WO2001029187A1 - Procede de production de transglutaminase derivee d'un micro-organisme - Google Patents

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WO2001029187A1
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transglutaminase
streptomyces
gene
bacterium
pro
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PCT/JP2000/007135
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Inventor
Seiichi Taguchi
Haruo Momose
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII

Definitions

  • the present invention uses a host-vector system of Streptomyces lividans (hereinafter sometimes abbreviated as S. lividans) to transfect actinomycetes derived from actinomycetes by a gene recombination method.
  • S. lividans Streptomyces lividans
  • the present invention relates to a method for secretory production.
  • the transglutaminase secreted and produced by the present invention is widely used in food processing, medicine and the like.
  • the transglutaminase secreted and produced according to the present invention is an enzyme that catalyzes the transacylation of the carboxyamide group in the peptide chain of the protein.
  • This enzyme is allowed to act on a protein, a Glu-Lys cross-linking reaction and a substitution reaction of Gin with Glu by deamidation of Gin may occur.
  • This transglutaminase is used for the production of gelled foods such as jelly, yogurt, cheese, or gel cosmetics, and for improving meat quality (Japanese Patent Publication 50382). It is also a highly industrial enzyme that is used for the production of heat-stable microcapsule materials and carriers for immobilized enzymes.
  • transglutaminase has been known to be of animal origin and of microbial origin (microglobulin transglutaminase: hereinafter referred to as “MTG”).
  • the former is a calcium ion-dependent enzyme that is distributed in animal organs, skin, blood, and so on.
  • guinea pig liver transglutaminase K. Ikura et al. Biochemistry 27 2898 (1988)
  • human epidermal keratinocyte transglutaminase M, A. Phillips et al. Proc. Natl. Acad. USA 87 9333 (1990)
  • human blood coagulation factor XI II A. Ichinose et al. Biochemistry 256900 (1990)
  • Streptoverticillium.Glyceocarneum Streptovertici Ilium griseocarneum
  • Streptoverticillium-cinnamonium StreptoverLic 111ium cinnamoneum sub sp.cinnamoneum
  • Streptoverticillium mobaraense hereinafter sometimes abbreviated as S.mobaraense
  • Microbial transglutaminase has been problematic in terms of supply amount, efficiency, etc. because it is produced from a culture of the above fungi and the like through purification operations. Attempts have also been made to produce transglutaminase by genetic engineering techniques. Regarding the transglutaminase protein and its gene, see, for example, JP-A-64-27471, Biosci. Biotech. Biochem., 58, 82-87 (1994), Biosci. Biotech. Biochem., 58, 88-92 ( 1994), JP-A-5-199883, Biochimie, 80, 313-319 (1998), Eur.J.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a large amount of transglutaminase by secreting and producing a large amount of transglutaminase from a bacterium of the genus Streptomyces.
  • the method of the present invention uses an actinomycete Streptomyces host-vector system to prepare a transglutinase minase gene derived from an actinomycete, namely, a signal peptide region, a pro-structural region, a mature structural region, and the transglutinogenic region.
  • an actinomycete Streptomyces host-vector system to prepare a transglutinase minase gene derived from an actinomycete, namely, a signal peptide region, a pro-structural region, a mature structural region, and the transglutinogenic region.
  • a phenotypic plasmid capable of high expression in Streptomyces bacteria is constructed, and this plasmid is transformed into a streptotype.
  • transglucinase transglucinase
  • protransglucinase transglucinase
  • the mature (active) transglutamin is obtained by cutting and removing the body with proteases derived from Streptomyces bacteria. And obtaining the Ichize a large amount production method of trans Guru evening Minaze.
  • FIG. 1 shows the procedure for constructing the plasmid pUJ-MTG for expression. ⁇ good form for carrying out the invention
  • a Streptomyces bacterium is used as a host vector, and a transglutaminase (pro) containing a pro-structural portion downstream of the native promoter of the transglucinase gene is used.
  • Transglucinase A gene-linked expression construct is produced, which is introduced into Streptomyces bacterium, expressed, and the extracellularly secreted protransglucinase is further added to the Streptomyces minase.
  • a large amount of mature (active) transglutaminase is obtained by cleavage by proteases or the like produced by the genus itself.
  • a secreted protein is generally translated as a peptide or a pre-peptide, and then undergoes post-translational modification to become a mature protein. That is, generally, after being translated as a pre-peptide or pre-pro-peptide, the signal peptide ("pre-part") is cleaved and converted to the mature peptide or pro-peptide, which is further cleaved by the protease. It is known to be matured.
  • Transglutaminase is one such protein. In the present specification, a transglutaminase having both a signal peptide and a pro moiety, that is, a primary translation product may be referred to as “preprotransglutaminase”.
  • protransglutaminase Is sometimes referred to as “protransglutaminase”.
  • the pro-part of protransglutaminase is sometimes referred to as the “pro-structure” or simply “pro-structure”, and in this specification the “pro-structure / pro-structure” of transglutaminase and the “pro-part” of the protein Is used interchangeably with Therefore, "protransglutaminase” is also referred to as "transgluminase with a pro-structure added.”
  • the protein obtained by “cleaving and removing” the pro moiety is a peptide bond
  • “mature transglutinase” and “active transglutinase” are used interchangeably.
  • the gene construct used in the present invention is generally required to express a promoter, a nucleic acid fragment encoding prebrotransglutaminase, and a target protein gene in Streptomyces bacteria. It has an appropriate sequence including an appropriate control sequence at an appropriate position.
  • the vector that can be used for this construct is not particularly limited, as long as it can function in a bacterium belonging to the genus Streptomyces. It may be incorporated. Preferred is a plasmid derived from a Streptomyces bacterium. Examples of such a plasmid include pIJ702 (J. Gen. Microbiol., 129, 2703-2714, (1983)), and a plasmid obtained by improving these. Is mentioned.
  • the promoter that can be used to express the transglutaminase gene in Streptomyces bacteria is the original promoter of the actinomycete transglutaminase gene.
  • the consensus sequence of the promoter is not clear, as in E. coli, and the promoter region may not always be specified.
  • a gene fragment containing the 5 'upstream region which is long enough to contain the structural gene for transglutaminase and a promoter region controlling its expression, may be used.
  • the transglutaminase gene that can be used in the present invention is not particularly limited. However, streptobirch simina cinnamonium IF0 12852, streptobacillum glyceocarnimu IF0 12776, S. mobaraence IF0 13819, Streptomyces lydicus (W096--06931)
  • the secreted transglutaminase gene derived from actinomycetes is preferred.
  • Transglucinase genes from S. cinnamoneum or S. mobaraens e are particularly preferred, and are used with the native (natural) promoter of those transglucinase genes.
