WO2000041561A1

WO2000041561A1 - Modele murin ne repondant pas aux composants cellulaires bacteriens

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Publication number: WO2000041561A1
Application number: PCT/JP2000/000132
Authority: WO
Inventors: Shizuo Akira; Osamu Takeuchi; Kiyoshi Takeda
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation
Priority date: 1999-01-14
Filing date: 2000-01-13
Publication date: 2000-07-20
Also published as: DE60042986D1; DE60039964D1; AU777334B2; CA2509345C; CA2368217C; ATE405155T1; ATE442774T1; AU2003700A; JP2006101884A; CA2368217A1; EP1142472A1; EP1716752B1; JP4197580B2; EP1716752A1; EP1142472B1; EP1142472A4; JP4070216B2; US7078585B1; CA2509345A1

Description

明細細菌菌体成分不応答性モデルマウス技術分野

本発明は、マイコプラズマ属、スピロヘータ属、ェセリシァ属等に属する細菌の菌体成分であるリポタンパク Zリポペプチドや、グラム陽性菌の細胞壁画分であるべプチドグリ力ンゃグラム陰性菌の細胞壁画分であるエンドトキシン等の細菌菌体成分に不応答性のモデル非ヒト動物に関し、またこれら細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物を用いた細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質や、 T L R 2に対するァゴニストやアン夕ゴニストのスクリーニング方法等に関する。背景技術

免疫反応や感染時の応答、造血、ウィルス感染や腫瘍細胞の障害に重要な役割を果たしている細胞間シグナル伝達物質であるサイトカインの中でも、リンパ球間でシグナルを伝え合うサイトカインはインターロイキン（以下「 I L」という）と呼ばれている。この I Lの中で、 I L 一 1 は、様々な免疫反応や炎症反応を介しているサイト力インであり、生体の恒常性維持に関与し、感染時や傷を受けた際に単球、マクロファージ、ケラチノサイト、血管内皮細胞等種々の細胞から産生される。 I L - 1 には、同一のレセプ夕一に結合する I L 一 1 ひと I L— 1 ;3の 2種類が存在することが知られている。また、 I L— 1 は、 T細胞の抗原やマイトジェンによる活性化の際に同時に働き、 T細胞から I L 一 2を分泌させ I L 一 2 レセプ夕一の発現を増強して T細胞の増殖を誘導することや、単球やマクロファージに作用し T N F — tt 、 I L— 1 、 I L 一 6 の産生を誘導することも知られている。

1 ー 1には、その受容体である 2種類の I L一 1 レセプター（以下「 I L— 1 R」という）があり、タイプ I及びタイプ IIのどちらの I L 一 1 Rもィムノグロブリン様ドメインが細胞外ドメインに 3力所存在し、タイプ I レセプ夕一は T細胞や結合組織で、タイプ II レセプ夕一は脾臓 B細胞や骨髄細胞等で発現され、タイプ I レセプ夕一は N F— κ Βを核内で誘導することが知られている。また、 I L一 1 Rに I L— 1 αや I L - 1 3と同程度の親和力で結合するが、生物活性を有さない I L一 1 レセプ夕一アン夕ゴニスト（以下「 I L— l r a」という）があり、 I L一 1の I L一 1 Rへの結合を競合的に阻害することも知られている。

I L— 1 8は、インターフェロンーァ（以下「 I F N—ァ」という）の生成を促進し、ナチュラルキラ一細胞の活性を高め、 I L一 1 2と共働して T細胞から I F N—ァの生成を誘導し、 T h l ( I L— 2産生性ヘルパー T細胞）応答における重要な役割を果たすことや、機能が似ている I L一 1 2とは構造的に異なり、 I L— 1 とは類似の構造を有することが知られている。また、 I L一 1 8は、 I L一 1 3の場合と同様に，その成熟化のために I L一 1 3変換酵素（ I C E) Zカスパーゼ 1 による分割を必要とする不活性先駆体として産生され、また I L一 1 R—関連キナーゼ（ I RAK) 及び N F— / c Bを活性化することも知られている。

また、これまでに I L一 1 Rと相同性を示す分子が複数同定されており、現在これら I L一 1 Rフアミリ一を介するシグナル伝達経路が盛んに研究されている。 M y D 8 8は、 I L— 1 R相同領域と D e a t h ドメインからなる細胞質内夕ンパク質であり、 I L一 1刺激後の I L一 1 Rコンプレックスへ I R A Kを取込んで、 N F— κ Bを活性化するァダプター分子として機能することも知られている。また、 My D 8 8遺伝子は、当初、 I L一 6による刺激分化により、骨髄白血球細胞 M l をマク口ファージへ速やかに誘導する骨髄細胞分化初期応答遺伝子として分離されたことも知られている。

また、グラム陰性細菌表層のぺプチドグリカンを取り囲んで存在する外膜の重要構成成分であるリポ多糖からなる菌体内毒素はエンドトキシンと呼ばれ、リポ多糖はリピド Aと呼ばれる脂質とこれに共有結合した各種の糖から構成されることが知られている。そして、このエンドトキシンは、主として発熱、白血球や血小板の減少、骨髄出血壊死、血糖低下、 I F N誘発、 Bリンパ球（骨髄由来免疫応答細胞）の活性化等の生物活性を有することも知られている。

一方、トール（T o 1 1 ) 遺伝子は、ショウジヨウバエの胚発生中の背腹軸の決定 (Cell 52, 269-279, 1988、 Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996)、また成体における抗真菌性免疫応答に必要であることが知られている（Cell 86, 973-983, 1996)。かかる T o 1 1 は、細胞外領域にロイシンリッチリピート（L R R) を有する I 型膜貫通受容体であり、この細胞質内領域は、哺乳類インタ一ロイキン一 1受容体（ I L - 1 R ) の細胞質内領域と相同性が高いことが明らかとなっている (Nature 351, 355-356, 1991、 Annu. Rev. Cell Dev. Biol.12, 393-416, 1996、 J. Leuko Biol.63, 650-657, 1998)。他の T o l 1 ファミリーメンバ一である 1 8 — wh e e 1 e rは、抗菌ホスト防御に関わっているが抗真菌性免疫応答には関わらないことが明らかになつており、 T o 1 1経路の選択的活性を介し、ショウジョゥバエにおいて特定の病原体が特異的抗菌性免疫応答を誘導することも明らかとなっている（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14614-14619, 1997、 EMBO J.16, 6120-6130, 1997、 Curr. Opin. Immunol. 11, 13-18， 1999)。

近年、 T o l l 様受容体（T L R) と呼ばれる T ο 1 1 の哺乳類のホモログが同定され、 T L R 2や T L R 4など現在までに 6つのファミリ —力報告されている (Nature 388, 394-397, 1997、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-593, 1998、 Blood 91, 4020-4027， 1998、 Gene 231, 59-65, 1999)。この T L Rファミリ一は、上記 I L— 1 Rと同様にシグナル伝達分子としてのアダプタ一タンパク質である前記 My D 8 8を介し、 I L一 1 R結合キナーゼ（ I RAK) をリクルートし、 T RAF 6 を活性化し、下流の N F— κ Bを活性化することが知られている（J. Exp. Med. 187, 2097-2101, 1998、 Mol. Cell 2, 253-258, 1998、 Immunity 11， 115-122, 1999)。また、哺乳類における T L Rファミリーの役割は、細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体（ P R R ： pattern recognition receptor) として、先天的な免疫認識に関わっているとも考えられてレる（Cell 91, 295-298, 1997)。

上記 P R Rにより認識される病原体会合分子パターン（P AM P ： pathogen-associated molecular pattern) の一つ vよ、グフム陰' 14菌の外膜の主成分であるリポ多糖（ L P S ) であって（Cell 91, 295-298, 1997)、かかる L P Sが宿主細胞を刺激して宿主細胞に TN F— 《、 I L一 1及び I L一 6等の各種炎症性（proinflammatory) サイト力インを産生させること (Adv. Immunol.28, 293-450, 1979、 Annu. Rev. Immunol.13， 437-457, 1995) や、 L P S結合タンパク質（ L B P ： LPS-binding protein) により捕獲された L P Sが細胞表面上の C D 1 4に引き渡されること力知られている (Science 249, 1431-1433, 1990、 Annu. Rev. Immunol.13, 437-457, 1995)。しかしながら、 C D 1 4は膜貫通ドメィンのないグリコシルホスファチジルイノシトール（G P I ) アンカー夕ンパク質であり、 L P Sに対する真のシグナル伝達受容体の存在が考えられている。

上記 T L Rファミリ一に属する T L R 4はグラム陰性菌菌体成分である L P Sのシグナル伝達分子であり、かかる T L R 4をトランスフエクシヨンすると、 N F— κ Bの持続的低活性化をもたらす（J. Exp. Med. 188, 2091-2097, 1998、 Nature 395, 284-288, 1998)。他方、 T L R 2 もインビトロでヒト胎児腎臓 2 9 3細胞（human embryonic kidney 293 cells) に過剰発現させると L P Sのシグナルを細胞内に伝えることから、 L P Sレセプターの候補であると考えられていた。また、 Godawski のグループは、ヒト TL R 2が CD 1 4と相互作用して L P S受容体複合体を形成すると報告している（J. Immunol.163， 639-643， 1999)。 L P Sでの刺激処理は受容体をオリゴマ一化し、次に I R AKを受容体複合体に動員する。これとは対照的に、 Poltorak らと Qureshiらのグループは、ポジショナルクロ一ニング法により、 T L R 4が C 3 H Z H e Jマウスの L P S低応答性に関する原因遺伝子（causative gene)、すなわち L p s遺伝子であることを報告している（Science 282, 2085-2088, 1998, J. Exp. Med.189, 615-625, 1999)。

本発明者らは、 TL R 4が実際に L P Sシグナル伝達に関わっていることを T L R 4欠損マウスを作製することにより明らかにしている（J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999) 、これは T L Rの一次構造における種特異的差異によるもの、つまりマウスでは T L R 4、ヒトでは T L R 2により介されている可能性がある。しかしながら、マウス T L R 2 も L P Sに対する応答で N F— κ Bを活性化したとの報告がある（J. Immunol. 162, 6971-6975, 1999)。また、 Chow ら ίま、 C 3 H /H e J マウスに関する結果と一致する結果、すなわちヒト T L R 4が投与量依存又は時間依存による L P S / C D 1 4に対する刺激によって N F - κ Βを介する遺伝子発現を活性化し、ヒト 2 9 3細胞を用いた場合には Kirschningらのグループと矛盾する結果を得て、これは 2 9 3細胞の口ッ卜の差にもよるものと推測されると報告している。（J. Biol. Chem. 274， 10689-10692, 1999)。

最近、 T L R 2がグラム陰性菌由来の L P Sに対する反応性のみに関わっているのではなく（J. Immunol. 162， 6971-6975， 1999)、別の共通細菌構造パターンであるグラム陽性菌由来のぺプチドグリカン（ P GN) とリポティコ酸（L T A) のシグナル伝達受容体として作用するとの報告 ^ある（J. Biol. Chem.274, 17406-17409, 1999、 J. Immunol. 163, 1-5, 1999)。また、全グラム陽性菌、可溶性 P G N及び L T Aが、 T L R 2 を発現する 2 9 3細胞の N F— κ B活性化を誘導したのに対して、 T L R 1や T L R 4を発現する細胞内の N F— κ Β活性化を誘導しなかったことも報告されている（J. Biol. Chem.274, 17406-17409, 1999)。また、 T L R 4ではなくヒト T L R 2を発現するチヤィニーズハムスター卵巣 ( C H O) 繊維芽細胞を、熱殺菌したスタフイロコッカス · ァウレウス ( Staphylococcus aureus) 及びス卜レフ卜コッカス · ニュ一七ニェ (Streptococcus pneumoniae) 並びにス夕フィロコッカス · ァゥレウス由来 P G Nにより同様に活性化したとの報告がなされている（ J. Immunol. 163, 1-5， 1999)。

他方、動物ゃヒ卜の病原性細菌として知られるマイコプラズマは細胞壁を欠如しているが、マクロファージを活性化する能力を備えている。これらマクロファージ活性化物質がリポタンパク/リポペプチドであるとの数多くの報告が現在までになされており、かかるリポペプチドのうちの 1つであるマイコプラズマ · フアーメン夕ンス（M.fermentans) 由来の 2 k Dマクロファージ活性化リポペプチド MA L P — 2は、その生化学的特性が明らかになつており、かつ合成されたものも利用することができる（J.Exp. Med.185:1951, 1997)。この脂質種は 2つの不斉炭素原子をもち、 S， Rラセミ体からなる合成 MA L P — 2はインビトロでピコモル濃度で天然化合物作用と類似の特異活性を示すことが知られている。そして、 M A L P— 2が N F— κ Bを活性化することを除いては、 M A L P— 2のシグナル経路や細胞表面レセプ夕一については殆ど知られていない。

その他、マイコバクテリゥム（mycobacterium) とボレリア ' ブルダドルフエリ（Bori'elia burgdorfei'i) 由来のリポタンパク Zリポペプチドが、インビトロでの T L R 2を介する宿主細胞の活性化を誘導したこと力 S報告されてレる（Science 285, 736-739, 1999、 Science 285, 732-736, 1999)。しかしながら、過剰発現実験から得られる結果は必ずしもインビボでの T L Rファミリーの機能を反映していない。このような応答性を N F — κ B活性化に基づいて分析した結果も、これら刺激により仲介される生物学的応答には関連しない（Infect. Immun. 66, 1638- 1647, 1998) と報告されている。

また、人工的に遺伝子を導入し発現させるトランスジエニックマウスと、胚性幹細胞（以下「E S細胞」という）を用いて人工的にゲノム上の特定遺伝子を相同組換えにより変化させる遺伝子ターゲティングとを用いた遺伝子欠損マウスを用いると、特定の遺伝子の機能を個体レベルで解析しうることが知られている。そして、一般に、遺伝子欠損マウスはノックアウトマウスと呼ばれているが、 T L R 2 ノックアウトマウスや M y D 8 8 ノックァゥトマウスは知られていない上に、 T L R 2ノックァゥトマウスや M y D 8 8 ノックァゥトマウスが細菌菌体成分に対して不応答性であることも知られていなかった。発明の開示、

