CN117778517A - 一种重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白细胞毒性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人凝血因子Ⅷ‑Fc融合蛋白细胞毒性的检测方法，它包括如下步骤：取人体细胞悬液，与重组人凝血因子Ⅷ‑Fc融合蛋白和PBMC细胞进行离体共培养，取培养液离心，上清液用全自动生化分析仪或酶标仪测定LDH含量；或：取人体红细胞，与重组人凝血因子Ⅷ‑Fc融合蛋白和补体进行离体共培养，取培养液离心，上清液用酶标仪测定血红素释放量。本发明检测结果准确可靠，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白细胞毒性的检测方法。
背景技术
凝血因子Ⅷ(FⅧ)是由肝脏中的肝窦内皮细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白，它在止血过程中发挥着至关重要的作用。由于FⅧ缺乏引起的血友病称之为血友病A，是临床上最普遍的血友病类型，约占血友病患者总数的80％以上。重组人凝血因子Ⅷ(rFⅧ)替代疗法是目前临床上治疗A型血友病最有效的方法，由于FⅧ的半衰期较短，患者需要隔天或者每3周进行静脉注射治疗。长期频繁静脉注射治疗不仅给患者带来肉体上的痛苦，还容易产生FⅧ抗体，严重影响治疗效果。因此，有效地延长rFⅧ的半衰期对临床治疗和缓解患者痛苦具有重要意义。重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白(rⅧ-Fc)与新生儿Fc受体(FcRn)的Fc结构域融合，能够进行FcRn介导的细胞内吞和再循环过程，从而免受细胞内降解，延长rⅧ-Fc的半衰期。由于rⅧ-Fc的广泛应用，rⅧ-Fc是否具有潜在的细胞毒作用成为科学家关注的重点。
目前还没有有关rⅧ-Fc对人体细胞检测方法的研究，导致rⅧ-Fc的安全性评估不足，临床使用中存在风险。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白细胞毒性的检测方法，它包括如下步骤：
取人体细胞悬液，与重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白和PBMC细胞进行离体共培养，取培养液离心，上清液用全自动生化分析仪或酶标仪测定LDH含量；
或：
取人体红细胞，与重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白和补体进行离体共培养，取培养液离心，上清液用酶标仪测定血红素释放量。
进一步地，所述人体细胞悬液与重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白和PBMC细胞的体积比为1：1：1；所述人体红细胞、重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白和补体的体积比为300μl：300μl：50μl。
更进一步地，所述重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白的浓度为1IU/ml；所述PBMC细胞的浓度为1.6×106/ml。
进一步地，所述人体细胞包括红细胞和/或T细胞。
更进一步地，所述红细胞的细胞悬液是活化和/或未活化的红细胞用含1mM氯化钙的PBS缓冲液制成；所述红细胞的细胞悬液的浓度为1×109/ml。
更进一步地，所述活化的红细胞是未活化的红细胞用组蛋白H4孵育而成。
更进一步地，所述T细胞的细胞悬液是活化的T细胞用含200IU/ml rhIL-2的完全培养基制成。
更进一步地，所述T细胞的细胞悬液浓度为2×106/ml。
更进一步地，所述活化的T细胞是未活化的T细胞用CD3/CD28单抗偶联磁珠孵育而成。
进一步地，所述培养是加重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白37℃孵育1h，再加PBMC细胞或补体37℃孵育24h。
本发明重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白细胞毒性的检测方法，通过将重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白与来自人体的T细胞、红细胞(活化/未活化)进行离体共培养，观察靶细胞(T细胞、红细胞)是否破裂导致LDH或血红素释放来评价rⅧ-Fc融合蛋白是否具有潜在的细胞毒作用；并且，本发明还可通过将样品与来自人体的红细胞(活化/未活化)和补体进行离体共培养，观察红细胞是否破裂导致血红素释放来评价rⅧ-Fc融合蛋白是否具有潜在的补体依赖的细胞毒作用，结果准确可靠，提高了检测效率。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1磷脂酰丝氨酸暴露检测结果(从左至右分别为未染色对照、活化红细胞、非活化红细胞)
