JP2003501384A - ヒトの組織におけるβ−グルクロニダーゼの阻害作用を有する薬剤の製造のためのベラパミル及びベラパミル誘導体の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はグルクロニダーゼをヒト組織において阻害する作用を有する薬剤の製造のためオンベラパミル又はベラパミル誘導体の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、ヒトの組織における酵素β−グルクロニダーゼの阻害のための薬剤
において、治療効果を直接獲得するか、又はグルクロニド化された作用物質もし
くはグルクロニド化可能な作用物質と一緒に組み合わせて使用することによって
治療範囲を改善する目的でのベラパミル又はベラパミル誘導体の使用に関する。

【０００２】 内因性又は外因性の物質とグルクロン酸との抱合はヒト及び動物において重要
な代謝反応である。グルクロン酸は種々の物質、例えば薬剤作用物質及びその代
謝物と抱合することがある。該抱合反応は、活性化されたグルクロン酸（ＵＤＰ
−グルクロン酸）を基質に酵素グルクロニルトランスフェラーゼによって転移さ
せることによって行う。生物は、一般に解毒のために抱合反応を使用する。それ
というのもグルクロン酸抱合物は通常は殆ど毒性はなく、その良好な水溶性に基
づいて腎臓を介して又は腸を介して胆汁分泌物として容易に排除されるからであ
る。また抱合は、非酵素的な経路でも化学合成によって実施できる。

【０００３】 しかしながらグルクロン酸抱合物は、グルクロニダーゼの触媒作用によっても
グルクロン酸に、かつ出発生成物に分解することができる。グルクロニドの分解
は、しばしばそれ自体の排除の後により深くに存在する小腸断片又は大腸におい
て胆汁を介して行う。この場合に生じる出発物質は再び吸収され、従って生物で
は再び活性化される。腸肝循環と呼ばれるプロセスは物質の所望の作用を延長さ
せるが、有毒物質の毒性作用も増大することがある。

【０００４】 種々の組織におけるβ−グルクロニダーゼ活性の薬剤による調節によって、新
規の治療概念が開ける。

【０００５】 ガン治療でのグルクロニダーゼ阻害剤の使用 腫瘍組織の特徴は、その高い濃度のβ−グルコニダーゼもしくは極端に高いグ
ルクロニダーゼ活性である。高められたグルクロニダーゼ活性と緊密に関連して
、一定の腫瘍は転移を形成するようになる。β−グルクロニダーゼ阻害剤の単独
の投与によって、高められたβ−グルクロニダーゼ活性に基づいて悪化及び転移
形成の傾向にある腫瘍では腫瘍グルクロニダーゼの阻害によって腫瘍の拡大が低
減される。サッカロ−１，４−ラクトン、２−アセトアミドグリカール及びヘパ
リン誘導体は前記の目的のために試験された［Bernacki R. J., Cancer Metasta
sis Rev (1985) 4: 81-101; Nakajima M., Journal of Cellular Biochemistry
(1988) 36: 157-167; Niwa T., Journal of Biochemistry (1972) 72: 207-211
］。選択的なグルクロニダーゼ阻害剤は最近では合成されるようになった（Boss
let K., EP0822192）。

【０００６】 その治療のための一般的な使用の他に、グルクロニダーゼ阻害剤はガン患者の
化学療法において所望の効果の増大のために同時に不所望の作用を低減させる場
合にも補助的に使用することができる。

【０００７】 化学療法は、ガン患者の特殊な物理的ストレス及び精神的ストレスを引き起こ
す。グルクロニダーゼ阻害剤は、化学療法の悪影響を和らげ、かつ同時に治療効
率を向上させることができる。そのために、以下の開始点を提供する。

【０００８】 化学療法剤は、とりわけ腸においてグルクロニドを介して排除される。そこに
存在するグルクロニダーゼの作用によって、グルクロニドの分解及び活性細胞毒
性物質の遊離が行われ、これらは恒常的な細胞分裂及び再生にある腸組織を害す
る。これによって、液体損失及び質量損失を伴って不快感、嘔吐及び下痢が患者
に生じる。

