TW202419629A - 生產富含幹細胞樣記憶ｔ細胞之人類嵌合抗原受體ｔ細胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法：(1) 提供人類周邊血液單核細胞；(2) 純化人類T細胞：將表面含有抗CD3/CD28抗體之磁珠加入人類周邊血液單核細胞，得到人類T細胞與磁珠複合物；(3) 活化人類T細胞：將人類T細胞與磁珠複合物培養活化，得到活化之人類T細胞與磁珠複合物；(4) 慢病毒轉染：將慢病毒加入活化之人類T細胞與磁珠複合物，進行轉染，得到人類CAR-T細胞與磁珠複合物；(5) 移除磁珠：自人類CAR-T細胞與磁珠複合物移除磁珠，得到人類CAR-T細胞；(6)人類CAR-T細胞擴增：將人類CAR-T細胞擴增培養，即可得富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類CAR-T細胞。本發明可於短時間擴增CAR-T細胞，且生成之人類CAR-T細胞具有高比例的幹細胞樣中央記憶表型的T細胞，更適於CAR-T細胞療法。
Description
本發明是關於一種生產人類嵌合抗原受體T細胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)的方法，尤其是一種生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之CAR-T細胞的方法。
CAR-T細胞療法是利用基因編輯技術使T細胞表現能辨識腫瘤細胞表面抗原之受體；當改造的T細胞輸回人體之後，能夠辨識腫瘤細胞進而毒殺之。
然此療法亦具有副作用，其中最嚴重之不良反應為細胞激素釋放症候群(cytokine release syndrome，CRS)，即當CAR-T細胞對抗腫瘤細胞時會大量釋放細胞激素，產生過於激烈的發炎反應、微血管滲漏、凝血連鎖反應，更甚者可能導致心臟、肺臟及腎臟衰竭或腦腫脹而危及生命。目前普遍認為，CAR-T細胞中若富含幹細胞樣中央記憶表型的T細胞(stem central memory T cell，Tscm)，可以增加CAR-T細胞在人體內存續的時間，增加治療療效，並降低細胞激素釋放症候群與神經學毒性之發生率及嚴重度。
然而，人體周邊血液中Tscm細胞比例僅約為1-5%。現有生產CAR-T細胞的技術中難以有效增加Tscm細胞比例與數量，除了所得的Tscm細胞比例不高，導致進行CAR-T細胞療法可能造成嚴重細胞激素釋放症候群與神經毒性之外，CAR-T進入人體後持續時間不夠久也降低治療療效，且目前技術要產生足夠量的CAR-T細胞以供輸回人體對抗腫瘤細胞，一般會需要在體外擴增9至14天的時間，耗時甚久。
為了克服現有生產技術之缺點，本發明之目的為提供一種製備方法，可以在短時間內生產足夠量的CAR-T細胞，且生產出的CAR-T細胞中富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞(Tscm)。
為達上述之發明目的，本發明提供一種生產富含Tscm之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其包含：步驟(1) 提供人類周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells；PBMC) ；步驟(2) 將磁珠加入所述人類PBMC，進行磁性分離，移除人類PBMC中的B細胞、NK細胞及單核球，得到人類T細胞與磁珠複合物，其中，所述磁珠的表面設有抗CD3的抗體及抗CD28的抗體；步驟(3) 將所述人類T細胞與磁珠複合物培養16小時至20小時，進行T細胞活化，得到活化之人類T細胞與磁珠複合物；步驟(4) 將慢病毒加入所述活化之人類T細胞與磁珠複合物，進行慢病毒轉染40小時至48小時，得到人類CAR-T細胞與磁珠複合物；步驟(5)自所述人類CAR-T細胞與磁珠複合物移除所述磁珠，得到人類CAR-T細胞；及步驟(6) 將所述人類CAR-T細胞培養92小時至96小時，得到富含Tscm之人類CAR-T細胞。
