JP2024068112A - 幹細胞様メモリーｔ細胞を高濃度に含有するヒトキメラ抗原受容体ｔ細胞集団の作製方法 - Google Patents

幹細胞様メモリーｔ細胞を高濃度に含有するヒトキメラ抗原受容体ｔ細胞集団の作製方法 Download PDF

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Abstract

【課題】幹細胞様メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）を高濃度に含有するＣＡＲ－Ｔ細胞を作製する方法を提供する。【解決手段】方法は、（１）ＰＢＭＣを用意する工程；（２）Ｔ細胞特異的抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いてＰＢＭＣからＴ細胞を単離する工程；（３）Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体の形態でＴ細胞を培養することでＴ細胞をポジティブセレクションする工程；（４）活性化ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体にＣＡＲ発現レンチウイルスを添加して、ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体上のＣＡＲ－Ｔ細胞にヒトＴ細胞を形質導入することで、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体を得る工程；（５）ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体からヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を解離させることで、該ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を得る工程；および（６）ＣＡＲ－Ｔ細胞をさらに培養して、Ｔｓｃｍを高濃度に含有するＣＡＲ－Ｔ細胞を得る工程を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、ヒトキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の作製方法に関し、特に幹細胞様メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）を高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の作製方法に関する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、遺伝子編集技術を用いて、腫瘍細胞の表面抗原を認識できる受容体をＴ細胞が発現できるようにする治療法である。改変Ｔ細胞を人体に注入し戻すと、改変Ｔ細胞は腫瘍細胞を認識し死滅させることができる。
しかし、この治療法にも副作用があり、最も重篤な副作用はサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）である。ＣＲＳとは、ＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍細胞と戦う際に大量のサイトカインが放出され、その結果、過剰な炎症、微小血管の漏出、および凝固につながる連鎖反応の惹起が生じるものと説明される。さらに、心不全、肺不全、腎不全、脳腫脹といった生命を脅かすイベントを引き起こす可能性もある。一般的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞にＴｓｃｍが豊富に存在すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞の人体での生存期間が延長され、治療効果が高まり、ＣＲＳや神経毒性の発生率や重症度が低下すると考えられている。
しかし、人体の末梢血に占めるＴｓｃｍ細胞の割合は、わずか１％～５％程度である。従来のＣＡＲ－Ｔ細胞作製法では、Ｔｓｃｍ細胞の割合および数が多いＣＡＲ－Ｔを効果的に生成することができない。従来法で調製されたＣＡＲ－Ｔ内のＴｓｃｍの割合は十分に高いものではないことから、当該治療は重篤なＣＲＳや神経毒性を引き起こすリスクが高いばかりでなく、ｉｎ ｖｉｖｏでの寿命短縮に関連する有効性の低下にも繋がっている。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するのに必要な作製時間も長く、治療に十分なＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するには９～１４日かかる。
国際公開第２０２０／０４７４５２号
既存の作製技術の欠点を克服するために、本発明は、Ｔｓｃｍも高濃度に含有する十分なＣＡＲ－Ｔ細胞を短い作製期間で作製する方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、幹細胞様メモリーＴ細胞を高濃度に含有するヒトキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞を作製する方法であって、（１）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用意する工程；（２）抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁気ビーズを、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および単球も含む上記ヒトＰＢＭＣと混合することによりヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を形成して、上記ヒトＰＢＭＣからヒトＴ細胞をポジティブセレクションする工程；（３）上記ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を１６時間～２０時間培養してＴ細胞を活性化することで、活性化ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を得る工程；（４）上記活性化ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体にＣＡＲ発現レンチウイルスを４０時間～４８時間添加して、上記ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