【０００９】 β−グルクロニダーゼ阻害剤は、細胞増殖抑制剤のグルクロニドからなる毒性
の生成物に対して腸を保護することができる。このように、例えば抗腫瘍剤であ
るイリノテクタン塩酸塩の腸内毒性はβ−グルクロニダーゼ阻害剤であるバイカ
リンの予防的投与によって低減させることができる。これらの患者はこうして激
しい下痢及びそれに併発する液体損失に対して保護する（Takasuna, K, Jpn J C
ancer Res (1995)86: 978-84; Kamataki T., US-pat. 5,447,719）。

【００１０】 一定の組織中でのグルクロニドの分解を使用する考察は、作用を有する薬剤の
不活性の前駆体（プロドラッグ）から活性物質を遊離することを主張している。
ら患した標的組織における有利な遊離によって、高められた物質濃度を介して僅
かな全身作用で多かれ少なかれ局所的作用を達成する［Sperker B., Clin Pharm
acokinet (1997)33: 18-31］。これらの治療可能性は、とりわけ副作用の多い物
質の使用において腫瘍治療において関心が持たれている。それというのも化学療
法剤の所望の細胞毒性が腫瘍組織に集中的であるからである。腫瘍の悪化及び転
移形成はしばしば高められたβ−グルクロニダーゼ活性と関連している。壊死的
な腫瘍部位において、細胞外空間での高められたグルクロニダーゼ活性が存在す
るが、健康な組織においてはグルクロニダーゼ活性は広範に細胞内に局在してい
る。腫瘍中で酸によって変化されたｐＨ値はβ−グルクロニダーゼの活性をもう
一度高めることができる。これらの生理学的条件は、化学療法剤とのグルクロン
酸抱合物の腫瘍患者への適用のための開始点を局所的に高められたグルクロニダ
ーゼ活性による分解後に作用を有する基質の局所的な遊離のために提供する［Sp
erker B., Clin Pharmacokinet 81997) 33: 18-31］。局所的作用を、グルクロ
ニドプロドラッグ及びβ−グルクロニダーゼと共有結合している腫瘍特異的抗体
の同時の添加によって強化することができる（Antibody-Directed Enzyme Prodr
ug Therapy =ADEPT）［Speaker B., Clin Pharmacokinet (1997) 33: 18-31］。

【００１１】 グルクロニド−プロドラッグの高められた腫瘍選択性は、相応してより高い作
用物質濃度を腫瘍中にもたらし、かつ健康な組織部位においてより低い作用物質
濃度に導く、すなわち化学療法剤の有効性及び認容性が向上する。

【００１２】 公知の例はドキソルビシン−グルクロニド−プロドラッグであり、これらは遊
離のドキソルビシンと比較して腫瘍中で約１０倍高いドキソルビシン濃度を可能
にするが、同時に低められた濃度で健康な組織をいたわるので、例えばドキソル
ビシンの典型的な心臓毒性の特性は二次的な役割だけしか果たさない［Bosslet
K., Cell Biophys (1994) 24-25: 51-63; Bosslet K., Cancer Res (1994)54: 2
151-9; Bosslet K., Cancer Res (1998) 58: 1195-201; Murdter, T. E., Cance
r Res (1997) 57: 2440-5］。

【００１３】 これらの研究のうちいずれも、今までは治療的に使用可能な生成物、すなわち
有用な薬剤に導くことはなかった。

【００１４】 本発明の記載 本発明の課題は、他の薬理学的に効果がないか、又は僅かな効果である、すな
わち低い副作用を有するグルクロニダーゼ阻害剤を見いだし、前記に述べた使用
での薬剤として単独に、又は治療の幅を高めるために別の薬剤と組み合わせて使
用することである。

