WO2000058443A1 - Procede de separation selective de cellules sanguines au moyen de lectine - Google Patents

Procede de separation selective de cellules sanguines au moyen de lectine Download PDF

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Hirofumi Yura
Yoshio Saito
Michihiro Kitagawa
Daisuke Wakamatsu
Akira Ihara
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    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4724—Lectins

Definitions

  • the present invention relates to a method for the selective separation of blood cells using lectins.
  • the present invention relates to a method for separating blood cells using a lectin, and more particularly, to a method for separating a target blood cell from a sample containing randomly both mature cells and immature cells contained in peripheral blood, bone marrow fluid, umbilical cord blood, etc. And a method for selective separation and recovery through Background of the Invention
  • stem cells Since blood cells have a long life and are consumed according to various physiological requirements, they need to be appropriately replenished by differentiation from stem cells. However, in patients with acute myeloid leukemia and the like, abnormalities occur in differentiated functional blood cells themselves and stem cell differentiation, making it difficult to replenish functional red blood cells, white blood cells, platelets, and the like. As a treatment for such hematologic diseases, hematopoietic stem cell transplantation can normalize the differentiation and regeneration of hematopoietic cells without the side effects of chemotherapy. However, despite this great advantage, harvesting stem cells is difficult because most of them are distributed in the bone marrow. Placental blood and umbilical cord blood contain a relatively large number of stem cells and can be collected in a minimally invasive manner, but are limited to childbirth. In blood, the stem cells present there are further reduced, making it less practical.
  • stem cells will contribute to the development of stem cell banking in which stem cells can be stimulated and proliferated with cytodynamics or stored for subsequent use.
  • Fetal nucleated cell collection methods that have begun to be used in prenatal genetic diagnosis and are currently being applied clinically are invasive methods such as amniocentesis, villus collection, and fetal blood collection, and are associated with the risk of rupture and infection. Is accompanied.
  • the noninvasive collection method for mothers and infants is to use maternal peripheral blood, and it has long been known that fetal cells may be mixed into maternal blood.
  • nucleated cells der Ru erythroblasts (NRBC), for example only very small quantities Umate that one in 1 0 5-1 0 7 nucleated cells before peripheral blood does not exist, how concentrated the cells Whether it is isolated, identified, is the key to a successful genetic diagnosis of fetal cells.
  • NRBC Ru erythroblasts
  • leukemia can range from hematopoietic cells themselves, which are pathological to myeloid ones, and peripheral lymphocytes and monocytes that become cancerous. It is essential to determine Furthermore, if the level of cancer cell development can be known, it will not only treat leukemia but also contribute to clinically important issues such as prevention and recurrence. It is required to perform a genetic test to determine whether the disease is induced. In such leukemia tests as well, it is necessary to separate and purify immature hematopoietic blood cells, proliferate and differentiate them with cytokines, and to make genetic diagnosis at each differentiation level simple and efficient. Come.
  • the inventors of the present invention have focused on the specific interaction of sugar chains and have been conducting research on them.Coating a sugar chain polymer having various sugar chains in a side chain on a substrate surface such as a petri dish has been conventionally performed. Has filed a patent application for a method for selectively immobilizing lectins having affinity for the sugar chain (Japanese Patent Application No. 8-59695).
  • hematopoietic stem cells express various sugar chains on the cell surface as they mature.
  • the symbol “Gal” shown in FIG. 1 is galactose, and “Gu” Represents glucose, and “Lac” represents lactose (Glu-Gal).
  • the specification of the patent application describes that human mature erythrocytes expressing galactose selectively adhere to the surface of a substrate on which galactose-recognizing lectin (Allo-A) is immobilized.
  • the object is to provide a method for selectively separating and recovering hematopoietic cells and / or erythroblasts from a blood sample containing differentiated mature cells and immature hematopoietic cells and erythroblasts.
  • the present invention also provides a separation device used in the selective separation method.
  • the separation method and separation device of the present invention are based on the interaction between cells and lectins and sugar chains and lectins, and selectively separate and collect cells, particularly cells such as hematopoietic stem cells and NRBC, which have great clinical significance. To make things possible. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a systematic diagram showing the state of differentiation of hematopoietic stem cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of selective enrichment of erythroblasts according to the change in lectin concentration in Example 6. Detailed Description of the Preferred Embodiment
  • a sample containing a cell to be immobilized on a solid phase is allowed to act on a lectin that recognizes a sugar chain represented by the cell, and the cell-lectin complex / non- Form a complex.
  • the cell-lectin complex / non-complex means a state in which both a cell-lectin-bound complex and unbound free cells and lectin (non-complex) coexist. I do.
  • This step is performed under conditions that inactivate the cells.
  • the condition for inactivating the cells means a condition for reducing the fluidity and spontaneous adhesion of the cell membrane, and typically, the temperature is 0 ° C. or higher to less than 37 ° C., preferably It is achieved by adjusting the temperature to 0 to 36 ° C, more preferably 4 to 30 ° C, and still more preferably 4 to 22 ° C.
  • this condition is not limited to the above-mentioned low-temperature adjustment, but can also be achieved, for example, by adding a reagent for stopping cell respiration such as sodium azide at 37 ° C.
  • Lectins that recognize sugar chains expressed by cells to be immobilized are used. For example, as shown in Figure 1, when immobilizing peripheral mature white blood cells, platelets, and red blood cells expressing galactose / glucose, galactose such as SBA, PNA, ECU Alio A, VAA, etc. When immobilizing lectins that recognize glucose, glucose-recognizing lectins such as Con A, LcH, and PSA, and cells that express mannose, select mannose-recognizing lectins such as LCA and GNAs CPA. .
  • the amount of lectin to be added varies depending on the type of cells to be immobilized and the like. Basically, in the second stage incubation described below, the cells to be immobilized on the surface of the substrate coated with the sugar chain polymer ( Cells that will be bound later will be bound but cells that should not be immobilized (cells that are later recovered from the liquid phase) will not bind to the substrate surface.
  • the amount of lectin to be added it is possible to control the selectivity for the maturity of cells such as leukocytes and the selectivity between cell types such as leukocytes and erythrocytes. Specifically, it is adjusted to a concentration of 20 mg / ml or less for at least one cell. This addition amount also varies depending on the properties of the lectin. For example, when SBA is used as the lectin, 5 mg / m] is sufficient.
  • immobilization of CD34-positive young cells Lectin should be added to a sample containing 2 ⁇ 10 6 cells at a concentration of 0.001 to 0.9 mg / ml, preferably 0. 0.02 to 0.1 mg / ml, more preferably 0.025 to 0.05 mg / ml.
  • the concentration of lectin added to a sample containing 2 ⁇ 10 6 cells should be 0.001 to 0.10. 0.3 mg / rak, preferably 0.002 to 0.05 mg / mk, and more preferably 0.004 to 0.025 mg / ml.
  • the incubation time in the first step is not particularly limited, and it is sufficient that at least the cells and the lectin act before the second step described below to form a cell-lectin complex / non-complex.
