WO2000078362A2 - Stabile radioaktiv markierte nanopartikel, verfahren zur herstellung und ihrer verwendung - Google Patents

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    • G21K5/00—Irradiation devices

Definitions

  • the present invention relates to stable radioactively labeled nanoparticles, a process for their preparation and their use for medical and diagnostic purposes.
  • radioactive material e.g. particle size and distribution
  • the production of monodisperse particles in the lower nanometer range is almost impossible.
  • Another possibility is e.g. the production of non-radioactive polymer, radioactive labeling by irradiation and subsequent production of nanoparticles, for example using the spinning disk method.
  • the disadvantage of this method is that the polymer partially decomposes by irradiation and the decomposition products that have to be removed have to be removed.
  • no particles in the nanometer range can be produced with this method (Lit.
  • radioactive labeled styrene and divinylbenzene microparticles are available labeled with a range of radionuclides. According to the manufacturer (NEN), however, it is not possible to produce particles in the nanometer range. Subsequent labeling of particles with radioactive iodine is also known (US Pat. No. 4,010,250). The method described here relates in particular to the marking of polyvinyl latex particles with a size of 2.02 and 0.37 ⁇ m. The disadvantage of the particles produced in this way is that the radioactivity is not bound very stably and the radioactivity can be washed out easily (Lit. J Pharm
  • WO 90/03803 describes a method for producing a radioactively labeled composition which is particularly suitable for lung scintigraphy.
  • the composition described contains radioactively labeled particles based on silica gel, aluminum silicate or other silicates.
  • Organic ligands which contain, for example, thiol, amino, alkylamino or dithiocarbamate groups are covalently bonded to the surface of these particles.
  • the particles have an average diameter of 1 to 20 ⁇ m.
  • the present invention solves this problem and relates to radioactively labeled nanoparticles with a size in the range from 10 to 1000 nm, in particular 10 nm to 300 nm, particularly preferably 30 nm to 150 nm, in which a radioactive molecule is covalently bound to a nanoparticle, and a process for
  • a wide variety of nanoparticles but also microparticles can be subsequently marked by covalent attachment of a radioactive molecule.
  • a comparatively small amount of the soluble radioactive markers can be used here and nevertheless good marking intensities can be achieved.
  • a nanoparticle is reacted with a radioactively labeled molecule in an aqueous medium, the radioactively labeled molecule being covalently bound to the nanoparticle.
  • polymers are copolymers derived from styrene and acrylic acid and / or methacrylic acid, from styrene and divinylbenzene, from styrene and butadiene.
  • a copolymer of styrene and acrylic acid was preferably used.
  • the use has the advantage that these particles are commercially and cheaply available. Furthermore, they are inert and insoluble in the most media, stable and toxicologically safe and the particles are spherical.
  • the surface of the nanoparticle can optionally with one or more functional groups, such as sulfate -0-S0 3 H, carboxylic acid (-COOH), aliphatic or aromatic amine (-NH 2 ), aldehyde (-CHO), hydroxyl (-OH) , Sulfonate (-S0 3 ), chloromethyl (-CH 2 -CI), chlorobenzyl (-C 6 H 5 -CH 2 -CI) bromomethyl (-CH 2 -Br), iodomethyl (-CH 2 -I), hydrazide ( -CONH-NH 2 ) or an epoxy group, which can be achieved, for example, by adding suitable monomers with corresponding functional groups during the polymerization (for example vinylbenzyl chloride for a chloromethyl group).
  • These functional groups can be further derivatized or modified.
  • a carboxy-modified particle can be converted into an amino-modified particle by coupling a diamine.
  • the marker is linked to the particles by coupling to suitable functional groups of the nanoparticle.
  • These functional groups are either already present in the nanoparticles by copolymerization with appropriate monomers which carry suitable functional groups, or have been formed by subsequent modification of these functional groups.
  • radioactively labeled molecules can be mentioned here, for example: primary, aliphatic amines for coupling radioactive alkyl halides, of acids, e.g. Acetic acid or for coupling aldehydes e.g.
  • Formaldehyde, acetaldehyde or other aldehydes This also includes optional subsequent stabilization from imine to amine by reduction.
  • Chloromethyl (vinylbenzyl chloride) for binding radioactive amines e.g.
  • Epoxy groups for binding radioactive amines e.g. methylamine or other radioactive nucleophiles.
  • Hydrazides for binding radioactive aldehydes or acids for binding radioactive aldehydes or acids.
  • Chloro, bromo or iodomethyl groups for binding radioactive thiols Chloro, bromo or iodomethyl groups for binding radioactive thiols
  • markers for the method according to the invention are e.g. Ag 110, C 14, Cd 109, Cs 137, Ca 47, Cl 36, Cr 51, Co 57, Fe 55, Fe 59, Ga 153, In
  • C14 a very short-lived spotlight that is very stable, in comparison e.g. to bromine, which has a short half-life and therefore cannot be stored for a long time.
  • Stable, long-life radiators with a minimum physical half-life of 14 days are particularly suitable for the purposes of the invention.
  • the surface of the nanoparticle is modified with at least one functional group, so that there is the possibility of coupling further ligands to the nanoparticle.
  • functional groups are: sulfate (-S0 4 ) or carboxylic acid group (-COOH), aliphatic amine group, such as -CH 2 -NH 2 , aromatic
  • Amine group such as -C 6 H 4 -NH 2 , amide residue (-CONH 2 ), aldehyde group (-CHO), hydroxyl- (-OH) or sulfonate group (-S0 3 H), chloromethyl- (-CH 2 CI), chlorobenzyl (-C 6 H 4 - CH 2 -CI), hydrazide (-CONH-NH 2 ) or epoxy residues.