【００１５】 前記課題はメインクレームの特徴部によって解決され、従属形式請求項の特徴
部によって向上される。

【００１６】 ベラパミルが細菌性のβ−グルクロニダーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の活性を大きな
範囲で阻害することは公知であるが（B. Sperker et al., Eur. J. Clin. Pharm
. (1999), Vol. 55, A. 16）、グルクロニダーゼを、ラット（哺乳動物）の腸組
織においては、Ｅ．ｃｏｌｉからの酵素によるよりもラットの酵素の場合には３
０倍の強度がある公知のグルクロニダーゼ阻害剤、例えばＤ−サッカリン酸−１
，４−ラクトースとは異なって阻害しない。

【００１７】 意想外にも、ベラパミルはヒトの組織中に存在するβ−グルクロニダーゼに強
力な阻害作用を及ぼすことが判明した。この阻害は、体重１ｋｇ及び１日あたり
１〜１０ｍｇの投与でラセミ混合物及び純粋なエナンチオマーによって同程度で
生じる。カルシウムアンタゴニストとして知られるベラパミルの心臓及び脈管系
への種々の作用は実質的にＳ−エナンチオマーに由来することは公知である［Mi
ckisch G. H., J Cancer Res Clin Oncol (1995) 121 (Suppl 3): R11-R16］。
従って、ほとんど心臓活性作用を有さないベラパミルのＲ−エナンチオマーもし
くはベラパミル誘導体の使用においてはβ−グルコニダーゼ活性に対する所望の
阻害作用が、ベラパミルに関して知られている薬理学的な作用が不所望の副作用
として生じないで達成されえる。

【００１８】 特に、ベラパミルもしくはその誘導体からなる遅延性薬剤の補助的な経口投与
が、長期間にわたり腸を低毒性のβ−グルクロニドからの毒性分解生成物に対し
て保護すべき使用のために規定される。ガン治療において補助的な投与を行う場
合において、ベラパミル型の阻害剤のもたらされる組織的な分配も欠点である。
ベラパミルが、化学療法に耐性の癌細胞の治療に有利な影響を及ぼすことは公知
である［Volm M., Anticancer Res 18(C4): 2905-1; Wainer I. W. Ann Oncol (
1993)4(Suppl 2):7-13］。そこには、作用様式の種々のメカニズムが議論されて
おり、その際、ベラパミルは化学療法剤を癌細胞から能動的に排出するのを抑え
［Simpson W. G., Cell Calcium (1985)6: 449-67］、又は多剤耐性遺伝子の発
現をほぼ阻止する［Ling V., Cancer Chemother Pharmacol (1997) 40 (Suppl):
S3-S8; Mickisch G. H., J Cancer Res Clin Oncol (1995) 121 (Suppl 3): R1
1-R16］。β−グルクロニダーゼの関与はそのメカニズムにおいては存在しない
。

【００１９】 ベラパミル型のグルクロニダーゼ阻害剤は化学療法においては新規のグルクロ
ニド−プロドラッグ−化学療法剤と組み合わせて補助的に使用することができる
。ベラパミル型のグルクロニダーゼ阻害剤による治療補助は、健康な組織を化学
療法剤の作用、特に刺入部位又は別の供給部位の高い局所的濃度の作用に対して
保護することを含む。

【００２０】 ベラパミル添加及び投与は、注入入口で局所的に健康な組織を痛めないように
行う、すなわち本願ではグルクロニダーゼを阻害するが、腫瘍組織中での組織的
な完全混和の後に腫瘍グルクロニダーゼの不活性化が行われない。

【００２１】 生理学的に殆ど安定でないグルクロニドプロドラッグは薬理学的にグルクロニ
ダーゼ阻害剤のベラパミルの添加によって、まず生物中での組織的な完全混和の
後に、有利には標的組織中で分解が生じるように安定化されていてよい。

【００２２】 生物学的に不活性のグルクロニドプロドラッグをβ−グルクロニダーゼ阻害剤
と一緒に添加する場合には、有効な基質への分解が遅延されるので、プロドラッ
グの場合には長期の解毒半減期で組織的な使用可能性が延長される。相応して用
量は少なくなり、かつ投与間隔を延長することができる。