本發明藉由控制人類T細胞與磁珠接觸的時間長短，經由7天培養所產出的人類CAR-T細胞有最佳的T細胞擴增量、並富含Tscm，提供一種相較於先前技術具有更佳免疫功效的人類CAR-T細胞，而更適合用於CAR-T免疫療法。
依據本發明，步驟(1) 中的人類PBMC係來自人類的全血或經由白血球分離法採集之白血球成品(Leukapheresis Product)。且所述人類PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球。
依據本發明，所述人類為健康人類或患有癌症之病患。
依據本發明，所述磁珠可活化人類T細胞。較佳的，所述磁珠為Dynabeads™ Human T-Expander CD3/CD28 (Gibco，Cat. No. 11141D) 或 CTS™ (Cell Therapy Systems) Dynabeads™ CD3/CD28 (Gibco, Cat. No. 40203D)。
較佳的，步驟(2)所述磁珠的數量為所述人類PBMC中人類T細胞數量的2至4倍，更佳的，所述磁珠的數量為所述人類PBMC中人類T細胞數量的3倍。
較佳的，步驟(3)及(4)之完全X-VIVO 15培養基總體積與培養角瓶底面積比例為0.12至0.3。更佳的，步驟(3)及(4)之完全X-VIVO 15培養基總體積與培養角瓶底面積比例為0.2至0.27。舉例來說，當培養角瓶底面積為75平方公分(cm
2)時，完全X-VIVO 15培養基總體基可為9毫升(mL)至22.5 mL。較佳的，當培養角瓶底面積為75 cm
2時，完全X-VIVO 15培養基總體基可為15 mL至20.25 mL。
更佳的，若同時進一步控制步驟(2)所述磁珠的數量為所述人類PBMC中人類T細胞數量的2至4倍及步驟(3)、(4)之完全X-VIVO 15培養基總體積與培養角瓶底面積比例為0.12至0.3，也就是同時控制人類T細胞與磁珠接觸的時間長短、步驟(2)中磁珠與人類PBMC中人類T細胞數量比及步驟(3)、(4)之完全X-VIVO 15培養基總體積與培養角瓶底面積比例，更可帶來在短時間內大量擴增T細胞，且使得產出的人類CAR-T細胞富含Tscm的效果。
較佳的，步驟(3)中人類T細胞與磁珠複合物是培養於36.5°C至37.5°C下16小時至20小時，例如可為16至19或17至19小時。更佳的，步驟(3)中人類T細胞與磁珠複合物是培養於37°C、5%二氧化碳的加濕環境下18小時。
較佳的，步驟(4)是在36.5°C至37.5°C下進行慢病毒轉染40小時至56小時。更佳的，步驟(4)是在37°C、5%二氧化碳的加濕環境下進行慢病毒轉染48小時。
較佳的，步驟(6)是將所述人類嵌合抗原受體T細胞培養於36.5°C至37.5°C下92小時至96小時。更佳的，步驟(6)是將所述人類嵌合抗原受體T細胞培養於37°C、5%二氧化碳的加濕環境下96小時。
較佳的，步驟(3)之人類T細胞與磁珠複合物培養、步驟(4)之慢病毒轉染及步驟(6)之人類CAR-T細胞培養，是使用含有IL-2的完全X-VIVO™ 15(Lonza, Cat. no. 04-418Q)培養基，且所述完全X-VIVO™ 15培養基中之IL-2之濃度為200 IU/mL。
依據本發明，完全X-VIVO™ 15培養基即為內含有 200 IU/mL之重組人類IL-2 (R&D Systems，Cat No. 202-IL-500)之X-VIVO™ 15培養基。
較佳的，步驟(4)的慢病毒轉染是將抗CD19、抗CD22、抗B細胞成熟抗原(b cell maturation antigen，BCMA)或抗間皮素之受體的基因轉染至人類T細胞中。
