WO2000074670A1 - VERWENDUNG VON VERAPAMIL UND VERAPAMILDERIVATEN ZUR HERSTELLUNG VON ARZNEIMITTELN MIT β-GLUCURONIDASE IM HUMANEN GEWEBE HEMMENDER WIRKUNG - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verapamil oder Verapamilderivaten zur Herstellung von Arzneimitteln mit Glucuronidase im humanen Gewebe hemmender Wirkung.

Description

Verwendung von Verapamil und Verapamilderivaten zur Herstellung von Arzneimitteln mit ß-Glucuronidase im humanen Gewebe hemmender Wirkung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Verapamil oder Verapamilderivaten in Arzneimitteln zur Hemmung des Enzyms beta-Glucuroπidase im humanen Gewebe mit dem Ziel, therapeutische Effekte direkt zu erzielen oder durch kombinierte Anwendung zusammen mit glucuronidierten oder glucuronidierbaren Wirkstoffen deren therapeutische Breite zu verbessern

Die Konjugation von endogenen oder exogenen Stoffen mit Glucuronsaure ist eine wichtige Stoffwechselreaktioπ bei Mensch und Tier Glucuronsaure kann mit den unterschiedlicnsten Stoffen, z B Arzneimittelwirkstoffeπ und deren Metabolite konjugiert werden Die Konjugationsreaktion erfolgt durch Übertragung von aktivierter Glucuronsaure (UDP-Glucuronsaure) auf das Substrat mittels des Enzyms Glucuronyltransferase Der Organismus bedient sich der Konjugationsreaktioπen im allgemeinen zur Entgiftung, da Glucuronsaurekonjugate üblicherweise weniger toxisch sind und aufgrund ihrer guten Wasserloslichkeit leicht über die Nieren oder als Gallensekret über den Darm ausgeschieden werden Eine Konjugation kann auch auf nichtenzymatischem Wege durch chemische Synthese erfolgen

Die Glucuronsaurekonjugate können aber auch durch katalytische Wirkung von Glucuronidasen in Glucuronsaure und in das Ausgangsprodukt gespalten werden Die Spaltung von Glucuroniden findet häufig nach Ausscheidung derselben über die Galle in tieferliegenden Dunndarmabschnitten oder im Dickdarm statt. Die dabei entstehenden Ausgangssubstanzen können wieder resorbiert und somit im Organismus erneut aktiv werden Dieser als enterohepatischer Kreislauf bezeichnete Vorgang kann die erwünschte Wirkung von Substanzen verlangern, aber auch die toxischen Wirkungen giftiger Substanzen steigern

Durch medikamentöse Regulierung der beta-Glucuronidase-Aktivitat in den unterschiedlichen Geweben eroffnen sich neue Therapiekonzepte Anwendung von Glucuronidase-Hemmem in der Krebstherapie

Eine Besonderheit von Tumorgeweben ist ihre hohe Konzentration an beta- Glucuronidase bzw eine extrem hohe Glucuronidaseaktivitat. Eng assoziiert mit der erhöhten Glucuronidaseaktivitat ist die Neigung bestimmter Tumore Metastasen zu bilden. Durch alleinige Gabe eines beta-Glucuronidasehemmers wird bei Tumoren, die aufgrund der erhöhten beta-Glucuronidaseaktivitat zur Progression und Metastasenbildung neigen, die Tumorausbreitung über die Hemmung der Tumorglucuronidase reduziert. Saccharo-1 ,4-lacton, 2-Acetamιdoglycal und Hepaπndeπvate wurden zu diesem Zweck getestet [Bernacki R. J , Cancer Metastasis Rev (1985) 4 81 -101 , Nakajima M., Journal of Cellular Biochemistry (1988) 36. 157-167, Niwa T., Journal of Biochemistry (1972) 72: 207-21 1 ]. Selektive Glucuronidaseinhibitoren sind in jüngster Zeit synthetisiert worden (Bosslet K., EP 0822192)

Neben dem alleinigen Einsatz zur Therapie können Glucuroπidasehemmer auch unterstützend in der Chemotherapie von Krebspatienten zur Erhöhung des erwünschten Effektes bei gleichzeitiger Reduzierung der unerwünschten Wirkungen eingesetzt werden.

Die Chemotherapie bedingt eine außerordentliche physische und psychische Belastung des Krebspatienten. Glucuronidasehemmer können negative Auswirkungen der Chemotherapie mildern und gleichzeitig die Effektivität der Therapie steigern. Dafür bieten sich folgende Ansatzpunkte.