  • SEQ ID No. 1 in the Sequence Listing shows all the nucleotides including a part of the 5 ′ upstream region of the S. c innamoneum IF012852-derived transglutaminase gene determined by the present inventors
  • SEQ ID No. 2 shows the nucleotides.
  • the amino acid sequence encoded by the sequence is shown.
  • the amino acid sequence from 1 to 32 is the pre-sequence, 33 to 86 is the pro-sequence, and 87 to 416 is the mature transglutaminase sequence. It is estimated that
  • SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing shows the entire nucleotide sequence including a part of the 5 ′ upstream region of the transglutinase minase gene derived from S.mobaraense IF013819
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence encoded by the sequence. Show.
  • the amino acid sequence from the first to the 31st is the sequence of the prepart
  • the 32nd to the 76th is the sequence of the pro part
  • the 77th to the 407th are the sequence of the mature transglutaminase. is there.
  • the method for introducing the gene construct used in the present invention into a bacterium of the genus Streptomyces is not particularly limited, and a commonly used protoplast method (Gene, 39, 281-286 (1985); JP-A-3-251182), A method such as the elect-mouth poration method (Bio / Technology, 7, 1067-1070 (1989)) may be used.
  • the obtained transformant may be cultured according to commonly used methods and conditions.
  • a medium for culturing the above microorganism may be a normal medium containing a normal carbon source, a nitrogen source, and inorganic ions. It is desirable to add organic trace nutrients such as vitamins and amino acids and natural materials such as polypeptone and yeast extract in order to obtain higher proliferation.
  • a carbon source Is a hydrate of glucose / sucrose ⁇ , organic acid, alcohol
  • the culture was carried out under aerobic conditions for about 1 day to 2 weeks while controlling the temperature in an appropriate range of 115.0 to 8.5 and a temperature of 15 to 37 ° C.
  • Ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt, and others are used as the nitrogen source.
  • the inorganic ion a magnesium ion, a phosphate ion, a lithium ion, an iron ion and others are appropriately used as needed.
  • transglutaminase secreted and produced according to the present invention can be separated and purified from the culture medium according to the respective characteristics and according to a method well known to those skilled in the art. For example, after centrifugal removal of cells, etc., precipitation with ammonium sulfate and ethanol, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography, isoelectric focusing, gel filtration, etc. Separation and purification may be performed by an appropriate known method or a combination thereof.
  • Chromosome D of S. cinnamoneuin IFO 12852 prepared by synthesizing the primers shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and prepared by the method of Saito and Miura (Biochem. Biophys. Act., 72, 619 (1963)).
  • the region encoding the transglutaminase sequence consisting of NA was amplified by PCR. Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) was used for the PCR reaction, and the reaction conditions were in accordance with the protocol.
  • SEQ ID NO: 5 PCR primer for amplifying transglutaminase gene derived from S. cinnaiDoneum
  • SEQ ID NO: 6 PCR primer for amplifying transglutinase gene from S. cinnamoneum
  • the DNA fragment of about 960bp which was then amplified using a Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2 ( Takara Shuzo) and [a- 32 P] dCTP, was reacted according to the attached protocol, to produce a DNA pro portion .
  • a Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2 Takara Shuzo
  • [a- 32 P] dCTP was reacted according to the attached protocol, to produce a DNA pro portion .
  • Southern blot hybridization was carried out according to a general method as described above, it was confirmed that the transglutaminase gene was present in an approximately 3.5 kb fragment cut out with the restriction enzyme BamHI.
  • a chromosomal DNA of S. cinnamonei IF0 852 was digested with BajnHI and a 3.5 kb fragment was recovered by agarose gel electrophoresis using EASYTRAP Ver.2 (Takara Shuzo) and inserted into the BamHI site of pUC18.
  • Escherichia coli JM109 manufactured by Takara Shuzo
  • a library was prepared.
  • the transgenic protein of S. cinnamoneum IFO 12852 was found to be transgenic in S. cinnamoneum CBS683.68. It was confirmed that it had almost the same nucleotide sequence as the gene.
  • the transglutaminase gene is inserted so that it is transcribed from EcoRI in the multicloning site of pUC18 to Hindlll.
  • the nucleotide sequence was determined using Daiichi Minine One Night Cycle Sequencing Kit (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA Sequencer 373A (manufactured by PE Applied Biosystems).
  • the determined nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence are shown in SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively. It is presumed that the amino acid sequence from the 1st to the 32nd is the pre-sequence, the 33rd to the 86th is the pro-sequence, and the 87th to the 416th is the sequence of mature transglutinase. .
  • Streptomyces lividans 66 transformed with pi J702 for Streptomyces lividans 3131 was used in the following medium. The cells were cultured under the conditions at 30 ° C for 2 days.
  • the plasmid DNA layer was separated and extracted under ultraviolet irradiation, and the extraction operation with toluene saturated with TE was repeated three times to remove ethidium bromide. Furthermore, after 1 dialysis with TE at 4 ° C, extraction operation was performed once with TE-saturated phenol and twice with chloroform-form-isoamyl alcohol, and the aqueous layer was collected.
  • PIJ702 (approximately 5.8 kb) of actinomycete multicopy plasmid was digested with Sacl and Pstl to prepare a large fragment of 5. lkb from which the mel (tyrosinase gene) promoter region was removed.
  • pOS ⁇ ⁇ - ⁇ (approximately 7.9 kb) (approximately 7.9 kb) incorporating a fusion of protease inhibitor Yuichi SSI (Streptomyces subtilin inhibitor) and antimicrobial peptide (avidesin) gene (Appl. Environ.
  • pUJS was digested with Hindlll and EcoRI to recover a large fragment of 8.6 kb.
  • PB3.5 (approximately 6.2 kb) carrying the transglucinase gene of S. cinnajnoneum IF012852 cloned in (1) was digested with Hindi II and EcoRI, and a 3.5 kb Hindi II-EcoRI fragment was recovered.
  • This 3.5 kb HindIII_EcoRI fragment was inserted into the Hindlll of pUJS and the EcoRI site to construct pUJ-MTG (about 12. lkb).
  • Figure 1 shows the above construction procedure.
  • E. coli AJ13669 a transformant obtained by transforming pUJ-MTG, is ! 1 ⁇ 2 surgery Institute of Bioscience and Biotechnology E surgery Research Station (1 single M X305-8566 Ibaraki Tsukuba ⁇ 3 ⁇ 4 1 Ding [
  • Example 3 Transfection of S. l ividans TK24
  • S. lividans TK24 is a strain derived from S. lividans 66 and has been imparted with streptomycin resistance (GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES, A LABORATORY MANU AL: DAHopwood et al., P266, 1985, The john Innes Foundation Norwich) 0 This strain was provided by D Hopwood (John Innes Institute, Colney Lane, Norwich NR 47UH, UK) and is available from the DA Hopwood laboratory.