較佳的，步驟(6)所得到的富含Tscm之人類CAR-T細胞的數量為步驟(2)中之人類T細胞與磁珠複合物中的人類T細胞的數量的10倍以上，亦即經過步驟(6)擴增培養後所得到的擴增的人類CAR-T細胞的數量為步驟(2)中之人類T細胞與磁珠複合物中的人類T細胞的數量的10倍以上。更佳的，步驟(6)所得到的富含Tscm之人類CAR-T細胞的數量為步驟(2) 中之人類T細胞與磁珠複合物中的人類T細胞的數量的20倍以上。再更佳的，步驟(6)所得到的富含Tscm之人類CAR-T細胞的數量為步驟(2) 中之人類T細胞與磁珠複合物中的人類T細胞的數量的30倍。
較佳的，步驟(6) 之培養，是使用培養基混合物，該培養基混合物是將新鮮的完全X-VIVO™15培養基加入含有步驟(5)所得之人類CAR-T細胞的懸浮液，即將新鮮的完全X-VIVO™ 15培養基加入自步驟(1)進行至步驟(5)所得之含有人類CAR-T細胞的原始培養基，且新鮮的完全X-VIVO™ 15培養基與步驟(5)所得之含有人類CAR-T細胞的原始培養基兩者之體積比為1：1至3：1。
較佳的，步驟(6)得到的富含Tscm之人類CAR-T細胞中，Tscm數量佔富含Tscm之人類CAR-T細胞數量之比例大於55%，也就是說，經過步驟(6)擴增培養後所得到的所有擴增的人類CAR-T細胞中，含有大於55%的Tscm。更佳的，步驟(6)得到的富含Tscm之人類CAR-T細胞中，Tscm數量佔富含Tscm之人類CAR-T細胞總數量之比例大於60%。更佳的，步驟(6)得到的富含Tscm之人類CAR-T細胞中，Tscm數量佔富含Tscm之人類CAR-T細胞總數量之比例大於70%。再更佳的，步驟(6)得到的富含Tscm之人類CAR-T細胞中，Tscm數量佔富含Tscm之人類CAR-T細胞總數量之比例大於75%。
較佳的，本發明之製備方法進一步包含步驟(7) 冷凍保存所述富含Tscm之人類CAR-T細胞。
本發明的優點在於可以在短時間內，大量擴增T細胞，且使得產出的人類CAR-T細胞富含Tscm，而能進一步分化、具有更長壽命，並能降低CAR-T細胞療法所引起的細胞激素釋放症候群與神經毒性。因此本發明製備方法所產出的人類CAR-T細胞更適合用於CAR-T細胞療法。
本發明以下列的實施例說明，這些實施例並不限制本發明前面所揭示的內容。熟習本發明之技藝者，可以做些許之改良與修飾，但不脫離本發明之範疇。
實施例
在本實施例中，首先於第0天進行
步驟 (1) 提供人類周邊血液單核細胞。具體而言，是收集健康的人類捐贈者之全血，以等量2% 白蛋白/磷酸緩衝生理食鹽水(Albumin/Phosphate buffered saline buffer，Alb/PBS buffer)稀釋、混合均勻後，利用具有隔室之SepMate™-50離心管進行密度梯度離心以分離出人類PBMC。詳細步驟如下：將15毫升(mL)的Ficoll-Paque (GE Healthcare)密度梯度培養基小心地添加至SepMate™-50離心管隔室(insert)之中間孔洞，再將稀釋後之全血沿離心管壁緩慢加入後，放入離心機以1200×g室溫離心20分鐘，並開啟離心機之剎車功能。將上層液倒入新的離心管，再於室溫下進行300×g離心8分鐘；移除上層液，重新以Alb/PBS緩衝液懸浮人類PBMC團塊，調整人類PBMC的濃度為：2至5×10
7個細胞/mL。
其中，細胞數的計算是取細胞懸浮液中的7.5微升(μL)與6 μL的PBS及1.5μL的以吖啶橙/碘化丙啶(Acridine Orange/ Propidium Iodide)染劑混合。接著，以自動螢光細胞計數儀(Automated Fluorescence Cell Counter，LUNA-FL™)計算細胞數目，並記錄存活的細胞數目、細胞存活率及細胞大小，最後計算出細胞懸浮液內的總細胞數。
此外，在進入步驟(2)之前，先檢測人類PBMC中CD3
+T細胞之比例，以計算出步驟(2)所需使用磁珠的數量。具體而言，將1 ×10
