WO2000065059A1 - Spleissfaktor - Google Patents

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WO2000065059A1
WO2000065059A1 PCT/AT2000/000100 AT0000100W WO0065059A1 WO 2000065059 A1 WO2000065059 A1 WO 2000065059A1 AT 0000100 W AT0000100 W AT 0000100W WO 0065059 A1 WO0065059 A1 WO 0065059A1
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atsrp30
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proteins
plant
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Andrea Barta
Sergyi Lopato
Maria Kalyna
Silke Dorner
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Österreichisches Forschungszentrum Seibersdorf Gesellschaft M.B.H.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the invention relates to proteins with splicing factor activity in plants.
  • Alternative pre-mRNA splicing is part of the expression program of a large number of genes in animals and plants. It enables the selection of different combinations of splice sites within a given pre-mRNA, whereby structurally and functionally different protein isoforms are formed (Breitbart et al. 1987; Manley and Tacke 1996; Cäceres and Krainer 1997).
  • Several protein factors have been described that are involved in regulating alternative splicing, including a family of RNA binding proteins with arginine / serine rich regions (SR proteins) (for a review, see Fu 1995; Chabot 1996; Valcarcel and Green 1996; Cäceres and Krainer 1997).
  • SR proteins are highly conserved nuclear phosphoproteins that are members of a protein family and share a serine-phospho-epitope that is recognized by the monoclonal antibody mAbl04 (Roth et al. 1991). They consist of at least one RNA-binding domain (RBD) [the typical RBD or RNA recognition motif (RRM) domain of about 80 amino acids] (Birney et al. 1993) and have several serine / arginine (SR-) Dipeptides near the carboxy ends (Zahler et al. 1992). In general, SR proteins are a defined subset of a large superfamily of nuclear proteins with RS-rich domains of variable sequence and position (Fu 1995).
  • the human SF2 / ASF splice factor a prototype of an SR protein, is essential for the first cleavage step in pre-mRNA splicing (Krainer et al. 1990b; Ge et al. 1991) and can also determine which 5 '- Splice site in pre-mRNAs with alternative sites is selected (Ge and Manley 1990; Krainer et al. 1990a).
  • the preferred use of the proximal 5 'splice at higher concentrations of SF2 / ASF is counteracted by members of the hnRNP A / B family of proteins (Mayeda and Krainer 1992; Mayeda et al.
  • SF2 / ASF and any other SR protein can complement S 100 extracts with a splice deficiency that are essentially devoid of SR proteins, but individual SR roteins sometimes show distinct specificity and efficiency in splicing various pre-mRNAs (Krainer et al. 1990b; Ge et al. 1991; Fu and Maniatis 1992; Kim et al.
  • RNA-binding specificity is conferred on an SR protein by the RRM region and neighboring sequences (Cäceres and Krainer 1993; Zuo and Manley 1993; Tacke and Manley 1995; Allain and Howe 1997; Tacke et al. 1997); the different RS domains are primarily responsible for protein-protein interactions that are modulated by the phosphorylation status of these regions (Wu and Maniatis 1993; A rein et al. 1994; Kohtz et al. 1994; Zuo and Maniatis 1996; Xiao and Manley 1997). In addition, RS domains have been shown to modulate RNA binding activity and sub-nuclear localization of SR proteins (Li and Bingham 1991; Hedley et al.
  • SR proteins could work by bridging splice sites through RNA-protein and protein-protein interactions, thus establishing early interactions for the splice site definition and for the assembly of spliceosomes. These interactions are stimulated by the binding of SR proteins to nearby amplifier sequences and modulated by the phosphorylation / dephosphorylation of the RS regions. There is limited information about the regulation of SR protein expression in vivo. With SF2 / ASF and SRp20, significant differences in mRNA and protein values were observed in different cell types and tissues (Jumaa et al. 1997; Hanamura et al. 1998).
  • SC35 expression is also very variable in cell lines (Fu and Maniatis 1992; Vellard et al. 1992), and some SR proteins are activated by mitogens (Diamond et al. 1993; Screaton et al. 1995).
  • some alternative spliced SR protein mRNAs have been described which code for truncated proteins with as yet unknown function (Ge et al. 1991; Cavaloc et al. 1994; Screaton et al. 1995; Jumaa et al. 1997).
  • Human SRp20 self-regulates its expression at the splicing level by binding to its own pre-mRNA, thus preventing over-expression of the active protein (Jumaa and Nielsen 1997).
  • SR proteins play a critical role in selecting the right splice site in mammals, it is interesting to characterize the corresponding protein family in plants.
  • mAbl04 antibody or a specific monoclonal antibody raised against human SF2 / ASF could be shown to have SR proteins including SF2 / ASF-like proteins (Lopato et al. 1996a).
  • the vegetable SR proteins are of different sizes and are smaller than 55 kD. It could also be shown that plant SR proteins are active in constitutive and alternative splicing when examined in heterologous HeLa cell extracts.
  • arginine / serine-rich proteins from Arabidopsis were characterized that belong to two different families (Lopato et al. 1996b; 1999). Both families have good homology with animal SR proteins in the amino-terminal RRM, but their carboxy-terminal domains are richer in arginine than in serine, have fewer SR dipeptides, and are therefore referred to as RS proteins. Nevertheless, these proteins are recognized by the mAbl04 antibody and can efficiently complement HeLa S100 extracts that lack SR protein.
  • Influencing the splicing process in plants is one of the ways to achieve improved plants.
  • the object of the present invention is therefore to provide new plant splice factors that can be used in the context of biotechnology.
  • the protein according to the invention is preferably characterized in that it has the sequence of amino acids 1 to 4, 7 to 19, 22 to 72, 74 to 85, 96 to 141, 149 to 153, 156 to 172, amino acid 168 being variable, however is not D or N, has the protein according to Fig.L A of the Appendix.
  • the highly conserved sequences specified are preferably arranged such that the distances approximately between the named sequences correspond to those according to FIG. 1A of the appendix, advantageously not more than 5 amino acid deletions or amino acid insertions being provided. Sequences are particularly preferred in which there is either no deletion or only a single deletion or insertion between the preserved sequences.
  • the protein according to the invention can have one or more amino acid substitutions compared to the protein shown in FIG. 1A of the appendix, as long as the sequence of amino acids 1 to 4, 7 to 19, 45 to 52, 111 to 116 and 149 to 153 of the protein according to FIG. l A of the Appendix or the function of the protein as a splice factor is not affected.
  • the function as a splice factor is then considered to be affected if, for example, the protein is only 10 to 20% of the natural activity of the protein according to FIG. 1A of the appendix.
  • Amino acid substitutions can be provided in particular in the region of the amino acids not marked as conserved in FIG. 2 of the appendix, especially if they do not significantly influence the three-dimensional structure or the charge distribution of the protein. In these regions, the exchange of hydrophobic amino acids with one another or the exchange of aromatic amino acids with one another is possible if the natural activity is not lost as a result.
  • Proteins are particularly preferred which contain an amino acid sequence which comprises at least 95%, in particular at least 98%,
  • the S-rich sequence between amino acid 95 and 102 of the sequence according to FIG. 1A of the appendix preferably contains at least 4, in particular at least 7, serine residues. It is advantageously G-free, in particular free of GGR or GGR repeats.
  • the protein of the invention can also be made available from other plants by standard methods of molecular biology due to the high homology of such proteins, for example by PCR-coupled cloning methods or by other screening of gene libraries, for example with the sequence according to FIG. 1A of the appendix.
  • the present invention relates to nucleic acid molecules that either comprise a nucleic acid sequence according to FIG. 1A of the appendix or comprise a nucleic acid sequence which codes for a protein according to the invention or have a nucleic acid sequence which binds to the nucleic acid molecule according to FIG. 1A under stringent conditions and codes for a splice protein active in plants or is complementary thereto is.
  • Stringent conditions mean, for example, hybridization in 7% SDS, 0.5 M NaP04, pH 7.0, 1 mM EDTA at 50 ° C. with subsequent washing with 3% SDS.
  • RNA molecules can be both DNA and RNA molecules.
  • RNA molecules the alternatively spliced forms, in particular those as described in the appendix, represent preferred embodiments of the present invention.
  • the invention also relates to a biologically functional vector, which is characterized in that it comprises a nucleic acid molecule according to the invention.
  • the invention further relates to a system comprising a nucleic acid which codes for a protein according to one of the claims and a nucleic acid which
  • AtSRp34 / SRl protein from Arabidopsis thaliana or for the protein corresponding to that in FIG. 1A from a plant other than Arabidopsis thaliana or for a protein derived from these proteins, wherein at least one of the nucleic acids under the control of one not naturally with them Nucleic acid-linked promoter stands.
  • Proteins derived from atSRp34 / SRl are also to be understood as those proteins which define the proteins according to the invention in an analogous manner starting from the protein shown in FIG. 1A. Both nucleic acids are preferably controlled by promoters which are not naturally linked to these nucleic acids.
  • At least one of the promoters under whose control the nucleic acids are preferably an inducible promoter.
  • the nucleic acid which codes for a protein according to the invention is under the control of a promoter which brings about an overexpression of this protein.
  • the nucleic acid which codes for a protein according to the invention is preferably under the control of a promoter which prevents the expression of this protein under defined conditions and enables the expression of this protein under defined other conditions.
  • the present invention relates to transgenic plants or plant cells which express a protein according to the invention and comprise a nucleic acid molecule according to the invention, a vector according to the invention or a system according to the invention.
  • the present invention further relates to the use of a protein according to the invention, a nucleic acid according to the invention, a vector according to the invention or a system according to the invention for changing the splicing properties of a plant cell or a plant.
  • the objects according to the invention can be used to change the development behavior of a plant.
  • a special aspect is the use for delaying the flowering of plants.
  • a delay in the flowering of a plant compared to the wild type is at least 15%, preferably at least 25%, can be brought about, for example if the protein according to the invention is placed under the control of a strong promoter.
  • Particularly preferred plants in the context of the present invention are the economic useful plants, such as cereals, beans, rice or fruit plants.
  • Figure 1A Genome sequence of atSRp30; Promoter and intron sequences are in lower case, cDNA sequences are in upper case, and the TATA box in bold italics.
  • the derived protein sequence is indicated under the DNA in the one-letter code.
  • the bold sequence in the tenth intron is contained in alternatively spliced mRNAs, and the underlined sequence is included when both 3 'and 5' cryptic splice sites are used.
  • the conserved RNP sub-motifs of both RRMs are shown in a box. The open arrows mark the ends of promoter sequences that were used for expression studies.
  • Solid horizontal arrows indicate the ends of the PCR product obtained with degenerate primers and used as a probe for library screening, () The end of the GatSRp30 clone.
  • the sequence data of the atSRp30 gene were entered into the EMBL database (accession number AJ131214).
  • FIG. 1B Schematic representation of GatSRp30, its mRNA isoforms, and derived proteins. Exons are shown as boxes and introns as lines (bold lines: introns that are contained in the alternative spliced mRNAs). Exonic 5 'and 3' untranslated regions are shaded gray and the coding regions are black. (*) The new stop codon in the alternative spliced products.
  • Fig. IC Schematic representation of GatSRp34, its mRNA isoforms and derived proteins. The drawings are as in B (accession number AF001035).
  • 1D Genomic partial sequence of atSRp34 / SRl, starting with exon 10 up to the stop codon.
  • the bold sequence in the long intron is contained in alternatively spliced mRNAs; the underlined sequence is included when both 3 'and 5' cryptic splices are used.
  • Fig. 2 Alignment of Arabidopsis atSRp30, atSRp34 / SRl and human SF2 / ASF protein sequences (single color area). Positions in which a single residue occurs in at least two of the sequences (shaded areas). Conservative substitutions such as RK, IVL, ED, FY, ST. The positions of the conserved RNP-1 and RNP-2 sub-motif and the glycine-rich region are indicated.
  • Fig. 3 Expression of atSRp30 and atSRp34 / SRl in Arabidopsis thaliana of the wild type.
  • A Expression in various plant tissues. Northern blot analyzes of poly (A) + RNA from leaves (L), stems (S), roots (R) and flowers (F) are shown. One microgram of RNA was loaded per lane, and the blots were probed either with a probe corresponding to the tenth intron of GatSRp30, or with the cDNAs from atSRp30 or atSRp34 / SRl.
  • B, C Developmental expression of atSRp30. Total RNA was isolated from the whole plant on different days during development, starting from the day of germination.
  • RNA was either used for Northern blot analysis with 10 ⁇ g / lane total RNA and the membrane probed with atSRp30 cDNA (B), or it was used for the analysis of the RT-PCR products on 1.2% agarose gel ( C).
  • the two primers for the PCR reaction were in the exons next to the tenth intron.
  • Fig. 4 Immunodetection of phosphorylated and dephosphorylated SR proteins from cell cultures of Arabidopsis.
  • A Immune detection of proteins in SR protein preparations (lanes 1 to 4).
  • (Lane 1) monoclonal antibody mAbl04, which is specific for a common phosphoepitope of SR proteins;
  • (Lane 2) Polyclonal antibody raised against recombinant atSRp30;
  • (Lane 3) polyclonal antibody raised against recombinant atSRp34 / SRl;
  • (Lane 4) Monoclonal antibody specific for human SF2 / ASF. Protein arkers are shown on the left.
  • (B, C) Dephosphorylation of SR proteins with alkaline phosphatase.
  • Fig. 5 Transcriptional analysis of atSRp30 (A-D) and atSRp34 / SRl (E-H) promoter-GUS fusions in transgenic Arabidopsis. GUS staining of (A, E) flowers in the post-flowering stage; (B, F) coloring patterns in the leaves; (C, G) primary and developing lateral roots; (D, H) seedlings (2 days after germination).
  • Fig. 6 Overexpression of atSRp30 in transgenic Arabidopsis plants.
  • the cDNA and genomic sequences of atSRp30 were cloned under the control of the strong 35S CaMV promoter (constructs pC30 and pG30, respectively) and used to transform Arabidopsis plants.
  • A Northern blot analysis of total RNA isolated from independent transgenic lines probed with atSRp30 cDNA. (Lanes 1 to 4) plants transformed with the pG30 construct; (Lanes 5 to 9) plants transformed with pC30; (Lane 10) control plants transformed with pBI121 (35S CaMV-GUS construct). mRNA isoforms are given.
  • B RT-PCR analysis of the same transgenic lines.
  • Figure 8 Regulation of the alternative splice pattern of atSRp31 and U1-70K in plants that overexpress atSRp30.
  • the relevant alternative splicing events are shown in the diagrams above. RT-PCR was performed using primers (marked with arrows) derived from the neighboring exons.
  • A Changes in the splice of the second intron of GatRSp31.
  • SR proteins The purification of the SR proteins was previously described (Lopato et al. 1996a). The proteins were separated using SDS-PAGE. After staining with Coomassie-G, the protein band was cut out and subjected to in-gel digestion with Lys-C endopeptidase. The resulting peptides were separated by HPLC and sequenced using automated Edman degradation as previously described (Wang et al. 1996).
  • the total DNA of carrot, tobacco and Arabidopsis was isolated using the cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method (Murray and Thompson 1980).
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • the most conserved part of the sequenced peptide YVGNLPGDI was used to assemble two degenerate forward primers.
  • Two reverse degenerate primers were derived from the SWQDLKDHM peptide sequence, which was also part of a sequenced peptide. All four combinations of degenerate primers were used as templates in PCR reactions with genomic DNA from different plants. PCR products were subcloned and sequenced.
  • the Arabidopsis PCR product was used as a probe for screening a ⁇ ZAPII genomic library from A. thaliana var. Columbia (Stratagene).
  • a positive clone, GatSRp30 was found, measured, subcloned and sequenced (EMBL accession number AJ131214).
  • a partial cDNA sequence was found with a BLAST search through EST databases accession number R65514, 4018 Arabidopsis thaliana cDNA clone 17J1T7 and was kindly provided by the Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State University. Sequence homology was performed using the sequence analysis Software packages version 7.1-UNIX from Genetics Computer Group
  • RNA blot analyzes were carried out as described (Lopato et al. 1996b). CDNAs encoding alternatively spliced isoforms were obtained by RT-PCR using total RNA preparations from A. thaliana plants of various developmental stages and primers derived from the untranslated 3 'region (for reverse transcription).
