WO2001038511A2 - Resolvase-katalysierte, sequenz-spezifische dna-rekombination in eukaryotischen zellen - Google Patents

Resolvase-katalysierte, sequenz-spezifische dna-rekombination in eukaryotischen zellen Download PDF

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    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • the present invention relates to a method for sequence-specific recombination of DNA in eukaryotic cells, comprising introducing into a cell a first DNA sequence comprising a res sequence, inserting a copy of the first DNA sequence and performing the sequence -specific recombination by the action of a resolvase or its derivative.
  • the present invention further relates to a method for testing topoisomerase inhibitors in a eukaryotic cell, comprising introducing into a cell a first DNA sequence according to SEQ ID NO: 1, introducing into a cell a copy of the first DNA sequence according to SEQ ID NO : l in direct orientation, the introduction of a wild-type resolvase, and addition of the topoisomerase inhibitors to be tested.
  • Controlled manipulation of eukaryotic genomes is an important method for researching the function (s) of certain genes in the living organism. In addition, it plays a role in gene therapy procedures in the medical field.
  • the production of transgenic animal strains, the modification of genes or gene segments (so-called "gene targeting") and the targeted integration of foreign DNA into the genome of higher eukaryotes are of particular importance in this context.
  • gene targeting the modification of genes or gene segments
  • telomere sequences are divided into two families. Members of the first, the so-called "integrase" family, catalyze the separation and relinking of DNA strands between two defined nucleotide sequences, which are referred to below as recombination sequences. These can either lie on two different molecules or on one DNA molecule. Intermolecular or intramolecular recombination then occurs. In the latter case the result of the reaction depends on the the respective arrangement of the recombination sequences from one another. If the recombination sequences are in inverted, ie opposite, orientation to one another, the DNA segment in between is inversed.
  • the recombination sequences are direct, ie rectified, repeats on a DNA substrate, deletion occurs.
  • intermolecular recombination ie when the two recombination sequences are placed on two different DNA molecules, the two DNA molecules can fuse. While members of the integrase family usually catalyze both intra- and intermolecular recombination, recombinases of the second family, the so-called “invertases / resolvases", are only capable of intramolecular recombination.
  • invertases / resolvases can only carry out intramolecular recombination if the recombination sequences exist either as inverted repeats (invertases) or as direct repeats (resolvases).
  • invertases inverted repeats
  • resolvases direct repeats
  • loxP is a 34 bp nucleotide sequence consisting of two 13 bp inverted nucleotide sequences and an 8 bp spacer in between; see. Hoess, R. et al. (1985) J. Mol. Biol., 181, pp. 351.
  • the binding sequences for Flp have a similar structure, but differ from loxP; see. Kilby, J. et al. (1993) Trends Genet., 9, pp. 413.
  • the recombination sequences can therefore not be interchanged, i.e. Cre cannot recombine ER7 and FLP / o-xP sequences.
  • Both recombination systems are active over long distances, i.e. the DNA segment to be inverted or deleted, flanked by two loxP or ERr sequences, can be several 10,000 base pairs (kb) long.
  • invertase resolvase family Two members of the invertase resolvase family have been used to manipulate eukaryotic genomes.
  • a mutant of invertin gin from bacteriophage Mu can catalyze the inversion of a DNA fragment in plant protoplasts without cofactors.
  • this mutant was found to be hyper recombinant, i.e. also catalyzes DNA strand separations at other than their natural recombination sequences; see. Maeser, S. & Kahmann, R. (1991) Mol. Gen. Genet., 230, pp. 170. This leads to undesired, sometimes lethal recombination events in the genome of the plant protoplasts.
  • the ⁇ resolvase is the prototype of the resolvase subfamily and is encoded by the bacterial transposon ⁇ (also known as transposon 1000).
  • the ⁇ resolvase is phylogenetically closely related to the Tn3 resolvase.
  • the ⁇ transposon occurs episomally as part of the F factor in the bacterium Escherichia coli.
  • the biological function of a transposon-encoded resolvase is usually to catalyze the dissolution of the so-called co-integrate through a sequence-specific DNA recombination.
  • the co-integrate consists of two directly repeated copies of the transposon and arises transiently through the process of transposition ("jumping" of the mobile genetic element into another genomic locus) within a bacterial cell.
  • the resolvase catalyzes the recombination between two identical recombination sequences, commonly known as res be designated.
  • Res comprises 145 nucleotides and, like the resolvase gene, is a natural part of the transposon.
  • the class II transposons consist of a res, a tnpA gene which codes for the transposase, and a tnpR gene which codes for the resolvase.
  • the transposon When the co-integrate is formed, the transposon is doubled, so that two copies of the transposon with the res sequence, the tnpA gene and the tnpR gene are present as a direct repeat; see. Review article by Grindley, NDF (1994) Nucl. Acids and Mol. Biol, 8, pp. 236.
  • the resolvase has a total of six binding sites in one res, ie each binding site is bound by a single resolvase molecule. Since the wild-type resolvase is in solution (and thus also intracellularly) as a homodimer, a total of 3 dimers bind to a res.
  • Res therefore consists of three dimer binding sites, called I, ⁇ and EI.
  • Two of the three binding sites ( ⁇ and III) are called auxiliary sequences.
  • the occupation of these sequences by two resolvase dimers is a necessary prerequisite for the activation of the actual recombination reaction, which ultimately leads to the DNA strand exchange. This takes place in the center of the imperfect palindromic binding site I in res, the so-called "crossover" region, and is catalyzed by the resolvase dimer bound to it.
  • resolvase mutants for example the 7 ⁇ 3 resolvase and the ⁇ -resolvase ( ⁇ -resolvase E124Q ), which, regardless of the presence (-) supercoilings in the DNA-substrate molecule, can catalyze recombination between two complete res.
  • the molecular one The basis for this phenotype has not yet been clearly clarified. Apparently the changed ones are playing
  • mutant resolvase when a (-) supercoiling is present is that these mutant resolvases can carry out the recombination without the two auxiliary sequences II and m and only with the palindromic binding site I in res. It follows from this that the recombination can also take place between two DNA segments which only contain the binding sites I and are therefore considerably shorter than the complete res. The recombination occurs regardless of the location and orientation of the recombination sequences, i.e. the two partner sequences can lie on one or on two different DNA molecules and occur as direct or inverted repeats.
  • intermolecular recombination can occur, which leads to a fusion of the two different DNA molecules, or, in the case of the intramolecular reaction, depending on the respective orientation of the binding sites I to one another, i.e. as direct or inverted repeats, for deletion or inversion of a DNA segment lying between the binding sites I
  • Unmodified resolvase is strictly dependent on the non-relaxed state of the DNA substrate, which must also carry two complete res sequences as direct repeats. There is only intramolecular recombination and the resulting deletion of a DNA segment.
  • the mutated variants e.g. ⁇ -resolvase E124Q or ⁇ -resolvase E102 E124Q, on the other hand, can also catalyze the recombination reaction on relaxed, e.g. linear, substrate molecules, although the complete res sequences (I, II and IH) are on the same DNA -Molecule must be in direct repetition. Even with the mutant resolvases, the complete res sequences only result in intramolecular recombination and the resulting deletion of a DNA segment.
  • the mutant resolvase can also carry out the recombination if only the res- Sequences with the binding site I are present, regardless of the torsional tension of the DNA, ie with or without (-) supercoiling. The localization of the res sequences on a DNA molecule and the orientation is insignificant.
  • the resolvase mutants can therefore perform both intra- and intermolecular recombinations.
  • Intracellular genomic and episomal DNA in higher eukaryotes is in a topologically relaxed state except for a few areas, i.e. there are hardly any free (-) superhelical turns in the DNA, e.g. could use the wild-type resolvase to catalyze recombination. Therefore, the resolvase has not been used for recombination in eukaryotic cells.
  • topological state of genomic DNA is regulated in the cell by a special class of enzymes called topoisomerases. If the enzymatic activity of these proteins fails, for example due to mutations or the action of inhibitors, topological tension accumulates in the genomic DNA as a result of other DNA transactions, such as transcription; see. Review article by Wang, J.C. (1996) Annu. Rev. Biochem., 65, pp. 635.
  • topoisomerases There are a number of substances that can selectively inhibit intracellular topoisomerase activities.
  • a special class of these substances is e.g. represented by camptothecin and its derivatives, which are already in therapeutic use as anti-cancer agents and selectively inhibit type I topoisomerases; Review article by Chen and Liu (1994), Annu. Rev.
  • a major problem in the development of new and more effective topoisomerase inhibitors is the lack of a simple test system, either in cell culture or in the living organism, e.g. the mouse, for determining the level of inhibition and / or the tissue specificity of such a substance.
  • Another object of the present invention is to provide a simple and controllable recombination system and the work equipment required. Another object of the present invention is to provide a simple and reliable test system for eukaryotic topoisomerase inhibitors.
  • FIG. 1A shows a schematic illustration of the ⁇ -resolvase-catalyzed recombination reaction
  • FIG. 1B shows a schematic illustration of the ⁇ -res sequence.
  • A A circular, topologically relaxed DNA is shown, which carries two res as direct repetitions (black arrows). Binding the resolvase dimers to each res leads to the formation of the synaptic complex, the synaptosome, in which the DNA strand breaks are catalyzed (indicated by open arrowheads). Both synapse formation and DNA strand exchange require negative superhelical tension on the DNA substrate.
  • FIG. 2A shows a schematic illustration of the ⁇ -resolvase expression vectors
  • FIG. 2B shows a schematic illustration of the substrate vector and the product vector resulting from the recombination.
  • A A schematic representation of the eukaryotic expression vectors for the wild-type ⁇ resolvase (pPGK ⁇ ) and their mutants ⁇ E102Y ' E124Q (pPGK ⁇ l02) and ⁇ EI24Q (pPGK ⁇ l24) is shown. The position and nature of the respective mutation in the resolvase gene is marked.
  • the wild type and the two mutants, ⁇ E102Y ' E124Q and ⁇ E124Q each have a version with and without a nuclear localization sequence (NLS) at the C-terminal end of the gene.
  • the genes are expressed by the phosphoglycerate kinase promoter (P-PGK). This promoter is active in all eukaryotic cells examined to date.
  • P-PGK phosphoglycerate kinase promoter
  • coli it contains the early SV40 promoter, which consists of res in front of the recombination cassette, the gene for neomycin (neo) resistance, res and the lacZ gene which codes for the ⁇ -galactosidase.
  • the location and respective orientation of the two PCR primers P-SV40 ceremonies and P-Seqanti are indicated by small arrows above and below the vector.
  • the recombination between the two res leads to the deletion of the intermediate neo gene, the simultaneous loss of a res copy and the expression of the lacZ gene.
  • the vector resulting from the recombination is called pCH-RZ.
  • the relevant interfaces in both vectors for the restriction enzyme BamHI are additionally marked.
  • Figure 3 shows a schematic representation of a Western analysis.
  • FIG. 4 shows a representation of the quantitative evaluation of transient co-transfection
  • Lipofection introduced into CHO cells.
  • the enzymatic activity of the ⁇ -galactosidase was determined photometrically after 72 hours in cell lysates, normalized to the protein content of the lysates and statistically evaluated.
  • a bar chart is shown with the respective
  • FIG. 5 shows a schematic representation of the detection of the deletion in reporter cell line H5 by PCR and subsequent Southern hybridization after separation of the DNA molecules in agarose gels (1.2% w / v).
  • a Southern analysis of the PCR products achieved by the respective expression vectors is shown.
  • the term unrec. or rec. indicate the position of the PCR products in the gel that result from the non-recombined (pCH-RNRZ) or recombined vector (pCH-RZ).
  • FIG. 6 A shows a representation of the quantitative evaluation of the influence of the topoisomerase inhibitor camptothecin on the recombination with wild-type ⁇ resolvase.
  • transposon denotes a mobile genetic element that comprises at least one recombination sequence, a transposase and a resolvase and is derived from bacteria.
  • FIG. 7 shows a representation of the quantitative evaluation of transient co-transfection experiments in CHO cells with substrate vectors linearized in vitro.
  • a bar chart is shown with the respective standard deviations from the mean.
  • the expression vectors for Cre and ⁇ -resolvase E102 ⁇ ' EI24Q were introduced separately with the substrate vector pCH-RLNRLZ, a derivative of pCH-RNRZ, which additionally contains two loxP sequences for recombination by Cre as direct repeats, by lipofection in CHO cells. Before lipofection, pCH-RLNRLZ was linearized with the restriction enzyme XmnI, which cuts only once in the entire vector, and then checked in an agarose gel electrophoresis.
  • the enzymatic activity of the ⁇ -galactosidase was determined photometrically after 72 hours in cell lysates, normalized to the protein content of the lysates and statistically evaluated.
  • the substrate plasmid was co-transfected with an expression vector for the lambda integrase (pPGKssInth) (bars 3 and 6, from left).
  • the pCH-RLNRLZ (pCH-RLZ) vector recombined in E. coli acted as a positive control, co-transfected with the respective expression vector for Cre (pPGKCre) or ⁇ -resolvase E102Y ' E124Q (pPGK ⁇ l02NLS) (bars 1 and 4).
  • resolvase refers to an enzyme encoded by a transposon that catalyzes the resolution of the co-integrate structure of the transposon by sequence-specific recombination as well as its derivatives, e.g. mutant resolvases.
  • derivatives used here denotes nucleic acid or amino acid sequences which have one or more deletions, substitutions, additions, insertions and / or inversions.
  • the term “derivatives” denotes a 3'- and / or 5'-shortened form of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, minor mutations (base exchange) of the res sequence according to SEQ ID NO: 1 or 2 and insertions, additions or deletions of SEQ ID NO: 1 or 2, all of these modifications having a comparable activity with the Have initial res sequences. Accordingly, the term “derivatives” also refers to the
  • Nucleic acids that have one or more of the listed mutations and encode a polypeptide with resolvase activity also designates polypeptides with one or more of the modifications listed, the polypeptides having resolvase activity.
  • basic amino acid used here denotes amino acid residues with a positively charged side chain, e.g. Lysine, arginine and histidine.
  • acidic amino acid refers to amino acid residues with a negatively charged side chain, e.g. Aspartic acid and glutamic acid.
  • transformation means any introduction of a nucleic acid sequence into a cell.
  • the insertion can e.g. be a transfection or lipofection by the calcium phosphate method, electroshock method or an oocyte injection.
  • One aspect of the present invention relates to a method for sequence-specific recombination of DNA in eukaryotic cells, comprising the simultaneous or sequential introduction into a cell of two copies of a first DNA sequence comprising a res sequence, and performing the sequence-specific recombination by the action of a resolvase.