Chemotherapeutika werden unter anderem auch via ihrer Glucuronide über den Darm ausgeschieden. Durch die Wirkungen der dort vorhanden Glucuronidasen erfolgt eine Spaltung dieser Glucuronide und Freisetzung der aktiven zelltoxischen Substanzen, die das in standiger Zellteilung und Regeneration befindliche Darmgewebe schadigen Daraus resultieren für den Patienten Übelkeit, Erbrechen und Durchfall, verbunden mit einem Flüsssigkeits- und Gewichtsverlust.

Beta-Glucuronidaseinhibitoren können den Darm vor toxischen Produkten aus Cytostatika-Glucuroniden schützen. So kann z.B. die intestinale Toxizitat des Antitumormittels Irinotectan Hydrochlorid, durch präventive Gabe des beta- Glucuronidaseinhibitors Baicalin minimiert werden. Die Patienten werden so vor einer massive Diarrhöe und dem damit verbundenen Flüssigkeitsverlust geschützt [Takasuna, K, Jpn J Cancer Res (1995) 86: 978-84; Kamataki T., US-Pat. 5,447,719).

Es bestehen Überlegungen, die Spaltung von Glucuroniden in bestimmten Geweben zu nutzen, um aus inaktiven Vorstufen von wirksamen Arzneimitteln (Prodrugs) die aktiven Substanzen freizusetzen. Durch die bevorzugte Freisetzung in erkrankten Zielgeweben kann über die erhöhte Substanzkonzentration eine mehr oder weniger lokale Wirkung bei geringer systemischer Wirkung erzielt werden [Sperker B., Clin Pharmacokinet (1997) 33: 18-31]. Diese Therapiemöglichkeit wäre vor allem bei der Anwendung nebeπwirkungsreicher Substanzen in der Tumortherapie von Interesse, weil die erwünschten cytotoxischen Eigenschaften von Chemotherapeutika auf das Tumorgewebe konzentriert werden können. Die Tumorprogression und die Metastasenbildung ist häufig mit einer erhöhten beta-Glucuroπidaseaktivität verbunden. In nekrotischen Tumorbereichen liegt eine erhöhte Glucuronidaseaktivitat im Extrazellulärraum vor, während im gesunden Gewebe die Glucuronidaseaktivitat weitgehend intrazellulär lokalisiert ist. Ein im Tumor nach sauer verschobener pH- Wert kann die Aktivität der beta-Glucuronidase nochmals erhöhen. Diese physiologischen Bedingungen bieten Ansatzpunkte für die Applikation von Glucuronsäurekonjugaten mit Chemotherapeutika an Tumorpatienten zur lokalen Freisetzung der wirksamen Substrate nach Spaltung durch die lokal erhöhte Glucuronidaseaktivitat [Sperker B., Clin Pharmacokinet (1997) 33: 18-31]. Verstärkt werden könnte die lokale Wirkung durch gleichzeitige Gabe einer Glucuronidprodrug und eines tumorspezifischeπ Antikörpers, der covalent mit beta-Glucuronidase verbunden ist (Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy = ADEPT) [Sperker B., Clin Pharmacokinet (1997) 33: 18-31].

Die erhöhte Tumorselektivität von Glucuronid-Prodrugs führt zu entsprechend höheren Wirkstoffspiegeln in den Tumoren und gleichzeitig zu niedrigeren Wirkstoffkonzentrationen in gesunden Geweberegionen, d.h. die Effektivitäten und Verträglichkeiten der Chemotherapeutika werden gesteigert.

Bekannte Beispiele sind Doxorubicin-Glucuronid-Prodrugs, welche im Vergleich zum freien Doxorubicin in Tumorgeweben ca. 10 fach höhere Doxorubicinspiegel ermöglichen, aber gleichzeitig gesundes Gewebe mit einer erniedrigten Konzentration schonen, so daß z.B. die typische kardiotoxische Eigenschaft von Doxorubicin nur noch eine untergeordnete Rolle spielt [Bosslet K., Cell Biophys (1994) 24-25: 51- 63; Bosslet K., Cancer Res (1994) 54: 2151-9; Bosslet K., Cancer Res (1998) 58: 1195-201 ; Murdter, T. E., Cancer Res (1997) 57: 2440-5].