  • the fragments were analyzed on 1.2% agarose gel.
  • the cSNA and genomic sequences of atSRp30 were amplified from A. thaliana cDNA and genomic DNA using primers 3 and 1 containing BamHI and Sacl restriction sites, respectively.
  • the DNA fragments were sequenced and introduced into the BamHI-SacI restriction sites of the pBI121 (Clontech) vector (with the GUS gene deleted) under the control of the 35S CaMV promoter, which led to constructs called pC30 or pG30. Cultivation of plants and suspension cultures and plant transformation process
  • the plants were typically kept at 23 ° in a cycle of 16 hours light and 8 hours dark unless otherwise noted.
  • the cell culture was grown in medium containing Murashige and Skoog salts, 2 x Gamborg's vitamins (Gamborg et al. 1968), 1 mg / 1 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 3% (M / V) Contained sucrose.
  • the cell cultures were incubated in 50 ml medium in conical 250 ml flasks in a rotary shaker at 110 rpm and 23 ° C in low light.
  • the cell suspensions were subcultivated every 7 days and diluted three times with fresh medium for each subculture.
  • Histochemical assay of GUS expression Histochemical assays of GUS expression were performed with 5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide (X-Gluc, Duchefa) as a substrate and were performed on intact seedlings or excised organs of mature plants grown in vivo, as by Jefferson (1987). The samples were treated with 70% ethanol for 2-6 hours to remove chlorophyll from the tissues if necessary.
  • X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide
  • SR proteins were purified from 3-week-old Arabidopsis plants or 5-day-old suspension cultures using a two-step salt precipitation process as described (Lopato et al. 1996a). Whole protein extracts were made with the buffer for SR protein isolation (Zahler et al. 1992). The proteins from the magnesium precipitate and the total protein extracts were separated on 12.5% SDS gel. The protocols for immunoblotting and detection have been described earlier (Lopato et al. 1999). Protein phosphorylation was carried out with alkaline phosphatase from calf intestine (Biolabs).
  • the coding region of atSP30cDNA was amplified by PCR using the primers 5 '-ATATACCATGGGTAGCCGATGGAATCGTAC-3' and (4).
  • the coding region of atSRp34 / SRlcDNA was amplified by PCR using the primers 5 '-ATATACCATGGGCAGTCGTTCGAG-3' and (6).
  • the primers contain Ncol and BamHI restriction sites.
  • the fourth nucleotide of the coding region was changed to G in both cases.
  • AtSRp30 and atSRp34 / SRI expressed in this way have Ser2-Arg and Ser2-Gly substitutions, respectively.
  • the fragments were cloned into the bacterial expression vector pET-3d (Novagen) and transformed into the E. coli strain BL21 (DE3) pLysS (Novagen).
  • ice-cold buffer B 333 mM Tris-HCl at pH 8.0, 100 mM EDTA at pH 8.0, 40 mg lysozyme
  • Lysis buffer (22.5 ml, IM LiCl, 20 mM EDTA, 0.5% NP-40) was added and the solution was sonicated at full strength for a total of 2 min (15 sec bursts with 1 min cooling periods therebetween).
  • the pellet was washed twice in 25 ml buffer C (10 mM Tris-HCl at pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 0.5 M LiCl, 0, 05% NP-40, 1 mM DTT) and then washed twice with the same buffer without LiCl.
  • the isolated inclusion bodies contained > 95% pure protein and were used for the production of polyclonal antibodies (Lopato et al. 1999).
  • the first peptide comprised the RNP-2 submotive of the first RRM, and the second peptide had high homology with a sequence between RNP-2 and RNP-1 of the second RRM (see Materials and Methods; Fig. 2, below).
  • degenerate primers were synthesized and used for PCR on purified genomic DNA from carrots, tobacco and Arabidopsis.
  • the Sequencing of the cloned PCR products resulted in two very homologous sequences from Arabidopsis and tobacco.
  • the Arabidopsis fragment was 838 bp long and contained 5 introns.
  • the fragment boundaries of the Arabidopsis fragment are marked with black arrows in FIG. 1A.
  • the protein sequence derived from the PCR sequence had extensive homology with human SF2 / ASF and atSRp34 / SRl (Fig. 2).
  • Arabidopsis PCR product was used as a probe to screen an A. thaliana ⁇ ZAPII genomic library.
  • a genomic clone was found and designated atSRp30 (genomic clone of Arabidopsis thaliana serine / arginine-rich protein with a derived molecular mass of approximately 30 kD). It was> 4.5 kb long, had a promoter region of 1805 bp, but ended 12 bp above the stop codon.
  • a corresponding cDNA was obtained from a cDNA library with expressed sequence tags (EST) from A.
  • thaliana Ecotyp Columbia The mRNA corresponding to this cDNA was designated as mRNAl of atSRp30. Primers from the 3 'untranslated region of this cDNA were used to obtain the missing sequences of the genomic clone by PCR amplification on purified genomic DNA. The DNA fragment contained an additional intron and the rest was identical to the corresponding sequence of the cDNAl.
  • the sequence of GatSRp30 and the derived protein sequence are shown in Fig. 1A.
  • GatSRp34 has a very similar gene structure to GatSRp30, except that the former has an intron in the 5 'untranslated region.
  • the RS domain of atSRp30 is shorter than that due to an extension at the 3 'end of atSRp34, which includes a previously described positively charged proline / serine / lysine (PSK) domain of unknown function (Lazar et al. 1995) by atSRp34. If this unique 3 'extension is not taken into account, atSRp34 / SRl is slightly more homologous with human SF2 / ASF, mainly due to their common G-rich joint region. Taken as a whole, these analyzes indicate that, in contrast to mammals for which only one SF2 / ASF protein has been described so far, two SF2 / ASF homologues are present in Arabidopsis.
  • RNA blots of poly (A) + mRNA from various tissues of wild-type Arabidopsis plants were probed with radioactively labeled atSRp30 or atSRp34 / SRl cDNAs and in each case showed at least two mRNA species (FIG. 3A).
  • the level of expression of each gene varied significantly in different tissues, but was greatest in flowers in both cases, followed by roots (Fig. 3A).
  • the ratio of the two distinguishable mRNAs, mRNA3 and mRNAl was different for each gene in the different organs.
  • mRNA3 appeared to be present in greater quantities in leaves, stems and flowers, while mRNAl was predominant in roots.
  • the ratio of the two main mRNAs of atSRp34 / SRl was approximately 1: 1 in leaves and stems, whereas in the Roots and flowers dominated mRNAl. Further probing of the RNA blot with the long tenth intron of atSRp30 showed that mRNA3 retained sequences of this intron, indicating that the alternative splicing involves this region of atSRp30 pre-mRNA.
  • mRNAl corresponded to the cDNA sequence of atSRp30, while due to the use of an alternative 3 'splice site mRNA3 retained part of the tenth intron (Fig. 1A, B).
  • the mRNA2 isoform with the two alternative 3 'and 5 • splice sites within intron 10 (Fig. 1A, B) was not recognizable in the Northern of the wild-type plants (see Fig. 3A) and was only by RT-PCR demonstrated by increasing the number of cycles (data not specified).
  • mRNA4 uses an additional alternative 3 'splice site; mRNA2 uses alternative 5 1 and 3 'splice sites (Fig. IC, D); and mRNA3, which is the major alternative spliced mRNA in plants when atSRp30 is overexpressed by the 35SCaMV promoter (Fig. 5 below), uses an alternative 5 'splicing site.
  • AtSRp30s and atSRp34s lack the carboxy-terminal part of the RS domain and instead have other sequences that are shown in Figure 1A for atSRp30s and bold in Fig. IC for atSRp34s.
  • RNA bloth hybridization and RT-PCR analysis (FIG. 3B, C) used.
  • RT-PCR primers obtained from exons in addition to the tenth intron were used. The results of both methods were fairly consistent, showing that expression of mRNAl is highest in younger plants and begins to decrease around day 12, while expression of mRNA3 is extremely low in young seedlings, peaking between days 9 and 14 then slowly decreases. Although we do not know how to regulate the ratio of these two transcripts, these regulatory events could determine the amount of true atSRp30 protein in individual cells.
  • the magnesium precipitate was subjected to an immunoblot and probed with four different antibodies. With anti-p30, six protein bands were detected as three doublets, the 43 to 46 kD doublet having the highest intensity. The other two doublets migrated with recognizable molecular masses of 38-40 and 31-34 kD (Fig. 4A, lane 2).
  • the immunostaining pattern with the monoclonal antibody mAbl04 (FIG. 4A, lane 1), which is specific for a serine phosphoepitope common for SR proteins
  • the anti-p34 antibodies recognize three proteins of approximately 46-47, 40 and 34 kD. Since the same antibody shows minimal cross-reaction with recombinant atSRp30 (data not shown), this band may represent proteins related to atSRp34 / SRl and are in good agreement with published overexpression data, in which the protein is 47-48 in size kD was detected (Lazar et al. 1995).
  • the 40 kD protein migrates with an alternatively spliced isoform of atSRp34 / SRl (see below) while the nature of the 34 kD polypeptide remains to be determined.
  • the anti-p34 immunoblot is very similar to that obtained with a monoclonal antibody specific for human SF2 / ASF (Fig.
  • ß- Glucuronidase (GUS) activity was not observed in any of the non-transgenic Arabidopsis tissues tested, not even in transgenic plants which have a promoterless GUS gene.
  • Control plants containing a 35S cauliflower mosaic virus (CaMV) promoter-GUS fusion were easy to stain, showing that substrate access did not limit GUS activity.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • the constructs used either contained a complete gene (pG30) or a cDNA (pC30) which codes for atSRp30 under the control of the strongly constitutive promoter of the 35S RNA of CaMV.
  • the 35S CaMV promoter is strong and constitutive in all plant tissues examined, which was confirmed in control experiments using GUS as a reporter gene.
  • negative controls were either transformed with a 35SRNA promoter GUS control (pBI121) or were transformants with the same construct, but for unknown reasons none Overexpression.
  • the two fusion constructs pG30 and pC30 were used for the transformation of Arabidopsis roots mediated by Agrobacterium. Forty independent, transgenic lines were regenerated for each construct; Eight of the lines transformed with pG30 and twelve of the lines transformed with pC30 were used for the further work. Some of these transgenic lines were used for RNA blot and RT-PCR analyzes, as shown in Fig. 6 A and B. Surprisingly, all pG30 transformants (Fig. 6A, B, lines 1 to 4) mainly expressed mRNA3, which has an alternative 3 'splice site within the long intron (Fig. IB), but mRNAl was still more common in these plants than in the control plant (Fig.
  • the total soluble protein extracts from transgenic plants were analyzed by Western blotting using anti-p30 for immunodetection (FIG. 6C) and with a control plant (lane 8, a transformed plant without overexpression of atSRp30) and with an SR protein preparation of Arabidopsis suspension culture (lane 1) compared.
  • the SR protein preparation had the characteristic pattern of anti-p30 (see FIG. 6C, lane 1, and FIG. 4A, lane 2), while due to the low frequency of atSRp30 in plants, no specific proteins were immunostained in the total protein extract of the control plant (Fig. 6C, lane 8).
  • AtSRp30 is only partially phosphorylated, which may be related to our observation that even complete dephosphorylation results in a 38 kD atSRp30 protein that retains the mAbl04 phospho-epitope (Fig. 4B, lanes 3- 6).
  • none of the antibodies used in pG30 transformants could detect a shorter protein product (atSRp30s) of the extremely common mRNA3 (see also FIG. 6C, lane 2).
  • AtSRp30 led to strong phenotypes with pleiotropic changes in both the morphology and the development of transgenic plants. No significant differences were found between plants transformed with pG30 and pC30 constructs, although the values of atSRp30 protein were different (FIG. 6C, see lane 2 and lanes 3 to 7). The observations were in T? and subsequent generations of independent transgenic lines reproducible and cosegregated together with the antibiotic resistance. In transgenic plants, the transition from the growth to the flowering stage was very late under short day conditions. The time from germination to the formation of the first ripe pod was 65-78 days in overexpressing plants compared to 42-47 days in control plants grown under the same conditions.
  • Transgenic plants also had larger rosette leaves (Fig. 7A, cf. wild type in B), the trichomes mainly having four to five branches, in contrast to the leaves in the wild type, which mainly had three-branch trichomes.
  • primary inflorescence produced numerous secondary branches with a vegetative, rosette-like appearance. These branches developed 7 to 15 vegetative leaves and eventually formed inflorescences.
  • the number of rosette leaves in transgenic plants at the time of flowering was slightly lower than in wild type (12 or 16 leaves on average).
  • Independent transgenic lines that overexpress atSRp30 showed the described characteristics with the to different degrees greatest impact on the time for the transition from the vegetative to the reproductive phase.
  • the atSRp31 splice factor belongs to a new family of plant RS proteins and has an alternatively spliced second intron (792 nucleotides) (Lopato et al. 1996b).
  • a 3 'cryptic splice point or the two alternative 3' and 5 'splice points were used for this intron (FIG. 8A), while in control lines (lane 1) and pG30-transformed lines (lanes 2 to 5) the latter form was predominant.
  • pC30 lines (lanes 6-10) mainly expressed the shape of the alternative 3 'splice, although their frequency was variable (in lanes 6 and 7 this shape can only be seen on the original photo).
  • DISCUSSION atSRp30 is a member of the SR protein family In addition to their characteristic domains, which include one or two RRMs and a carboxy-terminal RS domain with multiple SR dipeptides, SR proteins have (a) phosphoepeptide (s) that are recognized by mAbl04, and they are soluble in the presence of millimolar concentrations of magnesium salts.
  • the antibody to atSRp30 recognized a complex band pattern in the Mg precipitate, while no specific band could be found in the total protein fractions. The fact that atSRp30 could not be detected in raw lysates reflects the low frequency of the protein and / or the limited sensitivity of the antibody.
  • AtSRp30 when atSRp30 was overexpressed, the antibody detected a specific protein with an apparent mobility of 40 kD. In contrast, atSRp34 / SR of anti-p34 could be detected in total protein fractions.
  • Our immunoblot data confirm that atSRp30 is a real SR protein because it is present in SR protein preparations and has an immunostained band corresponding to mAbl04. However, since complete dephosphorylation could not be achieved, we do not know how many of these proteins are modified forms of atSRp30 or closely related proteins.
  • mRNA3 generated using an alternative 3 'splice site in the tenth intron, was the predominantly detected transcript, while the value of mRNAl was only moderately increased (Fig. 6).
  • a restrictive splice factor that is titrated due to overexpression of the atSRp30 gene. Such a factor would have to be specific for the tenth intron, since all other introns in atSRp30 are properly spliced.
  • mRNA3 and mRNAl can largely be synthesized in different cells via cell type-specific alternative splicing.
  • AtSRp30 influences the selection of the splice site in several plant pre-mRNAs and leads to changes in plant development
  • Arabidopsis atSRp30 was a good candidate for a splice modulator due to its similarity to human SF2 / ASF and its special expression pattern.
  • the ability to stably overexpress atSRp30 in whole plants, which remained viable, enabled us to determine for the first time the effects of elevated SR protein levels on the alternative splicing of specific endogenous transcripts. Some, but not all, of the endogenous transcripts tested were affected.
  • atSRp30 pre-mRNA itself and tSRp34 / SRl pre-mRNA, intronic alternative 5 'splice sites were activated, while with atSRp31 and Ul 70K pre-mRNAs the use of normal splice sites was generally increased, but was variable.
  • AtSRp30 can change the expression of other genes drastically by influencing their splicing patterns. Because the expression pattern of atSRp30 is usually very tissue-specific, some of the effects of overexpression observed could have been caused simply by its expression in inappropriate tissues, where it affects the expression of genes that are not the natural targets of this splice factor.
  • the observed decrease in the expression of the splice factor atSRp34 when overexpressing atSRp30 can in turn influence the expression of other genes, which leads to the observed changes in the phenotype.