  • the connection of such additional ligands can take place before, after or simultaneously with the connection of the radioactive molecule to the nanoparticle.
  • radioactively labeled particles include, for example, to name just a few: antigens, antibodies,
  • the corresponding nanoparticles are placed in an aqueous solution in which an excess of sulfo-NHS (N-hydroxysuccinimide-3-sulfonic acid salt, Aldrich) is preferably dissolved.
  • sulfo-NHS N-hydroxysuccinimide-3-sulfonic acid salt, Aldrich
  • the sulfo-NHS serves as a catalyst and prevents the particles from agglomerating.
  • the radioactively labeled molecule is added to this mixture, e.g. C14 labeled methylamine.
  • the pH value is adjusted with phosphate buffer so that it is in the slightly acidic range (pH ⁇ 7).
  • a carbodiimide or dissolved in distilled water is added to the reaction solution
  • Uronium salt added.
  • the carbodiimide is preferably added in excess.
  • Coupling reagents can be used. After the reaction has ended (a few hours), the particles are ultrafiltered and washed with distilled water until the free (unbound) radioactivity has been washed out. With the method according to the invention, radioactive nanoparticles with a specific activity of 1 to 100 ⁇ Ci / mg are obtained. By choosing suitable radioactive markers with appropriate radioactivity and choosing the appropriate nanoparticles with a suitable number of free functional groups, it is possible to precisely adjust the specific activity of the radioactively labeled particles obtained.
  • part of the particles is incubated for 24 hours in artificial gastric juice (0.1 M HCl) at 37 ° C., separated by ultrafiltration and the free radioactivity in the filtrate is determined.
  • the free radioactivity of the particles produced by the method according to the invention is only 0.1 to 2% according to this test. After incubation of the particles in artificial intestinal juice for 24 hours, the free activity of the radioactive particles is in the range from 0.1 to 2%.
  • the particles are already commercially available in various sizes and very narrow size distributions or with different surface modifications, i.e. elaborate manufacturing techniques are eliminated. 2)
  • the non-radioactive particles can be comprehensively characterized (e.g. with radioactive material it is difficult to measure the particle size distribution using photon correlation spectroscopy, as this could contaminate the device).
  • the surfaces of the particles can be modified (e.g. positively, negatively or zwitterionically charged).
  • different markings can be made (e.g. C14, tritium, S35, etc.).
  • radioactively labeled nanoparticles according to the invention can be used in particular where uniform particle size distribution, high sensitivity and fast, simple evaluation are important, such as:
  • diagnostics based on micro or nanoparticles e.g. latex agglutination tests, particle sandwich tests, micro-injectable markers, lung absorption, scintigraphy, aerosol characterization, examination of mucociliary transport, blood flow tests, tumor therapy and radiotherapy Diagnosis, as well as in in vivo and in vitro diagnosis, for example in agglutination assays or in assays by quantifying immobilization of nanoparticles.
  • the particles are ultrafiltered (Amicon ultrafiltration cell) and washed with distilled water until the free (unbound) radioactivity is washed out. Radioactive polystyrene particles with a specific activity of approx. 8 ⁇ Ci / mg are obtained.
  • Test solution has a pH of approx. 1.2.
  • Methylamine and non-radioactive labeled nanoparticles are added in a concentration that corresponds to the concentration in the radioactive labeled nanoparticles.
  • An aliquot of [14C] polystyrene nanoparticles of appropriate concentration in phosphate buffer is prepared as a control.
  • Each sample is incubated at 37 ° C in a shaking water bath for 4 h. After 1 h and after 4 h, 2 ml of each sample are removed, centrifuged and the supernatant removed. The supernatant is ultrafiltered (Centrifree Micropartition) to determine the concentration of free [14C] methylamine in each sample. The radioactivity is determined in the supernatant and in the resulting pellet for each sample.
  • the amount of radioactivity is determined in each of the above samples.
  • Example 5 Elimination behavior of [14C] polystyrene nanoparticles after oral administration
  • mice Five male rats (group 1) each received an oral single dose of 20 mg / kg of [14C] polystyrene nanoparticles as a suspension in phosphate buffer pH 7.5. The animals were given no food about 4 hours before and after the nanoparticle administration. The test animals are placed individually in a glass metabolism cage, and the sampling is carried out according to the scheme described in Example 4. The measurement of the radioactivity in the breathing air was dispensed with, since the previous experiment (Example 4) had shown that the particles are radioactively labeled so stably that no significant amounts of radioactivity are exhaled. In each of the above The amount of radioactivity is determined in samples. In addition, a further six male rats were given an oral single dose of 20 mg / kg of [14C] polystyrene nanoparticles as a suspension in phosphate buffer pH 7.5. The test animals are individually placed in a metabolism cage
  • Polypropylene and stainless steel set 1h, 2h, 4h, 6h, 12h and 24 h after administration of nanoparticles, one animal is killed by CO 2 anesthesia, blood and tissue are collected and the amount of radioactivity in the samples is determined.