  • To 120 minutes preferably 0 to 90 minutes, and more preferably 0 to 60 minutes.
  • “0 minutes” means that the first stage is followed immediately by the second stage.
  • the cell to be immobilized and the lectin form a cell-lectin complex / non-complex.
  • a sample containing the cell-lectin complex / non-complex is specifically recognized by the lectin under the condition of inactivating the cells. Incubate in a substrate whose surface is coated with a sugar chain polymer having a sugar chain.
  • the substrate used here can be selected from substrates conventionally used for cell culture, such as petri dishes, flasks, plates, cuvettes, films, fibers, beads, and separable chamber slides, depending on the application. Substrates of any shape can be used.
  • These substrates are made of inorganic materials such as glass and quartz, organic materials such as polystyrene, polycarbonate, polysulfone, polyurethane, and vinyl copolymers, and composite materials combining these materials. It may be composed of a material having heat resistance and water resistance enough to be sterilizable.
  • synthetic polymer materials are preferred from the viewpoint of cost and moldability, and hydrophobic materials are preferred from the viewpoint of sugar chain polymer adsorption.
  • a sugar chain polymer having polystyrene or a derivative thereof as a main chain it is preferable to use a base material mainly containing polystyrene or a derivative thereof.
  • the surface of the substrate is coated with a sugar chain polymer having a sugar chain specifically recognized by the lectin used in the first step.
  • sugar chain polymer examples include the following.
  • PVLA Poly (N-vinylbenzyl- [0- / 5-D-galactobi] having a galactose terminal obtained by combining monomers synthesized from aminomethylstyrene and lactose alone.
  • Lanosyl- (1 ⁇ 4) -D-gluconamide]) (abbreviated as PVLA);
  • PVMA Poly (N-vinylbenzyl- [0-H-D-glucoviranosyl-(1 ⁇ 4) having glucose terminals and obtained by homopolymerizing a monomer synthesized from //-aminomethylstyrene and maltose. ) -D-Gluconamide]) (abbreviated as PVMA);
  • PVMan Poly (N-vinylpentyl- [0-5-D-mannopyranosyl- (1 ⁇ 4) -D-mannamide) having a mannobiose terminal obtained by homopolymerizing a monomer synthesized from -aminomethylstyrene and mannobiose Do]) (abbreviated as PVMan);
  • sugar chain polymers may be homopolymers as described above, or may be copolymers with other monomers.
  • a copolymer with a monomer having an azide group, which is a photoreactive functional group is preferable because it can be easily covalently bonded to the substrate surface by light irradiation.
  • poly(azidostyrene-co- ⁇ N--vinylbenzyl- [0-5-D-galactobilanosinole- (1 ⁇ 4 ) -D-Gluconamide] ⁇ ) (abbreviated as AZ-PVLA); poly (3-azidostyrene-co- ⁇ N- / vinylbenzyl- [0-hy-D- Glucobilanosyl- (1 ⁇ 4) -D-gluconamide] ⁇ ) (abbreviated as AZ-PVMA).
  • the two-stage incubation when the two-stage incubation is performed in a dish or flask for cell culture under the same conditions as in the first stage, it is typically 10 to 120 minutes, preferably 20 to 9 minutes. It is carried out for 0 minutes, more preferably for 30 to 70 minutes.
  • the cell-lectin complex to be immobilized is immobilized on the substrate via the sugar chain polymer on the surface of the substrate.
  • a solid phase immobilized on the substrate and a liquid phase remaining without being immobilized are separated.
  • the sample containing the cell-lectin complex non-complex obtained in the first step is simply passed through the column, and the liquid phase is converted to the column. It can be separated from the solid phase by collecting it from the spout.
  • the liquid phase remaining unimmobilized in the blood cell collecting step is removed to fix the cells.
  • the immobilized base material is centrifuged to stabilize the immobilization of cells, and a uniform immobilized image of cells can be obtained.
  • the centrifugation time at this time may be within 30 minutes, but is preferably within 10 minutes from the viewpoint of shortening the processing time.
  • the centrifugal force varies depending on the type of cells to be immobilized and the type and concentration of the lectin to be used, but is preferably 30 G or more, more preferably 100 to 400 G, and still more preferably 1.0 G or more. A range up to 00 G is used.
  • the separation method of the present invention is carried out at an amount of lectin that suppresses immobilization of CD34-positive cells
  • the liquid phase mainly contains young CD34-positive cells selectively. From there, CD34-positive cells can be recovered with high purity.
  • the amount of lectin addition is further reduced and the immobilization of leukocytes and CD34-positive cells is suppressed, mature erythrocytes and NRBC are selected as solid phases. Alternatively, they can be left and separated.
  • granulocytes, leukocytes, and the like can be removed from the collected blood sample in advance, and the target cells can be concentrated.
  • general-purpose high-density fluids such as Ficoll Pack, Histopak, Percoll, etc., which are generally set to a specific gravity of about 1.077, can be used, but in the present invention, NRBC is separated from blood samples.
  • a material having a specific gravity of 1.085 to 1.10 can be particularly preferably used.
  • the present inventors have found that when a high-density liquid such as Ficoll Pack, Histopack, or Parkol having a specific gravity of 1.095 is used, the number of NRBC-recovered NRBC cells using the conventional lectin is 1.0. It was confirmed that the density was about 1.5 times or more as compared with the case of using the specific gravity liquid of 77. Although the effects of such pretreatment have been studied by many researchers for many years, they often vary depending on individual differences and the like, and clear conclusions have not been obtained. Conditions other than the above may be appropriately adopted.
  • a negative selection method in which cells other than the target cells are fixed and removed, and a positive selection method in which the target cells are fixed and concentrated are known.
  • the separation method of the present invention can use both negative and positive selection methods by appropriately adjusting the lectin concentration.
  • the above method is repeated several times to further improve the recovery rate of target cells. It can also be done.
  • the blood sample separated and purified by the separation method according to the present invention may be any blood sample including peripheral blood.
  • umbilical cord blood and maternal blood are preferably used.
  • the separation method of the present invention uses immature cells using a physiological phosphate buffer (PBS) containing AZ-PVLA as a sugar chain polymer and 0.1% by weight of serum albumin as a cell suspension.
  • PBS physiological phosphate buffer
  • Example 1 Temperature effect (1)--First step: The residual erythrocytes were lysed with ammonium chloride solution from umbilical cord blood-derived hemocytes collected by the Ficoll method to obtain a leukocyte fraction containing mononuclear cells. In a polypropylene tube, PBS containing various concentrations of SBA (galactose-recognizing lectin) was added to 2 ⁇ 10 6 / ml cord blood-derived mononuclear cell suspension, Incubation was performed at 4 ° C for 30 minutes with shaking every 5 minutes.
  • SBA galactose-recognizing lectin
  • Stage 2 After the above incubation, transfer the suspension to a 35 mm diameter dish coated with AZ-PVLA, rinse the tube with 1 ml of lectin-free PBS, and add the rinse solution to the same dish. Incubation was performed at a plurality of temperatures of 4 to 37 ° C. for 60 minutes.