  • a method is preferred in which a copy of the first DNA sequence is introduced in a direct orientation on the same DNA molecule as the other copy.
  • a method is particularly preferred, the first DNA sequence comprising a res sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the first DNA sequence can comprise, in addition to the recombination sequence, further DNA sequences which permit integration into a desired target location in the genome of the eukaryotic cell.
  • This integration takes place via homologous recombination, which is mediated by internal recombination mechanisms.
  • the other DNA sequences must be homologous to the target DNA and both 3 ' and 5 ' of the two res sequences present as direct repeats must be located.
  • the person skilled in the art knows how high the degree of homology and how long the respective 3 'and 5' sequences must be in order for the homologous recombination to take place with a sufficient probability; see. Review article by Capecchi, M. (1989) Science, 244, pp. 1288th
  • the method according to the invention can be used, for example, to delete the DNA segment lying between the directly oriented recombination sequences in eukaryotic cells during an intramolecular recombination.
  • the recombination sequences are directly oriented if the sequences are inserted in the 5 '-3' direction.
  • the recombination sequences for example res with the binding sites I, ⁇ and ⁇ i (SEQ FD NO: 1) or res with the binding site I (SEQ ID NO: 2), each via homologous recombination into an intron sequence 5 'and 3' of an exon the same DNA molecule and the recombination by the action of the resolvase, for example the ⁇ -resolvase EI24Q or ⁇ -resolvase E102Y ' E124Q ; the exon is deleted.
  • the polypeptide encoded by the corresponding gene can lose its activity or function or the transcription can be stopped by the deletion, so that no (complete) transcript is produced.
  • the resolvase or its derivative can carry a nuclear localization sequence at the C-terminal end, which ensures better intracellular transport of the recombinase into the cell nucleus.
  • the method according to the invention can be used to invert the DNA segment lying between the non-directly oriented recombination sequences in eukaryotic cells during an intramolecular recombination.
  • the recombination sequences res with the binding site I must be placed in the opposite orientation on the same DNA molecule.
  • the method according to the invention can also be used to carry out intermolecular recombination in eukaryotic cells. To do this, the
  • Recombination sequences res with the binding site I are placed on two different DNA molecules regardless of the orientation. The recombination then leads to a fusion of the two DNA molecules at the binding sites I.
  • Recombination sequences act.
  • the resolvase or the resolvase gene can already be present in the eukaryotic cell before the introduction of the first DNA sequence comprising a res sequence and / or the copy of the first DNA sequence or after the introduction of the first DNA sequence and / or of the copy of the first DNA sequence.
  • the resolvase used for the sequence-specific recombination is preferably expressed in the cell in which it carries out the reaction.
  • a second DNA sequence comprising a resolvase gene, is introduced into the cells.
  • Nucleic acids which encode modified ⁇ resolvases are preferably used, the resolvases preferably being modified in such a way that they are in the segment of amino acids 80-140, preferably 90-110, based on the wild type presolvase numbering shown in SEQ ID NO: 4 have at least one, preferably at least two, of the following mutations: (i) an acidic amino acid residue is replaced by an aromatic, hydrophilic or basic amino acid residue, (ii) a neutral one Amino acid residue is replaced by a hydrophilic amino acid residue, and (iii) a hydrophilic amino acid residue is replaced by a neutral or acidic amino acid residue.
  • nucleic acids encode modified ⁇ resolvases, in which Glu is replaced by Gin or Tyr, Asp by Ser, Ser by Asp, Gly by Ser, Asp by Ala and / or Glu by Arg.
  • particularly preferred resolvase genes are listed in SEQ ID NO: 3, 5 and 7 and also include their derivatives.
  • ⁇ resolvase genes whose encoded polypeptides have two mutations, in particular the resolvase gene according to SEQ ID NO: 5, are very particularly preferred because of their higher efficiency compared to the single mutants.
  • a method is particularly preferred in which the second DNA sequence is integrated into the eukaryotic genome of the cell via homologous recombination or randomly. Also preferred is a method in which the second DNA sequence comprises regulatory DNA sequences which bring about a spatial and / or temporal expression of the resolvase gene.
  • Spatial expression in this case means e.g. that the recombinase only in a certain cell type, e.g. Liver cells, kidney cells, nerve cells or cells of the immune system can be expressed through the use of cell type-specific promoters and only in these cells catalyzes the recombination.
  • a temporal expression in the regulation of resolvase expression can be achieved by promoters which are active in the adult organism from or at a specific development stage or at a specific time.
  • the spatial and / or temporal expression can be determined by using inducible promoters, e.g. can be achieved by interferon- or tetracycline-dependent promoters; see. Review article by Müller, U. (1999) Mech. Develop.
  • the resolvase used in the method according to the invention can be both the wild-type resolvase and a modified resolvase.
  • the use of a modified resolvase is preferred.
  • the resolvases preferably used in the method according to the invention comprise the amino acid sequences listed in SEQ ED NO: 4, 6 and 8.
  • the modified resolvase is modified such that it does the recombination reaction without (-) DNA supercoiling, ie on relaxed substrate molecules, preferably on relaxed linear substrate molecules.
  • the preparation of modified polypeptides and the screening for the desired activity are state of the art and easy to carry out; see. Erlich, H. (1989) PCR Technology. Stockton Press.
  • Modified resol vases are particularly preferred, the resol vases preferably being modified in such a way that they have at least one, preferably at least two, in the segment of amino acids 80-140, preferably 90-110, based on the wild type presolvase numbering shown in SEQ ID NO: 4.
  • Modified ⁇ resol vases are particularly preferred, in which Glu by Gin or Tyr, Asp by Ser, Ser by Asp, Gly by Ser, Asp by Ala and or Glu by Arg in the segment.
  • ⁇ -resolvase E124Q contains a glutamine residue instead of a glutamate residue at position 124.
  • ⁇ -resolvase E102 ' E124Q contains, in addition to the exchange of mutant 124, a tyrosine residue instead of the glutamate residue at position 102 compared to wild-type ⁇ - resolvase.
  • Both ⁇ resolvase mutants were produced via PCR mutagenesis of the ⁇ resolvase gene. These mutants can perform recombination between two directly repeated, complete res sequences without the cofactor (-) supercoiling.
  • the method according to the invention can be carried out in all eukaryotic cells.
  • the cells can be present, for example, in a cell culture and can include all types of plant or animal cells, for example vertebrates such as fish, frogs or mammals, or invertebrates such as worms or insects, for example flies.
  • the cells can be oocytes, embryonic stem cells, hematopoietic stem cells or any type of differentiated cells.
  • a method is preferred in which the eukaryotic cell is a non-mammalian cell, for example a zebrafish, Caenorhabditis elegans or Drosophila melanogaster cell.
  • the eukaryotic cell is a mammalian cell, for example a human cell or a non-human cell, for example a monkey, mouse, rat, rabbit, hamster, goat, cow, sheep or pig cell .
  • the method according to the invention thus relates likewise eukaryotic cells, comprising res according to SEQ ID NO: 1 or 2 in at least one and preferably two copies and / or the resol vas gene according to SEQ FD NO: 3, 5 or 7 or the polypeptides encoded by the genes or their respective derivatives.
  • the invention relates to the use of a res sequence according to SEQ FD NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in a sequence-specific recombination of DNA in eukaryotic cells.
  • the eukaryotic cell can also be in the cell assembly of a plant or animal organism, for example of vertebrates such as fish, frogs or non-human mammals or (if it is permissible in the patenting requirements of the respective patent system) in the form of a human organism, or invertebrates such as worms or insects, eg flies, which do not contain a resolvase.
  • the invention thus also relates to the use of a resolvase or a resolvase gene in a sequence-specific recombination in eukaryotic cells.
  • the invention relates to the use of the resolvase gene according to SEQ ID NO: 3, the resolvase E102Y ' E124Q according to SEQ FD NO: 5 and the resolvase E124Q according to SEQ ID NO: 7.
  • the invention also relates to transgenic organisms such as plants or animals, e.g. Vertebrates such as fish, frogs or mammals, or invertebrates such as worms or insects, e.g. To fly.
  • the invention preferably relates to transgenic non-mammalian organisms such as zebrafish, Caenorhabditis elegans or Drosophila melanogaster and transgenic mammalian organisms such as transgenic monkeys, mice, rats, rabbits, hamsters, goats, cows, sheep or pigs, the res according to SEQ ED NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in one or two copies and / or the resolvase gene according to SEQ ID NO: 3, 5 or 7 or their derivatives integrated in their cells.
  • the method according to the invention can also be used for testing topoisomerase inhibitors in a eukaryotic cell, comprising a) introducing into a cell a first DNA sequence according to SEQ ED NO: 1, b) introducing into a cell a copy of the first DNA sequence according to SEQ ED NO: 1 in direct orientation, and c) the introduction of a wild-type resolvase, and d) addition of the topoisomerase inhibitors to be tested.
  • the eukaryotic cells can be used in culture (ex vivo) or in the organism (in vivo) for the method according to the invention.
  • the method in the organism is preferred here, since the cell- and tissue-specific physiological influences on the possible degradation or modification of the topoisomerase inhibitors and the resulting effects can be tested with regard to their effectiveness.
  • the topoisomerase inhibitors can act on the cells before or after the expression of the resolvase, which leads to the activation of the recombination and is easy to detect, for example, via enzymes or marker proteins.
  • the efficiency of the respective substances with regard to their inhibitory effect on topoisomerases correlates with the activation of the recombination.
  • a spatial and or temporal activation of the recombination can be achieved by regulating the resolvase expression.
  • a spatial and / or temporal activation can also be achieved by regulating the action of topoisomerase inhibitors with constitutive expression of the wild-type resolvase.
  • a method is preferred, wherein a second DNA sequence comprising a wild-type resolvase gene is additionally introduced into the cell.
  • a method in which the wild-type resolvase is a wild-type ⁇ -resolvase is particularly preferred.
  • the invention further relates to a eukaryotic cell comprising two DNA sequences according to SEQ ID NO: 1.
  • a eukaryotic cell is preferred which also contains a wild-type resolvase gene, in particular a wild-type ⁇ resolvase.
  • the invention further relates to a transgenic organism such as plants or animals, for example vertebrates such as fish, frogs or mammals, or invertebrates such as worms or insects, for example flies.
  • the invention preferably relates to transgenic non-mammalian organisms such as zebrafish, Caenorhabditis elegans or Drosophila melanogaster and transgenic mammalian organisms such as transgenic monkeys, mice, rats, rabbits, hamsters, goats, cows, sheep or pigs which have two copies of res according to SEQ ED NO: l in direct orientation and have a resol vas gene, in particular a ⁇ resol vas gene according to SEQ ED NO: 3, integrated in their cells.
  • transgenic non-mammalian organisms such as zebrafish, Caenorhabditis elegans or Drosophila melanogaster
  • transgenic mammalian organisms such as transgenic monkeys, mice, rats, rabbits, hamsters, goats, cows, sheep or pigs which have two copies of res according to SEQ ED NO: l in direct orientation and have a resol vas gene,
  • the eukaryotic expression vectors for ⁇ -resolvase (pPGK ⁇ / pPGK ⁇ NLS ) and for the ⁇ ⁇ -resolvase mutants ⁇ E124Q (pPGK ⁇ l24 / pPGK ⁇ l24NLS) and ⁇ E102Y ' E124FDKKNK2 (pPGGKLD) GmbH (pPGGKLD) GmbH ).
  • the vector contains the phosphoglycerate kinase promoter (P-PGK) and the polyadenylation signal sequences from the small Simian Virus 40 (SV40) tumor antigen.
  • P-PGK phosphoglycerate kinase promoter
  • SV40 small Simian Virus 40
  • P- ⁇ A 5 'GATACTGCAGCATGCGACTTTTTGGTTACGCACGGGTATCA 3 '
  • P- ⁇ B 5 ' GATATCTAGATT AGTTGCTTTC ATTTATT ACTTT AT A 3 '
  • P- ⁇ l24Q 5 'CGACAGAGAATACTACAGCGTACCAATGAA 3'
  • P- ⁇ l24Qanti 5 'TTCATTGGTACGCTGTAGTATTCTCTGTCG 3'
  • P- ⁇ l02Y 5 'AGTACCGATGGGTATATGGGTAAAATGGTT 3'
  • P- ⁇ l02Yanti 5 'AACCATTTTACCCATATACCCATCGGTACT 3'
  • the wild-type resolvase gene without or with a nuclear localization sequence (NLS) was amplified with the primers P- ⁇ A and P- ⁇ B, or P2972 after a first denaturation step at 94 ° C. (5 min.) With 28 cycles of denaturation ( 95 ° C, 30sec), primer binding (56 ° C, 30sec.) And DNA synthesis (72 ° C, 45sec), followed by a final synthesis step (72 ° C, 4min.).
  • the resulting PCR fragment, restricted with PstI and Xbal replaces the Cre gene excised with the same enzymes in pPGKcrebpa.
  • the resolvase mutants were produced by assembly PCR.
  • the two ⁇ resolvase gene fragments were amplified in two separate PCR batches with the primers P- ⁇ A and P- ⁇ 124Qanti or P- ⁇ l24Q and P- ⁇ B contain the desired mutation, which were then used in the second step of the assembly PCR in equimolar amounts as a template for the following third PCR with the primers P- ⁇ A and P- ⁇ B.
  • the amplifications took place after a first denaturation step at 94 ° C (5 min.) With 30 cycles of denaturation (94 ° C; 45sec), Primer binding (60 ° C; 45sec.) And DNA synthesis (72 ° C; 45sec), as well as a final synthesis step (72 ° C; 6min).
  • the second mutation E102Y was introduced into the gene with the oligonucleotides P- ⁇ A, P- ⁇ l02Y, P- ⁇ l02Yanti and P- ⁇ B. The mutants were then PCR-primed P- ⁇ A and P2972 under the same reaction conditions with an NLS at the C-terminus of the protein.
  • the substrate vectors are derivatives of pCHHO (Pharmacia).
  • the recombination cassettes are under the control of the SV40 promoter, which guarantees a strong constitutive expression.
  • the plasmid also has the polyadenylation signal sequences of the SV40 tumor antigen.
  • the ⁇ -galactosidase gene (lacZ) contained in the starting vector together with the prokaryotic promoter was first cut out with Hindin and BamHI in order to reinsert it after PCR amplification with the primers P-lacZl and P-lacZantil without a prokaryotic promoter.