5個人類PBMC加入免疫檢測試套組(MACS 8-color immunophenotyping kit)中，4℃下避光反應10分鐘。接著，加入2 mL的2% 人白蛋白/生理食鹽水緩衝液(hAlb/Saline buffer)並以350×g室溫下離心5分鐘，移除上清液後輕敲細胞團塊，以200 μL之2% hAlb/Saline緩衝液重新懸浮細胞團塊，利用流式細胞儀CytoFLEX確認PBMC的亞群分布(subpopulations)，其中CD3
+T細胞比例約為40-70%。
接著，利用以下公式算出人類PBMC中表現有表面抗原CD3
+的細胞數，即人類T細胞的數量：
總PBMC數量 × CD3
+T細胞%= CD3
+T細胞的數量。
進行
步驟 (2) 將磁珠加入所述人類 PBMC ，進行磁性分離，移除人類 PBMC 中的 B 細胞、 NK 細胞及單核球， 得到人類 T 細胞與磁珠 複合物 ，其中，所述磁珠的表面設有抗 CD3 的抗體及抗 CD28 的抗體。具體而言，以2%Alb/PBS緩衝液將人類PBMC重新懸浮於試管中，調整人類T細胞的濃度為2~5×10
7個細胞/mL，但有核細胞總數不超過2×10
8/mL。取人類T細胞數量3倍數量之表面含有抗CD3/CD28抗體的磁珠(Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28；gibco，Cat. No. 11141D)，以2%Alb/PBS緩衝液清洗2遍之後，加入人類PBMC懸浮液中，得到一人類PBMC與磁珠混和物，其中磁珠與人類PBMC中人類T細胞的數量比例為3:1。人類PBMC與磁珠混和物於室溫下以6 rpm旋轉30分鐘後，將試管置於磁座上1到2分鐘，藉由移除上清液以去除人類PBMC中的B細胞、NK細胞及單核球後，即可得到透過抗原-抗體結合所形成之人類T細胞與磁珠複合物。
在進入步驟(3)之前，先計算出與磁珠結合的人類T細胞數量。具體而言，利用5倍人類T細胞與磁珠複合物體積的完全X-VIVO™ 15培養基(其內含有 200 IU/mL之重組人類IL-2 (R&D Systems，Cat No. 202-IL-500)之X-VIVO™ 15培養基)懸浮人類T細胞與磁珠複合物，取出7.5 μL的含有人類T細胞與磁珠複合物的懸浮液與6 μL的PBS緩衝液及1.5 μL的吖啶橙/碘化丙啶染劑混合之後以自動螢光細胞計數儀計算與磁珠結合的人類T細胞數。
接下來，進行
步驟 (3) 將所述人類 T 細胞與磁珠 複合物 培養，進行 T 細胞活化，得到活化之人類 T 細胞與磁珠複合物。具體而言，是將人類T細胞與磁珠複合物以完全X-VIVO™ 15培養基調整人類T細胞濃度為1×10
6個細胞/mL，種於培養角瓶(T-flask)中。在37°C、5%二氧化碳的加濕環境下培養20小時，得到活化之人類T細胞與磁珠複合物。
再來，於實施例進行的第1天，進行
步驟 (4) 將慢病毒加入所述活化之人類 T 細胞與磁珠 複合物中， 進行慢病毒轉染，得到人類 CAR-T 細胞 與磁珠 複合物。具體而言，是將MOI= 0.5~3之慢病毒溶液加入步驟(3)所得的活化之人類T細胞與磁珠複合物中，在不沖散人類T細胞與磁珠的結合狀態為前提下，以能避免破壞細胞活性的溫和的力量與速度均勻混合約30秒後培養於37°C、5%二氧化碳的加濕環境下48小時，進行慢病毒轉染，以得到人類CAR-T細胞與磁珠複合物。
接下來，在實施例進行的第3天，進行
步驟 (5) 自所述人類 CAR-T 細胞與磁珠複合物移除所述磁珠，得到人類 CAR-T 細胞。具體而言，測量包含有人類CAR-T細胞與磁珠複合物之懸浮液的體積，取出7.5 μL包含有人類CAR-T細胞與磁珠複合物的細胞懸浮液與6 μL的PBS緩衝液及1.5 μL的吖啶橙/碘化丙啶染劑混合後，以自動螢光細胞計數儀計算細胞數，並記錄存活的細胞數目、細胞存活率及細胞大小，再計算出總細胞數。將裝有包含人類CAR-T細胞與磁珠複合物之懸浮液之試管置於磁座上1~2分鐘後，取出細胞懸浮液液至新的試管中，此方式進行三次之後，即得到含有人類CAR-T細胞的懸浮液。