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Abstract

Stabiler radioaktiver Nanopartikel sowie Verfahren zu seiner Herstellung, wobei ein Nanopartikel mit einem radioaktiv markierten Molekül, insbesondere in einem wässrigen Medium, umgesetzt wird und eine kovalente Anbindung des radioaktiv markierten Moleküls an den Nanopartikel erfolgt. Der Nanopartikel weist üblicherweise eine Größe im Bereich von 10 bis 1000 nm auf. An den Nanopartikel können weitere Moleküle ausgewählt aus der folgenden Gruppe kovalent gebunden werden: Antigene, Antikörper, Nucleinsäuren oder Proteine, Enzyme, Arzneistoffe oder Rezeptorliganden. Die erfindungsgemäßen radioaktiven Nanopartikel eignen sich insbesondere für medizinische und diagnostische Zwecke, beispielsweise als Marker für zelluläre Antigene, zur Studie von phagozytotischen Prozessen, als mikroinjezierbarer Zellmarker, zur Scintigraphie, zur Aerosolcharakterisierung, bei der Lungenabsorption, bei Untersuchungen des mucoziliären Transports, bei Blutuntersuchungen oder zur Tumorbehandlung und -diagnose, sowie für Agglutinationsassays oder/und Assays durch Quantifizierung einer Immobilisierung von Nanopartikeln.

Description

Stabile radioaktiv markierte Nanopartikel, Verfahren zur Herstellung und ihrer Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft stabile radioaktiv markierte Nanopartikel, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung für medizinische und diagnostische Zwecke.
Bisher sind im Stand der Technik verschiedene Methoden zur Herstellung radioaktiver Partikel beschrieben worden.
So wird in Lit. Amer. Ind. Hyg. Ass. J. 1970, 31(3),349-52 die Herstellung von radioaktiven Partikeln aus radioaktiv markiertem Monomer und anschliessender Emulsionspolymerisation beschrieben. Hierfür wurden Monomere wie z.B. 1131 gelabeltes 2,4-lodostyrol verwendet. Der Nachteil liegt hier insbesondere in der schwierig zu steuernden Polymerisation, da teilweise eine spontane Polymerisation eintritt und die Partikelgrössen sehr unterschiedlich ausfallen können. Ausserdem müssen alle Syntheseschritte der Monomere und die anschliessende Polymerisation in Radioaktivlabors durchgeführt werden, was aufwendig und gefährlich ist.
Desweiteren ist die Charakterisierung von radioaktivem Material (z.B. Partikelgrösse und Verteilung) nicht trivial. Darüberhinaus ist die Herstellung monodisperser Partikel im unteren Nanometerbereich fast unmöglich .
Eine weitere Möglichkeit bietet z.B. die Herstellung von nichtradioaktivem Polymer, radioaktive Markierung durch Bestrahlung und anschliessende Herstellung von Nanopartikeln beispielsweise mittels der spinning disk Methode. Der Nachteil bei diesem Verfahren besteht darin, daß sich das Polymer durch Bestrahlung teilweise zersetzt und die anfallenden Zersetzungsprodukte entfernt werden müssen. Zudem lassen sich mit dieser Methode keine Partikel im Nanometerbereich herstellen (Lit.
Ann Occup Hyg. 13, 87-100, 1970).
Kommerzielle radioaktiv markierte Mikropartikel aus Styrol und Divinylbenzol sind gelabelt mit einer Reihe von Radionucliden erhältlich. Laut Aussage des Herstellers (NEN) ist eine Produktion von Partikeln im Nanometerbereich jedoch nicht möglich. Ebenfalls bekannt ist nachträgliche Labein von Partikeln mit radioaktivem lod (US - A-4, 010,250). Das hier beschriebene Verfahren betrifft insbesondere die Markierung von Polyvinyllatexpartikeln mit einer Größe von 2,02 und 0,37 μm. Der Nachteil bei den auf diesem Wege hergestellten Partikeln ist, daß die Radioaktivität nicht sehr stabil gebunden ist und die Radioaktivität sich leicht auswaschen läßt (Lit. J Pharm
Pharmacol. 1990, 42: 821-826).
WO 90/03803 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer radioaktiv markierten Zusammensetzung , welche sich insbesondere zur Lungen Scintigraphie eignet. Die beschriebene Zusammensetzung enthält radioaktiv markierte Partikel auf der Basis von Silicagel, Aluminiumsilicat oder anderen Silicaten. An der Oberfläche dieser Partikel sind organische Liganden , die beispielsweise Thiol-, Amino-, Alkylamino- oder Dithiocarbamatgruppen enthalten kovalent gebunden. Die Partikel besitzen einen mittleren Durchmesser von 1 bis 20 μm. Zur Markierung der Partikel werden vorwiegend Re-186, Re-188, Cu-67, Pb-212, Bi-212, As-77, Y-90, Ag-111 and Pd-
109 eingesetzt, die sehr kurze Halbwertszeiten besitzen.
In nahezu allen Ansätzen lassen sich die Methoden nicht für die Herstellung von Partikeln im Submikronbereich verwenden, sind nicht monodispers oder sind nur sehr aufwendig herzustellen.