  • a first denaturation step (94 ° C; 5 min.) was carried out, followed by 30 cycles of denaturation (94 ° C; 1 min.), Primer binding (56 ° C; 1 min.) And DNA synthesis (72 ° C; 4 min.). ) and a final synthesis step (72 ° C; 10min.).
  • neomycin resistance gene was then cut out of the vector pSV2Neo (Southern, PJ, Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, pp.327) with the restriction enzymes Smal and BglEt and with ⁇ - Resolvase recognition sequences flanked. These recombination sequences (res) are arranged in the construct in the same orientation.
  • the res was amplified with the primers P-RES1 and P-RESantil or P-RESanti2. It started with a first denaturation step (94 ° C; 5min.) And 30 cycles of denaturation (94 ° C; 30sec), primer binding (56 ° C; 30sec.) And DNA synthesis (72 ° C; 30 sec). A final synthesis step followed (72 ° C; 4min.).
  • the res located at the 5 ' terminus of the neomycing gene was ligated to the neomycin gene via Bgi ⁇ , the second res was connected to the 3' end of the gene by a blunt-end ligation.
  • P-lacZanti 1 5 'GAT AGG ATCC AG AC ATGAT AAGAT A 3'
  • P-RES 1 5 ' GATAAAGCTTGGGCCCAAAAAGTCGCATAAAAATGTATCC 3 '
  • P-RESantil 5 'GATAAGATCTAACAATTTTGCAACCGTCCGA 3'
  • P-RESanti2 5 'GATAAAGCTTAACAATTTTGCAACCGTCCGA 3'
  • the plasmid pCH-RNRZ was recombined in vivo in E. coli strain DH5 ⁇ cells (Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol., 166, pp. 557). This bacterial strain is distinguished by the fact that it carries an F'-plasmid which codes for wild-type ⁇ resolvase. The resulting recombined plasmid pCH-RZ was used as a positive control in the further experiments.
  • the plasmid pCH-RLNRLZ is a derivative of pCH-RNRZ and was generated via PCR with the following oligonucleotides:
  • Plasmid pCH-RNRZ (100ng) was used as a template for the PCR with these two oligonucleotides.
  • the PCR conditions correspond exactly to those under 1.2. (Substrate vectors) mentioned in the first paragraph.
  • the PCR fragment was isolated by agaraose gel electrophoresis, restricted with the restriction enzymes Hind Eil and Bgl II and in the pCH-RNRZ vector residue cut with Hind III / Bgl II (pCH-RNRZ without the Neo gene and the second (3 ') res sequence). This gives the resloxneoreslox (RLNRL) recombination cassette between the SV40 promoter and the lacZ gene.
  • the plasmid pCH-RLZ was generated by in vivo recombination as described for pCH-RZ.
  • Expression plasmid DNAs and pCH-RZ were isolated from E. coli strain DH5 ⁇ by means of affinity chromatography (Qiagen, Germany).
  • Substrate plasmid pCH-RNRZ was isolated from E. coli strain JC5547 (Willets, NS, Clark, AJ (1969) J. Bacteriol., 100, pp. 231).
  • the sequence control of all expression and substrate vectors, as well as all PCR-generated products, was carried out using the fluorescence-based 373A DNA sequencing system (Applied Biosystems). PCR reactions were carried out using the "Master Mix Q - Kit" (Quiagen, Germany). All DNAs were analyzed by agarose gel electrophoresis (0.8% - 1.5% w / v) in TBE buffer.
  • the transient expression and recombination analyzes were carried out with an ovary hamster cell line CHO (Puck, TT (1958) J. Exp. Med., 108, pp. 945) and a human epithelial cervical carcinoma cell line HeLa (Geye, GO, et al. ( 1952) Cancer Res., 12, pp. 264).
  • HeLa cells were cultivated in ⁇ -MEM (Life Technologies, Inc.), which was enriched with 10% fetal calf semen and contains streptomycin (0.1 mg / ml), penicillin (100 units / ml) and sodium pyruvate (ImM) , CHO cells were cultured in DMEM with the same additives, without sodium pyruvate.
  • HeLa reporter cell lines which stably integrated pCH-RNRZ into the genome were determined as follows: approx. 20 ⁇ g of the plasmid DNA were linearized with BamHI, purified by phenol / chloroform extractions, precipitated with ethanol and in approx. 5 ⁇ 10 6 cells of a lipofect (30 ⁇ l Fugene TM 6, Boehringer Mannheim) transfected. Stable cell lines were selected with 500 ⁇ g / ml G418 / Geneticin (Life Technologies) and then characterized by PCR, DNA sequencing and Southern analysis.
  • the ⁇ -gal staining was carried out after fixation of the cells with 0.5% glutaraldehyde by adding the staining solution (5mM K 4 Fe (Cn 6 ) x3H 2 O, 5mM K 3 Fe (Cn 6 ), 2mM MgCl 2 , 4mg ml X-Gal in PBS) and subsequent incubation for 7-8h at 37 ° C Colored cells were determined microscopically.
  • the ß-Gal assay was carried out using the "Galacto Light Kit” (Tropix, Perkin bucket) according to the manufacturer, carried out with quantities reduced to 33%. Relative light units (RLUs) were measured in the Lumat LB9501 luminometer (Berthold, Germany) and normalized to RLU / ⁇ g protein in the cell lysate.
  • lxlO 5 cells were first sown in 3.5 cm plates, and transfected with 2 ⁇ g expression vector (pPGK ⁇ NLS).
  • pPGK ⁇ NLS 2 ⁇ g expression vector
  • the cells were cultivated for 72 hours before the addition of the topoisomerase inhibitor camptothecin (50 ⁇ g / ml).
  • camptothecin 50 ⁇ g / ml.
  • a co-transfection of pCH-RNRZ and expression vector in a ratio of 1: 1 was carried out.
  • a further 72 hours later, a ⁇ -gal staining was carried out as described above.
  • the recombination analysis in the stable HeLa cell lines (H5) was carried out directly at the DNA level.
  • 5x10 6 cells were sown in 10 cm plates and, after 24 hours, transfected with 14 ⁇ g circular expression vector and 21 ⁇ l Fugene TM 6. After 72 hours, the cells were harvested to determine the genomic DNA via affinity chromatography (QIAamp Blood Kit; Qiagen,
  • genomic DNA About 100-400ng of the genomic DNA were amplified by PCR in order to detect the deletion of the neomycin resistance gene and a complete res caused by resolution.
  • P-SV40 tenu2 5 'ATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCAT 3 '
  • the amplification was carried out after an initial denaturation at 94 ° C (5 min.) With 34 cycles of denaturation (94 ° C, 1 min.), Primer binding (63 ° C, 1 min.) And DNA synthesis (72 ° C, 2 min.) , followed by a final synthesis step for 4 min at 72 ° C.
  • the amplified PCR products were separated by agarose gel electrophoresis, the recombination product was eluted (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Germany) and then sequenced.
  • the PCR products were transferred to a nylon membrane by means of Southern hybridization, and hybridized with the recombined PCR product as 32 P-dATP and 32 P-dCTP (Amersham) radiolabelled probe.
  • Another PCR with the primers P-SV eol and P-SVNeo2 served as Evidence of a possible inversion product.
  • Cell lysates from transiently transfected cells were prepared by boiling (15 min.) The cells in sample buffer (New England Biolabs). The proteins were separated by molecular weight in a 12.5% SDS-polyacrylamide gel and transferred to a nitrocellulose membrane (Immobilon P, Millipore) overnight. The membrane was treated with 1% blocking solution (BM Chemiluminescence Western Blotting Kit; Boehringer Mannheim, Germany) and incubated with polyclonal mouse antibodies against ⁇ -resolvase at a dilution of 1: 3000 (antibodies from N. Grindley, USA).
  • sample buffer New England Biolabs
  • the proteins were separated by molecular weight in a 12.5% SDS-polyacrylamide gel and transferred to a nitrocellulose membrane (Immobilon P, Millipore) overnight.
  • the membrane was treated with 1% blocking solution (BM Chemiluminescence Western Blotting Kit; Boehringer Mannheim, Germany) and incubated with polyclonal mouse antibodies against ⁇ -
  • the position of the resolvase on the membrane was made visible with the peroxidase-coupled secondary antibodies (BM Chemiluminescence Western Blotting Kit; Boehringer Mannnheim, Germany). Purified ⁇ resolvase acted as a control.
  • the kD marker (Broad rank marker, New England Biolabs) was used to compare the sizes.
  • ⁇ -resolvase or one of the mutants can catalyze recombination in eukaryotic cells.
  • the eukaryotic expression vectors, pPGK ⁇ and their derivatives which contain the resolvase gene or the genes for the derivatives under the control of the PGK promoter, were used.
  • cell lysates were prepared 72 hours later and examined by Western analysis.
  • the recombinase was detected by means of mouse polyclonal antibodies directed against wild-type ⁇ resolvase.
  • pPGKCre which expresses the Cre recombinase of the phage P1, was introduced into the cells.
  • the Westem analysis shows that, based on the respective expression vectors, the resolvase protein or its respective derivatives are synthesized in CHO cells.
  • the expression vectors were in each case transiently introduced together with the recombination substrate pCH-RNRZ.
  • the recombination leads to the deletion of the DNA segment in front of the ⁇ -galactosidase gene, which can then be expressed by the SV40 promoter. Successful recombination events can therefore be detected by an enzyme activity determination.
  • a human reporter cell line (H5) was determined. This cell line contains a copy of the substrate vector (pCH-RNRZ) randomly integrated into the genome by non-homologous recombination. This was demonstrated in advance using a Southern analysis. Approximately 72 hours after the introduction of the respective expression vectors into the cell line H5, genomic DNA was isolated and an attempt was made to detect the recombination via PCR with the primers P-SV40gar and P-CHSeqanti and subsequent Southern analysis.
  • the PCR product that is obtained with unrecombined substrate is longer than that after the deletion of the neo gene Recombination occurred, and thus both products can be separated from each other in an agarose gel electrophoresis.
  • the results show that recombination in the presence of the two
  • Resolve mutants ⁇ E124Q and ⁇ E102Y * E124Q have taken place and that - presumably very low - activity can also be measured with wild-type ⁇ resolvase (without NLS).
  • the expression vector pPGK ⁇ was first introduced alone in HeLa cells by lipofection. Approximately 72 hours later the cells were treated with CPT and after a further 3 hours the expression vector together with the substrate pCH-RNRZ was introduced into the cells pretreated in this way, again by lipofection. After a further 72 hours, the cells were stained by treatment with X-Gal. A blue staining of the cells shows that the enzyme ⁇ -galactosidase is expressed in the cells, which in turn suggests successful recombination events.
  • CPT topoisomerase inhibitor camptothecin

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen, umfassend das Einführen in eine Zelle einer ersten, eine res-Sequenz umfassenden, DNA-Sequenz, das Einführen einer Kopie der ersten DNA-Sequenz, und das Durchführen der Sequenz-spezifischen Rekombination durch Einwirken einer Resolvase oder dessen Derivat. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen von Topoisomeraseinhibitoren in einer eukaryotischen Zelle, umfassend das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA-Sequenz gemäss SEQ ID NO:1, das Einführen in eine Zelle einer Kopie der ersten DNA-Sequenz gemäss SEQ ID NO:1 in direkter Orientierung, das Einführen einer Wiltyp-Resolvase, und Zugabe der zu testenden Topoisomeraseinhibitoren.

Description

Resolvase-katalysierte, Sequenz-spezifische DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen, umfassend das Einführen in eine Zelle einer ersten, eine res- Sequenz umfassenden, DNA-Sequenz, das Einführen einer Kopie der ersten DNA-Sequenz und das Durchführen der Sequenz-spezifischen Rekombination durch Einwirken einer Resolvase oder dessen Derivat. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Testen von Topoisomeraseinhibitoren in einer eukaryotischen Zelle, umfassend das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO:l, das Einführen in eine Zelle einer Kopie der ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO:l in direkter Orientierung, das Einführen einer Wildtyp-Resolvase, und Zugabe der zu testenden Topoisomeraseinhibitoren.
Die kontrollierte Manipulation eukaryotischer Genome ist eine wichtige Methode zur Erforschung der Funktion(en) bestimmter Gene im lebenden Organismus. Darüberhinaus spielt sie eine Rolle bei gentherapeutischen Verfahren im medizinischen Bereich. Die Herstellung von transgenen Tierstämmen, die Veränderung von Genen oder Genabschnitten (sog. "gene targeting") und die zielgerichtete Integration fremder DNA in das Genom höherer Eukaryoten sind in diesem Zusammenhang von besonderer Bedeutung. Durch die Charakterisierung und Anwendung von Sequenz-spezifischen Rekombinationssystemen konnten diese Technologien in letzter Zeit erheblich verbessert werden.
Konservative, Sequenz-spezifische DNA-Rekombinasen werden in zwei Familien eingeteilt. Mitglieder der ersten, der sog. "Integrase"-Familie katalysieren die Trennung und Neuverknüpfung von DNA-Strängen zwischen zwei definierten Nukleotidsequenzen, die im folgenden als Rekombinationssequenzen bezeichnet werden. Diese können entweder auf zwei verschiedenen oder auf einem DNA-Molekül liegen. Es kommt dann zur inter- bzw. intramolekularen Rekombination. Im letzten Fall hän^t das Resultat der Reaktion von der jeweiligen Anordnung der Rekombinationssequenzen zueinander ab. Befinden sich die Rekombinationssequenzen in invertierter, d.h. entgegengesetzter, Orientierung zueinander, kommt es zur Inversion des dazwischen liegenden DNA-Segments. Befinden sich die Rekombinationssequenzen als direkte, d.h. gleichgerichtete, Wiederholungen auf einem DNA- Substrat, kommt es zur Deletion. Bei der intermolekularen Rekombination, d.h. wenn die beiden Rekombinationssequenzen auf zwei verschiedenen DNA-Molekülen plaziert sind, kann es zu einer Fusion der zwei DNA-Moleküle kommen. Während Mitglieder der Integrase-Familie üblicherweise sowohl intra- als auch intermolekulare Rekombination katalysieren, sind Rekombinasen der zweiten Familie, der sog. "Invertasen/Resolvasen", nur zur intramolekularen Rekombination fähig. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die "Invertasen/Resolvasen" intramolekulare Rekombination nur dann durchführen können, wenn die Rekombinationssequenzen entweder als invertierte Wiederholungen (Invertasen) oder als direkte Wiederholungen (Resolvasen) vorliegen. Das Einwirken der Invertasen führt immer zur Inversion eines zwischen den Rekombinationssequenzen liegenden DNA-Segments, wogegen Resolvasen immer eine Deletion herbeiführen.