ィンビボにおける細菌菌体成分に対する応答は、細胞表面上の各 T L Rの発現レベルの差異により変化することが予測されるものの、未だィンビボにおける細菌菌体成分刺激によるシグナル伝達に対する T L Rフアミリ一の各メンバーや T L Rフアミリーのアダプタータンパク質である M y D 8 8の関わりは明らかにされていない。本発明の課題は、インビボにおける細菌菌体成分刺激によるシグナル伝達に対する T L Rファミリ一各メンバーや T L Rファミリ一のアダプタ一タンパク質である M y D 8 8の関わり、特に T L R 2と My D 8 8とのインビボにおける役割を明らかにする上で有用な、マイコプラズマ属、スピロヘータ属、ェセリシァ属等に属する細菌の菌体成分であるリポタンパク Zリポぺプチドゃ、グラム陽性菌の細胞壁画分であるべプチドダリ力ンゃグラム陰性菌の細胞壁画分であるェンドトキシン等の細菌菌体成分に不応答性のモデル非ヒト動物、例えば T L R 2及び M y D 8 8遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、またこれら細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物を用いた細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質や、 T L R 2 に対するァゴニストゃアン夕ゴニストのスクリーニング方法等を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、プラスミドベクタ一を用いて E S細胞で相同的組換えによって、 T L R 2遺伝子の細胞内領域を含むェキソン領域、又は My D 8 8遺伝子領域の C末端部分をコ一ドした 2つのェキソン領域を、それぞれネオマイシン耐性遺伝子に置き換え、またそれぞれの C末端側に H S V— t k遺伝子を導入させて、 G 4 1 8とガンシクロビアに対して 2重に抵抗力のある E S細胞クロ一ンをスクリーニングし、この E S細胞クロ一ンを C 5 7 B L / 6のマウスの胚盤胞（blastocysts)の中に注入し、その生殖系列をとおして、メンデルの法則に従い出生してくる T L R 2又は M y D 8 8遺伝子機能が染色体上で欠損した T L R 2 ノックアウトマウスや My D 8 8 ノックアウトマウス力^ 生まれてから 2 0週間は明らかに異常を示さないトランスジエニックマウスであり、また、かかる T L R 2ノックアウトマウスや M y D 8 8 ノックァゥ卜マウスがグラム陽性菌の細胞壁成分であるペプチドグリカンゃリポタンパク Zリポペプチド等の細菌菌体成分に対して不応答性であることを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、細菌菌体成分であるリポタンパク Zリポベプチドに対して不応答性であることを特徴とする細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物（請求項 1 ) や、リポタンパク Zリポペプチドが、マイコプラズマ属に属する細菌に由来するマクロファージ活性化リボぺプチドであることを特徴とする請求項 1記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒ卜動物（請求項 2 ) や、細菌菌体成分であるペプチドグリカンに対して不応答性であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物（請求項 3 ) や、グラム陽性菌細胞壁画分に対して低応答性であることを特徴とする請求項 1 〜 3のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物（請求項 4 ) や、細菌菌体成分であるエンドトキシンに対して不応答性であることを特徴とする請求項 1 〜 4のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物（請求項 5 ) や、細菌菌体成分であるリポティコ酸に対して不応答性であることを特徴とする請求項 1 〜 5のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物（請求項 6 ) や、細菌菌体成分である結核菌溶解物に対して不応答性であることを特徴とする請求項 1 〜 6のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物（請求項 7 ) や、請求項 1 〜 4のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒ卜動物が、 T L R 2遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒ卜動物であることを特徴とする細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物（請求項 8 ) や、請求項 1 〜 7のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物が、 M y D 8 8遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物であることを特徴とする細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物（請求項 9 ) や、非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項 1 〜 9のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物（請求項 1 0 ) や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項 1 0記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物（請求項 1 1 ) に関する。

また本発明は、請求項 1 〜 1 1のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞と被検物質とをあらかじめィンビト口で接触せしめた後、該マクロファ —ジ又は脾臓細胞を細菌菌体成分の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマク口ファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 1 2 ) や、請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物から得られるマクロファ一ジ又は脾臓細胞と細菌菌体成分とをあらかじめィンビト口で接触せしめた後、該マク口ファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 1 3 ) や、請求項 1 〜 1 1のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られるマクロファ一ジ又は脾臓細胞を細菌菌体成分の存在下で培養し、該マクロファ一ジ又は脾臓細胞のマクロファ一ジ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 1 4 ) や、請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 1 5 ) や、請求項 1 〜 1 1のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファ一ジ又は脾臓細胞のマク口ファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 1 6 ) や、請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマク口ファージ又は脾臓細胞のマク口ファ一ジ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 1 7 ) や、請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 1 8 ) や、請求項 1 〜 1 1のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒ卜動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 1 9 ) や、マクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価するに際し、対照として細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒ卜動物と同種の野生型非ヒト動物の測定値と比較 · 評価することを特徴とする請求項 1 2〜 1 9のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 2 0 ) や、マクロファージ活性の程度の測定 · 評価が、該マクロファ一ジにおけるサイトカイン及び Z又は亜硝酸イオンの産生量の測定 · 評価であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 0 のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 2 1 ) や、脾臓細胞活性の程度の測定 - 評価が、該脾臓細胞における M H Cクラス IIの発現量の測定 ·評価であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 0のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 2 2 ) や、細菌菌体成分が、リポタンパク Zリポペプチドであることを特徴とする請求項 1 2〜 2 2のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 2 3 ) や、リポタンパク/リポペプチドが、マイコプラズマ属、スピロヘータ属又はェセリシァ属に属する細菌の菌体成分由来のリポタンパク Zリポベプチドであることを特徴とする請求項 2 3記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 2 4 ) や、細菌菌体成分が、ペプチドダリカンであることを特徴とする請求項 1 2〜 2 2のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 2 5 ) や、細菌菌体成分が、ェンドトキシンであることを特徴とする請求項 1 2〜 2 2のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一二ング方法（請求項 2 6 ) や、細菌菌体成分が、リポティコ酸であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 2のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 2 7 ) や、細菌菌体成分が、結核菌溶解物であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 2のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 2 8 ) や、細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 1 2 〜 2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 2 9 ) や、細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、 T L R 2に対するァゴニスト又はアン夕ゴニストであることを特徴とする請求項 1 2〜 2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 3 0 ) や、細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、インターロイキン一 1活性の抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 3 1 ) や、細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、ィン夕一ロイキン一 1 8活性の抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項 3 2 ) や、細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、 I F N—ァ活性の抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一ニング方法（請求項 3 3 ) や、細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、 T N F— α活性の抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一ニング方法（請求項 3 4 ) に関する。

また本発明は、請求項 1 2 〜 3 4のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法により得られることを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質（請求項 3 5 ) や、細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 3 5記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質（請求項 3 6 ) や、細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、 T L R 2に対するァゴニスト又はアン夕ゴニストであることを特徴とする請求項 3 5記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質（請求項 3 7 ) に関する。

また本発明は、請求項 1 〜 1 1のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物に被検物質を投与して、該被検物質の生物活性を評価することを特徴とする被検物質の評価方法（請求項 3 8 ) や、請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒ卜動物と、該非ヒト動物の野生型非ヒト動物とにそれぞれ被検物質を投与して、該被検物質の生物活性を比較 · 評価することを特徴とする被検物質の評価方法（請求項 3 9 ) や、生物活性がエンドトキシン活性であることを特徴とする請求項 3 8又は 3 9記載の被検物質の評価方法 (請求項 4 0 ) や、生物活性がイン夕一ロイキン一 1活性であることを特徴とする請求項 3 8又は 3 9記載の被検物質の評価方法（請求項 4 1 ) や、生物活性がィン夕ーロイキン一 1 8活性であることを特徴とする請求項 3 8又は 3 9記載の被検物質の評価方法（請求項 4 2 ) に関する。

また本発明は、請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒ卜動物に被検物質を投与して、該被検物質中の細菌菌体成分を検出することを特徴とする細菌菌体成分の検出方法（請求項 4 3 ) や、請求項 1 〜 1 1のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒ卜動物と、該非ヒト動物の野生型非ヒ卜動物とにそれぞれ被検物質を投与して、該被検物質中の細菌菌体成分を検出することを特徴とする細菌菌体成分の検出方法（請求項 4 4 ) や、細菌菌体成分、リポ夕ンパク/リポペプチドであることを特徴とする請求項 4 3又は 4 4記載の細菌菌体成分の検出方法（請求項 4 5 ) や、リポタンパクノリポペプチドが、マイコプラズマ属、スピロヘータ属又はェセリシァ属に属する細菌の菌体成分由来のリポタンパク/リポペプチドであることを特徴とする請求項 4 5記載の細菌菌体成分の検出方法（請求項 4 6 ) や、細菌菌体成分が、ペプチドダリカンであることを特徴とする請求項 4 3又は 4 4記載の細菌菌体成分の検出方法（請求項 4 7 ) や、細菌菌体成分が、エンドトキシンであることを特徴とする請求項 4 3又は 4 4 記載の細菌菌体成分の検出方法（請求項 4 8 ) や、細菌菌体成分が、リポティコ酸であることを特徴とする請求項 4 3又は 4 4記載の細菌菌体成分の検出方法（請求項 4 9 ) に関する。

また本発明は、マウス遺伝子ライブラリーからマウス E S Tクローン由来のプローブを用いてスクリーニングすることにより得られた T L R 2遺伝子の細胞内領域を含むェクソン部位の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリ Aシグナルとマ一力一遺伝子をもつプラスミドに置換して夕ーゲッティングベクターを構築し、該夕一ゲッティングベクターを線状化した後胚幹細胞に導入し、 T L R 2遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをィン夕一クロスすることによって得られることを特徴とする T L R 2 ノックアウトマウス (請求項 5 0 ) や、マウス遺伝子ライブラリ一からマウス E S Tクローン由来のプローブを用いてスクリーニングすることにより得られた M y D 8 8遺伝子領域の C末端部分をコードした 2つのェクソン領域の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリ Aシグナルとマーカ一遺伝子をもつプラスミドに置換して夕一ゲッティングベクターを構築し、該夕ーゲッティングベクターを線状化した後胚幹細胞に導入し、 My D 8 8遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクシヨンしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタ一クロスすることによって得られることを特徴とする My D 8 8ノックアウトマウス（請求項 5 1 ) に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の My D 8 8ノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図を示す図である。

第 2図は、本発明の My D 8 8ノックアウトマウスと野生型マウスに大腸菌由来の L P Sを投与した場合の生存率を示す図である。

第 3図は、本発明の My D 8 8ノックアウトマウスと野生型マウスにおける I L一 1を介しての T細胞増殖の結果を示す図である。

第 4図は、本発明の My D 8 8ノックアウトマウスと野生型マウスにおける I L一 1誘導による血中の TN F— ひと I L一 6のレベル結果を示す図である。

第 5図は、本発明の My D 8 8ノックアウトマウスと野生型マウスにおける I L— 1 8を介しての NK細胞の活性化の結果を示す図である。第 6図は、本発明の My D 8 8 ノックァゥトマウスと野生型マウスにおける I L一 1 2と I L一 1 8の刺激による I F N— 了の産生の結果を示す図である。

第 7図は、ドミナントネガティブ M y D 8 8の突然変異が、 I L— 1 8誘導 N F— κ B活性及び A P— 1活性に関与していることを示す図である。第 8図は、本発明の M y D 8 8ノックアウトマウス、野生型マウス、 T L R 4ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓 B細胞のサルモネラ，ミネソタ R e— 5 9 5に対する応答性の結果を示す図である。第 9図は、本発明の M y D 8 8ノックアウトマウス、野生型マウス、 TL R 4ノックアウトマウスのマクロファ一ジ及び脾臓 B細胞の I L一 4やインターフェロンーァに対する応答性の結果を示す図である。

第 1 0図は、本発明の My D 8 8 ノックアウトマウス、野生型マウス、 T L R 4ノックァゥトマウスのマクロファージ及び脾臓 B細胞のボルフイロモナス · ジンジバリスに対する応答性の結果を示す図である。

第 1 1図は、本発明の My D 8 8 ノックアウトマウス、野生型マウス、 TL R 4ノックァゥトマウスのマク口ファージ及び脾臓 B細胞のェシェリキア · コリ 05 5 ： B 5に対する応答性の結果を示す図である。

第 1 2図は、本発明の My D 8 8ノックアウトマウス、野生型マウス、 TL R 4ノックアウトマウスのマクロファ一ジ及び脾臓 B細胞のぺプチドダリカンに対する応答性の結果を示す図である。

第 1 3図は、本発明の My D 8 8ノックアウトマウス、野生型マウス、 TL R 4ノックァゥトマウスのマクロファージ及び脾臓 B細胞のリポティコ酸に対する応答性の結果を示す図である。

第 1 4図は、本発明の My D 8 8ノックアウトマウス、野生型マウス、 T L R 4ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓 B細胞の結核菌全細胞溶解物に対する応答性の結果を示す図である。

第 1 5図は、本発明の T L R 2ノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図を示す図である。

第 1 6図は、本発明の T L R 2ノックァゥ卜マウスと野生型マウスに大腸菌由来の L P Sを投与した場合の生存率を示す図である。

第 1 7図は、本発明の T L R 2 ノックアウトマウス、野生型マウス、 T L R 4ノックアウトマウスにおけるリピド A又は L P S誘導による I L— 6、 TN F— α又は N0₂—の産生量を示す図である。

第 1 8図は、本発明の T L R 2ノックアウトマウス、野生型マウス、 TL R 4ノックァゥトマウスの脾臓 B細胞のサルモネラ · ミネソタ R e 一 5 9 5由来 L P Sに対する応答性の結果を示す図である。

第 1 9図は、本発明の T L R 2ノックアウトマウス、野生型マウス、 T L R 4ノックァゥトマウスの腹腔マクロファージのグラム陽性菌の細胞壁成分に対する応答性の結果を示す図である。

第 2 0図は、本発明の TL R 2 ノックアウトマウス、野生型マウス、 T L R 4ノックァゥトマウスにおける P GN又は L TA誘導による I L — 6、 N0₂—又は TN F— αの産生量を示す図である。

第 2 1図は、本発明の TL R 2ノックアウトマウス、野生型マウス、 T L R 4ノックァゥ卜マウスにおいて、 L P S又は P GN刺激によるィンビトロでのキナーゼアツセィ、ウエスタンブロット分析及び電気泳動移動度分析の結果を示す図である。

第 2 2図は、 CH 3 ZH e Jマウスの腹腔マクロファージのリポぺプチド MAL P— 2に対する応答性の結果を示す図である。

第 2 3図は、ヒト単核細胞のリポペプチド MAL P— 2に対する応答性の結果を示す図である。

第 2 4図は、本発明の TL R 2ノックアウトマウス、野生型マウス、 TL R 4ノックアウトマウス、 M y D 8 8ノックアウトマウスの腹腔マクロファージのリポベプチド MA L P— 2に対する応答性の結果を示す図である。

