WO2001009348A1 - Polypeptides - Google Patents

Description

明 細 書 ポリぺプチド

技術分野

本発明はポリぺプチド、 さらに詳しくは、 バイォマスの有効利用に有用なダル コアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。 また、 本発明は該ポリぺプチ ドの遺伝子工学的生産に有用な遺伝子にも関する。

背景技術

非還元末端にひ一 1 , 4結合で結合された D—グルコースを遊離させる活性を 有する酵素としてはグルカン 1 ， 4— α—グノレコシダーゼ、 a -ダルコシダーゼ の 2つの酵素が知られている。

グルカン 1 , 4— α—ダルコシダ一ゼ （E C 3 . 2 . 1 . 3 ) は 1 ， 4— α —D—グルカンダルコヒドロラーゼ又はダルコアミラーゼとも呼ばれ、 α— 1 ，

4結合を介した D—ダルコピラノースの重合体の非還元末端に作用して — D— グルコースを遊離する酵素である。 Aspergillus属、 Mucor属、 Rhizopus属、 Piricularia属、 Thermomyces属、 Trichoderma¾等の力ビ、 Endomyces属、

Saccharomyces属等の酵母、 及び Clostridium属細菌由来のグルカン 1 , 4— α— ダルコシダーゼが現在知られている。 当該酵素はひ一アミラーゼとともにデンプ ンを加水分解する過程で重要な酵素で、 グルコース、 異性ィヒ糖やオリゴ糖の製造、 酒類や発酵アルコールの製造等の分野で工業的に広く利用されている。

デンプンからグルコースを製造する場合、 通常は蒸煮により糊化したデンプン に α—アミラーゼを約 8 0 °Cで作用させて液ィ匕し、 次いでグルカン 1 , 4— α— ダルコシダーゼを 5 5〜 6 0 °Cで作用させて糖化を行う。 糊化デンプンは粘度が 高く、 また、 耐熱性ひ一アミラーゼが実用化されていることもあって液化は高温 で行われる。 一方、 糖化時の温度は微生物による汚染を避けるために 5 5 °C以上 が望ましいが、 現在一般に使用されているカビ由来の酵素を用いる限り酵素の耐 熱性の問題から 6 0 °C以下に設定しなければならない。 このように液化と糖化の 至適温度が異なるので両工程を同時に行うことは不可能であり、 エネルギー収支 上の無駄が大きい。

a―ダルコシダーゼ （EC 3. 2. 1. 20) は非還元末端の α—ダルコシ ド結合に作用して α— D—グルコースを遊離する酵素で、 動物、 植物、 微生物に 広く存在している。 α—ダルコシダ一ゼは基質特異性によって （1 ) 〜 （3) の グループに分類される。 即ち、 （1) 極めて広いヘテロ及びホモ α—ダルコシド 化合物に作用するもの、 （2) α- 1 , 4—ダルコオリゴサッカライ ドに特異性 の高いもので、 高分子グルカンやへテ口ダルコシドには比較的作用力の弱いもの、 (3) ひ一 1 , 4—ダルコシド結合に強い特異性を持つ力 デンプンゃグリコー ゲンにも作用するもの、 である。 このうち （3) に属するものはグルコアミラー ゼと呼ばれることもある （ 「応用酵素学」 、 辻阪ら編、 講談社発行、 1 9 7 9年、 第 5 6頁） 。

高温環境に適応した超好熱性微生物は高度に耐熱性の酵素を生産している。 超 好熱性古細菌ピロコッカス ·フリォサス （Pyrococcus furiosus) は ct—ァミラ —ゼ、 α -ダルコシダーゼ、 β—グリ コシダーゼ、 β -グルカナーゼ等の糖加水 分解酵素を生産することが知られており、 その遺伝子がクローン化されているも のもある 〔ザ 'ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー （The

Journal of Biological Chemistry) 、 第 2 6 8卷、 第 244 0 2〜 244 0 7 頁 （1 9 9 3) ；ザ 'ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル 'ケミストリー、 第 2 7 2卷、 第 1 6 3 3 5〜 1 6 34 2頁 （1 9 9 7) ；ジヤーナル'ォブ'バクテ リオロジー （Journal of Bacteriology) 、 第 1 7 2卷、 第 3 6 54〜 3 6 6 0 頁 （1 9 9 0) ；ジャーナル ·ォブ ·バクテリオ口ジ一、 第 1 7 7卷、 第 7 1 0 5〜 7 1 1 1頁 （1 9 9 5) ；ジャーナル ·ォブ ·バクテリォロジ一、 第 1 8 1 卷、 第 2 84〜 2 90頁 （1 9 9 9) 〕 。 し力 し、 グルカン 1， 4 _α—グノレコ シダ一ゼを生産する超好熱性微生物及び超耐熱性グルカン 1 , 4—ひ一ダルコシ ダーゼは知られていない。 また、 従来知られているピロコッカス .フリオサスを 含む超好熱性微生物の生産する α—ダルコシダーゼは低分子基質にのみ作用し、

'等の高分子基質は分解しない。 発明の目的

本発明の目的は、 産業上利用価値の高い耐熱性ダルコアミラーゼ活性を有する ポリぺプチド、 該ポリぺプチドをコ一ドする遺伝子ならびに該ポリぺプチドの遺 伝子工学的製造方法を提供することにある。

発明の概要

本発明を概説すれば、 本発明の第 1の発明は耐熱性ダルコ了ミラーゼ活性を示 すポリぺプチドに関し、 配列表の配列番号 6のァミノ酸配列、 または該配列にお いて 1個以上のアミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入もしくは置換の少なくとも 1つ を有するアミノ酸配列で示されることを特徴とする。 本発明の第 2の発明は核酸 に関し、 第 1の発明のポリペプチドをコードすることを特徴とする。 本発明の第 3の発明は核酸に関し、 請求項 2記載の核酸にス トリンジェントな条件でハイブ リダイズ可能であり、 かつ耐熱性ダルコアミラーゼ活性を示すポリぺプチドをコ ードすることを特徴とする。 本発明の第 4の発明は糸且換え D NAに関し、 第 2の 発明又は第 3の発明の核酸を含んでなることを特徴とする。 本発明の第 5の発明 は形質転換体に関し、 第 4の発明の組換え D NAにより形質転換されてなること を特徴とする。 本発明の第 6の発明は第 1の発明のポリぺプチドの製造方法に関 し、 第 5の発明の形質転換体を培養し、 該培養物中より耐熱性ダルコアミラーゼ 活性を有するポリべプチドを採取することを特徴とする。 本発明の第 7の発明は グルコースの製造方法に関し、 α— 1 , 4結合を介した D—ダルコビラノースの 重合体に、 第 1の発明のポリぺプチドを作用させてグルコースを遊離させること を特徴とする。 本発明の第 8の発明はオリゴ糖の製造方法に関し、 _α— 1 , 4結 合を介した D—ダルコビラノースの重合体に、 第 1の発明のポリべプチドを作用 させてオリゴ糖を生成させることを特徴とする。 本発明の第 7の発明はシクロデ キストリンの製造方法に関し、 α— 4結合を介した D—ダルコビラノースの 重合体に、 第 1の発明のポリぺプチドを作用させてシクロデキストリンを生成さ せることを特徴とする。

本発明者らは鋭意研究した結果、 ピロコッカス ·フリォサスのゲノム上に新規 ポリペプチドをコードする遺伝子が存在することを見出した。 また、 該ポリぺプ チドのァミノ酸配列が種々の細菌由来 α—ァミラーゼ及びシク口マルトデキスト リングルカノ トランスフェラーゼとのみ高い相同性を示すにも関わらず、 該ポリ ぺプチドは意外にも耐熱性ダルコアミラーゼ活性を有することを見出した。 更に 研究を進め、 該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法を確立し、 本発明を完成し た。

図面の簡単な説明

図 1 ：反応温度と本発明のポリぺプチドのダルコアミラーゼ活 1"生の関係を示す 図である。

図 2 ：反応 ρ Ηと本発明のポリペプチドのダルコアミラーゼ活性の関係を示す 図である。

図 3 ： 8 0 °Cで熱処理を行ったときの本発明のポリぺプチドの残存ダルコアミ ラーゼ活性の関係を示す図である。

図 4 ： 9 5 °Cで熱処理を行ったときの本発明のポリペプチドの残存ダルコアミ ラーゼ活性の関係を示す図である。

図 5 ：金属イオン又は E D TAの濃度と本発明のポリペプチドのダルコアミラ —ゼ活性の関係を示す図である。

図 6 ：各粗抽出液をマルトペンタオースに作用させたときの生成物の組成を示 す図である。

図 7 ：各粗抽出液を可溶性デンプンに作用させたときの生成物の組成を示す図 である。

発明の詳細な説明

1 . 本発明のポリペプチドについて

本発明のポリペプチドは、 配列表の配列番号 6記載のアミノ酸配列、 又は該ァ ミノ酸配列において 1個以上のアミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入若しくは置換の 少なくとも 1つを有するアミノ酸配列で示され、 かつ耐熱性ダルコアミラーゼ活 性を示すことを特徴とする。

本明細書において、 ダルコアミラーゼ活性とは α— 1 , 4結合で連結された D ―ダルコビラノースからなる多糖又はォリゴ糖のダルコシド結合を非還元末端か ら順次加水分解し、 D—グルコースを遊離させる活性を意味する。 /3—D—グル コースを遊離させる酵素はグルカン 1 , 4— α—ダルコシダーゼ （E C 3 . 2 . 1 . 3 ) 、 α—D—グルコースを遊離させる酵素は α—ダルコシダーゼ （E C 3 . 2 . 1 . 2 0 ) と呼ばれているが、 本明細書におけるダルコアミラーゼ活性 とは両触媒活性のうち少なくとも一方を示すことをいう。