Die Rekombinasen, die zur Zeit hauptsächlich zur Manipulation eukaryotischer Genome benutzt werden, gehören zur Integrase-Familie. Es sind dies die Cre-Rekombinase des Bakteriophagen Pl und die Flp-Rekombinase aus Hefe; vgl. Müller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3. Die Rekombinationssequenzen, an die Cre-Rekombinase bindet, werden als loxP bezeichnet. loxP ist eine 34 bp lange Nukleotidsequenz, die aus je zwei 13 bp langen invertierten Nukleotidsequenzen und einem dazwischenliegenden 8 bp langen Spacer besteht; vgl. Hoess, R. et al. (1985) J. Mol. Biol., 181, pp. 351. Die Bindungssequenzen für Flp, als ERJ bezeichnet, sind ähnlich aufgebaut, unterscheiden sich jedoch von loxP; vgl. Kilby, J. et al. (1993) Trends Genet., 9, pp. 413. Die Rekombinationssequenzen können daher nicht gegeneinander ausgetauscht werden, d.h. Cre kann keine ER7 - und FLP keine /o-xP-Sequenzen rekombinieren. Beide Rekombinationssysteme sind über weite Distanzen aktiv, d.h. das zu invertierende oder deletierende DNA-Segment, flankiert von zwei loxP- oder ERr-Sequenzen, kann mehrere 10.000 Basenpaare (kb) lang sein.
Mit diesen beiden Systemen wurde z.B. gewebespezifische Rekombination im Mausmodell, chromosomale Translokation in Pflanzen und Tieren, und eine kontrollierte Induktion der Genexpression erzielt; vgl. Übersichtsartikel von Müller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3. So wurde das Gen der DNA-Polymerase ß in bestimmten Geweben der Maus deletiert; vgl. Gu, H. et al. (1994) Science, 265, pp. 103. Ein weiteres Beispiel ist die spezifische Aktivierung des Onkogens vom DNA-Tumorvirus SV40 in den Augenlinsen der Maus, was zur Tumorbildung in ausschließlich diesen Geweben führte. Die Cve-loxP Strategie wurde darüberhinaus auch im Zusammenhang mit induzierbaren Promotoren verwendet. Hierdurch wurde z.B. die Expression der Rekombinase mit einem Interferon-induzierbaren Promoter reguliert, was zur Deletion eines bestimmten Gens in der Leber und nicht - oder in nur geringem Ausmaß - in anderen Geweben führte; vgl. Kühn, R. et al. (1995) Science, 269, pp. 1427.
Zwei Mitglieder der Invertase Resolvase-Familie sind bislang zur Manipulation eukaryotischer Genome verwendet worden. Eine Mutante der Invertase Gin vom Bakteriophagen Mu kann ohne Kofaktoren die Inversion eines DNA-Fragments in Pflanzenprotoplasten katalysieren. Allerdings wurde festgestellt, daß diese Mutante hyperrekombinativ ist, d.h. auch an anderen als ihren natürlichen Rekombinationssequenzen DNA-Strangtrennungen katalysiert; vgl. Maeser, S. & Kahmann, R. (1991) Mol. Gen. Genet., 230, pp. 170. Dies führt zu ungewollten, teilweise letalen Rekombinationsereignissen im Genom der Pflanzenprotoplasten. Die plasmid-kodierte ß- Rekombinase aus Streptococcus pyogenes katalysiert Rekombination zwischen zwei direkt wiederholten Rekombinationssequenzen in Zellkulturen der Maus, was zum Ausschneiden des Segments führt. Allerdings wurde neben der Deletion auch Inversion nachgewiesen; vgl. Diaz, V. et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, pp. 6634. Damit ist der kontrollierte Einsatz dieser Mitglieder der Invertase/Resolvase-Familie zur Manipulation eukaryotischer Genome stark eingeschränkt bzw. untauglich.
Die γδ-Resolvase ist der Prototyp der Resolvasesubfamilie und wird durch das bakterielle Transposon γδ (auch als Transposon 1000 bezeichnet) kodiert. Die γδ-Resolvase ist phylogenetisch eng verwand mit der Tn3 Resolvase. In der Natur kommt das γδ-Transposon als Bestandteil des F-Faktors episomal im Bakterium Escherichia coli vor. Die biologische Funktion einer transposon-kodierten Resolvase besteht in der Regel darin, die Auflösung des sog. Ko- Integrats durch eine Sequenz-spezifische DNA-Rekombination zu katalysieren. Das Ko-Integrat besteht aus zwei direkt wiederholten Kopien des Transposons und entsteht transient durch den Prozess der Transposition ("Springen" des mobilen genetischen Elements in einen anderen genomischen Lokus) innerhalb einer Bakterienzelle. Die Resolvase katalysiert die Rekombination zwischen zwei identischen Rekombinationssequenzen, die allgemein als res bezeichnet werden. Res umfaßt 145 Nukleotide und ist, wie das Resolvasegen, natürlicher Bestandteil des Transposons. Im allgemeinen bestehen die Transposons der Klasse II aus einer res, einem tnpA-Gen, welches für die Transposase kodiert, und einem tnpR-Gen, welches für die Resolvase kodiert. Bei der Bildung des Ko-Integrates wird das Transposon verdoppelt, so daß zwei Kopien des Transposons mit der res-Sequenz, dem tnpA-Gen und dem tnpR-Gen als direkte Wiederholung vorliegen; vgl. Übersichtsartikel von Grindley, N.D.F. (1994) Nucl. Acids and Mol. Biol, 8, pp. 236. Die Resolvase hat insgesamt sechs Bindungsstellen in einer res, d.h. jede Bindungsstelle wird von einem einzelnen Resolvasemolekül gebunden. Da die Wildtyp- Resolvase in Lösung (und damit auch intrazellulär) als Homodimer vorliegt, binden insgesamt 3 Dimere an eine res. Res besteht folglich aus drei Dimer-Bindungsstellen, I, π und EI bezeichnet. Zwei der drei Bindungsstellen (π und III) bezeichnet man als Hilfssequenzen. Die Besetzung dieser Sequenzen durch zwei Resolvasedimere ist eine notwendige Voraussetzung für die Aktivierung der eigentlichen Rekombinationsreaktion, die letztendlich zum DNA- Strangaustausch führt. Dieser erfolgt im Zentrum der imperfekten palindromischen Bindungsstelle I in res, der sog. "crossover" Region, und wird von dem daran gebundenen Resolvasedimer katalysiert.
Mitglieder der Resolvase-Familie benötigen negative Torsionsspannung (sog. (-) DNA Supercoiling) des DNA- Substrats, um Rekombination zwischen zwei res katalysieren zu können. Ein zusätzlicher Protein-Kofaktor wird für die Reaktion nicht benötigt. Neben (-) DNA Supercoiling ist eine weitere Voraussetzung für die Rekombination, dass beide res als direkte Wiederholungen auf einem DNA-Molekül vorkommen. Resolvasen können folglich nur die intramolekulare Deletion eines zwischen zwei res-Sequenzen lokalisierten DNA Segments katalysieren. Der Grund für diese Restriktion bezüglich Lokalisation und Orientierung der res liegt in der Bildung eines spezifischen synaptischen Komplexes, des sog. Synaptosoms, zwischen mindestens sechs Resolvase-Dimeren und den zwei, nun gepaarten, res Kopien. Die Bildung des Synaptosoms ist in jedem Fall eine notwendige Voraussetzung für die Aktivierung der Rekombinationsreaktion durch die Resolvase. Eine umfassende Übersicht der durch die Resolvasen katalysierten Rekombinationsreaktion ist z.B. in Grindley (1994) zu finden.
Es existieren Resolvase-Mutanten, z.B. der 7π3-Resolvase und der γδ-Resolvase (γδ- ResolvaseE124Q), die, unabhängig vom Vorhandensein (-) Supercoilings im DNA-Substrat- Molekül, Rekombination zwischen zwei kompletten res katalysieren können. Die molekulare Basis für diesen Phänotyp ist bislang nicht eindeutig geklärt. Offenbar spielen die veränderten
Dimerisierungseigenschaften der mutanten Resolvasemonomere hierbei eine wichtige Rolle; vgl.
Arnold et al. (1999) EMBO J., 18, pp. 1407. In diesem Fall kommt es, wie bei der Reaktion mit
Wildtyp-Resolvase beobachtet, zur Deletion des zwischen den res-Sequenzen liegenden DNA- Segments.
Eine weitere Besonderheit der mutanten Resolvase bei Vorliegen eines (-) Supercoilings liegt darin, dass diese mutanten Resolvasen die Rekombination ohne die zwei Hilfssequenzen II und m und nur mit der palindromischen Bindungsstelle I in res durchfuhren können. Es folgt daraus, dass die Rekombination auch zwischen zwei DNA-Segmenten stattfinden kann, die ausschließlich die Bindungsstellen I enthalten und damit wesentlich kürzer sind als die vollständige res. Dabei erfolgt die Rekombination unabhängig von der Lokalisation und Orientierung der Rekombinationssequenzen, d.h. die beiden Partnersequenzen können auf einem oder auf zwei verschiedenen DNA-Molekülen liegen und als direkte oder invertierte Wiederholungen vorkommen. Es kann folglich zur intermolekularen Rekombination kommen, was zu einer Fusion der zwei verschiedenen DNA-Moleküle führt, oder, im Fall der intramolekularen Reaktion in Abhängigkeit der jeweiligen Orientierung der Bindungsstellen I zueinander, d.h. als direkte oder invertierte Wiederholungen, zur Deletion oder Inversion eines zwischen den Bindungsstellen I liegenden DNA-Segments.
Aus den bekannten Eigenschaften der beschriebenen Resolvase-Mutanten und des Wildtyp Enzyms ergibt sich die in diesem Zusammenhang wichtige Ausgangssituation:
(1) Nicht modifizierte Resolvase ist strikt abhängig vom nicht relaxierten Zustand des DNA- Substrats, das außerdem zwei komplette res-Sequenzen als direkte Wiederholungen tragen muß. Es kommt nur zur intramolekularen Rekombination und der daraus resultierenden Deletion eines DNA-Segments.
(2) Die mutierten Varianten, z.B. γδ-ResolvaseE124Q oder γδ-ResolvaseE102 E124Q dagegen können die Rekombinationsreaktion auch auf relaxierten, z.B. linearen, Substratmolekülen katalysieren, wobei die kompletten res-Sequenzen (I, II und IH) allerdings auf dem gleichen DNA-Molekül in direkter Wiederholung liegen müssen. Auch mit den mutanten Resolvasen kommt es mit den kompletten res-Sequenzen nur zur intramolekularen Rekombination und der daraus resultierenden Deletion eines DNA-Segments.
(3) Die mutante Resolvase kann die Rekombination jedoch auch durchfuhren, wenn nur die res- Sequenzen mit der Bindungsstelle I vorliegen, unabhängig von der Torsionsspannung der DNA, d.h. mit oder ohne (-) Supercoiling. Die Lokalisation der res-Sequenzen auf einem DNA- Molekül und die Orientierung ist dabei unwesentlich. Daher können die Resolvase-Mutanten sowohl intra- als auch intermolekulare Rekombinationen durchführen.
Intrazelluläre genomische und episomale DNA in höheren Eukaryoten befindet sich bis auf einige wenige Bereiche in einem topologisch relaxierten Zustand, d.h. es kommen kaum frei vorliegende (-) superhelikale Windungen in der DNA vor, die z.B. die Wildtyp-Resolvase für die Katalyse der Rekombination nutzen könnte. Daher wurde die Resolvase bisher nicht für die Rekombination in eukaryotischen Zellen verwendet.
Der topologische Zustand genomischer DNA wird in der Zelle durch eine besondere Enzymklasse reguliert, die man Topoisomerasen nennt. Kommt es zum Ausfall der enzymatischen Aktivität dieser Proteine, etwa durch Mutationen oder Einwirken von Inhibitoren, akkumuliert sich topologische Spannung in der genomischen DNA als Folge anderer DNA- Transaktionen, wie Transkription; vgl. Übersichtsartikel von Wang, J.C. (1996), Annu. Rev. Biochem., 65, pp.635. Es existiert eine Reihe von Substanzen, die die intrazellulären Topoisomeraseaktivitäten selektiv inhibieren können. Eine besondere Klasse dieser Substanzen ist z.B. durch Camptothecin und dessen Derivate repräsentiert, die als Antikrebsmittel bereits in der therapeutischen Anwendung stehen und Topoisomerasen des Typ I selektiv inhibieren; Übersichtsartikel von Chen und Liu (1994), Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 34, pp.191. Ein wesentliches Problem bei der Entwicklung neuartiger und effektiverer Topoisomeraseinhibitoren ist zur Zeit jedoch noch das Fehlen eines einfachen Testsystems, entweder in Zellkultur oder im lebenden Organismus, wie z.B. der Maus, zur Bestimmung der Inhibitionsstärke und/oder der Gewebespezifität einer solchen Substanz.
Somit besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein einfaches und regulierbares Rekombinationssystem und die benötigten Arbeitsmittel zur Verfügung zu stellen. Ferner besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein einfaches und zuverlässiges Testsystem für eukaryotische Topoisomeraseinhibitoren zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgaben werden durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Figuren erläutert.
Figur 1A zeigt eine schematische Darstellung der γδ-Resolvase katalysierten Rekombinationsreaktion und Figur 1B eine schematische Darstellung der γδ-res-Sequenz. (A) Dargestellt ist eine zirkuläre, topologisch entspannte DNA, die zwei res als direkte Wiederholungen trägt (schwarze Pfeile). Durch die Bindung der Resolvasedimere an jede res kommt es zur Bildung des synaptischen Komplexes, des Synaptosoms, in dem die DNA- Strangbrüche katalysiert werden (angedeutet durch offene Pfeilspitzen). Sowohl die Synapsenbildung als auch der DNA-Strangaustausch erfordert negative superhelikale Spannung des DNA- Substrats. Nach dem Strangaustauch kommt es zur Religation und dem Freisetzen des Rekombinationsprodukts, eines dimeren, einfach verknüpften DNA-Catenans. (B) Dargestellt ist der Aufbau einer res. Diese besteht aus drei separaten Bindungstellen für jeweils ein Resolvasedimer (dargestellt durch invertierte schwarze Pfeile als jeweilige Halbsequenz und markiert durch I bis in). Der Abstand zwischen den Zentren der drei Bindungsstellen ist in Basenpaaren (bp) angegeben und durch die dünnen Pfeile unter der res markiert. Der eigentliche DNA-Strangaustausch findet während der Rekombination am Zentrum der Bindungsstelle I statt (markiert durch offene Pfeilspitzen).