在進行步驟(6)之前，先計算收集到的人類CAR-T細胞數量與回收率。具體而言，測量所得到含有人類CAR-T細胞的懸浮液總體積，取7.5μL之含有人類CAR-T細胞的懸浮液與6 μL的PBS及1.5μL的以吖啶橙/碘化丙啶染劑混合。接著以自動螢光細胞計數儀計算細胞數目，並記錄存活的細胞數目、細胞存活率及細胞大小，再計算出包含有人類CAR-T細胞的懸浮液內之總細胞數。最後計算出磁珠移除後的細胞回收率(%)。
最後，進行
步驟 (6) 將人類 CAR-T 細胞進行培養，得到富含 Tscm 之人類 CAR-T 細胞。具體而言，是將步驟(5)所得到之含有人類CAR-T細胞的懸浮液，即含有人類CAR-T細胞的條件培養基，加入新鮮的完全X-VIVO
TM15培養基將人類CAR-T細胞調整為濃度為7×10
5/mL種於培養角瓶內，將培養角瓶培養於37°C、5%二氧化碳的加濕環境下96小時(4天)以獲得擴增的人類CAR-T細胞，即富含Tscm之人類CAR-T細胞。此步驟不僅可獲得擴增的人類CAR-T細胞，且所獲得的產物同時為培養富含Tscm之人類CAR-T細胞。擴增培養期間每2~3天添加部份新的完全X-VIVO
TM15培養基，將CAR-T細胞密度調整為濃度為7×10
5/mL種於培養角瓶內，但應避免將細胞密度過度稀釋達3倍以上。
比較例
比較例與實施例之製備方法步驟類似，差別之處在於比較例之製備方法與實施例之步驟(4)至(6)不同，比較例並未在如實施例步驟(4)進行慢病毒轉染48小時後，進行步驟(5)移除磁珠，而是進行步驟(4’)慢病毒轉染
96 小時後才移除磁珠。亦即，比較例在進行比較例製備方法的第1天進行步驟(4’) 將慢病毒加入所述活化之人類T細胞與磁珠複合物中，於37°C下進行慢病毒
轉染 96 小時，得到人類CAR-T細胞與磁珠複合物，並且在所述慢病毒轉染進行48小時額外補充適當培養基；接著，於比較例進行的第5天進行步驟(5’) 自人類CAR-T細胞與磁珠複合物中之磁珠移除，得到人類CAR-T細胞；最後進行步驟(6’) 將所述人類CAR-T細胞，培養於37°C下96小時，得到擴增的人類CAR- T細胞。
磁珠可以活化刺激、擴增T細胞，因此和實施例相較之下，比較例實際延長了磁珠活化T細胞的時間。
測試例1 測定T細胞擴增倍數
分別取實施例步驟(6)及比較例步驟(6’)獲得之具有擴增的人類CAR-T細胞的細胞懸浮液7.5 μL與6 μL的PBS及1.5μL的以吖啶橙/碘化丙啶染劑混合，接著以自動螢光細胞計數儀計算細胞數目，並記錄存活的細胞數目、細胞存活率及細胞大小，最後計算出總人類CAR-T細胞數目，並與第0天所測得的人類T細胞數量做比較。如圖1所示計算出實施例與比較例於第7天的人類T細胞擴增倍數，及如圖2所示在移除磁珠後培養96小時(4天)所獲得最終之擴增的人類CAR-T細胞的擴增倍數，另外分別列出實施例於第0天、第3天、第6天與第7天；及比較例於第0天、第5天、第6天、第7天、第8天與第9天的人類T細胞總數，如下表1所示。
表1實施例與比較例於製備過程中不同天數的細胞總數目
| 組別/天數 | 第0天 | 第3天 | 第5天 | 第6天 | 第7天 | 第8天 | 第9天 |
| 實施例 | 3.00×10 6 | 2.72×10 6 | 3.09×10 7 | 3.65×10 7 | |||
| 比較例 | 2.82×10 6 | 9.97×10 6 | 9.79×10 6 | 1.97×10 7 | 2.97×10 7 | 6.13×10 7 |
根據圖1、圖2及表1的結果，實施例在第7天可以使收穫的擴增的人類CAR-T細胞總數相較於第0天的人類T細胞總數擴增了12.17倍。而比較例雖然在第9天收穫時的細胞數目、擴增倍數大於實施例在第7天收穫時的細胞數目、擴增倍數；然於第7天時，比較例的細胞數目僅有1.97×10