  • S. lividans TK24 [JP-A-3-251182, Hunter, IS “DNA Cloning” A Practica 1 Approarch 2, Glover, DM (Ed.) IRL Press (1985), GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES, A LABORATORY MANUAL: DAHopwood et al., pi 04, 1985, The john Innes Foundation Norwich].
  • S. lividans TK24 was cultured in YEME medium + 0.5 glycine at 30 ° C for 2 days. 200 ml of the culture solution was centrifuged (1,300 g, room temperature, 10 minutes), and the obtained cells were suspended in 72 ml of 0.35 M saccharose.
  • TES N-Tris (hydroxymethy 1) methy 1-2-aminoethane sulphonic acid] 5.73 g Saccharose 103 g Magnesium chloride 2.03 g Potassium sulfate 0.5 g Calcium chloride 3.68 g Trace element solution 2 ml / L (pH 7.4) 1% Prepare a potassium phosphate solution separately, and use lm / 100 ml P buffer immediately before use.
  • transduction of the transglutaminase gene expression plasmid pUJ-MTG (about 12.1 kb) into the protoplast suspension of S. lividans TK24 was performed as follows.
  • the transformant pUJ-MTG / S. Lividans TK24 was cultured in 4 ml of soy broth (manufactured by DIFC0) liquid medium containing 10 zg / ml of cheostrepton at 30 ° C for 3 days. 1 ml was seeded in 100 ml of the above liquid medium (500 ml Sakaro flask) and cultured at 30 ° C for 2 weeks. The culture solution was sampled with time, the culture supernatant 101 was subjected to SDS-PAGE, and then, using the anti-transglutamine kinase antibody described in JP-A-6-046855, Molecular Clonin Western plots were performed under general conditions as described in the second edition (J.
  • transglutaminase transglutaminase
  • secretory production approximately 40-50 mg / l
  • transglutaminase protransglutaminase
  • the amount of transglutaminase having the same molecular weight as the mature transglucinase that the processed transglucinase was processed increases, and the maturation of about 40-50 mg / l Type transglutaminase accumulated.
  • the transglutaminase with the pro-structure was added.
  • SDS-PAGE was performed using the culture supernatant during the period of high secretion production of the protransglutaminase, followed by semi-dry blotting on a PVDF membrane. Protein Structural Analysis for Ioning ”, Tokyo Chemical Dojin (1993)). After blotting, the PVDF membrane was stained with Coomassie Brilliant Blue, destained, and air-dried.
  • N-terminal amino acid with protein sequencer (Model 476A, manufactured by PerkinElmer) The analysis of the no acid sequence was performed.
  • transglutaminase can be produced by a Streptomyces bacterium, and a large amount of transglutaminase can be obtained in a culture solution.
  • the transglutaminase that accumulates in the culture solution according to the method of the present invention is a mature transglutaminase that is cleaved by a prosthesis produced by the Streptomyces bacterium itself, so that it can be easily and extensively converted from the medium. Mature transglutaminase can be recovered.

Description

明細 ^
微生物由来トランスグル夕ミナーゼの製造法 発明の背景
本発明はストレブトマイセス · リビダンス（Streptomyces lividans ) (以下、 S. lividansと略すことがある）の宿主 -ベクター系を用いて、遗伝子組換え法により 放線菌由来のトランスグル夕ミナーゼを分泌生産させる方法に関するものである。 本発明によって分泌生産されるトランスグル夕ミナーゼは食品加工や医薬等に幅 広く利用されている。
本発明によって分泌生産されるトランスグル夕ミナーゼはタンパク質のべプチ ド鎖内にあるァ—カルボキシアミ ド基のァシル転移反応を触媒する酵素である。 本酵素をタンパク質に作用させると、 巳一 (ァ一 Glu)—Lys 架橋形成反応、 Gin の脱アミ ド化による Glu への置換反応が起こりうる。 このトランスグル夕ミナ一 ゼは、 ゼリー等のゲル化食品、 ヨーグルト、 チーズ、 あるいはゲル状化粧品など の製造や食肉の肉質改善等に利用されている （特公平卜 50382)。 また、 熱に安定 なマイクロカプセルの素材、 固定化酵素の担体などの製造に利用されているなど、 産業上利用性の高い酵素である。