ダルコアミラーゼ活^~生を測定する方法としては、 例えば、 アミロースを基質と して酵素反応を行い、 パーク アンド ジョンソン （Park & Johnson) 法によつ て還元糖の増加を測定する方法、 該酵素反応によって遊離してきた D—ダルコ一 スをグルコースォキシダ一ゼを用いた酵素法によつて測定する方法等の公知の方 法が挙げられる。

なお、 本発明のポリペプチドはダルコアミラーゼ活性を有していればよく、 そ の他の活性、 例えば α—ァミラーゼ活性、 /3—ァミラーゼ活性等の加水分解活性 ゃシクロマルトデキストリングルカノ トランスフェラーゼ等の糖転移活性を併せ 持つポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含される。 例えば、 配列表の配列 番号 6に記載のァミノ酸配列で示される本発明のポリべプチドは、 マルト一ス、 マルトトリオース、 マルトテトラオースのようなオリゴ糖を基質とした場合には、 グルコースとともに基質オリゴ糖よりも分子量の大きな産物を生成し、 糖転移活 性をも有している。

本発明のポリぺプチドは耐熱性のダルコアミラーゼ活性を有することを特徴と する。 ここで、 耐熱性のダルコアミラーゼ活性を有するとは、 特に限定するもの ではないが、 7 0 °C以上、 好ましくは 8 0 °C以上、 より好ましくは 8 5 °C以上、 最も好ましくは 9 0 °C以上の温度でダルコアミラーゼ活性を示すことを意味する。 なお、 本発明のポリぺプチドは、 耐熱性ダルコァミラーゼ活性を示す限りにお V、て配列表の配列番号 6記载のァミノ酸配列に 1個以上のァミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入もしくは置換の少なくとも 1つがなされたァミノ酸配列で示されるポ リペプチドを包含する。

すなわち、 天然に存在するポリペプチドにはそれをコードする D N Aの多形や 変異の他、 生成後のポリべプチドの生体内および精製中の修飾反応などによって そのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、 挿入、 付加、 置換等の変異が起こりうる。 し力 し、 このような変異が該ポリぺプチドの活性や構造の保持に関して重要でな い部分に存在する場合には、 変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、 生物学的活性を示すものがあることが知られている。

人為的にポリべプチドのァミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同 様であり、 この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。 例えば、 ヒ トインターロイキン 2 ( I L - 2 ) のアミノ酸配列中のあるシスティ ン残基をセリンに置換したポリぺプチドがィンターロイキン 2活性を保持するこ とが知られている [サイエンス （Science ) 、 第 2 2 4卷、 1 4 3 1頁 （1 9 8 4 ) ] 。

また、 ある種のポリペプチドは、 活性には必須でないペプチド領域を有してい ることが知られている。 例えば、 細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシ ダナルぺプチドゃ、 プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあ たり、 これらの領域のほとんどは翻訳後、 あるいは活性型ポリペプチドへの転換 に際して除去される。 このようなポリペプチドは一火構造上は異なった形で存在 しているが、 最終的には同等の機能を発現するポリペプチドである。 本発明によ り単離された、 配列表の配列番号 2に示される塩基配列の遺伝子には配列表の配 列番号 1記載のァミノ酸配列を持つポリぺプチドがコードされており、 該ポリぺ プチドは耐熱性のダルコアミラーゼ活性を有している。 また、 そのアミノ末端に は 1 9ァミノ酸残基からなるシダナルぺプチド様配列が存在する。 このポリぺプ チドからシグナルぺプチドが除去されたポリぺプチド、 すなわち配列表の配列番 号 6で示されるァミノ酸配列のポリぺプチドも耐熱 1·生ダルコアミラーゼ活性を有 している。 すなわち、 これらの 2種のポリペプチドはいずれも本発明のポリぺプ チドに含まれる。

遺伝子工学的にポリぺプチドの生産を行う場合には、 目的のポリぺプチドのァ ミノ末端、 あるいはカルボキシル末端に該ポリべプチドの活性とは無関係のぺプ チド鎖が付加されることがある。 例えば、 目的のポリペプチドの発現量を上げる ために、 使用される宿主中で高発現されているポリペプチドのァミノ末端領域の —部を目的のポリぺプチドのァミノ末端に付加した融合ポリぺプチドが作製され ることがある。 あるいは、 発現されたポリペプチドの精製を容易にするために、 特定の物質に親和性を有するぺプチドを目的のポリぺプチドのァミノ末端または カルボキシル末端に付加することも行われている。 これらの付加されたぺプチド は目的ポリぺプチドの活性に悪影響をおよぼさない場合には付加されたままであ つてもよく、 また、 必要であれば適当な処理、 例えば、 プロテア一ゼによる限定 分解などによって目的ポリぺプチドから除去できるようにすることもできる。 したがって、 本発明によって開示されたアミノ酸配列 （配列表の配列番号 1) に 1個以上のアミノ酸残基の欠失、 挿入、 付加、 置換が生じたアミノ酸配列によ つて示されるポリぺプチドであっても、 耐熱性ダルコアミラーゼ活性を有してレヽ れば本発明の範囲内に属するものである。

本発明のポリペプチドには、 下記実施例に記載された変異ポリペプチド、 例 えば、 F 206 S、 P 142 I、 L337V、 F S/P I , FS/LVが包含さ れる。

本発明のポリペプチドは、 例えば、 （1) 本発明のポリペプチドを生産する微 生物の培養物からの精製、 （2) 本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有 する形質転換体の培養物からの精製、 等の方法により製造することができる。

( 1 ) 本発明のポリぺプチドを生産する微生物の培養物からの精製

本発明のポリぺプチドを生産する微生物としては、 例えば、 ドィッチェ ·ザム ノレンク · フォン · ミク口オルガニスメン · ゥント . ツェルクルツレン GmbH (Deutsche Sammlung von Mikroorganisraen und Zellkulturen GmbH) より貝苒入 可能なピロコッカス ' フリオサス DSM3638が挙げられる。 微生物の培養 は、 その微生物の生育に適した条件で行えばよく、 好ましくは、 目的のポリぺプ チドの発現量が高くなるような培養条件が用いられる。 力べして菌体あるいは培 養液中に生産された目的のポリべプチドは、 通常のタンパク質の精製に用いられ る方法によって精製することができる。

上記菌株の培養にあたっては、 通常、 超耐熱菌の培養に用いられる方法が利用 でき、 培地に加える栄養源は該菌株が利用しうるものであればよい。 炭素源とし ては、 例えば、 デンプン等が利用でき、 窒素源としては、 例えば、 トリプトン、 ペプトン、 酵母エキス等が利用できる。 培地中には、 マグネシウム塩、 ナトリウ ム塩、 鉄塩等の金属塩を微量元素として加えてもよい。 また、 例えば、 培地の調 製に人工海水を用いることが有利である。 さらに、 培地は固形の硫黄を含んでい ない透明な培地が望ましく、 該培地を用いれば、 菌体の増殖は培養液の濁度を測 定することにより容易に監視することができる。

培養は静置培養または撹拌培養で行なうことができるが、 例えば、 アプライ ド .アンド .エンバイロンメンタル ·マイク口バイオロジー （Applied and Environmental Microbiology) 、 第 5 5卷、 第 2 0 8 6〜 2 0 8 8頁 （1 9 9 2 ) に記载のように、 透析培養法を用いてもよい。 一般に培養温度は 9 5 °C前後 が好ましく、 通常 1 6時間程度でポリぺプチドが培養物中に著量蓄積する。 培養 条件は、 使用する菌株、 培地組成に応じポリペプチドの生産量が最大になるよう に設定するのが好ましい。

ポリペプチドを採取するに当たっては、 まず、 無細胞抽出液を調製する。 無細 胞抽出液は、 例えば、 培養液から遠心分離、 濾過などによって菌体を集め、 つい で菌体を破砕することにより調製できる。 菌体の破砕方法としては、 超音波破砕、 ビーズ破砕、 溶菌酵素処理等のうちから目的酵素の抽出効果の高レ、方法を選べば よい。 また、 培養液上清中に該ポリペプチドが分泌されている場合には、 硫安塩 析法ゃ限外濾過法等によって培養液上清中のポリべプチドを濃縮し、 これを無細 胞抽出液とする。 力 くして得られた無細胞抽出液からポリペプチドを単離するに あたっては、 通常のタンパク質の精製に用いられる方法を使用できる。 例えば、 硫安塩析処理、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフィー、 ゲル 濾過クロマトグラフィ一等の方法を組み合わせて使用できる。

( 2 ) 本発明のポリべプチドをコ一ドする核酸を含む,袓換え D N Aにより形質 転換された形質転換体の培養物からの精製

本発明のポリべプチドをコ一ドする核酸、 例えば配列番号 2あるいは 7に示さ れる塩基配列を有する核酸を含む組換え D N Aで形質転換された形質転換体より、 本発明のポリぺプチドを取得することができる。 配列番号 2に示される塩基配列 からは配列番号 1に示されるァミノ酸配列のポリぺプチドが、 また、 配列番号 7 に示される塩基配列からは配列番号 6に示されるアミノ酸配列のポリべプチドが それぞれ生成する。 形質転換される宿主には特に限定はなく、 例えば、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 糸 状菌、 植物、 動物、 植物培養細胞、 動物培養細胞等、 組換え DN Aの分野で通常 使用されている宿主が挙げられる。

例えば、 本発明のポリペプチドは、 1 a cプロモーターの下流に配列表の配列 番号 2で表される塩基配列の DNAを連結したプラスミ ドである p S J 3231 を保持する大腸菌 JM109を用いて得ることができる。 なお、 p S J 3231 で形質転換された大腸菌 J M 109は、 Escherichia coli JM109/p S J 3231と命名、 表示され、 平成 1 1年 7月 30日 （原寄託日） より、 ブダぺス ト条約のもと、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の、 通商産業省工業技術 院生命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM BP— 7196として寄託さ れている。

