CN117987472A - 生产富含干细胞样中央记忆表型t细胞的人类嵌合抗原受体t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞(Tscm)的人类嵌合抗原受体T细胞的方法：提供人类周边血液单核细胞；纯化人类T细胞：将表面含有抗CD3/CD28抗体的磁珠加入人类周边血液单核细胞，得到人类T细胞与磁珠复合物；活化人类T细胞：将人类T细胞与磁珠复合物培养活化，得到活化的人类T细胞与磁珠复合物；慢病毒转染：将慢病毒加入活化的人类T细胞与磁珠复合物，进行转染，得到人类CAR‑T细胞与磁珠复合物；移除磁珠：自人类CAR‑T细胞与磁珠复合物移除磁珠，得到人类CAR‑T细胞；人类CAR‑T细胞扩增：将人类CAR‑T细胞扩增培养，即可得富含Tscm的人类CAR‑T细胞。本发明可于短时间扩增CAR‑T细胞，且生成的人类CAR‑T细胞具有高比例的Tscm的T细胞，更适于CAR‑T细胞疗法。
Description
技术领域
本发明是关于一种生产人类嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor Tcell，CAR-T)的方法，尤其是一种生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的CAR-T细胞的方法。
背景技术
CAR-T细胞疗法是利用基因编辑技术使T细胞表现能辨识肿瘤细胞表面抗原的受体；当改造的T细胞输回人体之后，能够辨识肿瘤细胞进而毒杀之。
然此疗法亦具有副作用，其中最严重的不良反应为细胞激素释放症候群(cytokine release syndrome，CRS)，即当CAR-T细胞对抗肿瘤细胞时会大量释放细胞激素，产生过于激烈的发炎反应、微血管渗漏、凝血连锁反应，更甚者可能导致心脏、肺脏及肾脏衰竭或脑肿胀而危及生命。目前普遍认为，CAR-T细胞中若富含干细胞样中央记忆表型的T细胞(stem central memory T cell，Tscm)，可以增加CAR-T细胞在人体内存续的时间，增加治疗疗效，并降低细胞激素释放症候群与神经学毒性的发生率及严重度。
然而，人体周边血液中Tscm细胞比例仅约为1-5％。现有生产CAR-T细胞的技术中难以有效增加Tscm细胞比例与数量，除了所得的Tscm细胞比例不高，导致进行CAR-T细胞疗法可能造成严重细胞激素释放症候群与神经毒性之外，CAR-T进入人体后持续时间不够久也降低治疗疗效，且目前技术要产生足够量的CAR-T细胞以供输回人体对抗肿瘤细胞，一般会需要在体外扩增9至14天的时间，耗时甚久。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明的目的为提供一种制备方法，可以在短时间内生产足够量的CAR-T细胞，且生产出的CAR-T细胞中富含干细胞样中央记忆表型T细胞(Tscm)。
为达上述的发明目的，本发明提供一种生产富含Tscm的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其包含：步骤(1)提供人类周边血液单核细胞(Peripheral blood mononuclearcells；PBMC)；步骤(2)将磁珠加入所述人类PBMC，进行磁性分离，移除人类PBMC中的B细胞、NK细胞及单核球，得到人类T细胞与磁珠复合物，其中，所述磁珠的表面设有抗CD3的抗体及抗CD28的抗体；步骤(3)将所述人类T细胞与磁珠复合物培养16小时至20小时，进行T细胞活化，得到活化的人类T细胞与磁珠复合物；步骤(4)将慢病毒加入所述活化的人类T细胞与磁珠复合物，进行慢病毒转染40小时至48小时，得到人类CAR-T细胞与磁珠复合物；步骤(5)自所述人类CAR-T细胞与磁珠复合物移除所述磁珠，得到人类CAR-T细胞；及步骤(6)将所述人类CAR-T细胞培养92小时至96小时，得到富含Tscm的人类CAR-T细胞。
本发明借由控制人类T细胞与磁珠接触的时间长短，经由7天培养所产出的人类CAR-T细胞有最佳的T细胞扩增量、并富含Tscm，提供一种相较于现有技术具有更佳免疫功效的人类CAR-T细胞，而更适合用于CAR-T免疫疗法。