【００２３】 腫瘍特異的なプロドラッグ治療においては、細胞膜貫通型のβ−グルクロニダ
ーゼ阻害剤、例えばベラパミルの付加的な投与によって治療の幅が、十分に細胞
内に存在するβ−グルクロニダーゼが健康な組織を阻害し、かつそれによって薬
理学的な作用が妨げられることによって広がる。腫瘍組織において、生理学的に
またはＡＤＥＰＴ−治療によって高められたグルクロニダーゼ濃度によって有効
な基質は依然として適当な用量選択において形成する。

【００２４】 本発明で請求されるβ−グルクロニダーゼ活性に対する阻害作用を、以下に挙
げられる結果で証明する。

【００２５】 ベラパミル、その代謝物及びガロパミルによるヒトのβ−グルクロニダーゼ活
性の低下のための試験 カルシウム−アンタゴニストであるベラパミル（ラセミ体でも両エナンチオマ
ーでも）、その代謝物及び誘導体であるガロパミルはヒトのβ−グルクロニダー
ゼの活性を低下させることができる。

【００２６】 β−グルクロニダーゼ活性の直接の阻害はヒトの肝臓ホモジェネートを使用す
る試験によって示すことができた。このために種々の肝臓試料のホモジェネート
を２．５ｍＭの４−メチルベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）とイ
ンキュベートし、ＨＰＬＣによって分析した。遊離した４−メチル−ウンベリフ
ェロンの濃度は、β−グルクロニダーゼの活性のための尺度である。ＭＵＧのほ
かに更に１００μＭのベラパミル（ラセミ体）を保持するホモジェネートにおい
ては、活性は、コントロール試料に対して約２５％だけ大きく低下した（図１）
。

【００２７】 並行して、ベラパミル、代謝物であるノルベラパミル、Ｄ７０２、Ｄ７０３及
びガロパミルをヒトのヘパトーム細胞系統ＨｅｐＧ２中で４８時間のインキュベ
ートの後に酵素の低下された発現に由来する５０〜６５％へのβ−グルクロニダ
ーゼ活性の低下をもたらした。この活性の低下は濃度依存性である（図２）。

【００２８】 β−グルクロニダーゼ活性の低下は、同様にベラパミル−ラセミ体及びＲ−ベ
ラパミル及びＳ−ベラパミルによっても強く観察されえる。代謝物であるノルベ
ラパミル、Ｄ７０２及びＤ７０３はＨｅｐＧ２細胞中でβ−グルクロニダーゼの
活性に対して匹敵する効果を示す。Ｄ６１７という更なる代謝物でのインキュベ
ーションは、統計的にあまり重要でない１２％だけの活性の低下のみをもたらす
。ガロパミルはベラパミルに匹敵する効果をもたらす（図３）。

【００２９】 例１ ベラパミルによるヒトの肝臓−β−グルクロニダーゼ活性の阻害 ヒトの肝臓ホモジェネートを、酵素−基質の４−メチルベリフェリル−β−Ｄ
−グルクロニドとインキュベートした（１時間、３７℃）。１００μＭのベラパ
ミル又はＤＭＳＯ（コントロール）を反応混合物に添加した。４−メチルウンベ
リフェロンの遊離をＨＰＬＣ分析によって測定した（*コントロールに対する大
きな差異；ｐ＜０．００１；ｎ＝３独立試験）。

【００３０】 例２ ヒトのヘパトーム細胞系統ＨｅｐＧ２におけるベラパミル作用の濃度依存性（
図２） ＨｅｐＧ２細胞を３７℃で、図２に挙げられる濃度のベラパミルと一緒に４８
時間インキュベートした。細胞の溶解の後に、それぞれ２．２５μｇの細胞性タ
ンパク質をβ−グルコニダーゼ−基質である４−メチルウンベリフェリル−β−
Ｄ−グルクロニドと一緒にインキュベート（２時間、３７℃）し、遊離した４−
メチルウンベリフェロンの濃度をＨＰＬＣによって測定した（*コントロールと
の大きな差異、ｐ＜０．０５）。