すなわち、 p S J 3231を保持する大腸菌 J M 109を通常の培養条件、 例 えば、 100 μ gZm 1のアンピシリンを含む LB培地 （トリプトン 10 リットル、 酵母エキス 5 gZリツトル、 Na C 1 5 g/リツトル、 pH7. 2) 中、 37 °Cで対数増殖期まで培養後、 0. 2mMとなるようイソプロピル一

D—チォガラクトピラノシドを添カ卩し、 さらに 37°Cで培養することにより、 培養菌体中にポリぺプチドを発現させることができる。

培養終了後、 遠心分離によって集めた菌体を超音波で破碎し、 さらに遠心分離 して上清を集め、 無細胞抽出液とする。 該無細胞抽出液は耐熱性のダルコアミラ —ゼ活性を示す。 さらにイオン交換クロマトグラフィー、 ゲルろ過、 疎水クロマ トグラフィー、 硫安沈殿等の公知の方法を用いることにより該無細胞抽出液から 本発明のポリぺプチドを精製することができる。 上記の精製過程において得られ る部分精製品も、 当然ながらダルコアミラーゼ活性を示す。 なお、 p S J 323 1を保持する大腸菌 J M 109で発現される本発明のポリぺプチドは高い耐熱性 を有しているため、 精製手段として培養菌体および/"または無細胞抽出液に対し て、 例えば、 80°C、 10分間の熱処理を行って熱変性して不溶化した宿主由来 のタンパク質を除去してもよい。

さらに、 配列表の配列番号 6に示されるアミノ酸配列の本発明のポリぺプチド は、 下記実施例に記載された pET21 amyCASを保持する大腸菌を使用し、 上記同様に取得することができる。

上記のように本発明のポリぺプチドを、 当該ポリぺプチドをコ一ドする核酸を 保持する形質転換体を用いて常温、 例えば、 3 7 °Cで発現させた場合でも、 得ら れた発現産物はその活性、 耐熱性などを保持している。 すなわち、 本発明のポリ ぺプチドは、 その本来の生産菌が生育する温度とは大きく離れた温度において発 現された場合にも、 その固有の高次構造を形成し得る。

こうして得られた本発明のポリぺプチド、 例えば配列表の配列番号 6に示され るアミノ酸配列のポリペプチドが有している酵素学的性質のいくつかを以下に示 す。

① 作用：

本発明のポリペプチドはアミロースを加水分解し、 グルコース、 ならびにオリ ゴ糖を生成する。

また、 本発明のポリペプチドはアミロースに作用し、 シクロデキストリンを生 成する。

②至適温度： 8 5〜 9 0 °Cで最大活性を示す。

③至適 p H : p H 5〜6で最大活性を示す。

④ C a C 1 ₂の存在により安定性が向上する。

⑤ E D T Aにより、 活性が阻害される。

2 . 本発明の核酸について

本発明の核酸は、 上記のような本発明のポリペプチドをコードする核酸であり、 具体的には、 配列表の配列番号 6記载のァミノ酸配列、 または該配列にぉレ、て 1 個以上のァミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入もしくは置換の少なくとも 1つがなさ れたァミノ酸配列で示され、 かつ耐熱性ダルコアミラーゼ活性を示すポリぺプチ ドをコードする核酸 （1 ) 、 配列表の配列番号 7記載の塩基配列で示される核酸 ( 2 ) 、 および上記核酸 （1 ) または （2 ) にストリンジヱントな条件でハイブ リダイズ可能であり、 かつ耐熱性ダルコアミラーゼ活性を示すポリぺプチドをコ ードする核酸 （3 ) 等である。

本明細書における核酸とは、 1本鎖または 2本鎖の D N Aまたは R N Aを意味 する。 上記核酸 （2 ) が R NAである場合は、 例えば配列表の配列番号 7記載の 塩基配列において Tを uで置換した塩基配列で示される。

本発明の核酸は、 例えば、 次のようにして得ることができる。

まず、 配列表の配列番号 7記載の塩基配列で示される核酸 （2 ) は、 本発明の ポリぺプチドの説明中に記載した方法で培養したピロコッカス 'フリオサス D S M 3 6 3 8より常法にしたがってゲノム D N Aを調製し、 それを用いて作製し た D NAライブラリーから単離することができる。 またこのゲノム D NAを^ M としたポリメラーゼ連鎖反応 （ P C R) により、 配列表の配列番号 7記載の塩基 配列で示される核酸を増幅することによつても取得できる。

また、 本発明により提供される、 本発明のポリペプチドをコードする核酸の塩 基配列、 例えば配列表の配列番号 7記載の塩基配列を基に、 本発明のポリべプチ ドと同様の耐熱性ダルコアミラーゼ活性を有するポリべプチドをコ一ドする核酸 を取得することも可能である。 すなわち、 本発明のポリペプチドをコードする核 酸、 またはその塩基配列の一部をハイブリダィゼーシヨンのプローブに用いるこ とにより、 耐熱性ダルコアミラーゼ活性を有するポリぺプチドをコードする D N Aを、 細胞から抽出した D N A、 該 D NAを铸型として得られた P C R産物等か らスクリーニングすることができる。 あるいは上記の塩基配列から設計されたプ ライマーを使用した P C R等の遺伝子増幅法を用いることにより、 耐熱性ダルコ ァミラーゼ活性を有するポリぺプチドをコードする D N Aを増幅することができ る。 また、 耐熱性ダルコアミラーゼ活†生を有するポリぺプチドをコ一ドする D N Aを化学的に合成することも可能である。 力かる方法により、 上記核酸 （1 ) ま たは （3 ) を得ることができる。

上記の方法では目的の核酸の一部のみを含む核酸断片が得られることがあるが、 その際には得られた核酸断片の塩基配列を調べて、 それが目的の核酸の一部であ ることを確かめた上、 該核酸断片、 あるいはその一部をプローブとしてハイブリ ダイゼーシヨンを行う力 \ または該核酸断片の塩基配列に基づいて合成されたプ ライマーを用いて P C Rを行うことにより、 目的の核酸全体を取得することがで きる。

上記の 「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」 とは、 1 9 8 9年、 コールド 'スプリング 'ハーバー 'ラボラトリ一発行、 T . マニアテイス （T. Maniatis) ら編集、 モレキュラー ·クロ一ユング：ァ ·ラボラトリー 'マ二ユア ノレ第 2版 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 2nd ed. ) 等 ίこ 8匚载 れ た条件でハイブリダイズ可能なことを意味し、 例えば、 以下の条件でハイブリダ ィズ可能なことをいう。 すなわち、 核酸を固定したメンブレンを 0. 5% SD S、 0. 1% ゥシ血清アルブミン （BSA) 、 0. 1% ポリビュルピロリ ドン、

0. 1 % フイコール 400、 0. 01% 変性サケ精子核酸を含む 6 X S S C (1 X S SCは 0. 1 5M Na C l、 0. 015 M クェン酸ナトリウム、 p H 7. 0を示す） 中で、 50°Cにて 12〜20時間、 プローブとともにインキュ ペートする。 インキュベーション終了後、 0. 5% SDSを含む 2 X S SC中、 37°Cでの洗浄から始めて、 33〇濃度は0. 1倍までの範囲で、 また、 温度は

50°Cまでの範囲で変化させ、 固定された核酸由来のシグナルがバックグラウン ドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、 プローブの検出を行 う。 また、 こうして得られた新たな核酸について、 そこにコードされているタン パクの有する活性を上記同様の方法によって調べることにより、 得られた核酸が 目的とするものであるかどうかを確認することができる。

また、 オリゴヌクレオチドプローブを使用する場合、 前記 「ストリンジェント な条件」 としては、 特に限定されないが、 例えば、 6 X SSC、 0. 5 % S D S、 5 Xデンハルト、 0. 01% 変性サケ精子核酸を含む溶液中、 〔Tm — 2 5 °C〕 の温度で一晚保温する条件などをいう。

オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの Tm は、 例えば、 下記の式に より求められる。

Tm =81.5— 16.6 (log₁₀[Na+ ])+0.41 (%G+C) - (600/N)

(式中、 Nはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長であり、 ％G + Cはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー中のグァニンおよびシトシ ン残基の含有量である。 ）

また、 オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長が 18塩基より短 い場合、 Tmは、 例えば、 A + T (アデニン +チミン） 残基の含有量と 2°Cとの 積と、 G + C残基の含有量と 4°Cとの積との和 〔(A+T) X2+(G+C) X4 〕 によ り推定することができる。 本発明においては、 本発明のポリペプチドをコードする核酸にストリンジェン トな条件でハイブリダィズ可能な核酸は、 本明細書に開示された塩基配列と同一 の塩基配列ではなくとも、 それが耐熱性ダルコアミラーゼ活性を示すポリぺプチ ドをコードする限り本発明の範囲に含まれるものであることは上記したとおりで ある。

すなわち、 遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン （3つの塩基の組み合わせ） はアミノ酸の種類ごとに 1〜6種類ずつが存在することが知られている。 したが つて、 あるアミノ酸配列をコードする核酸はそのアミノ酸配列にもよるが多数存 在することができる。 核酸は自然界において決して安定に存在しているものでは なく、 その塩基配列に変異が起こることはまれではない。 核酸上に起こった変異 がそこにコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合 （サイレント変異と 呼ばれる） もあり、 この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる核酸が生 じたといえる。 したがって、 ある特定のアミノ酸配列をコードする核酸が単離さ れても、 それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコード する多種類の核酸ができていく可能性は否定できない。 さらに同じアミノ酸配列 をコ一ドする多種類の核酸を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を 用レ、れば困難なことではない。