  • the changes in trichome development which can lead to additional branches, on the other hand, may reflect the overexpression of atSRp30 in the trichome support cell, which is a normal site for the expression of atSRp30. Therefore, atSRp30 can be a determinant of trichome development. It remains a critical goal to find the natural regulatory goals of atSRp30 to explain the observed changes in the phenotype and to expand our understanding of plant development pathways.
  • AtSRp30 A comparison analysis of atSRp30 with all known plant and animal SR proteins showed that it is a paralogue of atSRp34 / SRl and that both Arabidopsis proteins are closest to human SF2 / ASF.
  • the main structural difference is that atSRp30 does not have a G-rich region between the two RRMs, which can affect the flexibility and possibly the specificity of the RNA-binding region.
  • the assumption that the two proteins might have different activity is supported by the observation that their expression patterns are quite different in many cases, as shown in FIG. 5.
  • AtSRp30 is more restricted to specialized cell types and tissues, such as trichomes, cotyledons or lateral root systems, which indicates that this protein plays a special role in the initiation of organ formation, while atSRp34 / SRl is more strongly expressed in meristem tissue. Furthermore, our immunological and sequence data indicate that atSRp34 / SRl hSF2 / ASF is more similar than atSRp30.
  • a novel zinc finger protein is encoded by the Arabidopsis LSD1 gene and functions as a negative regulator of plant cell death. Cell 88: 685-694.
  • RNA 1 663-680.
  • a protein factor controls cell-specific alternative splicing of SV40 early pre-mRNA in vitro. Cell 62: 25-34.
  • the splicing factor SRp20 modifies splicing of its own mRNA and ASF / SF2 antagonizes this regulation.
  • the Drosophila RNA-binding protein RBP1 is localized to transcriptionally active sites of chromosomes and shows a functional similarity to human splicing factor ASF / SF2. Genes & Dev. 6: 2569-2579.
  • Arginine / serine-rich domains of the su (wa) and tra RNA processing regulators target proteins to a subnuclear compartment implicated in splicing. Cell 67: 335-342.
  • Uridylate-rich small nuclear RNAs Uridylate-rich small nuclear RNAs (UsnRNAs), their genes and pseudogenes, and Usn-RNPs in plants: Structure and function. A comparative approach. Crit. Rev. Plan Be. 12: 275-369.
  • SR proteins promote the first specific recognition of pre-mRNA and are present together with the Ul small nuclear ribonucleoprotein particle in a general splicing enhancer complex. Mol. Cell Biol. 14: 7670-7682.
  • RNA 1 335-346.
  • SR proteins A conserved family of pre-mRNA splicing factors. Genes & Dev. 6: 837-847.
  • the human splicing factor ASF / SF2 can speeifically recognize pre-mRNA 5 'splice sites. Proc. Natl. Acad. Be. 91: 3363-3367.

Abstract

Beschrieben wird ein Protein mit einer Spleißfaktoraktivität in Pflanzen, welches die Aminosäuresequenz des Proteins gemäß (Fig. 1 A aufweist oder die Sequenz der Aminosäuren (1 bis 4, 7 bis 19, 45 bis 52, 111 bis 116 und 149 bis 153) des Proteins gemäß (Fig. 1) auf weist und mehr als 85 % Ähnlichkeit mit diesem Protein aufweist oder mehr als 60 % Ähnlichkeit mit den Spleißproteinen atSRp34/SR1 und SF2/ASF gemäß (Fig. 2) aufweist, wobei die G-reiche Sequenz, die den Aminosäuren (85 bis 113) des atSRp34/SR1-Proteins entspricht, durch eine S-reiche Sequenz ersetzt ist, oder das dem in Fig. 1 A entsprechnenden Protein aus einer anderen Pflanze als Arabidopsis thaliana entspricht oder davon abgeleitet ist.

Description

Spleißfaktor
Die Erfindung betrifft Proteine mit Spleißfaktoraktivität in Pflanzen.
Alternatives pre-mRNA-Spleißen ist Teil des Expressionsprogramms einer großen Anzahl von Genen bei Tieren und Pflanzen. Es ermöglicht die Auswahl verschiedener Kombinationen von Spleißstellen innerhalb einer vorgegebenen pre-mRNA, wodurch strukturell und funktioneil verschiedene Protein-Isoformen gebildet werden (Breitbart et al. 1987; Manley und Tacke 1996; Cäceres und Krainer 1997) . Es sind mehrere Proteinfaktoren beschrieben worden, die an der Regulierung des alternativen Spleißens beteiligt sind, einschließlich einer Familie von RNA-bindenden Proteinen mit Arginin/Serin-reichen Regionen (SR-Proteine) (für eine Obersicht, siehe Fu 1995; Chabot 1996; Valcarcel und Green 1996; Cäceres und Krainer 1997) . SR-Proteine sind hoch konservierte nukleare Phosphoproteine, die Mitglieder einer Proteinfamilie sind und ein Serin-Phospho-Epitop gemeinsam haben, das vom monoklonalen Antikörper mAbl04 erkannt wird (Roth et al . 1991) . Sie bestehen aus mindestens einer RNA-bindenden Domäne (RBD) [die typische RBD- oder RNA-Erkennungsmotiv- (RRM-) Domäne von etwa 80 Aminosäuren] (Birney et al . 1993) und besitzen mehrere Serin/Arginin- (SR-)Dipeptide in der Nähe der Carboxy-Enden (Zahler et al. 1992) . Im Allgemeinen sind SR-Proteine eine definierte Untergruppe einer großen Überfamilie von Nuklearproteinen mit RS-reichen Domänen variabler Sequenz und Position (Fu 1995) .
Der menschliche SF2/ASF-Spleißfaktor, ein Prototyp eines SR-Proteins, ist essentiell für den ersten Spaltungsschritt beim pre- mRNA-Spleißen (Krainer et al . 1990b; Ge et al. 1991) und kann auch konzentrationsabhängig bestimmen, welche 5 ' -Spleißstelle in pre-mRNAs mit alternativen Stellen gewählt wird (Ge und Manley 1990; Krainer et al . 1990a) . Der bevorzugten Verwendung der pro- ximalen 5 ' -Spleißstelle bei höheren Konzentrationen von SF2/ASF wird von Mitgliedern der hnRNP A/B-Proteinfamilie entgegengewirkt (Mayeda und Krainer 1992; Mayeda et al. 1994), was darauf hinweist, dass die relative Häufigkeit dieser und möglicher anderer antagonistischer Spleißfaktoren die Muster des alterna- tiven Spleißens in vitro und in vivo bestimmt (Mayeda und Krainer 1992; Cäceres et al . 1994; Yang et al . 1994; Wang und Manley 1995; Hanamura et al . 1998) . SF2/ASF und jedes andere SR- Protein kann S 100-Extrakte mit Spleißdefizit komplementieren, denen SR-Proteine im Wesentlichen fehlen, aber einzelne SR- roteine zeigen manchmal distinkte Spezifität und Effizienz beim Spleißen verschiedener pre-mRNAs (Krainer et al . 1990b; Ge et al. 1991; Fu und Maniatis 1992; Kim et al . 1992; Mayeda et al . 1992; Fu 1993; Zahler et al . 1993; Screaton et al . 1995; Wang und Manley 1995) . Eine wichtige Aktivität von SF2/ASF und anderen SR-Proteinen ist weiters die Wechselwirkung mit exonischen Verstärker-Sequenzen, die die Verwendung einer benachbarten, schwachen Spleißstelle stimulieren (Sun et al . 1993; Tian und Maniatis 1993; Staknis und Reed 1994; Ramchatesingh et al . 1995; Tacke und Manley 1995; Lou et al . 1996) . Die RNA-bindende Spe- zifizität wird einem SR-Protein durch die RRM-Region und benachbarte Sequenzen verliehen (Cäceres und Krainer 1993; Zuo und Manley 1993; Tacke und Manley 1995; Allain und Howe 1997; Tacke et al. 1997); die verschiedenen RS-Domänen sind in erster Linie für Protein-Protein-Wechselwirkungen verantwortlich, die durch den Phosphorylierungsstatus dieser Regionen moduliert werden (Wu und Maniatis 1993; A rein et al. 1994; Kohtz et al. 1994; Zuo und Maniatis 1996; Xiao und Manley 1997) . Außerdem ist gezeigt worden, dass RS-Domänen die RNA-Bindungsaktivität und die subnukleare Lokalisierung von SR-Proteinen modulieren (Li und Bingham 1991; Hedley et al . 1995; Cäceres et al . 1997) . In jüngster Zeit ist gezeigt worden, dass sich SF2/ASF, SRp20 und 9G8 zwischen dem Nukleus und dem Cytoplasma hin- und herbewegen, und diese Eigenschaft hängt vom Vorhandensein und vom Typ der RS-Domäne ab (Cäceres et al. 1998) .
Die oben beschriebenen Untersuchungen führten zur Behauptung, dass SR-Proteine wirken könnten, indem sie Spleißstellen durch RNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen überbrücken und so frühe Wechselwirkungen für die Spleißstellen definition und für die Zusammenstellung von Spliceosomen etablieren. Diese Wechselwirkungen werden durch das Binden von SR-Proteinen an nahe Verstärkersequenzen stimuliert und durch die Phosphorylie- rung/Dephosphorylierung der RS-Regionen moduliert. Es gibt beschränkte Informationen über die Regulierung der SR- Proteinexpression in vivo. Bei SF2/ASF und SRp20 sind bei verschiedenen Zelltypen und Geweben signifikante Unterschiede in mRNA und Proteinwerten beobachtet worden (Jumaa et al . 1997; Hanamura et al . 1998). Die SC35-Expression ist in Zelllinien ebenfalls sehr variabel (Fu und Maniatis 1992; Vellard et al . 1992) , und einige SR-Proteine werden von Mitogenen aktiviert (Diamond et al . 1993; Screaton et al . 1995). Interessanterweise sind einige alternativ gespleißte SR-Protein-mRNAs beschrieben worden, die für verkürzte Proteine mit noch unbekannter Funktion codieren (Ge et al . 1991; Cavaloc et al . 1994; Screaton et al . 1995; Jumaa et al . 1997). Menschliches SRp20 reguliert seine Expression auf der Ebene des Spleißens selbst, indem es an seine eigene pre-mRNA bindet und so eine Überexpression des aktiven Proteins verhindert (Jumaa und Nielsen 1997) . Vor kurzem ist gefunden worden, dass die Mengen alternativ gespleißter mRNAs in Caenorhabditis elegans, die für SRp30b und SRp20 codieren, zumindest teilweise auf der Ebene der mRNA-Stabilität reguliert werden können (Morrison et al 1997) .
Bislang wurde in Organismen, die ein dem humanen SF2/ASF-Protein entsprechendes Protein aufweisen, nur jeweils eine Variante dieses Proteins gefunden.
Über die Mechanismen der Intronexzision in Pflanzenzellen ist nur wenig bekannt. Es wird allgemein angenommen, dass der Grundmechanismus des Spleißens bei Pflanzen dem bei Hefe und Säugetieren ähnlich ist (Solymosy und Pollak 1993; Luehrsen et al . 1994; Filipowicz et al . 1995; Brown und Simpson 1998) . Trotzdem werden in keinem bisher untersuchten Pflanzengewebe tierische Introns prozessiert (Barta et al . 1986; Van Santen und Spritz 1987; Wiebauer et al. 1988) . Offensichtlich ist das Verfahren der Intronerkennung in diesen beiden Gebieten unterschiedlich. Eines der entscheidenden Merkmale von Introns in Pflanzen scheint ein U- oder AU-reicher Charakter zu sein, während die Exons eher GC-reich sind (für eine Übersicht, siehe Brown und Simpson 1998) . Da SR-Proteine bei Säugetieren bei der Auswahl der richtigen Spleißstelle eine kritische Rolle spielen, ist es interessant, die korrespondierende Proteinfamilie bei Pflanzen zu charakterisieren. Bei der Suche nach ähnlichen Proteinen in Pflanzen unter Verwendung von mAbl04-Antikörper oder einen spezifischen monoklonalen Antikörper, der gegen menschliches SF2/ASF gezüchtet worden war, konnte gezeigt werden, dass Pflanzen sehr wohl SR-Proteine einschließlich SF2/ASF-ähnliche Proteine besitzen (Lopato et al . 1996a). Die pflanzlichen SR- Proteine sind jedoch von unterschiedlicher Größe und sind kleiner als 55 kD. Es konnte weiters gezeigt werden, dass pflanzliche SR-Proteine beim konstitutiven und alternativen Spleißen aktiv sind, wenn sie in heterologen HeLa-Zellextrakten untersucht werden.
Beim Versuch, einzelne pflanzliche Spleißfaktoren zu isolieren, wurden Arginin/Serin-reiche Proteine von Arabidopsis charakterisiert, die zu zwei verschiedenen Familien gehören (Lopato et al. 1996b; 1999). Beide Familien weisen eine gute Homologie mit tierischen SR-Proteinen im Amino-terminalen RRM auf, ihre Carboxy-terminalen Domänen sind jedoch reicher an Arginin als an Serin, weisen wenige SR-Dipeptide auf, und daher wurden sie als RS-Proteine bezeichnet. Trotzdem werden diese Proteine vom mAbl04-Antikörper erkannt und können HeLa Sl00-Extrakte, denen SR-Protein fehlt, effizient komplementieren.
In Arabidopsis thaliana konnte ein Protein mit Ähnlichkeit zum humanen SF2/ASF-Protein identifiziert werden (Lazar et al . , 1995) , das unter der Bezeichnung SRI, atSRp34 oder atSRp34/SRl bekannt ist .
Die Beeinflussung des Spleißprozesses bei Pflanzen stellt eine der Möglichkeiten dar, um zu verbesserten Pflanzen zu kommen. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher im zur Verfügung stellen von neuen pflanzlichen Spleißfaktoren, die im Rahmen der Biotechnologie verwendet werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Protein mit einer Spleißfaktoraktivität in Pflanzen, welches entweder
die Aminosäuresequenz des Proteins gemäß Fig. 1 A des Anhanges aufweist oder die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 4, 7 bis 19, 45 bis 52, 111 bis 116 und 149 bis 153 des Proteins gemäß Fig.l A des Anhanges aufweist und mehr als 85 % Ähnlichkeit mit diesem Protein aufweist oder mehr als 60 % Ähnlichkeit mit den Spleißproteinen atSRp34/SRl und SF2/ASF gemäß Fig.2 des Anhanges aufweist, wobei die G-reiche Sequenz, die den Aminosäuren 85 bis 113 des atSRp34/SRl-Proteins entspricht, durch eine S-reiche Sequenz ersetzt ist, oder das dem in Fig. 1 A entsprechnende Protein aus einer anderen Pflanze als Arabidopsis thaliana entspricht oder davon abgeleitet ist.
Das erfihdungsgemäße Protein zeichnet sich bevorzugter Weise dadurch aus, dass es die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 4, 7 bis 19, 22 bis 72, 74 bis 85, 96 bis 141, 149 bis 153, 156 bis 172, wobei Aminosäure 168 variabel, jedoch nicht D oder N ist, des Proteins gemäß Fig.l A des Anhanges aufweist. Die angegebenen hochkonservierten Sequenzen sind vorzugsweise derart angeordnet, dass die Abstände in etwa zwischen den benannten Sequenzen demjenigen gemäß Fig.l A des Anhanges entsprechen, wobei vorteilhafterweise nicht mehr als 5 Aminosäuredeletionen oder Amino- säureinsertionen vorgesehen werden. Besonders bevorzugt sind Sequenzen, bei welchen entweder keine oder nur eine einzige Deletion oder Insertion zwischen den koservierten Sequenzen vorhanden ist .
Das erfindungsgemäße Protein kann gegenüber dem in Fig.l A des Anhanges gezeigten Protein ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 4, 7 bis 19, 45 bis 52, 111 bis 116 und 149 bis 153 des Proteins gemäß Fig.l A des Anhanges oder die Funktion des Proteins als Spleißfaktor nicht betroffen ist. Die Funktion als Spleißfaktor ist dann als betroffen anzusehen, wenn das Protein beispielsweise nur mehr 10 bis 20 % der natürlichen Aktivität des Proteins gemäß Fig.l A des Anhanges beträgt.