Keine dieser Untersuchungen hat bisher zu therapeutisch nutzbaren Resultaten, d. h. brauchbaren Arzneimitteln, geführt. Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung hat sich zur Aufgabe gestellt, Glucuronidasehemmer zu finden, die ansonsten pharmakologisch nicht oder wenig wirksam sind, d. h. wenige Nebenwirkungen aufweisen, um sie als Arzneimittel in den vorstehend geschilderten Anwendungen alleine oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln zur Erhöhung der therapeutischen Breite einzusetzen.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Hauptanspruchs gelöst und durch die Merkmale des Unteranspruchs gefördert.

Es ist bekannt, daß Verapamil die Aktivität von bakterieller beta-Glucuronidase (E. coli) in einem erheblichen Ausmaß hemmt (B. Sperker et al., Eur. J. Clin. Pharm. (1999), Vol. 55, A. 16), jedoch die Glucuronidase im Darmgewebe von Ratten (Säugetieren) nicht hemmt, im Gegensatz zu bekannten Glucuronidasehemmern wie D-Saccharinsäure-1 ,4-lactose, welches beim Rattenenzym 30 mal stärker hemmt als bei dem Enzym aus E. coli.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Verapamil auf die im humanen Gewebe vorkommende ß-Glucuronidase eine starke Hemmwirkung ausübt. Die Hemmung erfolgt bei einer Applikation von 1 - 10 mg pro kg Körpergewicht und Tag im gleichen Ausmaß durch das racemische Gemisch und die reinen Enantiomere. Es ist bekannt, daß die diversen Wirkungen des als Calciumantagonisten bekannten Verapamils auf das Herz und das Gefäßsystem im wesentlichen vom S- Enantiomeren ausgehen [Mickisch G. H., J Cancer Res Clin Oncol (1995) 121 (Suppl 3): R11-R16]. Somit kann bei Anwendung des kaum kardioaktiv wirksamen R- Enantiomeren von Verapamil bzw. Verapamil-Derivaten der erwünschte Hemmeffekt auf die beta-Glucuronidaseaktivität erzielt werden, ohne daß die für Verapamil bekannten pharmakologischen Wirkungen als unerwünschte Nebenwirkung auftreten.

Insbesondere ist die adjuvante orale Gabe retardierter Arzneimittel aus Verapamil bzw. dessen Derivaten für Anwendungen bestimmt, die über längere Zeiträume den Darm vor den toxischen Spaltprodukten aus wenigtoxischen ß-Glucuroniden schützen sollen. Im Falle der adjuvanten Gabe in der Krebstherapie ist die dabei auch auftretende systemische Verteilung der Inhibitoren vom Verapamil-Typ kein Nachteil. Es ist bekannt, daß Verapamil die Behandlung chemotherapieresistenter Krebszellen günstig beeinflußt [Volm M., Anticancer Res 18(C4): 2905-17; Wainer I. W. Ann Oncol (1993) 4(Suppl 2): 7-13]. Dabei werden verschiedene Mechanismen der Wirkungsweise diskutiert, wobei Verapamil die aktive Ausschleusung der Chemotherapeutika aus den Krebszellen unterdrückt [Simpson W. G., Cell Caicium (1985) 6: 449-67] oder etwa die Expression von Multidrug-Resistance-Genen unterbindet [Ling V., Cancer Chemother Pharmacol (1997) 40(Suppl): S3-S8; Mickisch G. H., J Cancer Res Clin Oncol (1995) 121 (Suppl 3): R11-R16]. Eine Beteiligung von ß-Glucuronidasen ist bei diesen Mechanismen nicht gegeben.

Glucuronidasehemmer des Verapamil-Typs können auch unterstützend bei der Chemotherapie zusammen mit neuartigen Glucuronid-Prodrug-Chemotherapeutika eingesetzt werden. Die Therapieunterstützung mit Glucuronidasehemmern des Verapamil-Typs beinhaltet den Schutz des gesunden Gewebes vor den Wirkungen dieser Chemotherapeutika, insbesondere vor den Wirkungen hoher lokaler Konzentrationen an Einstichstellen oder anderen Zuführungsstellen.

Die Verapamil Gabe und Dosierung erfolgt in der Weise, daß lokal am Infusionszugang das gesunde Gewebe geschont wird, d.h. hier die Glucuronidasen inhibiert werden, aber nach der systemischen Durchmischung im Tumorgewebe keine Deaktivierung der Tumorglucuronidasen stattfindet.

