JP4197580B2 - 細菌菌体成分不応答性モデルマウス - Google Patents

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマ属、スピロヘータ属、エセリシア属等に属する細菌の菌体成分であるリポタンパク／リポペプチドや、グラム陽性菌の細胞壁画分であるペプチドグリカンやグラム陰性菌の細胞壁画分であるエンドトキシン等の細菌菌体成分に不応答性のモデル非ヒト動物に関し、またこれら細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物を用いた細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質や、ＴＬＲ２に対するアゴニストやアンタゴニストのスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応や感染時の応答、造血、ウイルス感染や腫瘍細胞の障害に重要な役割を果たしている細胞間シグナル伝達物質であるサイトカインの中でも、リンパ球間でシグナルを伝え合うサイトカインはインターロイキン（以下「ＩＬ」という）と呼ばれている。このＩＬの中で、ＩＬ−１は、様々な免疫反応や炎症反応を介しているサイトカインであり、生体の恒常性維持に関与し、感染時や傷を受けた際に単球、マクロファージ、ケラチノサイト、血管内皮細胞等種々の細胞から産生される。ＩＬ−１には、同一のレセプターに結合するＩＬ−１αとＩＬ−１βの２種類が存在することが知られている。また、ＩＬ−１は、Ｔ細胞の抗原やマイトジェンによる活性化の際に同時に働き、Ｔ細胞からＩＬ−２を分泌させＩＬ−２レセプターの発現を増強してＴ細胞の増殖を誘導することや、単球やマクロファージに作用しＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６の産生を誘導することも知られている。
【０００３】
ＩＬ−１には、その受容体である２種類のＩＬ−１レセプター（以下「ＩＬ−１Ｒ」という）があり、タイプＩ及びタイプＩＩのどちらのＩＬ−１Ｒもイムノグロブリン様ドメインが細胞外ドメインに３カ所存在し、タイプＩレセプターはＴ細胞や結合組織で、タイプＩＩレセプターは脾臓Ｂ細胞や骨髄細胞等で発現され、タイプＩレセプターはＮＦ−κＢを核内で誘導することが知られている。また、ＩＬ−１ＲにＩＬ−１αやＩＬ−１βと同程度の親和力で結合するが、生物活性を有さないＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（以下「ＩＬ−１ｒａ」という）があり、ＩＬ−１のＩＬ−１Ｒへの結合を競合的に阻害することも知られている。
【０００４】
ＩＬ−１８は、インターフェロン−γ（以下「ＩＦＮ−γ」という）の生成を促進し、ナチュラルキラー細胞の活性を高め、ＩＬ−１２と共働してＴ細胞からＩＦＮ−γの生成を誘導し、Ｔｈ１（ＩＬ−２産生性ヘルパーＴ細胞）応答における重要な役割を果たすことや、機能が似ているＩＬ−１２とは構造的に異なり、ＩＬ−１とは類似の構造を有することが知られている。また、ＩＬ−１８は、ＩＬ−１βの場合と同様に，その成熟化のためにＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）／カスパーゼ１による分割を必要とする不活性先駆体として産生され、またＩＬ−１Ｒ−関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）及びＮＦ−κＢを活性化することも知られている。
【０００５】
また、これまでにＩＬ−１Ｒと相同性を示す分子が複数同定されており、現在これらＩＬ−１Ｒファミリーを介するシグナル伝達経路が盛んに研究されている。ＭｙＤ８８は、ＩＬ−１Ｒ相同領域とＤｅａｔｈドメインからなる細胞質内タンパク質であり、ＩＬ−１刺激後のＩＬ−１ＲコンプレックスへＩＲＡＫを取込んで、ＮＦ−κＢを活性化するアダプター分子として機能することも知られている。また、ＭｙＤ８８遺伝子は、当初、ＩＬ−６による刺激分化により、骨髄白血球細胞Ｍ１をマクロファージへ速やかに誘導する骨髄細胞分化初期応答遺伝子として分離されたことも知られている。
【０００６】
また、グラム陰性細菌表層のペプチドグリカンを取り囲んで存在する外膜の重要構成成分であるリポ多糖からなる菌体内毒素はエンドトキシンと呼ばれ、リポ多糖はリピドＡと呼ばれる脂質とこれに共有結合した各種の糖から構成されることが知られている。そして、このエンドトキシンは、主として発熱、白血球や血小板の減少、骨髄出血壊死、血糖低下、ＩＦＮ誘発、Ｂリンパ球（骨髄由来免疫応答細胞）の活性化等の生物活性を有することも知られている。
【０００７】
一方、トール（Ｔｏｌｌ）遺伝子は、ショウジョウバエの胚発生中の背腹軸の決定（Ｃｅｌｌ ５２，２６９−２７９，１９８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２，３９３−４１６，１９９６）、また成体における抗真菌性免疫応答に必要であることが知られている（Ｃｅｌｌ ８６，９７３−９８３，１９９６）。かかるＴｏｌｌは、細胞外領域にロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を有するＩ型膜貫通受容体であり、この細胞質内領域は、哺乳類インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の細胞質内領域と相同性が高いことが明らかとなっている（Ｎａｔｕｒｅ ３５１，３５５−３５６，１９９１、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２，３９３−４１６，１９９６、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６３，６５０−６５７，１９９８）。他のＴｏｌｌファミリーメンバーである１８−ｗｈｅｅｌｅｒは、抗菌ホスト防御に関わっているが抗真菌性免疫応答には関わらないことが明らかになっており、Ｔｏｌｌ経路の選択的活性を介し、ショウジョウバエにおいて特定の病原体が特異的抗菌性免疫応答を誘導することも明らかとなっている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１４６１４−１４６１９，１９９７、ＥＭＢＯ Ｊ．１６，６１２０−６１３０，１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１，１３−１８，１９９９）。
【０００８】
近年、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれるＴｏｌｌの哺乳類のホモログが同定され、ＴＬＲ２やＴＬＲ４など現在までに６つのファミリーが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ ３８８，３９４−３９７，１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，５８８−５９３，１９９８、Ｂｌｏｏｄ ９１，４０２０−４０２７，１９９８、Ｇｅｎｅ ２３１，５９−６５，１９９９）。このＴＬＲファミリーは、上記ＩＬ−１Ｒと同様にシグナル伝達分子としてのアダプタータンパク質である前記ＭｙＤ８８を介し、ＩＬ−１Ｒ結合キナーゼ（ＩＲＡＫ）をリクルートし、ＴＲＡＦ６を活性化し、下流のＮＦ−κＢを活性化することが知られている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，２０９７−２１０１，１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２，２５３−２５８，１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１，１１５−１２２，１９９９）。また、哺乳類におけるＴＬＲファミリーの役割は、細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ：ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として、先天的な免疫認識に関わっているとも考えられている（Ｃｅｌｌ ９１，２９５−２９８，１９９７）。
【０００９】
上記ＰＲＲにより認識される病原体会合分子パターン（ＰＡＭＰ：ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ）の一つは、グラム陰性菌の外膜の主成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）であって（Ｃｅｌｌ ９１，２９５−２９８，１９９７）、かかるＬＰＳが宿主細胞を刺激して宿主細胞にＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６等の各種炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインを産生させること（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，２９３−４５０，１９７９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，４３７−４５７，１９９５）や、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ：ＬＰＳ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）により捕獲されたＬＰＳが細胞表面上のＣＤ１４に引き渡されることが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，１４３１−１４３３，１９９０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，４３７−４５７，１９９５）。しかしながら、ＣＤ１４は膜貫通ドメインのないグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質であり、ＬＰＳに対する真のシグナル伝達受容体の存在が考えられている。
【００１０】