Figur 2A zeigt eine schematische Darstellung der γδ-Resolvase Expressionsvektoren und Figur 2B eine schematische Darstellung des Substratvektors und des aus der Rekombination hervorgehenden Produktvektors. (A) Dargestellt ist eine schematische Repräsentation der eukaryotischen Expressionsvektoren für die Wildtyp γδ-Resolvase (pPGKγδ) und deren Mutanten γδE102Y' E124Q (pPGKγδl02) und γδEI24Q (pPGKγδl24) . Die Position und Natur der jeweiligen Mutation im Resolvasegen ist markiert. Vom Wildtyp und den beiden Mutanten, γδE102Y' E124Q und γδE124Q, existiert jeweils eine Version mit und eine ohne eine Nukleare Lokalisationssequenz (NLS) am C-terminalen Ende des Gens. Die Gene werden durch den Phosphoglycerat-Kinase-Promoter (P-PGK) expremiert. Dieser Promoter ist in allen bislang untersuchten eukaryotischen Zellen aktiv. (B) Dargestellt ist eine schematische Darstellung des Substratvektors, mit dem Rekombination in eukaryotischen Zellen getestet wird. pCH-RNRZ bezeichnet den nicht rekombinierten Vektor. Er enthält neben dem Ampizillin-Resistenzgen zur Amplifikation in E. coli, den frühen SV40 Promoter, der vor der Rekombinationskassette bestehend aus res, dem Gen für Neomyzin (Neo) Resistenz, res und dem lacZ Gen, welches für die ß-Galaktosidase kodiert. Die Lokalisation und jeweilige Orientierung der beiden PCR-Primer P-SV40prä und P-Seqanti ist durch kleine Pfeile oberhalb bzw. unterhalb des Vektors angedeutet. Die Rekombination zwischen beiden res führt zur Deletion des dazwischen liegenden Neo-Gens, dem gleichzeitigen Verlust einer res Kopie und der Expression des lacZ Gens. Der aus der Rekombination hervorgehende Vektor wird mit pCH-RZ bezeichnet. Markiert sind zusätzlich die relevanten Schnittstellen in beiden Vektoren für das Restriktionsenzym BamHI.
Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung einer Western- Analyse.
Nach Einbringen des jeweiligen Vektors, wie angezeigt, in CHO-Zellen wurden Zelllysate präpariert und Proteine in einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach ihrem
Molekulargewicht aufgetrennt. Die Anwesenheit der γδ-Resolvase und deren Derivate wurde durch polyklonale Maus-Antikörper, die gegen Wildtyp γδ-Resolvase gerichtet sind, sichtbar gemacht. Die Position von γδ-Resolvase im Gel ist durch einen Pfeil markiert. Spur 1 , Kontrolle mit Cre -Vektor; Spur 2, Kontrolle mit gereinigter Resolvase.
Figur 4 zeigt eine Darstellung der quantitativen Auswertung transienter Ko-Transfektions
Experimente in CHO Zellen.
Die jeweiligen γδ-Expressionsvektoren wurden separat mit dem Substrat pCH-RNRZ durch
Lipofektion in CHO-Zellen eingebracht. Die enzymatische Aktivität der ß-Galaktosidase wurde nach 72 Stunden in Zelllysaten photometrisch bestimmt, auf den Proteingehalt der Lysate normiert und statistisch ausgewertet. Dargestellt ist ein Balkendiagramm mit den jeweiligen
Standardabweichungen vom Mittelwert.
Figur 5 zeigt in einer schematischen Darstellung den Nachweis der Deletion in Reporterzellinie H5 durch PCR und nachfolgender Southern Hybridisierung nach Auftrennung der DNA- Moleküle in Agarose-Gelen (1,2% w/v). Dargestellt ist eine Southern Analse der durch die jeweiligen Expressionsvektoren erzielten PCR-Produkte. Die Bezeichnung unrek. bzw. rek. weisen auf die Position der PCR-Produkte im Gel hin, die durch den nicht rekombinierten (pCH- RNRZ) bzw. rekombinierten Vektor (pCH-RZ) entstehen.
Figur 6 A zeigt eine Darstellung der quantitativen Auswertung des Einflusses des Topoisomeraseinhibitors Camptothecin auf die Rekombination mit Wildtyp γδ-Resolvase. Der hier verwendete Ausdruck "Transposon" bezeichnet ein mobiles genetisches Element, das zumindest eine Rekombinationssequenz, eine Transposase und eine Resolvase umfaßt und aus Bakterien stammt.
Figur 7 zeigt eine Darstellung der quantitativen Auswertung transienter Ko-Transfektions- Experimente in CHO-Zellen mit in vitro linearisierten Substratvektoren.
Dargestellt ist ein Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen vom Mittelwert. Die Expressionsvektoren für Cre und γδ-ResolvaseE102γ'EI24Q wurden separat mit dem Substratvektor pCH-RLNRLZ, einem Derivat von pCH-RNRZ, das zusätzlich zwei loxP Sequenzen für die Rekombination durch Cre als direkte Wiederholungen enthält, durch Lipofektion in CHO-Zellen eingebracht. pCH-RLNRLZ wurde vor der Lipofektion mit dem Restriktionsenzym XmnI, dass nur einmal im gesammten Vektor schneidet, linearisiert und daraufhin in einer Agarosegelelektrophorese kontrolliert. Die enzymatische Aktivität der ß- Galaktosidase wurde nach 72 Stunden in Zelllysaten photometrisch bestimmt, auf den Proteingehalt der Lysate normiert und statistisch ausgewertet. Als Negativkontrolle wurde das Substratplasmid mit einem Expressionsvektor für die Lambda Integrase (pPGKssInth) ko- transfiziert (Balken 3 und 6, von links). Als Positivkontrolle fungierte der in E. coli rekombinierte pCH-RLNRLZ (pCH-RLZ) Vektor ko-transfiziert mit dem jeweiligen Expressionsvektor für Cre (pPGKCre) oder γδ-ResolvaseE102Y'E124Q (pPGKγδl02NLS) (Balken 1 und 4). Man sieht, dass die Rekombination zwischen den loxP Sequenzen auf pCH-RLNRLZ zu ß-Galaktosidase-Werten führt, die etwa bei 65% der Positivkontrolle liegen (vergl. Balken 1 und 2). Eine vergleichbare Rekombinationsaktivität konnte zwischen den res-Sequenzen durch γδ- ResolvaseE102Y'E124Q beobachtet werden (vergl. Balken 4 und 5)
Der hier verwendete Ausdruck "Resolvase" bezeichnet ein Enzym, das von einem Transposon kodiert wird, und das die Auflösung der Ko-Integrat Struktur des Transposons durch Sequenz- spezifische Rekombination katalysiert so wie seine Derivate, z.B. mutante Resolvasen.
Der hier verwendete Ausdruck "Derivate" bezeichnet Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen aufweisen. In diesem Sinne bezeichnet der Ausdruck "Derivate" eine 3'- und/oder 5'-verkürzte Form der in SEQ ID NO: l oder 2 gezeigten Sequenz, geringfügige Mutationen (Basenaustausch) der res-Sequenz gemäß SEQ ID NO:l oder 2 und Insertionen, Additionen oder Deletionen der SEQ ID NO:l oder 2, wobei alle diese Modifikationen eine vergleichbare Aktivität mit den Ausgangs-res-Sequenzen aufweisen. Entsprechend bezeichnet der Ausdruck "Derivate" auch die
Nukleinsäuren, die eine oder mehrere der aufgeführten Mutationen aufweisen und ein Polypeptid mit einer Resolvaseaktivität kodieren. In diesem Sinne bezeichnet der Ausdruck "Derivate" ebenfalls Polypeptide mit einer oder mehreren der aufgeführten Modifikationen, wobei die Polypeptide eine Resolvaseaktivität aufweisen.
Der hier verwendete Ausdruck "basische Aminosäure" bezeichnet Aminosäurereste mit positiv geladener Seitenkette, z.B. Lysin, Arginin und Histidin. Der hier verwendete Ausdruck "saure Aminosäure" bezeichnet Aminosäurereste mit negativ geladener Seitenkette, z.B. Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Der hier verwendete Ausdruck "direkte Orientierung" oder "direkte Wiederholung" bedeutet, dass Sequenzen jeweils in 5 '-3 '-Richtung vorliegen.
Der hier verwendete Ausdruck "Transformation" oder "transformieren" bezeichnet jegliches Einführen einer Nukleinsäuresequenz in eine Zelle. Das Einführen kann z.B. eine Transfektion oder Lipofektion sein, durch das Calciumphosphat-Verfahren, Elektroschock-Verfahren oder eine Oocyteninjektion durchgeführt werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" bezeichnet natürlich vorkommende oder künstlich erschaffene Konstrukte zur Aufnahme, Vermehrung, Expression oder Übertragung von Nukleinsäuren, z.B. Plasmide, Phagemide, Cosmide, künstliche Chromosomen, Bakteriophagen, Viren oder Retroviren.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen, umfassend das gleichzeitige oder sequenzielle Einführen in eine Zelle zweier Kopien einer ersten, eine res-Sequenz umfassenden, DNA-Sequenz und das Durchführen der Sequenz-spezifischen Rekombination durch Einwirken einer Resolvase. Bevorzugt ist ein Verfahren, in dem eine Kopie der ersten DNA-Sequenz in direkter Orientierung auf dem selben DNA-Molekül wie die andere Kopie eingeführt wird. Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, wobei die erste DNA-Sequenz eine res-Sequenz gemäß SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO:2 umfaßt. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die erste DNA-Sequenz neben der Rekombinationssequenz weitere DNA-Sequenzen umfassen, die eine Integration in einen gewünschten Zielort im Genom der eukaryotischen Zelle erlauben. Diese Integration verläuft über die homologe Rekombination, die durch zellinterne Rekombinationsmechanismen vermittelt wird. Dazu müssen die weiteren DNA-Sequenzen zur Zielort-DNA homolog sein und sowohl 3 ' als auch 5' von den zwei als direkte Wiederholungen vorliegenden res-Sequenzen liegen. Wie hoch der Grad der Homologie und wie lang die jeweiligen 3'- und 5 '-Sequenzen sein müssen, damit die homologe Rekombination mit einer hinreichenden Wahrscheinlichkeit abläuft, ist dem Fachmann bekannt; vgl. Übersichtsartikel von Capecchi, M. (1989) Science, 244, pp. 1288.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann z.B. verwendet werden, um in eukaryotischen Zellen bei einer intramolekularen Rekombination das zwischen den direkt orientierten Rekombinationssequenzen liegende DNA-Segment zu deletieren. Die Rekombinationssequenzen liegen direkt orientiert vor, wenn die Sequenzen jeweils in 5 '-3 '-Richtung eingebaut werden. Werden die Rekombinationssequenzen, z.B. res mit den Bindungsstellen I, π und πi (SEQ FD NO:l) oder res mit der Bindungsstelle I (SEQ ID NO:2), über homologe Rekombination jeweils in eine Intronsequenz 5 ' und 3 ' eines Exons auf dem selben DNA-Molekül placiert und die Rekombination durch das Einwirken der Resolvase, z.B. der γδ-ResolvaseEI24Q oder γδ- ResolvaseE102Y' E124Q ; durchgeführt, so wird das Exon deletiert. Dadurch kann z.B. das vom entsprechenden Gen kodierte Polypeptid seine Aktivität oder Funktion verlieren oder die Transkription durch die Deletion gestoppt werden, so daß kein (vollständiges) Transkript entsteht. Auf diese Weise kann z.B. die biologische Funktion des kodierten Polypeptids untersucht werden. Die Resolvase bzw. dessen Derivat kann dabei eine nukleare Lokalisationssequenz am C-terminalen Ende tragen, die für einen besseren intrazellulären Transport der Rekombinase in den Zellkern sorgt.
Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um in eukaryotischen Zellen bei einer intramolekularen Rekombination das zwischen den nicht direkt orientierten Rekombinationssequenzen liegende DNA-Segment zu invertieren. Dazu müssen die Rekombinationssequenzen res mit der Bindungsstelle I in umgekehrter Orientierung auf dem selben DNA-Molekül placiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner verwendet werden, um in eukaryotischen Zellen eine intermolekulare Rekombination durchzuführen. Dazu werden die
Rekombinationssequenzen res mit der Bindungsstelle I unabhängig von der Orientierung auf zwei verschiedenen DNA-Molekülen placiert. Die Rekombination führt dann zu einer Fusion der beiden DNA-Moleküle an den Bindungsstellen I .