第 2 5図は、本発明の TL R 2ノックアウトマウス、野生型マウス、 T L R 4ノックアウトマウス、 M y D 8 8ノックアウトマウスにおいて、リポペプチド M A L P— 2刺激によるインビトロでのキナーゼアツセィゥエスタンブロット分析及び電気泳動移動度分析の結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明における細菌菌体成分としては、マイコプラズマ属、スピロへ —夕属、ェセリシァ属に属する細菌の菌体成分であるリポタンパク Zリポペプチド、細菌細胞壁の骨格構造である N —ァセチルダルコサミンと N —ァセチルムラミン酸の繰返し多糖類に比較的短いぺプチド鎖が結合したペプチドダリカン、主としてグラム陰性菌の外膜成分として存在するエンドトキシンとも呼ばれるリポ多糖（L P S )、グラム陽性細菌の細胞壁成分であるリポティコ酸（ L T A )、結核菌（Mycobacterium tuberculosis) 溶解物、グラム陽性菌細胞壁画分等を挙げることができ、また本発明においては、便宜上、上記細菌菌体成分を担持するキャリアや、細菌菌体自体も本発明における細菌菌体成分に含めることとする。本発明において細菌菌体成分に対する不応答性とは、細菌菌体成分による刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われていることを意味し、低応答性とは刺激に対する反応性が低下していることを意味する。したがつて、本発明において細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物とは、細菌菌体成分による刺激に対して、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下している力、、あるいはほぼ失われているマウス、ラッ卜、ゥサギ等のヒト以外の動物をいう。また、細菌菌体成分による刺激としては、細菌菌体成分を生体に投与するインビボでの刺激や、生体から分離された細胞に細菌菌体成分を接触させるィンビトロでの刺激等を挙げることができる。そして、本発明における細菌菌体成分不応答性モデル非ヒ卜動物としては、リポタンパク Zリポペプチド、ペプチドダリカン、グラム陽性菌細胞壁画分、エンドトキシン、リポティコ酸、結核菌溶解物等の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物を挙げることができ、具体的には、 T L R 2ノックアウトマウス等の TL R 2遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、 M y D 8 8ノックァゥトマウス等の My D 8 8遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を挙げることができる。

本発明において、 M y D 8 8又は T L R 2遺伝子機能の染色体上での欠損とは、染色体上の My D 8 8又は丁 1^ 2遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される My D 8 8又は T L R 2を発現する機能が失われていることをいい、また、 My D 8 8又は T L R 2遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物としては、 1 08 8又は丁 L R 2ノックアウトマウスの他、例えば My D 8 8又は TL R 2遺伝子機能が欠損したラット等の齧歯目動物を例示することができる。

本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記 My D 8 8又は TL R 2遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と同種の非ヒト動物をいレ、マウスの場合を例に取ると、メンデルの法則に従い出生してくる F 2マウスのうち、 My D 8 8又は T L R 2非欠損型の同種のマウスをいう。これら F 2マウスにおける欠損型とその野生型、特に同腹の野生型を同時に実験に供することによって、個体レベルで正確な比較実験をすることができる。上記 M y D 8 8又は T L R 2遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の作製方法を、 M y D 8 8又は T L R 2が欠損したノックアウトマウスを例にとって以下説明する。

My D 8 8又は T L R 2遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーを P C R法等により増幅し、マウス E S Tクローン由来等のプロ一ブを用いてクローニングすることができる。このクローニングされた My D 8 8又は T L R 2遺伝子を組換え D N A技術により、 ^1 08 8又は丁尺 2 遺伝子の全部又は一部、例えば M y D 8 8又は T L R 2遺伝子の細胞内領域を含むェクソン部位の全部又は一部を、ボリ Aシグナル遺伝子とネォマイシン耐性遺伝子等マーカー遺伝子で置換し、 5 ' 末端側にジフテリアトキシン Aフラグメント（D T— A) 遺伝子や単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼ（H S V— t k) 遺伝子等の遺伝子を導入して夕 —ゲティングベクタ一を作製し、この作製された夕ーゲティングベクタ一を線状化し、エレクトロポレーシヨン法等により胚幹細胞（E S細胞）に導入して培養後、 G 4 1 8やガンシクロビア（GANC) 等の抗生物質により相同的組換えを起こした E S細胞を選択する。この選択された E S細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンプロット法等により確認することが好ましい。

上記組換え E S細胞をマウスの胚盤胞（blastocysts) 内にマイクロインジェクシヨンし、仮親の子宮に戻すことによってキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスは、キメラ率がよいと生まれてくるキメラマウスが雄に片寄るため、野生型の雌と交配させることによってへテロ組換えマウス（ + /— : F 1 ) を作出し、そのへテロ組換えマウスの雄と雌を交配させることによってホモ組換えマウス [F 2 ；野生型マウス（ + / + )、 1 08 8又は丁 1^ 2ノックァゥトマゥス（一ノー）] を得ることができ、これらはすべてメンデルの法則に従い産み出される。そして、本発明の M y D 8 8又は T L R 2ノックァゥトマウスが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスの腹腔マクロファ一ジから RN Aを単離してノーザンプロット法等により調べたり、またこのマウスの My D 8 8又は T L R 2の発現をウエスタンプロット法等により調べる方法がある。

作出された My D 8 8ノックァゥトマウスが細菌細胞壁成分に対して不応答性であることは、例えば、マイコプラズマ属、スピロヘータ属、ェセリシァ属等に属する細菌の菌体成分であるリポタンパク Zリポぺプチドを M y D 8 8ノックァゥトマウスのマクロファ一ジゃヒ卜単核細胞にインビト口で接触せしめ、かかる細胞における TN F— αや N0₂一の産生量を測定することや、グラム陰性菌の細菌細胞壁成分である L P S を My D 8 8ノックアウトマウスに静脈注射等により投与し、発熱、ショック、白血球や血小板の減少、骨髄出血壊死、血糖低下、 I F N誘発、 Bリンパ球（骨髄由来免疫応答細胞）の活性化等のエンドトキシンの生物活性を測定することや、 My D 8 8ノックアウトマウスのマクロファ —ジと脾臓 B細胞に、細菌由来の L P S、又はグラム陽性菌菌体成分であるペプチドグリカン、リポティコ酸、結核菌溶解物等の存在下において、例えば TN F誘発、脾臓 B細胞増殖応答、脾臓 B細胞表面での MH Cクラス II抗原の発現を測定することにより確認することができる。本発明の M y D 8 8ノックアウトマウスは、細菌の菌体成分であるリポタンパクノリポベプチドに不応答性であり、また現在までエンドトキシン低応答性として知られている C 3 HZH e Jマウスよりもエンドトキシン応答性が低下しており、ショック症状は全く認められず、また、 M y D 8 8ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓 B細胞は、ェンドトキシンに対して不応答性であるばかりでなく、グラム陽性細菌細胞壁成分であるペプチドグリカン、リポティコ酸、結核菌溶解物等に対しても不応答性であって、他方 I L一 4や I F N— ァに対して応答性であることから、この細菌菌体成分に対して不応答性であるノックアウトマウスは、リポタンパクノリポペプチド、エンド卜キシン、ペプチドグリカン、リポティコ酸等の作用機序の解明ゃェンドトキシンショックへの対処方法の確立に有用なモデルとすることができる。

また、作出された T L R 2ノックアウトマウスが細菌細胞壁成分に対して不応答性であることは、例えば、マイコプラズマ属、スピロへ一夕属、ェセリシァ属等に属する細菌の菌体成分であるリポタンパク Zリポぺプチドを T L R 2ノックァゥトマウスのマクロファージゃヒト単核細胞にインピト口で接触せしめ、かかる細胞における TN F— αや N0₂_ の産生量を測定することや、 T L R 2ノックァゥトマウスのマクロファージゃ脾臓 B細胞に、グラム陽性菌細胞壁画分、グラム陽性菌の細胞壁成分であるペプチドグリカン等の存在下において、 TN F誘発、脾臓細胞増殖応答、脾臓 B細胞表面での MH Cクラス II抗原の発現等を測定することにより確認することができる。そして、本発明の T L R 2 ノックアウトマウスは、細菌の菌体成分であるリポタンパクダリポベプチドゃぺプチドグリカンに不応答性であり、グラム陽性菌細胞壁画分に対して低応答性であって、 L P Sをはじめとして L T Aや I L一 4に対して応答性であることから、上記 TL R 2ノックアウトマウスは、リポタンパク Zリポペプチド、ペプチドグリカン、グラム陽性菌細胞壁画分等の作用機序の解明に有用なモデルとすることができる。

本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物は、細菌菌体成分の作用機序の解明の他、細菌感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又は TL R 2に対するァゴニスト若しくはアン夕ゴニストなどの細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質若しくは促進物質のスクリー二ングや、各種被検物質の生物活性の評価や、細菌菌体成分の検出等に用いることができる。例えば、細菌感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又は T L R 2に対するァゴニスト又はアン夕ゴニストなどの細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニング方法を、以下細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法を例にとって説明する。

本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物から得られるマクロファ一ジ又は脾臓細胞等と被検物質とをあらかじめィンビトロで接触せしめた後、該マクロファ一ジ又は脾臓細胞を細菌菌体成分の存在下で培養し、該マク口ファ一ジ又は脾臓細胞のマク口ファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することによる、細菌感染症に対する予防剤、免疫応答回復 · 促進剤等をスクリーニングする方法や、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物から得られるマク口ファージ又は脾臓細胞と細菌菌体成分とをあらかじめィンビトロで接触せしめた後、該マクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマク口ファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 ·評価することによる、細菌感染症に対する治療剤、症状改善剤等をスクリ一二ングする方法を挙げることができる。

また、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られるマクロファ —ジ又は脾臓細胞を細菌菌体成分の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマク口ファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することによる、細菌感染症に対する予防剤、免疫応答回復 · 促進剤等をスクリーニングする方法や、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物から得られるマク口ファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することによる、細菌感染症に対する予防剤、免疫応答回復 · 促進剤等をスクリーニングする方法を挙げることができる。

また、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することによる、細菌感染症に対する治療剤、症状改善剤等をスクリーニングする方法や、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒ卜動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファ一ジ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定'評価することによる、細菌感染症に対する治療剤、症状改善剤等をスクリーニングする方法を挙げることができる。

さらに、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物におけるマク口ファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 * 評価することによる、細菌感染症に対する予防剤、免疫応答回復 - 促進剤等をスクリーニングする方法や、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物におけるマク口ファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することによる、細菌感染症に対する治療剤、症状改善剤等をスクリーニングする方法を挙げることができる。

そして、マクロファージ活性の程度の測定 · 評価方法としては該マク口ファージにおけるサイトカイン及び Z又は亜硝酸イオンの産生量を測定 · 評価する方法を、脾臓細胞活性の程度の測定 · 評価方法としては該脾臓細胞における M H Cクラス Πの発現量を測定 ·評価する方法をそれぞれ例示することができる。また、マクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価するに際し、対照として細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物の野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒ卜動物の測定値と比較 · 評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。このことは、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒ卜動物を用いる各種被検物質の生物活性の評価や細菌菌体成分の検出等においても同様である。本発明のスクリーニング方法の対象となる抑制物質又は促進物質としては、前記細菌感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又は T L R 2 に対するァゴニスト若しくはアン夕ゴニストの他、マイコプラズマ属、スピロへ一夕属又はェセリシァ属に属する細菌の菌体成分由来のリポ夕ンパク/リポペプチドや、ペプチドグリカン、エンドトキシン、リポティコ酸、結核菌溶解物等の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質や、インターロイキン— 1活性、インターロイキン— 1 8活性、 I F N— τ活性、 T N F — α活性等の抑制物質又は促進物質を例示することができる。

なお、 T L R 2に対するァゴニスト又はアン夕ゴニストのスクリ一二ングは、上記のように細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質のスクリーニングと同様に行えばよいが、 T L R 4ノックアウトマウスを一緒に用いることもできる。すなわち、 T L R 2 ノックアウトマウスと T L R 4ノックアウトマウス、さらに必要に応じて野生型マウスに被検物質をそれぞれ投与して、該 T L R 2 ノックアウトマウス由来及び T L R 4 ノックァゥトマウス由来のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を比較評価することにより、 T L R 2及び/又は T L R 4に対するァゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングすることもできる。

本発明の被検物質の評価方法は、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物に被検物質を投与して、該被検物質の生物活性を評価することを特徴とする。本発明の被検物質の評価方法によると、被検物質の生物活性、例えばエンドトキシン活性、インターロイキン一 1 活性、インターロイキン一 1 8活性等を評価することができる。例えば、本発明の M y D 8 8 ノックアウトマウスを用いて、被検物質のェンド卜キシン活性を正確に評価することにより、エンドトキシン拮抗物質等のエンドトキシンによるショックゃ発熱作用を抑制することができる薬剤の開発に有用な情報を得ることができる。

また、本発明の My D 8 8ノックアウトマウスを用いて、被検物質の I L一 1活性を正確に評価することにより、病態モデルマウスにおける I L— 1の疾患との関わりを検索することができる。このように、被検物質の I L一 1活性を正確に評価したり、病態モデルマウスにおける I L— 1の関与を解析することにより、例えば、 I L一 1発現過多に起因するリウマチ様関節炎、移植片対宿主病、喘息等の疾病を治療することができる薬剤の開発に有用な情報を得ることができる。そして、評価対照となる I L— 1活性としては、フィ卜へマグルチニン（P HA)、コンカナパリン A (C o n A) 等のマイトジェンや、低濃度の I L一 2との共刺激による T細胞の増殖誘導活性や、単球やマクロファ一ジに作用して TN F— ひ、 I L— 1、 I L一 6の産生を誘導する活性などを挙げることができる。

そしてまた、本発明の My D 8 8ノックアウトマウスを用いて、被検物質の I L一 1活性を正確に評価することにより、例えば、 I L一 1 8 の過剰産生に起因する I型糖尿病や移植片対宿主病等の疾病を治療することができる薬剤の開発に有用な情報を得ることができる。そして、評価対照となる I L一 1 8活性としては、 I F N— ァの生成を促進する活性、 NK細胞活性を高める活性、 I L一 1 2と共働して T細胞から I F N—アの生成を誘導する活性、及び I R AKや N F— / c Bを活性化する作用を挙げることができる。