  • the dishes and the cells were simultaneously centrifuged at 90 G for a predetermined time.
  • the above 60 minute incubation was changed to 15 minutes, and after the incubation, the substrate and cells were simultaneously centrifuged at 90 G for a predetermined time. In addition, both centrifugations were performed simultaneously.
  • Example 4 Selective affinity based on leukocyte maturity It is known that white blood cells express a surface marker called CD34 on the surface of young cells (CD34 positive) and become CD34 negative when mature. Conventionally, young cells have been selectively immobilized using the CD34 antibody.
  • various types of PVLA incubation temperature of 4 ° C and 37 ° C
  • PVMeA incubation temperature of 4 ° C
  • the selective adhesion was examined by the amount of lectin added, and the results are shown in Table 4. The amount of lectin (SBA) added in the table is based on 2 ⁇ 10 6 cells.
  • the lectin-mediated separation method of the present invention can selectively separate CD34-positive immature cells and CD34-negative mature cells. Moreover, by setting the incubation temperature to a low temperature, the required amount of lectin to be added is reduced to about 1/20. In addition, it was shown that when PVMeA was used as the sugar chain polymer, selective adhesiveness was obtained even when the amount of lectin was further reduced, as compared with the case where PVLA was used.
  • SBA is known to have a stronger affinity for splice-linked galactose.
  • the results of selective adhesion to PVMeA with a galactose-terminated end at lower lectin loadings indicate that the cell separation method is based on the very specific affinity of lectins. Is shown. Furthermore, they also revealed that the low-temperature incubation revealed by the method is an effective method that significantly emphasizes the affinity of lectins.
  • Example 5 Selective affinity between blood cells
  • lectin (SBA) and the added pressure amount is changed with a small amount of less than 5 0 mu beta per 2 X 1 0 6 6 cells were adhered to the dish were PVLA coated The cells were examined. In this case, after the third stage separation of the solid phase and the liquid phase, the dish and adherent cells were simultaneously centrifuged at 450 G.
  • the test is performed by drying the adherent cells on a dish, staining the cells with hematoxylin and erythrocin, and counting the number of positively stained erythroblasts. When counted, the number of erythroblasts contained therein was evaluated. The result is shown in figure 2.
  • PRE is a comparative example in which a large amount (300 ⁇ ig) of lectin was added to adhere almost all cells.
  • Example 6 the Fuikoru isolated cell fractions from maternal blood was collected and added lectin (SBA) of 1 0 mu [delta] with respect to 2 X 1 0 6 6 cells, cell para was PVMeA coated Incubation was performed at 18 ° C for 30 minutes in a blue chamber slide. For comparison, the case where the lectin addition amount was set to 300 ⁇ was also examined. Table 6 below shows the results of tests performed on 20 examples. Table 6
  • Table 7 shows the results of the evaluation in 20 cases. At that time, informed The mother who is pregnant with a healthy boy is confirmed by echodiagnosis based on the centrifugation, and erythroblasts isolated from the collected maternal blood are subjected to FISH tests using the AneuVysion Assay Kit. (VYSIS, INC.) According to a standard method. Y-probe detection was performed. Table 7