トランスグル夕ミナーゼはこれまでに動物由来のものと微生物由来のもの （マ イクロービアルトランスグル夕ミナーゼ：以下 「M T G」 という） が知られてい る。 前者は、 カルシウムイオン依存性の酵素で、 動物の臓器、 皮膚、 血液などに 分布している。 例えば、 モルモット肝臓トランスグル夕ミナ一ゼ （K. Ikura et al . Biochemistry 27 2898( 1988) ) 、 ヒト表皮ケラチン細胞トランスグルタミ ナ一ゼ (M, A. Phi llips et al . Proc. Natl . Acad. Sci . USA 87 9333( 1990)) 、 ヒト血液凝固因子 XI I I (A. Ichinose et al . Biochemistry 25 6900( 1990) ) な どがある。 後者については、 ストレブトバ一チシリウム) の jgから、 カルシウム非依存性 のものが発見されている。 例えば、 ストレプトバーチシリゥム .グリセォカルネ ゥム (Streptovertici Ilium griseocarneum ) IFO 12776 、 ス卜レプ卜ノ ーチシ リウム -シナモニゥム ( StreptoverL ic 111 ium cinnamoneum sub sp. cinnamoneu m ) (以下、 S. cinnamoneumと略すことがある） IFO 12852 、 ストレブトバーチシ リウム -モノ ラエンス (Streptoverticillium mobaraense) (以下、 S.mobaraen seと略すことがある） IF0 13819等があげられている （特開昭 64- 27471) 。 これ らの微生物が生産するトランスグル夕ミナーゼの一次構造はぺプチドマッピング 及び遺伝子構造解析の結果、 動物由来のものとは相同性を全く持たないことが判 明している （ヨーロッパ特許公開公報 0481 504 A1) 。
微生物由来トランスグル夕ミナーゼ （MTG) は、 上記菌類等の培養物から精 製操作をへて製造されているため、 供給量、 効率等の点で問題があった。 また、 遺伝子工学的手法によるトランスグル夕ミナーゼの製造も試みられている。 トラ ンスグル夕ミナーゼタンパク質およびその遺伝子については例えば、 特開昭 64-2 7471、 Biosci. Biotech. Biochem., 58， 82-87(1994)、 Biosci. Biotech. Bioch em., 58,88- 92(1994)、 特開平 5- 199883、 Biochimie, 80， 313-319(1998)、 Eur. J. Biochem., 257, 570-576 (1998), WO 9606931、 W09622366などに報告されてお り、 これらには例えば S.lividans、 ァスペルギルス ·オリザェ（Aspergillus ory zae)、 大腸菌（Eshcherichia coli) (以下、 E.coliと略することがある）等の宿主 —ベクタ一系での発現生産に関する報告がなされている。 また、 E.coli、 酵母等 の微生物における分泌発現 （特開平 5-199883) による方法と E.coliで MTGを不 活性融合タンパク質封入体として発現させた後、 この封入体をタンパク質変性剤 で可溶化し、 脱変性剤処理を経て再生させることにより活性をもつ MTGを生産 する方法 （特開平 6- 30771)が報告されている。 しかしながら、 従来の方法による 微生物による分泌発現においては、 その発現量が非常に少ないという問題点が指 摘される。 ストレブ卜マイセスにおける卜ランスグル夕ミナーゼの分泌生産に関 しては、 具体的な分泌蓄¾£の記戯がある例として、 ストレブトマイセス . リビ ダンスを宿主とする追伝子組換え法でストレプトバーチシリウム ·モバラエンス 由来のトランスグル夕ミナ一ゼ造伝子を導入した報告があるが、 その分泌量は 0. lmg/1程度でしかない（Biosci . Biotech. Biochem.， 58, 82 - 87( 1994) ; 特開平 5-19 9883 )。 発明の開示
本発明は、 ス卜レブトマイセス属細菌にトランスグル夕ミナーゼを多量に分泌 生産させることによって、 トランスグル夕ミナーゼを多量に製造する方法を提供 することを目的とする。
本発明の方法は、放線菌ス卜レプトマイセスの宿主 -ベクター系を用いて、放線 菌由来のトランスグル夕ミナーゼ遺伝子、 すなわちシグナルべプチド領域とプロ 構造領域および成熟体構造領域、 並びに当該トランスグル夕ミナ一ゼ遺伝子の発 現を制御するその本来の （天然の） プロモーター領域を用いて、 ストレプトマイ セス属細菌内で高発現可能な発現型プラスミ ドを構築し、 この発現型プラスミ ド をストレブトマイセス属細菌に導入し、 培養することにより、 培養初期から中期 にはプロ構造部の付加したトランスグル夕ミナ一ゼ （プロトランスグル夕ミナ一 ゼ） を分泌させ、 培養後期にはプロ構造体をストレブトマイセス属細菌に由来す るプロテアーゼ等で切断除去することにより成熟型 （活性型） のトランスグル夕 ミナ一ゼを取得することを特徴とする、 トランスグル夕ミナーゼの多量製造方法 である。 図面の簡単な説明
図 1は、 発現用プラスミ ド pUJ- MTGの構築手順を示す。 発明を実施するための ίδ良の形態
本発明の方法により、 ストレプトマイセス厲細菌が宿主一べクタ一系として用 いられ、 トランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子の本来のプロモーターの下流にプロ構造 部を含むトランスグル夕ミナーゼ （プロトランスグル夕ミナーゼ） 遗伝子を結合 した発現構築物が作製され、 これがストレブトマイセス厲細菌中に導入され、 発 現され、 菌体外に分泌されたプロトランスグル夕ミナーゼが更にそのストレブト マイセス属自身が生産するプロテアーゼ等によって切断除去されることにより、 成熟型 （活性型） のトランスグル夕ミナーゼが多量に得られる。
分泌型タンパク質は一般にはプレぺプチドまたはプレブロぺプチドとして翻 訳され、 その後、 翻訳後修飾を受けて成熟型タンパク質になることが知られてい る。 すなわち、 一般に、 プレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳された 後、 シグナルペプチド （ 「プレ部分」 ） が切断されて成熟ペプチドまたはプロべ プチドに変換され、 プロべプチドはプロテア一ゼによってさらにプロ部分が切断 されて成熟型べプチドになることが知られている。 卜ランスグル夕ミナ一ゼはそ のようなタンパク質の一つである。 本明細書において、 シグナルペプチドおよび プロ部分の両方を有するトランスグル夕ミナーゼ、すなわち、一次翻訳産物を「プ レプロトランスグル夕ミナ一ゼ」 と称することがあり、 またシグナルペプチドを 有しないがプロ部分を有するトランスグル夕ミナーゼを 「プロトランスグル夕ミ ナ一ゼ」 と称することがある。 プロトランスグルタミナーゼのプロ部分は 「プロ 構造部」 または単に 「プロ構造」 と称することもあり、 本明細書においてトラン スグル夕ミナ一ゼの 「プロ構造部/プロ構造」 とタンパク質の 「プロ部分」 とは 互換的に使用される。 従って、 「プロトランスグル夕ミナーゼ」 は 「プロ構造部 を付加したトランスグル夕ミナーゼ」 とも称される。
本明細書においてプロ部分を 「切断除去」 したタンパク質とは、 ペプチド結合 を切断することによってプロ部分を構成する少なくとも 1以上のアミノ酸を除去 したタンパク^をいい、 その N末端領域が天然の成¾型夕ンパク^のものと完全 に一致するタンパク質、 および、 そのタンパク質の活性を有する限り、 天然の夕 ンパク質に比較して N末端にプロ部分に由来する 1以上の余分のアミノ酸を有す るものおよび天然の成熟型タンパク質よりもアミノ酸配列が短い夕ンパク質も含 まれる。 また、 本明細書において 「成熟型トランスグル夕ミナ一ゼ」 と 「活性型 トランスグル夕ミナーゼ」 は同じ意味で使用される。
本発明に使用される遺伝子構築物は、 一般にプロモー夕一、 プレブロトランス グル夕ミナ一ゼをコ一ドする核酸断片、 およびストレブトマイセス属細菌中で目 的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列を含む適切な配列を適切 な位置に有するものである。 この構築物のために使用できるベクターは特に制限 されず、 ストレブトマイセス属細菌中で機能し得るものであればよく、 プラスミ ドのように染色体外で自律増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるも のであってもよい。 ストレプトマイセス属細菌由来のプラスミ ドが好ましく、 そ のようなプラスミ ドとしては、 例えば pIJ702(J. Gen.Microbiol .， 129,2703-2714, ( 1983) )、 及びこれらを改良したプラスミ ド等が挙げられる。
