび VIIIの間の活性化ループ中に見出される Ser- 192のァラニンへ の変異は、 IL-1 により誘導される TAK1のリン酸化を失わせる。 更にこの変異は 、 TAK1のキナーゼ不活性型となる。 これらの結果を基にすると、 Ser- 192が TAK1 の自己リン酸化部位であり、 その触媒活性にとって重要である可能性が高い。 キナーゼの自己リン酸化は、 分子内または分子間反応のいずれかによって媒介 される。 分子間自己リン酸化のひとつの一般的例は、 受容体チロシンキナーゼの 活性化である。 リガンド結合により、 これらの受容体はホモ二量体を生成し、 そ れらの二量体化された相手側をリン酸ィ匕し、 このキナーゼの活性化をもたらす。 活性化の同様のメカニズムが、 ASK1および MLK3のような MAPKKKについて報告さ れている。 上流の刺激に応答して、 MLK3および ASK1の両方はホモ二量体を形成 し、 その結果活性化される。 他方で、 本発明者らは、 TAK1の自己リン酸化が分子 内反応によって生じることを見出した （データ省略)。 このことは二量体化が、 T AK1 の活性化にとって重要な工程ではないことを示唆している。 これと一致して 、本発明者らは、共免疫沈降ァッセィによって TAK1の二量体化を検出することは できなかった （データ省略)。 これらの知見は、 分子内自己リン酸化が MEKK1およ び SSK2の活性化にとつて重要であるという最近の報告と類似している （Deak, J. C. and Templeton, D.J. ( 1997) Biochem ， 322, 185-192 ; Siow' Y. L. et al .， ( 1997) J. Biol . Chem. , 272, 7586- 7594)。 TAK1、 MEKKU および SSK2の潜在的な 自己リン酸化部位は、 それらの活性化ループ中の相同の位置に存在する。 TAK1の 場合、 自己リン酸化および活性化には TAB1が必要である。 興味深いことに、 SSK 2の自己リン酸化にも、 相互作用する蛋白質である SSK1が必要であり、 SSK1は S SK2の上流のレギユレ一夕一として機能する（Posas,F . and Saito,H. ( 1998 ) EM BO J. , 17, 1385-1394)。従って、 TAK1、 SSK2、 そしておそらくは MEKK1は、 共通 の活性化メカニズムにより制御されているのかも知れない。 これらの知見は、 自 己リン酸化に関わる MAPKKK活性化には少なくとも 2種類の異なるメカニズム、す なわち二量体化が誘導する分子間自己リン酸化およびレギユレ一夕一依存型の分 子内自己リン酸化があることを示唆している。 産業上の利用の可能性
本発明により、 IL-1のシグナル伝達において、 TAB2が TRAF6と TAK1とを橋渡 しするアダプタ一として機能しすることが示された。 また、 TAB2の C末端の部分 ぺプチドが、 IL-1のシグナル伝達の阻害剤として機能することが明らかにされた 。 本発明のスクリーニング方法により、 TRAF6、 TAK1、 または TAB2を介したシグ ナル伝達の阻害を通して、 IL- 1のシグナル伝達を特異的に阻害するための化合物 を単離することが可能となる。 これら化合物は、 IL-1のシグナル伝達を阻害する ことにより抗炎症作用を示すことが可能であると考えられる。従って、、炎症が関 与する種々の疾病や傷害に対する新しい医薬の重要な候補である。