  • the method of separating nucleated erythroblasts using the lectin is an effective method for non- / minimally invasive detection of fetal cells from maternal blood and examination of fetal chromosomes.
  • the CD34-positive cell fraction concentrated according to Example 4 was collected, and the colony forming ability was compared using a commercially available Atssay kit (MethoCult GF H4434, StemCell Technologies Inc).
  • MethodhoCult GF H4434 StemCell Technologies Inc.
  • those obtained by enriching CD34 intestinal cells by the cell separation method using the lectin obtained a 8.8-fold higher colony formation rate than those obtained without separation.
  • the separation method and the separation device of the present invention are based on the interaction between cells and lectin and sugar chains and lectins. More specifically, the present invention utilizes the fact that, in these interactions, changes in adhesiveness and adhesion selectivity due to cell types occur depending on the active state of the cell, ie, the amount of lectin added.
  • cells particularly cells such as hematopoietic stem cells and NRBC, which have great clinical significance, can be selectively separated and collected.

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Description

レクチンを用いた血液細胞の選択的分離方法 発明の分野
本発明は、 レクチンを用いた血液細胞の分離方法、 特に、 末梢血、 骨髄液、 臍帯 血などに含まれる成熟細胞や未成熟細胞の両方をランダムに含有する試料から目的 とする血液細胞をレクチンを介して選択的に分離回収する方法に関する。 発明の背景
造血幹細胞は多分化能と自己複製能とを併せ持つた細胞である。 一生に渡り枯渴 することなく血球が生産されるためには、 造血幹細胞が持つ自己複製能は最も重要 な性質と考えられる。 造血幹細胞の多分化能に関しては、 例えば、 図 1に示すよう に、 幹細胞は、 骨髄性幹細胞とリンパ性幹細胞とに分化し、 それらはさらに分化し て、 骨髄性幹細胞からは血小板、 （成熟） 赤血球、 顆粒球及び単球など、 リンパ性幹 細胞からは T細胞や B細胞などの血液細胞が生成される。
血液細胞には寿命があり種々の生理的要求に従って消費されるので、 幹細胞から の分化によって適宜補充される必要がある。 ところが、 急性骨髄性白血病患者など では、 分化した機能的な血液細胞そのものや幹細胞分化に異常が生じ、 機能的な赤 血球、 白血球、 血小板などの補充が困難になっている。 このような血液性疾患の治 療法として、 造血幹細胞の移植は、 化学療法のような副作用が無く、 造血細胞の分 化及び再生を正常化することが可能となる。 しかし、 この大きな利点にも関わらず、 幹細胞はほとんどが骨髄に分布しているため、 その採取には困難が伴う。 胎盤血及 び臍帯血には比較的多くの幹細胞が含まれいて低侵襲的採取が可能であるが出産時 に限られたものであり、 また、 提供者の侵襲性など採取制限が最も少ない末梢血で は、 そこに存在する幹細胞はさらに減少し実用性が乏しくなる。
さらに、 提供者との H L A型が患者と一致していない幹細胞移植の場合、 対宿主 性移植片病（G V H D )と呼ばれる免疫拒絶反応を誘発することがある。 従って、 有 効で安全な幹細胞移植をするためには、 血液試料を選択的に分離精製し、 G V H D の原^となる提供者のリンパ球成分を除去した幹細胞試料を得ることが重要となつ てくる。
また、 このような幹細胞の分離精製は、 幹細胞をサイ ト力イン類で刺激して増殖 させたり、 次なる使用のために保存しておく幹細胞バンキングの発展にも寄与する こととなる。
一方、 近年の遺伝子操作技術の発展に伴い.、 有核胎児細胞を対象に出生前遺伝子 診断の試みが行われている。 この出生前遺伝子診断に用いられ始めている胎児有核 細胞の採取方法で、 現在、 臨床応用されているものは、 羊水穿刺、 絨毛採取、 胎児 採血といった侵襲的な手法であり、 破水と感染のリスクが伴う。 母児にとって非侵 襲的な採取方法としては、 母体末梢血を用いることであり、 胎児細胞が母体血に混 入することも従来から知られてはいたが、 母体末梢血に含まれる胎児有核細胞であ る赤芽球（NRBC)は、 例えば末梢血中の前有核細胞の 1 0 5〜1 0 7個に 1個という極 めて少量しか存在しないため、 その細胞を如何に濃縮、 分離、 同定するかが胎児細 胞の遺伝子診断の正否を握つている。
加えて、 遺伝子診断は白血病の治療にも有効であることが知られている。 例えば、 白血病には造血細胞そのものが病的である骨髄性のものや末梢のリンパ球や単球が 癌化するものまで様々であるが、 適切な投薬や治療法を決定するのに白血病のタイ プを決定することが不可欠である。 さらに、 ガン細胞の発生レベルを知ることがで きれば、 白血病の治療のみならず予防や再発という臨床的に極めて重要な問題に寄 与するため、 血液細胞の分化過程のどのレベルで発ガン因子が誘導されるかを遺伝 子検査することが求められている。 このような白血病に関する検査においても、 未 熟な造血性の血液細胞を分離精製し、 サイ トカイン類で増殖 ·分化させ各分化レべ ルでの遺伝子診断を簡便 ·効率化することが必要となってくる。
本発明者らは、 従来から糖鎖が有する特異的相互作用に着目し研究を行ってきて おり、 種々の糖鎖を側鎖に有する糖鎖高分子をシャーレなどの基材表面に被覆する ことにより、 その糖鎖に親和性を有するレクチンを選択的に固定化する方法につい て特許出願している （特願平 8-59695)。
一方、 図 1に示したように、 造血幹細胞は、 成熟するに従って細胞表面に種々の 糖鎖を発現するようになる。 なお、 図 1 に示す符号 「Gal」 はガラクトース、 「Gu はグルコース、 また、 「Lac」 はラクトース（Glu-Gal )を表す。 前記特許出願の明細書 には、 ガラク トース認識性のレクチン（Allo-A)を固定化した基材表面にガラクトー スを表現するヒト成熟赤血球が選択的に接着することが記載されている。
今回、 発明者らは、 レクチンを介した糖鎖高分子への造血細胞の固定化について さらに詳細に検討し、 インキュベ一ション温度及び用いるレクチンの添加量により、 細胞及び/または糖鎖高分子とレクチンとの間に特有な相関関係が生ずることを見い だし、 本発明をなすに至った。 発明の概要