Physiologisch wenig stabile Glukuronidprodrugs können pharmazeutisch durch Zusatz des Glucuronidaseinhibitors-Verapamil so stabilisiert werden, daß erst nach der systemischen Durchmischung im Organismus die Spaltung bevorzugt im Zielgewebe erfolgt. Bei Gabe biologisch inaktiver Glucuronidprodrugs zusammen mit einem beta- Glucuronidaseinhibitor wird die Spaltung in das wirksame Substrat verzögert, so daß bei Prodrugs mit langer Eliminationshalbwertszeit die systemische Verfügbarkeit verlängert wird. Entsprechend kann die Dosis verringert und das Dosierungsintervall verlängert werden.

Bei der tumorspezifischen Prodrugtherapie wird durch zusätzliche Gabe eines zellmembrandurchlässigen beta-Glucuronidaseinhibitors wie Verapamil die therapeutische Breite dadurch erhöht, daß die weitgehend intrazellulär vorliegende beta-Glucuronidase im gesunden Gewebe inhibiert und dadurch eine pharmakologische Wirkung verhindert wird. Im Tumorgewebe wird durch die physiologisch oder durch ADEPT-Therapie erhöhte Glucuronidasekonzentration das wirksame Substrat bei geeigneter Dosiswahl nach wie vor gebildet.

Die in der Erfindung beanspruchte Hemmwirkung auf die beta-Glucuronidaseaktivität wird in den nachfolgend aufgeführten Ergebnissen belegt.

Untersuchungen zur Senkung der humanen ß-Glucuronidase-Aktivität durch Verapamil, seine Metabolite und Gallopamil

Der Calcium-Antagonist Verapamil (sowohl Racemat als auch beide Enantiomere), seine Metabolite und das Derivat Gallopamil sind in der Lage, die Aktivität der menschlichen ß-Glucuronidase zu verringern.

Eine direkte Inhibition der ß-Glucuronidase-Aktivität konnte bei Experimenten mit humanen Leberhomogenaten gezeigt werden. Dazu wurden Homogenate verschiedener Leberproben mit 2.5 mM 4-Methylbeiliferyl-ß-D-glucuronid (MUG) inkubiert und mittels HPLC analysiert. Die Konzentrationen des freigesetzten 4-Methyl- umbelliferons ist ein Maß für die Aktivität der ß-Glucuronidase. Bei Homogenaten, die zusätzlich zu MUG noch 100μM Verapamil (Racemat) erhielten, war die Aktivität signifikant um ca. 25 % gegenüber der Kontrollproben verringert (Fig. 1).

Parallel bewirken Verapamil, die Metabolite Norverapamil, D702, D703 und Gallopamil in der humanen Hepatom-Zellinie HepG2 nach 48 h-lnkubation eine Verringerung der ß-Glucuronidase-Aktivität auf 50-65 %, die auf eine gesenkte Expression des Enzyms zurückzuführen ist. Diese Senkung der Aktivität ist konzentrationsabhängig (Fig. 2).

Die Senkung der ß-Glucuronidase-Aktivität konnte gleichermaßen stark mit Verapamil-Racemat und mit R- und S-Verapamil beobachtet werden. Die Metabolite Norverapamil, D702 und D703 zeigen einen vergleichbaren Einfluß auf die Aktivität der ß-Glucuronidase in HepG2-Zellen. Die Inkubation mit D617, einem weiteren Metaboliten, bewirkt nur eine Senkung der Aktivität um 12 %, die allerdings statistisch nicht signifikant ist. Gallopamil bewirkt einen dem Verapamil vergleichbaren Effekt (Fig. 3).

Beispiel 1

Hemmung der Aktivität humaner Leber-ß-Glucuronidase durch Verapamil (Fig. 1).

Humane Leberhomogenate wurden mit dem Enzym-Substrat 4-Methylbelliferyl-ß-D- glucuronid inkubiert (1 h, 37°C). 100 μM Verapamil oder DMSO (Kontrolle) wurden dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Freisetzung von 4-Methylumbelliferon wurde mittels HPLC-Analyse gemessen (*signifikanter Unterschied zur Kontrolle; p < 0.001 ; n = 3 unabhängige Experimente).

Beispiel 2

Konzentrationsabhängigkeit der Verapamil-Wirkung in der humanen Hepatom- Zellinie HepG2 (Fig. 2).