体上のＣＡＲ－Ｔ細胞にヒトＴ細胞を形質導入することで、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体を得る工程；（５）上記ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体からヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を解離させることで、該ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞（磁気ビーズなし）を得る工程；（６）上記ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を９２時間～９６時間さらに培養して、上記Ｔｓｃｍを高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を得る工程を含む方法を提供する。
本発明では、ヒトＴ細胞と磁気ビーズとの接触時間を制御することにより、７日間の培養により作製されたヒトＣＡＲ－Ｔ細胞が最大の増殖率を示し、かつＴｓｃｍを高濃度に含有していた。本発明は、既存の技術を用いて調製されたヒトＣＡＲ－Ｔ細胞よりも免疫機能が高く、したがってＣＡＲ－Ｔ免疫療法により適したヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する方法を提供する。
本発明によれば、工程（１）におけるヒトＰＢＭＣは、ヒト末梢血または白血球アフェレーシス産物のいずれかから単離され、当該ＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および単球などの細胞を含む。
本発明によれば、本明細書に記載のヒトＰＢＭＣの供給源は、健常ドナーまたは癌患者由来とすることができる。
本発明によれば、磁気ビーズはヒトＴ細胞を活性化することができる。好ましくは、磁気ビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１４１Ｄ）またはＣＴＳＴＭ（Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ，ＣＡＴ．Ｎｏ．４０２０３Ｄ）である。
好ましくは、工程（２）における抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁気ビーズの数は、ヒトＰＢＭＣ中のヒトＴ細胞の数の２～４倍である。より好ましくは、磁気ビーズの数は、ヒトＰＢＭＣ中のヒトＴ細胞の数の３倍である。
好ましくは、工程（３）および（４）における培養フラスコの培養面積（ｃｍ２）に対する完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地の総量（ｍＬ）の比は、０．１２ｍＬ／ｃｍ２～０．３ｍＬ／ｃｍ２である。すなわち、培地は、培養フラスコに充填されたとき、０．１２ｍＬ／ｃｍ２～０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積対表面積比を有する。より好ましくは、工程（３）および（４）における培養フラスコの培養面積に対する完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地の総量の比は、０．２ｍＬ／ｃｍ２～０．２７ｍＬ／ｃｍ２である。例えば、培養フラスコの培養面積が７５ｃｍ２の場合、適用するＸ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地の総量は９ｍＬ～２２．５ｍＬである。より好ましくは、培養フラスコの培養面積が７５ｃｍ２である場合、適用する完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地は１５ｍＬ～２０．２５ｍＬである。
好ましくは、工程（２）における磁気ビーズの数をヒトＰＢＭＣ中のヒトＴ細胞の数の２～４倍となるように制御すると同時に、工程（３）および（４）におけるフラスコの培養面積に対する完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地の総量の比を０．１２ｍＬ／ｃｍ２～０．３ｍＬ／ｃｍ２となるように制御する。すなわち、工程（２）におけるヒトＴ細胞と磁気ビーズの接触時間、磁気ビーズとヒトＴ細胞との比、ならびに工程（３）および（４）における完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地量と培養フラスコの培養面積との比を同時に制御することで、Ｔ細胞を短期間で何倍にも増殖させ、大きな集団をＴｓｃｍとすることができる。
好ましくは、工程（３）におけるヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を３６．５℃～３７．５℃で１６時間～２０時間培養する。例えば、１６時間～１９時間、または１７時間～１９時間とすることができる。より好ましくは、工程（３）におけるヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を、５％ＣＯ２を含む加湿環境下、３７℃で１８時間インキュベートする。
好ましくは、工程（４）におけるレンチウイルス形質導入を３６．５℃～３７．５℃で４０時間～５６時間行う。より好ましくは、工程（４）におけるレンチウイルストランスフェクションを、５％ＣＯ２を含む加湿環境下、３７℃で４８時間行う。
好ましくは、工程（６）において、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を３６．５℃～３７．５℃で９２時間～９６時間培養する。より好ましくは、工程（６）において、ヒトＴ細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿環境下、３７℃で９６時間培養する。
好ましくは、工程（３）におけるヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体の培養、工程（４）におけるレンチウイルス形質導入、および工程（６）におけるヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の培養は、ＩＬ－２を含む完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．０４－４１８Ｑ）培地を用いて行い、完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地中のＩＬ－２濃度は２００ＩＵ／ｍＬである。