Es besteht daher die Aufgabe stabile radioaktiv markierte Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, bei denen die Radioaktivität fest gebunden ist, d.h. sich im wesentlichen nicht auswaschen läßt und die sich auf einfache und wirtschaftliche Weise herstellen lassen.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe und betrifft radioaktiv markierte Nanopartikel mit einer Größe im Bereich von 10 bis 1000 nm, insbesondere 10 nm bis 300 nm, besonders bevorzugt 30 nm bis 150 nm, bei denen ein radioaktives Molekül kovalent an ein Nanopartikel gebunden ist, sowie ein Verfahren zur
Herstellung solcher Partikel. In der Literatur finden sich viele Vorschriften zur Kopplung von Molekülen an modifizierte Polystyrolpartikel. Diese Reaktionen beziehen sich allerdings nur auf größere Moleküle wie Proteine oder Antikörper. Sehr kleine Moleküle lassen sich normalerweise nicht oder nur in geringster Menge an Polystyrolpartikel koppeln. Daher ist es erstaunlich, daß es mit dem vorliegenden Verfahren möglich ist, beispielsweise radioaktiv markiertes Methylamin in rein wäßriger Reaktion an sehr kleine Polystyrolpartikel zu binden und dadurch radioaktive Partikel zu produzieren und den Prozess so zu führen, daß die Partikel dabei nicht agglomerieren. Durch die kovalente Bindung eines kleinen Moleküls wie Methylamin an z.B. Carboxyl- modifizierte Polystyrolpartikel wird die Größe und Oberfläche der Partikel nur unwesentlich beeinflusst. Ferner ist die entstehende Amidbindung äußerst resistent gegenüber den verschiedensten Medien so daß die Stabilität der Partikel gewährleistet ist.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können verschiedenste Nanopartikel aber auch Mikropartikel nachträglich durch kovalente Anbindung eines radioaktiven Moleküls markiert werden. Dabei kann eine vergleichsweise geringe Menge der löslichen radioaktiven Marker eingesetzt werden und dennoch können gute Markierungsintensitäten erzielt werden.
Hierzu wird ein Nanopartikel mit einem radioaktiv markierten Molekül in einem wässrigen Medium umgesetzt, wobei eine kovalente Anbindung des radioaktiv markierten Moleküls an den Nanopartikel erfolgt.
Der kann z.B. aus einem der folgenden Polymere aufgebaut sein: Polymere, die sich ableiten von mindestens einem der Monomeren Styrol, Acrylsäure und deren Estern oder Amiden, Methacrylsäure und deren Estern oder Amiden, Divinylbenzol, Cyanoacrylsäure und deren Estern und Amiden, Butadien und Vinyltoluol sowie Silica. Beispiele für Polymere sind Copolymere abgeleitet von Styrol und Acrylsäure und/oder Methacrylsäure, von Styrol und Divinylbenzol, von Styrol und Butadien.
In den anhängenden Beispielen wurde vorzugsweise ein Copolymer aus Styrol und Acrylsäure verwendet. Die Verwendung hat den Vorteil, daß diese Partikel kommerziell und günstig erhältlich sind. Weiterhin sind sie inert und unlöslich in den meisten Medien, stabil und toxikologisch unbedenklich und die Partikel sind sphärisch.
Die Oberfläche des Nanopartikels kann gegebenenfalls mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, wie z.B. Sulfat -0-S03H, Carbonsäure (-COOH), aliphatisches oder aromatisches Amin (-NH2), Aldehyd (-CHO), Hydroxyl (-OH), Sulfonat (-S03), Chloromethyl (-CH2-CI), Chlorbenzyl (-C6H5-CH2-CI) Bromomethyl (-CH2-Br), lodomethyl (-CH2-I), Hydrazid (-CONH-NH2) oder einer Epoxydgruppe modifiziert sein, was beispielsweise durch den Zusatz geeigneter Monomere mit entsprechenden funktionellen Gruppen während der Polymerisation erreicht werden kann (z.B. Vinylbenzylchlorid für eine Chloromethylgruppe). Diese funktionellen Gruppen können weiter derivatisiert oder verändert sein. Beispielsweise läßt sich ein carboxymodifiziertes Partikel durch Ankupplung eines Diamins in ein Amino- modifiziertes Partikel umwandeln.
Die Anbindung des Markers an die Partikel erfolgt durch Kopplung an geeignete funktionelle Gruppen des Nanopartikels. Diese funktionellen Gruppen sind entweder durch Copolymerisation mit entsprechenden Monomeren, die geeignete funktionelle Gruppen tragen, in den Nanopartikeln bereits vorhanden oder durch nachträgliche Modifikation dieser funktionellen Gruppen entstanden.
Hier sind beispielsweise folgende Kombinationen von funktionellen Gruppen und radioaktiv markierten Molekülen zu nennen: primäre, aliphatische Amine zur Kopplung von radioaktiven Alkylhalogeniden, von Säuren, z.B. Essigsäure oder zur Kopplung von Aldehyden, z.B.
Formaldehyd, Acetaldehyd oder anderen Aldehyden. Hierbei ist auch eine optionale nachträgliche Stabilisierung vom Imin zum Amin durch Reduktion eingeschlossen.
Melamin und optimale anschließende Reduktion von Imin zu Amin. - Aldehyde zur Bindung von radioaktiven Aminen, insbesondere Methylamin.
Chloromethyl (Vinylbenzylchlorid) zur Bindung von radioaktiven Aminen, z.B.
Methylamin.
Epoxydgruppen zur Bindung von radioaktiven Aminen, z.B. Methylamin oder anderen radioaktiven Nucleophilen. Hydroxylgruppen zur Bindung von radioaktiven Säuren, z.B. Essigsäure,
Phosphorsäure, oder zur Veretherung mit radioaktiven Alkylresten
Hydrazide zur Bindung von radioaktiven Aldehyden oder Säuren.
Säuren zur Bindung von radioaktiven Aminen, Hydraziden oder Alkoholen. - Thiole zur Bindung von Alkylhalogeniden oder Michaelakzeptoren.
Chloro-, Bromo-, oder lodomethylgruppen zur Bindung radioaktiver Thiole,
Amine und anderer Nucleophile.