Claims

請求の範囲
1. TAK1および TRAF6に結合する活性を有する蛋白質またはべプチドをコ一ド する、 下記 （a) から （e) のいずれかに記載の DNA。
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA。
(b) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとハイブリダイズする DNA。
(d) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコー ドする腿。
(e) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコー ドする DNA。
2. IL-1刺激に応答してシグナル伝達を行なう活性を有する蛋白質またはぺプ チドをコードする、 下記 （a) から （e) のいずれかに記載の DNA。
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする MA。
(b) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとハイブリダイズする DNA。
(d) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコー ドする DNAo
(e) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコー ドする DNAo
3. TAK1または TRAF6に結合する活性を有する蛋白質またはべプチドをコ一ド する、 下記 （a) または （b) に記載の DNA。
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸 が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコ ードする DNA。
( b ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコ ードする DNA。
4 . IL-1刺激に応答したシグナル伝達を阻害する活性を有する蛋白質またはべ プチドをコードする、 下記 （a ) または （b ) に記載の DNA。
( a ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸 が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコ ードする DNAo
( b ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコ ードする DNA。
5 . 請求項 1から 4のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質または ぺプチド。
6 . 請求項 1から 4のいずれかに記載の DNAが挿入されたベクター。
7 . 請求項 6に記載のベクターを保持する宿主細胞。
8 . 請求項 7に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から 発現させた蛋白質またはべプチドを回収する工程を含む、 請求項 5に記載の蛋白 質またはべプチドの製造方法。
9 . 請求項 5に記載の蛋白質またはべプチドに結合する抗体。
1 0 . 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖に相補的 な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
1 1 . IL-1のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
( a ) 被検試料の存在下、 請求項 1または 3に記載の DNAによりコードされる蛋 白質またはべプチドと TAK1蛋白質および/または TRAF6蛋白質とを接触させるェ 程、
( b ) 請求項 1または 3に記載の DNAによりコードされる蛋白質またはべプチド と TAK1蛋白質および/または TRAF6蛋白質との結合を検出する工程、 および ( c) 該結合を阻害する活性を有する化合物を選択する工程、 を含む方法。
12. 工程 （b) における検出が免疫沈降法により行なわれる、 請求項 10に 記載の方法。
13. IL-1のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
(a) 被検試料の存在下、 請求項 2に記載の DNAによりコードされる蛋白質を発 現する哺乳動物細胞に、 IL-1を接触させる工程、
(b) 請求項 2に記載の DNAによりコードされる蛋白質を介して伝達される生物 学的活性を検出する工程、 および
(c) 該生物学的活性を減少させる化合物を選択する工程、 を含む方法。
14. 生物学的活性が TAK1の活性化である、 請求項 13に記載の方法。
15. TAK1の活性化を MKK6のリン酸化により検出する、 請求項 14に記載の方 法。
16. 生物学的活性が NF- Bの活性化である、 請求項 13に記載の方法。
17. Ig- プロモーターの下流に結合したレポ一夕一遺伝子を含むベクターを細 胞内に導入し、 該細胞内におけるレポ一夕一遺伝子の発現を検出することにより 、 NF- /cBの活性化を検出する、 請求項 16に記載の方法。
18. 生物学的活性が JNKの活性化である、 請求項 13に記載の方法。
19. JNKの活性化を Junのリン酸化により検出する、 請求項 18に記載の方法 ο
20. 生物学的活性が請求項 2に記載の DNAによりコードされる蛋白質の細胞膜 から細胞質への移行である、 請求項 13に記載の方法。
2 1. 生物学的活性が TAK1の自己リン酸化である、 請求項 13に記載の方法。
22. 請求項 2に記載の DNAを発現するベクターが導入された哺乳動物細胞を用 いる、 請求項 13から 2 1のいずれかに記載の方法。
23. 請求項 1 1から 22に記載の方法により単離しうる化合物を有効成分と する、 IL- 1のシグナル伝達の阻害剤。
2 4 . 請求項 1に記載の DNAによりコ一ドされる蛋白質またはべプチドと TAK1 蛋白質および/または TRAF6蛋白質との結合を阻害する化合物を有効成分とする 、 IL-1のシグナル伝達の阻害剤。
2 5 . 請求項 4に記載の DNAまたは該 DNAによりコードされる蛋白質若しくは ペプチドを有効成分とする、 IL- 1、 IL- 18、 または LPSのシグナル伝達の阻害剤。
2 6 . 化合物が TAB2-Nまたは TAB2- Cである、 請求項 2 5に記載の IL-1、 IL-1 8、 または LPSのシグナル伝達の阻害剤。
2 7 . 炎症が関与する疾病または傷害を予防または治療するために用いられる 、 請求項 2 3から 2 6のいずれかに記載の IL- 1、 IL-18、 または LPSのシグナル 伝達の阻害剤。
2 8 . 請求項 1 1または 1 2に記載の方法により単離しうる TAB2阻害剤を有効 成分とする、 抗炎症剤または抗アレルギー剤。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2004022599A1 (ja) * 2002-08-22 2005-12-22 株式会社ペプタイドドア 融合抗体及びその作成方法
JP2013526829A (ja) * 2009-06-11 2013-06-27 サイノファーム タイワン リミテッド 細胞クローンのための阻害に基づくハイスループットスクリーニング方法
CN110201418A (zh) * 2019-05-09 2019-09-06 西安交通大学 一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1234880B9 (en) 1999-11-19 2009-09-23 Kunihiro Matsumoto Novel protein tab2
GB0306071D0 (en) * 2003-03-17 2003-04-23 Novartis Ag Organic compounds
WO2004087862A2 (en) * 2003-04-01 2004-10-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Tak1-mediated inhibition of osteogenesis
KR101595318B1 (ko) 2014-03-25 2016-02-18 한국알프스 주식회사 다채널 led 조명기구에서 채널간의 전류편차 최소화 제어방법
WO2016011155A1 (en) * 2014-07-15 2016-01-21 Kapre Subhash V Genetically detoxified pertussis that maintains intrinsic adjuvant activity