【００３１】 ベラパミル、ベラパミル−代謝物及びガロパミルとのインキュベートによるＨ
ｅｐＧ２細胞におけるβ−グルクロニダーゼ活性の低下（図３） ＨｅｐＧ２−細胞は１００μＭのベラパミル（Ｖｅｒａ）、それぞれ１００μ
ＭのＤ６１７、Ｄ７０２、Ｄ７０３、３０μＭのノルベラパミル（Ｎｏｒ）又は
１００μＭのガロパミル（Ｇａｌｌｏ）と一緒に３７℃で４８時間インキュベー
トした。細胞の溶解の後に、β−グルクロニダーゼ活性を４−メチルウンベリフ
ェリル−β−Ｄ−グルクロニド分解によって測定した（コントロールに対する大
きな差異、*Ｐ＜０．０１、**Ｐ＜０．００１；ｎ＝３独立試験）。

【００３２】 例４ ヒトのヘパトーム細胞系統ＨｅｐＧ２によるβ−グルクロニダーゼの発現の低
下（図４） ＨｅｐＧ２細胞を１００μＭのベラパミル又はＤＭＳＯ（コントロール）と一
緒に３７℃で４８時間インキュベートした。細胞の溶解の後に、５０μｇの細胞
性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース上にトラン
スファーし、引き続きモノクローナル抗体２１５６／４２とインキュベートした
。バンドの強度をデンシトメトリーによって測定した（ＤＥ＝デンシトメトリー
単位；*コントロールに対する大きな差異、ｐ＜０．０５；ｎ＝３独立試験）。

【００３３】 ラットの腸におけるベラパミルによるグルクロニダーゼの阻害（比較） Spague−Dawley−ラットを使用する研究において、経口投与されたモルフィン
−６−グルクロニド（Ｍ６Ｇ）の吸収を２つの群（群１：ｎ＝５ベラパミルを未
添加；群２：ｎ＝４予めベラパミルを添加）で試験した。この研究を複数のラッ
トで実施した。それというのもモルフィンからＭ６Ｇは代謝によって形成されな
い［Aasmundstad T. A., Biochem Pharmacol (1993) 46: 961-968］ので、血漿
中で測定されたＭ６Ｇは専ら経口的に投与されたＭ６Ｇの吸収に由来するからで
ある。

【００３４】 ベラパミルを予め添加することはＭ６Ｇの血漿濃度の高さ又はその時間経過に
影響はないが、モルフィン及びＭ３Ｇの濃度はベラパミルを予め添加する場合に
（群２）ベラパミルを添加しない群（群１）よりも明らかに低かった（図５）。

【００３５】 モルフィン及びＭ３Ｇの濃度はベラパミルを予め添加する場合に（群２）ベラ
パミルを添加しない群（群１）よりも明らかに低かった（図５）。

【００３６】 Ｍ６Ｇの血漿濃度の高さ又はその時間経過への乏しい影響は、モルフィン吸収
及びＭ３Ｇ吸収の低下が腸運動の抑制を原因とすることはあり得ない［Shah M.
H., J. Pharm Pharmacol (1987) 39:1037-1038; Krevsky B., Dig Dis Sci (199
2) 37: 919-924］。Ｍ６Ｇはモルフィンと同じ能力で腸運動を抑制することは公
知である［Schmidt N., Eur J Pharmacol (1994)255: 245-237］。ベラパミルに
よる前記の抑制の減少［Shah M. H., J Pharm Pharmacol (1987) 39: 1037-1038
］はＭ６Ｇ及びモルフィンにも同様に影響を及ぼすものと考えられる。それに対
して、モルフィンもしくはＭ３Ｇの血漿濃度だけが低下するが、Ｍ６Ｇの血漿濃
度は低下しない、すなわち経口投与の後に腸で使用可能なＭ６Ｇをモルフィンに
分解することを阻害する。そこから、吸収されたモルフィンの大部分がグルクロ
ニル−トランスフェラーゼによってＭ３Ｇに代謝されるので僅かなモルフィン血
漿濃度及び結果としてはＭ３Ｇ血漿濃度が得られる。試験の実施を例５に記載す
る。