本発明の細菌菌体成分の検出方法によると、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物に被検物質を投与して、該被検物質中に混在する微量の細菌菌体成分、例えばマイコプラズマ属、スピロへ一夕属、ェセリシァ属等に属する細菌の菌体成分由来のリポタンパク Zリポペプチド、ェセリシァ ' コリ、クレブシエラ ' ニューモニエ、シュ一ドモナス · 7エルギノサ、サルモネラ · チフィムリウム、セラチア · マルセッセンス、フレクスナー赤痢菌、ビブリオ · コレレエ、サルモネラ · ミネソタ、ポルフィロモナス · ジンジバリス等由来のエンドトキシン、スタフイロコッカス · ァゥレウス、コリネバクテリゥム · ジフテリア、ノカルジァ · コエリア力等由来のペプチドダリカン、ストレプトコッカス · ニューモニァ等由来のリポティコ酸、結核菌の全細胞溶解物等を検出することができる。

以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例 1 ( M y D 8 8 ノックアウトマウスの作製）

M y D 8 8遺伝子を 1 2 9 / S v J マウス遺伝子ライブラリ一 (Stratagene 社製）からスクリ一ニングし、 pBluescript ベクタ一 ( Stratagene社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及び D N Aシーケンシングにより特定した。夕ーゲッティングベクター（標的べクタ一）は、 pMCl-neo(Stratagene 社製）からのネオマイシン耐性遺伝子で、野生型アレルの 1 . 0 k b遺伝子断片を置換することにより構築された。置換された遺伝子断片は、 I L— I R A c P (受容体補助タンパク）の細胞質ドメインに似ているドメインをコードする 2つのェクソンを含んでいた。ネオマイシン耐性遺伝子は、 1 . 1 13の 5 ' 遺伝子断片と 5 . 2 k bの 3 ' 遺伝子断片をフランキング配列として有していた。次いで、 H S V — t kカセットを遺伝子断片の 3 ' 端に導入した。線状化された標識ベクターを E S細胞 E 1 4 . 1 にトランスフエクションし、 G 4 1 8及びガンシクロヴィァで選択した。両者に抵抗性を示す 1 7 6個のクローンを、 P C Rによる相同組換えのためにスクリーニングし、図 1 に示すプローブを用いるサザンプロット分析により 3 3個を確かめた。 3個の独立的に同定された標的 E Sクローンを、 C 5 7 B LZ 6マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションした。得られたキメラマウスを、ヘテロ接合体マウスを作製するために、 C 5 7 B LZ 6雌マウスと交尾させた。ヘテロ接合体マウスは、ホモ接合体マウスを得るため、ィンタークロスされ、これらのインタークロスから予測されたメンデル比 ( + /+ ： + /- ： - /- = 5 2 ： 9 3 ： 5 3 ) で生まれ、 My D 8 8 欠損マウスを作製することができた。本発明の M y D 8 8ノックアウトマウスは健康に育ち、 2 0週の年齢まで異常を示さなかった。突然変異により M y D 8 8遺伝子の不活性化が生起していることを確認するため. ノーザンブロッ卜分析を行ったところ、 M y D 8 8 m R N Aは M y D 8 8欠損マウスの肝臓及び脾臓からは検出されなかった。また、胸腺、脾臓及びリンパ節中の C D 3、 B 2 2 0、 C D 4及び C D 8のフローサイトメトリーで、リンパ球組成は野生型マウスと比較して My D 8 8 ノックァゥトマウスにおいても変わっていなかった。

実施例 2 (M y D 8 8 ノックアウトマウスのエンドトキシン不応答性）本発明の M y D 8 8 ノックアウトマウス 1 0匹に、大腸菌（〇 5 5 ： B 5 ) 由来の L P Sを 1 m g投与し、その生存率によりエンドトキシン不応答性を調べた。対照として同腹の野生型マウス 1 0匹を用いた。結果を図 2に示す。図 2より、野生型マウスは L S Pに応答し、投与後 4 日ですベて死亡したが、本発明の My D 8 8 ノックアウトマウスは、 L P S投与後 4 日では死亡するものはなく、エンドトキシン不応答性であることを確認することができた。

実施例 3 (M y D 8 8 ノックアウトマウスの I L一 1仲介機能の欠失）本発明の M y D 8 8 ノックァゥトマウスの胸腺細胞 1 X 1 0 ⁵を、 T 細胞増殖についての I L一 1 との共刺激物であるフィ卜へマグルチニン ( P H A) 2 g /m 1 , コンカナパリン A (C o n A) 2. s/ m 1 又は 2 n g Zm 1 の I L _ 2のそれぞれと、 I L一 1 /3 (Genzyme 社） 1 0 O UZm l との混合物と共に 9 6ゥエルの培養皿で 7 2時間培養し、 T細胞を増殖させた。 T細胞の増殖は、細胞内に取り込まれた [³ H] チミジンの [³H] 量を測定することにより求めた。その結果、 P HA、 C o n A又は I L一 2と I L一 1 /3との共存下で培養したとき、同腹子の野生型マウスの胸腺細胞は大いに増殖したが、本発明の My D 8 8ノックァゥトマウスの胸腺細胞は細胞増殖の増加がほとんど見られなかった（図 3参照）。また、胸腺細胞に代えて脾臓 B細胞を用いても、同じような結果が得られることがわかった。

また本発明の My D 8 8ノックアウトマウスの胸腺細胞を、ホルボール 1 2—ミリスチン酸塩 1 3—酢酸塩パラメトキシアンフエ夕ミン（P MA) 1 O n g/m l 又は C o n A 2. 5 gZm l と I L一 2 (Genzyme 社） 2 0 n gZm 1 との共存下で上記と同じように培養させ、細胞増殖の増加を見たところ、本発明の My D 8 8ノックァゥトマウスの胸腺細胞と、同腹子の野生型マウスの胸腺細胞とは、 I L— 2と PMAや C o n Aとの反応に関しては増殖において差が見られなかった（図 3参照）。これらのことから、 I L一 1が仲介する T細胞成長シグナルは、本発明の M y D 8 8ノックァゥトマウスの胸腺細胞で損なわれていることがわかる。

本発明の M y D 8 8 ノックアウトマウスの静脈内に I L 一 l j3 (Genzyme 社） 1 gを注入し、 2時間後肝臓と血清を取り出した。総 RN Aをトリゾール試薬（GIBC0社）を用いて肝臓から抽出し、この RN A ( 1 0 /i g) を電気泳動にかけ、ナイロン膜に移して血清アミロイド A (S AA— 1 )、血清アミロイド P (S A P) 及びハプトグロビン（H P ) のような急性期蛋白質について、 ³² Pでラベルされた c D N Aを用いてノーザンブロッ卜分析を行い、 mR N A発現の I L一 1の誘導増加を同腹子の野生型マウスのものと比較したところ、野生型マウスでは誘導の増加が見られたが、 λί y D 8 8ノックァゥトマウスでは見られなかつた。

また I L一 1が、腫瘍壊死因子（TN F— α) や I L— 6のような急性期蛋白質の産生や炎症性のサイト力インを誘導するため、本発明の Μ y D 8 8ノックァゥトマウスと同腹子の野生型マウスから上記の方法で取り出した血清の TN F— αや I L— 6の濃度が増加するかどうかを Ε L I S Αによって測定した。その結果、野生型マウスにおいては I L— 1 )3によって TN F— αや I L— 6の濃度が増加したが、 M y D 8 8ノックアウトマウスでは TN F—ひや I L一 6の濃度が I L一 1 3によつて増加されることはなかった（図 4参照）。

以上のことから、本発明の My D 8 8ノックアウトマウスでは、 I L 一 1を介する主な生物学的機能が厳格に欠失していることがわかる。実施例 4 (My D 8 8ノックアウトマウスの I L一 1 8仲介機能の欠失） I L一 1 8が NK細胞の溶解活性を増強することはよく知られている _c 本発明の My D 8 8ノックァゥトマウス及び同腹子の野生型マウスの脾臓 B細胞を、 I L一 1 8 (林原生化学研究所株式会社） 2 0 n gZm l の存在下又は不存在下、 ^{5 1} C rでラベルされたマウスリンホ一マ細胞 (以下「YAC— 1」という）標的細胞といっしょに 2 4時間培養し、 4時間後ガンマ一カウンターを用いて上清中の遊離した^{5 1} C r を測定した。その結果、インビト口で脾臓 B細胞を I L— 1 8の存在下培養したとき、野生型マウスにおける Y AC— 1標的細胞に対する溶解活性は劇的に増強したが、 My D 8 8ノックァゥトマウスにおいては増強されることはなかった。なお、 I L一 1 8に代えて I L— 2を用いた場合には、本発明の M y D 8 8ノックアウトマウスの脾臓 B細胞においても溶解活性が増強した（図 5参照）。またインビトロで、本発明の My D 8 8ノックアウトマウスの脾臓 B 細胞と同腹子の野生型マウスの脾臓 B細胞とを 2 0 n gZm l の I L一 1 8で刺激し、 2 4時間培養し、 E L I S Aによって培養上清における I F N—ァの産生について測定した。その結果、野生型マウスにおいては I F N— τの産生が誘発されたが、本発明の M y D 8 8ノックアウトマウスでは I F N—了の産生は見られなかった（図 5参照）。

9 5 %以上の純度に精製された本発明の M y D 8 8ノックアウトマウスの脾臓 T細胞及び同腹子の野生型マウスの脾臓 T細胞を、 2 n g/m 1 の I L— 1 2存在下、抗 C D 3抗体（ 2 0 ^ g Zm 1 ) (PharMingen 社）でコーティングされた培養皿で培養し、 4 日後細胞を採取し、ハンクス平衡塩溶液で洗浄した。洗浄後の細胞（ 2 X 1 0⁵) は、抗 C D 3 抗体（ 2 0 gZm 1 ) でコーティングされた 9 6ゥエルの培養皿で、 2 0 n gZm l の I L— 1 8又は 2 n g/m l の I L— 1 2で、 2 4時間再び刺激され培養された。その培養上清での I F N— rの濃度は E L I S Aによって測定し比較された。その結果、本発明の My D 8 8ノックァゥトマウスの脾臓 T細胞は、 I L— 1 8に応答した I F N—ァの産生を高めることができないことがわかった（図 6参照）。

本発明の MyD 8 8ノックァゥトマウス及び同腹子の野生型マウスの腹膜内に、熱で殺されたプロピオン酸菌ァクネ（ P . a c n e s ) 5 0 O ^ gを注入し、 7 日後脾臓から T細胞を精製した後、 2 0 n gZm l の I L一 1 8の存在下又は非存在下、抗 C D 3抗体（ 2 0 gZm 1 ) でコ一ティングされた 9 6ゥエルの培養皿で 2 4時間培養し刺激し、その培養上清における I F N—ァの濃度を E L I S Aによって測定した。また本発明の My D 8 8ノックァゥトマウス及び同腹子の野生型マウスの静脈内に、カルメット—ゲラン菌（B C G) (共和化学） 2 m gを注入し、 1 4日後脾臓から T細胞を精製した後、上記のように 2 4時間培養し刺激し、 I F N—ァの濃度を測定した。その結果、どちらの場合も、野生型マウスにおいては I L— 1 8に応答して高レベルの I F N—ァカ産生されたが、本発明の M y D 8 8 ノックアウトマウスでは I L一 1 8 の存在下で I F N— ァの産生を高めることはできなかった（図 6参照）。以上のことから、本発明の My D 8 8 ノックアウトマウスは、 I L— 1 8欠損マウスと同様に、インビボでの T h l細胞への発展に欠陥があり、 I L一 1 8 を介する主な生物学的活性は完全に欠失していることがわかる。

次に、ドミナントネガティブ（dominant negative) M y D 8 8の突然変異が、 I L一 1 8誘導 N F— κ B活性化も阻害するかどうか検討した。 C O S - 7 細胞は、 N F — κ B依存ルシフェラ一ゼレポ一夕一 (luciferase reporter) 遺伝子と共に My D 8 8 (アミノ酸 1 5 2から 2 9 6 ) 発現ベクターで過渡的にトランスフエクシヨンし、 I L一 1 8処理後のルシフェラーゼ活性を測定した。 M y D 8 8 の共発現 (coexpression) は I L一 1 8誘導活性をほぼ完全に阻害した（図 7参照）。

また I L一 1 8は、 A P— 1依存遺伝情報を活性化することから、 M y D 8 8 (アミノ酸 1 5 2から 2 9 6 ) 力 I L一 1 8誘導 A P― 1活性化のドミナントネガティブ突然変異としても働くかどうか試験した。 I L一 1 8での刺激は A P— 1活性を約 3〜 4倍増加し、この活性化は M y D 8 8 (アミノ酸 1 5 2から 2 9 6 ) の共発現（coexpression) で阻害された（図 7参照）。これらの結果は、 M y D 8 8が N F— κ Bと A P— 1 の I L一 1 8誘導活性化に関与していることを示している。

次に、 N F— κ Βの I L一 1 8誘導活性化が M y D 8 8欠損細胞で見られるかどうかを検討した。 I L— 1 2及び抗 C D 3抗体の存在下で 4 日間培養された脾臓 T細胞を 3時間飢餓状態にした後 I L - 1 8で刺激した。刺激された細胞から抽出された核を、 N F— κ B接合部を含む特定のプロ一ブを用いてゲル移動度シフト（mobility shift)分析を行つた。 I L - 1 8誘導 N F - κ B D N A接着活性は、野生型細胞からの核抽出物中では検出されたが、 M y D 8 8欠損細胞からは検出されなかった。他方、野生型あるいは My D 8 8欠損胸腺細胞を TN F— αで処理すると、ほとんど同レベルの N F— / c BDN Α接着活性を生じ、 My D 8 8 欠損細胞中の欠損 I L一 1 8誘導 N F— κ Β活性は、 N F— κ Βの異常機能あるいは調節低下によるものではないことを示した。

N F— κ Βの活性化の誘導に加えて、 I L— 1は C— J u n N端末キナ一ゼ（ J NK) を活性化することが知られている。 I Lー 1 8が J N Kの活性化を誘導するかどうか試験するため、代替として G S T— c一 J u n—融合蛋白を使ってインビト口キナーゼ分析を行った。 I L一 1 8を使った処理は、野生型マウスの T h 1—発達細胞中の J NKの活性化を誘導したが、 I L一 1 8誘導 J NK活性化は My D 8 8欠損細胞では見られなかった。反対に J NKの通常の活性が TN F— αで処理した M y D 8 8欠損細胞で見られた。 I L— 1 8誘導による N F— κ B及び J NKの活性は、 My D 8 8欠損マウス中では欠失している。これらの結果は、 M y D 8 8が N F— κ B及び J NKの I L一 1 8誘導活性化に必須であることを示している。