上記ＴＬＲファミリーに属するＴＬＲ４はグラム陰性菌菌体成分であるＬＰＳのシグナル伝達分子であり、かかるＴＬＲ４をトランスフェクションすると、ＮＦ−κＢの持続的低活性化をもたらす（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８，２０９１−２０９７，１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３９５，２８４−２８８，１９９８）。他方、ＴＬＲ２もインビトロでヒト胎児腎臓２９３細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ２９３ ｃｅｌｌｓ）に過剰発現させるとＬＰＳのシグナルを細胞内に伝えることから、ＬＰＳレセプターの候補であると考えられていた。また、Ｇｏｄａｗｓｋｉのグループは、ヒトＴＬＲ２がＣＤ１４と相互作用してＬＰＳ受容体複合体を形成すると報告している（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６３，６３９−６４３，１９９９）。ＬＰＳでの刺激処理は受容体をオリゴマー化し、次にＩＲＡＫを受容体複合体に動員する。これとは対照的に、ＰｏｌｔｏｒａｋらとＱｕｒｅｓｈｉらのグループは、ポジショナルクローニング法により、ＴＬＲ４がＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスのＬＰＳ低応答性に関する原因遺伝子（ｃａｕｓａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ）、すなわちＬｐｓ遺伝子であることを報告している（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，２０８５−２０８８，１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９，６１５−６２５，１９９９）。
【００１１】
本発明者らは、ＴＬＲ４が実際にＬＰＳシグナル伝達に関わっていることをＴＬＲ４欠損マウスを作製することにより明らかにしている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，３７４９−３７５２，１９９９）が、これはＴＬＲの一次構造における種特異的差異によるもの、つまりマウスではＴＬＲ４、ヒトではＴＬＲ２により介されている可能性がある。しかしながら、マウスＴＬＲ２もＬＰＳに対する応答でＮＦ−κＢを活性化したとの報告がある（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，６９７１−６９７５，１９９９）。また、Ｃｈｏｗらは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスに関する結果と一致する結果、すなわちヒトＴＬＲ４が投与量依存又は時間依存によるＬＰＳ／ＣＤ１４に対する刺激によってＮＦ−κＢを介する遺伝子発現を活性化し、ヒト２９３細胞を用いた場合にはＫｉｒｓｃｈｎｉｎｇらのグループと矛盾する結果を得て、これは２９３細胞のロットの差にもよるものと推測されると報告している。（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１０６８９−１０６９２，１９９９）。
【００１２】
最近、ＴＬＲ２がグラム陰性菌由来のＬＰＳに対する反応性のみに関わっているのではなく（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２，６９７１−６９７５，１９９９）、別の共通細菌構造パターンであるグラム陽性菌由来のペプチドグリカン（ＰＧＮ）とリポテイコ酸（ＬＴＡ）のシグナル伝達受容体として作用するとの報告がある（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１７４０６−１７４０９，１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６３，１−５，１９９９）。また、全グラム陽性菌、可溶性ＰＧＮ及びＬＴＡが、ＴＬＲ２を発現する２９３細胞のＮＦ−κＢ活性化を誘導したのに対して、ＴＬＲ１やＴＬＲ４を発現する細胞内のＮＦ−κＢ活性化を誘導しなかったことも報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１７４０６−１７４０９，１９９９）。また、ＴＬＲ４ではなくヒトＴＬＲ２を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）繊維芽細胞を、熱殺菌したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）及びストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）並びにスタフィロコッカス・アウレウス由来ＰＧＮにより同様に活性化したとの報告がなされている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３，１−５，１９９９）。
他方、動物やヒトの病原性細菌として知られるマイコプラズマは細胞壁を欠如しているが、マクロファージを活性化する能力を備えている。これらマクロファージ活性化物質がリポタンパク／リポペプチドであるとの数多くの報告が現在までになされており、かかるリポペプチドのうちの１つであるマイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来の２ｋＤマクロファージ活性化リポペプチドＭＡＬＰ−２は、その生化学的特性が明らかになっており、かつ合成されたものも利用することができる（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１９５１，１９９７）。この脂質種は２つの不斉炭素原子をもち、Ｓ，Ｒラセミ体からなる合成ＭＡＬＰ−２はインビトロでピコモル濃度で天然化合物作用と類似の特異活性を示すことが知られている。そして、ＭＡＬＰ−２がＮＦ−κＢを活性化することを除いては、ＭＡＬＰ−２のシグナル経路や細胞表面レセプターについては殆ど知られていない。
【００１３】
その他、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）とボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）由来のリポタンパク／リポペプチドが、インビトロでのＴＬＲ２を介する宿主細胞の活性化を誘導したことが報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５，７３６−７３９，１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５，７３２−７３６，１９９９）。しかしながら、過剰発現実験から得られる結果は必ずしもインビボでのＴＬＲファミリーの機能を反映していない。このような応答性をＮＦ−κＢ活性化に基づいて分析した結果も、これら刺激により仲介される生物学的応答には関連しない（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６，１６３８−１６４７，１９９８）と報告されている。
【００１４】
また、人工的に遺伝子を導入し発現させるトランスジェニックマウスと、胚性幹細胞（以下「ＥＳ細胞」という）を用いて人工的にゲノム上の特定遺伝子を相同組換えにより変化させる遺伝子ターゲティングとを用いた遺伝子欠損マウスを用いると、特定の遺伝子の機能を個体レベルで解析しうることが知られている。そして、一般に、遺伝子欠損マウスはノックアウトマウスと呼ばれているが、ＴＬＲ２ノックアウトマウスやＭｙＤ８８ノックアウトマウスは知られていない上に、ＴＬＲ２ノックアウトマウスやＭｙＤ８８ノックアウトマウスが細菌菌体成分に対して不応答性であることも知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
インビボにおける細菌菌体成分に対する応答は、細胞表面上の各ＴＬＲの発現レベルの差異により変化することが予測されるものの、未だインビボにおける細菌菌体成分刺激によるシグナル伝達に対するＴＬＲファミリーの各メンバーやＴＬＲファミリーのアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８の関わりは明らかにされていない。本発明の課題は、インビボにおける細菌菌体成分刺激によるシグナル伝達に対するＴＬＲファミリー各メンバーやＴＬＲファミリーのアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８の関わり、特にＴＬＲ２とＭｙＤ８８とのインビボにおける役割を明らかにする上で有用な、マイコプラズマ属、スピロヘータ属、エセリシア属等に属する細菌の菌体成分であるリポタンパク／リポペプチドや、グラム陽性菌の細胞壁画分であるペプチドグリカンやグラム陰性菌の細胞壁画分であるエンドトキシン等の細菌菌体成分に不応答性のモデル非ヒト動物、例えばＴＬＲ２及びＭｙＤ８８遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、またこれら細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物を用いた細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質や、ＴＬＲ２に対するアゴニストやアンタゴニストのスクリーニング方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、プラスミドベクターを用いてＥＳ細胞で相同的組換えによって、ＴＬＲ２遺伝子の細胞内領域を含むエキソン領域、又はＭｙＤ８８遺伝子領域のＣ末端部分をコードした２つのエキソン領域を、それぞれネオマイシン耐性遺伝子に置き換え、またそれぞれのＣ末端側にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を導入させて、Ｇ４１８とガンシクロビアに対して２重に抵抗力のあるＥＳ細胞クローンをスクリーニングし、このＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６のマウスの胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ）の中に注入し、その生殖系列をとおして、メンデルの法則に従い出生してくるＴＬＲ２又はＭｙＤ８８遺伝子機能が染色体上で欠損したＴＬＲ２ノックアウトマウスやＭｙＤ８８ノックアウトマウスが、生まれてから２０週間は明らかに異常を示さないトランスジェニックマウスであり、また、かかるＴＬＲ２ノックアウトマウスやＭｙＤ８８ノックアウトマウスがグラム陽性菌の細胞壁成分であるペプチドグリカンやリポタンパク／リポペプチド等の細菌菌体成分に対して不応答性であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち本発明は、（１）ＴＬＲ２をコードする遺伝子の機能を染色体上で欠損せしめた非ヒト動物を、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル動物として使用する方法や、（２）非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする上記（１）記載の方法や、（３）齧歯目動物がマウスであることを特徴とする上記（２）記載の方法に関する。
【００１８】