7遠低於實施例的3.65×10
7，擴增倍數也僅約實施例細胞擴增倍數的一半，僅6.99倍。因此可以證實本發明可以在短時間內使人類T細胞加速生長、大量擴增。
測試例2 測定人類T細胞之不同亞群分布
分別將實施例步驟(6)及比較例步驟(6’)獲得之擴增的人類CAR-T細胞利用螢光標定及流式細胞儀，檢測T細胞表面標誌，包含：CD3、CD4、CD8、CD95、CD45RA、CCR7而測定所獲得的人類T細胞之不同亞群：Tscm、中央記憶T細胞(central memory T cell，T
CM)、效應記憶T細胞(effector memory T cell，T
EM)、最終分化效應記憶T細胞(terminally differentiated effector memory T cell，T
EMRA)的分布。其結果如圖3至5B及表2所示。
表2 實施例與比較例於擴增的人類CAR-T細胞收穫天數之T細胞亞群分布(%)
| T細胞亞群 天數 | Tscm | T CM | T EM | T EMRA |
| 實施例 第7天 | 79.68 | 10.24 | 1.74 | 8.34 |
| 比較例 第9天 | 34.14 | 10.81 | 7.23 | 47.81 |
一般而言，健康的人類血液中，Tscm約佔T細胞的2%至3% (Gattinoni, Luca, et al. "A human memory T cell subset with stem cell–like properties." Nature medicine 17.10 (2011): 1290-1297)。而根據表2、圖3、圖4A及圖4B可知，本發明實施例所得之擴增的人類CAR-T細胞中Tscm所佔比例為79.68%，較比較例之Tscm比例34.14%要高；此外，實施例Tscm總數為2.91×10
7( 3.65×10
7× 79.68% = 2.91×10
7)，而比較例Tscm總數為2.09×10
7(6.13×10
7× 34.14% = 2.09×10
7) ，實施例相較比較例的Tscm增加幅度達到39%。再者，實施例之T
EMRA8.35%較比較例47.81%大幅下降，亦即T細胞仍處於較少分化表現階段，沒有進入衰竭情況，能進一步分化為T
CM、T
EM，且具有較T
CM、T
EM、T
EMRA更長的壽命，並具有自我更新能力。因此本發明實施例所製得之富含Tscm之人類CAR-T細胞較比較例所得之擴增的人類CAR-T細胞更適合用於CAR-T細胞療法。並更能降低CAR-T細胞療法所引起的細胞激素釋放症候群與神經毒性。
綜上，本發明的製備方法所產出的富含Tscm之人類CAR-T細胞，僅需更短的培養時間，即可產出具有高比例、富含幹細胞樣中央記憶型T細胞表型，能進一步分化、具有更長壽命，並能降低CAR-T細胞療法所引起的細胞激素釋放症候群與神經毒性。因此本發明製備方法所產出的富含Tscm之人類CAR-T細胞更適合用於CAR-T細胞療法。
以上所述僅是本發明的較佳實施例而已，並非對本發明做任何形式上的限制；雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然而並非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案的範圍內，當可利用上述揭示的技術內容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明技術方案的範圍內。
無
圖1 為實施例與比較例於第7天的人類T細胞擴增倍數；
圖2 為實施例於第7天與比較例於第9天的人類T細胞擴增倍數；
圖3 為實施例於第7天與比較例於第9天的人類T細胞亞群分布；
圖4A 為實施例於第7天的人類T細胞亞群分布流式細胞儀圖；
圖4B 為比較例於第9天的人類T細胞亞群分布流式細胞儀圖。