本発明によれば、完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地とは、組換えヒトＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ Ｎｏ．２０２－ＩＬ－５００）を２００ＩＵ／ｍＬ含むＸ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地である。
好ましくは、工程（４）におけるレンチウイルス形質導入とは、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）または抗メソテリン受容体配列を含む遺伝子をヒトＴ細胞に形質導入することである。
好ましくは、工程（６）で得られるＴｓｃｍを高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞集団中のヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の数は、工程（２）におけるヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体中のヒトＴ細胞の数、すなわち工程（２）において磁気ビーズを用いて単離されたヒトＴ細胞の数の１０倍を超える。すなわち、工程（６）における培養増殖により得られるヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の数は、工程（２）におけるヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体中のヒトＴ細胞の数の１０倍を超える。より好ましくは、工程（６）において得られるＴｓｃｍを高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の数は、工程（２）におけるヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体中のヒトＴ細胞の数の２０倍を超える。さらに好ましくは、工程（６）において得られるＴｓｃｍを高濃度で含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の数は、工程（２）におけるヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体中のヒトＴ細胞の数の３０倍を超える。
好ましくは、工程（６）におけるヒトＣＡＲ－Ｔの培養は、培地混合物を用いて行い、培地混合物は、新鮮な完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地と、工程（５）で得られたヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の条件培地とを含む混合物である。すなわち、工程（１）～工程（５）を経たヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の培養で得られた条件培地に、新鮮な完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地を加える。好ましくは、新鮮な完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地と工程（５）で得られたヒトＣＡＲ－Ｔ細胞による条件培地の体積比は、１：１～３：１である。
好ましくは、工程（６）で得られたＴｓｃｍを高濃度で含有するＴｓｃｍ高含有ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のうち、Ｔｓｃｍの割合は５５％を超える。すなわち、工程（６）における培養増殖後に得られた全ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のうち、５５％超がＴｓｃｍである。より好ましくは、工程（６）で得られたＴｓｃｍを高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のうち、Ｔｓｃｍの割合は６０％を超える。より好ましくは、工程（６）で得られたＴｓｃｍを高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のうち、Ｔｓｃｍの割合は７０％を超える。さらに好ましくは、工程（６）で得られたＴｓｃｍを高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞では、Ｔｓｃｍの割合が７５％を超える。
好ましくは、本発明はさらに、（７）上記Ｔｓｃｍを高濃度で含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を凍結保存する工程を含む。
本発明の利点は、短期間でのＴ細胞の十分な増殖をもたらし、Ｔｓｃｍに富むヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するＣＡＲ－Ｔの製造手順にあり、得られたＣＡＲ－Ｔ細胞はさらに分化することができ、寿命が長く、ＣＲＳや神経毒性などの副作用を引き起こしにくい。したがって、本発明の方法によって作製されたヒトＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法により適している。
図１は、実施例および比較例について、０日目と比較した７日目のヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖倍率を示す。 図２は、０日目と比較した、実施例の７日目および比較例の９日目のヒトＴ細胞の増殖倍率を示す。 図３は、実施例の７日目および比較例の９日目のヒトＴ細胞亜集団を示す。 図４Ａは、実施例の７日目のヒトＴ細胞亜集団のフローサイトメトリーである。 図４Ｂは、比較例の９日目のヒトＴ細胞亜集団のフローサイトメトリーである。
本発明の所定の目的を達成するために採用した技術的手段を、添付の図面ならびに以下の本発明の調製例および実施例を通してさらに説明する。本明細書中で提案された記載は、例示のみを目的とした好ましい例に過ぎず、本開示の範囲を限定することを意図したものではないことを理解されたい。本開示の精神および範囲から逸脱することなく本開示を実施または適用するために、種々の修飾および変更がなされ得る。
実施例