本発明の方法において、 ス卜レプトマイセス属細菌でトランスグル夕ミナーゼ 遺伝子を発現させるために利用できるプロモー夕一は放線菌のトランスグルタミ ナーゼ遺伝子の本来のプロモーターである。
ただし、 放線菌においては、 E. col iにおけるようにプロモーターのコンセンサ ス配列は明確になっておらず、 プロモー夕一領域が必ずしも特定できない場合が ある。 このような場合、 トランスグル夕ミナーゼの構造遺伝子及びその発現を制 御するプロモーター領域を含むのに十分な長さの 5'上流域を包含する遺伝子断片 を利用すればよい。
本発明において利用できるトランスグル夕ミナーゼ遺伝子は特に限定されない が、 ス トレブトバーチシリゥム ·シナモニゥム IF0 12852、 ス 卜レプトバ一チシリ ゥム ·グリセォカルニゥム IF0 12776、 S. mobaraence IF0 13819, ストレプトマ イセス ' リディカス（Streptomyces lydicus ) (W096- 06931 )等の放線菌由来の分泌 型卜ランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子が好ましい。 S. c innamoneumまたは S. mobaraens e由来のトランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子が特に好ましく、それらのトランスグル夕 ミナ一ゼ遗伝子の本来の （天然の） プロモーターと共に使用される。
配列表配列番号 1に本発明者らが決定した S. c innamoneum IF012852由来のトラ ンスグル夕ミナーゼ遺伝子の 5'上流域を一部含む全塩基 i£列を、 および、 配列番 号 2に該塩基配列にコードされるァミノ酸配列を示す。 ァミノ酸配列の 1番目か ら 3 2番目までがプレ部分の配列、 3 3番目から 8 6番目までがプロ部分の配列、 8 7番目から 4 1 6番目までが成熟型トランスグル夕ミナーゼの配列であると推 定される。
また、配列表配列番号 3に S.mobaraense IF013819由来のトランスグル夕ミナー ゼ遺伝子の 5'上流域の一部を含む全塩基配列を、 および、 配列番号 4に該配列に コードされるアミノ酸配列を示す。 アミノ酸配列の 1番目から 3 1番目までがプ レ部分の配列、 3 2番目から 7 6番目までがプロ部分の配列、 7 7番目から 4 0 7番目までが成熟型トランスグル夕ミナーゼの配列である。
本発明に使用される遺伝子構築物のストレプトマイセス属細菌への導入方法は 特に限定されず、 通常よく用いられるプロトプラスト法（Gene， 39， 281-286( 198 5 )；特開平 3- 251182 )、 エレクト口ポーレーシヨン法 (Bio/Technology, 7， 1067- 1070( 1989 ) )等の方法を用いれば良い。また得られた形質転換体は通常よく用いら れている方法や条件に従って培養すればよい。 例えば、 上記微生物を培養するた めの培地としては通常の炭素源、 窒素源、 無機イオンを含有する通常の培地でよ い。 さらに高い増殖性を得るためにはビタミン、 アミノ酸等の有機微量栄養素や ポリペプトン、 酵母エキス等の天然素材を添加する事が望ましい。 炭素源として は、 【1/¾性デンプン、 グルコースゃシュクロース^の 水化物、 有機酸、 アルコ
—ル^、 その他が適 S使用される。 培觀ま好気条件下に 115.0から8.5、 温度 を 1 5 °Cから 3 7 °Cの適当な範囲に制御しつつ、 1日ないし 2週間程度培養を行 ラ。
蓥素源としては、 アンモニアガス、 アンモニア水、 アンモニゥム塩、 その他が 用いられる。 無機イオンとしては、 マグネシウムイオン、 燐酸イオン、 力リウ ムイオン、 鉄イオン、 その他が必要に応じ適宜使用される。 そのような条件下で 形質転換体を培養することにより、 プレブ口トランスグル夕ミナ一ゼが菌体内で 多量に生産され、 プロトランスグル夕ミナーゼとして菌体外に分泌され、 その後、 ストレプトマイセス属細菌自身がこの培養条件下で分泌生産するプロテアーゼに よって培地中で切断され、 成熟型 （活性型） トランスグル夕ミナーゼが多量に培 養液中に蓄積する。
本発明により分泌生産されたトランスグル夕ミナーゼはそれぞれの特性に応じ、 当業者によく知られた方法に従って、 培養後の培地から分離精製することができ る。 例えば、 菌体の遠心除去等を行った後、 硫酸アンモニゥムゃエタノール沈殿 をはじめ、 イオン交換カラムクロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラ フィ一、 高速液体クロマトグラフィ一、 等電点電気泳動、 ゲル濾過等の適切な既 知の方法により、 またはこれらを組み合わせることにより分離、 精製すれば良い。 実施例
実施例 1 . S. cinnamoneum IF0 12852のトランスグル夕ミナ一ゼ遺伝子の取得
S. cinnamoneum CBS683.68のトランスグル夕ミナーゼ遺伝子の配列は既に決定 されている（Biochimie. , 80, 313- 319( 1998) )。この配列を参考にして、配列番号
5と配列番号 6に示したプライマ一を合成し、 斉藤、 三浦の方法（Biochem. Biop hys. Act. , 72, 619( 1963) )により調製した S. cinnamoneuin IFO 12852の染色体 D N Aから成; ¾トランスグルタミナ一ゼ配列をコードする 域を P C R法にて増幅 した。 P C R反応には Pyrobest DNA polymerase (宝酒造社製）を用い、反応条件は これのプロトコールに従った。
(配列番号 5 ) 5 -TCCGATGACCGGGAAACTCCTCCCGCCGAG-3'
(配列 ¾号 6 ) 5 -CGGCCAGCCTTGCTCCACCTTGGCGGGGGC-3'
[配列表フリーテキス卜]
配列番号 5 ： S. cinnaiDoneum由来のトランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子増幅用 PCRブラ ィマー
配列番号 6 ： S. cinnamoneum由来のトランスグル夕ミナーゼ遺伝子増幅用 PCRプラ ィマ一
次に増幅した約 960bpの D N A断片を、 Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2(宝酒造社製）と [ a-32P]dCTPを用いて、添付のプロトコールに従って反応させ、 D N Aプロ一ブを作製した。作製したプローブと S. cinnamoneum IF0 12852の染色 体 D N Aを用いて、 Molecular Cloning第 2版（J. Sajnbrook, E. F. Fritsch an d T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9.31 ( 1989) )に記載さ れているような一般的方法に従って、 サザンブロットハイプリダイゼーシヨンを 行ったところ、 制限酵素 BamHIで切り出される約 3.5 k bの断片にトランスグル夕 ミナーゼ遺伝子が存在していることが確認できた。 そこで S. cinnamonei IF0 12 852の染色体 DNAを BajnHIで消化した約 3.5 k bの断片を EASYTRAP Ver.2 (宝酒造社 製） を用いてァガローズゲル電気泳動により回収し、 これを pUC18の BamHI部位に 挿入した後、 Escherichia col i JM109 (宝酒造社製） のコンビテントセルに導入 し、 ライブラリーを作製した。 先に作製したトランスグル夕ミナーゼの D N Aプ ローブを用いて、 Molecular Clonin 第 2版 （J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pi .90( 1989)) に記載さ れるような一般的手順に従つたコロ二一ハイプリダイゼ一シヨンにより、 ライブ ラリーのスクリーニングを行い、 トランスグル夕ミナ一ゼ造伝子断片がクローン 化されたプラスミ ドを保持する^株を取得し、 これよりプラスミ ドを回収し、 pB 3.5と名付けた。