本発明の細菌菌体成分不応答性モデル動物である、ＭｙＤ８８ノックアウトマウスは、グラム陰性細菌由来のエンドトキシンや、グラム陽性菌由来のペプチドグリカン、リポテイコ酸、結核菌溶解物等のグラム陽性菌の細胞壁成分や、リポタンパク／リポペプチドなどに対して不応答性であり、また、ＴＬＲ２ノックアウトマウスは、グラム陽性菌等の細胞壁成分ペプチドグリカンや、リポタンパク／リポペプチド等に対して不応答性であり、グラム陽性菌細胞壁画分に対して低応答性であるため、これらのノックアウトマウスを用いることによって、グラム陽性菌の細胞壁成分であるペプチドグリカンや、リポタンパク／リポペプチド等の選択的成分のシグナル受容体に対して有用な情報や、細菌感染症に対する促進物質又は抑制物質、ＴＬＲ２に対するアゴニストやアンタゴニストなどの細菌菌体成分に対する応答性の促進物質又は抑制物質のスクリーニングや、被検物質のエンドトキシン活性、ＩＬ−１活性、ＩＬ−１８活性を評価や、被検物質中の細菌菌体成分の検出が可能となり、ひいては、これらエンドトキシン等の細菌細胞壁成分、ＩＬ−１、ＩＬ−１８又はこれらのレセプターの過剰な産生等に起因する疾病に対する薬剤の開発に有用な情報や、マイコプラズマ属やスピロヘータ属等の細菌による感染成立の分子機構の解明及び感染症への新たな治療薬の開発に有用な情報を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明における細菌菌体成分としては、マイコプラズマ属、スピロヘータ属、エセリシア属に属する細菌の菌体成分であるリポタンパク／リポペプチド、細菌細胞壁の骨格構造であるＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸の繰返し多糖類に比較的短いペプチド鎖が結合したペプチドグリカン、主としてグラム陰性菌の外膜成分として存在するエンドトキシンとも呼ばれるリポ多糖（ＬＰＳ）、グラム陽性細菌の細胞壁成分であるリポテイコ酸（ＬＴＡ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）溶解物、グラム陽性菌細胞壁画分等を挙げることができ、また本発明においては、便宜上、上記細菌菌体成分を担持するキャリアや、細菌菌体自体も本発明における細菌菌体成分に含めることとする。
【００２０】
本発明において細菌菌体成分に対する不応答性とは、細菌菌体成分による刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われていることを意味し、低応答性とは刺激に対する反応性が低下していることを意味する。したがって、本発明において細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物とは、細菌菌体成分による刺激に対して、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われているマウス、ラット、ウサギ等のヒト以外の動物をいう。また、細菌菌体成分による刺激としては、細菌菌体成分を生体に投与するインビボでの刺激や、生体から分離された細胞に細菌菌体成分を接触させるインビトロでの刺激等を挙げることができる。そして、本発明における細菌菌体成分不応答性モデル非ヒト動物としては、リポタンパク／リポペプチド、ペプチドグリカン、グラム陽性菌細胞壁画分、エンドトキシン、リポテイコ酸、結核菌溶解物等の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物を挙げることができ、具体的には、ＴＬＲ２ノックアウトマウス等のＴＬＲ２遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、ＭｙＤ８８ノックアウトマウス等のＭｙＤ８８遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を挙げることができる。
【００２１】
本発明において、ＭｙＤ８８又はＴＬＲ２遺伝子機能の染色体上での欠損とは、染色体上のＭｙＤ８８又はＴＬＲ２遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭｙＤ８８又はＴＬＲ２を発現する機能が失われていることをいい、また、ＭｙＤ８８又はＴＬＲ２遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物としては、ＭｙＤ８８又はＴＬＲ２ノックアウトマウスの他、例えばＭｙＤ８８又はＴＬＲ２遺伝子機能が欠損したラット等の齧歯目動物を例示することができる。
【００２２】
本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記ＭｙＤ８８又はＴＬＲ２遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と同種の非ヒト動物をいい、マウスの場合を例に取ると、メンデルの法則に従い出生してくるＦ２マウスのうち、ＭｙＤ８８又はＴＬＲ２非欠損型の同種のマウスをいう。これらＦ２マウスにおける欠損型とその野生型、特に同腹の野生型を同時に実験に供することによって、個体レベルで正確な比較実験をすることができる。上記ＭｙＤ８８又はＴＬＲ２遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の作製方法を、ＭｙＤ８８又はＴＬＲ２が欠損したノックアウトマウスを例にとって以下説明する。
【００２３】
ＭｙＤ８８又はＴＬＲ２遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーをＰＣＲ法等により増幅し、マウスＥＳＴクローン由来等のプローブを用いてクローニングすることができる。このクローニングされたＭｙＤ８８又はＴＬＲ２遺伝子を組換えＤＮＡ技術により、ＭｙＤ８８又はＴＬＲ２遺伝子の全部又は一部、例えばＭｙＤ８８又はＴＬＲ２遺伝子の細胞内領域を含むエクソン部位の全部又は一部を、ポリＡシグナル遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子等マーカー遺伝子で置換し、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを作製し、この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション法等により胚幹細胞（ＥＳ細胞）に導入して培養後、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００２４】
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ）内にマイクロインジェクションし、仮親の子宮に戻すことによってキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスは、キメラ率がよいと生まれてくるキメラマウスが雄に片寄るため、野生型の雌と交配させることによってヘテロ組換えマウス（＋／−：Ｆ１）を作出し、そのヘテロ組換えマウスの雄と雌を交配させることによってホモ組換えマウス［Ｆ２；野生型マウス（＋／＋）、ＭｙＤ８８又はＴＬＲ２ノックアウトマウス（−／−）］を得ることができ、これらはすべてメンデルの法則に従い産み出される。そして、本発明のＭｙＤ８８又はＴＬＲ２ノックアウトマウスが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスの腹腔マクロファージからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスのＭｙＤ８８又はＴＬＲ２の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００２５】
作出されたＭｙＤ８８ノックアウトマウスが細菌細胞壁成分に対して不応答性であることは、例えば、マイコプラズマ属、スピロヘータ属、エセリシア属等に属する細菌の菌体成分であるリポタンパク／リポペプチドをＭｙＤ８８ノックアウトマウスのマクロファージやヒト単核細胞にインビトロで接触せしめ、かかる細胞におけるＴＮＦ−αやＮＯ_２ ⁻の産生量を測定することや、グラム陰性菌の細菌細胞壁成分であるＬＰＳをＭｙＤ８８ノックアウトマウスに静脈注射等により投与し、発熱、ショック、白血球や血小板の減少、骨髄出血壊死、血糖低下、ＩＦＮ誘発、Ｂリンパ球（骨髄由来免疫応答細胞）の活性化等のエンドトキシンの生物活性を測定することや、ＭｙＤ８８ノックアウトマウスのマクロファージと脾臓Ｂ細胞に、細菌由来のＬＰＳ、又はグラム陽性菌菌体成分であるペプチドグリカン、リポテイコ酸、結核菌溶解物等の存在下において、例えばＴＮＦ誘発、脾臓Ｂ細胞増殖応答、脾臓Ｂ細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現を測定することにより確認することができる。
【００２６】
本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスは、細菌の菌体成分であるリポタンパク／リポペプチドに不応答性であり、また現在までエンドトキシン低応答性として知られているＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスよりもエンドトキシン応答性が低下しており、ショック症状は全く認められず、また、ＭｙＤ８８ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓Ｂ細胞は、エンドトキシンに対して不応答性であるばかりでなく、グラム陽性細菌細胞壁成分であるペプチドグリカン、リポテイコ酸、結核菌溶解物等に対しても不応答性であって、他方ＩＬ−４やＩＦＮ−γに対して応答性であることから、この細菌菌体成分に対して不応答性であるノックアウトマウスは、リポタンパク／リポペプチド、エンドトキシン、ペプチドグリカン、リポテイコ酸等の作用機序の解明やエンドトキシンショックへの対処方法の確立に有用なモデルとすることができる。
【００２７】
また、作出されたＴＬＲ２ノックアウトマウスが細菌細胞壁成分に対して不応答性であることは、例えば、マイコプラズマ属、スピロヘータ属、エセリシア属等に属する細菌の菌体成分であるリポタンパク／リポペプチドをＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージやヒト単核細胞にインビトロで接触せしめ、かかる細胞におけるＴＮＦ−αやＮＯ_２ ⁻の産生量を測定することや、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージや脾臓Ｂ細胞に、グラム陽性菌細胞壁画分、グラム陽性菌の細胞壁成分であるペプチドグリカン等の存在下において、ＴＮＦ誘発、脾臓細胞増殖応答、脾臓Ｂ細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現等を測定することにより確認することができる。そして、本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウスは、細菌の菌体成分であるリポタンパク／リポペプチドやペプチドグリカンに不応答性であり、グラム陽性菌細胞壁画分に対して低応答性であって、ＬＰＳをはじめとしてＬＴＡやＩＬ−４に対して応答性であることから、上記ＴＬＲ２ノックアウトマウスは、リポタンパク／リポペプチド、ペプチドグリカン、グラム陽性菌細胞壁画分等の作用機序の解明に有用なモデルとすることができる。
【００２８】