本発明における課題は、 レクチンを用いて目的とする幼若な細胞や分化した成熟 細胞を選択的かつ高収率で分離、 濃縮及び回収する方法、 並びにその方法を利用し た分離装置を提供することである。
かかる課題は、 分化した成熟細胞及び未熟な造血性細胞並びに赤芽球を含有する 血液試料から造血細胞及び/または赤芽球を選択的に分離回収する方法において、 当 該方法が、
( 1 ) 前記試料を、 細胞を不活性化する条件下においてレクチンと作用させて細胞- レクチン複合体/非複合体を形成する工程、
(2) 前記、 細胞-レクチン複合体/非複合体を含む資料を、 前記条件下で、 前記レク チンに特異的に認識される糖鎖を有する糖鎖含有高分子で表面被覆した基材ととも にィンキュベーシヨンして前記細胞をレクチンを介して前記基材表面に固定化する 工程、 及び
(3) 液相と固相とを分離し、 液相及び/または固相から目的とする血液細胞を回収す る工程、 さらに場合によって、
(4) 前記ィンキュベ一シヨンの前または後に前記基材と細胞を同時に遠心処理し細 胞の固定化を加速、 安定化させる工程、 あるいは前記血液細胞を回収する工程で細 胞が固定化された基材を遠心処理し細胞の固定化を安定化させる工程を含んでなり、 前記レクチンが、 前記固相から回収される細胞とは結合して基材表面に固定化する が、 前記液相から回収される細胞は基材表面に固定化しない量で存在することを特 徴とする血液細胞の選択的分離方法によって解決される。 本発明の選択的分離方法において、 細胞を不活性化する条件は、 0 以上3 7 °C未満の低温条件、 または、 細胞呼吸を停止させる試薬を添加する条件とすること ができる。 さらに、 使用するレクチンの濃度やインキュベーション時間を適宜設定 することにより、 これまでに得られなかった高度な選択的分離が可能となる。
さらに本 ¾明は、 前記選択的分離方法に用いられる分離装置も提供する。
本発明の分離方法及び分離装置は、 細胞—レクチン及び糖鎖ーレクチンの相互作 用に基づくものであり、 細胞、 特に臨床的に大きな意義を持つ造血幹細胞や NRBC といった細胞を選択的に分離回収することを可能とする。 図面の簡単な説明
図 1は、 造血幹細胞の分化の様子を示す系統図である。
図 2は、 実施例 6におけるレクチン濃度変化による赤芽球の選択的濃縮の結果を示 すグラフである。 好ましい実施態様の詳細な説明
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明の分離方法では、 第 1段階として、 固相に固定化すべき細胞を含有する試 料を、 その細胞が表現している糖鎖を認識するレクチンと作用させて細胞-レクチン 複合体/非複合体を形成する。 ここで、 細胞-レクチン複合体/非複合体とは、 細胞 とレクチンとが結合した複合体と、 結合していないフリーな細胞及びレクチン （非 複合体） の両方が共存している状態を意味する。 この過程は、 前記細胞を不活性化 する条件下において行われる。
ここで、 細胞を不活性化する条件とは、 細胞膜の流動性及び自発的粘着力を低下 させる条件を意味し、 典型的には、 温度を 0 °C以上〜 3 7 °C未満、 好ましくは 0〜 3 6 °C、 より好ましくは 4〜3 0 °C、 さらに好ましくは 4〜2 2 °Cに調節すること によって達成される。 しかし、 この条件は、 前記低温調節に限られるものではなく、 例えば、 3 7 °Cにおいてアジ化ナトリウムなどの細胞呼吸を停止させる試薬を添加 させることによつても達成できる。
レクチンは、 固定化されるべき細胞が表現している糖鎖を認識するものを用いる。 例えば、 図 1に示したように、 ガラクトースゃグルコースを表現している末梢の成 熟した白血球、 血小板や赤血球などを固定化する場合には、 SBA、 PNA、 ECU Alio A、 VAAなどのガラクト一ス認識性のレクチンや、 Con A、 LcH、 PSAなどのグルコ ース認識性レクチン、マンノースを表現する細胞を固定化する場合には、 LCA、 GNAs CPAなどのマンノ一ス認識性レクチンを選択する。
レクチンの添加量は固定化すべき細胞の種類等によって変化し、 基本的には、 後 述する第 2段階のィンキュベ一シヨンにおいて、 糖鎖高分子を被覆した基材表面に、 固定化すべき細胞 （後に固相から回収される細胞） は結合するが、 固定化すべきで ない細胞 （後に液相から回収される細胞） は前記基材表面に結合しない量とする。 このレクチン添加量を特定することにより、 例えば白血球などの細胞の成熟性に対 する選択性や、 白血球、 赤血球などの細胞型間の選択制を制御することが可能にな る。 具体的には、 少なくとも細胞 1個以上に対して 2 0 mg/ml以下の濃度で調節す る。 この添加量はレクチンの性質によっても変化し、 例えば、 レクチンとして SBA を用いたときは、 5 mg/m】で十分である。
特に、 糖鎖高分子として/?結合ガラク ト一ス末端を有するラク ト一スまたはひ結 合ガラク トース末端を有するメ リビオースを組み込んだポリマーを用いた場合、 CD34陽性の幼若な細胞の固定化を抑制し CD34陰性の成熟細胞を優先的に固定化す べきときには、 細胞 2 X 1 0 6個を含む試料に対するレクチンの添加濃度を 0 . 0 0 1〜0 . 9 mg/ml、 好ましくは 0 . 0 0 2〜0 . 1 mg/ml、 さらに好ましくは 0 . 0 2 5〜0 . 0 5 mg/mlとする。 また、 赤血球 (NRBC)を選択的に固定化し、 白血球な どの他の細胞を固定化しない場合には、 細胞 2 X 1 0 6個を含む試料に対するレクチ ンの添加濃度を 0 . 0 0 1〜 0 . 3 mg/rak 好ましくは 0 . 0 0 2〜0 . 0 5 mg/mk さらに好ましくは 0 . 0 0 4〜0 . 0 2 5 mg/mlとする。
この第 1段階におけるインキュベーション時間は特に限定されず、 少なくとも細 胞とレクチンが後述の第 2段階の前に作用され、 細胞-レクチン複合体/非複合体を 形成すれば良く、 典型的には 0〜 1 2 0分間、 好ましくは 0〜 9 0分、 さらに好ま しくは 0〜6 0分とする。 ただし、 「0分」 とは、 第 1段階を行った直後に第 2段階 に移行することを意味する。 その結果、 固定化されるべき細胞とレクチンとが、 細 胞-レクチン複合体/非複合体を形成する。 次に、 本発明の分離法の第 2段階として、 前記細胞-レクチン複合体/非複合体を含 む試料を、 前記細胞を不活性化する条件下で、 前記レクチンに特異的に認識される 糖鎖を有する糖鎖高分子で表面を被覆した基材内でィンキュベ一トする。
ここで用いる基材は、 シャーレ、 フラスコ、 プレート、 キュベット、 フィルム、 ファイバ一、 ビーズ、 及びセパラブルチャンバースライ ドなどの従来から細胞培養 に用いられている基材から選択でき、 用途に.応じていかなる形状の基材も使用でき る。
これらの基材は、 ガラス、 石英などの無機材料、 ポリスチレン、 ポリカーボネー ト、 ポリスルホン、 ポリウレ夕ン、 ビニル系共重合体などの有機材料、 さらには、 これらが組み合わされた複合的素材などのいずれからなってもよいが、 滅菌可能な 程度の耐熱性及び耐水性を有している材料からなるのが好ましい。 特に合成高分子 材料は、 価格や成型性の点から好ましく、 糖鎖高分子の吸着性から疎水性のものが 好ましい。 例えば、 ポリスチレンやその誘導体を主鎖とする糖鎖高分子を用いる場 合には、 ポリスチレンやその誘導体を主原料とする基材を使用するのが好ましい。 前記の基材表面には、 第 1段階で用いたレクチンに特異的に認識される糖鎖を有 する糖鎖高分子を被覆する。
糖鎖高分子の例として、 以下のものを挙げることができる。
-；?-アミノメチルスチレンとラク ト一スとから合成されたモノマーを単独 31合して 得られガラクト一ス末端を有する、 ポリ （N- -ビニルベンジル- [0-/5-D-ガラクトビ ラノシル -( 1→4)-D-グルコンアミ ド]) (PVLAと略記する）；