【００３７】 例５ ベラパミルを予め経口投与するか、又はせずに、Sprague−Dawley−ラットに
Ｍ６Ｇを経口投与した後のモルフィン−６−グルクロニド（Ｍ６Ｇ）、モルフィ
ン及びモルフィン−３−グルクロニド（Ｍ３Ｇ）の血漿濃度−時間経過（図５） ９匹の雄のSprague−Dawley−ラットに試験を実施した。これらのラットを２
つの群に分けた：群１（５匹、体重：２５８．６±３１．２ｇ）に６２．５ｍｇ
／ｋｇのモルフィン−６−グルクロニド（Ｍ６Ｇ）を経口投与した。群２（４匹
、体重２７２±８ｇ）にはＭ６Ｇの添加（６２．５ｍｇ／ｋｇ 経口）の１５分
前に７０ｍｇ／ｋｇのベラパミルを経口投与させた。これらの群はそれらの体重
に関してはそれほど大きく異ならない（ｔ−試験：ｔ＝−０．９２３，ｐ＝０．
４０１、群１−群２の差に関する信頼区間：−５１．６〜２４．８ｇ）。

【００３８】 Ｍ６Ｇ及びベラパミルをリンゲル−ラクテートに溶解させ、引き続きチロース
−粘液（Tylose Schleim）と混合した。それぞれのラットをチロース粘液中の体
重１ｋｇあたり６２．５ｍｇのＭ６Ｇを経口投与した。４匹のラットはＭ６Ｇの
投与の１５分前にチロース粘液中の体重１ｋｇあたり７０ｍｇのベラパミルを経
口投与させた。

【００３９】 Ｍ６Ｇ、モルフィン及びＭ３Ｇの血漿濃度の測定のために、それぞれのラット
において６つの血液試料（それぞれ約２００μｌ）を以下の時間に採取した：Ｍ
６Ｇの投与前並びにＭ６Ｇ投与の１時間、２時間、４時間、６時間及び８時間後
。これらの血液試料をヘパリン処理されたＥＤＴＡプラスチックチューブに移し
、直ちに遠心分離した。調製された血漿試料を分析まで−２０℃に保管した。Ｍ
６Ｇ、モルフィン及びモルフィン−３−グルクロニド（Ｍ３Ｇ）の濃度はＨＰＬ
Ｃによって測定した（Hartley R., Biomed Chrmatogr (1993)7: 34-37）。検出
限界は全ての３種の物質については１０ｎｇ／ｍｌ、すなわちモルフィンに関し
ては３５．０５ナノモル／ｌ及びモルフィングルクロニドに関しては２２．４５
ナノモル／ｌにある。変動係数は全体の較正範囲（１０〜５００ｎｇ／ｍｌ）に
おいては１１％未満にある。

【００４０】 ベラパミルによる細菌性のβ−グルクロニダーゼの阻害 例５から、ラットの腸におけるグルクロニド（Ｍ６Ｇ）の分解が行われること
は明らかである。ラットのβ−グルクロニダーゼ及び／又は細菌性のβ−グルク
ロニダーゼ（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が前記の分解の原因であるかは明らかではな
い。

【００４１】 この疑問を明確にするために、ラットの腸のホモジェネートからのβ−グルク
ロニダーゼ及びＥ．ｃｏｌｉからのβ−グルクロニダーゼをベラパミル又はＤ−
グルカル酸−１，４−ラクトンと一緒に４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−
グルクロニド（ＭＵＧ）の存在下にインキュベートした。４−メチルウンベリフ
ェリル−β−Ｄ−グルクロニドの分解はβ−グルクロニダーゼの活性に関する尺
度である。案の定、Ｄ−グルカル酸−１，４−ラクトンは、ラット腸のホモジェ
ネートのβ−グルクロニダーゼ活性もＥ．ｃｏｌｉのβ−グルクロニダーゼも阻
害する（図６Ａ及びＢ）。意想外にも、ベラパミルによって細菌性の酵素が明ら
かに阻害され（ＩＣ_５０＝３０μＭ）、それに対してラットのβ−グルクロニダ
ーゼはベラパミルによって測定不可能な影響を受ける（図６Ａ及びＢ）。