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837703A (en) * 1993-03-31 1998-11-17 Cell Therapeutics, Inc. Amino-alcohol substituted cyclic compounds
US5576423A (en) * 1994-12-02 1996-11-19 Schering Corporation Antibodies to the slam protein expressed on activated T cells
DE69731682T2 (de) * 1996-04-24 2005-12-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha TAB1 Protein und dafür kodierende DNA
JP3907247B2 (ja) 1996-04-24 2007-04-18 中外製薬株式会社 Ｔａｂ１蛋白質及びそれをコードするｄｎａ
EP1234880B9 (en) 1999-11-19 2009-09-23 Kunihiro Matsumoto Novel protein tab2

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAEUERLE, P.A.; BALTIMORE, D., CELL, vol. 87, 1996, pages 13 - 20
DATABASE GENBANK [online] 27 January 1997 (1997-01-27), HILLIER L. ET AL.: "zq73h04.r1 stratagene neuroepithelium (#937231) homo sapiens cDNA clone IMAGE:647287 5', mRNA sequence", XP002972938, accession no. NCBI Database accession no. AA207239 *
DATABASE GENBANK [online] Database accession no. AB018276 *
DINARELLO, C.A., BLOOD, vol. 87, 1996, pages 2095 - 2147
GENOME RESEARCH, vol. 6, no. 9, September 1996 (1996-09-01), pages 807 - 828, XP002140684 *
GREENFEDER, S.A., J. BIOL. CHEM., vol. 270, 1995, pages 13757 - 13765
JUN NINOMIYA-TSUJI ET AL.: "The kinase TAK1 can activate the NIK-IkappaB as well as the MAP kinase cascade in the IL-1 signalling pathway", NATURE, vol. 398, 18 March 1999 (1999-03-18), pages 252 - 256, XP002926063 *
KORHERR, C. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 94, 1997, pages 12829 - 12832
KOUJI SHIBUYA: "TGF-beta signal dentatsukei ni okeru TAB1-TAK1 no yakuwari", SEIKAGAKU, vol. 71, no. 10, 25 October 1999 (1999-10-25), pages 1205 - 1212, XP002942295 *
MOLECULAR CLONING, vol. 5, pages 61 - 5
MOLECULAR CLONING, vol. 5, pages 61 - 5. 63
SAMBROOK J. ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
TAKAHIRO NAGASE ET AL.: "Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. XI. The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large protein in vitro", DNA RESEARCH, vol. 5, no. 5, 30 October 1998 (1998-10-30), pages 277 - 286, XP000853885 *
THANOS, D.; MANIATIS, T., CELL, vol. 80, 1995, pages 529 - 532
VERMA, I.M. ET AL., GENES DEV., vol. 9, 1995, pages 2723 - 2735
ZHAODAN CAO ET AL.: "Traf6 is a signal transducer for interleukin-1", NATURE, vol. 383, 3 October 1996 (1996-10-03), pages 443 - 446, XP002926064 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2004022599A1 (ja) * 2002-08-22 2005-12-22 株式会社ペプタイドドア 融合抗体及びその作成方法
JP2013526829A (ja) * 2009-06-11 2013-06-27 サイノファーム タイワン リミテッド 細胞クローンのための阻害に基づくハイスループットスクリーニング方法
CN110201418A (zh) * 2019-05-09 2019-09-06 西安交通大学 一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法
CN110201418B (zh) * 2019-05-09 2020-10-27 西安交通大学 一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法

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