• / -アミノメチルスチレンとマルト一スとから合成されたモノマ一を単独重合して 得られグルコース末端を有する、 ポリ （N -ビニルベンジル- [0-ひ- D-グルコビラノ シル -( 1→4)-D-グルコンアミ ド]) (PVMAと略記する）；
• -ァミノメチルスチレンとマンノビオースとから合成されたモノマーを単独重合 して得られマンノビオース末端を有する、 ポリ （N ビニルペンジル- [0- 5-D-マン ノピラノシル -( 1→4)-D-マンナミ ド]) (PVManと略記する）；
.尸-ァミノメチルスチレンとメリビオースとから合成されたモノマーを単独重合し て得られガラクトース末端を有する、 ポリ （N-P-ビニルベンジル- [0-ひ- D-ガラクト ビラノシル -( 1→6)-D-グルコンアミ ド]) (PVMeAと略記する）； •p-アミノメチルスチレンとラク トースとから合成されたモノマーを単独重合して 得られる PVLA をカルボキシメチル化して得られるカルボキシメチル化ガラクトー ス末端を有する、 ポリ ビニルベンジル- [0-6-カルボキシメチル - ? -D-ガラク トビラノシル -( l→4 )-0-D-6-カルボキシメチノレ-グルコンアミ ド]) (PVLACOOH と略 記する）；
• P-クロロメチルスチレンとグルコースとかち合成されたモノマ一を単独重合して 得られグルコース末端を有する、 ポリ （3-0-4， -ビニルベンジル -D-グルコース）（PVG と略記する）；
• ; アミノメチルスチレンとキトビオースとから合成されたモノマ一を単独重合し て得られ N-ァセチルグルコサミン末端を有する、ポリ （N-P-ビニルベンジル - [0-D-2- ァセトアミ ド -2-デォキシ - 5 -D-グルコビラノシル -( l→4)-0-D-2- ァセトアミ ド -2-デ ォキシ - ? -D-グルコンアミ ド]) (PVGIcNAcと略記する）；
• アミノメチルスチレンとラミナリビオースとから合成されたモノマ一を単独重 合して得られグルコース末端を有する、 ポリ （N- ビニルベンジル- [0- ?-D-グルコ ビラノシル -( 1→4)-D-グルコンアミ ド]) (PVLamと略記する）；
これらの糖鎖高分子は、 上記のようなホモポリマ一でもよく、 他のモノマーとの コポリマーでもよい。 例えば、' 光反応性官能基であるアジド基を有するモノマーと のコポリマ一は、 光照射によって容易に基材表面と共有結合できるので好ましい。 アジド基を導入した糖鎖高分子として、 前記 PVLA とのコポリマーであるポリ （3- アジドスチレン- co-{N- -ビニルベンジル- [0- 5-D-ガラクトビラノシノレ- ( 1→4)-D-グ ルコンアミ ド] }) (AZ-PVLA と略記する）；前記 PVMA とのコポリマ一であるポリ (3-アジドスチレン- co-{N-/ ビニルベンジル- [0-ひ- D-グルコビラノシル -( 1→4)-D- グルコンアミ ド] }) (AZ-PVMAと略記する） などを挙げることができる。
この 2段階のインキュベーションは、 例えば、 第 1段階と同じ条件下で細胞培 養用のディッシュやフラスコなどで実施された場合、 典型的には 1 0〜1 2 0分、 好ましくは 2 0〜9 0分、 さらに好ましくは 3 0〜7 0分間行われる。 その結果、 固定化すべき細胞-レクチン複合体が基材表面の糖鎖高分子を介して基材に固定化さ れる。
また、 ビーズゃ不織布を充填したカラムで細胞の沈降時間を無視できる条件では、 さらに時間を短縮することができる。 このような処理時間の短縮は、 第 2段階のィ ンキュベ—シヨンの前または後に基材と細胞を同時に遠心処理し細胞の沈降 ·固定 化を加速 ·安定化させることによって達成できる。 このときの遠心時間は 3 0分以 内であればよいが、 処理時間の短縮という観点から 1 0分以内であることが望まし い。 遠心力は、 固定化すべき細胞の種類、 及び使用するレクチンの種類や濃度によ つて変化するが、 一般に 3 0〜4 5 0 0·の範 Hが好適に用いられる。
次いで、 本発明の分離方法の第 3段階として、 基材に固定化された固相と、 固定 化されずに残った液相とを分離する。 例えば、 糖鎖を被覆したビーズやプレートを 充填したカラムを用いた場合には、 第 1段階で得られた細胞—レクチン複合体 非 複合体を含む試料をカラムに通すだけで、 液相をカラムの注出口から回収すること によって固相と分離できる。
また、 チャンバースライ ドゃシャーレなどの基材に固定化された細胞の染色体を 検査する場合には、 前記血液細胞を回収する工程で固定化されずに残った液相を除 き、 細胞が固定化された基材を遠心処理し細胞の固定化を安定化させ均一な細胞の 固定化像を得ることができる。 このときの遠心時間は 3 0分以内であればよいが、 処理時間の短縮という観点から 1 0分以内であることが望ましい。 遠心力は、 固定 化すべき細胞の種類、 及び使用するレクチンの種類や濃度によって変化するが、 好 ましくは 3 0 G以上、 より好ましくは 1 0 0〜4 0 0 G、 さらに好ましくは 1， 0 0 0 Gまでの範囲が用いられる。
さらに具体的にいうと、 例えば、 糖鎖高分子として PVLA を用いガラクトース特 異的レクチンとして SBA等を用い液相及び/または固相から目的とする造血細胞を 回収する場合、 血液細胞の固定化され易さは、 成熟赤血球、 NRBC >白血球〉幼若 な CD34 陽性細胞という順序になる。 従って、 レクチンの量を低下させると、 まず CD34陽性細胞が固定化されなくなり、 次いで白血球が固定化されなくなり、 最終的 には成熟赤血球、 NRBCが選択的に固定化されることになる。 逆に言えば、 CD34陽 性細胞の固定化が抑制されるレクチン添加量で本発明の分離方法を実施すれば、 液 相には主として幼若な CD34陽性細胞が選択的に含まれており、 そこから CD34陽性 細胞を高純度で回収することができる。 また、 レクチン添加量をさらに低下させ、 白血球や CD34陽性細胞の固定化を抑制すれば、 固相には成熟赤血球や NRBCを選 択的に残留させ分離することができる。
本発明の分離方法にあっては、 前記第 1段階に先立って、 採取した血液試料か ら、 顆粒球及び白血球等を予め除去し、 目的とする細胞を濃縮しておくこともで きる。 この場合、 一般的に比重 1 . 0 7 7程度に設定された汎用のフイコールパ ック、 ヒストパック、 パーコールなどの高比重液を用いることができるが、 本発 明において NRBC を血液資料から分 |Ι ··濃縮する場合の前処理としては、 比重 1 . 0 8 5〜 1 . 1 0のものが特に好適に用いられ得る。 例えば本発明者らは、 比重 1 . 0 9 5のフイコールパック、 ヒス トパック、 パ一コールなどの高比重液 を用いた場合、 結果としてレクチンによる NRBCの回収細胞数が従来の比重 1 . 0 7 7の比重液を用いたときと比較して約 1 . 5倍以上どなることを確認した。 このような前処理の効果は、 長年多くの研究者によって検討されているが、 個体 差などによって変化することが多く明確な結論が得られておらず、 本発明の分離 法においても場合によって上記以外の条件を適宜に採用し得る。
また、 図 1に示されるように、 グルコース系の糖鎖高分子とレクチンとの組み合 わせも同様に実施できることは言うまでもない。
一般に、 細胞を分離する方法として、 目的とする細胞以外の細胞を固定化して除 去するネガティブ ·セレクションと、 目的とする細胞を固定化して濃縮するポジテ イブ ·セレクションとが知られているが、 本発明の分離方法は、 レクチンの濃度を 適宜調整することによって、 ネガティブ及びポジティブ ·セレクションの両方の手 法を利用することができる。