【００４２】 試験実施は例６に記載する。

【００４３】 例６ ベラパミル及びＤ−グルカル酸−１，４−ラクトン（Ａラット、Ｂ Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）による４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）分
解の阻害（図６） ラット粘膜（十二指腸及び空腸）の冷凍組織粉末を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのpefabloc^（Ｒ）（Fa. Roth, Ka
rlsruhe, Germany）中に懸濁した。タンパク質濃度をローリー法によって測定し
た（Lowry O. H., J Biol Chem (1951) 193:265-275）。インキュベーション及
び分析は［Sperker B, J Pharmacol Exp Ther(1997)281:914-920］に従って実施
した。５０μｌのインキュベーション混合物は２．２５μｇのラットタンパク質
ホモジェネート又は１１０ｐｇ（０．００１ユニット）の精製されたＥ．ｃｏｌ
ｉのβ−グルクロニダーゼ（Fa. Sigma, Deisenhofen, Germany）を含有してい
る。試験バッファーは０．２ｍＭのＭＵＧ（Fa. Sigma, Deisenhofen, Germany
）を含有している。

【００４４】 該インキュベーション混合物をベラパミル又はＤ−グルカル酸−１，４−ラク
トンと３７℃で混合した。１０分後に、ＭＵＧバッファーを添加した。３７℃で
１時間経過したら、酵素反応を１５０μｌの２００ｍＭの炭酸ナトリウム溶液の
添加によって停止させた。遠心分離（５分間、１３０００回転／分）の後に、上
清をＨＰＬＣ（蛍光：吸収３５５ｎｍ、放出４６０ｎｍ）によって分析した。酵
素活性を４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）によって較正した。これらの試験
はβ−グルクロニダーゼの相応するｐＨ最適値（ｐＨ７．０ Ｅ．ｃｏｌｉもし
くはｐＨ５．０ ラット）で実施した。図６の結果はベラパミルがラットのグル
クロニダーゼを阻害しないが、Ｅ．ｃｏｌｉからの細菌性グルクロニダーゼのた
めの良好な阻害剤であることを示している。

【００４５】 公知の阻害剤であるＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンはそれに対して両者の
酵素をほぼ同様に良好に阻害する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は１００μＭのベラパミル（ラセミ体）を保持するホモジェネートにおけ
るコントロール試料の活性を示すグラフである。

【図２】 図２はヒトのヘパトーム細胞系統ＨｅｐＧ２におけるベラパミル作用の濃度依
存性に関する試験データを示すグラフである。

【図３】 図３はベラパミル、ベラパミル−代謝物及びガロパミルとのインキュベートに
よるＨｅｐＧ２細胞におけるβ−グルクロニダーゼ活性の低下に関する試験デー
タを示すグラフである。

【図４】 図４はヒトのヘパトーム細胞系統ＨｅｐＧ２によるβ−グルクロニダーゼの発
現の低下に関する試験データを示すグラフである。

【図５】 図５はベラパミルを予め経口投与するか、又はせずに、Sprague−Dawley−ラ
ットにＭ６Ｇを経口投与した後のモルフィン−６−グルクロニド（Ｍ６Ｇ）、モ
ルフィン及びモルフィン−３−グルクロニド（Ｍ３Ｇ）の血漿濃度−時間経過に
関する試験データを示すグラフである。