Ähnliche und weitere Reaktionen sind der Literatur zu entnehmen (Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, 1996).
Je nach Auswahl des radioaktiven Markers können unterschiedliche Markierungen vorgenommen werden. Als Marker für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich z.B. Ag 110, C 14, Cd 109, Cs 137, Ca 47, Cl 36, Cr 51 , Co 57, Fe 55, Fe 59, Ga 153, In
111 , 1 125, 1 131 , Mn 54, Hg 203, Na 22, Ni 63, P 32, P 33, Rb 86, Ru 106, S 35, Se 75, Sr 85, Tc 99 oder Tritium, insbesondere C14, Tritium, P 32 und S 35.
So ist z.B. C14 ein sehr kurzlebiger Strahler, der sehr stabil ist, im Vergleich z.B. zu Brom, welcher nur eine kurze Halbwertszeit hat und daher nicht lange gelagert werden kann.
Besonders geeignet im Sinne der Erfindung sind stabile, langlebige Strahler mit einer physikalischen Mindest-Halbwertszeit von 14 Tagen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Oberfläche des Nanopartikels mit mindestens einer funktionelle Gruppe modifiziert, so daß die Möglichkeit besteht weitere Liganden an den Nanopartikel zu koppeln. Als Beispiel für solche funktionellen Gruppen sind zu nennen: Sulfat- (-S04) oder Carbonsäuregruppe (-COOH), aliphatische Amingruppe, wie -CH2-NH2, aromatische
Amingruppe, wie -C6H4-NH2, Amidrest (-CONH2), Aldehydgruppe (-CHO), Hydroxyl- (-OH) oder Sulfonatgruppe (-S03H), Chloromethyl- (-CH2CI), Chlorbenzyl (-C6H4- CH2-CI), Hydrazid- (-CONH-NH2) oder Epoxydreste. Die Anbindung derartiger weiterer Liganden kann vor, nach oder gleichzeitig mit der Anbindung des radioaktiven Moleküls an den Nanopartikel erfolgen.
Weitere Moleküle, die auf diese Weise kovalent an den radioaktiv markierten Partikel gebunden werden können sind z.B., um nur einige zu nennen: Antigene , Antikörper,
Nucleinsauren oder Proteine , Enzyme, Arzneistoffe oder Rezeptorliganden. Auf eine explizite Aufzählung aller geeigneter Liganden wird hier verzichtet, da eine derartige Auflistung den Rahmen dieser Anmeldung sprengen würde. Außerdem sind diese dem Fachmann bekannt sind und werden von ihm je nach Anwendung speziell ausgewählt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die entsprechenden Nanopartikel in eine wässrige Lösung gegeben, in der vorzugsweise ein Überschuß Sulfo-NHS (N- Hydroxysuccinimid-3-Sulfonsäuresalz, Aldrich) gelöst ist. Das Sulfo- NHS dient im vorliegenden Fall als Katalysator und verhindert, daß die Partikel agglomerieren. Der
Zusatz dieses Reagenz ist aber nicht zwingend. In den anhängenden Beispielen wurden aus den vorstehend genannten Gründen Copolymerisate von Styrol mit Acrylsäure verwendet, so daß die im Kern im wesentlichen aus Polystyrol bestehenden Partikel eine Oberflächenmodifikation mit Carboxylaten besitzen.
Zu dieser Mischung wird in einem darauffolgenden Schritt das radioaktiv markierte Molekül gegeben, z.B. C14 markiertes Methylamin. Der pH Wert wird mit Phosphatpuffer so eingestellt, daß er im leicht sauren Bereich (pH < 7) liegt. Für den Fall, daß die eingesetzten Nanopartikel freie Carboxylgruppen tragen, wird zu der Reaktionslösung ein in destillierten Wasser gelöstes Carbodiimid oder
Uroniumsalz zugegeben. Vorzugsweise wird das Carbodiimid im Überschuß zugesetzt.. Bei dieser Reaktion können die gebräuchlichen, dem Fachmann bekannten Carbodiimide, wie z.B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodimid (EDC) oder Uroniumsalze, wie z.B. TSTU (= 2-Succinimido-1 , 1 ,3,3- tetramethyluronium -tetrafluoroborat) oder weitere an sich bekannte
Kupplungsreagenzien, verwendet werden. Nach Abschluß der Reaktion (einige Stunden) werden die Partikel ultrafiltriert und mit destilliertem Wasser so lange gewaschen, bis die freie (ungebundene) Radioaktivität herausgewaschen ist. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man radioaktive Nanopartikel mit einer spezifischen Aktivität von 1 bis 100 μCi/mg. Durch Wahl von geeigneten radioaktiven Markern mit entsprechender Radioaktivität und Wahl der entsprechenden Nanopartikel mit geeigneter Anzahl an freien funktionellen Gruppen, ist es möglich die spezifische Aktivität der erhaltenen radioaktiv markierten Partikel genau einzustellen.
Zur Bestimmung der Stabilität wird ein Teil der Partikel für 24 h lang in künstlichem Magensaft (0,1 M HCI) bei 37°C inkubiert, durch Ultrafiltration abgetrennt und die freie Radioaktivität im Filtrat bestimmt. Die freie Radioaktivität der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Partikel beträgt nach diesem Test nur 0,1 bis 2%. Nach Inkubation der Partikel in künstlichem Darmsaft für 24 Stunden liegt die freie Aktivität der radioaktiven Partikel im Bereich von 0,1 bis 2%.