pB3.5にクローン化されている断片の塩基配列を決定したところ、 S . cinnamone um IFO 12852の卜ランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子は、 S. cinnamoneum CBS683.68の卜 ランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子とほぼ同じ塩基配列を有することが確認された。 ま たトランスグル夕ミナーゼ遺伝子は pUC18のマルチクロ—ニングサイ 卜の EcoRIか ら Hindlllの方向に転写されるように挿入されている。塩基配列の決定はダイ夕一 ミネ一夕一サイクルシークェンシングキット （PEアプライ ドバイオシステムズ 社製）と DN Aシ一クェンサー 373 A (PEアプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて行った。
決定された塩基配列と該塩基配列にコードされるアミノ酸配列をそれそれ配列 表配列番号 1および 2に示す。 アミノ酸配列の 1番目から 32番目までがプレ部 分の配列、 33番目から 86番目までがプロ部分の配列、 87番目から 416番 目までが成熟型トランスグル夕ミナーゼの配列であると推定される。 実施例 2. トランスグル夕ミナ一ゼ遺伝子発現用プラスミ ドの構築
1) プラスミ ドベクター (pIJ702)の取得
11702の調製は[ 8& 61^01.，162，406-412(1985)； J.Bacteriol. ,169,1929 - 1937(1987)]に従い行った。 具体的にはストレブトマイセス · リビダンス 66を pi J702で形質転換したストレプトマイセス · リビダンス 3131(ATCC 35287)(J.Gen.M icrobiol., 129， 2703- 2714(1983))を以下の培地条件で 30°C、 2日間培養した。
[ YEME培地 + 0.5%グリシン + 50 g/m 1チォストレプトン]
0. 3% ィースト ·エキストラクト
0. 5% ペプトン 0 . 3 % マル卜 ·エキス 卜ラク ト
0 1 % 塩化マグネシウム
1 0 % グルコース
3 4 0 % サッカロース
0 5 % グリシン
0 1 % 50mg/nilチォストレブ 溶液
(シグマ ド溶液） (pH7.0 ) 上記条件下で培養した培養培地 2 0 0 m lを遠心分離（12，000g, 4°C, 10分間） し、 50mM Tris-HCl (pH8.0)-5mM EDTA- 50 1 NaClで洗浄後、 得られた菌体を 50mM Tris-HCl(pH8.0)-10mM EDTA-25% Sucrose (以下「TE-Sucrose」 という。 ） 1 0 m 1に懸濁した。次に 30mg/mlのリゾチーム （シグマ）を含む TE-Sucrose 2mlおよび 0.25M EDTA 4mlを加え、 37°Cで 3 0分間ィンキュベート後、 20% SDS 2mlを加え、 さらに 5M NaCl 5mlを加えて穏やかに攪拌した後、 0°Cで 1晚ィンキュペートした。 次に遠心分離（100, 000g, 4。C, 40分間）により得られた上清に 30%ポリエチレン 60 00を終濃度 10%になるように加え、 0 で4.5時間ィンキュベートした。その後、遠 心分離（900 g, 4°C， 5分間）し、 沈殿を 10mM Tris-HCl(pH8.0)-lmM EDTA-50mM Na CIに溶かした。 次に、 塩化セシウム 16.8gおよび lOmg/mlの濃度にェチジゥムブ口 マイ ドを lOmM Tris-HCl(pH8.0)-lmM EDTA (以下「TE」 という。 ) に溶かし調製し た溶液 1.2mlを加え、 遠心分離（1，300 g, 室温， 15分間）により、 残さを取り除い た後、 遠心分離 （230, 000 g, 20V, 12時間） を行った。遠心後、 紫外線照射下で プラスミ ド DNA層を分離抽出し、 TEで飽和したブ夕ノールによる抽出操作を 3回繰 り返し行いェチジゥムブロマイ ドを除いた。 さらに TEで 4°Cで 1晚透析した後、 T E飽和フエノールで 1回、 クロ口ホルム 'イソァミルアルコールで 2回の抽出操作 を行い、水層を回収した。次に 1/10容量の 3M酢酸ナトリウム（pH5.2)溶液と 2倍容 (のエタノールを加え、 - 80°Cに 30分 i し、 ^心分離 (12,000 g, 4°C, 15分 により沈殿を回収し、 70%エタノールで洗浄後、 乾燥し、 TE200〃1に溶かした。 約 10 gのプラスミ ド DNAが得られた。
2) 発現用プラスミ ド構築
まず、 放線菌（Streptomyces)と E.coliの両方の宿主で複製可能なシャトルべク 夕一を作製した。 放線菌多コピープラスミ ドの PIJ702 (約 5.8kb) を Saclと Pstl で切断し、 mel (チロシナーゼ遺伝子） プロモー夕一領域を除去した 5. lkbの大き い断片を調製した。 次にプロテアーゼインヒビ夕一 SSI(Streptomyces subtilisi n inhibitor)と抗菌ペプチド （アビデシン） 遺伝子の融合体が組み込まれた pOS ΔΒ-Αρΐ (約 7.9kb) (Appl. Environ. Microbiol. , 60, 3566-3572(1994)) を Hind ΙΠと Pstlで切断し、 約 2kbの断片を調製した。 さらに Escherichia coliの多コビ 一型プラスミ ド pUC18 (宝酒造社製） を EcoRIで切断し、 T4 DNAポリメラ一ゼ（宝 酒造社製）で平滑末端化してセルフライゲイシヨンを行い、 EcoRIで切断されない プラスミ ドを選択し、 さらに Saclと Hindlll切断した 2.7kbの断片を調製した。 次に PIJ702の Sacl- Pstl 5. lkb断片と pOSAB- Aplの Hindlll- Pstl 2kb断片、およ び 1^18の5&(^1-^11(1111 2.7kb断片の 3者ライゲイシヨンを行い、シャトルべクタ -pUJS (約 9.8kb) を構築した。
さらに pUJSを Hindlllと EcoRI切断して大断片 8.6kbを回収した。 （1)でクロー ン化した S.cinnajnoneum IF012852のトランスグル夕ミナーゼ遺伝子を搭載した p B3.5 (約 6.2kb)を Hindi IIと EcoRIで切断し、 3.5kbの Hindi II- EcoRI断片を回収し た。 この 3.5kbの HindIII_EcoRI断片を pUJSの Hindlllと EcoRIサイ トに揷入した pU J-MTG (約 12. lkb) を構築した。
以上の構築手順を図 1に示す。
pUJ-MTGを形質転換して得られた形質転換体 E. coli AJ13669は通商産業省工業 ½術院生命工学ェ 術研 所 ( 1 1本 M X305-8566 茨城 つくば巿¾ 1丁 [ | 1 - 3 ) に¾託されている (Ψ-成 11年 10月 14 [:！付けで受託： ^号 FERM P-17602とし て寄託され、 平成 12年 8月 28日付けで受託赉号 FERM BP-7287としてブダペスト条 約に基づく寄託へ移^された） 。 実施例 3 . S. l ividans TK24への形質 ¾入
S. lividans TK24は S. lividans 66に由来する株であり、 ストレプトマイシン耐性 が付与されている（GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES, A LABORATORY MANU AL : D.A.Hopwood et al. , p266, 1985, The john Innes Foundation Norwich)0 本菌株は D丄 Hopwood(John Innes Institute, Colney Lane, Norwich NR4 7UH, U.K. )より提供されたものであり、 D.A. Hopwood研究室より入手可能である。