実施例 5 (My D 8 8ノックアウトマウスのマクロファ一ジと脾臓 B細胞の細菌細胞壁成分不応答性）

5— 1 (T L R 4欠損マウスの作製）

最近、 C S HZH e Jマウスが T o l 1様受容体（T L R) 4遺伝子のミスセンス点突然変異により L P Sに対して低応答性であることが報告され（Science 282, 2085-8， 1998、 J. Exp. Med.189, 615-625, 1999、 J. Immunol.162, 3749-3752, 1999), また本発明者らによって、 T L R 4欠損マウスのマク口ファ一ジと脾臓 B細胞が L P Sに低応答性であり、 T L R 4遺伝子が L P Sシグナル伝達に不可欠であることが判明した (J. Immunol.162， 3749-3752, 1999)。そこで、 T L R 4欠損マウスと M y D 8 8欠損マウスとのマクロファージと脾臓 B細胞の細菌細胞壁成分に対する応答性を比較するために、 T L R 4欠損マウス（ 1 2 9 ZO 1 a X C 5 7 B LZ 6から交配した F ₂) を文献記載（J. Immunol.162, 1999,3749-3752) のようにジーン夕一ゲティング法により作製した。また、以下の実施例には、年齢が一致する野生型マウス、 T L R 4欠損マウス及び M y D 8 8欠損マウスを使用した。

5 - 2 (細菌細胞壁成分の調製）

フエノール抽出し、ゲル濾過法によって精製されたェセリシァ ' コリ (Escherichia coli) 血清型 O 5 5 ： B 5 (シグマ社製）、クレブシエラ · ニュ一モニエ（Klebsiella pneumoniae) (シグマ社製）、シユードモナス · ァエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa) 血清型 1 0 (シグマ社製）、サルモネラ ' チフィムリウム（Salmonella typhimurium) (シグマネ土製）、セラチア ' マルセッセンス（Serratia marcescens) (シグマ社製）、フレクスナ一赤痢菌（Shigella flexneri) 血清型 1 A (シグマ社製）、ビブリオ . コレレエ（Vibrio cholerae) 血清型イナバ 5 6 9 B (シグマ社製）等の L P Sを購入した。フエノールクロロフオルム石油ェ一テル抽出法により調製されたサルモネラ ·ミネソタ（ Salmonella minnesota) R e — 5 9 5の L P Sは購入した（シダマ社製）。また、文献（FEBS Lett. 332, 1994,197-201) 記載の方法で、ボルフイロモナス ' ジンジバリス ( Porphyromonas gingivalis) 3 8 1の L P S及びリピド Aを調製した, 結核菌の全細胞溶解物は、デュボス培地（ディフコ社製）で結核菌ァォャマ B株（N I H J 1 6 3 5 ) を 1 ヶ月間培養した後、細胞を回収してリン酸緩衝生理食塩水（P B S ) で再懸濁し、細胞を超音波処理して調製した。

5 - 3 (腹膜マクロファージの調製）

上記作製した野生型マウス、 T L R 4欠損マウス及び M y D 8 8欠損マウスのそれぞれの腹腔内に 4 %のチォダリコール酸塩を 2 m 1 ずつ注入し、 3 日後に腹膜腔から腹膜滲出細胞を単離し、氷温のハンクス緩衝液（Hank's buffered salt solution： H B S S ) で洗浄することによつて腹膜細胞を得た。この細胞を R P M I 1 6 4 0培地に浮遊させ、ブラスチックシャーレに分注し、 3 7 °Cで 2時間培養し、その後、ハンクス緩衝液で洗浄することにより非付着細胞を取り除き、付着細胞を腹膜マクロファージとして以下の実験に使用した。

5 - 4 (サルモネラ ·ミネソタ R e — 5 9 5の L P Sに対する不応答性）上記野生型マウス（野生型）、 T L R 4欠損マウス（T L R 4—ノ一）、 M y D 8 8欠損マウス（M y D 8 8 — /—）等のそれぞれの腹膜マクロファージの L P Sに対する応答性をサルモネラ ' ミネソタ R e _ 5 9 5 の L P Sを用いて調べた。それぞれのマウスの腹膜マクロファージを、種々の濃度（ 0、 0 . 0 1 、 0 · 1 、 1 、 1 0又は l O O ^ gZm l ) の L P Sの存在下で 2 4時間培養して刺激し、 L P S応答性のマク口ファージから放出される腫瘍壊死因子（TN F — α ) の濃度を E L I S A により測定した（図 8 A参照）。この結果から、野生型マウスのマクロファ一ジでの T N F — αの産生は、 L P Sの投与量に応じて増加するのに対して、 T L R 4欠損マウスや M y D 8 8欠損マウスでは、 l O O ^ g /m 1 の濃度の L P S刺激においても T N F - を産生せず、これらが L P S不応答性であることがわかった。

また、サルモネラ · ミネソタ R e _ 5 9 5の L P Sに対する脾臓 B細胞の応答性についても調べてみた。野生型マウス、 T L R 4欠損マウス、 M y D 8 8欠損マウスのそれぞれの脾臓 B細胞（ 1 X 1 0 ⁵) を単離し、 9 6ゥエルの培養皿内で培養し、種々の濃度（ 0、 0 . 0 1、 0 . 1 、 1、 1 0又は 1 0 0 / g /m l ) の L P Sで脾臓 B細胞を刺激した。培養から 4 0時間後に 1 C i の [³ H] —チミジン（デュポント社製）を添加して更に 8時間培養し、 [³H] の摂取量をシンチレ一シヨン力ゥン夕一（パッカード社製）で測定した（図 8 B参照）。この結果から、 L P Sの刺激により野生型マウスの脾臓 B細胞では、 L P Sの投与量に依存して細胞増殖反応を促進したが、 T L R 4欠損マウス又は M y D 8 8欠損マウスのどちらの脾臓 B細胞においても、 L P Sによる細胞増殖反応は見られなかった。

また、フローサイトメトリ一により、 R e — 5 9 5の L P Sに対する応答における脾臓 B細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（MH C ) クラス II ( I 一 A ^b分子）の発現について調べてみた。野生型マウス、 M y D 8 8欠損マウス及び T L R 4欠損マウスのそれぞれの脾臓 B細胞 ( 1 X 1 0 ⁶) を種々の濃度（ 0、 0 . 0 1 、 0 . 1 、 1 、 1 0又は 1 0 0 ii g /m 1 ) の L P S共存下に 4 8時間培養した。培養後細胞を採取して、フィコエリトリン（ p h y c o e r y t h r i n : P E ; ファ一ミンジェン社製）で標識した抗 B 2 2 0抗体、又はピオチン化抗マウス I — A ^h抗体（ファ一ミンジェン社製）に、フルォレセインイソシァネート（F I T C ; ファーミンジェン社製）で標識したストレプトアビジンを結合させた F I T C標識化抗体により、それらの細胞表面における I 一 A ^b分子に結合させて細胞を染色した。染色した細胞をセルクェストのソフトウェア（べクトンディッキンソン社製）により蛍光活性化セルソ一夕一キヤリバ一（FACS Calibur) で分析した。この結果から、 R e — 5 9 5の L P Sは、野生型マウスの脾臓 B細胞表面での I 一 A ^h 分子の発現を増大しているのに対し、 T L R 4欠損マウスや M y D 8 8 欠損マウスの脾臓 B細胞では、高濃度の L P S ( 1 0 0 g /m 1 ) で刺激しても、 I 一 A^b分子の発現は増大しなかった（図 8 C参照）。以上のことから、 TL R 4欠損マウスと My D 8 8欠損マウスは共にサルモネラ · ミネソタ R e— 5 9 5の L P Sに対して不応答であることがわかる。

5 - 5 ( I L一 4と I F N—ァに対する T L R 4欠損マウス及び My D 8 8欠損マウスの応答性）

T L R 4欠損及び M y D 8 8欠損マウスの脾臓 B細胞が全ての刺激物に対して不応答性であるかどうかを調べるため、 T L R 4欠損マウス及び My D 8 8欠損マウスの脾臓 B細胞の他の刺激物に対する応答性を検討したところ、以下に示すように応答性は損なわれておらず、これらのマウスは L P Sに対する応答性が特異的に欠損していることがわかった。野生型マウス、 My D 8 8欠損マウス、及び T L R 4欠損マウスのそれぞれの脾臓 B細胞（ 1 X 1 0 ⁵) を単離し、 I L— 4 (G e n z ym e社製）及び抗 I gM抗体の共存下又は抗 CD 4 0抗体の存在下において 4 0時間培養し、 [³H] —チミジン（デュポント社製）を添加して更に 8時間培養し、 [³H] の取込み量を 3シンチレーシヨンカウン夕一で測定した（図 9 A参照）。この結果から、 T L R 4欠損マウス及び M y D 8 8欠損マウスの脾臓 B細胞は、 I L一 4及び抗 I g M抗体の混合物、又は抗 C D 4 0抗体に対する応答において、野生型マウスの脾臓 B細胞と同じ挙動を示した。

次に、野生型マウス、 My D 8 8欠損マウス、及び T L R 4欠損マウスのそれぞれの脾臓 B細胞（ 1 X 1 0 ⁶) を、 l O O UZm l の I L一 4の存在下又は非存在下において 4 8時間培養しそれらの細胞を刺激した。その後、 P E標識抗 B 2 2 0抗体又は F I T C標識抗マウス I 一 A b抗体により、脾臓 B細胞表面の I 一 A ^h分子と結合させて細胞を染色しセルクエス卜 · ソフトウェアを用いて蛍光活性化セルソ一夕一キヤリバ —で細胞増殖を測定した（図 9 B参照）。その結果、 T L R 4欠損マウス及び My D 8 8欠損マウスの脾臓 B細胞は、 I L一 4に対する応答においても、野生型マウスの脾臓 B細胞と同じ挙動を示した。

野生型マウス、 M y D 8 8欠損マウス又は T L R 4欠損マウスのそれぞれの腹腔内に、 5 0 0 0 Uの I F N— τ (G e n z yme社製）又は P B Sを投与し、投与から 3 日後に腹膜マク口ファ一ジを採取し、 F I T C標識抗マウス I 一 A ^b抗体でマクロファ一ジの膜面に存在する I 一 A ^b分子と結合させて細胞を染色し、セルクェストのソフトウェアにより蛍光活性化セルソ一夕一キヤリバーで分析した（図 9 C参照）。この結果から、野生型マウス、 T L R 4欠損マウス及び My D 8 8欠損マウスにおいて、腹膜マクロファージでの I 一 A^b分子の発現、すなわち I F N - rが誘発する細胞増殖の阻害も同程度であった。

5 - 6 (貧食作用分析）

野生型マウス、 My D 8 8欠損マウス及び TL R 4欠損マウスのマク口ファ一ジに 0. 0 2 5 %の蛍光ラテックスビーズ（ 0. 7 5 m) (ポリサイエンス社製）を加え、 3 7 °Cで 2時間、 C〇₂インキュベータ一中で培養した。その後、貧食されなかったビーズを取り除くため、この培養物を P B Sで 3回勢いよく洗浄し、 2 0分間、 2. 5 %のホルムァルデヒドを含む P B Sでインキュベートし、培養物をホルムアルデヒドで固定した。これらの固定細胞を、 Ax i o p h o t o顕微鏡（C a r 1 Z e i s s社製）で視覚化したところ、 T L R 4欠損マウス及び M y D 8 8欠損マウスの腹膜マクロファージは共に、ラテックス粒子を貧食していることがわかった。したがって、これらの他の刺激による T L R 4欠損マウス及び My D 8 8欠損マウスのマクロファ一ジの貧食能は損なわれていないことがわかった。

5 - 7 (ポルフィロモナス · ジンジバリスの L P Sに対する応答性）ポルフィ口モナス · ジンジバリスの L P Sは、 L P S低応答性である C 3 H/H e J マウスの細胞の活性化能において、ある程度の反応を示すことから（ Immunol.158， 1997,4430-6)、それぞれのマウスのポルフイロモナス · ジンジバリスの L P Sに対する応答性を前記サルモネラ * ミネソタ R e — 5 9 5の場合と同様に調べた。野生型マウスのマク口ファージでは、ポルフィロモナス · ジンジバリスの L P Sの投与量に依存して T N F— ひを誘発していたが、 T L R 4欠損マウスのマクロファージでは、 C 3 HZH e J マウスのマクロファ一ジと同様に低応答性であり、野生型マウスのマクロファ一ジの 3分の 1程度の TN F— α産生能を示したに過ぎなかった。これに対し、 My D 8 8欠損マウスのマクロファ一ジでは、高濃度の L P Sで刺激しても、検出しうる程の TN F— αを産生しなかった（図 1 0 Α参照）。

また、ポルフィロモナス · ジンジバリス 3 8 1 の L P Sに対して、 T L R 4欠損マウスの脾臓 B細胞は低レベルの増殖応答を示し、脾臓 B細胞の I — A ^b分子の発現を増大させていたが、 M y D 8 8欠損マウスの脾臓 B細胞は増殖応答を示さず、 I —A^b分子の発現も確認できなかつた（図 1 0 B、 C参照）。また、ボルフイロモナス · ジンジバリス 3 8 1 のリピド Aにおいても同様の結果が得られた。これらのことから、ポルフイロモナス · ジンジバリスの L P Sに対する応答において、 T L R 4 欠損マウスは低応答性であり、 My D 8 8欠損マウスは不応答性であることがわかった。また、ボルフイロモナス ' ジンジバリスの L P Sにより誘発されるシグナル伝達に対し、 M y D 8 8は必須であるが、 T L R 4は部分的に寄与していることがわかった。

5 - 8 (大腸菌〇 5 5 ： B 5の L P Sに対する応答性）

大腸菌（05 5 ： B 5 ) の L P Sに対する応答性についても、前記サルモネラ · ミネソタ R e — 5 9 5の場合と同様に調べた。 T L R 4欠損マウス及び M y D 8 8欠損マウスの腹膜マクロファージでは、野生型マウスのマクロファージと比較して、大腸菌（05 5 : B 5 ) の L P Sに対する応答性を損なっていた（図 1 1 A)。しかし、高濃度の L P Sで刺激した場合、 T L R 4欠損マウスのマクロファ一ジは少量の TN F— a を産生した力、それに対して M y D 8 8欠損マウスのマク口ファージは、高濃度の L P S刺激においても T N F— αを産生しなかった。