本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物は、細菌菌体成分の作用機序の解明の他、細菌感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又はＴＬＲ２に対するアゴニスト若しくはアンタゴニストなどの細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニングや、各種被検物質の生物活性の評価や、細菌菌体成分の検出等に用いることができる。例えば、細菌感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又はＴＬＲ２に対するアゴニスト又はアンタゴニストなどの細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニング方法を、以下細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法を例にとって説明する。
【００２９】
本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞等と被検物質とをあらかじめインビトロで接触せしめた後、該マクロファージ又は脾臓細胞を細菌菌体成分の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価することによる、細菌感染症に対する予防剤、免疫応答回復・促進剤等をスクリーニングする方法や、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞と細菌菌体成分とをあらかじめインビトロで接触せしめた後、該マクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価することによる、細菌感染症に対する治療剤、症状改善剤等をスクリーニングする方法を挙げることができる。
【００３０】
また、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を細菌菌体成分の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価することによる、細菌感染症に対する予防剤、免疫応答回復・促進剤等をスクリーニングする方法や、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価することによる、細菌感染症に対する予防剤、免疫応答回復・促進剤等をスクリーニングする方法を挙げることができる。
【００３１】
また、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価することによる、細菌感染症に対する治療剤、症状改善剤等をスクリーニングする方法や、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価することによる、細菌感染症に対する治療剤、症状改善剤等をスクリーニングする方法を挙げることができる。
【００３２】
さらに、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価することによる、細菌感染症に対する予防剤、免疫応答回復・促進剤等をスクリーニングする方法や、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価することによる、細菌感染症に対する治療剤、症状改善剤等をスクリーニングする方法を挙げることができる。
【００３３】
そして、マクロファージ活性の程度の測定・評価方法としては該マクロファージにおけるサイトカイン及び／又は亜硝酸イオンの産生量を測定・評価する方法を、脾臓細胞活性の程度の測定・評価方法としては該脾臓細胞におけるＭＨＣクラスＩＩの発現量を測定・評価する方法をそれぞれ例示することができる。また、マクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価するに際し、対照として細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物の野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物の測定値と比較・評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。このことは、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物を用いる各種被検物質の生物活性の評価や、細菌菌体成分の検出等においても同様である。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法の対象となる抑制物質又は促進物質としては、前記細菌感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又はＴＬＲ２に対するアゴニスト若しくはアンタゴニストの他、マイコプラズマ属、スピロヘータ属又はエセリシア属に属する細菌の菌体成分由来のリポタンパク／リポペプチドや、ペプチドグリカン、エンドトキシン、リポテイコ酸、結核菌溶解物等の細菌菌体成分に対する応答性の抑制物質又は促進物質や、インターロイキン−１活性、インターロイキン−１８活性、ＩＦＮ−γ活性、ＴＮＦ−α活性等の抑制物質又は促進物質を例示することができる。
【００３５】
なお、ＴＬＲ２に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングは、上記のように細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質のスクリーニングと同様に行えばよいが、ＴＬＲ４ノックアウトマウスを一緒に用いることもできる。すなわち、ＴＬＲ２ノックアウトマウスとＴＬＲ４ノックアウトマウス、さらに必要に応じて野生型マウスに被検物質をそれぞれ投与して、該ＴＬＲ２ノックアウトマウス由来及びＴＬＲ４ノックアウトマウス由来のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を比較評価することにより、ＴＬＲ２及び／又はＴＬＲ４に対するアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングすることもできる。
【００３６】
本発明の被検物質の評価方法は、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物に被検物質を投与して、該被検物質の生物活性を評価することを特徴とする。本発明の被検物質の評価方法によると、被検物質の生物活性、例えばエンドトキシン活性、インターロイキン−１活性、インターロイキン−１８活性等を評価することができる。例えば、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスを用いて、被検物質のエンドトキシン活性を正確に評価することにより、エンドトキシン拮抗物質等のエンドトキシンによるショックや発熱作用を抑制することができる薬剤の開発に有用な情報を得ることができる。
【００３７】
また、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスを用いて、被検物質のＩＬ−１活性を正確に評価することにより、病態モデルマウスにおけるＩＬ−１の疾患との関わりを検索することができる。このように、被検物質のＩＬ−１活性を正確に評価したり、病態モデルマウスにおけるＩＬ−１の関与を解析することにより、例えば、ＩＬ−１発現過多に起因するリウマチ様関節炎、移植片対宿主病、喘息等の疾病を治療することができる薬剤の開発に有用な情報を得ることができる。
【００３８】
そして、評価対照となるＩＬ−１活性としては、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）等のマイトジェンや、低濃度のＩＬ−２との共刺激によるＴ細胞の増殖誘導活性や、単球やマクロファージに作用してＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６の産生を誘導する活性などを挙げることができる。
【００３９】
そしてまた、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスを用いて、被検物質のＩＬ−１活性を正確に評価することにより、例えば、ＩＬ−１８の過剰産生に起因するＩ型糖尿病や移植片対宿主病等の疾病を治療することができる薬剤の開発に有用な情報を得ることができる。そして、評価対照となるＩＬ−１８活性としては、ＩＦＮ−γの生成を促進する活性、ＮＫ細胞活性を高める活性、ＩＬ−１２と共働してＴ細胞からＩＦＮ−γの生成を誘導する活性、及びＩＲＡＫやＮＦ−κＢを活性化する作用を挙げることができる。
【００４０】
本発明の細菌菌体成分の検出方法によると、本発明の細菌菌体成分に対して不応答性である非ヒト動物に被検物質を投与して、該被検物質中に混在する微量の細菌菌体成分、例えばマイコプラズマ属、スピロヘータ属、エセリシア属等に属する細菌の菌体成分由来のリポタンパク／リポペプチド、エセリシア・コリ、クレブシェラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノサ、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、フレクスナー赤痢菌、ビブリオ・コレレエ、サルモネラ・ミネソタ、ポルフィロモナス・ジンジバリス等由来のエンドトキシン、スタフィロコッカス・アウレウス、コリネバクテリウム・ジフテリア、ノカルジア・コエリアカ等由来のペプチドグリカン、ストレプトコッカス・ニューモニア等由来のリポテイコ酸、結核菌の全細胞溶解物等を検出することができる。
【００４１】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
（ＭｙＤ８８ノックアウトマウスの作製）
ＭｙＤ８８遺伝子を１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）からスクリーニングし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定した。ターゲッティングベクター（標的ベクター）は、ｐＭＣ１−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）からのネオマイシン耐性遺伝子で、野生型アレルの１．０ｋｂ遺伝子断片を置換することにより構築された。置換された遺伝子断片は、ＩＬ−１ＲＡｃＰ（受容体補助タンパク）の細胞質ドメインに似ているドメインをコードする２つのエクソンを含んでいた。ネオマイシン耐性遺伝子は、１．１ｋｂの５′遺伝子断片と５．２ｋｂの３′遺伝子断片をフランキング配列として有していた。次いで、ＨＳＶ−ｔｋカセットを遺伝子断片の３′端に導入した。線状化された標識ベクターをＥＳ細胞Ｅ１４．１にトランスフェクションし、Ｇ４１８及びガンシクロヴィアで選択した。両者に抵抗性を示す１７６個のクローンを、ＰＣＲによる相同組換えのためにスクリーニングし、図１に示すプローブを用いるサザンブロット分析により３３個を確かめた。