依据本发明，步骤(1)中的人类PBMC系来自人类的全血或经由白血球分离法采集的白血球成品(Leukapheresis Product)。且所述人类PBMC包含T细胞、B细胞、NK细胞及单核球。
依据本发明，所述人类为健康人类或患有癌症的病患。
依据本发明，所述磁珠可活化人类T细胞。较佳的，所述磁珠为DynabeadsTMHumanT-Expander CD3/CD28(Gibco，Cat.No.11141D)或CTSTM(Cell Therapy Systems)DynabeadsTM CD3/CD28(Gibco,Cat.No.40203D)。
较佳的，步骤(2)所述磁珠的数量为所述人类PBMC中人类T细胞数量的2至4倍，更佳的，所述磁珠的数量为所述人类PBMC中人类T细胞数量的3倍。
较佳的，步骤(3)及(4)的完全X-VIVO 15培养基总体积与培养角瓶底面积比例为0.12至0.3。更佳的，步骤(3)及(4)的完全X-VIVO 15培养基总体积与培养角瓶底面积比例为0.2至0.27。举例来说，当培养角瓶底面积为75平方公分(cm2)时，完全X-VIVO 15培养基总体基可为9毫升(mL)至22.5mL。较佳的，当培养角瓶底面积为75cm2时，完全X-VIVO 15培养基总体基可为15mL至20.25mL。
更佳的，若同时进一步控制步骤(2)所述磁珠的数量为所述人类PBMC中人类T细胞数量的2至4倍及步骤(3)、(4)的完全X-VIVO 15培养基总体积与培养角瓶底面积比例为0.12至0.3，也就是同时控制人类T细胞与磁珠接触的时间长短、步骤(2)中磁珠与人类PBMC中人类T细胞数量比及步骤(3)、(4)的完全X-VIVO 15培养基总体积与培养角瓶底面积比例，更可带来在短时间内大量扩增T细胞，且使得产出的人类CAR-T细胞富含Tscm的效果。
较佳的，步骤(3)中人类T细胞与磁珠复合物是培养于36.5℃至37.5℃下16小时至20小时，例如可为16至19或17至19小时。更佳的，步骤(3)中人类T细胞与磁珠复合物是培养于37℃、5％二氧化碳的加湿环境下18小时。
较佳的，步骤(4)是在36.5℃至37.5℃下进行慢病毒转染40小时至56小时。更佳的，步骤(4)是在37℃、5％二氧化碳的加湿环境下进行慢病毒转染48小时。
较佳的，步骤(6)是将所述人类嵌合抗原受体T细胞培养于36.5℃至37.5℃下92小时至96小时。更佳的，步骤(6)是将所述人类嵌合抗原受体T细胞培养于37℃、5％二氧化碳的加湿环境下96小时。
较佳的，步骤(3)的人类T细胞与磁珠复合物培养、步骤(4)的慢病毒转染及步骤(6)的人类CAR-T细胞培养，是使用含有IL-2的完全X-VIVOTM 15(Lonza,Cat.no.04-418Q)培养基，且所述完全X-VIVOTM 15培养基中的IL-2的浓度为200IU/mL。
依据本发明，完全X-VIVOTM 15培养基即为内含有200IU/mL的重组人类IL-2(R&DSystems，Cat No.202-IL-500)的X-VIVOTM 15培养基。
较佳的，步骤(4)的慢病毒转染是将抗CD19、抗CD22、抗B细胞成熟抗原(b cellmaturation antigen，BCMA)或抗间皮素的受体的基因转染至人类T细胞中。
较佳的，步骤(6)所得到的富含Tscm的人类CAR-T细胞的数量为步骤(2)中的人类T细胞与磁珠复合物中的人类T细胞的数量的10倍以上，亦即经过步骤(6)扩增培养后所得到的扩增的人类CAR-T细胞的数量为步骤(2)中的人类T细胞与磁珠复合物中的人类T细胞的数量的10倍以上。更佳的，步骤(6)所得到的富含Tscm的人类CAR-T细胞的数量为步骤(2)中的人类T细胞与磁珠复合物中的人类T细胞的数量的20倍以上。再更佳的，步骤(6)所得到的富含Tscm的人类CAR-T细胞的数量为步骤(2)中的人类T细胞与磁珠复合物中的人类T细胞的数量的30倍。
较佳的，步骤(6)的培养，是使用培养基混合物，该培养基混合物是将新鲜的完全X-VIVOTM15培养基加入含有步骤(5)所得的人类CAR-T细胞的悬浮液，即将新鲜的完全X-VIVOTM 15培养基加入自步骤(1)进行至步骤(5)所得的含有人类CAR-T细胞的原始培养基，且新鲜的完全X-VIVOTM 15培养基与步骤(5)所得的含有人类CAR-T细胞的原始培养基两者的体积比为1：1至3：1。