なお、 造血幹細胞といった微量に含まれる細胞を、 廃棄される細胞数を極力少な くしながら選択的に分離するには、 上記の方法を複数回繰り返して、 目的とする細 胞の回収率をさらに向上させることもできる。
本願発明に係る分離方法によって分離精製される血液試料は、 末梢血を含む如何 なるものであってもよいが、 幹細胞を選択的に回収するには、 骨髄液、 抹消血、 臍 帯血または胎盤血とするのが好ましい。 また、 NRBC を選択的に回収するには、 臍 ' 血、 母体血とするのが好ましい。 実施例 以下に、本発明の分離方法ついて、糖鎖高分子として AZ-PVLA、細胞浮遊液として 0.1 重量％ゥシ血清アルブミンを添加した生理的リン酸緩衝液（PBS)を用い、 未成熟細胞 である造血幹細胞を選択的に分離回収する場合例として具体的に説明する。
1 ：インキュベーション条件
実施例 1 ：温度効果 （ 1 ) - - 第 1段階： フイコール法で回収された臍帯血由来の血球から塩化アンモニゥム溶液 で残存赤血球を溶血し、 単核球を含む白血球分画を得た。 ポリプロピレン製チュー ブ中で、 2 X 1 0 6個/ mlの臍帯血由来の単核球懸濁液に対し、 種々の濃度の SBA (ガラクト一ス認識性のレクチン） を含む PBS を添加し、 4 °Cで 3 0分間、 5分毎 に攪拌しながらインキュベーションした。
第 2段階：上記インキュベーション終了後、 懸濁液を AZ-PVLA被覆した直径 3 5 mmディッシュに移し、さらにレクチンを含まない PBS 1 mlでチューブをリンスし、 そのリンス液も同じディヅシュに加えて、 4 から 3 7 °Cの複数の温度で 6 0分間 ィンキュベ一シヨンした。
また、 上記 6 0分のインキュベーションのかわりにディッシュと細胞を同時に 9 0 G で所定時 fa遠心した。 または、 - 上記 6 0分のインキュベーションを 1 5分に変え、 インキュベーションの後で基材と細胞を同時に 9 0 Gで所定時間遠心した。加えて、 双方の遠心処理を同時に行った。
第 3段階：揺動後、 懸濁液を回収し、 上記 PBS 1 mlで洗浄して、 固相 （シャーレ） と液相 （懸濁液） とを分離した。
得られた細胞懸濁液中の回収細胞数を自動血球計数器で測定し、 仕込み細 J3S数に 対する接着細胞数の割合 （接着率） を計算した。 その結果、 いずれの温度において もレクチン添加量を増加させるにつれて接着率が増大する傾向が見られた。 そこで、 単核球 8 0 %接着させるために最低限必要なレクチン (SBA)の添加量を各温度につい て以下の表 1にまとめた。 表 1
Figure imgf000013_0001
これらの結果から、 単核球を 8 0 %接着させるために必要なレクチン (SBA)添加量 は、 温度が低下するに従って減少すること、 即ち、 インキュベーション温度を低温 にすることにより、 少量のレクチンで接着分離可能となるように接着効率が向上す ることがわかった。 4 °Cでは、 0 . 0 1 mgで 5 0 %程度の細胞接着が観察された。 なお、 これらの細胞接着が、 レクチンを介した糖鎖特異的なものであることは、 前 記ディッシュに種々の濃度のガラクトース液を添加することにより、 4 °Cの場合も 3 7 °Cの場合も、細胞接着が 6 0〜9 0 %程度まで阻害されたことから確認された。 また、 6 0分のインキュベーションの代わりに 9 0 G による遠心を加えた場合に は、 3分以上の遠心処理で 6 0分のィンキュベーシヨンと同等のレクチンによる血 球接着が得られた。 また、 6 0分のインキュベーションを 1 5分に変え、 インキュ ベ一シヨン後 9 0 G の遠心処理を加えた場合も、 2分以上の遠心処理で安定な血球 接着が得られた。 このような遠心処理は、 過剰な遠心処理によって細胞が損傷し非 特異的接着が生じない限り、 レクチンによる選択的接着を加速 '安定化し、 処理時 間を短縮することに寄与した。 実施例 2 ：温度効果 （ 2 )
用いるレクチンを ΡΝΑ及び ECL (ともにガラクト一ス認識性） に換えた以外は、 実施例 1と同様の条件で実験を行い、 以下の表 2に示す結果を得た。 表 2
Figure imgf000014_0001
表 2の結果から、 用いるレクチンの種類に関わらず、 細胞接着率とインキュベー ション温度とに相関関係が存在することが明らかになった。 実施例 3 ：温度効果の実体
実施例 1における 3 7 °Cでのィンキュベーシヨンの場合と同じ条件で、 細胞浮遊 液にアジ化ナトリウムを添加して同様の実験を行った。 結果を表 3に示す。 ただし、 細胞接着性は、 固定化されずに回収された非接着細胞の割合 （回収率） で表した。 表 3
Figure imgf000014_0002
これらの結果から、 レクチンを介した細胞接着性は、 温度低下とともに向上する が、 この現象は温度を下げずとも、 細胞の代謝活性を抑制することが知られている アジ化ナトリウムを添加した場合についても見られることを示している。 即ち、 レ クチンの細胞に対する温度依存的な親和性は、 細胞の膜運動性の影響を受け、 膜運 動性が低下することにより親和性が向上する傾向があることが示唆された。
2 . 選択的親和性
実施例 4 ： 白血球の成熟性に基づく選択的親和性 白血球細胞は幼若な細胞は表面に CD34 と呼ばれる表面マ一カーを表現し （CD34 陽性）、 成熟すると CD34 陰性となることが知られている。 従来は、 CD34抗体を用 いて幼弱な細胞を選択的に固定化することも行われている。 ここで (ま、 糖鎖高分子 として 結合型ガラクトース末端を有する PVLA (インキュベーション温度 4 °C、 37 °C) 及びひ-結合型ガラクトース末端を有する PVMeA (インキュベーション温度 4 °C) を用い、 種々のレクチン添加量での選択的接着性を検討した。 結果を表 4 に示 す。 表中のレクチン (SBA)添加量は、 細胞 2 X 1 0 6個に対する量である。 表 4
Figure imgf000015_0001
これらの結果から、 レクチンを介した本発明の分離方法によれば、 CD34陽性の幼 若細胞と CD34 陰性の成熟細胞とを選択的に分離することができることが解った。 しかも、 インキュベーション温度を低温に設定することにより、 必要とされるレク チン添加量が 1/20程度に低減される。 また、 糖鎖高分子として PVMeAを用いた場 合は、 PVLA を用いた場合に比較して、 レクチン添加量をさらに減少させても選択 的接着性が得られることが示された。
一般に、 SBA はひ-結合型ガラクト一スにより強い親和性を有していることが知ら れている。 ひ-結合型ガラクト一ス末端を有する PVMeA に対する選択的接着が、 よ り低いレクチン添加濃度で生じた結果は、 当該細胞分離法がレクチンの極めて特異 的な親和性に基づいたものであることを示している。 さらに、 当該方法において明 らかにされた低温ィンキュベーシヨンが、 レクチンの親和性を著しく強調する有効 な方法であることも明らかにした。 実施例 5 ：血球間の選択的親和性
インキュベーション温度を 4 °Cとし、 実施例 1と同様の実験を行なって、 臍帯血 由来の赤血球及び白血球の 9 5 %を接着するのに必要なレクチン添加量を求めた。 この場合、 溶血操作は行わなかった。 結果を下記の表 5に示す。
表
5、
Figure imgf000016_0001
表 5に示すとおり、 赤血球と白血球とのレクチンを介した接着性を比較すると、 赤血球の方が親和性が高く、 より低いレクチン添加量で接着可能であることがわか 。 実施例 6 ：臍帯血赤芽球の分離
実施例 5の方法に従って、 インキュベーション温度を 4 °Cとし、 レクチン (SBA)添 加量を細胞 2 X 1 0 6個当たり 5 0 μβ 以下という少量で変化させて、 PVLA被覆 したディッシュに接着された細胞を検査した。 この場合、 第 3段階の固相と液相の 分離の後に、 4 5 0 G でディッシュと接着細胞を同時に遠心処理したものも比較し た。