【００４３】
３個の独立的に同定された標的ＥＳクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションした。得られたキメラマウスを、ヘテロ接合体マウスを作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスと交尾させた。ヘテロ接合体マウスは、ホモ接合体マウスを得るため、インタークロスされ、これらのインタークロスから予測されたメンデル比（＋／＋：＋／−：−／−＝５２：９３：５３）で生まれ、ＭｙＤ８８欠損マウスを作製することができた。本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスは健康に育ち、２０週の年齢まで異常を示さなかった。突然変異によりＭｙＤ８８遺伝子の不活性化が生起していることを確認するため、ノーザンブロット分析を行ったところ、ＭｙＤ８８ｍＲＮＡはＭｙＤ８８欠損マウスの肝臓及び脾臓からは検出されなかった。また、胸腺、脾臓及びリンパ節中のＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ４及びＣＤ８のフローサイトメトリーで、リンパ球組成は野生型マウスと比較してＭｙＤ８８ノックアウトマウスにおいても変わっていなかった。
【実施例２】
【００４４】
（ＭｙＤ８８ノックアウトマウスのエンドトキシン不応答性）
本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス１０匹に、大腸菌（Ｏ５５：Ｂ５）由来のＬＰＳを１ｍｇ投与し、その生存率によりエンドトキシン不応答性を調べた。対照として同腹の野生型マウス１０匹を用いた。結果を図２に示す。図２より、野生型マウスはＬＳＰに応答し、投与後４日ですべて死亡したが、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスは、ＬＰＳ投与後４日では死亡するものはなく、エンドトキシン不応答性であることを確認することができた。
【実施例３】
【００４５】
（ＭｙＤ８８ノックアウトマウスのＩＬ−１仲介機能の欠失）
本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスの胸腺細胞１×１０^５を、Ｔ細胞増殖についてのＩＬ−１との共刺激物であるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）２μｇ／ｍｌ、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）２．５μｇ／ｍｌ又は２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２のそれぞれと、ＩＬ−１β（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）１００Ｕ／ｍｌとの混合物と共に９６ウェルの培養皿で７２時間培養し、Ｔ細胞を増殖させた。Ｔ細胞の増殖は、細胞内に取り込まれた［^３Ｈ］チミジンの［^３Ｈ］量を測定することにより求めた。その結果、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ又はＩＬ−２とＩＬ−１βとの共存下で培養したとき、同腹子の野生型マウスの胸腺細胞は大いに増殖したが、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスの胸腺細胞は細胞増殖の増加がほとんど見られなかった（図３参照）。また、胸腺細胞に代えて脾臓Ｂ細胞を用いても、同じような結果が得られることがわかった。
【００４６】
また本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスの胸腺細胞を、ホルボール１２−ミリスチン酸塩１３−酢酸塩パラメトキシアンフェタミン（ＰＭＡ）１０ｎｇ／ｍｌ又はＣｏｎＡ２．５μｇ／ｍｌとＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）２０ｎｇ／ｍｌとの共存下で上記と同じように培養させ、細胞増殖の増加を見たところ、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスの胸腺細胞と、同腹子の野生型マウスの胸腺細胞とは、ＩＬ−２とＰＭＡやＣｏｎＡとの反応に関しては増殖において差が見られなかった（図３参照）。これらのことから、ＩＬ−１が仲介するＴ細胞成長シグナルは、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスの胸腺細胞で損なわれていることがわかる。
【００４７】
本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスの静脈内にＩＬ−１β（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）１μｇを注入し、２時間後肝臓と血清を取り出した。総ＲＮＡをトリゾール試薬（ＧＩＢＣＯ社）を用いて肝臓から抽出し、このＲＮＡ（１０μｇ）を電気泳動にかけ、ナイロン膜に移して血清アミロイドＡ（ＳＡＡ−Ｉ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）及びハプトグロビン（ＨＰ）のような急性期蛋白質について、^３２ＰでラベルされたｃＤＮＡを用いてノーザンブロット分析を行い、ｍＲＮＡ発現のＩＬ−１の誘導増加を同腹子の野生型マウスのものと比較したところ、野生型マウスでは誘導の増加が見られたが、ＭｙＤ８８ノックアウトマウスでは見られなかった。
【００４８】
またＩＬ−１が、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）やＩＬ−６のような急性期蛋白質の産生や炎症性のサイトカインを誘導するため、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスと同腹子の野生型マウスから上記の方法で取り出した血清のＴＮＦ−αやＩＬ−６の濃度が増加するかどうかをＥＬＩＳＡによって測定した。その結果、野生型マウスにおいてはＩＬ−１βによってＴＮＦ−αやＩＬ−６の濃度が増加したが、ＭｙＤ８８ノックアウトマウスではＴＮＦ−αやＩＬ−６の濃度がＩＬ−１βによって増加されることはなかった（図４参照）。
【００４９】
以上のことから、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスでは、ＩＬ−１を介する主な生物学的機能が厳格に欠失していることがわかる。
【実施例４】
【００５０】
（ＭｙＤ８８ノックアウトマウスのＩＬ−１８仲介機能の欠失）
ＩＬ−１８がＮＫ細胞の溶解活性を増強することはよく知られている。本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス及び同腹子の野生型マウスの脾臓Ｂ細胞を、ＩＬ−１８（林原生化学研究所株式会社）２０ｎｇ／ｍｌの存在下又は不存在下、^５１Ｃｒでラベルされたマウスリンホーマ細胞（以下「ＹＡＣ−１」という）標的細胞といっしょに２４時間培養し、４時間後ガンマーカウンターを用いて上清中の遊離した^５１Ｃｒを測定した。その結果、インビトロで脾臓Ｂ細胞をＩＬ−１８の存在下培養したとき、野生型マウスにおけるＹＡＣ−１標的細胞に対する溶解活性は劇的に増強したが、ＭｙＤ８８ノックアウトマウスにおいては増強されることはなかった。なお、ＩＬ−１８に代えてＩＬ−２を用いた場合には、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスの脾臓Ｂ細胞においても溶解活性が増強した（図５参照）。
【００５１】
またインビトロで、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスの脾臓Ｂ細胞と同腹子の野生型マウスの脾臓Ｂ細胞とを２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８で刺激し、２４時間培養し、ＥＬＩＳＡによって培養上清における１ＦＮ−γの産生について測定した。その結果、野生型マウスにおいてはＩＦＮ−γの産生が誘発されたが、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスではＩＦＮ−γの産生は見られなかった（図５参照）。
【００５２】
９５％以上の純度に精製された本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスの脾臓Ｔ細胞及び同腹子の野生型マウスの脾臓Ｔ細胞を、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２存在下、抗ＣＤ３抗体（２０μｇ／ｍｌ）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）でコーティングされた培養皿で培養し、４日後細胞を採取し、ハンクス平衡塩溶液で洗浄した。洗浄後の細胞（２×１０^５）は、抗ＣＤ３抗体（２０μｇ／ｍｌ）でコーティングされた９６ウェルの培養皿で、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８又は２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２で、２４時間再び刺激され培養された。その培養上清でのＩＦＮ−γの濃度はＥＬＩＳＡによって測定し比較された。その結果、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスの脾臓Ｔ細胞は、ＩＬ−１８に応答したＩＦＮ−γの産生を高めることができないことがわかった（図６参照）。
【００５３】
本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス及び同腹子の野生型マウスの腹膜内に、熱で殺されたプロピオン酸菌アクネ（Ｐ．ａｃｎｅｓ）５００μｇを注入し、７日後脾臓からＴ細胞を精製した後、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８の存在下又は非存在下、抗ＣＤ３抗体（２０μｇ／ｍｌ）でコーティングされた９６ウェルの培養皿で２４時間培養し刺激し、その培養上清におけるＩＦＮ−γの濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。また本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス及び同腹子の野生型マウスの静脈内に、カルメット−ゲラン菌（ＢＣＧ）（共和化学）２ｍｇを注入し、１４日後脾臓からＴ細胞を精製した後、上記のように２４時間培養し刺激し、ＩＦＮ−γの濃度を測定した。その結果、どちらの場合も、野生型マウスにおいてはＩＬ−１８に応答して高レベルのＩＦＮ−γが産生されたが、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスではＩＬ−１８の存在下でＩＦＮ−γの産生を高めることはできなかった（図６参照）。
【００５４】