HepG2-Zellen wurden 48 h bei 37°C mit den in Fig. 2 angegebenen Konzentrationen Verapamil inkubiert. Nach Lyse der Zellen wurde jeweils 2.25 μg zelluläres Protein mit dem ß-Glucuronidase-Substrat 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid inkubiert (2h, 37°C) und die Konzentration des freigesetzten 4-Methylumbelliferons mittels HPLC gemessen (^*signifikanter Unterschied zur Kontrolle, p< 0.05). Senkung der ß-Glucuronidase-Aktivitat in HepG2-Zellen durch Inkubation mit Verapamil, Verapamil-Metabo ten und Gallopamil (Abb 3)

HepG2-Zellen wurden 48h bei 37°C mit 100 μM Verapamil (Vera), je 100μM D617, D702 D703 30μM Norverapamil (Nor) oder 100μM Gallopamil (Gallo) inkubiert Nach Lyse der Zellen wurde die ß-Glucuronidase-Aktivitat mittels 4- Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid-Spaltung bestimmt (signifikanter Unterschied zur Kontrolle, ^*P < 0 01 , ^**p< 0 001 , n = 3 unabhängige Expenemte)

Beispiel 4

Senkung der beta-Glucuronidase-Expresssioπ durch Verapamil in der humanen Hepatom Zellinie HepG2 (Abb 4)

HepG2 Zellen wurden 48 h bei 37°C mit 100 μM Verapamil oder DMSO (Kontrolle) inkubiert Nach Lyse der Zellen wurden 50 μg zellulares Protein mittels SDS-Page aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und anschließend mit dem monoklonalen Antikörper 2156/42 inkubiert. Die Bandenmtensitat wurde densitometπsch bestimmt (DE = densitometπsche Einheiten, * signifikanter Unterschied zur Kontrolle, p < 0 05, n=3 unabhängige Experimente)

Hemmung der Glucuronidasen im Rattendarm durch Verapamil (Vergleich)

In einer Studie mit Spague-Dawley-Ratten wurde die Absorption von oral applizierten Morphιn-6-Glucuronιd (M6G) an zwei Gruppen (Gruppe 1 n=5, ohne Verapamilgabe, Gruppe 2 n=4 vorherige Verapamilgabe) untersucht Die Studie wurde mit Ratten durchgeführt, da diese aus Morphin metabolisch kein M6G bilden [Aasmundstad T A , Biochem Pharmacol (1993) 46 961-968), so daß das im Plasma gemessene M6G ausschließlich aus der Absorption des oral gegebenen M6G entstammt

Wahrend die vorherige Gabe von Verapamil keinen Einfluß auf die Hohe der Plasmakonzentrationen von M6G oder deren Zeitverlauf hatte, waren die Konzentrationen von Morphin und M3G bei vorheriger Verapamil-Gabe (Gruppe 2) deutlich kleiner als bei der Gruppe ohne Verapamil (Gruppe 1) (Abb 5) zentrationen von Morphin und M3G bei vorheriger Verapamil-Gabe (Gruppe 2) deutlich kleiner als bei der Gruppe ohne Verapamil (Gruppe 1) (Fig. 5).

Der fehlende Einfluß auf die Höhe der Plasmakonzentration von M6G oder deren Zeitverlauf macht unwahrscheinlich, daß die Verminderung der Morphin- und M3G- Absorption auf einer Hemmung der intestinalen Motilität [Shah M. H., J. Pharm Pharmacol (1987) 39:1037-1038; Krevsky B., Dig Dis Sei (1992) 37:919-924] beruhen. Es ist bekannt, daß M6G die intestinale Motilität mit gleicher Potenz hemmt wie Morphin [Schmidt IM., Eur J Pharmacol (1994) 255: 245-237]. Eine Steigerung dieser Hemmung durch Verapamil [Shah M. H., J Pharm Pharmacol (1987) 39: 1037-1038] wirkt sich mit aller Wahrscheinlichkeit auf M6G und Morphin gleichermaßen aus. Dagegen wurden nur die Plasmaspiegel von Morphin bzw. M3G, nicht aber von M6G vermindert, d.h. die Spaltung des nach oraler Applikation intestinal verfügbaren M6G zu Morphin wird somit gehemmt. Daraus resultieren geringere Morphin- und in der Folge M3G-Plasmaspiegel, da der größte Teil des absorbierten Morphins durch Glucuronyl-Transferasen zu M3G metabolisiert wird. Die Versuchsdurchführung wird in Beispiel 5 beschrieben.