Das vorliegende Verfahren besitzt gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren viele Vorteile:
1) Die Partikel sind schon kommerziell in verschiedensten Grossen und sehr engen Grössenverteilungen oder mit verschiedenen Oberflächenmodifikationen erhältlich, d.h. aufwendige Techniken zur Herstellung entfallen. 2) Die nicht radioaktiven Partikel können umfassend charakterisiert werden (mit radioaktivem Material ist z.B. eine Messung der Partikelgrössenverteilung mittels Photonen Korrelations Spektroskopie schlecht möglich, da dadurch das Gerät kontaminiert werden könnte).
3) Die Oberflächen der Partikel können modifiziert sein (z.B. positiv, negativ oder zwitterionisch geladen sein).
4) Je nach Auswahl des radioaktiven Markers können unterschiedliche Markierungen vorgenommen werden (z.B. C14, Tritium, S35 usw.).
5) Eine weitere Bindung anderer Liganden an die Partikel ist möglich, die Ankopplung an die Partikel kann vorher, nachher oder zusammen mit dem Marker erfolgen
6) Die Reaktionen sind einfach und können in rein wässrigem Medium ohne Lösungsmittel durchgeführt werden, so lassen sich Agglomerationen vermeiden
7) Durch die kovalente Anbindung des radioaktiven Markers entstehen sehr stabile Partikel, die keine Radioaktivität verlieren 8) Die Reaktionen können auch auf sehr kleine Partikel im Nanometerbereich angewendet werden.
Die erfindungsgemäßen radioaktiv markierten Nanopartikeln sind insbesondere dort anwendbar, wo es auf einheitliche Partikelgrössenverteilung, hohe Sensitivität und schnelle, simple Auswertung ankommt wie z.B.:
Als Marker für zelluläre Antigene, zur Studie von phagozytotischen Prozessen Diagnostika, die auf Mikro- oder Nanopartikeln beruhen, z.B. Latex Agglutinationstests, Partikel Sandwich Tests, Mikroinjezierbare ZeUmarker, Lungenabsorption, Scintigraphie, Aerosolcharakterisierung, Untersuchung des mucoziliären Transportes, Blutflussuntersuchungen, Tumorbehandlungen (Radiotherapie) und Diagnose, sowie bei der in vivo sowie der in vitro Diagnose, beispielsweise in Agglutinationsassays oder in Assays durch Quantifizierung einer Immobilisierung von Nanopartikeln.
Beispieh : Herstellung radioaktiv markierter Polystyrol-Nanopartikel
1 ml käuflicher 140 nm Polystyrolpartikel, die freie Carboxylgruppen an der Oberfläche tragen, werden mit 8 ml destilliertem Wasser, in dem 200 mg Sulfo-NHS
(N-Hydroxysuccinimid-3-Sulfonsäuresalz, Aldrich) gelöst wurde, vermischt. Dazu werden 10 mg C14 radioaktiv markiertes Methylamin (gelöst in 1 ml dest. Wasser) gegeben. Der pH Wert wird mit Phosphatpuffer auf 6,5 eingestellt. Zu dieser Lösung wird 1 ml dest. Wasser, in dem 150 mg EDAC (wasserlösliches Carbodiimid, Fluka) gelöst wurden, hinzugefügt und die Suspension über Nacht gerührt. Am nächsten
Tag werden die Partikel ultrafiltriert (Amicon Ultrafiltrationszelle) und mit destiliertem Wasser so lange gewaschen, bis die freie (ungebundene) Radioaktivität herausgewaschen ist. Man erhält radioaktive Polystyrolpartikel mit einer spezifischen Aktivität von ca. 8 μCi/mg.
Beispiel 2:
Stabilität radioaktiv markierter [14C]-Polystyrol-Nanopartikel in künstlichem Magen- und Darmsaft
Zum Beweis der Stabilität wird ein Teil der Partikel für 24 h lang in künstlichem
Magensaft (0,1 M HCI) bei 37°C inkubiert. Die Partikel werden vom Puffer durch Ultrafiltration abgetrennt und die freie Radioaktivität im Filtrat bestimmt. Nach 24 h betrug die freie Radioaktivität nur 0,2%. Desweiteren wurden die Partikel in künstlichem Darmsaft für 24 h bei 37°C inkubiert. Diesmal betrug die freie Radioaktivität nur 0,4%. Aus der spezifischen Radioaktivität der Partikel sowie einer Bestimmung der freien Carboxylgruppen auf den Partikeln läßt sich berechnen, daß etwa 1/3 der Carboxylgruppen an der Oberfläche des Partikels mit Methylamin reagiert haben und noch 2/3 freie Carboxylgruppen vorliegen.
An die noch freien Carboxylgruppen der Partikel können weitere Moleküle (z.B. Antikörper, Antigene, Nucleinsauren oder Proteine) kovalent gebunden werden. Zudem sind die Partikel durch die negative Oberflächenladung stabilisiert vor Agglomeration und unspezifischer Absorption von Fremdmolekülen . Zusammensetzung künstlicher Magensaft (USP) für 1 L Lösung::
2,0 g NaCI und 3,2 g Pepsin weden in einer Mischung aus 7,0 ml konzentrierter Salzsäure und 950 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird auf 1000 ml aufgefüllt. Diese
Testlösung hat einen pH Wert von ca. 1,2.