S. lividans TK24を [特開平 3- 251182、 Hunter, I. S. "DNA Cloning" A Practica 1 Approarch 2， Glover,D.M. (Ed. ) IRL Press(1985)、 GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES, A LABORATORY MANUAL: D.A.Hopwood et al . , pi 04, 1985, The john Innes Foundation Norwich]の方法に従って、 7° D卜プラス卜ィ匕し幵質導入 した。具体的には S. lividans TK24を YEME培地 +0.5 グリシンで 30° 2日間培養 した。 培養液 200mlを遠心分離（1， 300 g, 室温、 10分間）し、 得られた菌体を 0.35 Mサッカロース 72mlに懸濁した。
次に、 この懸濁液を遠心分離（1 , 300 g, 室温、 10分間）し、菌体を ling/nilのリゾチ —ム （シグマ） を含む P緩衝液 60mlに再懸濁し、 これを 30°C、 2.5時間インキュべ 一卜し、 脱脂綿で濾過し、 残さを取り除いた。 得られた濾液を遠心分離 （1，300 g, 室温、 10分間） し、 P緩衝液 25mlで洗浄を 2回繰り返した後、 沈殿を P緩衝液 lmlに懸濁し、 プロトブラスト懸濁液とした。 [ P緩衝液]
TES [N-Tr i s ( hydroxymethy 1 )methy 1 -2-aminoethane sulphonic acid] 5.73g サッカロース 103g 塩化マグネシウム 2.03g 硫酸カリウム 0.5g 塩化カルシウム 3.68g 微量元素溶液 2ml/L(pH7.4) なお、 1%リン酸 1カリウム溶液を別調製し、 使用直前に 100ml P緩衝液当たり lm
1を加えた。
[微量元素溶液]
1L中、 以下のものを含む。
塩化亜鉛 40mg
塩化第二鉄 200mg
塩化第二銅 10mg
塩化マンガン 10mg
四硼酸ナトリウム ΙΟπκ
モリ 酸アンモニゥム lOmg 次に、 トランスグル夕ミナーゼ遺伝子発現プラスミ ド pUJ- MTG (約 12.1kb)の S. lividans TK24のプロトプラスト懸濁液への形質導入を以下のように行った。
DNA溶液（0.2〃g/ 1 ) 20 / 1
S. l ividans TK24のプロトプラスト懸濁液 100/z l
0.35M サッカロース 20 z l 20%ポリエチレングリコール 1000を含む P緩衝液 1.5ml
を穏やかに混和し、 室温で 2分間静^する。 遠心分離（1 , 700 g、 室温、 10分間）し、 ペレツトを集め、 P緩衝液で 2回洗浄を 繰り返し、 P緩衝液 lmlに 濁した後に 200〃 1ずつを以下の R-2寒天培地に塗布し た。
[R-2寒天培地]
1 ) R-2/A
硫酸力リウム 0.5g/l
塩化マグネシウム 20.2g/l
塩化カルシウム 5.9g/l
グルコース 20.0g/l
プロリン 6.0g/l
カザミノ酸 0.2g/l
微量元素溶液 4 ml
4 .0g/l
2) R-2/B
TES 11.5g/l
イースト ·エキストラクト 10.0g/l
サッカロース 203 g/1 (pH7.4)
3) 1 % KH2P0,
1 )2)3)をそれそれ別調製し、 プレート培地作製時に R- 2/Aおよび R- 2/Bを混合し、 さらに 1 % K¾P04溶液を最終容量 200ml当たり 1mlの割合で混合した。 形 4転換体が塗布された R- 2寒天培地を 30°Cで 18時間ィンキュベートした後、 2 00 zg/mlのチォス卜レプトンを含む P緩衝液 lmlを加え、寒天の全表而を覆い、さ らに 30°Cで 7日間インキュベートし、 コロニーを得た。 得られたコロニーからプ ラスミ ドを調製して目的のプラスミ ドが導入されていることを確認した。 実施例 4 . 卜ランスグルタミナーゼ逍伝子の発現と分泌生産
形質転換体 pUJ- MTG/S. lividans TK24をチォストレプトン 10 zg/mlを含む卜リ プトン .ソ―ャ ·ブロス（DIFC0社製）液体培地 4mlで 3 0 °C、 3日間培養し、 この 1 mlを 100mlの上記液体培地 （500ml容坂ロフラスコ） にシードし、 3 0 °Cで 2週間 培養した。 経時的に培養液をサンプリングして、 その培養上清液 1 0 1を S D S— P A G Eに供してから、 特開平 6- 046855記載の抗トランスグル夕ミナ一ゼ抗 体を用いて、 Molecular Clonin 第 2版 (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. M aniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl8.60( 1989) )に記載される ような一般的条件でウエスタンプロットを行った。 その結果、 培養 7〜1 0日目 頃まではプロ構造部の付加したトランスグル夕ミナーゼ （プロトランスグルタミ ナ一ゼ）の分泌生産（約 40-50mg/l)が認められ、 さらに培養を継続するとプロト ランスグル夕ミナ一ゼがプロセッシングを受けた成熟トランスグル夕ミナ一ゼと ほぼ同じ分子量を有するトランスグル夕ミナーゼの生成量が増大し、 2週間目頃 には約 40-50mg/lの成熟型トランスグルタミナーゼが蓄積した。
プロ構造部の付加したトランスグル夕ミナーゼ （プロトランスグル夕ミナ一ゼ の分泌生産量の多い時期の培養上清を用いて、 SDS- PAGE後、 PVDF膜にセミ ドライ ブロッテイングした （ 「遺伝子クロ一ニングのためのタンパク質構造解析」 、 東 京化学同人 （1993) ) 。 ブロッテイング後、 PVDF膜をクマシ一ブリリアントブル 一で染色し、 脱染、 風乾した。 プロトランスグル夕ミナーゼの部分を切り取り、 プロテインシークェンサ一 （モデル 476A、 パーキンエルマ一社製） で N末端アミ ノ酸配列の解析を行った。 その結 ¾、 プロトランスグルタミナーゼの N末端アミ ノ酸配列の 10アミノ酸配列 (Gly-Asp-Gly-Glu-Glu-Lys-Gly-Ser-Tyr-Ala-) (配列 番号 7 )が確認された。 このアミノ酸配列は Biochimie. , 80, 313- 319( 1998)で示 されたプロ領域の配列とは異なっており、 実施例 1で決定したアミノ酸配列 （配 列番号 2 ) と一致した。 本発明により、 ストレプトマイセス属細菌にトランスグル夕ミナーゼを生産さ せ、 培養液中にトランスグル夕ミナ一ゼを多量に得ることができる。 本発明の方 法によって培養液中に蓄積するトランスグル夕ミナーゼは、 ストレプトマイセス 属細菌自身によって生産されるプロテーゼによって切断された成熟型トランスグ ル夕ミナーゼであるため、 簡便かつ大規模に培地から成熟型トランスグル夕ミナ ーゼを回収することができる。

Claims

^求の範囲
1 . 放線菌出来のトランスグル夕ミナーゼ遗伝子配列及び当該トランスグル夕 ミナ一ゼ遗伝子の発現を制御しているプロモー夕一配列を含む遗伝子構築物を導 入したス卜レプトマイセス屈細菌。
2 . 放線菌がストレプトバ一チシリウム ·シナモニゥムである詰求項 1に記載 のストレプトマイセス厲細菌。
3 . ストレブトマイセス ' リビダンスである請求項 1または 2に記載のス卜レ プトマイセス属細菌。
4 . 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のストレプトマイセス属細菌を培養し、 放線菌由来のプロトランスグル夕ミナーゼを培地中に分泌させることを特徴とす る、 プロトランスグル夕ミナ一ゼの製造法。