まず、工程（１）では、０日目にヒトＰＢＭＣを用意した。具体的には、健常人ドナーの全血を採取し、等量の２％アルブミン／リン酸緩衝生理食塩水緩衝液（Ａｌｂ／ＰＢＳ緩衝液）と均一に混合し、希釈した全血サンプルを得た。その後、インサートを含むＳｅｐＭａｔｅＴＭ－５０チューブを用いて、密度勾配遠心分離により、希釈した全血サンプルからヒトＰＢＭＣを単離した。詳しい手順を以下に示す。ＳｅｐＭａｔｅＴＭインサートの中央の穴から慎重にピペッティングすることで、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｒ）－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ密度勾配培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１５ｍＬをＳｅｐＭａｔｅＴＭ－５０チューブに添加した。次に、希釈した全血サンプルをＳｅｐＭａｔｅＴＭ－５０チューブの側面にピペッティングすることでゆっくりと添加した。ＳｅｐＭａｔｅＴＭ－５０チューブを、遠心分離機を使用し、１２００×ｇ、室温で２０分間ブレーキをオンにして遠心分離した。遠心分離後、ヒトＰＢＭＣを含むと思われる上層を新しいチューブに注いでから、３００×ｇ、室温で８分間遠心分離した。その後、上清を捨て、ヒトＰＢＭＣ細胞ペレットを適量の２％Ａｌｂ／ＰＢＳ緩衝液で再懸濁して、ヒトＰＢＭＣ濃度を２～５×１０７細胞／ｍＬに調整した。
細胞数の計測は、まず細胞懸濁液７．５μＬをサンプリングし、ピペッティングによりＰＢＳ緩衝液６μＬおよびアクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム染色液１．５μＬと混合することによって行った。その後、ＬＵＮＡ－ＦＬＴＭ自動蛍光セルカウンターを用いて、細胞サンプルの密度、生存率およびサイズを測定した。懸濁液中の総細胞数は、生存細胞密度と細胞懸濁液の総量との乗算により算出した。
さらに、工程（２）を行う前に、工程（２）に必要な磁気ビーズ数を算出するためにヒトＰＢＭＣ中のＣＤ３＋Ｔ細胞の割合を知る必要があった。このため、ＭＡＣＳ ８－ｃｏｌｏｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｃｏｃｋｔａｉｌ １０μＬおよび７－ＡＡＤ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ １μＬを用いて、４℃の暗所で１０分間共インキュベートすることで、１×１０５個のＰＢＭＣを染色した。２％ｈＡｌｂ／生理食塩水緩衝液２ｍＬを添加して細胞を洗浄した後、３５０×ｇ、室温で５分間遠心分離した。その後、上清を捨て、細胞ペレットを軽く叩き、２％Ａｌｂ／生理食塩水緩衝液２００μＬで再懸濁した。フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を用いてＰＢＭＣの細胞亜集団を分析したが、ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合はおおよそ４０％～７０％程度であった。
ヒトＰＢＭＣ中の表面抗原ＣＤ３＋を示す細胞の数、すなわちヒトＴ細胞の数の算出には、下記式を適用した。
全ＰＢＭＣ×ＣＤ３＋Ｔ細胞％＝ＣＤ３＋Ｔ細胞数
次に、工程（２）では、抗体でコーティングされた磁気ビーズをヒトＰＢＭＣと混合して、ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を形成することにより、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および単球も含むヒトＰＢＭＣからＴ細胞をポジティブセレクションしたが、磁気ビーズは抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされていた。具体的には、２％ｈＡｌｂ／ＰＢＳ緩衝液をチューブに加えてヒトＰＢＭＣを再懸濁して、最大で１ｍＬ当たりの総有核細胞（ＰＢＭＣ）数が２×１０８個を超えることなく、ヒトＴ細胞密度を２～５×１０７細胞／ｍＬに調整した。ＰＢＭＣと混合する前に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８：Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１４１Ｄ）でコーティングされた磁気ビーズを２％Ａｌｂ／ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。磁気ビーズをヒトＰＢＭＣ懸濁液に加えて、ヒトＰＢＭＣと磁気ビーズとの混合物を得たが、磁気ビーズ数とヒトＴ細胞数との比は３：１であった。ヒトＰＢＭＣおよび磁気ビーズは、チューブを６ｒｐｍ、室温で３０分間回転させて混合した。混合後、ヒトＰＢＭＣおよび磁気ビーズを含むチューブを磁石の中に１～２分間入れた後、ヒトＰＢＭＣ中のＢ細胞、ＮＫ細胞および単球などの未結合細胞を含む上清を捨てた。ＣＤ３を発現するほとんどのヒトＴ細胞は、抗原抗体相互作用によって磁気ビーズに結合し、この工程により得られるＴ細胞－磁気ビーズ複合体を形成する。
工程（３）の前に、磁気ビーズに結合したヒトＴ細胞数を算出した。完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地（組換えヒトＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ Ｎｏ．２０２－ＩＬ－５００）を２００ＩＵ／ｍＬ含むＸ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地）をヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体サンプルの懸濁液量の５倍量添加して、ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体の密度を再調整した。ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を含む懸濁液７．５μＬをサンプリングし、ＰＢＳ緩衝液６μＬおよびアクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム染色液１．５μＬと混合した。その後、磁気ビーズに結合したヒトＴ細胞数を自動蛍光セルカウンターで測定した。