较佳的，步骤(6)得到的富含Tscm的人类CAR-T细胞中，Tscm数量占富含Tscm的人类CAR-T细胞数量的比例大于55％，也就是说，经过步骤(6)扩增培养后所得到的所有扩增的人类CAR-T细胞中，含有大于55％的Tscm。更佳的，步骤(6)得到的富含Tscm的人类CAR-T细胞中，Tscm数量占富含Tscm的人类CAR-T细胞总数量的比例大于60％。更佳的，步骤(6)得到的富含Tscm的人类CAR-T细胞中，Tscm数量占富含Tscm的人类CAR-T细胞总数量的比例大于70％。再更佳的，步骤(6)得到的富含Tscm的人类CAR-T细胞中，Tscm数量占富含Tscm的人类CAR-T细胞总数量的比例大于75％。
较佳的，本发明的制备方法进一步包含步骤(7)冷冻保存所述富含Tscm的人类CAR-T细胞。
本发明的优点在于可以在短时间内，大量扩增T细胞，且使得产出的人类CAR-T细胞富含Tscm，而能进一步分化、具有更长寿命，并能降低CAR-T细胞疗法所引起的细胞激素释放症候群与神经毒性。因此本发明制备方法所产出的人类CAR-T细胞更适合用于CAR-T细胞疗法。
附图说明
图1为实施例与比较例于第7天的人类T细胞扩增倍数；
图2为实施例于第7天与比较例于第9天的人类T细胞扩增倍数；
图3为实施例于第7天与比较例于第9天的人类T细胞亚群分布；
图4A为实施例于第7天的人类T细胞亚群分布流式细胞仪图；
图4B为比较例于第9天的人类T细胞亚群分布流式细胞仪图。
具体实施方式
本发明以下列的实施例说明，这些实施例并不限制本发明前面所揭示的内容。熟习本发明的技术人员，可以做些许的改良与修饰，但不脱离本发明的范畴。
实施例
在本实施例中，首先于第0天进行步骤(1)提供人类周边血液单核细胞。具体而言，是收集健康的人类捐赠者的全血，以等量2％白蛋白/磷酸缓冲生理盐水(Albumin/Phosphate buffered saline buffer，Alb/PBS buffer)稀释、混合均匀后，利用具有隔室的SepMateTM-50离心管进行密度梯度离心以分离出人类PBMC。详细步骤如下：将15毫升(mL)的Ficoll-Paque(GE Healthcare)密度梯度培养基小心地添加至SepMateTM-50离心管隔室(insert)的中间孔洞，再将稀释后的全血沿离心管壁缓慢加入后，放入离心机以1200×g室温离心20分钟，并开启离心机的剎车功能。将上层液倒入新的离心管，再于室温下进行300×g离心8分钟；移除上层液，重新以Alb/PBS缓冲液悬浮人类PBMC团块，调整人类PBMC的浓度为：2至5×107个细胞/mL。
其中，细胞数的计算是取细胞悬浮液中的7.5微升(μL)与6μL的PBS及1.5μL的以吖啶橙/碘化丙啶(Acridine Orange/Propidium Iodide)染剂混合。接着，以自动萤光细胞计数仪(Automated Fluorescence Cell Counter，LUNA-FLTM)计算细胞数目，并记录存活的细胞数目、细胞存活率及细胞大小，最后计算出细胞悬浮液内的总细胞数。
此外，在进入步骤(2)之前，先检测人类PBMC中CD3+ T细胞的比例，以计算出步骤(2)所需使用磁珠的数量。具体而言，将1×105个人类PBMC加入免疫检测试套组(MACS 8-color immunophenotyping kit)中，4℃下避光反应10分钟。接着，加入2mL的2％人白蛋白/生理盐水缓冲液(hAlb/Saline buffer)并以350×g室温下离心5分钟，移除上清液后轻敲细胞团块，以200μL的2％hAlb/Saline缓冲液重新悬浮细胞团块，利用流式细胞仪CytoFLEX确认PBMC的亚群分布(subpopulations)，其中CD3+ T细胞比例约为40-70％。
接着，利用以下公式算出人类PBMC中表现有表面抗原CD3+的细胞数，即人类T细胞的数量：
总PBMC数量×CD3+ T细胞％＝CD3+ T细胞的数量。