Zusammensetzung künstlicher Darmsaft (USP) für 1 Liter Lösung:
6,8 g Natnumdihydrogenphosphat werden in 250 ml Wasser gelöst und 380 ml 0,1 N
NaOH Lösung sowie 200 ml Wasser hinzugegeben. Es werden 10,0 g Pankreatin hinzugefügt, gemischt und die Lösung mit 0,1 N NaOH auf einen pH von 7,5 +/- 0,1 eingestellt. Es wird mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.
Beispiel 3:
Stabilität radioaktiv markierter [14C]-Polystyrol-Nanopartikel in Darmhomogenisat
Dünndarm und Inhalt von 3 frisch getöteten männlichen Ratten wird entnommen und separat in Phosphatpuffer geeigneten pH-Wertes homogenisiert ( ca. 3 ml Puffer auf 1 g Gewebe). Etwa 5 ml Aliquot von jedem Homogenisat werden mit 0,5 mg/ml
[14C]-Polystyrol-Nanopartikel bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Das verbleibende Homogenat wird gepoolt, gut durchmischt und weitere 2 Proben zu je 5 ml entnommen. Zu einer der beiden Proben wird [14C]-Methylamin in einer Konzentration gegeben, die der Konzentration in den radioaktiv markierten Nanopartikeln entspricht. Zu der anderen Homogenat-Probe werden [14C]-
Methylamin und nicht-radioaktiv markierte Nanopartikel in einer Konzentration zugegeben, die der Konzentration in den radioaktiv markierten Nanopartikeln entspricht. Zur Kontrolle wird ein Aliquot [14C]-Polystyrol-Nanopartikel entsprechender Konzentration in Phosphatpuffer angesetzt. Jede Probe wird bei 37°C im Schüttelwasserbad für 4 h inkubiert. Nach 1 h und nach 4 h werden 2 ml jeder Probe entnommen, zentrifugiert und der Überstand entnommen. Der Überstand wird ultrafiltriert (Centrifree Micropartition), um die Konzentration an freiem [14C]-Methylamin in jeder Probe zu bestimmen. Die Radioaktivität wird im Überstand und im resultierenden Pellet für jede Probe ermittelt.
Tabelle 1
Stabilität von [14C]-Polystyrol-Nanopartikel in Darmhomogenat
Figure imgf000012_0001
Tabelle 2
Stabilität von [14C]-Methylamin in Darmhomogenat
Figure imgf000012_0002
Tabelle 3
Stabilität von [14C]-Methylamin und Polystyrol-Nanopartikel in Darmhomogenat
Figure imgf000013_0001
Beispiel 4:
Ausscheidungsverhalten von [14C]-Polystyrol-Nanopartikel nach intravenöser Gabe
Fünf männliche Ratten erhalten eine intravenöse Einzelgabe von 2 mg/kg [14C]- Polystyrol-Nanopartikel in 0,9% (m/V) Kochsalzlösung. Die Testtiere werden einzeln in einen Metabolismuskäfig aus Glas gesetzt. Etwa 4 h vor und nach der Nanopartikelgabe erhalten die Tiere keine Nahrung. Urin und Faeces wird für vorher festgelegte Zeitabschnitte quantitativ gesammelt. Die Käfige werden bei jeder Faeces-Entnahme ausgewaschen und das Waschwasser aufgehoben. Die ausgeatmetete Atemluft von 3 Tieren wird in einer absorbierende Lösung von Ethanolamin:Ethandiol = 3:7 aufgefangen. Nach Abschluß der Probennahmen werden die Ratten getötet, eine letzte Blutprobe (5-10 ml) entnommen und die Tiere in folgende Gewebefraktionen aufgeteilt:
Blut, Magen, Dünn- und Dickdarm, Leber, Lunge, Nieren, Milz, Muskelgewebe, Lymphknoten und restlicher Tierkörper. Inhalt von Magen, Dünn- und Dickdarm werden getrennt und durch fünfmaliges Waschen mit Phosphatpufferlösung ausgespült.
In jeder einzelnen der o.g. Proben wird die Menge an Radioaktivität bestimmt.
Tabelle 4
Kumulative Wiederfindung der Totalen Radioaktivität nach einer intravenösen
Einzelgabe von [14C]-Polystyrol-Nanopartιkel in Ratten (in % der applizierten Dosis)
Figure imgf000014_0001
Beispiel 5: Ausscheidungsverhalten von [14C]-Polystyrol-Nanopartikel nach oraler Gabe
Fünf männliche Ratten (Gruppe 1) erhalten je eine orale Einzelgabe von 20 mg/kg [14C]-Polystyrol-Nanopartikel als Suspension in Phosphatpuffer pH 7,5. Etwa 4 h vor und nach der Nanopartikelgabe erhalten die Tiere keine Nahrung. Die Testtiere werden einzeln in einen Metabolismuskäfig aus Glas gesetzt, die Probennahme erfolgt nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Schema. Auf die Messung der Radioaktivität in der Atemluft wurde verzichtet, da der vorangegangene Versuch (Beispiel 4) gezeigt hatte, daß die Partikel so stabil radioaktiv markiert sind, daß keine nennenswerten Mengen an Radioaktivität abgeatmet werden. In jeder einzelnen der o.g. Proben wird die Menge an Radioaktivität bestimmt. Zusätzlich erhalten weitere sechs männliche Ratten erhalten je eine orale Einzelgabe von 20 mg/kg [14C]-Polystyrol-Nanopartikel als Suspension in Phosphatpuffer pH 7,5. Die Testtiere werden einzeln in einen Metabolismuskäfig aus
Polypropylen und rostfreiem Stahl gesetzt. 1h, 2h, 4h, 6h, 12h und 24 h nach Nanopartikelgabe wir je ein Tier duch C02-Narkose getötet, Blut und Gewebe gesammelt und die Menge an Radioaktivität in den Proben bestimmt.