Aminosäuresubstitutionen können insbesondere im Bereich der nicht als konserviert markierten Aminosäuren in Fig.2 des Anhanges vorgesehen werden, insbesondere dann, wenn sie die dreidimensionale Struktur oder die Ladungsverteilung des Proteins nicht wesentlich beeinflussen. In diesen Regionen ist beispiels- weise der Austausch von hydrophoben Aminosäuren untereinander oder der Austausch von aromatischen Aminosäuren untereinander möglich, wenn dadurch die natürliche Aktivität nicht verlorengeht .
Erfindungsgemäß bevorzugt sind alle Proteine, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die zumindest 90 % Identität mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 85 und 96 bis 222 des Proteins gemäß Fig.l A des Anhanges aufweist.
Besonders bevorzugt sind Proteine, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die zumindest 95 %, insbesondere zumindest 98 %,
Identität mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 85 und 96 bis
222 des Proteins gemäß Fig.l A des Anhanges aufweist.
Mit den erfindungsgemäßen Proteinen konnte erstmalig in einem Organismus ein zweites SF2/ASF-ähnliches Protein gefunden werden (neben atSRp34/SRl) , womit sich die Möglichkeit einer kombinierten Beeinflussung des Spleißprozesses ergibt. Im Anhang ist gezeigt, dass die beiden Proteine eine gegenseitige Beeinflussung des Spleißprozesses aber auch eine Wirkung auf andere Proteine zeigen, die darüberhinaus bei entsprechender genetischer Kontrolle in überraschenden Möglichkeiten der Veränderung der Spleißeigenschaften der Pflanze oder der Pflanzenzelle resultiert .
Die S-reiche Sequenz zwischen Aminosäure 95 und 102 der Sequenz gemäß Fig.l A des Anhanges enthält vorzugsweise mindestens 4, insbesondere mindestens 7, Serinreste. Vorteilhafterweise ist sie G-frei, insbesondere frei von GGR oder GGR-Repeats.
Das erfindungsgemäße Protein kann durch Standard-Methoden der Molekularbiologie bedingt durch die hohe Homologie derartiger Proteine auch aus anderen Pflanzen zur Verfügung gestellt werden, etwa durch PCR-gekoppelte Klonierungsmethoden oder durch sonstiges Screenen von Genbibliotheken beispielsweise mit der Sequenz gemäß Fig.l A des Anhanges.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die entweder eine Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 1 A des Anhanges umfassen oder eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die für ein erfindungsgemäßes Protein kodiert oder eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die unter stringenten Bedingungen an das Nukleinsäuremolekül gemäß Fig.l A bindet und für ein in Pflanzen aktives Spleißprotein kodiert oder dazu komplementär ist.
Unter stringenten Bedingungen wird beispielsweise das Hybridisieren in 7 % SDS, 0,5 M NaP04 , pH 7,0, 1 mM EDTA bei 50°C mit anschließender Waschung mit 3 % SDS verstanden.
Diese Moleküle können sowohl DNS- als auch RNS-Moleküle sein. Im Falle von RNS-Molekülen stellen die alternativ gespleißten Formen, insbesondere diejenigen, wie sie im Anhang beschrieben werden, bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein biologisch funktioneller Vektor, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung weiters ein System, umfassend eine Nukleinsäure, die für ein Protein nach einem der Ansprüche kodiert, und eine Nukleinsäure, die
für das atSRp34/SRl-Protein aus Arabidopsis thaliana oder für das dem in Fig. 1 A entsprechnende Protein aus einer anderen Pflanze als Arabidopsis thaliana oder für ein von diesen Proteinen abgeleitetes Protein kodiert, wobei mindestens eine der Nukleinsäuren unter Kontrolle eines nicht natürlicherweise mit diesen Nukleinsäuren verbundenen Promotors steht.
Unter von atSRp34/SRl abgeleiteten Proteinen sind auch diejenigen Proteine zu verstehen, die die erfindungsgemäßen Proteine ausgehend von dem in Fig.l A dargestellten Protein in analoger Weise definieren. Vorzugsweise werden beide Nukleinsäuren von Promotoren kontrolliert, die nicht natürlicherweise mit diesen Nukleinsäuren verbunden sind.
Bevorzugterweise ist zumindest einer der Promotoren, unter deren Kontrolle die Nukleinsäuren stehen, ein induzierbarer Promotor.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steht die Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, unter Kontrolle eines Promotors, der eine Überexpression dieses Proteins bewirkt .
Vorzugsweise steht die Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, unter Kontrolle eines Promotors, der unter definierten Bedingungen die Expression dieses Proteins unterbindet und unter definierten anderen Bedingungen die Expression dieses Proteins ermöglicht.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen, die ein erfindungsgemäßes Protein exprimieren und ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, einen erfindungsgemäßen Vektor oder ein erfindungsgemäßes System umfassen.
Weiters betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins, einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, eines erfindungsgemäßen Vektors oder eines erfindungsgemäßen Systems zur Veränderung der Spleißeigenschaften einer Pflanzenzelle oder einer Pflanze.
Weiters können die erfindungsgemäßen Gegenstände zur Veränderung des Entwicklungsverhaltens einer Pflanze verwendet werden.
Ein besonderer Aspekt liegt dabei bei der Verwendung zur Verzögerung des Blütenansatzes von Pflanzen.
Erfindungsgemäß hat sich gezeigt, dass mit dieser Verwendung eine Verzögerung des Blütenansatzes einer Pflanze gegenüber dem Wildtyp von zumindest 15 %, vorzugsweise von zumindest 25 %, herbeigeführt werden kann, beispielsweise wenn das erfindungsgemäße Protein unter die Kontrolle eines starken Promotors gestellt wird.
Besonders bevorzugte Pflanzen stellen im Rahmen der vorliegenden Erfindung die wirtscha tlichen Nutzpflanzen dar, wie Getreide, Bohnen, Reis oder Obstpflanzen.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren näher erläutert, ohne dass sie jedoch auf diese eingeschränkt werden soll .
Es zeigen:
Fig. 1A: Genomsequenz von atSRp30; Promotor- und Intronsequenzen sind in Kleinbuchstaben, cDNA-Sequenzen sind in Großbuchstaben angegeben, und die TATA-Box in fetter Kursivschrift. Die abgeleitete Proteinsequenz ist unter der DNA im Einbuchstaben-Code angegeben. Die fett gedruckte Sequenz im zehnten Intron ist in alternativ gespleißten mRNAs enthalten, und die unterstrichene Sequenz ist enthalten, wenn beide kryptischen 3'- und 5'- Spleißstellen verwendet werden. Die konservierten RNP-Submotive beider RRMs sind in einem Kästchen dargestellt. Die offenen Pfeile markieren die Enden von PromotorSequenzen, die für Expressionsstudien verwendet wurden. Durchgehende horizontale Pfeile zeigen die Enden des PCR-Produkts an, das mit degenerierten Primern erhalten und als Sonde für das Screenen der Bibliothek verwendet wurde, ( ) Das Ende des GatSRp30-Klons. Die Sequenzdaten des atSRp30-Gens wurden der EMBL-Datenbank eingegeben (Zugangsnummer AJ131214) .
Fig. 1B: Schematische Darstellung von GatSRp30, seiner mRNA- Isoformen, und abgeleiteter Proteine. Exons sind als Kästchen und Introns als Linien dargestellt (fette Linien: Introns, die in den alternativ gespleißten mRNAs enthalten sind) . Exonische 5'- und 3 ' -unübersetzte Regionen sind grau schattiert, und die codierenden Regionen sind schwarz. (*) Das neue Stopkodon in den alternativ gespleißten Produkten. Fig. IC: Schematische Darstellung von GatSRp34, seiner mRNA- Isoformen und abgeleiteter Proteine. Die Zeichnungen sind wie in B (Zugangsnummer AF001035) .
Fig. 1D: Genomische Teilsequenz von atSRp34/SRl, beginnend mit Exon 10 bis zum Stopkodon. Die fett gedruckte Sequenz im langen Intron ist in alternativ gespleißten mRNAs enthalten; die unterstrichene Sequenz ist enthalten, wenn beide kryptischen 3'- und 5 ' -Spleißstellen verwendet werden.
Fig. 2: Aufreihung von Arabidopsis atSRp30, atSRp34/SRl und menschlichen SF2/ASF Proteinsequenzen (einfarbiger Bereich) . Positionen, in denen ein einzelnder Rest in mindestens zwei der Sequenzen vorkommt (schattierte Bereiche) . Konservative Substitutionen, wie RK, IVL, ED, FY, ST. Die Positionen des konservierten RNP-1- und RNP-2-Submotivs und die glycinreiche Region sind angegeben.
Fig. 3: Expression von atSRp30 und atSRp34/SRl in Arabidopsis thaliana vom Wildtyp. (A) Expression in verschiedenen Pflanzengeweben. Northern Blot-Analysen von Poly(A)+RNA von Blättern (L) , Stängeln (S) , Wurzeln (R) und Blüten (F) sind gezeigt. Ein Mikrogramm RNA wurde pro Spur geladen, und die Blots wurden entweder mit einer Sonde, die dem zehnten Intron von GatSRp30 entspricht, oder mit den cDNAs von atSRp30 oder atSRp34/SRl sondiert. (B, C) Entwicklungsmäßige Expression von atSRp30. Gesamt- RNA wurde an verschiedenen Tagen während der Entwicklung, angefangen vom Tag der Keimung, aus der ganzen Pflanzen isoliert. Die RNA wurde entweder für die Northern Blot-Analyse mit 10 μg/ Spur Gesamt-RNA verwendet und die Membran mit atSRp30 cDNA sondiert (B) , oder sie wurde für die Analyse der RT-PCR-Produkte auf 1,2% Agarosegel verwendet (C) . Die beiden Primer für die PCR-Reaktion befanden sich in den Exons neben dem zehnten Intron.
Fig. 4: Immunnachweis von phosphorylierten und dephosphorylier- ten SR-Proteinen von Zellkulturen von Arabidopsis. (A) Immunnachweis von Proteinen in SR-Proteinpräparationen (Spuren 1 bis 4). (Spur 1) Monoklonaler Antikörper mAbl04, der für ein gemeinsames Phosphoepitop von SR-Proteinen spezifisch ist; (Spur 2) Polyklonaler Antikörper, gezüchtet gegen rekombinantes atSRp30; (Spur 3) Polyklonaler Antikörper, gezüchtet gegen rekombinantes atSRp34/SRl; (Spur 4) Monoklonaler Antikörper, spezifisch für menschliches SF2/ASF. Protein arker sind an der linken Seite angegeben. (B, C) Dephosphorylierung von SR-Proteinen mit alkalischer Phosphatase. (Spuren 1, 2) SR-Proteine, inkubiert bei 37°C ohne Enzym für 0 bzw. 24 Stunden; (Spuren 3, 4) SR-Proteine, inkubiert mit 0,2 und 1,0 EH/μl Enzym für 3 Stunden; (Spuren 5, 6) SR-Proteine, inkubiert mit 1,0 und 2,0 EH/μl Enzym für 24 Stunden. Proteine wurden entweder mit anti-p30 (B) oder anti-p34 (C) sondiert.
Fig. 5: Transkriptionsanalyse von atSRp30 (A-D) und atSRp34/SRl (E-H) Promotor-GUS-Fusionen in transgener Arabidopsis. GUS-Färbung von (A, E) Blüten im Stadium nach der Blüte; (B, F) Färbemuster in den Blättern; (C, G) primäre und sich entwickelnde Lateralwurzeln; (D, H) Setzlinge (2 Tage nach dem Keimen) .
Fig. 6: Überexpression von atSRp30 in transgenen Arabidopsis- Pflanzen. Die cDNA und die genomischen Sequenzen von atSRp30 wurden unter der Kontrolle des starken 35S CaMV-Promotors (Konstrukte pC30 bzw. pG30) kloniert und verwendet, um Arabidopsis-Pflanzen zu transformieren. (A) Northern Blot- Analyse von Gesamt-RNA, isoliert von unabhängigen transgenen Linien, sondiert mit atSRp30 cDNA. (Spuren 1 bis 4) mit dem pG30-Konstrukt transformierte Pflanzen; (Spuren 5 bis 9) mit pC30 transformierte Pflanzen; (Spur 10) mit pBI121 (35S CaMV- GUS-Konstrukt) transformierte Kontrollpflanzen. mRNA-Isoformen sind angegeben. (B) RT-PCR-Analyse der gleichen transgenen Linien. Die verwendeten Primer sind mit Pfeilen im Diagramm von GatSRp30 angegeben. (Spur 10) In diese Kontrollspur wurde 4 Mal mehr Material geladen. (C) Immundetektion von atSRp30 in Gesamtproteinextrakten von überexprimierenden transgenen Pflanzen. (Spur 1) SR-Proteinpräparationen von Arabidopsis-Zellkultur (Wildtyp) ; (Spur 2) mit pG30 transformierte Linie; (Spuren 3 bis 7) mit pC30 transformierte Linien; (Spur 8) pC30-transgene Linie, die mRNAl nicht überexprimiert . Gegen atSRp30 (anti-p30) gezüchteter Antikörper wurde für den Immunnachweis verwendet. Fig. 7: Veränderungen des Phänotyps bei Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren. (A) Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren; (B) Pflanzen vom Wildtyp; (C) atSRp30 überexprimierende Pflanzen, die unter Kurztagbedingungen gezüchtet wurden, zeigen keine apikale Dominanz, was zu einem buschigen Phänotyp führt.
Fig. 8: Regulierung des alternativen Spleißmusters von atSRp31 und U1-70K in Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren. Die relevanten alternativen Spleißereignisse sind in den Diagrammen oben dargestellt. RT-PCR erfolgte unter Verwendung von Primern (mit Pfeilen markiert) , die von den benachbarten Exons abgeleitet wurden. (A) Veränderungen im Spleißen des zweiten Introns von GatRSp31. (Spur 1) mit pBI121 (35SCaMV-GUS-Konstrukt) transformierte Kontrolllinie, (Spuren 2 bis 5) mit pG30-Konstrukt transformierte Linien; (Spuren 6 bis 10) mit pC30 transformierte Linien. (B) Korrekt gespleißte mRNA, die für das Ul-70K-Protein codiert, wird bei der Überexpression von atSRp30 erzeugt. (Spur 1) mit pBI121 (35SCaMV-GUS-Konstrukt) transformierte Kontrollpflanze; (Spuren 2, 3) mit dem pG30-Konstrukt transformierte Linien; (Spuren 4 bis 8) mit pC30 transformierte Pflanzen; (Spur 9) transgene pC30-Kontrollpflanze, die mRNAl nicht über expri- miert; (Spur 10) 19 Tage alte Pflanze vom Wildtyp.
Fig. 9: Veränderungen des Expressionsmusters von atSRp34/SRl bei Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren. (A) Bevorzugte Verwendung einer alternativen 5 ' -Spleißstelle im elften Intron von atSRp34/SRl. Das Gen, die relevanten alternativen Spleißereignisse und die abgeleiteten Proteine sind oben dargestellt, wobei das Gel RT-PCR-Produkte zeigt, die mit Primern von den benachbarten Exons erhalten wurden. (Spur 1) Kontrolle, nicht transformierte Pflanze vom Wildtyp; (Spuren 2 bis 5) mit dem pG30- Konstrukt transformierte Linien; (Spuren 6 bis 11) mit pC30 transformierte Pflanzen; (Spur 11) transgene pC30 Kontrollpflanze, die mRNAl nicht überexprimiert. (B) Immunnachweis von atSRp34 und atSRp34s in Gesamtproteinextrakten von transgenen Pflanzen. (Spuren 1, 2) von Arabidopsis-Pflanzen bzw. Zellkultur-isolierte SR-Proteinpräparationen; (Spur 3) mit pC30 transformierte Kontrollpflanze, die mRNAl nicht überexprimiert; (Spur 4) mit pC30 transformierte Linie; (Spur 5) mit dem pG30-Kon- strukt transformierte Linie. Anti-p34-Antikörper wurden für den Immunnachweis verwendet.