以上のことから、本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスは、ＩＬ−１８欠損マウスと同様に、インビボでのＴｈ１細胞への発展に欠陥があり、ＩＬ−１８を介する主な生物学的活性は完全に欠失していることがわかる。
【００５５】
次に、ドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）ＭｙＤ８８の突然変異が、ＩＬ−１８誘導ＮＦ−κＢ活性化も阻害するかどうか検討した。ＣＯＳ−７細胞は、ＮＦ−κＢ依存ルシフェラーゼレポーター（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子と共にＭｙＤ８８（アミノ酸１５２から２９６）発現ベクターで過渡的にトランスフェクションし、ＩＬ−１８処理後のルシフェラーゼ活性を測定した。ＭｙＤ８８の共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）はＩＬ−１８誘導活性をほぼ完全に阻害した（図７参照）。
【００５６】
またＩＬ−１８は、ＡＰ−１依存遺伝情報を活性化することから、ＭｙＤ８８（アミノ酸１５２から２９６）がＩＬ−１８誘導ＡＰ−１活性化のドミナント ネガティブ突然変異としても働くかどうか試験した。ＩＬ−１８での刺激はＡＰ−１活性を約３〜４倍増加し、この活性化はＭｙＤ８８（アミノ酸１５２から２９６）の共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）で阻害された（図７参照）。これらの結果は、ＭｙＤ８８がＮＦ−κＢとＡＰ−１のＩＬ−１８誘導活性化に関与していることを示している。
【００５７】
次に、ＮＦ−κＢのＩＬ−１８誘導活性化がＭｙＤ８８欠損細胞で見られるかどうかを検討した。ＩＬ−１２及び抗ＣＤ３抗体の存在下で４日間培養された脾臓Ｔ細胞を３時間飢餓状態にした後ＩＬ−１８で刺激した。刺激された細胞から抽出された核を、ＮＦ−κＢ接合部を含む特定のプローブを用いてゲル移動度シフト（ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ）分析を行った。ＩＬ−１８誘導ＮＦ−κＢＤＮＡ接着活性は、野生型細胞からの核抽出物中では検出されたが、ＭｙＤ８８欠損細胞からは検出されなかった。他方、野生型あるいはＭｙＤ８８欠損胸腺細胞をＴＮＦ−αで処理すると、ほとんど同レベルのＮＦ−κＢＤＮＡ接着活性を生じ、ＭｙＤ８８欠損細胞中の欠損ＩＬ−１８誘導ＮＦ−κＢ活性は、ＮＦ−κＢの異常機能あるいは調節低下によるものではないことを示した。
【００５８】
ＮＦ−κＢの活性化の誘導に加えて、ＩＬ−１はＣ−ＪｕｎＮ端末キナーゼ（ＪＮＫ）を活性化することが知られている。ＩＬ−１８がＪＮＫの活性化を誘導するかどうか試験するため、代替としてＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ−融合蛋白を使ってインビトロキナーゼ分析を行った。ＩＬ−１８を使った処理は、野生型マウスのＴｈ１−発達細胞中のＪＮＫの活性化を誘導したが、ＩＬ−１８誘導ＪＮＫ活性化はＭｙＤ８８欠損細胞では見られなかった。反対にＪＮＫの通常の活性がＴＮＦ−αで処理したＭｙＤ８８欠損細胞で見られた。ＩＬ−１８誘導によるＮＦ−κＢ及びＪＮＫの活性は、ＭｙＤ８８欠損マウス中では欠失している。これらの結果は、ＭｙＤ８８がＮＦ−κＢ及びＪＮＫのＩＬ−１８誘導活性化に必須であることを示している。
【実施例５】
【００５９】
（ＭｙＤ８８ノックアウトマウスのマクロファージと脾臓Ｂ細胞の細菌細胞壁成分不応答性）
５−１（ＴＬＲ４欠損マウスの作製）
最近、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスがＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４遺伝子のミスセンス点突然変異によりＬＰＳに対して低応答性であることが報告され（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，２０８５−８，１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９，６１５−６２５，１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，３７４９−３７５２，１９９９）、また本発明者らによって、ＴＬＲ４欠損マウスのマクロファージと脾臓Ｂ細胞がＬＰＳに低応答性であり、ＴＬＲ４遺伝子がＬＰＳシグナル伝達に不可欠であることが判明した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，３７４９−３７５２，１９９９）。そこで、ＴＬＲ４欠損マウスとＭｙＤ８８欠損マウスとのマクロファージと脾臓Ｂ細胞の細菌細胞壁成分に対する応答性を比較するために、ＴＬＲ４欠損マウス（１２９／ＯｌａＸＣ５７ＢＬ／６から交配したＦ_２）を文献記載（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，１９９９，３７４９−３７５２）のようにジーンターゲティング法により作製した。また、以下の実施例には、年齢が一致する野生型マウス、ＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスを使用した。
【００６０】
５−２（細菌細胞壁成分の調製）
フェノール抽出し、ゲル濾過法によって精製されたエセリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ５５：Ｂ５（シグマ社製）、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（シグマ社製）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型１０（シグマ社製）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（シグマ社製）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（シグマ社製）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）血清型１Ａ（シグマ社製）、ビブリオ・コレレエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）血清型イナバ５６９Ｂ（シグマ社製）等のＬＰＳを購入した。フェノールクロロフォルム石油エーテル抽出法により調製されたサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒｅ−５９５のＬＰＳは購入した（シグマ社製）。また、文献（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３３２，１９９４，１９７−２０１）記載の方法で、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）３８１のＬＰＳ及びリピドＡを調製した。結核菌の全細胞溶解物は、デュボス培地（ディフコ社製）で結核菌アオヤマＢ株（ＮＩＨＪ１６３５）を１ヶ月間培養した後、細胞を回収してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再懸濁し、細胞を超音波処理して調製した。
【００６１】
５−３（腹膜マクロファージの調製）
上記作製した野生型マウス、ＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスのそれぞれの腹腔内に４％のチオグリコール酸塩を２ｍｌずつ注入し、３日後に腹膜腔から腹膜滲出細胞を単離し、氷温のハンクス緩衝液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）で洗浄することによって腹膜細胞を得た。この細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、プラスチックシャーレに分注し、３７℃で２時間培養し、その後、ハンクス緩衝液で洗浄することにより非付着細胞を取り除き、付着細胞を腹膜マクロファージとして以下の実験に使用した。
【００６２】
５−４（サルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５のＬＰＳに対する不応答性）
上記野生型マウス（野生型）、ＴＬＲ４欠損マウス（ＴＬＲ４−／−）、ＭｙＤ８８欠損マウス（ＭｙＤ８８−／−）等のそれぞれの腹膜マクロファージのＬＰＳに対する応答性をサルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５のＬＰＳを用いて調べた。それぞれのマウスの腹膜マクロファージを、種々の濃度（０、０．０１、０．１、１、１０又は１００μｇ／ｍｌ）のＬＰＳの存在下で２４時間培養して刺激し、ＬＰＳ応答性のマクロファージから放出される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した（図８Ａ参照）。この結果から、野生型マウスのマクロファージでのＴＮＦ−αの産生は、ＬＰＳの投与量に応じて増加するのに対して、ＴＬＲ４欠損マウスやＭｙＤ８８欠損マウスでは、１００μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳ刺激においてもＴＮＦ−αを産生せず、これらがＬＰＳ不応答性であることがわかった。
【００６３】
また、サルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５のＬＰＳに対する脾臓Ｂ細胞の応答性についても調べてみた。野生型マウス、ＴＬＲ４欠損マウス、ＭｙＤ８８欠損マウスのそれぞれの脾臓Ｂ細胞（１×１０^５）を単離し、９６ウェルの培養皿内で培養し、種々の濃度（０、０．０１、０．１、１、１０又は１００μｇ／ｍｌ）のＬＰＳで脾臓Ｂ細胞を刺激した。培養から４０時間後に１μＣｉの［^３Ｈ］−チミジン（デュポント社製）を添加して更に８時間培養し、［^３Ｈ］の摂取量をβシンチレーションカウンター（パッカード社製）で測定した（図８Ｂ参照）。この結果から、ＬＰＳの刺激により野生型マウスの脾臓Ｂ細胞では、ＬＰＳの投与量に依存して細胞増殖反応を促進したが、ＴＬＲ４欠損マウス又はＭｙＤ８８欠損マウスのどちらの脾臓Ｂ細胞においても、ＬＰＳによる細胞増殖反応は見られなかった。
【００６４】