Die erste DNA-Sequenz kann jedoch noch weitere Nukleinsäuresequenzen umfassen, die ein oder mehrere Polypeptid(e) von Interesse kodieren. So kann z.B. mit den Rekombinationssequenzen ein Strukturprotein, ein Enzym oder ein regulatorisches Protein in das Genom eingeführt werden, das nach erfolgter intramolekularer Rekombination wieder eliminiert wird, wodurch die Expression und Aktivierung des Polypeptids aufgehoben wird. Wird durch die intramolekulare Rekombination das Polypeptid von Interesse nicht deletiert sondern invertiert, kann es zu einer anschließenden Expression und Aktivierung des Polypetids kommen. Das eingeführte Polypeptid kann endogen oder exogen sein. Femer kann ein Markerprotein eingeführt werden. Dem Fachmann ist bewußt, daß diese Auflistung von Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens nur beispielhaft und nicht abschließend ist. Beispiele für erfindungsgemäße Anwendungen, die mit den bisher verwendeten Cre- und Flp-Rekombinasen durchgeführt wurden, sind z.B. in dem Übersichtsarktikel von Kilby, N. et al., (1993), Trends Genet., 9, pp.413, zu finden.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens muß eine Resolvase auf die
Rekombinationssequenzen einwirken. Dabei kann die Resolvase oder das Resolvase-Gen bereits vor Einführen der ersten, eine res-Sequenz umfassenden, DNA-Sequenz und/oder der Kopie der ersten DNA-Sequenz in der eukaryotischen Zelle vorliegen oder nach Einführung der ersten DNA-Sequenz und/oder der Kopie der ersten DNA-Sequenz eingeführt werden. Die für die Sequenz-spezifische Rekombination verwendete Resolvase wird bevorzugt in der Zelle expremiert, in der sie die Reaktion durchführt. Dazu wird eine zweite DNA-Sequenz, umfassend ein Resolvase-Gen, in die Zellen eingeführt. Bevorzugt werden Nukleinsäuren verwendet, die modifizierte γδ-Resolvasen kodieren, wobei die Resolvasen vorzugsweise in der Art modifiziert sind, daß sie in dem Segment von Aminosäuren 80 - 140, vorzugsweise 90 - 1 10, bezogen auf die in SEQ ID NO:4 gezeigte Wildtypresolvasenummerierung wenigstens eine, vorzugsweise wenigstens zwei, der folgenden Mutationen aufweisen: (i) ein saurer Aminosäurerest ist durch einen aromatischen, hydrophilen oder basischen Aminosäurerest ersetzt, (ii) ein neutraler Aminosäurerest ist durch einen hydrophilen Aminosäurerest ersetzt, und (iii) ein hydrophiler Aminosäurerest ist durch einen neutralen oder sauren Aminosäurerest ersetzt. Besonders bevorzugte Nukleinsäuren kodieren modifizierte γδ-Resolvasen, wobei in dem Segment Glu durch Gin oder Tyr, Asp durch Ser, Ser durch Asp, Gly durch Ser, Asp durch Ala und/oder Glu durch Arg ersetzt ist. insbesondere bevorzugte Resolvase-Gene sind in SEQ ID NO:3, 5 und 7 aufgeführt und schließen ebenfalls deren Derivate ein. Ganz besonders bevorzugt sind γδ- Resolvase-Gene, deren kodierte Polypeptide zwei Mutationen aufweisen, insbesondere das Resolvase-Gen gemäß SEQ ID NO:5, aufgrund ihrer höheren Effizienz gegenüber den Einfachmutanten. Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die zweite DNA-Sequenz ins eukaryo tische Genom der Zelle über homologe Rekombination oder wahllos integriert wird. Ferner bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die zweite DNA-Sequenz regulatorische DNA- Sequenzen umfaßt, die eine räumliche und/oder zeitliche Expression des Resolvase-Gens bewirken.
Räumliche Expression bedeutet in diesem Fall z.B., daß die Rekombinase nur in einem bestimmten Zelltyp, z.B. Leberzellen, Nierenzellen, Nervenzellen oder Zellen des Immunsystems, durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren expremiert werden kann und nur in diesen Zellen die Rekombination katalysiert. Eine zeitliche Expression bei der Regulation der Resolvase-Expression kann durch Promotoren erzielt werden, die ab oder in einem bestimmten Entwicklungsstadium oder zu einem bestimmten Zeitpunkt im adulten Organismus aktiv sind. Ferner kann die räumliche und/oder zeitliche Expression durch die Verwendung von induzierbaren Promotoren, z.B. durch Interferon- oder Tetrazyklin-abhängige Promotoren, erzielt werden; vgl. Übersichtsartikel von Müller, U. (1999) Mech. Develop. ,82, pp. 3. Eine räumliche und/oder zeitliche Aktivierung der Rekombination kann jedoch nicht nur durch die Regulation der Resolvaseexpression erzielt werden, sondern ist auch durch das Einwirken von Topoisomeraseinhibitoren bei konstitutiver Expression der Wildtyp-Resolvase erreichbar.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Resolvase kann sowohl die Wildtyp- Resolvase als auch eine modifizierte Resolvase sein. Bevorzugt ist die Verwendung einer modifizierten Resolvase. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt verwendeten Resolvasen umfassen die Aminosäuresequenzen aufgeführt in SEQ ED NO: 4, 6 und 8. Die modifizierte Resolvase ist derart modifiziert, daß sie die Rekombinationsreaktion ohne (-) DNA supercoiling, d.h. auf relaxierten Substratmolekülen, vorzugsweise auf relaxierten linearen Substratmolekülen, durchführen kann. Die Herstellung von modifizierten Polypeptiden und die Durchmusterung auf die gewünschte Aktivität sind Stand der Technik und einfach durchzufuhren; vgl. Erlich, H. (1989) PCR Technology. Stockton Press. Bevorzugt ist die Verwendung der γδ-Resolvase gemäß SEQ ID NO:4. Besonders bevorzugt sind modifizierte Resolvasen, wobei die Resolvasen vorzugsweise in der Art modifiziert sind, daß sie in dem Segment von Aminosäuren 80 - 140, vorzugsweise 90 - 110, bezogen auf die in SEQ ID NO:4 gezeigte Wildtypresolvasenummerierung wenigstens eine, vorzugsweise wenigstens zwei, der folgenden Mutationen aufweisen: (i) ein saurer Aminosäurerest ist durch einen aromatischen, hydrophilen oder basischen Aminosäurerest ersetzt, (ii) ein neutraler Aminosäurerest ist durch einen hydrophilen Aminosäurerest ersetzt, und (iii) ein hydrophiler Aminosäurerest ist durch einen neutralen oder sauren Aminosäurerest ersetzt. Besonders bevorzugt sind modifizierte γδ- Resolvasen, wobei in dem Segment Glu durch Gin oder Tyr, Asp durch Ser, Ser durch Asp, Gly durch Ser, Asp durch Ala und oder Glu durch Arg ersetzt ist. Insbesondere bevorzugt sind zwei γδ-Resolvase-Mutanten, die als γδ-ResolvaseE124Q (SEQ ID NO:8) und γδ-ResolvaseE102Y' E124Q (SEQ ID NO:6) bezeichnet werden; vgl. Arnold et al. (1999), siehe oben. γδ-ResolvaseE124Q enthält einen Glutamin-Rest anstelle eines Glutamat-Restes an Position 124. γδ-ResolvaseE102 ' E124Q enthält, neben dem Austausch der Mutante 124, noch einen Tyrosin-Rest anstelle des Glutamat-Restes an Position 102 gegenüber Wildtyp γδ-Resolvase. Beide γδ-Resolvase Mutanten wurden über PCR-Mutagenese des γδ-Resolvasegens hergestellt. Diese Mutanten können Rekombination zwischen zwei direkt wiederholten, kompletten res-Sequenzen ohne den Kofaktor (-) Supercoiling durchführen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in allen eukaryotischen Zellen durchgeführt werden. Die Zellen können z.B. in einer Zellkultur vorliegen und alle Arten von pflanzlichen oder tierischen Zellen z.B. von Vertebraten wie Fische, Frösche oder Säuger, oder Invertebraten wie Würmer oder Insekten, z.B. Fliegen, umfassen. Z.B. können die Zellen Oocyten, embryonale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen oder jede Art von differenzierten Zellen sein. Bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die eukaryotische Zelle eine Nicht-Säugerzelle z.B. eine Zebrafisch-, Caenorhabditis elegans oder Drosophila melanogaster Zelle ist. Femer bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die eukaryotische Zelle eine Säugerzelle z.B. eine menschliche Zelle oder eine nicht menschliche Zelle z.B. eine Affen-, Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Hamster-, Ziege-, Kuh-, Schaf- oder Schweinezelle ist. Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft somit ebenfalls eukaryotische Zellen, umfassend res gemäß SEQ ID NO:l oder 2 in mindestens einer und vorzugsweise zwei Kopien und/oder des Resolvasegens gemäß SEQ FD NO:3, 5 oder 7 oder der durch die Gene kodierten Polypeptide, bzw. deren jeweiligen Derivate.
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer res-Sequenz gemäß SEQ FD NO: l oder SEQ ID NO:2 in einer Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen. Die eukaryotische Zelle kann auch im Zellverband eines pflanzlichen oder tierischen Organismus, z.B. von Vertebraten wie Fische, Frösche oder nicht menschlichen Säugers oder (wenn es in den Patentierungsvorausetzungen des jeweiligen Patentsystems gewährbar ist) in Form eines menschlichen Organismus, oder Invertebraten wie Würmer oder Insekten, z.B. Fliegen, vorliegen, der keine Resolvase enthält. Dieser Organismus kann zur Kreuzung mit anderen Organsimen verwendet werden, die ihrerseits die Resolvase in ihren Zellen enthalten, so daß Nachkommen entstehen, in deren Zellen dann die Sequenz-spezifische Rekombination durch Einwirken der Resolvase durchgeführt wird. Die Erfindung betrifft somit ebenfalls die Verwendung einer Resolvase oder eines Resolvase-Gens in einer Sequenz-spezifischen Rekombination in eukaryotischen Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung des Resolvase-Gens gemäß SEQ ID NO:3, der ResolvaseE102Y' E124Q gemäß SEQ FD NO:5 und der ResolvaseE124Q gemäß SEQ ID NO:7.
Die Erfindung betrifft femer transgene Organismen wie Pflanzen oder Tiere, z.B. Vertebraten wie Fische, Frösche oder Säuger, oder Invertebraten wie Würmer oder Insekten, z.B. Fliegen. Bevorzugt betrifft die Erfindung transgene Nicht-Säugerorganismen wie Zebrafisch, Caenorhabditis elegans oder Drosophila melanogaster und transgene Säugerorganismen wie transgene Affen, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hamster, Ziege, Kuh, Schaf oder Schwein, die res gemäß SEQ ED NO:l oder SEQ ID NO:2 in einer oder zwei Kopien und/oder das Resolvasegen gemäß SEQ ID NO:3, 5 oder 7 oder deren Derivate in ihren Zellen integriert haben.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann femer zum Testen von Topoisomeraseinhibitoren in einer eukaryotischen Zelle verwendet werden, umfassend a) das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ED NO:l, b) das Einführen in eine Zelle einer Kopie der ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ED NO: l in direkter Orientierung, und c) das Einführen einer Wildtyp-Resolvase, und d) Zugabe der zu testenden Topoisomeraseinhibitoren. Die eukaryotischen Zellen können dabei in Kultur (ex vivo) oder im Organismus (in vivo) für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Bevorzugt ist hierbei das Verfahren im Organismus, da hier die zell- und gewebespezifischen physiologischen Einflüsse auf den möglichen Abbau bzw. die Modifizierung der Topoisomeraseinhibitoren und die daraus resultierenden Effekte hinsichtlich ihrer Wirksamkeit getestet werden können. Die Topoisomeraseinhibitoren können vor oder nach der Expression der Resolvase auf die Zellen einwirken, was zur Aktivierung der Rekombination führt und z.B. über Enzyme oder Markerproteine leicht nachzuweisen ist. Die Effizienz der jeweiligen Substanzen bezüglich ihres inhibitorischen Effekts auf Topoisomerasen korreliert mit der Aktivierung der Rekombination.
Eine räumliche und oder zeitliche Aktivierung der Rekombination kann durch eine Regulation der Resolvaseexpression erzielt werden. Eine räumliche und/oder zeitliche Aktivierung ist auch durch eine Regulation des Einwirkens von Topoisomeraseinhibitoren bei konstitutiver Expression der Wildtyp-Resolvase erreichbar.
Bevorzugt ist ein Verfahren, wobei zusätzlich eine zweite DNA-Sequenz umfassend ein Wildtyp-Resolvase-Gen in die Zelle eingeführt wird. Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die Wildtyp-Resolvase eine Wildtyp γδ-Resolvase ist. Die Erfindung betrifft femer eine eukaryotische Zelle, umfassend zwei DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO:l. Bevorzugt ist eine eukaryotische Zelle, die femer ein Wildtyp-Resolvase-Gen, insbesondere eine Wildtyp γδ-Resolvase enthält. Femer betrifft die Erfindung einen transgenen Organismus wie Pflanzen oder Tiere, z.B. Vertebraten wie Fische, Frösche oder Säuger, oder Invertebraten wie Würmer oder Insekten, z.B. Fliegen. Bevorzugt betrifft die Erfindung transgene Nicht-Säugerorganismen wie Zebrafisch, Caenorhabditis elegans oder Drosophila melanogaster und transgene Säugerorganismen wie transgene Affen, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hamster, Ziege, Kuh, Schaf oder Schwein, der zwei Kopien von res gemäß SEQ ED NO:l in direkter Orientierung und ein Resolvasegen, insbesondere ein γδ-Resolvasegen gemäß SEQ ED NO:3 in ihren Zellen integriert haben. Beispiele
1. Herstellung der Expressions- und Substratvektoren
1.1 Expressionsvektoren
Die eukaryotischen Expressionsvektoren für γδ-Resolvase (pPGKγδ/pPGKγδNLS) sowie für die γ δ-Resolvase Mutanten γδE124Q (pPGKγδl24/pPGKγδl24NLS) und γδE102Y' E124Q (pPGKγδ 102/pPGKγδl02NLS) sind Derivate von pPGKcrebpa (K. Fellenberg, Universität Köln). Der Vektor enthält den Phosphoglyceratkinase-Promoter (P-PGK) und die Polyadenylierungs- Signalsequenzen vom kleinen Simian Virus 40 (SV40) Tumor-Antigen. Die durch PCR klonierten γδ-Resolvase-Gene wurden zwischen diese Elemente in den Vektor ligiert. Für die Klonierung der Resolvase-Gene wurden folgende Primer verwendet:
P-γδA: 5 ' GATACTGCAGCATGCGACTTTTTGGTTACGCACGGGTATCA 3 '
P-γδB : 5 ' GATATCTAGATT AGTTGCTTTC ATTTATT ACTTT AT A 3 '
P-γδl24Q: 5 ' CGACAGAGAATACTACAGCGTACCAATGAA 3 ' P-γδl24Qanti: 5' TTCATTGGTACGCTGTAGTATTCTCTGTCG 3 ' P-γδl02Y: 5 ' AGTACCGATGGGTATATGGGTAAAATGGTT 3 ' P-γδl02Yanti: 5' AACCATTTTACCCATATACCCATCGGTACT 3 '
P2972: 5' CATATCTAGACTATTAAACCTTCCTCTTCTTCTTAGGGTTGCTTT
C ATTTATT ACTTT ATA 3'
Die Amplifikation des Wildtyp-Resolvase-Gens ohne bzw. mit nuklearer Lokalisationssequenz (NLS) erfolgte mit den Primern P-γδA und P-γδB, bzw. P2972 nach einem ersten Denaturierungsschritt bei 94°C (5min.) mit 28 Zyklen von Denaturierung (95°C, 30sec), Primer- Bindung (56°C, 30sec.) und DNA-Synthese (72°C, 45sec), gefolgt von einem letzten Syntheseschritt (72°C, 4min.). Das resultierende PCR-Fragment, mit PstI und Xbal restringiert, ersetzt das mit denselben Enzymen herausgeschnittene Cre-Gen in pPGKcrebpa.