また、これらマウスの脾臓 Β細胞における増殖応答についても同様な傾向が見受けられた（図 1 1 Β参照）。さらに、 1 0 jLt g Zm 1 を超える L P Sで刺激した T L R 4欠損マウスの脾臓 B細胞は、野生型マウスの脾臓 B細胞と同程度の I 一 A^b分子の発現を示したが、 M y D 8 8欠損マウスの脾臓 B細胞は 1 O O ^ gZm l の L P Sでの刺激に対しても I 一 A ^b分子の発現を示さなかった（図 1 1 C参照）。以上の結果から、ポルフィロモナス · ジンジバリスの L P S刺激の場合と同様に、 T L R 4 欠損マウスは大腸菌（05 5 : B 5 ) の L P Sに対して低応答性であるが、 M y D 8 8欠損マウスは不応答性であることがわかった。

5 - 9 (ペプチドグリカンに対する応答性）

グラム陽性菌の主要な細胞壁成分であるべプチドグリカン（P G N) がマク口ファ一ジを活性化することが報告されている（J. Immunol.155, 1995,2620-30、 Infect. Immun. 62,1994, 2715-21)。そこで、スタフィロコッカス · ァウレウスの P GN ( F 1 u k a社製）に対する応答性を前記サルモネラ ' ミネソタ R e — 5 9 5の場合と同様に調べた。 P GN で刺激した場合、 T L R 4欠損マウスの腹膜マクロファージは、投与量に依存して野生型マウスのマク口ファージとほぼ同程度の TN F— αを産生したが、 M y D 8 8欠損マウスのマクロファ一ジは、高濃度の P G N刺激に対してもに TN F— ひを産生しなかった（図 1 2 A参照）。

ス夕フイロコッカス · ァゥレウスの P GNで刺激した場合、野生型マウスの脾臓 B細胞は細胞増殖応答を示し、 M y D 8 8欠損マウスにおいては野生型マウスと比べて細胞増殖応答が大きく損なわれていたが、その程度が T L R 4欠損マウスの場合は小さかった（図 1 2 B参照）。また、 1 0 /x gZm l を超える濃度の P GNで刺激した場合、野生型マウスも T L R 4欠損マウスも I 一 A ^b分子発現の増大が観察されたが、 My D 8 8欠損マウスの脾臓 B細胞では、 1 0 0 / gZm 1 の P GN刺激の場合でも I 一 A^b分子の発現の増大は見られなかった（図 1 2 C参照）。これらのことより、 T L R 4欠損マウスは、黄色ブドウ球菌の P G Nに対して野生型マウスとほぼ同様の応答を示すが、 My D 8 8欠損マウスは不応答性であることがわかった。

5 - 1 0 (リポティコ酸に対する応答性）

リポティコ酸（L TA) は、グラム陽性菌の細胞壁成分であって、単球とマクロファージの活性化を誘導する（ Infect. Immun. 62, 1994,2715-21) ことから、ストレプトコッカス.' ニューモニァの L TA に対する応答性を前記サルモネラ · ミネソタ R e— 5 9 5の場合と同様に調べた。野生型マウスの腹膜マクロファージは、 L T Aの投与量に応じて T N F— αの産生を増大していた。これに対して、 My D 8 8欠損マウスのマクロファージでは、高濃度の L T A刺激に対しても T N F— ひを産生しなかった。また、 T L R 4欠損マウスも野生型マウスと比較すると T N F— ひの産生が損なわれていたが、 1 0 0 2 87111 1 のし丁 A刺激では T N F - αを誘発していた（図 1 3 Α参照）。

次に、ストレプトコッカス · ニューモニァの L TA刺激に対するこれらマウス脾臓 B細胞の細胞増殖反応と I - A^b分子の発現の増大を分析した（図 1 3 B参照）。この結果から、野生型マウスの脾臓 B細胞は、 L T Aの投与量に応じて L T Aに対する応答を増大させるのに対し、 My D 8 8欠損マウスの脾臓 B細胞は、 L T Aに対する増殖反応を非常に損なっていた。 T L R 4欠損マウスの脾臓 B細胞においても増殖反応は損なわれていたが、高濃度の L T Aで刺激した場合では増殖応答性を示した。また、野生型マウス及び T L R 4欠損マウスの脾臓 B細胞では細胞表面において I 一 A ^h分子の発現が増大するのに対し、 M y D 8 8欠損マウスの脾臓 B細胞では増大がみられなかった（図 1 3 C参照）。これらのことから、 M y D 8 8欠損マウスはストレプトコッカス . 二ュ一モ二ァの L T A刺激に対して不応答性であることがわかる。

5 - 1 1 (結核菌全細胞溶解物に対する応答性）

結核菌細胞壁成分、特にリポアラビノマンナンは、骨髄性細胞の活性ィ匕を誘導することで知られていること力、ら（J. Immunol. 149, 1992,541-7、 J. Clin. Invest. 91, 1993,2076-83)、結核菌全細胞溶解物に対する応答性を前記サルモネラ · ミネソタ R e— 5 9 5の場合と同様に調べた。野生型マウスのマクロファージは、全細胞溶解物の投与量に依存して T N F— αを産生していた。また、 T L R 4欠損マウスのマク口ファ一ジも、野生型マウスのものと比較するとわずかであるが T N F — ひを産生していた。しかし、 M y D 8 8欠損マウスのマクロファージは、高濃度の全細胞溶解物に対しても T N F — ひを産生しなかった（図 1 4 A参照）。

次に、結核菌全細胞溶解物による刺激に対するこれらマウスの応答性について調べた。野生型マウスの脾臓 B細胞は、全細胞溶解物の投与量に依存して増大する細胞増殖応答と細胞表面での I 一 A ^b分子の発現を示し、 T L R 4欠損マウスの脾臓 B細胞でもまた、野生型マウスのものより低いものの細胞増殖応答と I 一 A ^h分子の発現を示した。これに対して、 M y D 8 8欠損マウスの脾臓 B細胞では、増殖反応と I 一 A ^b分子の発現の増大が大きく損なわれており、全細胞溶解物に対して不応答性であることがわかった（図 1 4 B 、 C参照）。 5 - 1 2 (他の菌体細胞壁成分に対する応答性）

野生型マウス、 T L R 4欠損マウス及び M y D 8 8欠損マウスの応答性について、他の菌体細胞壁成分 [クレブシエラ ' ニューモニエ、シュ —ドモナス · ァゥリギノサ 1 0、サルモネラ · チフィムリウム、フレクスナ一赤痢菌、ビブリオ，コレラ等の L P S、及び大日本製薬株式会社のカヮ夕シゲォ氏から提供されたス夕フイロコッカス · ェピデルミディス（Staphylococcus eqidermidis) の P GN] に対する応答性についても上記と同様に調べた。結果を表 1に示す。この表 1から、全ての菌体の成分において、 My D 8 8欠損マウスが不応答性であることがわかつた。

表 1 試料マウス応答性

LPS 野生 TLR4-/- ΜνΠ88-/-

Escherichia coll 055:B5 ++ +

i ieusieua pnBurnoniee ++

Porphyromonas glngivalls ++ +

Pseudomonas aeruginosa ++ +

Salmonella mlnnesota Re595 ++

Salmonella typhlmurlum ++ +

Serratia marcescens ++ + 一

Shigella flexner! ++. +

Vibrio cholerae ++ +

PGN

Staphylococcus aureus ++ ++

Staphylococcus epidermldls ++ +

LTA

Streptococcus faecalis ++ + 一

結核菌全細胞溶解物

Mycobacterium tuberculosis ++ +

また L P Sは、 T L R 4を独自のシグナル受容体として利用し、不応答性を示すもの（サルモネラ · ミネソタ R e 5 9 5ゃクレブシエラ，二ユーモニエ等の L P S) や、 T L R 4欠損マウスに対して低いが応答性を示すもの（ボルフイロモナス · ジンジバリス、ェシエリキア . コリ O 5 5 : B 5、シュ一ドモナス ' ァゥリギノサ、フレクスナ一赤瘌菌、サルモネラ ' チフィムリウム、ビブリオ ' コレラ等の L P S) の 2つの型に分類できることがわかった。後者の L P Sに対して My D 8 8欠損マウスは応答性を示さないことから、これらの L P Sの認識とシグナル伝達は、 T L R 4と他の T L Rとの両方により、及び Z又は My D 8 8をアダプタ一分子として使用する T L R関連受容体により介されるものと考えられる。

実施例 6 (T L R 2ノックアウトマウスの作製）

1 2 9 / S V Jマウス遺伝子ライブラリー（ストラタジーン社製）から、ヒト T L R 2遺伝子と類似したマウス E S Tクロ一ン（登録番号 D 7 7 6 7 7 ) 由来のプローブを用いて、 T L R 2遺伝子をスクリ一ニングし、 pBluescript ベクター（ストラタジーン社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及び DN A配列決定により特定した。夕ーゲッティングベクタ一は、 T L R 2遺伝子の細胞内領域を含むェクソン部位 1. 3 k bの遺伝子フラグメントを、ポリ Aシグナルをもつ pMCl-neo (ストラタジーン社製）に置換することにより構築した。かかる夕一ゲッティングベクタ一は、 4. 8 k bの 5 ' 遺伝子フラグメントと 1. 0 k bの 3 ' 遺伝子フラグメントとをフランキング配列として有し、 H S V_ t kカセットを 5 ' 末端に含んでいる。この夕一ゲッティングべク夕一を S a i l により線状化し、胎生 1 4. 1 日目の胚幹細胞（ E S細胞）にエレクトポレーシヨンし、 G 4 1 8及びガンシクロビアに抵抗性を示す 1 2 0個のクローンを、 P C Rによる相同組換えのためにスクリ —ニングし、図 1 5 Aに示すプロ一ブを用いるサザンブロット分析により 9個を確かめた。

相同組み換え変異 T L R 2対立遺伝子を含有していた 3個の標的 E S クローンを、 C 5 7 B LZ 6マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製した。この雄のキメラマウスと C 5 7 B L / 6雌マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをィンタークロスすることによってホモ接合体マウスを得た（図 1 5 B)。なお、本発明の T L R 2欠損マウスはメンデルの法則に従い作製することができ、 2 0週目までは顕著な異常を示さなかった。相同組み換え変異により T L R 2遺伝子の不活性化が生起していることを確認するため、野生型マウス（ + / + ) 及び丁 L R 2ノックアウトマウス（一 Z—）の腹腔マクロファージ（ 5 X 1 0⁶) から抽出した全 R N A ( 1 5 ) を電気泳動にかけナイロン膜に移して、文献 (Immunity 9, 143-150, 1998) 記載の方法と同様に、 [³² P] で標識した T L R 2 に特異的な c D N A又は G A P D H ( glycelaldehyde-3- phosphate dehydrogenase) に特異的な c D N Aを用いてノーザンブロット分析を行った。これらの結果から、 T L R 2 mR N Aは T L R 2欠損マウスの腹腔マク口ファージからは検出されなかった（図 1 5 C)。また、 T L R 2 ノックアウトマウスの胸腺細胞及び脾臓細胞中の C D 3、 B 2 2 0 , C D 4及び C D 8の発現は、野生型マウスのものと比較しても差異がなかった（図は示さず）。

実施例 7 (T L R 2ノックアウトマウスのエンドトキシン応答性）本発明の TL R 2ノックアウトマウス（ 5匹）、 TL R 4ノックアウトマウス（ 5匹）及び野生型マウス（ 5匹）に、それぞれ大腸菌（O 5 5 ： B 5 ) 由来の L P Sを 1 m g投与し、その生存率により L P S不応答性を調べた。結果を図 1 6に示す。図 1 6より、本発明の T L R 2ノックアウトマウス（T L R 2—ノ一）及び野生型マウスは L P Sに応答し、投与後 4日でほとんどが死亡したのに対して、 T L R 4ノックアウトマウス（T L R 4—ノー）は、 L P S投与後 6日目においても死亡するものはなく、エンドトキシン不応答性であることを確認することができた。実施例 8 (T L R 2ノックァゥトマウスのグラム陰性菌の菌体成分に対する応答性）

T L R 2ノックアウトマウス（T L R 2— Z—）、 T L R 4ノックァゥトマウス（TL R 4— Z—）及び野生型マウス（野生型）のそれぞれの腹腔内に 4 %のチォグリコール酸培地（D I F C O社製）を 2 m 1 ずつ注入し、 3 日後に各マウスの腹腔内から腹膜滲出細胞を単離し、これらの細胞を 1 0 %のゥシ胎仔血清（G I B C O社製）を添加した R PM I 1 6 4 0培地（ G I B C 0社製）中で 3 7 °Cにて 2時間培養し、氷温のハンクス緩衝液（Hank's buffered salt solution： H B S S ； G I B C O社製）で洗浄することにより非付着細胞を取り除き、付着細胞を腹膜マクロファージとして以下の実験に使用した。

得られた各腹膜マクロファージを I N F r ( 3 0 u n i t / m 1 ) の存在下又は非存在下において、 1. 0 n gZm 1 の大腸菌由来の合成リピド A ( 5 0 6化合物；第一化学薬品社製）又はサルモネラ · ミネソタ R e _ 5 9 5由来の L P S (シグマ社製）といつしょに 2 4時間培養した。なお、かかる合成リピド Aとしては、 0. 0 2 5 %のトリエチルァミンを含有し、エンドトキシンを全く含有しない水に可溶化したものを用いた。培養後、培養上清中の I L— 6 (図 1 7 A)、 T N F - α (図 1 7 Β)、 Ν0₂- (図 1 7 C) の産生量を測定した。なお、 I L一 6は固相酵素免疫検定法（E L I S A ； E ND OG E N社製）により、 TN F 一 aは製造者（G e n z y m e社製）の指示に基づき E L S I Aにより、 N〇 ₂—は N〇 ₂ZN0₃アツセィキット（同仁科学研究所社製）を使用した G r e i s s法により測定した。

上記の結果から、野生型マウス及び T L R 2 ノックアウトマウスのマクロファージでは、 L P Sやリピド Aに対して同様な応答を示し、 I L 一 6 と TN F— ひを産生していた。また、 L P Sやリピド Aに I F N— 7を加え培養することにより、さらなる TN F— α産生の増大が確認できた。一方、 T L R 4ノックアウトマウスのマクロファージにおいては、 I L _ 6 と T N F— αを産生しなかった。また、野生型マウス又は T L R 2 ノックアウトマウスから得られたマクロファージを I F N— ァの添加したリピド A又は L P Sにおいて培養することにより、 NO ₂—の産生が確認できた。また、リピド Aや L P Sの投与量を 1 / g /m 1 とした場合も前記と同様の結果が得られた（図は示さず）。