また、フローサイトメトリーにより、Ｒｅ−５９５のＬＰＳに対する応答における脾臓Ｂ細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ（Ｉ−Ａ^ｂ分子）の発現について調べてみた。野生型マウス、ＭｙＤ８８欠損マウス及びＴＬＲ４欠損マウスのそれぞれの脾臓Ｂ細胞（１×１０^６）を種々の濃度（０、０．０１、０．１、１、１０又は１００μｇ／ｍｌ）のＬＰＳ共存下に４８時間培養した。培養後細胞を採取して、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ；ファーミンジェン社製）で標識した抗Ｂ２２０抗体、又はビオチン化抗マウスＩ−Ａ^ｂ抗体（ファーミンジェン社製）に、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ；ファーミンジェン社製）で標識したストレプトアビジンを結合させたＦＩＴＣ標識化抗体により、それらの細胞表面におけるＩ−Ａ^ｂ分子に結合させて細胞を染色した。染色した細胞をセルクエストのソフトウェア（ベクトンディッキンソン社製）により蛍光活性化セルソーターキャリバー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）で分析した。この結果から、Ｒｅ−５９５のＬＰＳは、野生型マウスの脾臓Ｂ細胞表面でのＩ−Ａ^ｂ分子の発現を増大しているのに対し、ＴＬＲ４欠損マウスやＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞では、高濃度のＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）で刺激しても、Ｉ−Ａ^ｂ分子の発現は増大しなかった（図８Ｃ参照）。以上のことから、ＴＬＲ４欠損マウスとＭｙＤ８８欠損マウスは共にサルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５のＬＰＳに対して不応答であることがわかる。
【００６５】
５−５（ＩＬ−４とＩＦＮ−γに対するＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスの応答性）
ＴＬＲ４欠損及びＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞が全ての刺激物に対して不応答性であるかどうかを調べるため、ＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞の他の刺激物に対する応答性を検討したところ、以下に示すように応答性は損なわれておらず、これらのマウスはＬＰＳに対する応答性が特異的に欠損していることがわかった。
【００６６】
野生型マウス、ＭｙＤ８８欠損マウス、及びＴＬＲ４欠損マウスのそれぞれの脾臓Ｂ細胞（１×１０^５）を単離し、ＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）及び抗ＩｇＭ抗体の共存下又は抗ＣＤ４０抗体の存在下において４０時間培養し、［^３Ｈ］−チミジン（デュポント社製）を添加して更に８時間培養し、［^３Ｈ］の取込み量をβシンチレーションカウンターで測定した（図９Ａ参照）。この結果から、ＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞は、ＩＬ−４及び抗ＩｇＭ抗体の混合物、又は抗ＣＤ４０抗体に対する応答において、野生型マウスの脾臓Ｂ細胞と同じ挙動を示した。
【００６７】
次に、野生型マウス、ＭｙＤ８８欠損マウス、及びＴＬＲ４欠損マウスのそれぞれの脾臓Ｂ細胞（１×１０^６）を、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４の存在下又は非存在下において４８時間培養しそれらの細胞を刺激した。その後、ＰＥ標識抗Ｂ２２０抗体又はＦＩＴＣ標識抗マウスＩ−Ａ^ｂ抗体により、脾臓Ｂ細胞表面のＩ−Ａ^ｂ分子と結合させて細胞を染色し、セルクエスト・ソフトウェアを用いて蛍光活性化セルソーターキャリバーで細胞増殖を測定した（図９Ｂ参照）。その結果、ＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞は、ＩＬ−４に対する応答においても、野生型マウスの脾臓Ｂ細胞と同じ挙動を示した。
【００６８】
野生型マウス、ＭｙＤ８８欠損マウス又はＴＬＲ４欠損マウスのそれぞれの腹腔内に、５０００ＵのＩＦＮ−γ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）又はＰＢＳを投与し、投与から３日後に腹膜マクロファージを採取し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩ−Ａ^ｂ抗体でマクロファージの膜面に存在するＩ−Ａ^ｂ分子と結合させて細胞を染色し、セルクエストのソフトウェアにより蛍光活性化セルソーターキャリバーで分析した（図９Ｃ参照）。この結果から、野生型マウス、ＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスにおいて、腹膜マクロファージでのＩ−Ａ^ｂ分子の発現、すなわちＩＦＮ−γが誘発する細胞増殖の阻害も同程度であった。
【００６９】
５−６（貧食作用分析）
野生型マウス、ＭｙＤ８８欠損マウス及びＴＬＲ４欠損マウスのマクロファージに０．０２５％の蛍光ラテックスビーズ（０．７５μｍ）（ポリサイエンス社製）を加え、３７℃で２時間、ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。その後、貧食されなかったビーズを取り除くため、この培養物をＰＢＳで３回勢いよく洗浄し、２０分間、２．５％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳでインキュベートし、培養物をホルムアルデヒドで固定した。これらの固定細胞を、Ａｘｉｏｐｈｏｔｏ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）で視覚化したところ、ＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスの腹膜マクロファージは共に、ラテックス粒子を貧食していることがわかった。したがって、これらの他の刺激によるＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスのマクロファージの貧食能は損なわれていないことがわかった。
【００７０】
５−７（ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬＰＳに対する応答性）
ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬＰＳは、ＬＰＳ低応答性であるＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの細胞の活性化能において、ある程度の反応を示すことから（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，１９９７，４４３０−６）、それぞれのマウスのポルフィロモナス・ジンジバリスのＬＰＳに対する応答性を前記サルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５の場合と同様に調べた。野生型マウスのマクロファージでは、ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬＰＳの投与量に依存してＴＮＦ−αを誘発していたが、ＴＬＲ４欠損マウスのマクロファージでは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスのマクロファージと同様に低応答性であり、野生型マウスのマクロファージの３分の１程度のＴＮＦ−α産生能を示したに過ぎなかった。これに対し、ＭｙＤ８８欠損マウスのマクロファージでは、高濃度のＬＰＳで刺激しても、検出しうる程のＴＮＦ−αを産生しなかった（図１０Ａ参照）。
【００７１】
また、ポルフィロモナス・ジンジバリス３８１のＬＰＳに対して、ＴＬＲ４欠損マウスの脾臓Ｂ細胞は低レベルの増殖応答を示し、脾臓Ｂ細胞のＩ−Ａ^ｂ分子の発現を増大させていたが、ＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞は増殖応答を示さず、Ｉ−Ａ^ｂ分子の発現も確認できなかった（図１０Ｂ、Ｃ参照）。また、ポルフィロモナス・ジンジバリス３８１のリピドＡにおいても同様の結果が得られた。これらのことから、ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬＰＳに対する応答において、ＴＬＲ４欠損マウスは低応答性であり、ＭｙＤ８８欠損マウスは不応答性であることがわかった。また、ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬＰＳにより誘発されるシグナル伝達に対し、ＭｙＤ８８は必須であるが、ＴＬＲ４は部分的に寄与していることがわかった。
【００７２】
５−８（大腸菌Ｏ５５：Ｂ５のＬＰＳに対する応答性）
大腸菌（Ｏ５５：Ｂ５）のＬＰＳに対する応答性についても、前記サルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５の場合と同様に調べた。ＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスの腹膜マクロファージでは、野生型マウスのマクロファージと比較して、大腸菌（Ｏ５５：Ｂ５）のＬＰＳに対する応答性を損なっていた（図１１Ａ）。しかし、高濃度のＬＰＳで刺激した場合、ＴＬＲ４欠損マウスのマクロファージは少量のＴＮＦ−αを産生したが、それに対してＭｙＤ８８欠損マウスのマクロファージは、高濃度のＬＰＳ刺激においてもＴＮＦ−αを産生しなかった。
【００７３】
また、これらマウスの脾臓Ｂ細胞における増殖応答についても同様な傾向が見受けられた（図１１Ｂ参照）。さらに、１０μｇ／ｍｌを超えるＬＰＳで刺激したＴＬＲ４欠損マウスの脾臓Ｂ細胞は、野生型マウスの脾臓Ｂ細胞と同程度のＩ−Ａ^ｂ分子の発現を示したが、ＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞は１００μｇ／ｍｌのＬＰＳでの刺激に対してもＩ−Ａ^ｂ分子の発現を示さなかった（図１１Ｃ参照）。以上の結果から、ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬＰＳ刺激の場合と同様に、ＴＬＲ４欠損マウスは大腸菌（Ｏ５５：Ｂ５）のＬＰＳに対して低応答性であるが、ＭｙＤ８８欠損マウスは不応答性であることがわかった。
【００７４】
５−９（ペプチドグリカンに対する応答性）
グラム陽性菌の主要な細胞壁成分であるペプチドグリカン（ＰＧＮ）がマクロファージを活性化することが報告されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５，１９９５，２６２０−３０、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２，１９９４，２７１５−２１）。そこで、スタフィロコッカス・アウレウスのＰＧＮ（Ｆｌｕｋａ社製）に対する応答性を前記サルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５の場合と同様に調べた。ＰＧＮで刺激した場合、ＴＬＲ４欠損マウスの腹膜マクロファージは、投与量に依存して野生型マウスのマクロファージとほぼ同程度のＴＮＦ−αを産生したが、ＭｙＤ８８欠損マウスのマクロファージは、高濃度のＰＧＮ刺激に対してもにＴＮＦ−αを産生しなかった（図１２Ａ参照）。