进行步骤(2)将磁珠加入所述人类PBMC，进行磁性分离，移除人类PBMC中的B细胞、NK细胞及单核球，得到人类T细胞与磁珠复合物，其中，所述磁珠的表面设有抗CD3的抗体及抗CD28的抗体。具体而言，以2％Alb/PBS缓冲液将人类PBMC重新悬浮于试管中，调整人类T细胞的浓度为2～5×107个细胞/mL，但有核细胞总数不超过2×108/mL。取人类T细胞数量3倍数量的表面含有抗CD3/CD28抗体的磁珠(Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28；gibco，Cat.No.11141D)，以2％Alb/PBS缓冲液清洗2遍之后，加入人类PBMC悬浮液中，得到一人类PBMC与磁珠混和物，其中磁珠与人类PBMC中人类T细胞的数量比例为3:1。人类PBMC与磁珠混和物于室温下以6rpm旋转30分钟后，将试管置于磁座上1到2分钟，借由移除上清液以去除人类PBMC中的B细胞、NK细胞及单核球后，即可得到通过抗原-抗体结合所形成的人类T细胞与磁珠复合物。
在进入步骤(3)之前，先计算出与磁珠结合的人类T细胞数量。具体而言，利用5倍人类T细胞与磁珠复合物体积的完全X-VIVOTM 15培养基(其内含有200IU/mL的重组人类IL-2(R&D Systems，Cat No.202-IL-500)的X-VIVOTM 15培养基)悬浮人类T细胞与磁珠复合物，取出7.5μL的含有人类T细胞与磁珠复合物的悬浮液与6μL的PBS缓冲液及1.5μL的吖啶橙/碘化丙啶染剂混合之后以自动萤光细胞计数仪计算与磁珠结合的人类T细胞数。
接下来，进行步骤(3)将所述人类T细胞与磁珠复合物培养，进行T细胞活化，得到活化的人类T细胞与磁珠复合物。具体而言，是将人类T细胞与磁珠复合物以完全X-VIVOTM15培养基调整人类T细胞浓度为1×106个细胞/mL，种于培养角瓶(T-flask)中。在37℃、5％二氧化碳的加湿环境下培养20小时，得到活化的人类T细胞与磁珠复合物。
再来，于实施例进行的第1天，进行步骤(4)将慢病毒加入所述活化的人类T细胞与磁珠复合物中，进行慢病毒转染，得到人类CAR-T细胞与磁珠复合物。具体而言，是将MOI＝0.5～3的慢病毒溶液加入步骤(3)所得的活化的人类T细胞与磁珠复合物中，在不冲散人类T细胞与磁珠的结合状态为前提下，以能避免破坏细胞活性的温和的力量与速度均匀混合约30秒后培养于37℃、5％二氧化碳的加湿环境下48小时，进行慢病毒转染，以得到人类CAR-T细胞与磁珠复合物。
接下来，在实施例进行的第3天，进行步骤(5)自所述人类CAR-T细胞与磁珠复合物移除所述磁珠，得到人类CAR-T细胞。具体而言，测量包含有人类CAR-T细胞与磁珠复合物的悬浮液的体积，取出7.5μL包含有人类CAR-T细胞与磁珠复合物的细胞悬浮液与6μL的PBS缓冲液及1.5μL的吖啶橙/碘化丙啶染剂混合后，以自动萤光细胞计数仪计算细胞数，并记录存活的细胞数目、细胞存活率及细胞大小，再计算出总细胞数。将装有包含人类CAR-T细胞与磁珠复合物的悬浮液的试管置于磁座上1～2分钟后，取出细胞悬浮液液至新的试管中，此方式进行三次之后，即得到含有人类CAR-T细胞的悬浮液。
在进行步骤(6)之前，先计算收集到的人类CAR-T细胞数量与回收率。具体而言，测量所得到含有人类CAR-T细胞的悬浮液总体积，取7.5μL的含有人类CAR-T细胞的悬浮液与6μL的PBS及1.5μL的以吖啶橙/碘化丙啶染剂混合。接着以自动萤光细胞计数仪计算细胞数目，并记录存活的细胞数目、细胞存活率及细胞大小，再计算出包含有人类CAR-T细胞的悬浮液内的总细胞数。最后计算出磁珠移除后的细胞回收率(％)。
最后，进行步骤(6)将人类CAR-T细胞进行培养，得到富含Tscm的人类CAR-T细胞。具体而言，是将步骤(5)所得到的含有人类CAR-T细胞的悬浮液，即含有人类CAR-T细胞的条件培养基，加入新鲜的完全X-VIVOTM 15培养基将人类CAR-T细胞调整为浓度为7×105/mL种于培养角瓶内，将培养角瓶培养于37℃、5％二氧化碳的加湿环境下96小时(4天)以获得扩增的人类CAR-T细胞，即富含Tscm的人类CAR-T细胞。此步骤不仅可获得扩增的人类CAR-T细胞，且所获得的产物同时为培养富含Tscm的人类CAR-T细胞。扩增培养期间每2～3天添加部份新的完全X-VIVOTM 15培养基，将CAR-T细胞密度调整为浓度为7×105/mL种于培养角瓶内，但应避免将细胞密度过度稀释达3倍以上。