【図６】 図６はベラパミル及びＤ−グルカル酸−１，４−ラクトン（Ａラット、Ｂ Ｅ
．ｃｏｌｉ）による４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵ
Ｇ）分解の阻害に関する試験データを示すグラフである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１２月１５日（２０００．１２．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３１】 例３ ベラパミル、ベラパミル−代謝物及びガロパミルとのインキュベートによるＨ
ｅｐＧ２細胞におけるβ−グルクロニダーゼ活性の低下（図３） ＨｅｐＧ２−細胞は１００μＭのベラパミル（Ｖｅｒａ）、それぞれ１００μ
ＭのＤ６１７、Ｄ７０２、Ｄ７０３、３０μＭのノルベラパミル（Ｎｏｒ）又は
１００μＭのガロパミル（Ｇａｌｌｏ）と一緒に３７℃で４８時間インキュベー
トした。細胞の溶解の後に、β−グルクロニダーゼ活性を４−メチルウンベリフ
ェリル−β−Ｄ−グルクロニド分解によって測定した（コントロールに対する大
きな差異、*Ｐ＜０．０１、**Ｐ＜０．００１；ｎ＝３独立試験）。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】削除

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年６月１９日（２００１．６．１９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ １２３ １２３ (72)発明者 ベルンハルト シュペルカー ドイツ連邦共和国 グライフスヴァルト シュタインシュトラーセ 43 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 AA95 BB01 CC16 CC27 EE41 4C206 AA01 AA02 HA13 MA01 MA04 MA72 MA75 NA03 NA06 NA13 NA14 ZA66 ZB11 ZB26

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトの組織グルクロニダーゼの阻害のためのベラパミル又は
   ベラパミル誘導体の使用。
2. 【請求項２】 ベラパミル誘導体として、そのＲ−エナンチオマー、ベラパ
   ミルの代謝物、ガロパミル又はベラパミル、ガロパミル及びそれらの代謝物の化
   学的に置換された誘導体または製薬学的に認容性の酸とのこれらの塩を使用する
   、請求項１記載の使用。
3. 【請求項３】 Ｒ−エナンチオマーを、純粋形又はラセミ体に対して濃縮さ
   れた形で使用する、請求項１又は２記載の使用。
4. 【請求項４】 適当な薬理学的に認容性の助剤を有するグルクロニダーゼ阻
   害剤を経口又は非経口の、通常に遊離する形で、又は制御されて遊離する形で使
   用する、請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
5. 【請求項５】 グルクロニダーゼ阻害剤を単独でβ−グルクロニダーゼの阻
   害のためにら患した組織に使用して、病気の進行を、例えば腫瘍悪化又は転移形
   成の阻害によって妨げる、請求項１から４までのいずれか１項記載の使用。
6. 【請求項６】 グルクロニダーゼ阻害剤を、代謝によって形成される副作用
   が多い作用物質とのグルクロニド抱合体を安定化させるために使用し、その副作
   用を低減させるか、もしくは解毒に導く、請求項１から４までのいずれか１項記
   載の使用。
7. 【請求項７】 グルクロニダーゼ阻害剤を、炎症を抑制する経口投与される
   べき作用物質のグルクロニド抱合体と組み合わせて使用して、これを上部の胃腸
   管で分解及び吸収から保護し、深くに存在する腸部分において腸の局所治療のた
   めに分解によって活性化させる、請求項１から４までのいずれか１項記載の使用
   。
8. 【請求項８】 グルクロニダーゼ阻害剤が、グルクロニドプロドラッグと組
   み合わせて使用する場合にこれを標的組織における活性化の保持下に健康な組織
   における活性化に対して保護する、請求項１から４までのいずれか１項記載の使
   用。
9. 【請求項９】 グルクロニダーゼ阻害剤及びグルクロニド−プロドラッグの
   他に組織特異的な物質（例えば抗体、タンパク質、リポソーム）に結合したβ−
   グルクロニダーゼを組み合わせて使用して、標的組織におけるプロドラッグの活
   性化を高め、健康な組織を活性化から保護する、請求項１から４までのいずれか
   １項又は請求項８記載の使用。