例えば、 遺伝子工学的なタンパク質の生産において、 目的のタンパク質をコ一 ドする本来の核酸上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低 、もので あった場合には、 タンパク質の発現量が低いことがある。 このような場合にはコ ードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、 コドンを宿主で繁用され ているものに人為的に変換することにより、 目的タンパク質の高発現を図ること が行われている （例えば、 特公平 7— 1 0 2 1 4 6号） 。 このように特定のアミ ノ酸配列をコ一ドする多種類の核酸は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、 自然界においても生成されうるものである。

本発明のポリペプチドをコードする核酸、 例えば、 配列表の配列番号 7記載の 塩基配列を有する核酸を適当なベクタ一に連結して組換え D N Aを作成すること ができる。 該組換え D NAの作成に使用されるベクターには特に限定はなく、 例 えば、 プラスミ ドベクター、 ファージベクター、 ウィルスベクター等を使用する ことができ、 組換え D N Aの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良レ、。 さらに、 当該組換え D N Aを適当な宿主に導入して形質転換体を作成すること ができる。 形質転換体の作成に使用される宿主にも特に限定するはなく、 細菌、 酵母、 糸状菌等の微生物の他、 哺乳動物、 植物、 昆虫等の培養細胞等を使用する ことができる。 当該形質転換体を培養して培養物中に本発明のポリぺプチドを産 生させることにより、 本発明のポリべプチドを大量に製造することが可能となる。

3 . 本発明のポリペプチドを用いたグルコース、 オリゴ糖、 シクロデキストリ ンの製造方法について

本発明のポリペプチドを用いることにより、 ひ一 1 , 4转合を介した D—ダル コピラノースの重合体から D—グルコースを遊離させることができる。 なお、 本 発明における _α— 1 , 4結合を介した D—ダルコビラノースの重合体はダルコピ ラノースの重合度に特に限定はなく、 マルト一ス、 アミロースやデンプンなどが 包含される。 さらに、 同一分子内に α— 1 , 4結合以外の結合、 例えば α— 1 , 6結合や、 D—グルコース以外の糖、 例えばフルク トースを含む重合体も本発明 におけるひ一 1 , 4結合を介した D—ダルコビラノースの重合体に包含される。 配列表の配列番号 1で示される本発明のポリぺプチドは耐熱性が高く、 熱による 基質の構造、 物性の変化との相乗効果もあって、 より効率よく基質を分解するこ とができる。

具体的な反応条件としては、 例えば、 配列表の配列番号 1記載のアミノ酸配列 で示されるポリべプチドを用いる場合、 5 O mM酢酸ナトリゥム緩衝液 （p H 5 . 5 ) 中で基質と 8 0 °Cで反応させることにより、 D—グルコースを遊離させ ることができる。 ただし、 デンプン、 マルトースなど基質の種類により最適な反 応条件が異なるのは当然のことである。

本発明のダルコースの製造方法に使用されるポリペプチドは単離、 精製された ポリペプチドに限定されるものではなく、 グルコースの製造に悪影響を及ぼさな い限りにおいて、 粗精製、 あるいは部分精製されたポリペプチドを使用すること もできる。 本発明のポリべプチドは基質溶液中に遊離の状態で添加してもよいが、 適当な担体に固定化して基質と反応させると反応終了後のポリぺプチドの回収が 容易である。 また、 本発明のポリべプチドと共に耐熱 1"生を有する α—アミラーゼ等の酵素を 使用することにより、 高い効率でデンプンを D_グルコースまで分解することが 可能となる。

さらに、 本発明のポリペプチドを使用してオリゴ糖、 シクロデキストリンを製 造することが可能である。

基質としてデンプン、 アミロースや適当なオリゴ糖を使用し、 上記の本発明の ポリペプチドに適した条件で反応を実施することにより、 オリゴ糖、 シクロデキ ス トリンを製造することができる。 この際、 目的とする産物に応じて反応条件を 適宜調整するのは当然のことである。 本発明の方法により得られるオリゴ糖とし ては、 例えばマルトース （G2) 〜マルトォクタオース （G8) のマルトオリゴ 糖が挙げられる。 また、 本発明の方法により得られるシクロデキストリンとして は α—シクロデキストリン、 j3—シクロデキストリン、 γ—シクロデキストリン が挙げられる。 実施例

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、 本発明は以下の実施 例のみに限定されるものではない。

また、 本明細書に記載の操作のうち、 プラスミ ド DNAの調製、 制限酵素消化 などの基本的な操作については上記のモレキュラー ·クローニング：ァ .ラボラ トリー 'マニュアル第 2版に記載の方法によった。 さらに、 以下に示す大腸菌を 用いたプラスミ ドの構築には、 特に記載の無い限り大腸菌 J Ml 09を宿主とし て使用した。 また、 形質転換された大腸菌は 100 μ gZm 1のアンピシリンを 含む LB培地 （トリプトン 1%、 酵母エキス 0. 5%、 Na C l 0. 5 %、 pH7. 0) 、 あるいは LB培地に 1. 5%の寒天を加え固化させた LBプレー トを用いて 37 °Cで好気的に培養した。

実施例 1 ダルコアミラーゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の

( 1) ピロコッカス ' フリオサス ゲノム DNAの調製

ピロコッカス . フリオサス DSM3638 (ドイツチェ .ザムルンク ' フォ ン · ミクロオルガニスメン ' ゥント ' ツェルクルツレン Gmb Hより購入） を以 下の方法で培養した。

トリプトン （ディフコラボラトリーズネ ± ) 1 %、 酵母エキス （ディフコラボ ラトリーズネ ±¾) 0. 5%、 可溶性デンプン （ナカライテスク社製） 1 %、 ジャ マリン S · ソリッド （ジャマリンラボラトリー社製） 3. 5%、 ジャマリン S ' リキッド （ジャマリンラボラトリー社製） 0. 5%、 Mg S O₄ 0. 00 3%、 N a C 1 0. 0 0 1 %、 F e S〇₄ · 7H₂ 〇 0. 000 1 %、 C o S O ₄ 0. 0 0 0 1 %、 C a C 1 ₂ · 7H₂ 〇 0. 000 1 %、 Z n S O ₄ 0. 0 0 0 1 %、 C u S 0₄ · 5H₂ O 0. 1 p pm、 KA 1 (S0₄ ) ₂ 0. 1 p pm、 H₃ B〇₃ 0. l p pm、 N a ₂ Mo 0₄ · 2Η₂ 0 0. l p pm、

N i C 1 ₂ · 6H₂ O 0. 2 5 p p mの組成の培地 2リットルを 2リツトノレ容 のメディゥムボトルにいれ、 1 2 0°C、 2 0分間殺菌した後、 窒素ガスを吹き込 み溶存酸素を除去した後、 これに上記菌株を接種して 9 5°C、 1 6時間静置培養 した後、 遠心分離により菌体を回収した。

つぎに、 得られた菌体を 2 5%スクロースを含む 5 OmM ト リス一 HC 1

(p H 8. 0) 4m lに懸濁し、 この懸濁液に 2m lの 0. 2M EDTA、 0. 8m lのリゾチーム （5mgZm l ) を加えて 20°C、 1時間保温した後、 24 m 1の S ET溶液 （ 1 5 OmM N a C l、 1 mM EDTA、 2 OmM トリ ス一 HC 1、 pH 8. 0) 、 4m lの 5%SD S、 400 μ \のプロティナーゼ K ( 1 Omg m 1 ) を加え、 さらに 3 7°C、 1時間保温した。 フエノールーク ロロホルム抽出を行って反応を停止した後、 エタノール沈殿を行ってゲノム DN Aを得た。

( 2 ) グノレコアミラ一ゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドする遺伝子を含む D N A断片の調製

ピロコッカス 'フリォサス ゲノムの塩基配列をもとにして、 配列表の配列番 号 3記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド a m 1 — F 1および配列表の 配列番号 4記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド AMY - 2 Nを合成し た。 この 2つのオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、 上記ゲノム DN Aを铸 型として P C R反応を行った。 PCR反応は、 タカラ EXタック （宝酒造社製） 添付のプロ トコールに従い、 94°Cで 0. 5分、 55°Cで 1分、 72。Cで 5分の 反応を 30サイクル行った。 この反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 約 3. 5 k bの増幅 DN A断片をゲルより抽出、 精製した。 この約 3. 5 k bの増幅 D N A断片の塩基配列を配列表の配列番号 5に示す。

(3) 組換えプラスミ ド p S J 3231の構築

上記 （2) で得られた約 3. 5 k bの増幅 DNA断片を Xb a Iおよび S p h

1 (ともに宝酒造社製） で消化してァガロースゲル電気泳動に供し、 目的の遺伝 子を含む約 2. 3 k bの DNA断片を抽出、 精製した。 一方、 プラスミ ドベクタ — p UC 19 (宝酒造社製） を X b a Iおよび S p h Iで消化し、 アル力リホス ファターゼ （宝酒造社製） により脱リン酸化処理した。 上記 2種の DNA断片を DNAリガ一ゼ （宝酒造社製） により連結後、 大腸菌 J Ml 09 (宝酒造社製） を形質転換した。 得られた形質転換体より数個を選択し、 各形質転換体に保持さ れるプラスミ ド DNAの挿入 DNA断片のサイズを確認し、 上記の約 2. 3 k b DNA断片を保持するプラスミ ドを精製した。 得られたプラスミ ド DNAの塩基 配列を決定し、 上記の約 3. 5 k bDN A断片に由来する、 配列表の配列番号 2 に記載の塩基配列の DNAを有するプラスミ ド p S J 3231を得た。 p S J 3