検査方法は、 接着細胞をディッシュ上で乾燥させ、 へマトキシリン、 エリスロシ ンで細胞を染色し、 正染色性赤芽球をカウントすることによって行い、 ランダムに 選択した領域で 1 0 0個の細胞をカウントしたとき、 その中に含まれる赤芽球の数 で評価した。 結果を図 2に示す。 図中、 PREは、 多量 （3 0 0 \ig ) のレクチンを添 加して殆ど全ての細胞を接着するようにした比較例である。
添加するレクチンの量を減少させ、 レクチンに対する親和性が低い白血球の付着 を阻害すると、 ディッシュ上に成熟赤血球と赤芽球を選択的に接着させることがで きた。 結果的に、 臍帯血中に少量しか存在しない赤芽球を 1 0 0個カウントあたり 1個以上という高い確率で検出することができた。 また、 液相と固相の分離の後に
4 5 0 G、 3分以上の遠心処理を加えると、 接着細胞が均一な球形を示し、 染色態 度が良好となり顕微鏡による赤芽球の視認を容易ならしめた。 一方、 遠心処理が不 十分な場合 （遠心力が低い、 あるいは遠心時間が短いなど)、 均一な細胞染色像が得 られず、 目的とする細胞を顕微鏡で視認する事に困難が生じた。 従って、 微妙な核 内構造を細胞染色によって検出する必夢のある細胞診断を当該レクチンによる細胞 分離法で効率化することにおいて、 基材表面に接着した細胞を適切な条件で遠心す ることは極めて重要であることが明らかとなった。 実施例 7 ：母体血の胎児赤芽球の濃縮
実施例 6の方法に従って、 母体血からフイコール分離された細胞分画を回収し、 細胞 2 X 1 0 6個に対して 1 0 μδのレクチン (SBA)を添加して、 PVMeA被覆したセ パラブルチャンバースライ ド中、 1 8 °Cで 3 0分間インキュベーションした。 比較 のため、 レクチン添加量を 3 0 0 μδ とした場合も調べた。 2 0例について試験した 結果を下記表 6に示す。 表 6
Figure imgf000017_0001
* 3 0 g添加した場合、 赤芽球以外の有核白血球の接着が多すぎてカウントで きなかったものを含む。
上記の試験をふまえ、 胎児赤芽球を検出するためのレクチン （SBA) 添加量の最 適値を検査した。 2 0例で査定した結果を表 7に示す。 その際、 インフォームドコ ンセントに基づき健常な男児を妊娠している母体をエコー診断により確認し、 採血 された母体血から分離された赤芽球を AneuVysion Assay Kit. (VYSIS, INC.)で定法に よる FISH検査を行い Y-プローブの検出を行った。 表 7
Figure imgf000018_0001
これらの結果から、 レクチン添加量を減少させて白血球の接着を阻害すると、 赤 芽球を選択的に濃縮することができ、 母体血から遺伝子診断に有用な赤芽球を効率 よく検出できることが示された。 さらに、 レクチンの限界的添加量も存在し 8 ng以 上のレクチンを添加する方が赤芽球の損失が少ないことも明らかとなった。 この場 合、 2 0 ng 以上の添加量から徐々に有核細胞である白血球の混入が増加し、 3 2 ng以上では NRBCの確認が困難なほどの混入が生じた。 また、 同様の結果は、 糖鎖高分子として PVLAを用いた場合でも再現された。
一方、 赤芽球などの赤血球成分の処理量が少ない母体血サンプルでは、 第 1段階 のレクチンによるインキュベーションを行わなくても良好な赤血球選択的な接着が 再現された。
また、 このとき、 男児を妊娠している母体 8例を検査したところ、 男児特有の Y- プローブが 8例検出され母体血から胎児細胞が高い確率で回収できることも明らか となった。 以上から、 当該レクチンによる有核赤芽球の分離法は、 非/低侵襲的に母 体血から胎児細胞を検出して、 胎児の染色体を検査する有効な方法であることが判 つた。
実施例 4に従って濃縮された CD34 陽性の細胞分画を回収し、 コロニー形成能の 比較を市販のアツセィキット （MethoCult GF H4434, StemCell Technologies Inc) を用 いて行った。 その結果、 当該レクチンによる細胞分離法によって CD34腸性細胞を 濃縮したものは、 分離をしないものに比べ 8 . 8倍のコロニー形成率が得られた。 このことから、 レクチン処理は後のコロニー形成に影響を与えることなく、 効率的 に造血性の細胞を増加させることができることが明らかとなった。 従って、 当該レ クチンによる細胞分離法は、 幹細胞移植を必要とする患者に GVHD を緩和させるこ とのできる減リンパ球移植片を提供することから、 白血病細胞の各分化過程で誘導 される発ガン遺伝子を効率よく検査することにも利用できるものと考えられる。 産業上の利用可能性
以上、 詳細に説明したように、 本発明の分離方法及び分離装置は、 細胞ーレクチ ン及び糖鎖—レクチンの相互作用に基づくものである。 より詳細には、 これらの相 互作用において、 細胞の活性状態ゃレクチン添加量に依存して接着性変化や細胞夕 ィプによる接着選択性が生ずることを利用したものである。 本発明の分離方法及び 分離装置を用いるより、 細胞、 特に臨床的に大きな意義を持つ造血幹細胞や NRBC といった細胞を選択的に分離回収することができる。

Claims

請求の範囲
1 . 分化した成熟細胞及び未成熟な造血性細胞並びに赤芽球を含有する血液 試料から造血細胞及び/または赤芽球を選択的に分離回収する方法において、 当該方 法が、
( 1 ) 前記試料を、 細胞を不活性化する条件下においてレクチンと作用させて細胞- レクチン複合体/非複合体を形成する工程、
( 2 ) 前記細胞-レクチン複合体/非複合体を含む試料を、 前記条件下で、 前記レクチ ンに特異的に認識される糖鎖を有する糖鎖含有高分子で表面被覆した基材とともに' ィンキュベーシヨンして前記細胞をレクチンを介して前記基材表面に固定化するェ 程、 及び、
( 3 ) 液相と固相とを分離し、 液相及び/または固相から目的とする血液細胞を回 収する工程、 さらに場合によって、
( 4 ) 前記インキュベーションの前または後に前記基材と細胞を同時に遠心処理し 細胞の固定化を加速、 安定化させる工程、 あるいは前記血液細胞を回収する工程で 細胞が固定化された基材を遠心処理し細胞の固定化を安定化させる工程をさらに含 んでなり、 、
前記レクチンが、 前記固相から回'収される細胞とは結合して基材表面に固定化す るが、 前記液相から回収される細胞は基材表面に固定化しない量で存在することを 特徴とする血液細胞の選択的分離方法。
2 . 前記細胞を不活性化する条件が、 0 °C以上 3 7 °C未満の低温条件、 また は、 細胞呼吸を停止させる試薬を添加する条件であることを特徴とする請求項 1に 記載の血液細胞の選択的細胞分離方法。
3 . 前記レクチンの濃度が、 少なくとも細胞 1個当たり 2 0 mg/ml以下の範 囲であることを特徴とする請求項 1または 2に記載の血液細胞の選択的分離法。
4 . 前記工程 （ 1 ) のインキュベーション時間を 0から 1 2 0分間とし、 前 記ェ fi? ( 2 ) のインキュベーション時問を 1 0から 1 2 0分問としたことを特徴と する請求項 1ないし 3のいずれかに記載の血液細胞の選択的分離方法。
5 . 基材が、 ポリスチレン、 ポリカーボネート、 ポリスルホン、 ポリウレ夕 ン、 ビニル系共重合体、 またはガラス製のシャーレ、 フラスコ、 プレート、 キュべ ット、 フィルム、 ファイバー、 ビーズ、 及びセパラブルチヤンバースライ ドから選 択された基材であり、 前記レクチンと結合できる糖成分を結合させたことを特徴と する請求項 1ないし 4のいずれかに記載の分離方法を行うための血液細胞の選択的
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