比较例
比较例与实施例的制备方法步骤类似，差别之处在于比较例的制备方法与实施例的步骤(4)至(6)不同，比较例并未在如实施例步骤(4)进行慢病毒转染48小时后，进行步骤(5)移除磁珠，而是进行步骤(4’)慢病毒转染96小时后才移除磁珠。亦即，比较例在进行比较例制备方法的第1天进行步骤(4’)将慢病毒加入所述活化的人类T细胞与磁珠复合物中，于37℃下进行慢病毒转染96小时，得到人类CAR-T细胞与磁珠复合物，并且在所述慢病毒转染进行48小时额外补充适当培养基；接着，于比较例进行的第5天进行步骤(5’)自人类CAR-T细胞与磁珠复合物中的磁珠移除，得到人类CAR-T细胞；最后进行步骤(6’)将所述人类CAR-T细胞，培养于37℃下96小时，得到扩增的人类CAR-T细胞。
磁珠可以活化刺激、扩增T细胞，因此和实施例相较之下，比较例实际延长了磁珠活化T细胞的时间。
测试例1测定T细胞扩增倍数
分别取实施例步骤(6)及比较例步骤(6’)获得的具有扩增的人类CAR-T细胞的细胞悬浮液7.5μL与6μL的PBS及1.5μL的以吖啶橙/碘化丙啶染剂混合，接着以自动萤光细胞计数仪计算细胞数目，并记录存活的细胞数目、细胞存活率及细胞大小，最后计算出总人类CAR-T细胞数目，并与第0天所测得的人类T细胞数量做比较。如图1所示计算出实施例与比较例于第7天的人类T细胞扩增倍数，及如图2所示在移除磁珠后培养96小时(4天)所获得最终的扩增的人类CAR-T细胞的扩增倍数，另外分别列出实施例于第0天、第3天、第6天与第7天；及比较例于第0天、第5天、第6天、第7天、第8天与第9天的人类T细胞总数，如下表1所示。
表1实施例与比较例于制备过程中不同天数的细胞总数目
根据图1、图2及表1的结果，实施例在第7天可以使收获的扩增的人类CAR-T细胞总数相较于第0天的人类T细胞总数扩增了12.17倍。而比较例虽然在第9天收获时的细胞数目、扩增倍数大于实施例在第7天收获时的细胞数目、扩增倍数；然于第7天时，比较例的细胞数目仅有1.97×107远低于实施例的3.65×107，扩增倍数也仅约实施例细胞扩增倍数的一半，仅6.99倍。因此可以证实本发明可以在短时间内使人类T细胞加速生长、大量扩增。
测试例2测定人类T细胞的不同亚群分布
分别将实施例步骤(6)及比较例步骤(6’)获得的扩增的人类CAR-T细胞利用萤光标定及流式细胞仪，检测T细胞表面标志，包含：CD3、CD4、CD8、CD95、CD45RA、CCR7而测定所获得的人类T细胞的不同亚群：Tscm、中央记忆T细胞(central memory T cell，TCM)、效应记忆T细胞(effector memory Tcell，TEM)、最终分化效应记忆T细胞(terminallydifferentiated effector memory Tcell，TEMRA)的分布。其结果如图3至4B及表2所示。
表2实施例与比较例于扩增的人类CAR-T细胞收获天数的T细胞亚群分布(％)
一般而言，健康的人类血液中，Tscm约占T细胞的2％至3％(Gattinoni,Luca,etal."A human memory T cell subset with stem cell–like properties."Naturemedicine 17.10(2011):1290-1297)。而根据表2、图3、图4A及图4B可知，本发明实施例所得的扩增的人类CAR-T细胞中Tscm所占比例为79.68％，较比较例的Tscm比例34.14％要高；此外，实施例Tscm总数为2.91×107(3.65×107×79.68％＝2.91×107)，而比较例Tscm总数为2.09×107(6.13×107×34.14％＝2.09×107)，实施例相较比较例的Tscm增加幅度达到39％。再者，实施例的TEMRA 8.35％较比较例47.81％大幅下降，亦即T细胞仍处于较少分化表现阶段，没有进入衰竭情况，能进一步分化为TCM、TEM，且具有较TCM、TEM、TEMRA更长的寿命，并具有自我更新能力。因此本发明实施例所制得的富含Tscm的人类CAR-T细胞较比较例所得的扩增的人类CAR-T细胞更适合用于CAR-T细胞疗法。并更能降低CAR-T细胞疗法所引起的细胞激素释放症候群与神经毒性。