次に、図 1 7 Dに示す各種濃度のサルモネラ ' ミネソタ R e— 5 9 5 由来の L P Sの存在下で、野生型マウス、 T L R 2ノックアウトマウス及び T L R 4ノックアウトマウスの各腹腔マクロファージを培養して T N F— αの産生を測定した。この結果から、野生型マウス及び T L R 2 ノックアウトマウスのマクロファージは、 L P Sの投与量に応じて同様な増加傾向を示すのに対し、 TL R 4ノックァゥトマウスのマクロファージは、いかなる濃度でも T N F— ひを産生しなかった。

実施例 9 (サルモネラ ·ミネソタ R e— 5 9 5の L P Sに対する応答性）サルモネラ · ミネソタ R e— 5 9 5の L P Sに対する各種マウス（野生型、 T L R 2— Z— 、 T L R 4 -/-) の脾臓細胞の応答性について調べた。それぞれのマウスの脾臓細胞（ 1 X 1 0⁵) を単離し、図 1 8 Aに示す各種濃度の L P Sにより 9 6ゥエルプレート内で培養して刺激した。培養から 4 0時間後に 1 C i の [ ³ H] —チミジン（デュポント社製）を添加して更に 8時間培養し、 [³H] の摂取量を /3シンチレ一シヨンカウンタ一（パッカ一ド社製）で測定した（図 1 8 A)。この結果から、野生型マウス及び TL R 2ノックァゥトマウスの脾臓細胞では、 L P Sの投与量に依存して同様に細胞増殖反応を促進していたが、 T L R 4欠損マウスの脾臓細胞では、いかなる濃度の L P S刺激においても L P Sによる細胞増殖反応は見られなかった。

また、フロ一サイトメトリ一により、 R e— 5 9 5の L P Sに対する応答における B細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（MHC) クラス II ( I - A ^b) の発現について調べてみた。野生型マウス、 T L R 2 ノックアウトマウス（ 2— Z—）、 T L R 4ノックアウトマウス（4一 Z—）のそれぞれの脾臓 B細胞（ 1 X 1 0⁵) を単離し、種々の濃度（ 0、 1 0¹、 1 0²、 1 0³、 1 0⁴又は 1 0⁵ n gズ m l ) の L P S又は 1 0 0 UZm 1 の I L一 4を用いて、 9 6ゥエルプレート内で 4 8時間培養した。培養後細胞を採取して、フィコエリトリン（ p h y c o e r y t h r i n : P E ；ファーミンジェン社製）で標識した抗 B 2 2 0抗体、又はピオチン化抗マウス I 一 A^b抗体（ファーミンジェン社製）に、フルォレセインイソシァネート（F I T C ；ファーミンジェン社製）で標識したストレプトアビジンを結合させた F I T C標識化抗体により、それらの細胞表面における I 一 A^b分子に結合させて細胞を染色した。染色した細胞をセルクェストソフトウェア（べクトンディッキンソン社製）により蛍光活性化セルソ一夕一キヤリバ一（FACS Calibur) で分析した (図 1 8 B)。この結果から、 R e— 5 9 5の L P Sは、野生型マウス及び T L R 2ノックァゥトマウスの脾臓 B細胞表面での I 一 A ^b分子の発現を増大しているのに対し、 T L R 4欠損マウスの脾臓 B細胞では、高濃度の L P S ( 1 0⁵ n gZm 1 ) で刺激しても、 I 一 A ^b分子の発現は増大しなかった。以上のことから、 TL R 2ノックアウトマウスは、野生型マウス同様 L P Sに対して応答性を示すことがわかった。また、 I L - 4で刺激した場合では、脾臓 B細胞表面での I 一 A^b分子の発現はどのノックァゥ卜マウスにおいても正常であった。

実施例 1 0 (T L R 2ノックアウトマウスのマクロファージのグラム陽性菌由来の細胞壁成分不応答性）

上記野生型マウス（野生型）、 T L R 2ノックアウトマウス（T L R 2 一 Z―)、 T L R 4ノックアウトマウス（T L R 4— /一）等のそれぞれの腹膜マクロファ一ジのグラム陽性菌由来の細胞壁成分に対する応答性を、ス夕フイロコッカス * ァウレウス（S. aureus)、コリネバクテリウム ' ジフテリア（C. diphtheriae) 及びノカルジァ · コエリア力（N. coeliaca) の細胞壁調製物を用いて調べた。細胞調製物は、文献（Biken J. 18， 77-92, 1975、 Infect. Immun. 38， 817-824、 1982) 記載の方法と同様に、適切な培養条件下で培養した細胞菌体を、ブラウン · メカ二力ル · セル · ホモジナイザ一（M S Kモデル； B. Braun Apparatebau ¾ 製）又は Dyno-Mill (タイプ K D L ； Willy A, Biochofen Manufactureing Engineers社製）のいずれかで破壊した。破壊した細胞懸濁液の分画遠心法により得た粗細胞壁画分をプロテアーゼで処理し、細胞壁に元々存在していない成分を除去することにより精製調製した。

それぞれのマウスの腹膜マク口ファ一ジを、種々の濃度（ 0 、 0 . 1 、 1 、 1 0又は 1 0 0 g Zm 1 ) の上記調製物の存在下で 2 4時間培養して刺激し、それぞれのマク口ファージから放出される腫瘍壊死因子（T N F - α ) の濃度を E L I S Aにより測定した（図 1 9 )。これらの結果から、 T L R 2 ノックアウトマウスのマクロファージは、野生型マウス及び T L R 4ノックアウトマウスのものより、グラム陽性菌由来の細胞壁成分に対する応答における T N F — aの産生が損なわれることがわかつた。

実施例 1 1 ( T L R 2 ノックアウトマウスのグラム陽性菌の細胞壁成分に対する応答性）

次に、グラム陽性菌のどの細胞壁成分が T L R 2を介してマクロファージを活性化するのかを調べてみた。従来、グラム陽性菌の細胞壁成分であるペプチドダリカン（P G N) 及びリポティコ酸（L T A) が単球 /マクロファージを活性化するとの報告がある（ Infect. Immun. 60, 3664-3672, 1992、 Immunity 1, 509-516, 1994、 J. Biol. Chem. 271, 23310-23316, 1996, Infect. Immun. 64, 1906-1912, 1996) こと力、ら、 1 O ^ g/m lのス夕フイロコッカス · ァゥレウスの P G N ( F 1 u k a社製；図 2 0 A ) 又は 1 0 gZm lのス夕フイロコッカス ' ァウレウスの L T A (シグマ社製；図 2 0 C ) を用いて、実施例 8 と同様の方法により、各種マウスの腹膜マク口ファージに対する応答での I L一 6 及び N0₂—の産生量を測定した。また、実施例 1 0と同様に、各種マウスの腹膜マクロファージの P GN (図 2 0 B) 又は L TA (図 2 0 D) に対する応答での TN F— αの産生を測定した。

図 2 O Aの結果から、野生型マウス及び T L R 4ノックアウトマウスの腹膜マクロファ一ジでは、 P GNに対する応答により I L— 6を産生するのに対し、 T L R 2ノックァゥトマウスのものでは産生しないことがわかった。また、野生型マウス及び T L R 4ノックアウトマウスの腹膜マク口ファージを I F N—ァの存在下で P GNといつしょに培養すると N〇 ₂—を産生するのに対して、 T L R 2 ノックアウトマウスのものでは産生しないことがわかった。一方、野生型マウス及び T L R 2ノックァゥトマウスの腹膜マクロファージでは、 L T Aに対する応答により I L - 6を産生するのに対し、 T L R 4ノックァゥ卜マウスのものでは産生しないことがわかった（図 2 0 C)。また、野生型マウス及び T L R 2 ノックァゥトマウスの腹膜マクロファージを I F N—ァの存在下で L T Aといつしょに培養すると N0₂—を産生するのに対して、 T L R 4ノックアウトマウスのものでは産生しないことがわかった（図 2 0 C

図 2 0 Bに示されているように、 TL R 4ノックァゥトマウスの腹膜マクロファージは、野生型マウスのものと同様に、 P GNの投与量に応じて TN F— αの産生を増加させるのに対して、 TL R 2ノックアウトマウスのものでは、 T N F— α産生が実質的に損なわれており、 P GN 不応答性であることがわかった。一方、図 2 0 Dに示されているように、 TL R 2ノックァゥトマウスの腹膜マクロファ一ジは野生型マウスのものと同様に、 L TAの投与量に応じて TN F— αの産生を誘導するのに対し、 T L R 4ノックアウトマウスのもめでは、 T N F— ひ産生がなく、 L TA不応答性であることがわかった。以上のことから、グラム陽性菌の細胞壁成分である P 0 が丁 L R 2 を介してマク口ファ一ジを活性することや、 L TAが T L R 4を介してマクロファージを活性することがわ力、つた。

実施例 1 2 (L P S又は P G N刺激によるインビトロでのキナーゼアツセィ及びウエスタンプロット）

T L Rファミリーメンバーは、アダプタータンパク質 My D 8 8を介してセリン Zトレォニンキナーゼである I R AKを活性化し、次いで r e 1 型転写因子である N F— κ Bを活性化する、細胞内シグナル伝達分子として知られてレる（Mol. Cell 2, 253-258, 1998、 J. Exp. Med. 187, 2097-2101， 1998、 Immunity 11, 115-122, 1999)。 L P S及び P GN力かかる細胞内シグナル伝達分子を活性化するかどうかを次のようにして調べた。各種マウスの腹腔マクロファ一ジ（ 1 X 1 0⁶) を、 I n g Z m l のサルモネラ · ミネソタ R e — 5 9 5の L P S又は 1 O g/m l のスタフイロコッカス · ァゥレウスの P GNで図 2 1に示された時間刺激し、これらの細胞菌体を、溶解緩衝液（最終濃度で 1. 0 %のトリトン X— 1 0 0、 1 3 7 mMの N a C l 、 2 0 mMの卜リス— H C 1 、 5 mMの ED TA、 1 0 %のグリセロール、 I mMの P M S F、 2 0 /i g ノ m l のァプロチェン、 2 0 gZm l のロイぺプチン、 I mMの N a ₃ 〇₄及び 1 O mMの —ダリセロリン酸を含有する緩衝液： p H 8. 0 ) 中にて溶解し、抗 I RAK坊体（林原生化学研究所株式会社）で免疫沈降して、文献（Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 183-196, 1998、 Immunity 11, 115-122, 1999) 記載のように、インビトロキナーゼアツセィを行い、 I R AKの自己リン酸化を測定した（図 2 1 A， B における A u t o )。

また、上記溶解物を、 S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離させ、ニトロセルロース膜に移し、この膜を抗 I R A K抗体 (Transduction Laboratories 社製）でブロッ卜して、ェンノ、ンスド · ケミルミネッセンス装置（デュポント社製）を使用して視覚化した（図 2 1 A, Bにおける WB)。以上の結果から、 L P Sに対する応答での I RAK活性化は、野生型マウス（野生型）及び T L R 2 ノックアウトマウス（T L R 2— /— ) において観察できたが、 T L R 4ノックアウトマウス（T L R 4— Z—）では観察できなかった。一方、 P G Nに対する応答での I RAK活性化は、野生型マウス及び TL R 4ノックアウトマウスのみにおいて確認することができた。これらのことから、 L P S は丁 L R 4を、 P GNは T L R 2をそれぞれ介し認識されることがわかつた。

さらに、 L P S又は P GNに対する応答による N F— κ Bの活性化についも調べてみた。上記 L P S又は P GNで刺激した各種マウスのマク口ファ一ジから核抽出物を精製し、 N F— κ Bの DN A結合部位に対する特異的プロ一ブといつしょにインキュベートし、文献（Immunity 9, 143-150, 1998) 記載の電気泳動移動度シフト分析により視覚化した。その結果を図 2 1 C， Dに示す。なお、図中の矢印は N F— κ Βと特異的プローブとの複合物の位置を示し、矢頭は特異的プローブのみの位置を示している。これらの結果から、 L P Sに対する応答による N F— κ Β の DNA結合活性を、野生型マウス及び丁 L R 2ノックァゥトマウスのマクロファージの核抽出物において検出できたが、 T L R 4ノックァゥトマウスのものではかかる活性を検出できなかった。一方、 P GNに対する応答による N F _ K Β活性化は、野生型マウスと T L R 4ノックァゥトマウスのマクロファージで確認できたが、 T L R 2ノックァゥトマウスのものでは確認できなかった。これらのことから、 T L R 4は L P S誘導 N F— / B活性化に、 T L R 2は P G N誘導 N F— κ B活性化に不可欠であることがわかった。実施例 1 3 (R— MAL P— 2と S— MAL P— 2の立体特異的リポぺプチド合成及び H P L C精製）

出発原料として、各々 9 9 %以上の純粋なェナンチォマーを含有する ( S ) 一（一）ーグリシドール及び（ R ) — ( + ) —グリシドール（シダマーアルドリッチ社製）の 2つの試薬を用いて文献（Int. J. Peptide Protein. Res.38, 545, 1991) 記載の方法により、 S— （ 2， 3—ジハイドロォキシプロピル）一 L一システィンの立体異性体を合成した。これら立体異性体から N _u—フルォレニルメトキシカルボニル基で保護された S— [ 2 ( S ) , 3—ビス（パルミトイルォキシ）プロピル] 一 Lーシスティンと S— [ 2 (R), 3—ビス（パルミトイルォキシ）プロピル] 一 L一システィンとの異性体をそれぞれ合成し、上記文献記載の方法でカップリングし、担体に結合したフルォレニルメトキシカルボニル基で保護されたペプチドを得た。 1 O m gの粗精製 MA L P— 2 を、 SP 250/10 Nucleosil 300-7 C8 column (Macherey&Nagel社製）を用いて逆相 H P L Cによりバッチ処理してさらに精製し、 0. 1 %のトリフルォロ酢酸を含んだ水 Z 2—プロパノールの直線的グラジェントにより 4 0°Cで溶出し、活性溶出画分を N 0解離分析によりモニターし、最終生成物は質量分析、及び、正確なペプチド含量を決定するためのをァミノ酸分析により特徴づけられた。これら MAL P— 2を水 / 2—プロパノ —ル 1 : 1 (容積比）の溶液を用い 1 mgZm 1 の濃度に調整し、 4 °C で保存した。