Tabelle 5
Kumulative Wiederfindung der Totalen Radioaktivität nach einer oralen Einzelgabe von [14C]-Polystyrol-Nanopartikel in Ratten der Gruppe 1 (in % der applizierten
Dosis)
Figure imgf000016_0001
Tabelle 6
Kumulative Wiederfindung der Totalen Radioaktivität (in % der applizierten Dosis) zu bestimmten Zeitpunkten nach einer oralen Einzelgabe von [14C]-Polystyrol- Nanopartikel in Ratten der Gruppe 2
Figure imgf000017_0001

Claims

Patentansprüche:
1. Radioaktive Nanopartikel, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel eine Größe im Bereich von 10 bis 1000 nm besitzen.
2. Radioaktive Nanopartikel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nanopartikel kovalent angebundene radioaktiv markierte Moleküle aufweisen.
3. Radioaktive Nanopartikel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß an ihnen weitere Moleküle ausgewählt aus der folgenden Gruppe kovalent gebunden sind: Antigene , Antikörper, Nucleinsauren oder Proteine , Enzyme, Arzneistoffe oder Rezeptorliganden,
4. Radioaktive Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß diese nach 24 h bei 37°C in 0,1 M HCI, sowie in künstlichem Darmsaft USP nicht mehr als 2,0% ihrer Radioaktivität freigesetzt haben.
5. Radioaktiver Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktive Molekül mit einem Strahler markiert ist, der aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Ag 110, C 14, Cd 109, Cs 137, Ca 47, Cl 36, Cr 51 , Co 57, Fe 55, Fe 59, Ga 153, In 111 , I 125, I 131 , Mn 54, Hg 203, Na 22, Ni 63, P 32, P 33, Rb 86, Ru 106, S 35, Se 75, Sr 85, Tc 99.
6. Radioaktive Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der radioaktive Marker eine Halbwertszeit im Bereich von mindestens 14 Tagen besitzt
7. Radioaktive Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Nanopartikel aufgebaut ist aus Silica oder aus Polymeren, die sich ableiten von mindestens einem der Monomeren Styrol, Acrylsäure und deren Estern oder Amiden, Methacrylsäure und deren Estern oder Amiden, Divinylbenzol, Cyanoacrylsäure und deren Estern und Amiden,
Butadien und Vinyltoluol.
8. Radioaktive Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Nanopartikels mit mindestens einer funktionellen Gruppe modifiziert ist: Sulfat- (-S04) oder Carbonsäuregruppe (- COOH), aliphatische oder aromatische Amingruppe (-NH2), Amidrest (- CONH2), Aldehydgruppe (-CHO), Hydroxyl- (-OH) oder Sulfonatgruppe (-S03) oder Chloromethyl- (-CH2CI), Hydrazid- (-CONH-NH2) oder Epoxydreste.
9. Verfahren zur Herstellung stabiler radioaktiver Nanopartikel, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nanopartikel mit einem radioaktiv markierten Molekül in einem wässrigen Medium umgesetzt wird, wobei eine kovalente Anbindung des radioaktiv markierten Moleküls an den Nanopartikel erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Nanopartikel eine Größe im Bereich von 10 bis 1000 nm aufweist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß weitere Liganden an den Nanopartikel angekoppelt werden, wobei die Anbindung der Liganden vor, nach oder gleichzeitig mit der Anbindung an das radioaktive Molekül erfolgt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem wässrigen Medium erfolgt.
13. Verwendung eines radioaktiven Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 für medizinische und diagnostische Zwecke.
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der radioaktive
Nanopartikel als Marker für zelluläre Antigene, zur Studie von phagozytotischen Prozessen, als mikroinjezierbarer ZeUmarker, zur Scintigraphie, zur Aerosolcharakterisierung, bei der Lungenabsorption, bei Untersuchungen des mucoziliären Transports, bei Blutuntersuchungen oder zur Tumorbehandlung und -diagnose eingesetzt wird.
Stabile radioaktiv markierte Nanopartikel, Verfahren zur Herstellung und ihrer Verwendung
Zusammenfassung:
Stabiler radioaktiver Nanopartikel sowie Verfahren zu seiner Herstellung, wobei ein Nanopartikel mit einem radioaktiv markierten Molekül, insbesondere in einem wässrigen Medium, umgesetzt wird und eine kovalente Anbindung des radioaktiv markierten Moleküls an den Nanopartikel erfolgt. Der Nanopartikel weist üblicherweise eine Größe im Bereich von 10 bis 1000 nm auf. An den Nanopartikel können weitere Moleküle ausgewählt aus der folgenden Gruppe kovalent gebunden werden: Antigene , Antikörper, Nucleinsauren oder Proteine , Enzyme, Arzneistoffe oder Rezeptorliganden. Die erfindungsgemäßen radioaktiven Nanopartikel eignen sich insbesondere für medizinische und diagnostische Zwecke, beispielsweise als Marker für zelluläre
Antigene, zur Studie von phagozytotischen Prozessen, als mikroinjezierbarer ZeUmarker, zur Scintigraphie, zur Aerosolcharakterisierung, bei der Lungenabsorption, bei Untersuchungen des mucoziliären Transports, bei Blutuntersuchungen oder zur Tumorbehandlung und -diagnose, sowie für Agglutinationsassays oder/und Assays durch Quantifizierung einer Immobilisierung von Nanopartikeln.
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