工程（３）では、ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を１６～２０時間培養してＴ細胞を活性化することで、活性化ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を得た。具体的には、適量の完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地を用いてＴ字フラスコ内のヒトＴ細胞密度が１×１０６個／ｍＬになるようにヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を培養し、５％ＣＯ２を含む加湿環境下、３７℃で２０時間インキュベートすることで、活性化ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を得た。
次に、本実施例の１日目に、工程（４）で、活性化ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体の培養物にＣＡＲ発現レンチウイルスを添加して、細胞－磁気ビーズ複合体上のＣＡＲ－Ｔ細胞にヒトＴ細胞を形質導入した。具体的には、ヒトＴ細胞と磁気ビーズとが解離しないように軽い力および穏やかな速度で均一に混合することで、工程（３）で得られた活性化ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体の培養物に感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）０．５～３でレンチウイルスを添加した。３０秒間混合後、再び培養物を、５％ＣＯ２を含む加湿環境下、３７℃でさらに４８時間インキュベートしてレンチウイルスを形質導入することで、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体を生成した。
本実施例の３日目に、工程（５）で、解離によりヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体からヒトＣＡＲ－Ｔ細胞（磁気ビーズなし）を得た。まず、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体培養物の総量を測定した。次に、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体培養物７．５μＬをサンプリングし、ＰＢＳ緩衝液６μＬおよびアクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム染色液１．５μＬと混合した。ＬＵＮＡ－ＦＬＴＭ自動蛍光セルカウンターを用いて、細胞サンプルの密度、生存率およびサイズを測定した。懸濁液中のヒトＣＡＲ－Ｔ細胞（ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体の状態）の総数は、生存細胞密度とヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体培養物の総量との乗算により算出した。ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体を含む細胞懸濁液を含むチューブを静かにピペッティングしてＣＡＲ－Ｔ細胞と磁気ビーズとを解離させた後、磁石の中に１～２分間入れて、細胞サンプルから磁気ビーズを固定し除去できるようにした。この工程を３回繰り返すことで、細胞サンプルから磁気ビーズを十分に除去して、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のみからなる細胞懸濁液を採取することができた。
工程（６）の前に、ＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体培養物から得たヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の数および回収率を算出した。具体的には、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞懸濁液の総量を求めた。ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を含む懸濁液７．５μＬをサンプリングし、ＰＢＳ緩衝液６μＬおよびアクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム染色液１．５μＬと混合した。その後、ＬＵＮＡ－ＦＬＴＭ自動蛍光セルカウンターを用いて、細胞サンプルの密度、生存率およびサイズを測定した。懸濁液中のＣＡＲ－Ｔ細胞の総数は、生存細胞密度とヒトＣＡＲ－Ｔ細胞懸濁液の総量との乗算により算出した。これとともに、磁気ビーズ除去手順の細胞回収率（％）も求めた。
最後に、工程（６）では、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞をさらに培養して、Ｔｓｃｍを高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。具体的には、懸濁液中にヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を含むヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の元の条件培地に新鮮な完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地を添加して、Ｔフラスコ内の細胞密度を７×１０５細胞／ｍＬに調整した。該Ｔフラスコを、５％ＣＯ２を含む加湿環境下、３７℃で合計９６時間（４日間）インキュベートした。この工程中、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞がさらに増殖するだけでなく、そのＴｓｃｍ集団も高濃度化する。当該工程で得られた産物が、Ｔｓｃｍを高濃度で含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞である。また、同じフラスコ内のＣＡＲ－Ｔ細胞密度を７×１０５細胞／ｍＬに維持するために、２～３日ごとに条件培地に適量の新鮮な完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地を追加した。ここで、新鮮な完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地を添加して細胞密度を調整する際は、３倍希釈未満に希釈することが好ましい。
比較例