実施例 1 4 (C H 3 ZH e Jマウスの腹腔マク口ファージのリボタンパク/リポぺプチドに対する応答性）

CH 3 ZH e J 由来のエンドトキシン低応答性マウスから P E C (腹腔滲出細胞）を単離し、これら P E C ( 6 X 1 0⁵ ) を 5 %の F C Sと 2 5 Mの 2 —メルカプトエタノールを含んだダルベッコ M E M培地 (DM EM) 1. 2 5 m 1 の入った 2 4穴細胞培養プレート中で 3 7 °C にて一晩培養した。この培養物から非付着細胞を取り除き、新しい培養液に交換して腹膜マクロファージを調製した。各種濃度（ 0. 1、 1、 1 0、 1 0²、 1 0³、 1 0⁴、 1 0⁵又は 1 0⁶ p g /m l ) の実施例 8 の方法により得られた R— MAL P— 2又は S— MAL P— 2と、濃度 3 0 u n i t Zm l の組換えイン夕一フエロンーァ ( r I F N - r ) の共存下に、上記腹膜マクロファージを培養し、培養上清中の N〇₂―、 T N F - α及び I L— 6の産生量を測定した（図 2 2 )。 TN F— αは培養から 3時間後に E L I S A (G e n z ym e社製）によって、 I L一 6 は培養から 2 1時間後に E L I S A (E ND O G E N社製）によって、 N0₂—は培養から 4 6時間後に N0₂/N0₃アツセィキット（同仁科学研究所社製）を使用した G r e i s s法によってそれぞれ測定した。これらの結果から、 S— M A L P— 2より R— M AL P— 2の方が、腹膜マクロファージに対してより高い特異活性を示すことがわかった。実施例 1 5 (ヒト単球のリポタンパク Zリポペプチドに対する応答性）健康なヒトから得られた単球を洗浄後、実験に用いた。実施例 1 3の方法により得られた R— MAL P— 2又は S— — 2の各種濃度

( 0. 1、 1、 1 0、 1 0²、 1 0³、 1 0⁴又は 1 0⁵ p g Zm l ) 下、ヒト単球（ 7. 5 X 1 0⁵) を 2 0時間刺激した。刺激後、 I L— 8、 MC P— 1及び TN F— αの産生量を E L I S Aにより測定した（図 2 3 )。この結果から、実施例 1 4のマウス由来のマクロファージの場合と同様に、 S— MAL P— 2より R— MAL P— 2の方がマク口ファージ等に分化する前のヒト単球に対してより高い特異活性を示すことがわかつた。

実施例 1 6 (T L R 2ノックアウトマウスのリポタンパク/リポぺプチド不応答性）野生型マウス（野生型）、 T L R 2 ノックアウトマウス（T L R 2 — Z 一）、 T L R 4ノックアウトマウス（T L R 4— Z—）、 My D 8 8 ノックアウトマウス（M y D 8 8 — Z—）のそれぞれの腹膜マクロファージのリポタンパク/リポぺプチドに対する応答性を、マイコプラズマ由来の M A L P— 2を用いて調べた。それぞれのマウスの腹膜マクロファージを実施例 1 4と同様の方法により単離し、各腹膜マクロファージを r I N F r ( 3 0 u n i t / m 1 ) の存在下（図 2 4 B及び D) 又は非存在下（図 2 4 A及び C) において、実施例 1 3より得られた各種濃度（ 0、 0. 1 、 1、 1 0、 1 0²、 1 0³又は 1 0⁴ p g Zm l ) の R— MA L P— 2又は S— M A L P— 2 といつしょに 2 4時間培養した。培養後、培養上清中の TN F— α及び NO ₂—の産生量を測定した（図 2 4 )。

上記の結果から、野生型マウス及び T L R 4欠損マウスの腹膜マク口ファージは、 R— MAL P— 2の投与量に応じて TN F— αや N〇 ₂—の産生を増加しているのに対して、 T L R 2欠損マウス及び M y D 8 8欠損マウスの腹腔マクロファージでは TN F— αも N 0₂—も産生していなかった（図 2 4 A及び B)。また、 S— MAL P— 2においても同様の結果が得られた（図 2 4 C及び D )。その他、 R— MA L P— 2又は S— MAL P— 2刺激による I L一 6産生も、 T L R 2欠損マウス及び M y D 8 8欠損マウスの腹腔マク口ファージでは不応答性であることが確認された（図示せず）。以上のことから、 R— MAL P— 2等のマイコプラズマ由来のリポタンパク Zリポペプチドが T L R 2及び M y D 8 8を介してマクロファージを活性化することがわかった。

実施例 1 7 (リポタンパクノリポペプチド刺激によるインビトロでのキナーゼアツセィ及びウエスタンブロット）

実施例 1 6の結果から、リポタンパク Zリポペプチドが細胞内シグナル伝達分子を活性化するかどうかを調べるために、上記 4種のマウスの腹腔マクロファージ（ 1 X 1 0⁶) を、 0. 3 n g Zm l の R— MA L P— 2で 1 0分間刺激し、実施例 1 2 と同様に抗 I R A K抗体を用いてインビトロキナーゼアツセィ（図 2 5 Aの A u t o) 及びウエスタンブロット分析（図 2 5 Aの WB) や電気泳動移動度シフト分析（図 2 5 B) を行った。また、抗 J NK 1抗体を用いたインビトロキナーゼアツセィ (図 2 5 Cの A u t o ) 及びウエスタンブロット分析（図 2 5 Cの WB) を行った。これらの結果から、 T L R 2 ノックアウトマウス及び My D 8 8ノックァゥトマウスのマクロファ一ジにおいて、に対する I RA ：、 N F— κ B及び J NKの活性化が確認できなかった。以上のことから、マイコプラズマ由来のリポタンパク Zリボペプチドは、 T L R 2及び M y D 8 8シグナル伝達経路を介して生体反応を引き起こしていることが明かとなった。産業上の利用可能性

本発明の細菌菌体成分不応答性モデル動物である、 My D 8 8 ノックアウトマウスは、グラム陰性細菌由来のエンドトキシンや、グラム陽性菌由来のペプチドダリカン、リポティコ酸、結核菌溶解物等のグラム陽性菌の細胞壁成分や、リポタンパクノリポベプチドなどに対して不応答性であり、また、 T L R 2 ノックアウトマウスは、グラム陽性菌等の細胞壁成分ペプチドダリカンや、リポタンパク Zリポペプチド等に対して不応答性であり、グラム陽性菌細胞壁画分に対して低応答性であるため、これらのノックアウトマウスを用いることによって、グラム陽性菌の細胞壁成分であるべプチドグリカンや、リポタンパク Zリポペプチド等の選択的成分のシグナル受容体に対して有用な情報や、細菌感染症に対する促進物質又は抑制物質、 T L R 2に対するァゴニストやアン夕ゴニス卜などの細菌菌体成分に対する応答性の促進物質又は抑制物質のスクリ —ニングゃ、被検物質のエンドトキシン活性、 I L 一 1活性、 I L 一 1 8活性を評価や、被検物質中の細菌菌体成分の検出が可能となり、ひいては、これらエンドトキシン等の細菌細胞壁成分、 I L— 1 、 I L— 1 8又はこれらのレセプターの過剰な産生等に起因する疾病に対する薬剤の開発に有用な情報や、マイコプラズマ属ゃスピロへ一夕属等の細菌による感染成立の分子機構の解明及び感染症への新たな治療薬の開発に有用な情報を得ることができる。

Claims

請求の範囲

1 . 細菌菌体成分であるリポタンパク /リポぺプチドに対して不応答性であることを特徴とする細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物。

2 . リポタンパク/リポペプチドが、マイコプラズマ属に属する細菌に由来するマクロファージ活性化リポベプチドであることを特徴とする請求項 1記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒ卜動物。

3 . 細菌菌体成分であるべプチドグリ力ンに対して不応答性であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物。

4 . グラム陽性菌細胞壁画分に対して低応答性であることを特徴とする請求項 1 〜 3のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物

5 . 細菌菌体成分であるェンドトキシンに対して不応答性であることを特徴とする請求項 1 〜 4のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物。

6 . 細菌菌体成分であるリポティコ酸に対して不応答性であることを特徴とする請求項 1 〜 5のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物。

7 . 細菌菌体成分である結核菌溶解物に対して不応答性であることを特徴とする請求項 1 〜 6のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物。

8 . 請求項 1 〜 4のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物が、 T L R 2遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物であることを特徴とする細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物。

9 . 請求項 1 〜 7のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物が、 M y D 8 8遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物であることを特徴とする細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物。

1 0 . 非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項 1 〜 9 のいずれか記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒ卜動物。

1 1 . 齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項 1 0記載の細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物。

1 2 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞と被検物質とをあらかじめインビト口で接触せしめた後、該マクロファージ又は脾臓細胞を細菌菌体成分の存在下で培養し、該マク口ファージ又は脾臓細胞のマクロファ一ジ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一ニング方法。

1 3 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞と細菌菌体成分とをあらかじめインビトロで接触せしめた後、該マクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマク口ファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一ニング方法。

1 4 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を細菌菌体成分の存在下で培養し、該マクロファ一ジ又は脾臓細胞のマクロファ一ジ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

1 5 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒ卜動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

1 6 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマク口ファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

1 7 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞のマク口ファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

1 8 . 請求項 1 〜 1 1のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒ卜動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

1 9 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価することを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一二ング方法。

2 0 . マクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 · 評価するに際し、対照として細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物と同種の野生型非ヒ卜動物の測定値と比較 · 評価することを特徴とする請求項 1 2〜 1 9のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

2 1 . マクロファージ活性の程度の測定 ' 評価が、該マクロファージにおけるサイトカイン及び Z又は亜硝酸イオンの産生量の測定 · 評価であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 0のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

2 2 . 脾臓細胞活性の程度の測定 ' 評価が、該脾臓細胞における M H C クラス IIの発現量の測定 '評価であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 0のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一ニング方法。

2 3 . 細菌菌体成分が、リポタンパク Zリポペプチドであることを特徴とする請求項 1 2〜 2 2のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

2 4 . リポタンパク/リポペプチド力マイコプラズマ属、スピロへ一夕属又はェセリシァ属に属する細菌の菌体成分由来のリポタンパク Zリポペプチドであることを特徴とする請求項 2 3記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一二ング方法。

2 5 . 細菌菌体成分が、ペプチドグリカンであることを特徴とする請求項 1 2〜 2 2のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一ニング方法。

2 6 . 細菌菌体成分が、エンドトキシンであることを特徴とする請求項 1 2〜 2 2のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

2 7 . 細菌菌体成分が、リポティコ酸であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 2のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

2 8 . 細菌菌体成分が、結核菌溶解物であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 2のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

2 9 . 細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 1 2 〜 2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一二ング方法。

3 0 . 細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、 T L R 2に対するァゴニスト又はアン夕ゴニストであることを特徴とする請求項 1 2〜2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリ一ニング方法。

3 1 . 細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、インタ一ロイキン一 1活性の抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

3 2 . 細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、インタ一ロイキン— 1 8活性の抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーエング方法。

3 3 . 細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、 I F N - r活性の抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 1 2〜 2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

3 4 . 細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、 T N F 一 α活性の抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 1 2〜

2 8のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。

3 5 . 請求項 1 2〜 3 4のいずれか記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法により得られることを特徴とする細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質。

3 6 . 細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項 3 5 記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質。

3 7 . 細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質が、 T L R 2に対するァゴニスト又はアン夕ゴニストであることを特徴とする請求項 3 5記載の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質。

3 8 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒ卜動物に被検物質を投与して、該被検物質の生物活性を評価することを特徴とする被検物質の評価方法。

3 9 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物と、該非ヒ卜動物の野生型非ヒ卜動物とにそれぞれ被検物質を投与して、該被検物質の生物活性を比較 · 評価することを特徴とする被検物質の評価方法。

4 0 . 生物活性がエンドトキシン活性であることを特徴とする請求項 3 8又は 3 9記載の被検物質の評価方法。

4 1 . 生物活性がィン夕ーロイキン— 1活性であることを特徴とする請求項 3 8又は 3 9記載の被検物質の評価方法。

4 2 . 生物活性がィン夕一ロイキン一 1 8活性であることを特徴とする請求項 3 8又は 3 9記載の被検物質の評価方法。

4 3 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒ卜動物に被検物質を投与して、該被検物質中の細菌菌体成分を検出することを特徴とする細菌菌体成分の検出方法。

4 4 . 請求項 1 〜 1 1 のいずれか記載の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物と、該非ヒト動物の野生型非ヒト動物とにそれぞれ被検物質を投与して、該被検物質中の細菌菌体成分を検出することを特徴とする細菌菌体成分の検出方法。

4 5 . 細菌菌体成分が、リポタンパク Zリポペプチドであることを特徴とする請求項 4 3又は 4 4記載の細菌菌体成分の検出方法。

4 6 . リポタンパク/リポペプチド力、マイコプラズマ属、スピロへ一夕属又はェセリシァ属に属する細菌の菌体成分由来のリポタンパクノリポペプチドであることを特徴とする請求項 4 5記載の細菌菌体成分の検出方法。

4 7 . 細菌菌体成分が、ペプチドダリカンであることを特徴とする請求項 4 3又は 4 4記載の細菌菌体成分の検出方法。

4 8 . 細菌菌体成分が、エンドトキシンであることを特徴とする請求項 4 3又は 4 4記載の細菌菌体成分の検出方法。

4 9 . 細菌菌体成分が、リポティコ酸であることを特徴とする請求項 4 3又は 4 4記載の細菌菌体成分の検出方法。

5 0 . マウス遺伝子ライブラリ一からマウス E S Tクローン由来のプロ —ブを用いてスクリーニングすることにより得られた T L R 2遺伝子の細胞内領域を含むェクソン部位の全部又は一部の遺伝子フラグメントをポリ Aシグナルとマーカ一遺伝子をもつプラスミドに置換して夕一ゲッティングベクターを構築し、該夕ーゲッティングベクタ一を線状化した後胚幹細胞に導入し、 T L R 2遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをィンタークロスすることによって得られることを特徴とする T L R 2 ノックァゥトマウス。

5 1 . マウス遺伝子ライブラリ一からマウス E S Tクロ一ン由来のプローブを用いてスクリーニングすることにより得られた M y D 8 8遺伝子領域の C末端部分をコ一ドした 2つのェクソン領域の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリ Aシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換して夕ーゲッティングベクターを構築し、該夕ーゲッティングベクタ一を線状化した後胚幹細胞に導入し、 M y D 8 8遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをィン夕 —クロスすることによつて得られることを特徴とする M y D 8 8 ノックアウトマウス。