無
Claims (10)
- 一種生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其包含： 步驟(1) 提供人類周邊血液單核細胞； 步驟(2) 將磁珠加入所述人類周邊血液單核細胞，進行磁性分離，移除人類周邊血液單核細胞中的B細胞、NK細胞及單核球，得到人類T細胞與磁珠複合物，其中，所述磁珠的表面設有抗CD3的抗體及抗CD28的抗體； 步驟(3) 將所述人類T細胞與磁珠複合物培養16小時至20小時，進行T細胞活化，得到活化之人類T細胞與磁珠複合物； 步驟(4) 將慢病毒加入所述活化之人類T細胞與磁珠複合物，進行慢病毒轉染40小時至48小時，得到人類嵌合抗原受體T細胞與磁珠複合物； 步驟(5) 自所述人類嵌合抗原受體T細胞與磁珠複合物移除所述磁珠，得到人類嵌合抗原受體T細胞；及 步驟(6) 將所述人類嵌合抗原受體T細胞培養92小時至96小時，得到富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞。
- 如請求項1所述之生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其中，所述人類周邊血液單核細胞是分離自人類的全血。
- 如請求項1所述之生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其中，步驟(2)中所述磁珠的數量為所述人類周邊血液單核細胞中人類T細胞數量的2至4倍。
- 如請求項1所述之生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其中，步驟(3)中所述之人類T細胞與磁珠複合物培養於36.5°C至37.5°C下16小時至20小時。
- 如請求項1所述之生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其中，步驟(4)是在36.5°C至37.5°C下進行慢病毒轉染40小時至48小時。
- 如請求項1所述之生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其中，步驟(4)的慢病毒轉染是將抗CD19、抗CD22、抗B細胞成熟抗原或抗間皮素之受體基因轉染至所述人類T細胞與磁珠複合物的人類T細胞中。
- 如請求項1所述之生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其中，步驟(6)是將所述人類嵌合抗原受體T細胞，培養於36.5°C至37.5°C下90小時至96小時。
- 如請求項1所述之生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其中，步驟(3)之人類T細胞與磁珠複合物培養、步驟(4)之慢病毒轉染及步驟及(6)之將人類嵌合抗原受體T細胞進行培養，是使用完全X-VIVO TM15培養基。
- 如請求項1至8任一項所述之生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其中，步驟(6)得到的所述富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的數量為步驟(2)中所述人類T細胞與磁珠複合物中的人類T細胞的數量的10倍以上。
- 如請求項1至8任一項所述之生產富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞的方法，其中，步驟(6)得到的所述富含幹細胞樣中央記憶表型T細胞之人類嵌合抗原受體T細胞中，幹細胞樣中央記憶表型T細胞所佔比例大於55%。
Priority Applications (5)
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