比較例の方法は、工程（４）～工程（６）間を除き、実施例と同様であった。実施例では、工程（５）の磁気ビーズの除去は、工程（４）に示したようにレンチウイルス形質導入を４８時間行った後に行った。一方、比較例では、９６時間のレンチウイルス形質導入の後まで磁気ビーズを除去しなかった。すなわち、比較例の方法は、（４’）活性化ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体の培養物にレンチウイルスを９６時間添加して、細胞－磁気ビーズ複合体上のＣＡＲ－Ｔ細胞にヒトＴ細胞を形質導入する工程であり、該工程は比較例の作製１日目に実施した。追加の培地は、レンチウイルス形質導入開始の４８時間後にも供給した。その後、（５’）ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体から磁気ビーズを除去して、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を得る工程を、比較例の作製５日目に行った。最後に、（６’）ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を３７℃で９６時間培養して、増殖ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を得る工程を行った。
磁気ビーズはＴ細胞を活性化、刺激および増殖させることができるため、実施例と比較すると、比較例のＴ細胞は実際に磁気ビーズによってより長時間活性化された。
試験例１ Ｔ細胞の増殖倍率の決定
実施例の工程（６）および比較例の工程（６’）で得られた増殖ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を含む細胞懸濁液７．５μＬをサンプリングし、それぞれＰＢＳ緩衝液６μＬおよびアクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム染色液１．５μＬと混合した。その後、ＬＵＮＡ－ＦＬＴＭ自動蛍光セルカウンターを用いて、細胞サンプルの密度、生存率およびサイズを測定した。実施例および比較例におけるヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の総数を、生存細胞密度と細胞懸濁液の総量との乗算により算出し、それぞれ０日目に測定した総ヒトＴ細胞数と比較した。図１は、実施例および比較例の培養７日目における増殖倍率の結果を示す。図２は、実施例（７日目）および比較例（９日目）について、磁気ビーズ除去後、９６時間（４日間）の培養後に得られた増殖ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖倍率の結果を示す。また、０日目、３日目、６日目および７日目の実施例のヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の総数、ならびに０日目、５日目、６日目、７日目、８日目および９日目の比較例のヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の総数を下記表１に示す。
Figure 2024068112000002
図１、図２および表１の結果によれば、実施例の７日目に得られた増殖ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の総数は、０日目のヒトＴ細胞の総数に対して増殖倍率が１２．１７であった。比較例の９日目に得られた総細胞数および増殖倍率は実施例の７日目よりも高いものの、比較例の７日目の総細胞数は１．９７×１０７であり、実施例（３．６５×１０７）よりもはるかに低い。また、比較例の０日目に対する７日目の増殖倍率６．９９は、実施例の約半分にすぎない。したがって、本発明により、Ｔ細胞をより急速に成長させ、著しく増殖させることができることが示されている。
試験例２ ヒトＴ細胞亜集団の特徴付け
実施例の工程（６）および比較例の工程（６’）で得られた増殖ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の表面マーカーを蛍光標識した後、フローサイトメトリーにより分析して、Ｔｓｃｍ、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）および最終分化型エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ）を含むヒトＴ細胞亜集団を特徴付けした。結果を図３、４Ａ、４Ｂおよび表２に示す。
Figure 2024068112000003
健常ドナーの全血中では、Ｔｓｃｍは通常、全Ｔ細胞集団の２％～３％である（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌｕｃａ，ｅｔ ａｌ．“Ａ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔ ｗｉｔｈ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．” Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７．１０（２０１１）：１２９０－１２９７）。表２、図３、図４Ａおよび図４Ｂの結果によれば、Ｔｓｃｍは、実施例において増殖ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の７９．６８％であり、比較例におけるＴｓｃｍの割合３４．１４％よりはるかに高い。また、実施例のＴｓｃｍ総数は２．９１×１０７個（３．６５×１０７×７９．６８％＝２．９１×１０７個）であるのに対し、比較例のＴｓｃｍ総数は２．０９×１０７個（６．１３×１０７×３４．１４％＝２．０９×１０７個）であり、実施例と比較例とではＴｓｃｍの割合に３９％の差があることが分かる。さらに、実施例のＴＥＭＲＡの割合は８．３５％であり、比較例（４７．８１％）より著しく低い。これは、概念的には、実施例のＴ細胞の大部分は、より分化度が低い状態であり、老化していない可能性が高いため、ＴＣＭやＴＥＭにさらに分化する能力を保持し、ＴＣＭ、ＴＥＭおよびＴＥＭＲＡよりも寿命が長く、自己再生能力も有すると思われることを意味する。結果として、本発明の実施例で作製したものなどのＴｓｃｍ集団を高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞は、比較例として作製したものと比較して、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法により適している。また、本発明を用いて作製したヒトＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法によって誘発されるＣＲＳや神経毒性の副作用を軽減できる可能性がある。