5 . 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のストレプトマイセス属細菌を培養し、 放線菌由来のプロ卜ランスグル夕ミナーゼを培地中に分泌させ、 前記ストレブト マイセス属細菌由来のプロテア一ゼによって前記プロトランスグル夕ミナーゼの プロ構造部を切断除去し、 放線菌由来の成熟型トランスグル夕ミナーゼを回収す ることを特徴とする、 成熟型トランスグル夕ミナーゼの製造法。
6 . プロトランスグル夕ミナーゼが配列番号 2の 3 3番目のグリシン残基から 4 1 6番目のプロリン残基に至るアミノ酸配列を有する、請求項 4に記載の方法。
7 . 成熟型トランスグル夕ミナーゼが配列番号 2の 8 7番目のセリン残基から 4 1 6番目のプロリン残基に至るアミノ酸配列を有する、請求項 5に記載の方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004024912A1 (ja) * 2002-09-10 2004-03-25 Amano Enzyme Inc. トランスグルタミナーゼ生産菌
CN102676413A (zh) * 2011-03-08 2012-09-19 田黎 对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海生境放线菌及代谢产物
CN102676412A (zh) * 2011-03-08 2012-09-19 中国航天员科研训练中心 一株具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0113304A (pt) 2000-08-17 2004-01-06 Ajinomoto Kk Método para planejar e preparar uma transglutaminase mutante, mtg mutante transglutaminase mutante, gene, dna recombinante, microorganismos, método para produzir uma mtg mutante ou uma transglutaminase mutante, e, cristais de mtg monoclìnicos
US20090061046A1 (en) * 2007-08-02 2009-03-05 Novozymes A/S Method for producing an acidified milk drink
US20100316764A1 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 Engrain, LLC Flour supplement compositions and methods for preparing wheat flour
CN102643820B (zh) * 2012-05-10 2013-08-28 江南大学 一种优化的谷氨酰胺转胺酶启动子及其应用
JP2023540349A (ja) * 2020-09-08 2023-09-22 キュリー カンパニー インコーポレイテッド 組成物およびその使用方法
CN114686388A (zh) * 2020-12-25 2022-07-01 江苏东汇生物科技有限公司 一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0481504A1 (en) * 1990-10-19 1992-04-22 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant transglutaminase
WO1996006931A1 (en) * 1994-08-26 1996-03-07 Novo Nordisk A/S Microbial transglutaminases, their production and use
EP0889133A2 (en) * 1997-07-04 1999-01-07 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing microbial transglutaminase

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0481504A1 (en) * 1990-10-19 1992-04-22 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant transglutaminase
WO1996006931A1 (en) * 1994-08-26 1996-03-07 Novo Nordisk A/S Microbial transglutaminases, their production and use
EP0889133A2 (en) * 1997-07-04 1999-01-07 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing microbial transglutaminase

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DURAN R. ET AL.: "Purification, characterisation and gene cloning of transglutaminase from streptoverticillium cinnamoneum CBS 683.68", BIOCHIMIE, vol. 80, no. 4, April 1998 (1998-04-01), pages 313 - 319, XP002936048 *
PASTERNACK RALF ET AL.: "Bacterial pro-transglutaminase from streptovertillium mobaraense purification, characterisation and sequence of the zymogen", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 257, no. 3, 1 November 1998 (1998-11-01), pages 570 - 576, XP002936049 *
See also references of EP1225217A4 *
WASHIZU KINYA ET AL.: "Molecular cloning of the gene for microbial transglutaminase from streptoverticillium and its expression in streptomyces lividans", BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, vol. 58, no. 1, 23 January 1994 (1994-01-23), pages 82 - 87, XP002936047 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004024912A1 (ja) * 2002-09-10 2004-03-25 Amano Enzyme Inc. トランスグルタミナーゼ生産菌
US7329521B2 (en) 2002-09-10 2008-02-12 Amano Enzyme Inc. Transglutaminase-producing strain
CN102676413A (zh) * 2011-03-08 2012-09-19 田黎 对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海生境放线菌及代谢产物
CN102676412A (zh) * 2011-03-08 2012-09-19 中国航天员科研训练中心 一株具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌
CN102676412B (zh) * 2011-03-08 2014-01-22 中国航天员科研训练中心 一株具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌

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