B e i s p i e l e :
MATERIALIEN UND METHODEN
Reinigung von SR-Proteinen und Proteinsequenzierung
Die Reinigung der SR-Proteine wurde vorher beschrieben (Lopato et al . 1996a). Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Nach dem Färben mit Coomassie-G wurden die Proteinbande herausgeschnitten und einem In-Gel-Verdau mit Lys-C-Endopeptidase unterworfen. Die resultierenden Peptide wurden mittels HPLC aufgetrennt und mit Hilfe des automatisierten Edman-Abbaus sequenziert, wie früher beschrieben (Wang et al . 1996).
Isolierung und Sequenzierung von genomischer DNA und cDNA von atSR 30 und atSRp34/SRl
Die Gesamt-DNA von Karotte, Tabak und Arabidopsis wurde mit dem Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) -Verfahren isoliert (Murray und Thompson 1980) . Der am meisten konservierte Teil des sequenzierten Peptids YVGNLPGDI wurde verwendet, um zwei degenerierte Vorwärts-Primer zusammenzustellen. Zwei reverse degenerierte Primer wurden von der Peptidsequenz SWQDLKDHM abgeleitet, die auch Teil eines sequenzierten Peptids war. Alle vier Kombinationen von degenerierten Primern wurden in PCR-Reaktionen mit genomischer DNA von verschiedenen Pflanzen als Templat verwendet. PCR-Produkte wurden subkloniert und sequenziert. Das PCR-Produkt von Arabidopsis wurden als Sonde für das Screenen einer genomischen λZAPII Bibliothek von A. thaliana var. Columbia (Stratagene) verwendet. Ein positiver Klon, GatSRp30, wurde gefunden, vermessen, subkloniert und sequenziert (EMBL-Zugangs- numer AJ131214) . Eine teilweise cDNA-Sequenz wurde mit einer BLAST-Suche durch die EST-Datenbanken mit der Zugangsnummer R65514, 4018 Arabidopsis thaliana cDNA Klon 17J1T7 gefunden und vom Arabidopsis Biological Resource Center an der Ohio State University freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Sequenzhomologie wurde unter Verwendung des Sequenzanalyse- Softwarepaketes Version 7.1-UNIX von Genetics Computer Group
(GCG, University of Madison, Madison, WI) analysiert. Die Sequenzierung der cDNA und der genomischen Klons erfolgte unter Verwendung eines A.L.F. DNA-Sequencer and Auto Read Sequencing Kit (Pharmacia) . Um einen cDNA-Klon von atSRp34/SRl zu erhalten, wurde der EST-Klon mit der Zugangsnummer ACT76795, 11573 atcDNA Klon 151I9T7 sequenziert. Die Genomsequenzen für atSRp34/SRl
(Zugangsnummer AF001035) wurden mittels PCR isoliert und sequenziert .
Analyse alternativ gespleißter Isoformen
Die RNA-Blot-Analysen erfolgten wie beschrieben (Lopato et al . 1996b) . Für alternativ gespleißte Isoformen codierende cDNAs wurden durch RT-PCR unter Verwendung von Gesamt-RNA-Präpara- tionen von A. thaliana-Pflanzen verschiedener Entwicklungsstadien und von der unübersetzten 3 ' -Region (für die reverse Transkription) abgeleiteten Primern erhalten.
(1) 5'- AATXlAGσ CA ATCπ:AτAτCτAτCG AAA CC'
3' [atSRp30) und
(2) S'-AAT^A^^QAAAO^ATAΥ ^IX^AAAAAAAAC'
3' {atSRp34/SRl)
(Die unterstrichenen Nukleotide entsprechen Restriktionsstellen) und vom Anfang der unübersetzten 5 ' -Region am Ende der codierenden Region (für PCR) :
(3) S^AAACrGGATCCAGAA ^TCTAACGCTr- -TCG 3' [atSRps30] und
(4) 5^ATATAGGATCCTCAACCAGAUAUCACAGGTG-3' [atSRp30); und
(5] S'-AAATATCTAGAGATCTCAAATCGACGACC-3'
[atSRp34/SRl) und (6) δ^ATATAGGATCCCATTTTACCTCGATGGAC^'
[atSRp34/SRl).
Alle Produkte wurden sequenziert. Das alternative Spleißen der langen Introns wurde unter Verwendung von Primern untersucht, die von benachbarten Exons abgeleitet wurden: (7) 5^AATG GCTCTGTGTCACCTGCTAGATCC-3'
(αtSRp301 und
(8) 5'-ATATAGGATCCAGATATCACAGGTGAAAC-3'
(-z 5Rp30J; und
(9) 5^ATAGGATCCAGGAGCAGAAGTCCCAAGGCAAA 3' {atSRpM/SRl) und
(10) 5^AAAGTCGA^GAAGX--TAGAGGAGATCTTGATC-3' iatSRp34/SRl).
Die Fragmente wurden auf 1,2% Agarosegel analysiert .
Konstrukte für Promotoranalyse und Überexpression Etwa 1 kb Promotorsequenzen von atSRp30 und atSRp34/SRl plus ihre kompletten unübersetzten 5 ' -Regionen (einschließlich des ersten Introns im Fall von atSRp34/SRl) wurden mittels PCR vom Genomklon GatSRp30 bzw. genomischer DNA von A. thaliana als Templat unter Verwendung von Primern
(11) 5'-AAAC-TAAGC-r- GGTATCτTC-TτCCCTGCAAG^, [atSRp30)}
(12) 5'-AAACCTAGGCGGCTACTCAGCTGATACCTCAG- ACCAG-3' [atSR≠O],
(13) S'-AAACTAAGCITAAATATTGAACCGGCCTCGGT- TC-3' [atSRp34/SRl)}
(14) 5'-AAAC GGATCC πTCCTGTTGGTCGTCGACG- ATTTGθ' {atSRρ34/SRl)} und
(15) 5^AAACTGGATCCTCTTCCTTTATCAAATCC-3' {atSRp34/SRl)
enthaltend Hindlll und BamHI Restriktionsstellen erhalten. Diese Fragmente wurden mit Hindlll und BamHI digeriert und mit dem GUS-Reportergen (Jefferson 1987) in pBHOl (Clontech) fusioniert.
Die cDNA und die genomischen Sequenzen von atSRp30 wurden von cDNA und genomischer DNA von A. thaliana unter Verwendung der Primer 3 und l, enthaltend BamHI bzw. Sacl Restriktionsstellen, amplifiziert . Die DNA-Fragmente wurden sequenziert und in die BamHI-SacI Restriktionsstellen des pBI121 (Clontech) Vektors (wobei das GUS-Gen gelöscht ist) unter Kontrolle des 35S CaMV Promotors eingebracht, was zu pC30 bzw. pG30 genannten Konstrukten führte. Kultivierung von Pflanzen und Suspensionskulturen und Pflanzentransformationsprozess
Die Bedingungen zur Aufrechterhaltung von Karotten- und Tabak- BY2-Suspensionskulturen wurden früher beschrieben (Lopato et al . 1996a) . Die Suspensionskultur von A. thaliana Ecotyp Columbia war ein Geschenk von Czaba Koncz (Max Planck-Institut für Züchtungsforschung, Köln, Deutschland) und wurde aufrechterhalten, wie in Lopato et al . (1999) beschrieben ist. A. thaliana Ecotyp Columbia wurde in allen Transferexperimenten verwendet. Die Samen wurden durch 30 min Durchtränkung mit Wasser oberflächensterilisiert, gefolgt von 1 min Inkubation in 70% Ethanol, 10 min in 10% Bleiche und 5 Spülungen mit sterilem Wasser. Die sterilisierten Samen wurden in MS-Medium (Murashige und Skoog 1962) gezüchtet, das mit 1% Saccharose angereichert war. Die Pflanzen wurden üblicherweise in einem Zyklus von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit bei 23° gehalten, wenn nicht anders angegeben. Die Zellkultur wurde in Medium gezüchtet, das Murashige-und-Skoog-Salze, 2 x Gamborg's Vitamine (Gamborg et al. 1968), 1 mg/1 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 3% (M/V) Saccharose enthielt. Die Zellkulturen wurden in 50 ml Medium in konischen 250 ml Kolben in einer Rotationsschüttel- vorrichtung bei 110 Upm und 23°C in schwachem Licht inkubiert. Die Zellsuspensionen wurden alle 7 Tage subkultiviert und bei jeder Subkultur dreifach mit frischem Medium verdünnt.
Alle Konstrukte wurden unter Verwendung eines triparentalen Paarungsverfahrens mit dem Helferplasmid pRK2013 (Ditta et al . 1980) in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al. 1983) eingebracht. Wurzelexplantate von A. thaliana wurden unter Verwendung des von Valvekens et al . (1988) beschriebenen Verfahrens mit einer Modifikation transformiert: Die Wurzelexplantate wurden von 15 Tage alten Setzlingen genommen, die auf vertikal an geordneten Agarplatten (Huang und Ma 1992) gezüchtet worden waren. Die Samen der transgenen Pflanzen wurden in Gegenwart von 50 μg/ml Kanamycin keimen gelassen.
Histochemischer Assay der GUS-Expression Histochemische Assays der GUS-Expression wurden mit 5-Brom-4- chlor-3-indolylglucuronid (X-Gluc, Duchefa) als Substrat durchgeführt und erfolgten an intakten Setzlingen oder ausgeschnittenen Organen reifer Pflanzen, die in vivo gezüchtet worden waren, wie von Jefferson (1987) beschrieben wurde. Die Proben wurden 2 bis 6 Stunden lang mit 70% Ethanol behandelt, um erforderlichenfalls Chlorophyll aus den Geweben zu entfernen.
Reinigung von SR-Proteinen von Arabidopsis und Immunblot
SR-Proteine wurden von 3 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen oder 5 Tage alten Suspensionskulturen unter Verwendung eines zweistufigen Salzausfällverfahrens gereinigt, wie beschrieben (Lopato et al. 1996a). Gesamtproteinextrakte wurden mit dem Puffer für die SR-Proteinisolierung (Zahler et al . 1992) hergestellt. Die Proteine vom Magnesiumniederschlag und die Gesamtproteinextrakte wurden auf 12,5% SDS-Gel aufgetrennt. Die Protokolle für den Immunblot und den Nachweis sind früher beschrieben worden (Lopato et al. 1999). Die Proteindephosphorylierung erfolgte mit alkalischer Phosphatase von Kälberdarm (Biolabs) .
Expression von atSRp30 und atpSR34/SRl in Bakterien
Die codierende Region von atSP30cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer 5 ' -ATATACCATGGGTAGCCGATGGAATCGTAC-3 ' und (4) amplifiziert .
Die codierende Region von atSRp34/SRlcDNA wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer 5 ' -ATATACCATGGGCAGTCGTTCGAG-3 ' und (6) amplifiziert . Die Primer enthalten Ncol und BamHI Restriktionsstellen. Um die Ncol-Restriktionsstelle zu erhalten, wurde das vierte Nukleotid der codierenden Region in beiden Fällen auf G geändert. So exprimiertes atSRp30 und atSRp34/SRl weisen Ser2- Arg bzw. Ser2-Gly-Substitutionen auf. Die Fragmente wurden in den bakteriellen Expressionsvektor pET-3d (Novagen) geklont und in den E. coli-Stamm BL21 (DE3)pLysS (Novagen) transformiert.
Einzelne Kolonien wurden in 100 ml LB-Medium zu einer Dichte von 0,4 bis 0,5 OD550 gezüchtet, auf 900 ml frisches, vorgewärmtes Medium transferiert und 1 Stunde lang inkubiert . Die Kulturen wurden mit 0,4 mM IPTG induziert und weitere 5 Stunden lang gezüchtet. Das Bakterienpellet wurde zwei Mal in 500 ml eiskaltem Waschpuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl bei pH 7,5) gewaschen und für die Einschlusskδrperisolierung verwendet: 2 g Bakterienpellet wurde in 18 ml eiskaltem Puffer A (10 mM Tris-HCl bei pH 7,9, 100 mM KCl, 2 mM DTT, 35% Saccharose) resuspendiert. 4,5 ml eiskalter Puffer B (333 mM Tris-HCl bei pH 8,0, 100 mM EDTA bei pH 8,0, 40 mg Lysozym) wurden zugesetzt und auf Eis mindestens 10 min lang inkubiert. Lysepuffer (22,5 ml, I M LiCl, 20 mM EDTA, 0,5% NP-40) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde insgesamt 2 min lang bei voller Stärke beschallt (15 sek Ausbrüche mit Kühlperioden von 1 min dazwischen) . Nach 10 min Zentrifugie- ren (Sorvall, SS34, 13000 Upm) wurde das Pellet zwei Mal in 25 ml Puffer C (10 mM Tris-HCl bei pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 0,5 M LiCl, 0,05% NP-40, 1 mM DTT) und dann zwei Mal mit dem gleichen Puffer ohne LiCl gewaschen. Die isolierten Einschlusskδrper enthielten >95% reines Protein und wurden für die Herstellung polyklonaler Antikörper (Lopato et al . 1999) verwendet.
ERGEBNISSE
Isolierung und Sequenzierung von genomischen und cDNA-Klons von atSRp30
Zuerst identifizierten wir pflanzliche SR-Proteine in Magnesiumchloridpellets von Proteinextrakten von Karotten- und Tabakzeil- kulturen und von Arabidopsis-Pflanzen. Die Proteine wurden mit dem monoklonalen Antikörper mAbl04, der für ein gemeinsames Phosphoepitop in allen SR-Proteinen spezifisch ist, und mit einem monoklonalen Antikörper, der für den menschlichen SF2/ASF- Spleißfaktor spezifisch ist, nachgewiesen (Lopato et al . 1996a). Ein Protein von etwa 50 kD von der Karotten-SR-Präparation, das von beiden Antikörpern erkannt wurde, wurde isoliert und teilweise sequenziert. Es wurden zwei Peptide mit signifikanter Homologie mit menschlichem SF2/ASF und atSRp34/SRl gefunden. Das erste Peptid umfasste das RNP-2 Submotiv des ersten RRM, und das zweite Peptid hatte eine hohe Homologie mit einer Sequenz zwischen RNP-2 und RNP-1 des zweiten RRM (siehe Materialien und Methoden; Fig. 2, unten) . Auf Basis dieser Sequenzen wurden degenerierte Primer synthetisiert und für PCR an gereinigter genomischer DNA von Karotten, Tabak und Arabidopsis verwendet. Die Sequenzierung der geklonten PCR-Produkte ergab zwei sehr homologe Sequenzen von Arabidopsis und Tabak. Das Arabidopsis-Fragment war 838 Bp lang und enthielt 5 Introns. Die Fragment grenzen des Arabidopsis-Fragments sind in Fig. 1A mit schwarzen Pfeilen gekennzeichnet. Die von der PCR-Sequenz abgeleitete Proteinsequenz hatte eine extensive Homologie mit menschlichem SF2/ASF und atSRp34/SRl (Fig. 2) . Das PCR-Produkt von Arabidopsis wurde als eine Sonde verwendet, um eine λZAPII-Genombibliothek von A. thaliana zu screenen. Es wurde ein genomischer Klon gefunden und als atSRp30 bezeichnet (genomischer Klon von Serin/Arginin-reichem Protein von Arabidopsis thaliana mit einer abgeleiteten Molekülmasse von etwa 30 kD) . Er war >4,5 kb lang, hatte eine Promotorregion von 1805 Bp, endete jedoch 12 Bp oberhalb des Stopkodons . Eine korrespondierende cDNA wurde von einer cDNA-Bibliothek mit exprimierten Sequenz-Tags (EST) von A. thaliana Ecotyp Columbia erhalten und sequenziert. Die dieser cDNA entsprechende mRNA wurde als mRNAl von atSRp30 bezeichnet. Es wurden Primer aus der 3 ' -nicht-translatierten Region dieser cDNA verwendet, um die fehlenden Sequenzen des genomischen Klons durch PCR-Amplifikation auf gereinigter genomischer DNA zu erhalten. Das DNA-Fragment enthielt ein zusätzliches Intron, und der Rest war mit der entsprechenden Sequenz der cDNAl ident. Die Sequenz von GatSRp30 und die abgeleitete Proteinsequenz sind in Fig. 1A dargestellt.