231を保持する大腸菌 JM109は Escherichia coli JM109/p S J 3 231と命名されている。 実施例 2 ポリペプチドの製造

(1) ポリペプチドの発現

実施例 1の （3) で作成した p S J 3231、 またはベクターコントロールと して用いた pUC 19を保持する大腸菌 J Ml 09をそれぞれ 100 g/ml のアンピシリンを含む 5m 1の LB培地に接種し、 37 °Cで好気的に一晩培養し た。 この培養液をそれぞれ新鮮な 20 m 1の同じ培地に 1 %ずっ植菌して 37 °C で好気的に培養し、 濁度が OD₆。。=0. 4〜0. 7に達した時点で終濃度 0. 2 mMとなるようにイソプロピル一 ]3— D—チォガラクトピラノシド （I PT G ；宝酒造社製） を加え、 更に一晩培養した。 培養終了後、 菌体を遠心分離して 集め、 0. 5 m 1の 50 mM酢酸ナトリゥム緩衝液 （ p H 5. 5) に懸濁し、 超 音波処理により破碎した後、 80°Cで 10分間処理した。 これを遠心分離して得 た上清をウルトラフリ一一 MC (ミリポア社製） で 20倍に濃縮し、 無細胞抽出 液として以下の活性測定に供した。

5 μ 1の無細胞抽出液を等量の 2 Xサンプル緩衝液 [ 125 mM T r i s -HC 1 (pH6. 8) 、 4% SDS、 20% グリセロール、 0. 005% ブロモフエノールブル一〕 と混合し、 分離ゲル中に 0. 1%可溶性デンプンを含 有する SDS—ポリアクリルアミ ドゲルにアプライして常法通り電気泳動を行つ た。 電気泳動終了後、 ゲルを 50mM 酢酸ナトリウム緩衝液 （pH5. 5) 中、 室温で 5分ずつ 3回洗浄し、 同緩衝液中、 80°〇で1. 5時間反応させた。 反応 終了後、 軽く水洗した後、 ヨウ素液 （10mM 1₂ 、 1% K I水溶液） でゲ ルを染色した。

その結果、 pUC l 9を保持する大腸菌 J Ml 09から調製した無細胞抽出液 ではデンプンの分解は見られなかったのに対して、 p S J 3231保持する大腸 菌 J M 109から調製した無細胞抽出液ではデンプンが分解された結果生じる透 明なバンドがゲル上に認められた。 I PTG非添加の試料に比べて 0. 2mM

I PTGを添加した試料においてこのバンドは強かった。

このこと力 ら、 p S J 3231を保持する大腸菌 J Ml 09において発現され たポリべプチドはデンプン分解活性を持つことが明らかになった。

( 2 ) 発現ポリぺプチドによるデンプン加水分解物の同定

検討に先立ち下記方法により発現ポリべプチド溶液を調製した。

p S J 3.231を保持する大腸菌 J Ml 09を 100 μ g/m 1のアンピシリ ンを含む 2 Om 1の LB培地に接種し、 37でで1晚培養した。 これを 1リット ルの上記培地に植菌し、 濁度が OD₆。_Q = 0. 5に達するまで 37 °Cで培養し、 終濃度 0. 2mMとなるように I PTGを加え、 更に一 B免培養した。 遠心によつ て集めた菌体を 40 m 1の 50 mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5. 5) に懸濁 し、 超音波破碎した後、 80°Cで 10分間処理し、 遠心して上清を得た。

こうして得た遠心上清に 60%飽和となるように硫酸アンモユウムを加え、 4でで 1晚攪拌した。 遠心によつて集めた沈殿を 1 m 1の上記酢酸緩衝液に溶解 し、 同緩衝液に対して透析した。 透析により生じた沈殿を 20 1の上記緩衝 液に懸濁し、 以下、 発現ポリぺプチド懸濁液として使用した。

発現したポリべプチドが有するデンプン加水分解活性の同定は下記方法により 行なった。 すなわち、 各種基質に発現ポリペプチド懸濁液を作用させ、 生成物を 薄層クロマトグラフィーにより同定した。

5% 可溶性デンプン （ナカライテスタ社製） 水溶液又は 5% アミロース （ナ 力ライテスクネ ± ) 水懸濁液 20 μ 1、 発現ポリペプチド懸濁液 20 μ 1、 50 0 mM酢酸ナトリゥム緩衝液 （ p H 5. 5) 10 μ 1及び水 50 μ 1を混合し、 80 °Cで 17時間反応させた。 反応液 2 μ 1をシリカゲル薄層クロマトグラフィ 一に供した。 薄層プレートはシリカゲル 60 F 254 (メルク社製） 、 展開溶媒 はエタノール： 1ーブタノール：水 =5 ： 5 ： 3を用いた。 展開後の薄層プレー トにオルシノール一硫酸試薬 [オルシノール （シグマ ¾ ) 400mgを 22. 8mlの硫酸に溶解し、 水を加えて 20 Omlとしたもの] 又は硝酸銀一アンモ ニァ試薬 (0. 1M硝酸銀と 5N アンモニア水の等量混合物） を噴霧し、 ホッ トプレートで加熱してスポットを観察し、 基質からの生成物を確認した。

その結果、 可溶性デンプンとアミロースのいずれの基質を用いた場合にも発現 ポリべプチドによってグルコースが生じた。 発現ポリぺプチドのみ及び基質のみ の対照実験ではダルコースは見られなかつた。

水素化ホウ素ナトリゥムで還元した基質を用いて上記と同様の反応を行った。 但し、 反応時間は 0時間、 1時間、 3時間、 5. 5時間、 23時間とした。 基質 の還元は以下の方法で行った； 20 Omgのデンプンまたはアミロースを 1 m 1 の水に懸濁し、 加熱して溶解させた後、 4. 5mlに希釈した。 この溶液を氷冷 し、 予め氷冷した 0. 5mlの 1. 5%水素化ホウ素ナトリウム水溶液を徐々に 加え、 25 °Cで 1時間反応させた。 0. lm 1のアセトンを加えて室温で 20分 間放置し、 1 N酢酸で中和したものを基質溶液として用レ、た。

この反応液に含まれる還元糖量をパーク アンド ジョンソン法で測定した。 すなわち、 10 μ 1の適宜希釈した反応液、 40 /X 1の水、 50 1の炭酸シァ ン化物溶液 （5. 3 gの炭酸ナトリウムと 0. 65 gのシアン化カリウムを 1リ ッ トルの水に溶解したもの） 、 および 50 μ 1の 0. 05% フェリシアン化力 リゥム水溶液を混合し、 沸騰湯浴中 15分間反応させた。 75 μ 1の反応液と 1 2 5 μ 1の鉄ミヨゥバン液 （1. 5 gの鉄ミョゥバンと l gの SD Sを 1リット ルの 0. 1 5 N硫酸に溶解したもの） を混合して 1 5分間室温で放置後、 6 9 0 nmの吸光度を測定した。 還元末端量は、 濃度既知のグルコースを用いて検量線 を作成し、 グルコース換算量として求めた。 また、 反応液に含まれるグルコース 量をグルコーステストヮコー （和光純薬社製） を用いて測定した。

その結果、 反応時間とともに還元糖及びグルコースは増加しており、 本発明の ポリぺプチドがダルコアミラーゼ活性を有することが示された。 実施例 3 ポリぺプチドの酵素学的性質

( 1 ) 粗抽出液の調製

p S J 3 2 3 1を保持する大腸菌 J Ml 0 9を 1 0 0 μ g/m 1のアンピシリ ンを含む 2 Om 1の LB培地に接種し、 3 7。じで1晚培養した。 これを 1リット ルの上記培地に植菌し、 濁度が OD₆。。=0. 5になるまで 3 7 °Cで振盪培養し、 終濃度 0. 2mMとなるように I PTGを加え、 更に 1晚培養した。 遠心によつ て集めた菌体を 7 5m 1の 5 OmM酢酸ナトリウム緩衝液 （pH 5. 5 ) に懸濁 し、 超音波破砕した。 超音波破砕液の遠心上清を 8 0°Cで 1 0分間処理し、 生じ た不溶物を遠心によって除去した。 この遠心上清に 6 0%飽和となるように硫酸 アンモニゥムを加え、 4 °Cで 5時間攪拌した後、 遠心によって沈殿を得た。 これ を 1 m 1の上記酢酸ナトリウム緩衝液に懸濁し、 同緩衝液に対して 1晚透析し、 遠心によって得た上清を粗抽出液として以後の実験に用いた。

(2) 反応温度依存性

実施例 3 _ ( 1 ) で調製した粗抽出液 1 0 μ 1にマルトトリオース （終濃度 1 %) 、 C a C 1 ₂ (同 1 mM) 及び上記酢酸ナトリゥム緩衝液 （同 5 0 mM) を加えて全量を 5 0 1 とした。 これを 40°C、 6 0°C、 7 0°C、 8 0°C、 8 5°C, 90 °C、 9 5 °C又は 1 00 °Cで 1時間反応させ、 反応液に含まれるダルコ 一ス量をグルコーステストヮコ一を用いて測定することにより本発明のポリぺプ チドのダルコアミラーゼ活性を測定した。 その結果、 本発明のポリペプチドのグ ルコアミラーゼ活性は 8 5〜 9 0 °Cで最大となつた。

この結果を図 1に示す。 すなわち図 1は反応温度と本発明のポリぺプチドのグ ルコアミラーゼ活性の関係を示す図であり、 横軸は反応温度 (°C) を、 縦軸はグ ルコアミラーゼ活性 （相対値、 ％) を示す。