Die Resolvase-Mutanten wurden durch Assembly-PCR hergestellt. Hierbei wurden im ersten Schritt der Assembly-PCR, in zwei getrennten PCR-Ansätzen mit den Primern P-γδA und P-γδ 124Qanti bzw. P-γδl24Q und P-γδB die zwei γδ-Resolvasegen-Fragmente amplifiziert, die im überlappenden Bereich die gewünschte Mutation enthalten, die dann im zweiten Schritt der Assembly-PCR in äquimolaren Mengen als Matrize für die folgende dritte PCR mit den Primern P-γδA und P-γδB eingesetzt wurden. Die Amplifikationen erfolgten jeweils nach einem ersten Denaturiemngsschritt bei 94°C (5min.) mit 30 Zyklen von Denaturierung (94°C; 45sec), Primerbindung (60°C; 45sec.) und DNA-Synthese (72°C; 45sec), sowie einem letzten Syntheseschritt (72°C; 6min). Analog dazu wurde mit den Oligonukleotiden P-γδA, P-γδl02Y, P-γδl02Yanti und P-γδB die zweite Mutation E102Y ins Gen eingeführt. Die Mutanten wurden anschließend durch eine PCR mit den Primern P-γδA und P2972 unter denselben Reaktionsbedingungen mit einer NLS am C-Terminus des Proteins versehen.
1.2 Substratvektoren
Die Substratvektoren sind Derivate von pCHHO (Pharmacia). Hierbei stehen die Rekombinationskassetten unter der Kontrolle des SV40-Promoters, der eine starke konstitutive Expression garantiert. Desweiteren besitzt das Plasmid die Polyadenylierungssignalsequenzen des SV40 Tumor-antigens. Das im Ausgangsvektor mitsamt prokaryotischem Promoter enthaltene ß-Galactosidase-Gen (lacZ) wurde zunächst mit Hindin und BamHI ausgeschnitten, um es nach PCR-Amplifikation mit den Primern P-lacZl und P-lacZantil ohne prokaryotischem Promoter wieder einzufügen. Es wurde ein erster Denaturierungsschritt (94°C; 5min.) durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen von Denaturierung (94°C; 1min.), Primerbindung (56°C; lmin.) und DNA-Synthese (72°C; 4min.) und einem letzten Syntheseschritt (72°C; 10min.).
Anschließend wurde aus dem Vektor pSV2Neo (Southern, P.J., Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, pp.327) mit den Restriktionsenzymen Smal und BglEt das Neomycin-Resistenzgen ausgeschnitten und mit über PCR hergestellten γδ-Resolvase-Erkennungssequenzen flankiert. Diese Rekombinationssequenzen (res) sind im Konstrukt in gleicher Orientierung angeordnet.
Die Amplifikation der res erfolgte mit den Primern P-RES1 und P-RESantil bzw. P-RESanti2. Sie begann mit einem ersten Denaturierungsschritt (94°C; 5min.) und 30 Zyklen von Denaturierung (94°C; 30sec), Primerbindung (56°C; 30sec.) und DNA-Synthese (72°C; 30 sec). Es folgte ein abschließender Syntheseschritt (72°C; 4min.). Die am 5 '-Terminus des Neomycingens gelegene res wurde über Bgiπ an das Neomycingen ligiert, die zweite res wurde durch eine blunt-end-Ligation mit dem 3 '-Ende des Gens verbunden. Die entstandene Rekombinationskassette res-Neo-res wurde über die HindlEI-Schnittstelle zwischen SV40- Promoter und lacZ-Gen in das Substratplasmid kloniert. Dieser wurde als pCH-RNRZ bezeichnet. Die oben genannten Oligonukleotide werden im folgenden aufgelistet: P-lacZ 1 : 5 ' GATAAAGCTTGCCGT AGATAAAC AGGCTG 3 '
P-lacZanti 1 : 5 ' GAT AGG ATCC AG AC ATGAT AAGAT A 3 '
P-RES 1 : 5 ' GATAAAGCTTGGGCCCAAAAAGTCGCATAAAAATGTATCC 3 '
P-RESantil : 5' GATAAGATCTAACAATTTTGCAACCGTCCGA 3 ' P-RESanti2: 5 ' GATAAAGCTTAACAATTTTGCAACCGTCCGA 3 '
Das Plasmid pCH-RNRZ wurde in vivo, in E. coli Stamm DH5α-Zellen (Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. ,166, pp. 557), rekombiniert. Dieser Bakterienstamm zeichnet sich dadurch aus, daß er ein F'-Plasmid trägt, das für Wildtyp-γδ-Resolvase kodiert. Das entstandene rekombinierte Plasmid pCH-RZ wurde in den weiteren Experimenten als Positivkontrolle verwendet.
Das Plasmid pCH-RLNRLZ ist ein Derivat von pCH-RNRZ und wurde über PCR mit den folgenden Oligonukleotiden generiert:
P-loxneo: 5 ' TTGTTAGATCTATAACTTCGTATAGC ATACATTATACGAAGTT ATAGCATGATTGAACAAGATGGATTG 3 ' P-reslox: 5 ' CGGCAAGCTTATAATTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
AACAATTTTGCAACCGTCCGAAATA 3 '
Plasmid pCH-RNRZ (lOOng) wurde als Matrize für die PCR mit diesen beiden Oligonukleotiden eingesetzt. Die PCR-Bedingungen entsprechen exakt denen unter 1.2. (Substratvektoren), im ersten Paragraph, genannten. Das PCR Fragment wurde über eine Agaraose Gelelektrophorese isoliert, mit den Restriktionsenzymen Hind Eil und Bgl II restringiert und in den mit Hind III / Bgl II geschnittenen pCH-RNRZ Vektor-Rest (pCH-RNRZ ohne das Neo Gen und die zweite (3') res Sequenz) ligiert. Damit erhält man die Rekombinationskassette resloxneoreslox (RLNRL) zwischen dem SV40 Promoter und dem lacZ Gen. Das Plasmid pCH-RLZ wurde durch in vivo Rekombination wie für pCH-RZ beschrieben generiert.
Expressionsplasmid-DNAs, sowie pCH-RZ wurden aus E. coli Stamm DH5α mittels Affinitätschromatographie (Qiagen, Deutschland) isoliert. Substratplasmid pCH-RNRZ wurde aus E. coli Stamm JC5547 (Willets, N.S., Clark, A.J. (1969) J. Bacteriol., 100, pp. 231) isoliert. Die Sequenzkontrolle aller Expressions- und Substratvektoren, sowie aller PCR-generierten Produkte wurde mittels des fluoreszenzbasierten 373A DNA-Sequenzierungssystems (Applied Biosystems) durchgeführt. PCR-Reaktionen wurden mit dem „Master Mix Q - Kit,, (Quiagen, Deutschland) durchgeführt. Sämtliche DNAs wurden über Agarosegel-Elektrophorese (0,8%- 1,5% w/v) in TBE-Puffer analysiert.
2. Zellkultur und Konstruktion der Reporter-Zellinien
Die transienten Expressions- und Rekombinationsanalysen wurden mit einer Ovar- Hamsterzellinie CHO (Puck, T.T. (1958) J. Exp. Med., 108, pp. 945) und einer menschlichen epithelialen Cervixcarcinom-Zellinie HeLa (Geye, G.O., et al. (1952) Cancer Res., 12, pp. 264) durchgeführt. HeLa-Zellen wurden in α-MEM (Life Technologies, Inc.) kultiviert, welches mit 10% fötalem Kälbersemm angereichert wurde, und Streptomycin (0,lmg/ml), Penizillin (100 units/ml), sowie Natriumpyruvat (ImM) enthält. CHO-Zellen wurden in DMEM mit denselben Zusätzen, ohne Natriumpyruvat, kultiviert.
HeLa-Reporterzellinien, die pCH-RNRZ stabil ins Genom integriert haben, wurden wie folgt konstmiert: ca. 20μg der Plasmid-DNA wurden mit BamHI linearisiert, durch Phenol/Chloroform-Extraktionen gereinigt, mit Ethanol präzipitiert und in ca. 5xl06 Zellen mittels eines Lipofects (30μl Fugene™6, Boehringer Mannheim) transfiziert. Stabile Zellinien wurden mit 500μg/ml G418/Geneticin (Life Technologies) selektioniert und anschließend durch PCR, DNA-Sequenzierung und Southern-Analyse charakterisiert.
3. In-Vivo Rekombinationsanalysen
Um intramolekulare Rekombination in vivo durchzuführen, wurden ca. Ix 10" Zellen in 3, Sem- Platten ausgesäht. Nach 24h erfolgte eine Cotransfektion von zirkulärem Expressionsvektor, zusammen mit zirkulärem superhelikal gewundenem Substratplasmid, im Mengenverhältnis 3: 1, mit dem Lipofect Fugene™6 (Boehringer Mannheim) nach Angaben des Herstellers (2μg DNA; 3μl Fugene). Zum Nachweis der stattgefundenen Rekombination wurde nach 72h entweder eine ß-Gal-Färbung oder ein ß-Gal-Assay durchgeführt, da im rekombinierten Zustand das lacZ-Gen direkt durch den SV40-Promoter transkribiert und somit exprimiert werden kann, was im Ausgangssubstrat aufgrund der zwischenliegenden Rekombinationskassette nicht funktioniert. Die ß-Gal-Färbung erfolgte nach Fixiemng der Zellen mit 0,5% Glutaraldehyd durch Zugabe der Färbungslösung (5mM K4Fe(Cn6)x3H2O, 5mM K3Fe(Cn6), 2mM MgCl2, 4mg ml X-Gal in PBS) und anschließender Inkubation für 7-8h bei 37°C. Die Anzahl der blau gefärbten Zellen wurde mikroskopisch ermittelt. Der ß-Gal Assay wurde mit Hilfe des „Galacto Light Kits,, (Tropix, Perkin Eimer) nach Angaben des Herstellers, mit auf 33% reduzierten Mengen durchgeführt. Relative Lichteinheiten (RLUs) wurden im Luminometer Lumat LB9501 (Berthold, Deutschland) gemessen und auf RLU / μg Protein im Zelllysat normiert.
Um Rekombination von Wildtyp-γδ-Resolvase nach Topoisomerase I-Inhibition zu analysieren, wurden zunächst lxlO5 Zellen in 3,5cm-Platten ausgesäht, und mit 2μg Expressionsvektor (pPGKγδNLS) transfiziert. Um eine ausreichende Expression der Rekombinase zu gewährleisten, wurden die Zellen 72h kultiviert, bevor die Zugabe des Topoisomerase-Lnhibitors Camptothecin (50μg/ml) erfolgte. Nach 3-stündiger Inkubation und einem Mediumwechsel wurde eine Cotransfektion von pCH-RNRZ und Expressionsvektor im Verhältnis 1 : 1 durchgeführt. Weitere 72h später wurde eine ß-Gal-Färbung, wie oben beschrieben, durchgeführt.
Die Rekombinationsanalyse in den stabilen HeLa-Zellinien (H5) wurde direkt auf DNA-Ebene durchgeführt. Hierzu wurden 5x106 Zellen in lOcm-Platten ausgesäht und nach 24h mit 14μg zirkulärem Expressionsvektor und 21μl Fugene™6 transfiziert. Nach 72h wurden die Zellen geemtet, um die genomische DNA über Affinitätschromatographie (QIAamp Blood Kit; Qiagen,
Deutschland), nach Angaben des Herstellers zu isolieren.
Mittels PCR wurden ca.l00-400ng der genomischen DNA amplifiziert, um die durch Resolution vemrsachte Deletion des Neomycin-Resistenzgens und einer kompletten res nachzuweisen.
Hierzu wurden 50 pmol der folgenden Oligonukleotide eingesetzt:
P-SV40prä2: 5' ATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCAT 3'
P-pCH-Seqanti: 5' CAGAAGGCATCAGTCGGCTTGCG 3'
Die Amplifikation erfolgte nach einer ersten Denaturiemng bei 94°C (5min.) mit 34 Zyklen von Denaturiemng (94°C, 1min.), Primerbindung (63°C, 1min.) und DNA-Synthese (72°C, 2min.), gefolgt von einem letzten Syntheseschritt für 4min bei 72°C.
Die amplifizierten PCR-Produkte wurden durch Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, das Rekombinationsprodukt wurde eluiert (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Deutschland) und anschließend sequenziert. Um die Reinheit der Negativ-Kontrollen zu demonstrieren wurden die PCR-Produkte mittels Southern Hybridisierung auf eine Nylonmembran übertragen, und mit dem rekombinierten PCR-Produkt als 32P-dATP und 32P-dCTP (Amersham) radioaktiv markierte Sonde hybridisiert. Eine weitere PCR mit den Primern P-SV eol und P-SVNeo2 diente als Nachweis eines möglicherweise auftretenden Inversionsproduktes.
4. Western Analyse
Zelllysate von transient transfizierten Zellen wurden durch Kochen (15 min.) der Zellen in Probenpuffer (New England Biolabs) hergestellt. Die Proteine wurden in einem 12,5%-igen SDS-Polyacrylamidgel nach Molekulargewicht aufgetrennt und über Nacht auf eine Nitrocellulose-Membran (Immobilon P, Millipore) transferiert. Die Membran wurde mit 1%-iger Blockierlösung (BM Chemiluminescence Western Blotting Kit; Boehringer Mannheim, Deutschland) behandelt und mit polyklonalen Maus-Antikörpern gegen γδ-Resolvase bei einer Verdünnung von 1 :3000 inkubiert (Antikörper von N. Grindley, USA). Mit den Peroxidase- gekoppelten sekundären Antiköφem wurde die Position der Resolvase auf der Membran sichtbar gemacht (BM Chemiluminescence Western Blotting Kit; Boehringer Mannnheim, Deutschland). Als Kontrolle fungierte gereinigte γδ-Resolvase. Zum Größenvergleich wurde der kD-Marker (Broad ränge marker, New England Biolabs) verwendet.
5. Ergebnisse
5.1 Synthese von Wildtyp und mutanter γδ-Resolvase in CHO Zellen
Um zu testen, ob γδ-Resolvase oder eine der Mutanten Rekombination in eukaryotischen Zellen katalysieren kann, war es zunächst notwendig zu demonstrieren, daß die Rekombinase von den Zellen synthetisiert werden kann. Hierfür wurden die eukaryotischen Expressionsvektoren, pPGKγδ und deren Derivate, die das Resolvase Gen bzw. die Gene für die Derivate unter der Kontrolle des PGK-Promoters enthält, eingesetzt. Nach dem Einbringen der Expressionsvektoren in CHO Zellen durch Lipofektion, wurden 72 Stunden später Zelllysate hergestellt und durch eine Western-Analyse untersucht. Der Nachweis der Rekombinase erfolgte mittels polyklonalen Antiköφem der Maus, die gegen Wildtyp γδ-Resolvase gerichtet sind. Als Kontrolle wurde pPGKCre, der die Cre Rekombinase des Phagen Pl expremiert, in die Zellen eingebracht.