Um den Vergleich von Merkmalen von atSRp30 und dessen eng verwandten atSRp34/SRl-Protein von Arabidopsis zu erleichtern (Lazar et al . 1995), wurde die Genomsequenz dieses Proteins unter Verwendung von PCR ermittelt. GatSRp34 hat eine sehr ähnliche Genstruktur wie GatSRp30, außer dass das erstere ein Intron in der 5' nicht übersetzten Region aufweist. Das Fragment von GatSRp34, das den Teil von Exon 11 bis zum Stopkodon um- fasst, ist in Fig. IC dargestellt, wo die alternativen Spleißereignisse unter Einbeziehung von Intron 11 ebenfalls angegeben sind.
Vergleich von atSRp30 mit anderen SR-Proteinen Die abgeleiteten Proteinsequenzen von atSRp30 und atSRp34/SRl sind sehr homolog (80,7% ähnlich und 67,1% ident) miteinander und weisen beide sehr hohe Ähnlichkeit (75,3% bzw. 77,8%) und Identität (58,1% bzw. 59,4%) mit menschlichem SF2/ASF auf (Fig. 2) . Da atSRp30 und atSRp34/SRl weniger homolog mit anderen bisher identifizierten tierischen oder pflanzlichen SR-Proteinen sind, können beide Proteine als echte Orthologe von menschlichem SF2/ASF angesehen werden. In ihren Amino-terminalen Teilen enthalten alle drei Proteine zwei RRMs mit ihren konservierten RNP- 2- und RNP-1-Submotiven, wobei das zweite RRM atypisch ist und die invariante SWQDLKD-Signatur, die charakteristisch für SF2/ASF-ähnliche SP-Proteine ist, enthält (Birney at al. 1993) . Im Gegensatz zu atSRp34/SRl und SF2/ASF sind die RRMs von atSRp30 jedoch nicht durch eine glycinreiche "Gelenk" -Region getrennt, sondern durch eine serinreiche Sequenz. Die RS-Domäne von atSRp30 ist aufgrund einer Verlängerung am 3 ' -Ende von atSRp34, die eine vorher beschriebene, positiv geladene Prolin/ Serin/Lysin-reiche (PSK) Domäne unbekannter Funktion einschließt (Lazar et al . 1995), kürzer als die von atSRp34. Wenn diese unike 3 ' -Verlängerung nicht in Betracht gezogen wird, ist atSRp34/SRl geringfügig homologer mit menschlichem SF2/ASF, hauptsächlich aufgrund ihrer gemeinsamen G-reichen Gelenkregion. In ihrer Gesamtheit weisen diese Analysen darauf hin, dass im Gegensatz zu Säugetieren, für die bisher nur ein SF2/ASF-Protein beschrieben worden ist, in Arabidopsis zwei SF2/ASF-Homologe vorhanden sind.
RNA-Verteilung und alternative Spleißformen von atSRp30 und atSRp34/SRl
RNA-Blots von Poly(A)+ mRNA von verschiedenen Geweben von Arabidopsis-Pflanzen vom Wildtyp wurden mit radioaktiv markierten atSRp30 oder atSRp34/SRl cDNAs sondiert und wiesen in jedem Fall mindestens zwei mRNA-Spezies auf (Fig. 3A) . Das Ausmaß der Expression jedes Gens variierte in verschiedenen Geweben erheblich, war jedoch in beiden Fällen bei Blüten am größten, gefolgt von Wurzeln (Fig. 3A) . Außerdem war das Verhältnis der beiden unterscheidbaren mRNAs, mRNA3 und mRNAl, für jedes Gen in den unterschiedlichen Organen verschieden. Für atSRp30 schien mRNA3 in größeren Mengen in Blättern, Stängeln und Blüten vorhanden zu sein, während mRNAl in Wurzeln vorherrschend war. Im Gegensatz dazu betrug das Verhältnis der beiden wichtigsten mRNAs von atSRp34/SRl etwa 1:1 in Blättern und Stängeln, während in den Wurzeln und Blüten mRNAl dominierte. Eine weitere Sondierung des RNA-Blots mit dem langen zehnten Intron von atSRp30 zeigte, dass mRNA3 Sequenzen dieses Introns behielt, was darauf hinweist, dass das alternative Spleißen diese Region von atSRp30 pre-mRNA mit einbezieht.
Die gesamten Sequenzen der verschiedenen mRNA-Isoformen wurden durch RT-PCR-Klonen von Gesamt-RNA unter Verwendung von Primern der 5'- und 3' -Enden der Gene erhalten (siehe Materialien und Methoden) . mRNAl entsprach der cDNA-Sequenz von atSRp30, während auf Grund der Verwendung einer alternativen 3 ' -Spleißstelle mRNA3 einen Teil des zehnten Introns behielt (Fig. 1A, B) . Die mRNA2-Isoform mit den beiden alternativen 3'- und 5 • -Spleißstellen innerhalb von Intron 10 (Fig. 1A, B) war in den Northern der Pflanzen vom Wildtyp nicht erkennbar (siehe Fig. 3A) und wurde nur durch RT-PCR durch Erhöhung der Zyklenzahl nachgewiesen (Daten nicht angegeben) .
Es wurde der gleiche Ansatz verwendet, um die mRNA-Isoformen von atSRp34/SRl zu sequenzieren (Fig. IC) . Die längste mRNA-Spezies, die auch die in Pflanzen vom Wildtyp häufigste ist, wurde mRNA5 genannt und behielt das meiste von Intron 11 (das in der Position ist, die Intron 10 von atSRp30 entspricht) mit Ausnahme eines internen Introns von etwa 80 Nukleotiden. Während der frühen Entwicklung der Pflanzen konnten zwei andere, kleinere alternative mRNAs festgestellt werden, jedoch nur mittels RT-PCR (Daten nicht angegeben) . mRNA4 verwendet eine zusätzliche alternative 3 ' -Spleißstelle; mRNA2 verwendet alternative 51- und 3'- Spleißstellen (Fig. IC, D) ; und mRNA3 , die die wichtigste alternativ gespleißte mRNA in Pflanzen ist, wenn atSRp30 vom 35SCaMV- Promotor überexprimiert wird (Fig. 5 unten), verwendet eine alternative 5 ' -Spleißstelle.
Die obigen, alternativ gespleißten mRNAs von atSRp30 und atSRp34/SRl hatten alle ein Stopkodon innerhalb des Rahmens in der Nähe des 5 '-Endes der behaltenen Intronsequenz . Den hypothetischen, kürzeren Proteinen, die als atSRp30s und atSRp34s bezeichnet werden, fehlt der Carboxy-terminale Teil der RS-Domäne, und sie haben statt dessen andere Sequenzen, die in Fig. 1A für atSRp30s und in Fig. IC für atSRp34s fett gedruckt dargestellt sind.
Um Informationen über Veränderungen in den Transkriptions- und alternativen Spleißmustern von atSRp30 während der Entwicklung der Pflanze zu erhalten, wurde die Gesamt-RNA von ganzen Pflanzen verschiedenen Alters isoliert und für RNA-Bloth-Hybridisie- rung und RT-PCR-Analyse (Fig. 3B, C) verwendet. Für RT-PCR wurden von Exons neben dem zehnten Intron erhaltene Primer verwendet. Die Ergebnisse beider Verfahren waren ziemlich übereinstimmend und zeigten, dass die Expression von mRNAl in jüngeren Pflanzen am höchsten ist und etwa um Tag 12 abzunehmen beginnt, während die Expression von mRNA3 bei jungen Setzlingen extrem niedrig ist, zwischen Tag 9 und 14 ihren Höhepunkt erreicht und danach langsam abnimmt. Obwohl wir nicht wissen, wie das Verhältnis dieser beiden Transkripte reguliert wird, könnten diese regelnden Ereignisse die Menge echten atSRp30-Proteins in einzelnen Zellen bestimmen.
Antikörpernachweis von Arabidopsis SR-Proteinen
In Hühnern wurden polyklonale Antikörper gegen gereinigtes rekombinantes atSRp30 und atSRp34/SRl gezüchtet und eingesetzt, um Antigene in verschiedenen Ammoniumsulfatfraktionen von Arabidop- sis-Extrakten zu identifizieren. Die Extrakte wurden durch se- quenzielles Ausfällen mit Ammoniumsulfat und Magnesiumchlorid fraktioniert, um SR-Proteine anzureichern (Roth et al . 1990). Die anti-p30- und anti-p34-Antikörper erkannten Proteine im Abschnitt von 60-90% Ammoniumsulfat. Die immunreaktiven Proteine im dialysierten 60-90%-Abschnitt fielen in Gegenwart von 20 mM Magnesiumchlorid quantitativ aus. Es wurden keine Kreuzreaktionen von Pflanzenproteinen mit der pre-immunen Immunglobulinfrak- tion gefunden (Daten nicht angegeben) .
Der Magnesiumniederschlag wurde einem Immunblot zugeführt und mit vier verschiedenen Antikörpern sondiert. Mit anti-p30 wurden sechs Proteinbande als drei Doubletts detektiert, wobei das 43- bis 46-kD-Doublett die höchste Intensität aufwies. Die beiden anderen Doubletts wanderten mit erkennbaren Molekülmassen von 38-40 bzw. 31-34 kD (Fig. 4A, Spur 2) . Das Immunfärbemuster mit dem monoklonalen Antikörper mAbl04 (Fig. 4A, Spur 1) , das für ein bei SR-Proteinen übliches Serin-Phosphoepitop spezifisch ist
(Roth et al. 1990), war sehr ähnlich, obwohl das kleinste Band deutlicher war als bei anti-p30 (Spur 2) . Dies könnte auf ein zusätzliches SR-Protein von etwa 30 kD hinweisen, oder es könnte das Vorhandensein mehrerer oder stärkerer Phosphoepitope innerhalb von p30 widerspiegeln. Wir fanden mit dem mAbl04-Antikörper keine Proteine mit großer Molekülmasse, obwohl Lazar et al.
(1995) von immunreaktiven Proteinen bis zu 120 kD berichtet haben.
Die anti-p34-Antikörper erkennen hautpsachlich drei Proteine von etwa 46-47, 40 und 34 kD. Da der gleiche Antikörper eine minimale Kreuzreaktion mit rekombinantem atSRp30 zeigt (Daten nicht angegeben) , stellen diese Bande möglicherweise mit atSRp34/SRl verwandte Proteine dar und stimmen gut mit veröffentlichten Daten über die Überexpression überein, bei welchen das Protein mit einer Größe von 47-48 kD immundetektiert wurde (Lazar et al . 1995) . Das 40 kD-Protein wandert mit einer alternativ gespleißten Isoform von atSRp34/SRl mit (siehe unten) , während die Natur des 34 kD-Polypeptids noch zu bestimmen ist. Interessanterweise ist der Immunblot mit anti-p34 jenem sehr ähnlich, der mit einem für menschliches SF2/ASF spezifischen monoklonalen Antikörper erhalten wurde (Fig. 4A, vgl. Spur 3 und 4) . Daher findet zwischen anti-hSF2, das ein diskontinuierliches Epitop innerhalb von RRMl von hSF2/ASF, nicht aber andere menschliche SR-Proteine erkennt (Hanamura et al. 1998) und dem gleichen Set von Arabidopsis-Proteinen wie anti-p34 eine Kreuzreaktion statt, was die Vermutung stützt, dass hSF2/ASF dem atSRp34/SRl in dieser Region ähnlicher ist als dem atSRp30.
Die Tatsache, dass atSRp30 und atSRp34/SRl in der SR-Proteinzu- bereitung vorhanden sind und mit spezifischen Banden im mAbl04- Immunblot mitwandern, weist darauf hin, dass beide Proteine phosphoryliert sind. Um diesen Hinweis zu überprüfen, behandelten wir die SR-Proteinzubereitung für verschiedene Zeiten mit steigenden Konzentrationen von alkalischer Phosphatase (Fig. 4B, C) . Im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen (Spuren 1, 2) führten diese Behandlungen zu einem Anstieg der Mobilität aller immungefärbten Bande. Unter diesen Bedingungen erkannte anti-p30 hautps chlich drei Proteine (27, 31, 38 kD) , während anti-p34 zwei Proteine erkannte (31 und 38kD) . Wie erwartet waren alle diese Proteine nicht mehr mit mAbl04 gefärbt, mit Ausnahme des 38 kD-Bandes, das möglicherweise einen teilweise dephosphory- lierten Zwischenstoff darstellt, der gegen weitere Dephosphory- lierung resistent ist (Daten nicht angegeben) . Interessanterweise führte die Dephosphorylierung zum Auftreten neuer Bande von größerer offensichtlicher Molekülmasse, was mit unserer Beobachtung übereinstimmt, dass nicht phosphoryliertes rekombinantes atSRp30 und atSRp34/SRl sehr unlöslich sind und eine starke Tendenz zur Aggregation haben.
Transkriptionelle Aktivität von SR-Proteinpromotoren bei Arabidopsis
Es ist bemerkenswert, dass Arabidopsis im Gegensatz zu Säugetieren zwei SF2/ASF-ähnliche Proteine besitzt. Wie die Northern Blot-Analyse zeigte, werden die Gene beider Proteine in allen Pflanzenorganen transkribiert. Es war daher interessant, zu untersuchen, ob beide Gene allgemein in allen Geweben oder spezifisch in verschiedenen Geweben transkribiert werden, oder in welchem Ausmaß sie überlappende Aktivitäten haben. Zu diesem Zweck wurden die Promotoren von GatSRp30 und GatSRp34 einschließlich der 5 ' -unubersetzten Regionen bis zum Startkodon mit der codierenden Region eines Reporter-ß-Glucuronidase-Gens fusioniert und mittels von Agrobacterium tumefaciens mediierter Wurzeltransformation in A. thaliana-Pflanzen transferiert, ß- Glucuronidase (GUS) -Aktivität wurde in keinem getesteten, nicht- transgenen Arabidopsis-Gewebe jeweils beobachtet, auch nicht in transgenen Pflanzen, die ein promotorloses GUS-Gen besitzen. Kontrollpflanzen, die eine 35S Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) - Promotor-GUS-Fusion enthielten, waren leicht zu färben, was zeigt, dass der SubstratZugang die GUS-Aktivität nicht einschränkte. Um jeglichen Einfluss der transgenen Position auf die Promotoraktivität auszuschließen, wurden die Analysen mit verschiedenen unabhängigen transgenen Linien durchgeführt .
Unter Verwendung detaillierter histochemischer Analysen fanden wir, dass beide Gene distinkte, jedoch auch überlappende Muster transkriptioneller Aktivität aufwiesen. Blumen im Stadium nach der Blüte (Fig. 5A, E) zeigten im Wesentlichen die gleichen Färbemuster für beide Gene, wobei die deutlichste Expression bei den Pollenkörnern auftrat und Kelchblätter und Griffel nur schwach färben. Außerdem wurde bei der Abszissionszone der Blüte bei atSRp30-GUS-transgenen Pflanzen schwache Aktivität beobachtet (Fig. 5A) . Die Blätter von atSRp30-GUS-Pflanzen zeigten die stärkste Färbung in vaskulären Bündeln und in den Stützzellen jedes Trichoms (Fig. 5B) , während die Fusion atSRp34-GUS nur in sekundären Venen und in den umgebenden Zellen schwach aktiv war, jedoch niemals eine Aktivität in Trichomen oder Stützzellen beobachtet wurde (Fig. 5F) . Die Unterschiede in den GUS-Färbemustern dieser Gene waren während der verschiedenen Stadien der lateralen Wurzelentwicklung besonders evident. Sowohl atSRp30 als auch atSRp34-GUS-Fusionen waren in den allerersten Stadien der lateralen Wurzelbildung aktiv, wenn Perizykelzellen stimuliert werden, dedifferenzieren und sich vermehren. Dann in den späteren Stadien, wenn es zur Redifferen zierung kommt, um das Lateralwurzelmeristem zu bilden, wurde atSRp30-GUS in den vergrößerten Basalzellen der sich bildenden Lateralwurzel expri- miert (Fig. 5C) , während die Expression von atSRp34-GUS für das aktivierte Wurzelmeristem charakteristisch war (Fig. 5G) . Die Färbemuster während der frühen Entwicklung der Setzlinge bot zusätzliche Beweise für die unterschiedlichen transkriptionellen Aktivitäten von atSRp30 und atSRp34/SRl. Jedes der Gene wurde in spezifischen Regionen entlang der Achse Spitze-Basis des Setzlings exprimiert. Bei den atSRp30-GUS-Setzlingen war die Expression auf die Keimblätter beschränkt (Fig. 5D) , während bei den atSRp34-GUS-Setzlingen Expression im Hypokotyl und in den Wurzeln beobachtet wurde (Fig. 5H) , was darauf hinweist, dass diese Gene in Regionen mit verschiedenen Zellteilungsmusters trans- kriptionell aktiv sein können. Dieser Hinweis wurde durch die unterschiedliche Expression von atSRp30 und atSRp34/SRl während der Lateralwurzelbildung, sowie in Trichomstützzellen bestätigt.