(3) 反応 pH依存性

実施例 3 _ ( 1 ) で調製した粗抽出液 1 0 μ 1にマノレトトリオース （終濃度 1 %) 及び緩衝液 （酢酸ナトリウム、 ME S— N a OH、 リン酸ナトリウム、 T r i s—HC 1又はグリシン一 N a〇H；終濃度 5 OmM) を加え、 全量を 5 0 H 1 として 8 0°Cで 1時間反応させた。 緩衝液の pHは 80°Cで調整した。 反応 液に含まれるグルコース量をグルコーステストヮコ一を用いて測定することによ り本発明のポリぺプチドのダルコアミラーゼ活性を測定した。 その結果、 本発明 のポリぺプチドのダルコアミラ一ゼ活性は p H 5〜 6で最大となつた。

この結果を図 2に示す。 すなわち図 2は反応 p Hと本発明のポリぺプチドのグ ルコアミラーゼ活性の関係を示す図であり、 横軸は反応 p Hを、 縦軸はダルコア ミラーゼ活性 （相対値、 %) を示す。 図 2において白丸 （〇） は酢酸ナトリウム 緩衝液を、 黒丸 （鲁） は ME S— N a OH緩衝液を、 白四角 （口） はリン酸ナト リウム緩衝液を、 黒四角 （画） は T r i s— HC 1緩衝液を、 白三角 （△) はグ リシン一 N a OH緩衝液を示す。

(4) 熱安定性

実施例 3— ( 1 ) で調製した粗抽出液に、 等量の 5 0 mM酢酸ナトリゥム緩衝 液 （p H 5. 5) 、 2mM E D T Aを含む等量の同緩衝液又は 2 mM C a C 1 ₂を含む等量の同緩衝液を加え、 8 0°C又は 9 5°Cで 1、 5又は 2 4時間熱処 理を行った。 熱処理後の粗抽出液 3 0 μ 1にマルトトリオース （終濃度 1 %) 、 上記酢酸ナトリゥム緩衝液 （同 5 OmM) 及び C a C 1 ₂ (同 1 mM) を加えて 全量を 5 0 μ 1 とし、 8 0°Cで 1時間反応させた。 反応液に含まれるグルコース 量をグルコーステストヮコ一を用いて測定し、 熱処理を行っていない粗抽出液に 対する残存活性を求めた。 その結果、 8 0°Cでの熱処理を行った場合、 EDTA 非存在下では 24時間後も殆ど失活しなかつた。 9 5 °Cでの熱処理の熱処理を行 つた場合、 C a C 1 ₂非添加では 1時間の熱処理で大部分の活性が失われたのに 対して 1 mM C a C 1 ₂を添加すると 5時間の熱処理では失活が見られず、 2 4時間の熱処理後にも若干の残存活性が見られた。 この結果を図 3と図 4に示す。 すなわち図 3は 80°C、 図 4は 9 5°Cで熱処理 を行ったときの本発明のポリべプチドの残存ダルコアミラーゼ活性の関係を示す 図であり、 横軸は熱処理時間 （時間） を、 縦軸は残存ダルコアミラーゼ活性

(%) を示す。 図 3及び図 4において白丸 （〇） は EDTA及び C a C 1 ₂非添 加での熱処理を、 黒丸 （拿） は l mM EDTA添加熱処理を、 白四角 （口） は 1 mM C a C 1 ₂添加熱処理を示す。

また、 1 OmM C a C 1 ₂存在下、 上記と同様に 9 5°C、 24時間の熱処理 を行った後の残存活性を求めたところ、 ほぼ 1 0 0%の活性が保持されていた。

(5) _P H安定性

実施例 3— ( 1 ) で調製した粗抽出液 2 0 μ 1に 1 0 0 mM緩衝液 （酢酸ナト リゥム、 ME S— N a OH、 リン酸ナトリゥム、 T r i s— HC 1又はグリシン -N a OH) 2 0 μ \を加えて 8 0°Cで 1 0分間熱処理した。 熱処理後の粗抽出 液 3 0 μ 1にマルトトリオース （終濃度 1 %) 及び上記酢酸ナトリゥム緩衝液 (同 5 OmM) を加えて全量を 5 0 1とし、 8 0°Cで 1時間反応させた。 反応 液に含まれるグルコース量をグルコーステス トヮコーを用いて測定し、 熱処理を 行っていない粗抽出液に対する残存活性を求めた。 その結果、 p H 5〜9での熱 処理後に 5 0%以上の残存活性が得られた。

(6) 金属イオンの影響

実施例 3— ( 1 ) で調製した粗抽出液 1 0 1にマルトトリオース （終濃度 1 %) 、 酢酸ナトリウム緩衝液 （p H 5. 5、 終濃度 5 OmM) 及び C o C 1 ₂、 C a C l ₂、 C u S〇₄、 F e C l ₃、 Z n C l ₂、 Mg C l ₂又は EDTA (終濃 度 0、 0. 5、 1、 2又は 1 OmM) を加え、 全量を 5 0 μ 1として 8 0 °Cで 1 時間反応させた。 反応液に含まれるグルコース量をグルコーステストヮコ一を用 いて測定することにより本発明のポリぺプチドのダルコアミラーゼ活性を測定し た。 その結果、 本発明のポリペプチドのダルコアミラーゼ活性は 0. 5、 1、 2 又は 1 OmMの C o C 1 ₂、 C a C l ₂、 F e C 1 ₃及び M g C 1 ₂によっては顕 著な影響を受けず、 2mMの C u S0₄、 Z n C l ₂及び 0. 5mMの EDTA によって完全に阻害された。

この結果を図 5に示す。 すなわち図 5は金属ィオン又は E D T Aの濃度と本発 明のポリぺプチドのダルコアミラーゼ活性の関係を示す図であり、 横軸は添加し た金属イオン又は EDT Aの濃度を、 縦軸はダルコアミラーゼ活性 （相対 値、 ％) を示す。 図 5において白丸 （〇） は CoC l ₂添加を、 黒丸 （書） はじ a C 1₂添加を、 白四角 （口） は Cu S0₄添加を、 黒四角 （酾） は F e C l ₃添 加を、 白三角 （△) は ZnC l ₂添加を、 黒三角 （▲) は MgC l ₂添加を、 ァ ステリスク （*) は EDTA添加を示す。 実施例 4 変異型ポリぺプチドの性質

( 1 ) 組換えプラスミ ド p E T 21 a m y C Δ Sの構築

配列表の配列番号 8記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド P X 253

- 01及び配列表の配列番号 9記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド R 4を合成した。 この 2つのオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、 p S J 32 31を铸型として PC R反応を行った。 PCR反応はタカラ EXタック添付のプ ロトコールに従い、 94°Cで 0. 5分、 55°Cで 0. 5分、 72°Cで 2分の反応 を 30サイクル行った。 エタノール沈殿によってこの反応液から DNAを回収し、

Nc o lと E c oR I (共に宝酒造社製） で消化した後、 ァガロースゲル電気泳 動に供して約 1. 0 k bの DNA断片をゲルより抽出、 精製した。 こうして得ら れた DN A断片と、 Nc o lと E c oR Iで消化した p ET 21 d (ノバジェン 社製） を T 4 D N Aリガーゼで連結し、 大腸菌 J M 109を形質転換した。 得 られた形質転換体からプラスミ ドを調製し、 pRH03を得た。 pRH03には 上記の約 1. O k b DNA断片が挿入されており、 塩基配列を決定したところ、 N c o I認識部位である C CAT GG配列に続いて、 配列表の配列番号 7記載の 塩基配列の 2番目のじから 1048番目の Cまでを含んでいた。

実施例 1— (2) で調製した約 3. 5 k bの増幅 DNA断片を A f 1 I Iと S a c I (ともに宝酒造社製） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動に供して約 1.

8 k bの DNA断片をゲルより抽出、 精製した。 この DNA断片と、 Af 1 I I と S a c Iで消化した pRH03を T4 DNAリガーゼで連結し、 大腸菌 J M 109を形質転換した。 得られた形質転換体からプラスミ ドを調製し、 pET2 1 amyCASを得た。 pET21 amyCASの塩基配列を決定したところ、 本ブラスミ ドは配列表の配列番号 7記載の塩基配列で示されるポリヌクレオチド を有し、 該塩基配列は配列表の配列番号 6記载のァミノ酸配列のァミノ酸配列で 示されるポリペプチドをコードしていた。

(2) 変異型ポリペプチド発現プラスミ ドの構築

配列表の配列番号 1記載のァミノ酸配列 配列表の配列番号 10記載の塩基配 列で示されるオリゴヌクレオチド F 206 S— F、 配列表の配列番号 1 1記載の 塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド F 206 S— R、 配列表の配列番号 12 記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド P 142 I— F、 配列表の配列番 号 13記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド P 142 I— R、 配列表の 配列番号 14記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド L 337V— F、 配 列表の配列番号 1 5記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド L 337 V— R、 配列表の配列番号 16記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド F 2、 配列表の配列番号 1 7記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド F 3、 配列 表の配列番号 18記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド AN 2— R 1 F 2、 配列表の配列番号 19記載の塩基配列で示されるォリゴヌクレオチド R 5、 配列表の配列番号 20記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド R 6を合成 した。

p S J 3231を铸型とし、 表 1に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとし て PCR反応を行った。 PCR反応はタカラ EXタック添付のプロトコールに従 レ、、 94。じで0. 5分、 55°Cで 0. 5分、 72°Cで 1分の反応を 20サイクル 行った。 これらの PCR反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 表 1の分子鎖 長の行に示した分子鎖長の DN A断片をゲルより抽出、 精製した。 反応名 F S-F F S-R P I -F P I -R L V-F LV-R

F 260 F 206 P 142 P 142 L 337 L 337 プライマー 1

S-F S-R I一 F I一 R V-F V-R

AN 2一

プライマー 2 R 5 F 2 R 6 R4 F 3

R 1 F 2 分子鎖長

約 400 約 260 約 290 約 260 約 300 約 350 (b p)