图2红细胞毒性作用评价培养后照片
图3红细胞毒性作用评价培养上清LDH检测结果(U/L)
图4磷脂酰丝氨酸暴露检测结果(左为未染色对照、右为活化T细)
图5 T细胞激活效率检测(从左至右分别为未染色对照、活化T细胞、非活化T细胞)
图6 T细胞毒性作用评价培养上清LDH检测结果(U/L)
图7活化红细胞加补体溶血时间曲线
图8未活化红细胞加补体溶血时间曲线
图9补体依赖的红细胞毒性作用评价培养后照片(注：1～3列为活化红细胞，4～6列为未活化红细胞；A1、B1，A6、B6为未加药品对照，A2～A5为ELOCTA，B2～B5为r-VIII-Fc，C2～C5为r-VIII，D2～D5为血源VIII。A1、A6，第2列、第4列加了补体；B1、B6，第3列、第5列未加补体)
图10血红素释放(OD541)检测结果
具体实施方式
实施例1本发明重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白体外细胞毒性的检测
1)红细胞的活化：取沉淀红细胞，用含有1mM氯化钙的PBS缓冲液制成5×108/ml红细胞悬液。加入组蛋白H4(终浓度10μg/L)，于37℃孵育10min，得经活化的红细胞悬液。
2)LDH含量检测：取步骤1)所得红细胞悬液，用含有1mM氯化钙的PBS缓冲液制成1×109/ml红细胞悬液，分别取200μl加入24孔板中，再每孔加入200μl的1IU/ml的重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白，37℃孵育1h，最后每孔加入200μl的1.6×106/ml PBMC细胞，37℃孵育24h，室温离心，用微量加样器每孔取上清液300μl，用全自动生化分析仪或酶标仪测定LDH含量。
实施例2本发明重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白体外细胞毒性的检测
1)T细胞的活化：取T细胞，用含有200IU/ml rhIL-2的完全培养基制成2×106/mlT细胞悬液。按照CD3/CD28单抗偶联磁珠和T细胞数量比例1:2，将重悬的磁珠按比例加入铺好细胞的培养容器中。将上述培养容器置于37℃，5％CO2培养箱中培养。逐日观察细胞状态，当细胞密度超过2.5×106cells/mL或培养基变黄时，调整细胞密度至2×106cells/mL，得活化的T细胞悬液。
2)LDH含量检测：取步骤1)所得T细胞悬液，分别取200μl加入24孔板。每孔加入200μl的1IU/ml的重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白，37℃孵育1h，最后每孔加入200μl的1.6×106/ml PBMC细胞，37℃孵育24h，室温离心，用微量加样器每孔取上清液300μl，用全自动生化分析仪或酶标仪测定LDH含量。
实施例3本发明重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白体外细胞毒性的检测
1)红细胞的活化：取沉淀红细胞，用含有1mM氯化钙的PBS缓冲液制成5×108/ml红细胞悬液。加入组蛋白H4(终浓度10μg/L)，于37℃孵育10min，得经活化的红细胞悬液。
2)血红素释放量检测：取步骤1)所得红细胞悬液，用含有1mM氯化钙的PBS缓冲液制成1×109/ml红细胞悬液，分别300μl加入24孔板中。再每孔加入300μl的重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白，37℃孵育1h，最后每孔加入50μl补体，37℃孵育24h，室温离心，用微量加样器每孔取上清液200μl，用酶标仪测定波长541nm吸光度值。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果：
试验例1重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白体外细胞毒性的检测
1仪器与试药
1.1仪器
细胞培养箱(2406-2，SHELLAB)，显微镜(CKX41，OLYMPUS)，酶标仪(Synnergy HTX，BioTek)，流式细胞仪(Accuri C6 Plus，BD Pharmingen)，离心机(5180R，Eppendorf)，生化分析仪(Cedex Bio，Roche)。
1.2试药
重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白(成都蓉生药业有限责任公司)，重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白(ELOCTA)，重组人凝血因子Ⅷ(成都蓉生药业有限责任公司)，人凝血因子Ⅷ(成都蓉生药业有限责任公司)，补体(利用豚鼠血清制备的具有酶活性的蛋白质，由成都蓉生药业有限责任公司提供)。