Überexpression von atSRp30 in transgenen Pflanzen
Bei Drosophila führte die ektopische Überexpression von SRp55/B52 zu verschiedenen Abnormitäten bei der Entwicklung obwohl die Identität betroffener Transkripte noch immer unbekannt ist (Kraus und Lis 1994) . Es war daher von Interesse, die Wir- kung der Überexpression von atSRp30 auf die Pflanzenentwicklung und auf die alternativen Spleißmuster einzelner Pflanzentransskripte zu untersuchen. Die verwendeten Konstrukte enthielten entweder ein komplettes Gen (pG30) oder eine cDNA (pC30) , die für atSRp30 unter Kontrolle des stark konstitutiven Promotors der 35S RNA von CaMV codiert. Der 35S CaMV-Promotor ist stark und konstitutiv in allen untersuchten Pflanzengeweben, was in Kontrollversuchen unter Verwendung von GUS als Reportergen be stätigt wurde. Um die Bedingungen des Regenerations- und Transformationsprozesses in der RNA-Analyse von Transformanten zu regeln, wurden Negativkontrollen entweder mit einer 35SRNA-Promotor-GUS-Kontrolle (pBI121) transformiert oder waren Transfor- manten mit dem gleichen Konstrukt, die jedoch aus unbekannten Gründen keine Überexpression aufwiesen.
Die beiden Fusionskonstrukte pG30 und pC30 wurden für die von Agrobacterium mediierte Transformation von Arabidopsiswurzeln verwendet. Vierzig unabhängige, transgene Linien wurden für jedes Konstrukt regeneriert; acht der mit pG30 transformierten Linien und zwölf der mit pC30 transformierten Linien wurden für die weitere Arbeit verwendet . Einige dieser transgenen Linien wurden für RNA-Blot- und RT-PCR-Analysen verwendet, wie in Fig. 6 A und B dargestellt ist . Überraschenderweise exprimierten alle pG30-Transformanten (Fig. 6A, B, Linien 1 bis 4) hauptsächlich mRNA3 , die innerhalb des langen Introns eine alternative 3 ' - Spleißstelle besitzt (Fig. IB) , aber mRNAl war in diesen Pflanzen trotzdem noch häufiger als in der Kontrollpflanze (Fig. 6A, Spur 10) , wie von der RNA-Blotanalyse abgelesen wurde (in Spur 10 in Fig. 6B wurde vier Mal mehr Produkt geladen) . Obwohl die mRNAl-Werte in beiden Typen von Transformanten ziemlich verschieden sind (Fig. 6A) , zeigt die RT-PCR ähnliche Ausbeuten (Fig. 6B) , weil eine große Anzahl von Zyklen verwendet wurde, um alle alternativ gespleißten Produkte zu detektieren. Wie erwartet überexprimierten alle pC30 enthaltenden Transformanten nur mRNAl (Fig. 6A, Spuren 5-9) . In beiden Typen von Transformanten waren überexprimierte mRNAs >100-fach häufiger als in Pflanzen vom Wildtyp. Als pC30-Transformanten mit RT-PCR analysiert wurden, war interessanterweise nur mRNA2 vorhanden, die kryptische 3'- und 5 ' -Spleißstellen in Intron 10 verwendet (Fig. 6B und IB) , während eine kleine Menge von mRNA3 in Pflanzen vom Wildtyp erkennbar war. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein Überschuss an atSRp30 die Auswahl der 5 ' -Spleißstelle der endogenen atSRp30 pre-mRNA verändert.
In Anbetracht der obigen Ergebnisse war es von Interesse, die Überexpression von atSRp30 auf Proteinebene zu messen. Die gesamten, löslichen Proteinextrake von transgenen Pflanzen wurden durch Western Blotting unter Verwendung von anti-p30 zur Immun- detektion analysiert (Fig. 6C) und mit einer Kontrollpflanze (Spur 8, eine transformierte Pflanze ohne Überexpression von atSRp30) und mit einer SR-Proteinzubereitung von Arabidopsis- Suspensionskultur (Spur 1) verglichen. Die SR-Proteinzubereitung hatte das charakteristische Muster von anti-p30 (vgl. Fig. 6C, Spur 1, und Fig. 4A, Spur 2) , während auf Grund der geringen Häufigkeit von atSRp30 in Pflanzen im Gesamtproteinextrakt der Kontrollpflanze keine spezifischen Proteine immungefärbt wurden (Fig. 6C, Spur 8) . Im Gegensatz dazu war ein spezifisches Proteinband in den pC30-Transformanten zu erkennen (Spuren 3-7) , das mit einem Proteinband in der SR-Proteinzubereitung mitwanderte (Spur 1) . Im Gegensatz dazu wurde im pG30- Transformanten (Spur 2) nur ein schwaches Proteinband festgestellt. Diese Ergebnisse stimmen gut mit dem RNA-Expressionsmuster von mRNAl in beiden Typen von Transformanten überein (Fig. 6A) . Es ist interessant, dass die Überexpression von atSRp30 ein immungefärbtes Protein von 38 kD und nicht ein Band ergab, das mit dem häufigeren 43- bis 46-kD-Doublett mitwanderte, das bei der SR- Proteinzubereitung zu sehen war (Fig. 6C, Spur 1) . Eine wahrscheinliche Erklärung ist, dass das überexprimierte atSRp30 nur teilweise phosphoryliert ist, was mit unserer Beobachtung zusammenhängen kann, dass selbst vollständige Dephosphorylierung zu einem 38 kD atSRp30-Protein führt, das das mAbl04-Phospho- epitop behält (Fig. 4B, Spuren 3-6) . Allerdings konnte mit keinem der verwendeten Antikörper in pG30-Transformanten ein kürzeres Proteinprodukt (atSRp30s) der äußerst häufigen mRNA3 nachgewiesen werden (siehe auch Fig. 6C, Spur 2) .
Phänotypänderungen bei Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren
Die Überexpression von atSRp30 führte zu starken Phänotypen mit pleiotropen Veränderungen sowohl in der Morphologie als auch bei der Entwicklung der transgenen Pflanzen. Zwischen Pflanzen, die mit pG30- und pC30-Konstrukten transformiert waren, wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, obwohl die Werte von atSRp30-Protein verschieden waren (Fig. 6C, vgl. Spur 2 und Spuren 3 bis 7) . Die Beobachtungen waren in T? und folgenden Generationen unabhängiger transgener Linien reproduzierbar und cose- gregierten mit der antibiotischen Resistenz zusammen. Bei transgenen Pflanzen war der Übergang vom Wachstums- zum Blühstadium unter Kurztagbedingungen stark verspätet . Die Zeit vom Keimen bis zur Bildung der ersten reifen Schote betrug 65-78 Tage bei überexprimierenden Pflanzen im Vergleich zu 42-47 Tagen bei Kontrollpflanzen, die unter den gleichen Bedingungen gezogen wurden. Außerdem zeigten ausgewachsene Pflanzen eine reduzierte apikale Dominanz, was zu einem "buschigen" Phänotyps mit erhöhter Anzahl sekundärer Infloreszenzen und verkürzter primärer Infloreszenz führte (Fig. 7C) . Das Züchten der transgenen Pflanzen unter Langtagbedingungen führte zu einer teilweisen Rückkehr zu einem normalen Phänotyp. Trotz der teilweisen Wiedererlangung der apikalen Dominanz blieben jedoch der Übergang zum Blühen und die Zeit bis zum Altern verspätet. Unter Langtagbedingungen begann die Mehrheit der Pflanzen von überexprimierenden Linien zwischen 35 und 39 Tagen nach dem Keimen zu blühen, während Kontrollpflanzen zwischen Tag 25 und Tag 28 blühten. Die ersten Infloreszenzen waren sehr kurz und nicht größer als 0,5 bis 1 cm, als sich die erste Blüte öffnete. Die Blüten bei transgenen Pflanzen waren etwa 30% größer als bei Kontrollpflanzen (4 bzw. 3 mm) . Transgene Pflanzen hatten auch größere Rosettenblätter (Fig. 7A, vgl. Wildtyp in B) , wobei die Trichome hauptsächlich vier bis fünf 5 Zweige hatten, im Gegensatz zu den Blättern beim Wildtyp, die hauptsächlich dreizweigige Trichome aufwiesen. In stark überexprimierenden Linien produzierte die primäre Infloreszenz zahlreiche sekundäre Zweige mit vegetativem, rosetten artigem Aussehen. Diese Zweige entwickelten 7 bis 15 vegetativartige Blätter und bildeten schließlich Infloreszenzen. Unter Langtagbedingungen war die zum Zeitpunkt der Blüte bestimmte Anzahl der Rosettenblätter bei transgenen Pflanzen etwas geringer als beim Wildtyp (durchschnittlich 12 bzw. 16 Blätter) . Unabhängige transgene Linien, die atSRp30 überexprimieren, zeigten in verschiedenem Ausmaß die beschriebenen Charakteristika mit den größten Auswirkungen auf die Zeit für den Übergang von der vegetativen zur reproduktiven Phase.
Überexprimiertes atSRp30 moduliert alternatives Spleißen in vivo
Der Einfluss der Überexpression von atSRp30 auf sein eigenes alternatives Spleißmuster und die große Homologie von atSRp30 mit dem menschlichen alternativen Spleißfaktor SF2/ASF wiesen darauf hin, dass dieses Protein ein Modulator des pflanzlichen Spleißens sein könnte. Diese Annahme kann in vitro nicht überprüft werden, da keine pflanzlichen Spleißextrakte zur Verfügung stehen. Daher verwendeten wir Gesamt-RNA-Präparationen von pG30- Transformanten (niedrigeres Niveau der atSRp30-Überexpression) und pC30-Transformanten (höheres Niveau der atSRp30-Überexpression) für die RT-PCR-Analyse mehrerer Pflanzenintrons, von denen bekannt ist, dass sie unter Wildtyp-Bedingungen alternativ prozessiert werden.
Unter mehreren getesteten Genen, wie FCA (Macknight et al . 1997), Rubiscoaktivase (Werneke et al . 1989), Agamous (Yanofsky et al. 1990) und LSD1 (Dietrich et al . 1997) wurden bei Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren, keine Veränderungen der Spleißmuster festgestellt. Es wurde jedoch gefunden, dass das pre-mRNA-Spleißen dreier Pflanzengene von der Überexpression betroffen wird, wie im folgenden ausgeführt ist.
Der Spleißfaktor atSRp31 gehört zu einer neuen Familie von pflanzlichen RS-Proteinen und besitzt ein alternativ gespleißtes zweites Intron (792 Nukleotide) (Lopato et al . 1996b). Beim Wildtyp der Pflanze wurden bei diesem Intron entweder eine kryptische 3 ' -Spleißstelle oder die beiden alternativen 3'- und 5'- Spleißstellen verwendet (Fig. 8A) , während in Kontrolllinien (Spur 1) und pG30-transformierten Linien (Spuren 2 bis 5) die letztere Form vorherrschend war. Im Gegensatz dazu exprimierten pC30-Linien (Spuren 6-10) hauptsächlich die Form der alternativen 3 ' -Spleißstelle, obwohl ihre Häufigkeit variabel war (in den Spuren 6 und 7 ist diese Form nur auf dem Originalfoto zu erkennen) . Diese Transkripte sind wahrscheinlich einem nonsens-ver- mittelten Abbau ausgesetzt und codieren möglicherweise für das gleiche Rumpfprotein. Ein weiteres, gut beschriebenes alternatives Spleißereignis findet im Fall des Ul-7OK-Gens von Arabidopsis statt, wobei Transkripte, die das Intron 6 behalten, in den meisten Geweben (außer in den Wurzeln) häufiger sind als das richtig gespleißte Transkript (Golovkin and Reddy 1996) . Die Ergebnisse der RT-PCR von Kontrollpflanzen (Fig. 8B, Spuren 1, 9, 10) bestätigen diese Beobachtung. In beiden atSRp30-Transformanten, entweder in den niedriger exprimierenden pG30-Linien (Spuren 2 und 3) oder den höher exprimierenden pC30-Linien (Spuren 4 bis 8) wurden die meisten Transkripte korrekt gespleißt, und es wurde nur ein geringes Ausmaß an Zurückhalten der Introns beobachtet . Dieses regulatorische Ereignis könnte möglicherweise das Niveau des aktiven Proteins beeinflussen.
Der interessanteste Fall der Modulierung des alternativen Spleißens wurde im Fall des langen Introns (Intron 11) von GatSRp34 gefunden, eines engen Homologen von GatSRp30 (Fig. 9) . Bei Pflanzen vom Wildtyp (Fig. 9, Spur 1) wird ein Teil dieses Introns alternativ gespleißt, um mRNA5 zu erzeugen. Bei pG30- Transformanten (Spuren 2 bis 5) war mRNA3 die hauptsächliche, alternativ gespleißte Form, während die Werte von mRNAl unverändert schienen. Wenn atSRp30 stark überexprimiert wurde, wurde die alternativ gespleißte mRNA3 überraschenderweise zum Haupt- transkript, während die Menge mRNAl erheblich abnahm. Wenn man annimmt, dass kürzere PCR-Produkte möglicherweise überrepräsentiert sind, kann die Reduktion von mRNAl sogar noch drastischer sein. Diese Annahme wurde durch die Immunblot- Analyse der Gesamtproteinextrakte bestätigt: atSRp34/SRl wurde in Kontrollpflanzen (Fig. 9B, Spur 3) und in einem pG30-Transformanten (Spur 5) nachgewiesen, nicht jedoch in einem pC30-Transformanten (Spur 4) . Es wurde jedoch in diesem Fall ein kleineres, spezifisches Proteinband (atSRp34s, 38 kD) sichtbar, was darauf hinweist, dass das Proteinprodukt von mRNA3 in diesem Transforman- ten dominierend ist. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Überexpression von atSRp30 die Genexpression seines engen Homologen atSRp34/SRl stark beeinflusst.
DISKUSSION atSRp30 ist ein Mitglied der SR-Proteinfamilie Zusätzlich zu ihren charakteristischen Domänen, die ein oder zwei RRMs und eine Carboxy-terminale RS-Domäne mit multiplen SR- Dipeptiden einschließen, besitzen SR-Proteine (ein) Phosphoepi- top(e), das die von mAbl04 erkannt wird/werden, und sie sind in Gegenwart millimolarer Konzentrationen von Magnesiumsalzen löslich. Der Antikörper zu atSRp30 erkannte ein komplexes Banden muster im Mg-Niederschlag, während in den Gesamtproteinfraktionen kein spezifisches Band festgestellt werden konnte. Die Tatsache, dass atSRp30 in rohen Lysaten nicht nachgewiesen werden konnte, spiegelt die geringe Häufigkeit des Proteins und/oder die eingeschränkte Sensibilität des Antikörpers wider. Als atSRp30 jedoch überexprimiert wurde, wies der Antikörper ein spezifisches Protein mit einer offensichtlichen Mobilität von 40 kD nach. Im Gegensatz dazu konnte atSRp34/SR von anti-p34 in Gesamtproteinfraktionen nachgewiesen werden. Unsere Daten aus dem Immunblot bestätigen, dass atSRp30 ein echtes SR-Protein ist, da es in SR-Proteinpräparationen vorhanden ist und mit mAbl04 korrespondierende immungefärbte Bande aufweist. Da jedoch keine vollständige Dephosphorylierung erreicht werden konnte, wissen wir nicht, wie viele dieser Proteine modifizierte Formen von atSRp30 oder eng verwandten Proteinen darstellen.