以上のようにして精製した増幅 DN A断片を铸型として用レ、、 表 2に示す とプライマーの組み合わせで更に PC R反応を行った。 表 2における 「铸型 1J 及び 「铸型 2」 は表 1の 「反応名」 に対応し、 表 1の各反応に由来する DN A断 片を表 2の反応において铸型として使用したことを示す。 PCR反応はタカラ E Xタック添付のプロトコールに従い、 94°Cで 0. 5分、 55°Cで 0. 5分、 7 2°Cで 1分の反応を 10サイクル行った。 これらの PCR反応液をァガロースゲ ル電気泳動に供し、 表 2の分子鎖長の行に示した分子鎖長の DN A断片をゲルよ り抽出、 精製した。 表 2 反応名 F S P I L V 羅 1 F S-F P I -F L V-F 醒 2 F S-R P I一 R LV-R プライマー 1 F 2 AN 2 -R 1 F 2 F 3 プライマー 2 R 5 R 6 R4 分子鎖長（b p) 約 650 約 530 約 640 表 2の反応 F S由来の DNA断片を A f 1 I Iと Nd e I (宝酒造社製） で消 化してァガロースゲル電気泳動に供し、 約 320 b pの DNA断片をゲルより抽 出、 精製した。 本断片と、 A f 1 I Iと Nd e Iで消化した p ET21 amy C 厶 Sを T4 DNAリガーゼで連結し、 大腸菌 J M 109を形質転換した。 得ら れた形質転換体からブラスミ ドを調製し、 p amyCAS— F 206 Sを得た。 p amy CA S-F 206 Sの D N A塩基配列を決定したところ、 本プラスミ ド は配列表の配列番号 6のァミノ酸配列で示されるポリぺプチドの 187番目 （配 列表の配列番号 1のアミノ酸配列の 206番目に相当する） の Ph eが S e rで 置換されたポリペプチドをコードしていることが明らかになった。 この変異ポリ ペプチドを F 206 Sと称する。

表 2の反応 P I由来の DNA断片を B a 1 I (宝酒造社製） と A f 1 I Iで消 ィ匕してァガロースゲル電気泳動に供し、 約 280 b pの DNA断片をゲルより抽 出、 精製した。 本断片と、 B a 1 Iと A f 1 I Iで消化した p ET21 amy C 厶 Sを T4 DNAリガーゼで連結し、 大腸菌 J M 109を形質転換した。 得ら れた形質転換体からプラスミ ドを調製し、 p amyCAS— P 142 Iを得た。 p amy CA S-P 142 Iの D N A塩基配列を決定したところ、 本プラスミ ド は配列表の配列番号 6のァミノ酸配列で示されるポリべプチドの 123番目 （配 列表の配列番号 1のアミノ酸配列の 142番目に相当する） の P r oが I 1 eで 置換されたポリべプチドをコ一ドしていることが明らかになった。 この変異ポリ ぺプチドを P 142 I と称する。

表 2の反応 LV由来の DNA断片を Nd e Iと E c oR Iで消化してァガロー スゲル電気泳動に供し、 約 1 70 b pの DNA断片をゲルより抽出、 精製した。 本断片と、 Nd e lと E c oR Iで消化した pET21 amyCASを T4 D N Aリガーゼで連結し、 大腸菌 J M 109を形質転換した。 得られた形質転換体 からプラスミドを調製し、 p amy C Δ S— L 337 Vを得た。 p amyCAS -L 337 Vの DNA塩基配列を決定したところ、 本プラスミ ドは配列表の配列 番号 6のァミノ酸配列で示されるポリぺプチドの 318番目 （配列表の配列番号 1のアミノ酸配列の 337番目に相当する） の L e uが V a 1で置換されたポリ ぺプチドをコ一ドしていることが明らかになった。 この変異ポリぺプチドを L 3 37 Vと称する。 (3) 野生型及び変異型ポリペプチドの製造

pET21 amyCAS、 p a m y C厶 S— F 206 S、 p amyCA S— P

142 I又は p amyCAS— L 337Vで大腸菌 BL21 (DE 3) (ノバジ ェン社製） を形質転換した。 得られた形質転換体を 100 μ gZm 1のアンピシ リンを含む 20mlの LB培地に接種し、 37 °Cで好気的に 1晚培養した。 培養 終了後、 菌体を遠心によって集め、 0. 8 m 1の 50 mM酢酸ナトリゥム緩種 ϊ液 (ρΗ5. 5) に懸濁し、 超音波処理によって破砕した後、 80°Cで 30分間処 理した。 これを遠心分離して得た上清を粗抽出液とした。 以下、 pET21 am yCA S、 p amy CAS-F 206 S, p a m y C Δ S— P 142 I及び p a myCA S— L 337 Vで形質転換された大腸菌 BL21 (DE 3) 由来の粗抽 出液を順に粗抽出液 WT、 粗抽出液 F 206 S、 粗抽出液 P 142 1及び粗抽出 液し 337 Vと呼ぶ。

( 4 ) 野生型及び変異型ポリぺプチドによるマルトオリゴ糖の分解

実施例 4一 （ 3 ) で得た各粗抽出液 5 μ 1にマルト トリオース （終濃度 1 %) 、 酢酸ナトリウム緩衝液 （ρΗ5. 5、 終濃度 50mM) 及び C a C 1₂ (終濃度 1 mM) を加え、 全量を 50 μ 1として 80°Cで 1時間反応させた。 反応液に含 まれるグルコース量をグルコーステストヮコ一を用いて測定することにより各粗 抽出液中に含まれる本発明のポリぺプチドのダルコアミラーゼ活性を測定した。 その結果、 粗抽出¾WTのダルコアミラーゼ活性を 1とした時、 粗抽出液 F 20 6 Sでは 2. 08、 抽出液 P 142 Iでは 0. 55、 粗抽出液 L 337 Vでは 0.

30であった。

マルト トリオースの代わりにマルトペンタオースを用いて上記と同様の反応を 行った。 その結果、 粗抽出液 WTのダルコアミラーゼ活性を 1とした時、 粗抽出 液 F 206 Sでは 1. 92、 抽出液 P 142 Iでは 0. 53、 粗抽出液 L 337 Vでは 0. 37であった。

マルトペンタオースを基質として用いた上記反応液 35 μ 1に 65 μ 1のァセ トニトリルを加えて混合し、 遠心によって不溶物を除いた。 この試料に含まれる ォリゴ糖組成をパルパックタイプ S (宝酒造ネ： t ) を用いた順相 H PLCで分析 した。 移動相には 65%ァセトニトリル水溶液を用い、 流速は lml 分、 カラ ム温度は 40°Cとし、 ショーデックス R I— 7 1示差屈折計 （昭和電工ネ±¾) で 検出した。 0. 1 %のグルコース （ナカライテスタネ ±0) 、 マノレト一ス、 マルト トリオ一ス、 マルトペンタオース又はマルトへプタオース （以上、 生化学工業社 製） 水溶液 3 5 μ 1にァセトニトリル 6 5 μ 1を加えて遠心した上清を標準物質 として用いた。 標準物質の保持時間は以下の通りであった。 グルコース ： 5. 6 分、 マルトース ： 7. 3分、 マノレトトリオ一ス ： 9. 7分、 マノレトペンタォー ス ： 1 7. 8分、 マルトへプタオース ： 30. 7分。 その結果、 各粗抽出液をマ ノレトペンタオースに作用させた場合、 重合度:！〜 8のマルトオリゴ糖が生成して いることが明らかになった。 この結果を図 6に示す。 すなわち図 6は各粗抽出液 をマルトペンタオースに作用させたときの生成物の組成を示す図であり、 横軸は 生成物 （G 1 ： グルコース、 G 2 ：マルトース、 G 3 ：マルト トリオース、 G 4 ：マルトテトラオース、 G 6 ：マゾレトへキサオース、 G 7 ：マルトへプタオ一 ス、 G 8 ：マルトォクタオース） を、 縦軸は反応液中の生成物の濃度 （ダルコ一 ス換算、 μΜ) を示す。 図 6において白丸 （〇） は粗抽出液 WTを、 黒丸 （秦） は粗抽出液 F 206 Sを、 白四角 （口） は粗抽出液 Ρ 1 4 2 Iを、 黒四角 （讕） は粗抽出液 L 3 3 7 Vを示す。 なお、 上記の HP LCにおいて得られたダルコ一 スの生成量は、 グルコーステストヮコ一を使用して得られた結果と一致しない。 これは上記 H P L Cはグルコースの溶出位置に溶媒由来のピークが出現し、 ダル コースの測定値に誤差が生じているためと考えられる。

(5) 野生型及び変異型ポリペプチドによるデンプンの分解

特開平 7— 1 4 3 8 8 0 「超耐熱性ひ一アミラーゼ遺伝子」 の実施例 3に記載 の方法で超耐熱性ひ—アミラーゼ標品を調製した。 粗抽出液 F 2 0 6 S及び超耐 熱性 α—アミラーゼ標品を各々、 反応①では 40 μ 1 と 0 μ し 反応②では 30 μ 1 と 1 0 1、 反応③では 20 μ 1 と 2 0 μ 1、 反応④では 1 0 μ 1と 3 0 / 1、 反応⑤では 0 1 と 40 1使用し、 可溶性デンプン （ナカライテスク 、 終濃度 2%) 、 酢酸ナトリウム緩衝液 (p H 5. 5、 終濃度 5 0mM) 及び C a C 1 ₂ (終濃度 1 πιΜ) を加え、 全量を 2 00 μ 1 として 80°Cで 1晚反応させ た。 これらの反応液中のオリゴ糖を実施例 4 _ (4) に記載の順相 HP LCを用 いた方法で分析した。 その結果、 通常のアルコール発酵用酵母が発酵可能なダル コース、 マルトース、 マルト トリオースの濃度 （グルコース換算） の和は、 超耐 熱性 α—ァミラーゼ標品又は粗抽出液 F 20 6 Sを単独で使用した場合に比べて 両酵素を併用した場合の方が大きくなつた。 この結果を図 7に示す。 すなわち図 7は各粗抽出液を可溶性デンプンに作用させたときの生成物の組成を示す図であ り、 横軸は生成物 （G 5 ：マルトペンタオース、 他は図 6と同じ） を、 縦軸は反 応液中の生成物の濃度 （グルコース換算、 μΜ) を示す。 図 7において、 白丸 (〇） は反応①、 白三角 （△) は反応②、 白四角 （口） は反応③、 黒三角 （Α) は 1反応④、 黒丸 （暴） は反応⑤を示す。