2方法
2.1红细胞毒性作用评价
(1)红细胞(RBC)的制备：将全血以1000rpm离心10min；离心后加生理盐水，混匀，去掉上清液后继续离心。可重读此步骤，直至离心后上清液清澈透亮。
(2)红细胞的活化：取沉淀红细胞适量，用含有1mM氯化钙的PBS缓冲液制成5×108/ml红细胞悬液。加入组蛋白H4(终浓度10μg/L)，于37℃孵育10min。
(3)活化红细胞表面磷脂酰丝氨酸暴露检测：通过流式细胞术评估Annexin-V与RBC的结合，计算FITC-膜联蛋白-V阳性红细胞亚群比例。
(4)细胞接种及加样：分别取活化和未活化的红细胞悬液，用含有1mM氯化钙的PBS缓冲液制成1×109/ml红细胞悬液，分别取200μl加入24孔板中。每孔加入一定体积(200μl)稀释好(1IU/ml)的药物，37℃孵育1h，阴性对照加培养基；另做加人纤维蛋白原(2g/L，200μl)对照组。每孔加入一定体积的PBMC细胞(1.6×106/ml，200μl)，37℃孵育24h。
(5)细胞毒性(死/活细胞)检测(LDH法)：培养完成后室温离心，用微量加样器每孔取上清液300μl，用全自动生化分析仪或酶标仪测定LDH含量。
2.2T细胞毒性作用评价
(1)T淋巴细胞的制备：从人全血中分离外周血单个有核细胞(PBMC)，通过磁柱富集法分离总T细胞。
从人全血中分离外周血单个有核细胞(PBMC)：在离心管中，使用PBS以至少1:1的比例稀释血液样本；准备与稀释前全血样本相同体积的Ficoll，加入到离心管的底部(或在Ficoll的上层缓缓加入稀释后的全血)；在室温下，以400×g离心20分钟(离心过程中务必使“Brake”按键处于关闭状态，或将离心机加减速调至最低)；采集PBS和Ficoll层交界处的PBMC到新试管内；在离心管中加入适量PBS，洗涤细胞；在2-8℃下，以300-400×g离心细胞4-5分钟，弃掉上清液。将细胞重新悬浮在5ml的PBS中，并计数。
通过磁柱富集法分离总T细胞：在20℃，520g离心10分钟，弃掉上清液，每107个细胞在80μl的冷MACS缓冲液中重新悬浮；通过涡旋15s彻底重悬CD3微珠，每107个细胞添加20μl的磁珠，充分混合样品；在4℃，孵育15分钟；每107个细胞加入2ml预冷的MACS缓冲液洗涤细胞；4℃，300g离心10分钟；离心完成后，吸出上清液并丢弃；按500μl冷MACS缓冲液/108细胞重新悬浮细胞；将MS柱连接到兼容的MACS分离器上，在柱下放置一个15ml锥形管以捕获液体，并将3ml的冷MACS缓冲液加到柱上；将细胞悬浮液加载到准备好的MS柱上；在它流过后，用3ml的冷MACS缓冲液彻底清洗MS柱，再重复此步骤两次；丢弃流过的液体，并在柱下放置一个新的15ml锥形管；用5ml冷MACS缓冲液，立即放在柱塞上；保持适度的连续推动以恢复标记的T细胞；添加适量的冷MACS缓冲液并执行细胞计数。
(2)T细胞的活化
用含有200IU/ml rhIL-2的完全培养基调整T细胞密度至2×106cells/mL，将调整好密度的细胞置于细胞培养容器中。
按照CD3/CD28单抗偶联磁珠和T细胞数量比例1:2，将重悬的磁珠按比例加入铺好细胞的培养容器中。将上述培养容器置于37℃，5％CO2培养箱中培养。根据实验需求，可在培养阶段对活化的T细胞进行进一步分析(取样后，去除磁珠并对细胞进行流式检测)。逐日观察细胞状态，建议每周至少两次对细胞进行取样计数，并定期补液。当细胞密度超过2.5×106cells/mL或培养基变黄时，调整细胞密度至2×106cells/mL。将细胞培养至适宜时长(6天)后收获细胞。
(3)活化T细胞表面磷脂酰丝氨酸暴露检测：通过流式细胞术评估Annexin-V与T细胞的结合，计算FITC-膜联蛋白-V阳性T细胞亚群比例。(4)测试激活效率(CD69+CD25+百分比)：通过流式细胞术评估，CD69+CD25+T细胞亚群比例。
(5)细胞接种及加样：取活化的T细胞悬液，制成2×106/ml T细胞悬液，分别取200μl加入24孔板。每孔加入一定体积(200μl)稀释好(1IU/ml)的药物，37℃孵育1h；阴性对照加培养基。每孔加入一定体积的PBMC细胞(1.6×106/ml，200μl)，37℃孵育24h。
(6)细胞毒性(死/活细胞)检测(LDH法)：培养完成后室温离心，用微量加样器每孔取上清液300μl，用全自动生化分析仪或酶标仪测定LDH含量。
2.3补体依赖的红细胞毒性作用评价
(1)红细胞(RBC)的制备：取健康人抗凝的血制备为压积红细胞，方法同2.1。
(2)红细胞的活化：方法同2.1。
(3)红细胞悬液制备：取活化和未活化的红细胞悬液，离心后用PBS缓冲液悬浮红细胞，调节至适宜浓度，使其在波长541nm处的吸光度为1.0±0.1。(4)溶血反应动力学曲线测定：分别取稀释好(1IU/ml)的药物180μl于96孔板中，每孔加红细胞悬液20μl，混匀，用PBS缓冲液做阴性对照。每孔加补体50μl，同时做未加补体对照，混匀后立即用酶标仪(预热至37℃)在波长541nm处测定起始吸光度(As)，之后，每隔1分钟测定1次，即得样品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线。