Beispiel 5

Plasmakonzentrations-Zeit-Verläufe von Morphin-6-Glucuronid (M6G), Morphin und Morphin-3-Glucuronid (M3G) nach oraler Applikation an Sprague-Dawley-Ratten von M6G, mit oder ohne vorherige orale Applikation von Verapamil (Fig. 5).

Die Untersuchung wurde an 9 männlichen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt. Die Ratten wurden in 2 Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 (5 Tiere, Gewicht: 258.6 ±31.2 g) erhielt nur 62.5 mg/kg Morphin-6-Glucuronid (M6G) peroral verabreicht. Gruppe 2 (4 Tiere, Gewicht 272 ± 8g) bekam 15 Minuten vor M6G-Gabe (62.5 mg/kg peroral) 70 mg/kg Verapamil peroral verabreicht. Die Gruppen unterschieden sich hinsichtlich ihres Gewichtes nicht signifikant voneinander (t-Test: t= -0.923, p=0.401 ; Konfidenzintervall für Differenzen Gruppe 1 - Gruppe 2: -51.6 bis 24.8 g).

M6G und Verapamil wurden in Ringer-Laktat gelöst und anschließend mit Tylose- Schleim gemischt. Jeder Ratte wurden 62.5 mg M6G pro kg Körpergewicht in Tylose-Schleim oral verabreicht. 4 Ratten erhielten 15 min vor der Verabreichung von M6G 70 mg Verapamil pro kg Körpergewicht in Tylose-Schleim oral verabreicht.

Zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen von M6G, Morphin und M3G wurden bei jeder Ratte 6 Blutproben (je ca. 200 μl) zu folgenden Zeiten entnommen: vor der Applikation von M6G, sowie 1 , 2, 4, 6 und 8 Stunden nach M6G-Gabe. Die Blutproben wurden in heparinisierte EDTA Kunststoffröhrchen überführt und sofort zentrifugiert. Die bereiteten Plasmaproben wurden bis zur Analyse bei -20°C gelagert. Die Konzentration von M6G, Morphin und Morphin-3-Glucuronid (M3G) wurden mittels HPLC bestimmt (vgl. Hartley R., Biomed Chromatogr (1993) 7: 34- 37). Die Nachweisgrenze lag für alle drei Substanzen bei 10 ng/ml, d.h. 35.05 nmol/l für Morphin und 22.45 nmol/l für die Morphinglucuronide. Der Variationskoeffizient lag im gesamten Kalibrationsbereich (10-500 ng/ml) unter 11%.

Hemmung mikrobieiler beta-Glucuronidase durch Verapamil

Aus Beispiel 5 ist ersichtlich, daß eine Spaltung von Glucuroniden (M6G) im Darm der Ratte erfolgt. Es ist nicht ersichtlich, ob beta-Glucuronidasen der Ratte und/oder mikrobielle beta-Glucuronidasen (z.B. E. coli) für diese Spaltung verantwortlich sind.

Um diese Frage zu klären, wurden beta-Glucuronidasen aus Ratten-Darm- Homogenaten und aus E. coli mit Verapamil oder D-Glucarsäure-1 ,4-lacton in Gegenwart von 4-Methyiumbelliferyl-ß-D-glucuronid (MUG) inkubiert. Die Spaltung von 4-Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronid ist ein Maß für die Aktivität der beta- Glucuronidase. Wie zu erwarten hemmt D-Glucarsäure-1 ,4-lacton sowohl die beta- Glucuronidase-Aktivität der Ratten-Darm-Homogenate als auch die E. co/7-beta- Glucuronidase (Fig. 6 A und B). Überraschender weise wird das bakterielle Enzym von Verapamil deutlich gehemmt (IC₅₀ = 30 μM), hingegen wird die Ratten-beta- Glucuronidase von Verapamil nicht meßbar beeinflußt (Fig. 6 A und B).

Die Versuchsdurchführung wird in Beispiel 6 beschrieben. Beispiel 6

Hemmung der 4-Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronid (MUG) Spaltung durch Verapamil und D-Glucarsäure-1 ,4-lacton (A Ratte, B E. coli) (Fig. 6).