( 6 ) 本発明のポリぺプチドのシクロデキストリン合成活十生

実施例 4— ( 5 ) の反応①の反応液 5 0 μ 1に A s p e r g i l l u s n i v e u s由来ダルコアミラーゼ （生化学工業社製） 2単位を加え、 3 7°Cで 3時 間反応させた。 この反応液を実施例 4— (4) に記載の順相 HP LCを用いた方 法で分析したところ、 ct—シクロデキストリン （以下 CDと略す） 、 β— CO及 び CD (以上、 生化学工業社製） と同一の保持時間を示すピークが見られた。 a— CDの保持時間は 1 2. 3分、 一 C Dの保持時間は 1 5. 2分、 CD の保持時間は 1 9. 7分であった。 これらを分取し、 トリプルステージ四重極型 質量分析装置 A P 1 3 0 0 (パーキン一エルマ一 ·サイエックス社製） を用いて 正イオンモードで質量分析を行った。 その結果、 各々のピーク由来の試料は α―、

0 _及び Y—CDと同一のマススペク トルを示した。 よって、 粗抽出液 F 2 0 6 Sに含まれる本発明のポリぺプチドは CD合成活性を有することが明らかになつ た。

( 7) 2重変異型ポリぺプチド発現ブラスミ ドの構築

p a my C A S— F 2 0 6 Sを P s t I (宝酒造 ¾ ) と A f 1 I Iで消化し た後にァガロースゲル電気泳動に供し、 ゲルから約 3. l k bの DNA断片を抽 出、 精製して DN A 1を得た。 p a my C A S— P 1 4 2 Iを P s t lと A f l

1 Iで？肖化した後にァガロースゲル電気泳動に供し、 ゲルから約 4. 6 1^ 1)の13 NA断片を抽出、 精製して DNA2を得た。 p a my C厶 S— F 20 6 Sを P s t Iと N d e Iで消化した後にァガロースゲル電気泳動に供し、 ゲルから約 4. 9 k bの DNA断片を抽出、 精製して DNA 3を得た。 p a my C A S— L 3 3 7 を s t Iと Nd e Iで消化した後にァガロースゲル電気泳動に供し、 ゲル から約 2. 8 k bの DNA断片を抽出、 精製して DN A 4を得た。

DNA 1と DNA2を T4 DNAリガーゼで連結し、 大腸菌 HB 1 0 1 (宝 酒造社製） を形質転換し、 形質転換体からプラスミ ド p amy C A S— F 2 0 6 S/P 1 4 2 Iを得た。 p a my C A S— F 2 0 6 S/P 1 4 2 Iの DNA塩基 配列を決定したところ、 本プラスミドは配列表の配列番号 6のァミノ酸配列で示 されるポリペプチドの 1 8 7番目の P h eが S e rで、 また 1 2 3番目の P r o が I 1 eで置換されたポリペプチドをコードしていることが明らかになった。 こ の変異ポリペプチドを F SZP Iと称する。

DNA 3と DNA4を T 4 D N Aリガーゼで連結し、 大腸菌 H B 1 0 1を 形質転換し、 形質転換体からプラスミ ド p amy C A S— F 20 6 S/L 3 3 7 Vを得た。 p a my C A S— F 2 0 6 S/L 3 3 7 Vの DNA塩基配列を決定し たところ、 本プラスミ ドは配列表の配列番号 6のアミノ酸配列で示されるポリべ プチドの 1 8 7番目の P h eが S e rで、 また 3 1 8番目の L e uが V a 1で置 換されたポリペプチドをコードしていることが明らかになった。 この変異ポリべ

(8) 2重変異型ポリペプチドの性質

p a my C A S -F 2 0 6 S/P 1 4 2 I又は p a my C A S— F 2 0 6 SZ L 3 3 7 Vで大腸菌 B L 2 1 (DE 3) を形質転換した。 形質転換体から実施例 4— (3) と同様の方法で粗抽出液 F SZP I及び粗抽出液 F SZLVを得た。 実施例 4— (3) で調製した粗抽出液 WT、 粗抽出液 F 2 0 6 S又は上記の粗 抽出液 F SZP I、 粗抽出液 F S/LV 2 0 μ \に可溶性デンプン （終濃度 2 %) 、 酢酸ナトリゥム緩衝液 （ ρ Η 5. 5、 終濃度 5 0 mM) 及び C a C 1 ₂ (終濃度 1 mM) を加え、 全量を 1 0 0 μ 1 として 8 0°Cで 1晚反応させた。 こ れらの反応液中のオリゴ糖を実施例 4一 （4) に記載の順相 HP LCを用いた方 法で分析した。 その結果、 グルコース、 マルトース、 マルトトリオースの濃度

(グルコース換算） の和は、 粗抽出液 WTを使用した場合を 1とすると、 粗抽出 液 F 2 06 Sを使用した場合には 2. 2 2、 粗抽出液 F S / P Iを使用した場合 には 2. 2 2、 粗抽出液 F S/LVを使用した場合には 2. 7 9であった。 また、 生成した CDの組成は、 粗抽出液 WTを使用した場合には γ— CDが /3 — CDの約 1Z2であったのに対して、 粗抽出液 F 2 0 6 Sを使用した場合と粗 抽出液 F S/LVを使用した場合には γ— CDと ]3— CDがほぼ等量、 粗抽出液 F SZP Iを使用した場合には Y—CDが ]3— CDの約 1. 7倍であった。 この 結果を表 3に示す。

生成量 （μΜ)

粗抽出液

/3 -CD γ -CD

WT 2 2 0 1 0 3

F 2 0 6 S 2 9 2 2 94

F S/P I 2 2 7 3 8 6

F S/LV 3 7 9 3 6 3

産業上の利用の可能性

本発明によって、 グルコアミラーゼ活性を有するポリぺプチドが提供される。 本発明のポリペプチドは高い耐熱性を有し、 デンプンを効率良く分解することが できる。 また、 本発明のポリペプチドと高度好熱菌由来の _α—アミラーゼと併用 することによりデンプンから効率良くグルコースを製造することができ、 ノくィォ マスの利用が容易になる。 配列表フリーテキスト

SEQ ID NO: 3： PCR primer ami- Fl for amplifying a gene encoding a polypeptide having a glucoamylase activity from Pyrococcus furiosus.

SEQ ID NO: 4 PCR primer AMY-2N for amplifying a gene encoding a polypeptide having a glucoamylase activity from Pyrococcus furiosus.

SEQ ID NO: 8: PCR primer PX253 - 01. SEQ ID NO：9： PCR primer R4.

SEQ ID NO: 10: PCR primer 206S-F. SEQ ID NO: 11: PCR primer F206S- R. SEQ ID NO: 12: PCR primer P142I-F. SEQ ID NO: 13: PCR primer P142I-R. SEQ ID NO: 14: PCR primer L337V-F. SEQ ID NO: 15: PCR primer L337V-R. SEQ ID NO: 16: PCR primer F2.

SEQ ID NO: 17: PCR primer F3.

10 SEQ ID NO: 18: PCR priraerAN2-RlF2.

SEQ ID NO :19: PCR primer R5.

SEQ ID NO :20: PCR primer R6.

Claims

請 求 の 範 囲

1. 配列表の配列番号 6記载のァミノ酸配列、 または該配列において 1個以上 のアミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入もしくは置換の少なくとも 1つを有するアミ ノ酸配列で示され、 かつ耐熱性ダルコアミラ一ゼ活性を示すポリぺプチド。

2. 請求項 1記載のポリペプチドをコードする核酸。

3. 配列表の配列番号 7記載の塩基配列を有することを特徴とする請求項 2記 載の核酸。

4. 請求項 2または請求項 3記載の核酸にストリンジェントな条件でハイブリ ダイズ可能であり、 かつ耐熱性ダルコアミラ一ゼ活性を示すポリぺプチドをコ一 ドする核酸。

5. 請求項 2〜4いずれか 1項に記載の核酸を含んでなる組換え DNA。

6. 請求項 5記載の組換え D N Aにより形質転換されてなる形質転換体。

7. 請求項 6記載の形質転換体を培養し、 該培養物中より耐熱性ダルコアミラ ーゼ活性を有するポリぺプチドを採取することを特徴とする請求項 1のポリぺプ チドの製造方法。

8. α-1, 4結合を介した D—ダルコビラノースの重合体に、 請求項 1記載 のポリぺプチドを作用させてグルコースを遊離させることを特徴とするダルコ一 スの製造方法。

9. α-1, 4結合を介した D—ダルコビラノースの重合体に、 請求項 1記載 のポリべプチドを作用させてオリゴ糖を生成させることを特徴とするオリゴ糖の 製造方法。

10. α-1, 4結合を介した D—ダルコビラノースの重合体に、 請求項 1記 載のポリペプチドを作用させてシクロデキストリンを生成させることを特徴とす るシクロデキストリンの製造方法。