(5)细胞接种及加样：分别取活化和未活化的红细胞悬液，用含有PBS缓冲液制成1×109/ml红细胞悬液，分别取300μl加入24孔板中。每孔加入一定体积(300μl)稀释好(1IU/ml)的药物，37℃孵育1h。每孔加入一定体积的人补体(50μl)，37℃孵育24h。
(6)细胞毒性检测(血红素释放)：培养完成后室温离心，用微量加样器每孔取上清液200μl，用酶标仪测定波长541nm吸光度值。
3、结果
3.1红细胞毒性作用评价
红细胞表面磷脂酰丝氨酸暴露检测结果见图1；培养后观察结果见图2；LDH检测结果见图3；
3.2细胞毒性作用评价
活化T细胞表面磷脂酰丝氨酸暴露检测结果见图4；T细胞激活效率检测结果见图5；LDH检测结果见图6。
3.3补体依赖的红细胞毒性作用评价
溶血反应动力学曲线测定结果见图7～8，培养后观察结果见图9；细胞毒性检测(血红素释放)结果见图10。
综上，本发明重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白细胞毒性的检测方法，通过将重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白与来自人体的T细胞、红细胞(活化/未活化)进行离体共培养，观察靶细胞(T细胞、红细胞)是否破裂导致LDH或血红素释放来评价rⅧ-Fc融合蛋白是否具有潜在的细胞毒作用；并且，本发明还可通过将样品与来自人体的红细胞(活化/未活化)和补体进行离体共培养，观察红细胞是否破裂导致血红素释放来评价rⅧ-Fc融合蛋白是否具有潜在的补体依赖的细胞毒作用，结果准确可靠，提高了检测效率。
Claims (10)
1.一种重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白细胞毒性的检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：
取人体细胞悬液，与重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白和PBMC细胞进行离体共培养，取培养液离心，上清液用全自动生化分析仪或酶标仪测定LDH含量；
或：
取人体红细胞，与重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白和补体进行离体共培养，取培养液离心，上清液用酶标仪测定血红素释放量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述人体细胞悬液与重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白和PBMC细胞的体积比为1：1：1；所述人体红细胞、重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白和补体的体积比为300μl：300μl：50μl。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白的浓度为1IU/ml；所述PBMC细胞的浓度为1.6×106/ml。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述人体细胞包括红细胞和/或T细胞。
5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于：所述红细胞的细胞悬液是活化和/或未活化的红细胞用含1mM氯化钙的PBS缓冲液制成；所述红细胞的细胞悬液的浓度为1×109/ml；。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述活化的红细胞是未活化的红细胞用组蛋白H4孵育而成。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述T细胞的细胞悬液是活化的T细胞用含200IU/ml rhIL-2的完全培养基制成。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述T细胞的细胞悬液浓度为2×106/ml。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述活化的T细胞是未活化的T细胞用CD3/CD28单抗偶联磁珠孵育而成。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述培养是加重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白37℃孵育1h，再加PBMC细胞或补体37℃孵育24h。
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