Tiefgefrorenes Gewebepulver einer Ratten-Mucosa (duodenum und jejunum) wurde in 20mM Tris-HCI, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1mM pefabloc® (Fa. Roth, Karlsruhe, Germany) suspendiert. Die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Lowry bestimmt [Lowry O. H., J Biol Chem (1951) 193:265-275]. Die Inkubation und Analyse erfolgte nach: [Sperker B, J Pharmacol Exp Ther (1997) 281 : 914-920]. 50μl Inkubationsmischung enthielten 2.25 ug Ratten-Protein-Homogenat oder 110 pg (0.001 units) gereinigter E. co//^'-beta-Glucuronidase (Fa. Sigma, Deisenhofen, Germany). Die Testpuffer enthielten 0.2 mM MUG (Fa. Sigma, Deisenhofen, Germany).

Die Inkubationsmischungen wurden bei 37°C mit Verapamil oder D-Glucarsäure-1 , 4- lacton versetzt. Nach 10 Minuten wurden die MUG Puffer zugesetzt. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden die enzymatischen Reaktionen durch Zugabe von 150 μl 200 mM Natriumcarbonat-Lösung gestoppt. Nach Zentrifugation (5 min, 13.000 U/min) wurden die Überstände mittels HPLC (Fluoreszenz: Absorption 355 nm, Emission 460 nm) analysiert. Die Enzymaktivität wurde mit der Freisetzung von 4- Methylumbelliferone (MU) korreliert. Die Versuche wurden bei den entsprechenden pH-Optima der beta-Glucuronidasen (pH 7.0 E. coli bzw. pΗ 5.0 Ratte) durchgeführt. Die Ergebnisse der Fig. 6 zeigen, daß Verapamil nicht in der Lage ist die Glucuronidase der Ratte zu inhibieren, jedoch ein guter Inhibitor für die bakteriellen Glucuronidase aus E. coli. ist.

Der bekannte Inhibitor D-Glucarsäure-1 , 4-lacton hemmt dagegen beide Enzyme etwa gleich gut.

Claims

Patentansprüche

1. Verwendung von Verapamil oder Verapamilderivaten zur Hemmung von humaner Gewebeglucuronidase.

2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als Verapa- miiderivate dessen R-Enaπtiomeres, Metabolite von Verapamil, Gallopamil oder chemisch substituierte Derivate von Verapamil, Gallopamil und deren Metabolite oder ihre Salze mit pharmakologisch verträglichen Säuren eingesetzt werden.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die R-Enantiomere in reiner Form oder gegenüber dem Racemat in angereicherter Form eingesetzt werden.

4. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Glucuronidasehemmer mit geeigneten pharmakologisch verträglichen Hilfsstoffen oralen oder parenteralen, in normal freisetzender oder kontrolliert freisetzender Form verwendet wird.

5. Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Glucuronidasehemmer alleine zur Hemmung der ß-Glucuronidase im erkrankten Gewebe eingesetzt wird, um das Fortschreiten der Erkrankung zu verhindern, z.B. durch Hemmung der Tumorprogression oder der Metastasenbildung.

ö. Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Glucuronidasehemmer zur Stabilisierung metabolisch gebildeter Glucuronid- konjugate nebenwirkungsreicher Wirkstoffe eingesetzt wird, um deren Nebenwirkungen zu reduzieren bzw. eine Detoxifizierung einzuleiten. Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Glucuronidasehemmer kombiniert mit einem oral einzunehmenden Glucu- roπidkonjugat eines entzündungshemmenden Wirkstoffes verwendet wird, um dieses im oberen Magen-Darm-Trakt vor einer Spaltung und Resorption zu schützen und in tieferiiegenden Darmabschnitten durch Spaltung für die intestinale Lokaltherapie zu aktivieren.

Verwendung nach Anspruch 1 bis 4 zur Verbesserung der gewebespezifischen Therapie, dadurch gekennzeichnet, daß der Glucuronidasehemmer bei kombinierter Anwendung mit einer Glucuronidprodrug diese vor der Aktivierung im gesunden Gewebe, bei Erhalt der Aktivierung im Zielgewebe, schützt.

Verwendung nach Anspruch 1 bis 4 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß neben dem Glucuronidasehemmer und der Glucuronid-Prodrug an gewebespezifische Substanzen (z.B. Antikörper, Proteine, Liposome) gebundene beta- Glucuronidase kombiniert eingesetzt wird, um die Aktivierung der Prodrug im Zielgewebe zu erhöhen und das gesunde Gewebe vor der Aktivierung zu schützen.