综上，本发明的制备方法所产出的富含Tscm的人类CAR-T细胞，仅需更短的培养时间，即可产出具有高比例、富含干细胞样中央记忆型T细胞表型，能进一步分化、具有更长寿命，并能降低CAR-T细胞疗法所引起的细胞激素释放症候群与神经毒性。因此本发明制备方法所产出的富含Tscm的人类CAR-T细胞更适合用于CAR-T细胞疗法。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制；虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，包含：
步骤(1)提供人类周边血液单核细胞；
步骤(2)将磁珠加入所述人类周边血液单核细胞，进行磁性分离，移除人类周边血液单核细胞中的B细胞、NK细胞及单核球，得到人类T细胞与磁珠复合物，其中，所述磁珠的表面设有抗CD3的抗体及抗CD28的抗体；
步骤(3)将所述人类T细胞与磁珠复合物培养16小时至20小时，进行T细胞活化，得到活化的人类T细胞与磁珠复合物；
步骤(4)将慢病毒加入所述活化的人类T细胞与磁珠复合物，进行慢病毒转染40小时至48小时，得到人类嵌合抗原受体T细胞与磁珠复合物；
步骤(5)自所述人类嵌合抗原受体T细胞与磁珠复合物移除所述磁珠，得到人类嵌合抗原受体T细胞；及
步骤(6)将所述人类嵌合抗原受体T细胞培养92小时至96小时，得到富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞。
2.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，所述人类周边血液单核细胞是分离自人类的全血。
3.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中所述磁珠的数量为所述人类周边血液单核细胞中人类T细胞数量的2至4倍。
4.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的人类T细胞与磁珠复合物培养于36.5℃至37.5℃下16小时至20小时。
5.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(4)是在36.5℃至37.5℃下进行慢病毒转染40小时至48小时。
6.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(4)的慢病毒转染是将抗CD19、抗CD22、抗B细胞成熟抗原或抗间皮素的受体基因转染至所述人类T细胞与磁珠复合物的人类T细胞中。
7.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(6)是将所述人类嵌合抗原受体T细胞，培养于36.5℃至37.5℃下90小时至96小时。
8.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(3)的人类T细胞与磁珠复合物培养、步骤(4)的慢病毒转染及步骤及(6)的将人类嵌合抗原受体T细胞进行培养，是使用完全X-VIVOTM 15培养基。
9.如权利要求1至8任一项所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(6)得到的所述富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的数量为步骤(2)中所述人类T细胞与磁珠复合物中的人类T细胞的数量的10倍以上。
10.如权利要求1至8任一项所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(6)得到的所述富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞中，干细胞样中央记忆表型T细胞所占比例大于55％。
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