要約すると、本発明の方法は、Ｔｓｃｍ集団を高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞をより短期間で作製することができる。作製したヒトＣＡＲ－Ｔ細胞はＴｓｃｍの割合が高いため、さらに分化する能力が高く、寿命が長く、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法によって誘発されるＣＲＳや神経毒性の副作用を軽減できる可能性がある。したがって、本発明の方法により作製したヒトＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法により適している。
上記の実施形態は、本発明の好ましい実施形態に過ぎず、いかなる側面においても本発明を限定することを意図するものではない。本発明により主張される権利の範囲は、特許請求の範囲に基づくものとする。

Claims (10)

  1. 幹細胞様メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）を高濃度に含有するヒトキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞を作製する方法であって、
    （１）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用意する工程；
    （２）抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁気ビーズを上記ヒトＰＢＭＣと混合することによりヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を形成して、上記ヒトＰＢＭＣからヒトＴ細胞をポジティブセレクションする工程；
    （３）上記ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を１６時間～２０時間培養してＴ細胞を活性化することで、活性化ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体を得る工程；
    （４）上記活性化ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体にＣＡＲ発現レンチウイルスを４０時間～４８時間添加して、上記ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体上のＣＡＲ－Ｔ細胞にヒトＴ細胞を形質導入することで、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体を得る工程；
    （５）上記ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞－磁気ビーズ複合体からヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を解離させることで、該ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を得る工程；および
    （６）上記ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を９２時間～９６時間さらに培養して、上記Ｔｓｃｍを高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を得る工程
    を含む方法。
  2. 工程（１）における上記ヒトＰＢＭＣは、ヒト全血または白血球アフェレーシス産物から単離することで採取される、請求項１に記載の方法。
  3. 工程（２）における上記抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁気ビーズの数は、上記ヒトＰＢＭＣ中のヒトＴ細胞の数の２～４倍である、請求項１に記載の方法。
  4. 工程（３）における上記ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体は、３６．５℃～３７．５℃で１６時間～２０時間培養される、請求項１に記載の方法。
  5. 工程（４）における上記形質導入は、３６．５℃～３７．５℃で４０時間～４８時間実施される、請求項１に記載の方法。
  6. 工程（４）における上記形質導入は、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）または抗メソテリン受容体配列を含む遺伝子のヒトＴ細胞への形質導入である、請求項１に記載の方法。
  7. 工程（６）において上記ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を３６．５℃～３７．５℃で９２時間～９６時間培養する、請求項１に記載の方法。
  8. 工程（３）における上記ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体の培養、工程（４）における上記ヒトＴ細胞－磁気ビーズ複合体上のＣＡＲ－Ｔ細胞へのヒトＴ細胞の形質導入、および工程（６）における上記ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のさらなる培養は、完全Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５培地で行われる、請求項１に記載の方法。
  9. 工程（６）で得られた上記Ｔｓｃｍを高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の数は、工程（２）において磁気ビーズを用いてポジティブセレクションされたヒトＴ細胞の数の１０倍を超える、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 工程（６）で得られた上記Ｔｓｃｍを高濃度に含有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のＴｓｃｍの割合は５５％より高い、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
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