Ist die Expression von atSRp30 selbstregulierend?
Als atSRp30 pre-mRNA überexprimiert wurde, war mRNA3, die durch die Verwendung einer alternativen 3 ' -Spleißstelle im zehnten Intron erzeugt wird, das hauptsächlich nachgewiesene Transkript, während der Wert von mRNAl nur mäßig erhöht war (Fig. 6) . Es gibt mehrere mögliche Erklärungen für dieses Phänomen. Erstens kann ein einschränkender Spleißfaktor vorhanden sein, der aufgrund der Überexpression des atSRp30-Gens austitriert wird. Ein solcher Faktor würde für das zehnte Intron spezifisch sein müssen, da alle anderen Introns in atSRp30 ordentlich gespleißt werden. Zweitens können mRNA3 und mRNAl größtenteils in verschiedenen Zellen über zelltypenspezifisches alternatives Spleißen synthetisiert werden. Da der in den Überexpressions- versuchen verwendete konstitutive 35S-CaMV-Promotor in den meisten Geweben aktiv ist, kann die große Menge mRNA3 eine unpassende Expression in Zelltypen widerspiegeln, in denen ein für die richtige Prozessierung des zehnten Introns erforderlicher Faktor fehlt. Um diese Frage zu klären, werden Experimente notwendig sein, die darauf abzielen, jene Zellen festzustellen, in denen das alternative Spleißereignis stattfindet.
Die Tatsache, dass das Verhältnis von mRNA3 zu mRNAl bei allen Transformanten, die GatSRp30 (Fig. 6A) überexprimieren, konstant ist, stimmt mit einem möglichen selbstregulierenden Mechanismus überein, der atSRp30 involviert. Überproduziertes atSRp30-Pro- tein kann das alternative Spleißereignis stimulieren und so seine eigene Expression nach unten regulieren, was, wie gezeigt worden ist, bei mehreren tierischen Spleißfaktoren der Fall ist, wie Sxl (Bell et al . 1991), tra (Mattox und Baker 1991) und SWAP (Zachar et al . 1987) von Drosophila sowie SRp20 (Jumaa and Nielsen 1997) von der Maus. In Übereinstimmung mit diesem Modell konnten wir kein Proteinprodukt von mRNA3 (atSRp30s) finden. Wir erhielten Beweise für einen Einfluss von atSRp30 auf das alternative Spleißen von Transkripten vom endogenen Gen in Pflanzen, die die atSRp30 cDNA (Fig. 6B, Spuren 5 bis 9) überexprimieren, was zu einer bevorzugten Verwendung einer alternativen 5 ' - Spleißstelle führte. Die Überexpression von atSRp30 könnte eine unterschiedliche Auswirkung auf die große Menge exogener pre- mRNA haben, die in Zellen vorhanden ist, wo dieses Protein normalerweise nicht exprimiert wird, was zu einer bevorzugten Verwendung einer alternativen 3' -Spleiß stelle führt (Fig. 6A, B, Spuren 1 bis 4) . Leider kann diese Hypothese nicht in vitro überprüft werden, da keine pflanzlichen Spleißextrakte verfügbar sind. Zukünftige Experimente sollten sich damit beschäftigen, ob atSRp30 tatsächlich seine eigene Produktion selbst regulieren kann.
Überexpression von atSRp30 beeinflusst die Auswahl der Spleißstelle bei mehren pflanzlichen pre-mRNAs und führt zu Veränderungen in der Pflanzenentwicklung
Zahlreiche Versuche in vitro und in vivo haben gezeigt, dass menschliches SF2/ASF in die Auswahl von 5 ' -Spleißstellen involviert ist, indem es kooperativ an diese Stelle (Zuo und Manley 1994) und an Ul snRNP (Kohtz et al . 1994; Jamison et al . 1995; Zahler und Roth 1995) bindet. Wie andere SR-Proteine beeinflusst SF2/ASF weiters teilweise die Auswahl der Spleißstelle, indem es an Verstärkersequenzen bindet, die in intronischen oder exoni- schen Regionen häufig vorhanden sind. Durch das Binden an diese Elemente aktiviert das Protein das Spleißen durch Rekrutieren des Spleißmechanismus an eine benachbarte Spleißstelle mit Hilfe von Protein-Protein-Wechselwirkungen (Wu und Maniatis 1993; Amrein et al . 1994; Zuo und Manley 1994) . Arabidopsis atSRp30 war aufgrund seiner Ähnlichkeit mit menschlichem SF2/ASF und seinem besonderen Expressionsmuster ein guter Kandidat für einen Spleißmodulator. Die Fähigkeit, atSRp30 in ganzen Pflanzen stabil zu überexprimieren, die gangbar blieb, ermöglichte es uns, zum erst Mal die Auswirkungen erhöhter SR-Proteinwerte auf das alternative Spleißen spezifischer endogener Transkripte festzustellen. Es waren einige, jedoch nicht alle getesteten endogenen Transkripte betroffen. Bei atSRp30 pre-mRNA selbst und tSRp34/SRl pre-mRNA wurden intronische alternative 5 '-Spleißstellen aktiviert, während bei atSRp31 und Ul 70K pre-mRNAs die Verwendung der normalen Spleißstellen allgemein erhöht, jedoch variabel war. Wir haben keine Erklärung für diese Variabilität bei einzelnen Transformanten (siehe Fig. 8) , da die atASp30 Proteinwerte bei mehreren pC30-Transformanten ähnlich waren (Fig. 6C) . Die deutlichste Auswirkung der Überexpression von atSRp30 betraf das Spleißmuster des engen Homologen atSRp34/SRl, bei welchem die bevorzugte Verwendung der alternativen 5 '-Spleißstelle hauptsächlich zu einer mRNA-Rumpf-Isoform, atSRp34s, und zu so gut wie keinem atSRp34/SRl-Protein führte. Obwohl wir bis jetzt keine Informationen über die Aktivität des kleineren atSRp34s haben, weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die normale Expression von atSRp30-Protein in den gleichen Zellen, die atSRp34/SRl transkribieren, für die Synthese von authentischem atSRp34/SRl-Protein wichtig ist. Diese regulatorische Schleife könnte die unterschiedlichen Expressionsmuster beider Faktoren in Wurzelgewebe und jungen Setzlingen erklären. Es muss jedoch noch ermittelt werden, ob es einen reziproken Effekt der Überexpression von atSRp34/SRl auf das alternative Spleißen von atSRp30 pre-mRNA gibt.
Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren, zeigten konstitutiv und ubiquitär interessante Veränderungen in der Morphologie sowie in mehreren Aspekten ihrer Entwicklung. Obwohl einige Details noch genauer untersucht werden müssen, können viele Unterschiede durch Veränderungen in den Phasenübergängen und in der Definition der Schicksale der Zellen erklärt werden. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass atSRp30 die Expression anderer Gene drastisch verändern kann, indem es ihre Spleißmuster beeinflusst. Da das Expressionsmuster von atSRp30 normalerweise sehr gewebespezifisch ist, könnten einige der beobachteten Auswirkungen der Überexpression einfach durch seine Expression in ungeeigneten Geweben verursacht worden sein, wo es die Expression von Genen beeinflusst, die nicht die natürlichen Ziele dieses Spleißfaktors sind. Außerdem kann der beobachtete Rückgang der Expression des Spleißfaktors atSRp34 beim Überexprimieren von atSRp30 seinerseits die Expression anderer Gene beeinflussen, was zu den beobachteten Veränderungen des Phänotyps führt . Die Veränderungen bei der Trichomentwicklung, die zu zusätzlichen Verzweigungen führen können, kann andererseits die Überexpression von atSRp30 in der Stützzelle des Trichoms widerspiegeln, die eine normale Stelle für die Expression von atSRp30 ist. Da her kann es sich bei atSRp30 um eine Determinante der Trichomentwicklung handeln. Es bleibt ein kritisches Ziel, die natürlichen Regulierungsziele von atSRp30 zu finden, um die beobachteten Veränderungen des Phänotyps zu erklären, sowie um unser Verständnis der Entwicklungswege bei Pflanzen zu erweitern.
Zwei SF2/ASF-ähnliche Faktoren bei Arabidopsis
Die Immunblot-Analyse mit mAbl04 wies vorher darauf hin, dass die Komplexität der SR-Proteinfamilie bei Tieren größer ist als bei Pflanzen (Lopato et al. 1996a), da mehrere Proteine mit größerer Molekülmasse in SR-Präparationen von Säugetieren, jedoch nicht von Pflanzen, identifiziert worden sind. Die Existenz von zwei SF2/ASF-ähnlichen Faktoren in Arabidopsis kann das Fehlen von Orthologen anderer Mitglieder der SR-Proteinfamilie kompensieren. Die ähnliche Genstruktur von atSRp30 und atSRp34/SRl ist ein Hinweis für ein früheres Genverdoppelungsereignis. Es ist interessant, dass das vorletzte lange Intron in beiden Genen erhalten ist und in die alternativen Spleißereignisse involviert ist. Aus der Northern Blot-Analyse von RNAs verschiedener Pflanzenorgane ist zu schließen, dass das Verhältnis der verschiedenen SR-Protein-mRNAs ziemlich variabel ist und möglicherweise in der Häufigkeit der resultierenden Proteine widergespiegelt wird. Bei beiden Genen führt das alternative Spleißereignis zu vorhergesagten Proteinen mit einer RS-Rumpf-Region und einigen neuen, zusätzlichen Carboxy-terminalen Aminosäuren. Während ein kürzeres Protein von atSRp34/SRl bei atSRp30 überexprimierenden Pflanzen deutlich erkennbar war, beobachteten wir bei diesen Pflanzen nie atSRp30s, obwohl die entsprechende alternativ gespleißte mRNA in großer Menge vorhanden ist . Die Expression von atSRp30s cDNA in Escherichia coli ergab stabiles Protein (Daten nicht angegeben) . Daher wird entweder mRNA3 nicht effizient übersetzt, oder sie wird über einen vorzeitigen, von einem Non- sense-Kodon mediierten Abbauweg abgebaut, oder atSRp30s wird bevorzugt von einem der pflanzlichen Proteinabbausysteme erkannt .
Eine Vergleichsanalyse von atSRp30 mit allen bekannten pflanzlichen und tierischen SR-Proteinen ergab, dass es ein Paralog von atSRp34/SRl ist und dass beide Arabidopsis-Proteine dem menschlichen SF2/ASF am nächsten sind. Der größte strukturelle Unterschied besteht darin, dass atSRp30 keine G-reiche Region zwischen den beiden RRMs hat, was die Flexibilität und möglicherweise die Spezifität der RNA-bindenden Region beeinflussen kann. Die Annahme, dass die beiden Proteine unterschiedliche Aktivität haben könnten, wird von der Beobachtung erhärtet, dass ihre Expressionsmuster in vielen Fällen ziemlich verschieden sind, wie in Fig. 5 dargestellt ist. Im Allgemeinen ist die Expression von atSRp30 mehr auf spezialisierte Zelltypen und Gewebe beschränkt, wie Trichome, Keimblätter oder laterale Wurzelanlagen, was darauf hinweist, dass dieses Protein bei der Initiierung der Organbildung eine besondere Rolle spielt, während atSRp34/SRl in Meristemgewebe stärker exprimiert wird. Weiters weisen unsere immunologischen und Sequenzdaten darauf hin, dass atSRp34/SRl hSF2/ASF ähnlicher ist als atSRp30. In ihrer Gesamtheit weisen diese Daten darauf hin, dass atSRp34/SRl ein allgemeinerer Spleißfaktor ist, ähnlich wie hSF2/ASF, während atSRp30 speziellere Funktionen haben könnte und möglicherweise als ein regulierender Spleißfaktor fungiert, der das alternative Spleißen und die Genexpression in spezifischen Zelltypen moduliert. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Protein mit einer Spleißfaktoraktivität in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass es
die Aminosäuresequenz des Proteins gemäß Fig. 1 A des
Anhanges aufweist oder die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 4, 7 bis 19, 45 bis 52,
111 bis 116 und 149 bis 153 des Proteins gemäß Fig.l A des
Anhanges aufweist und mehr als 85 % Ähnlichkeit mit diesem
Protein aufweist oder mehr als 60 % Ähnlichkeit mit den Spleißproteinen atSRp34/SRl und SF2/ASF gemäß Fig.2 des Anhanges aufweist, wobei die G-reiche Sequenz, die den Aminosäuren 85 bis 113 des atSRp34/SRI-Proteins entspricht, durch eine S-reiche
Sequenz ersetzt ist, oder das dem in Fig. 1 A des Anhanges entsprechnende Protein aus einer anderen Pflanze als Arabidopsis thaliana entspricht oder davon abgeleitet ist.
2. Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 4, 7 bis 19, 22 bis 72, 74 bis 85, 96 bis 141, 149 bis 153, 156 bis 172, wobei Aminosäure 168 variabel, jedoch nicht D oder N ist, des Proteins gemäß Fig.l A des Anhanges aufweist.
3. Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz enthält, die zumindest 90 % Identität mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 85 und 96 bis 222 des Proteins gemäß Fig.l A des Anhanges aufweist.
4. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz enthält, die zumindest 95 %, insbesondere zumindest 98 %, Identität mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 85 und 96 bis 222 des Proteins gemäß Fig.l A des Anhanges aufweist .
5. Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 1 A des Anhanges umfasst oder eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert oder eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die unter stringenten Bedingungen an das Nukleinsäuremolekül gemäß Fig .1 A des Anhanges bindet und für ein in Pflanzen aktives Spleißprotein kodiert oder dazu komplementär ist .
6. Biologisch funktioneller Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5 umfasst.
7. System, umfassend eine Nukleinsäure, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert, und eine Nukleinsäure, die für das atSRp34/SRl-Protein aus Arabidopsis thaliana oder für das dem in Fig. 1 A des Anhanges entsprechnende Protein aus einer anderen Pflanze als Arabidopsis thaliana oder für ein von diesen Proteinen abgeleiteten Proteinen
kodiert, wobei mindestens eine der Nukleinsäuren unter Kontrolle eines nicht natürlicherweise mit diesen Nukleinsäuren verbundenen Promotors steht .
8. System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass beide Nukleinsäuren von Promotoren kontrolliert werden, die nicht natürlicherweise mit diesen Nukleinsäuren verbunden sind.
9. System nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der Promotoren, unter deren Kontrolle die Nukleinsäuren stehen, ein induzierbarer Promotor ist.
10. System nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert, unter Kontrolle eines Promotors steht, der eine Überexpression dieses Proteins bewirkt.
11. System nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert, unter Kontrolle eines Promotors steht, der unter definierten Bedingungen die Expression dieses Proteins unterbindet und unter definierten anderen Bedingungen die Expression dieses Proteins ermöglicht .
12. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 exprimiert .
13. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5 oder einen Vektor nach Anspruch 6 umfasst .
14. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein System nach einem der Ansprüche 7 bis 11 umfasst .
15. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, einer Nukleinsäure nach Anspruch 5, eines Vektors nach Anspruch 6 oder eines Systems nach einem der Ansprüche 7 bis 11 zur Veränderung der Spleißeigenschaften einer Pflanzenzelle oder einer Pflanze.
16. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, einer Nukleinsäure nach Anspruch 5, eines Vektors nach Anspruch 6 oder eines Systems nach einem der Ansprüche 7 bis 11 zur Veränderung des Entwicklungsverhaltens einer Pflanze.
17. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, einer Nukleinsäure nach Anspruch 5, eines Vektors nach Anspruch 6 oder eines Systems nach einem der Ansprüche 7 bis 11 zur Verzögerung des Blütenansatzes von Pflanzen.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Verzögerung des Blütenansatzes gegenüber dem Wildtyp zumindest 15 %, vorzugsweise zumindest 25 % ausmacht.
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