Die Ergebnisse zeigen, daß Proteine mit den jeweilig erwarteten Molekulargewichten in den Zellen vorhanden war, die mit den Resolvaseexpressionsvektoren in der Lipofektion behandelt wurden. Dieses Protein war nicht nachweisbar, wenn der Kontrollvektor pPGKCre eingesetzt wurde. 5.2 Resolvase katalysierte intramolekulare Rekombination in CHO und HeLa Zellen
Die Westem- Analyse zeigt, daß, ausgehend von den jeweiligen Expressionsvektoren, das Resolvase Protein bzw. deren jeweilige Derivate in CHO Zellen synthetisiert wird. Um zu testen, welche der verschiedenen Resolvaseproteine die Rekombination zwischen zwei res-Sequenzen in CHO Zellen katalysieren können, wurden die Expressionsvektoren jeweils mit dem Rekombinationssubstrat pCH-RNRZ zusammen transient eingeschleust. Die Rekombination führt zur Deletion des DNA Segments vor dem ß-Galaktosidase Gen, das dann durch den SV40 Promoter expremiert werden kann. Erfolgreiche Rekombinationsereignisse können demnach durch eine Enzymaktivitätsbestimmung nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass in derartigen Ko-Transfektionsexperimenten alle mutanten Resolvase Proteine, sowohl mit als auch ohne die C-terminale NLS, die Rekombination mit hoher Effizienz durchführen können. Die Wildtyp- Resolvase, ob mit oder ohne NLS, ist dagegen inaktiv, d.h. es kann keine Rekombination auf diesem Weg nachgewiesen werden.
In einem weiteren Ansatz wurde getestet, ob die mutante γδ-ResolvaseE102Y' E124Q Rekombination auf linearisierten, episomalen Substraten, die zwei komplette res als direkte Wiederholungen tragen, katalysieren kann. Das Ergebnis zeigt, dass diese Resolvasemutante diese Reaktion mit hoher Effizienz katalysiert, die mit der durch die Rekombinase Cre katalysierten durchaus vergleichbar ist. Zusammengenommen bedeuten diese Ergebnisse, dass Resolvasemutanten in der Lage sind, zirkuläre oder topologisch hnearisierte episomale Substrate, die zwei Kopien der kompletten res Sequenz als direkte Wiederholungen enthalten, mit hoher Effizient rekombinieren können, was letztendlich zur Deletion des zwischen der res Sequenzen befindlichen DNA-Segments führt.
Um zu testen, ob das Rekombinationssubstrat auch als stabiler Bestandteil des eukaryotischen Genoms von der Resolvase bzw. dessen Derivate rekombiniert werden kann, wurde eine menschliche Reporterzellinie (H5) konstmiert. Diese Zellinie enthält eine Kopie des Substratvektors (pCH-RNRZ) durch nicht homologe Rekombination zufällig im Genom integriert. Dies wurde anhand einer Southern Analyse vorab nachgewiesen. Ca. 72 Stunden nach Einbringen der jeweiligen Expressionsvektoren in die Zellinie H5 wurde genomische DNA isoliert und versucht, die Rekombination über PCR mit den Primern P-SV40prä und P- CHSeqanti und anschließender Southern Analyse nachzuweisen. Das PCR Produkt, welches man mit unrekombiniertem Substrat erhält, ist länger als das nach der Deletion des neo Gens durch Rekombination entstandene, und somit sind beide Produkte in einer Agarose Gelelektrophorese voneinander zu trennen. Die Ergebnisse zeigen, dass Rekombination in Anwesenheit der beiden
Resolvasemutanten γδ E124Q und γδ E102Y* E124Q stattgefunden hat und das eine - vermutlich sehr geringe - Aktivität auch mit Wildtyp γδ-Resolvase (ohne NLS) messbar ist.
Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass beide γδ-Resolvase Mutanten sowohl episomale als auch genomische Substrate rekombinieren können. Ein signifikanter Effekt hinsichtlich der Effizienz der Rekombination durch die am C-terminalen Ende angefügte NLS konnte hierbei nicht festgestellt werden. Eine sehr geringe Aktivität der Wildtyp γδ-Resolvase ist nur mit der Zelllinie H5, nicht jedoch in transienten Ko-Transfektionsexperimenten, nachzuweisen. Daraus ergibt sich, dass der topologische Zustand der genomischen bzw. episomalen intrazellulären DNA vorwiegend relaxiert ist, bzw. eine Aktivierung der Wildtyp γδ-Resolvase nicht erlaubt.
5.3 Aktivierung der Wildtyp γδ-Resolvase durch den Topoisomeraseinhibitor Camptothecin
Um zu testen, ob die Wildtyp γδ-Resolvase durch das Einwirken des Topoisomeraseinhibitors Camptothecin (CPT), der indirekt den topologischen Zustand intrazellulärer DNA verändert, aktiviert werden kann, wurde der Expressionsvektor pPGKγδ zunächst alleine in HeLa Zellen durch Lipofektion eingeführt. Ca. 72 Stunden danach wurden die Zellen mit CPT behandelt und nach weiteren 3 Stunden der Expressionsvektor zusammen mit dem Substrat pCH-RNRZ in die derart vorbehandelten Zellen, wiederum durch Lipofektion, eingebracht. Nach weiteren 72 Stunden erfolgte die Anfärbung der Zellen durch Behandlung mit X-Gal. Eine Blaufärbung der Zellen zeigt, dass das Enzym ß-Galaktosidase in den Zellen expremiert wird, was wiedemm auf erfolgreiche Rekombinationsereignisse schliessen läßt. Die Ergebnisse zeigen, dass ohne CPT keine Rekombination durch die Wildtyp γδ-Resolvase in HeLa Zellen stattfindet, wogegen durch das Einwirken des CPTs, in allen Experimenten blaue Zellen nachzuweisen sind. In Kontrollexperimenten wurde weiterhin sichergestellt, dass dieser Effekt nicht auf die CPT Behandlung der Zellen per se zurückzuführen ist (nicht gezeigt). Somit kann infolge des Einwirkens eines Topoisomeraseinhibitors auf den topologischen Zustand intrazellulärer DNA die Rekombination durch die Wildtyp γδ-Resolvase nachweisbar aktiviert werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in einer eukaryotischen Zelle, umfassend a) das Einführen in eine Zelle einer ersten, eine res-Sequenz umfassenden, DNA- Sequenz, b) das Einführen in eine Zelle einer Kopie der ersten DNA-Sequenz, und c) das Durchfuhren der Sequenz-spezifischen Rekombination durch Einwirken einer Resolvase.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kopie der ersten DNA-Sequenz in direkter Orientierung auf dem selben DNA-Molekül eingeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste DNA-Sequenz eine res-Sequenz gemäß SEQ ED NO:l oder deren Derivat oder eine res-Sequenz gemäß SEQ ED NO:2 oder deren
Derivat umfaßt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zusätzlich eine zweite DNA- Sequenz umfassend ein Resolvase-Gen in die Zelle eingeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die zweite DNA-Sequenz femer eine regulatorische DNA-Sequenz umfaßt, die eine räumliche und/oder zeitliche Expression des Resolvase-Gens und Erzeugung der Resolvase bewirkt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Resolvase eine modifizierte Resolvase, vorzugsweise eine solche Resolvase ist, die in der Lage ist, eine Resolvase- Rekombinationsreaktion auf relaxierten Substratmolekülen, vorzugsweise auf relaxierten linearen Substratmolekülen, durchzuführen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Resolvase eine γδ-Resolvase, vorzugsweise eine modifizierte γδ-Resolvase ist und besonders bevorzugt eine solche modifizierte γδ-Resolvase ist, die in der Lage ist, eine Resolvase-Rekombinationsreaktion auf relaxierten Substratmolekülen durchzuführen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die modifizierte γδ-Resolvase in dem Segment von
Aminosäuren 80 - 140, vorzugsweise 90 - 110, bezogen auf die in SEQ ED NO:4 gezeigte Wildtypresolvasenummerierung, wenigstens eine, vorzugsweise wenigstens zwei, der folgenden Mutationen aufweist
(i) ein saurer Aminosäurerest ist durch einen aromatischen, hydrophilen oder basischen
Aminosäurerest ersetzt,
(ii) ein neutraler Aminosäurerest ist durch einen hydrophilen Aminosäurerest ersetzt, und
(iii) ein hydrophiler Aminosäurerest ist durch einen neutralen oder sauren
Aminosäurerest ersetzt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei in dem Segment Glu durch Gin oder Tyr, Asp durch Ser, Ser durch Asp, Gly durch Ser, Asp durch Ala und/oder Glu durch Arg ersetzt ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die modifizierte γδ-Resolvase wenigstens zwei Mutationen in dem Segment aufweist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die modifizierte γδ-Resolvase γδ- ResolvaseEI24Q oder γδ-ResolvaseE102Y' E124Q ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1, wobei die erste und/oder die Kopie der ersten, eine res-Sequenz umfassenden, DNA-Sequenz femer DNA-Sequenzen umfaßt/umfassen, die eine Integration der ersten und/oder der Kopie der ersten DNA-Sequenz in das Genom der eukaryotischen Zellen mittels homologer Rekombination bewirkt/bewirken.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die erste und/oder die Kopie der ersten, eine res-Sequenz umfassenden, DNA-Sequenz femer eine Nukleinsäuresequenz umfaßt/umfassen, die ein Polypeptid von Interesse codiert.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid von Interesse ein Struktuφrotein, ein endogenes oder exogenes Enzym, ein regulatorisches Protein oder ein Markeφrotein ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die eukaryotische Zelle eine Zebrafisch-, Caenorhabditis elegans oder Drosophila melanogaster oder eine Säugerzelle ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Säugerzelle eine menschliche Zelle, eine Affen-, Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Hamster-, Ziege-, Kuh-, Schaf- oder Schweinezelle ist.
17. Verwendung einer res-Sequenz gemäß SEQ ED NO:l oder deren Derivat oder einer res- Sequenz gemäß SEQ ED NO:2 oder deren Derivat in einer Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen.
18. Modifizierte γδ-Resolvase, vorzugsweise in der Art modifiziert, daß sie in dem Segment von Aminosäuren 80 - 140, vorzugsweise 90 - 110, bezogen auf die in SEQ ID NO:4 gezeigte
Wildtypresolvasenummerierung wenigstens eine, vorzugsweise wenigstens zwei, der folgenden Mutationen aufweist
(i) ein saurer Aminosäurerest ist durch einen aromatischen, hydrophilen oder basischen Aminosäurerest ersetzt, (ii) ein neutraler Aminosäurerest ist durch einen hydrophilen Aminosäurerest ersetzt, und
(iii) ein hydrophiler Aminosäurerest ist durch einen neutralen oder sauren Aminosäurerest ersetzt, unter der Voraussetzung, daß bei nur einer Modifikation Glu an Postition 124, bezogen auf die in SEQ ED NO:4 gezeigte Wildtypresolvasenummerierung, nicht durch Gin ersetzt ist.
19. Modifizierte γδ-Resolvase nach Anspruch 18, wobei in dem Segment Glu durch Gin oder Tyr, Asp durch Ser, Ser durch Asp, Gly durch Ser, Asp durch Ala und/oder Glu durch Arg ersetzt ist.
20. Modifizierte γδ-Resolvase nach Anspruch 18 oder 19, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ED NO:6 oder deren Derivat aufweist.
21. Nukleinsäuresequenz, die für eine modifizierte γδ-Resolvase, wie in Anspruch 18 bis 20 definiert, kodiert oder ein Derivat derselben.
22. Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 21, die eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ED NO:5 ist.
23. Verwendung der Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 21 oder 22 und/oder der Resolvase nach einem der Ansprüche 18 bis 20 zur Verwendung in einer Sequenz-spezifischen
Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen.
24. Verfahren zum Testen von Topoisomeraseinhibitoren in einer eukaryotischen Zelle, umfassend a) das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ED NO:l, b) das Einführen in eine Zelle einer Kopie der ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ED NO:l in direkter Orientierung, c) das Einfuhren einer Wildtyp-Resolvase, und d) Zugabe der zu testenden Topoisomeraseinhibitoren.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei zusätzlich eine zweite DNA-Sequenz umfassend ein Wiltyp-Resolvase-Gen in die Zelle eingeführt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die zweite DNA-Sequenz femer eine regulatorische DNA-Sequenz umfaßt, die eine räumliche und/oder zeitliche Expression des Resolvase-Gens bewirkt.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die erste und/oder die Kopie der ersten DNA-Sequenz ferner DNA-Sequenzen umfaßt/umfassen, die eine Integration der ersten und/oder der Kopie der ersten DNA-Sequenz in das Genom der eukaryotischen Zellen mittels Rekombination bewirkt/bewirken.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei die erste und/oder die Kopie der ersten DNA-Sequenz femer eine Nukleinsäuresequenz umfaßt/umfassen, die ein Polypeptid von Interesse codiert.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Polypeptid von Interesse ein Struktuφrotein, ein endogenes oder exogenes Enzym, ein regulatorisches Protein oder ein Markeφrotein ist.
30. Eukaryotische Zelle, umfassend zwei DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO:2 und gegebenenfalls ein Resolvase-Gen.
31. Eukaryotische Zelle nach Anspruch 30, wobei das Resolvase-Gen eine Wildtyp- Resolvase, eine γδ-Resolvase, eine γδ-ResolvaseE1 4Q oder γδ-ResolvaseE102Y' E124Q codiert.
32. Kit zum Testen von Topoisomeraseinhibitoren in einer eukaryotischen Zelle, enthaltend eine eukaryotische Zelle nach Anspruch 30 oder 31.
33. Transgener Organismus, umfassend res-Sequenzen gemäß SEQ ID NO:l oder SEQ ED NO:2 und/oder ein Resolvase-Gen gemäß SEQ ED NO:3, SEQ ED NO:5 oder SEQ ED NO:7 oder deren Derivate.
34. Eukaryotische Zelle, erhältlich dadurch, dass die in Ansprüche 1, 12, 15 bis 17, 23 bis 25, 27, 30 und 31 genannte eukaryotische Zelle dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bislό oder 24 bis 29 unterworfen wird.
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