【００７５】
スタフィロコッカス・アウレウスのＰＧＮで刺激した場合、野生型マウスの脾臓Ｂ細胞は細胞増殖応答を示し、ＭｙＤ８８欠損マウスにおいては野生型マウスと比べて細胞増殖応答が大きく損なわれていたが、その程度がＴＬＲ４欠損マウスの場合は小さかった（図１２Ｂ参照）。また、１０μｇ／ｍｌを超える濃度のＰＧＮで刺激した場合、野生型マウスもＴＬＲ４欠損マウスもＩ−Ａ^ｂ分子発現の増大が観察されたが、ＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞では、１００μｇ／ｍｌのＰＧＮ刺激の場合でもＩ−Ａ^ｂ分子の発現の増大は見られなかった（図１２Ｃ参照）。これらのことより、ＴＬＲ４欠損マウスは、黄色ブドウ球菌のＰＧＮに対して野生型マウスとほぼ同様の応答を示すが、ＭｙＤ８８欠損マウスは不応答性であることがわかった。
【００７６】
５−１０（リポテイコ酸に対する応答性）
リポテイコ酸（ＬＴＡ）は、グラム陽性菌の細胞壁成分であって、単球とマクロファージの活性化を誘導する（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２，１９９４，２７１５−２１）ことから、ストレプトコッカス・ニューモニアのＬＴＡに対する応答性を前記サルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５の場合と同様に調べた。野生型マウスの腹膜マクロファージは、ＬＴＡの投与量に応じてＴＮＦ−αの産生を増大していた。これに対して、ＭｙＤ８８欠損マウスのマクロファージでは、高濃度のＬＴＡ刺激に対してもＴＮＦ−αを産生しなかった。また、ＴＬＲ４欠損マウスも野生型マウスと比較するとＴＮＦ−αの産生が損なわれていたが、１００μｇ／ｍｌのＬＴＡ刺激ではＴＮＦ−αを誘発していた（図１３Ａ参照）。
【００７７】
次に、ストレプトコッカス・ニューモニアのＬＴＡ刺激に対するこれらマウス脾臓Ｂ細胞の細胞増殖反応とＩ−Ａ^ｂ分子の発現の増大を分析した（図１３Ｂ参照）。この結果から、野生型マウスの脾臓Ｂ細胞は、ＬＴＡの投与量に応じてＬＴＡに対する応答を増大させるのに対し、ＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞は、ＬＴＡに対する増殖反応を非常に損なっていた。ＴＬＲ４欠損マウスの脾臓Ｂ細胞においても増殖反応は損なわれていたが、高濃度のＬＴＡで刺激した場合では増殖応答性を示した。また、野生型マウス及びＴＬＲ４欠損マウスの脾臓Ｂ細胞では細胞表面においてＩ−Ａ^ｂ分子の発現が増大するのに対し、ＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞では増大がみられなかった（図１３Ｃ参照）。これらのことから、ＭｙＤ８８欠損マウスはストレプトコッカス・ニューモニアのＬＴＡ刺激に対して不応答性であることがわかる。
【００７８】
５−１１（結核菌全細胞溶解物に対する応答性）
結核菌細胞壁成分、特にリポアラビノマンナンは、骨髄性細胞の活性化を誘導することで知られていることから（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，１９９２，５４１−７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１，１９９３，２０７６−８３）、結核菌全細胞溶解物に対する応答性を前記サルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５の場合と同様に調べた。野生型マウスのマクロファージは、全細胞溶解物の投与量に依存してＴＮＦ−αを産生していた。また、ＴＬＲ４欠損マウスのマクロファージも、野生型マウスのものと比較するとわずかであるがＴＮＦ−αを産生していた。しかし、ＭｙＤ８８欠損マウスのマクロファージは、高濃度の全細胞溶解物に対してもＴＮＦ−αを産生しなかった（図１４Ａ参照）。
【００７９】
次に、結核菌全細胞溶解物による刺激に対するこれらマウスの応答性について調べた。野生型マウスの脾臓Ｂ細胞は、全細胞溶解物の投与量に依存して増大する細胞増殖応答と細胞表面でのＩ−Ａ^ｂ分子の発現を示し、ＴＬＲ４欠損マウスの脾臓Ｂ細胞でもまた、野生型マウスのものより低いものの細胞増殖応答とＩ−Ａ^ｂ分子の発現を示した。これに対して、ＭｙＤ８８欠損マウスの脾臓Ｂ細胞では、増殖反応とＩ−Ａ^ｂ分子の発現の増大が大きく損なわれており、全細胞溶解物に対して不応答性であることがわかった（図１４Ｂ、Ｃ参照）。
【００８０】
５−１２（他の菌体細胞壁成分に対する応答性）
野生型マウス、ＴＬＲ４欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスの応答性について、他の菌体細胞壁成分［クレブシェラ・ニューモニエ、シュードモナス・アウリギノサ１０、サルモネラ・チフィムリウム、フレクスナー赤痢菌、ビブリオ・コレラ等のＬＰＳ、及び大日本製薬株式会社のカワタシゲオ氏から提供されたスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のＰＧＮ］に対する応答性についても上記と同様に調べた。結果を表１に示す。この表１から、全ての菌体の成分において、ＭｙＤ８８欠損マウスが不応答性であることがわかった。
【００８１】
【表１】
【００８２】
またＬＰＳは、ＴＬＲ４を独自のシグナル受容体として利用し、不応答性を示すもの（サルモネラ・ミネソタＲｅ５９５やクレブシェラ・ニューモニエ等のＬＰＳ）や、ＴＬＲ４欠損マウスに対して低いが応答性を示すもの（ポルフィロモナス・ジンジバリス、エシェリキア・コリＯ５５：Ｂ５、シュードモナス・アウリギノサ、フレクスナー赤痢菌、サルモネラ・チフィムリウム、ビブリオ・コレラ等のＬＰＳ）の２つの型に分類できることがわかった。後者のＬＰＳに対してＭｙＤ８８欠損マウスは応答性を示さないことから、これらのＬＰＳの認識とシグナル伝達は、ＴＬＲ４と他のＴＬＲとの両方により、及び／又はＭｙＤ８８をアダプター分子として使用するＴＬＲ関連受容体により介されるものと考えられる。
【実施例６】
【００８３】
（ＴＬＲ２ノックアウトマウスの作製）
１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（ストラタジーン社製）から、ヒトＴＬＲ２遺伝子と類似したマウスＥＳＴクローン（登録番号Ｄ７７６７７）由来のプローブを用いて、ＴＬＲ２遺伝子をスクリーニングし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により特定した。ターゲッティングベクターは、ＴＬＲ２遺伝子の細胞内領域を含むエクソン部位１．３ｋｂの遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルをもつｐＭＣ１−ｎｅｏ（ストラタジーン社製）に置換することにより構築した。かかるターゲッティングベクターは、４．８ｋｂの５′遺伝子フラグメントと１．０ｋｂの３′遺伝子フラグメントとをフランキング配列として有し、ＨＳＶ−ｔｋカセットを５′末端に含んでいる。このターゲッティングベクターをＳａｌＩにより線状化し、胎生１４．１日目の胚幹細胞（ＥＳ細胞）にエレクトポレーションし、Ｇ４１８及びガンシクロビアに抵抗性を示す１２０個のクローンを、ＰＣＲによる相同組換えのためにスクリーニングし、図１５Ａに示すプローブを用いるサザンブロット分析により９個を確かめた。
【００８４】
相同組み換え変異ＴＬＲ２対立遺伝子を含有していた３個の標的ＥＳクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製した。この雄のキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６雌マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることによってホモ接合体マウスを得た（図１５Ｂ）。なお、本発明のＴＬＲ２欠損マウスはメンデルの法則に従い作製することができ、２０週目までは顕著な異常を示さなかった。
【００８５】
相同組み換え変異によりＴＬＲ２遺伝子の不活性化が生起していることを確認するため、野生型マウス（＋／＋）及びＴＬＲ２ノックアウトマウス（−／−）の腹腔マクロファージ（５×１０^６）から抽出した全ＲＮＡ（１５μｇ）を電気泳動にかけナイロン膜に移して、文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９，１４３−１５０，１９９８）記載の方法と同様に、［^３２Ｐ」で標識したＴＬＲ２に特異的なｃＤＮＡ又はＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｌａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｏ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に特異的なｃＤＮＡを用いてノーザンブロット分析を行った。これらの結果から、ＴＬＲ２ｍＲＮＡはＴＬＲ２欠損マウスの腹腔マクロファージからは検出されなかった（図１５Ｃ）。また、ＴＬＲ２ノックアウトマウスの胸腺細胞及び脾臓細胞中のＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ４及びＣＤ８の発現は、野生型マウスのものと比較しても差異がなかった（図は示さず）。
【実施例７】
【００８６】
（ＴＬＲ２ノックアウトマウスのエンドトキシン応答性）
本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウス（５匹）、ＴＬＲ４ノックアウトマウス（５匹）及び野生型マウス（５匹）に、それぞれ大腸菌（Ｏ５５：Ｂ５）由来のＬＰＳを１ｍｇ投与し、その生存率によりＬＰＳ不応答性を調べた。結果を図１６に示す。図１６より、本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウス（ＴＬＲ２−／−）及び野生型マウスはＬＰＳに応答し、投与後４日でほとんどが死亡したのに対して、ＴＬＲ４ノックアウトマウス（ＴＬＲ４−／−）は、ＬＰＳ投与後６日目においても死亡するものはなく、エンドトキシン不応答性であることを確認することができた。
【実施例８】
【００８７】
（ＴＬＲ２ノックアウトマウスのグラム陰性菌の菌体成分に対する応答性）
ＴＬＲ２ノックアウトマウス（ＴＬＲ２−／−）、ＴＬＲ４ノックアウトマウス（ＴＬＲ４−／−）及び野生型マウス（野生型）のそれぞれの腹腔内に４％のチオグリコール酸培地（ＤＩＦＣＯ社製）を２ｍｌずつ注入し、３日後に各マウスの腹腔内から腹膜滲出細胞を単離し、これらの細胞を１０％のウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で３７℃にて２時間培養し、氷温のハンクス緩衝液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ社製）で洗浄することにより非付着細胞を取り除き、付着細胞を腹膜マクロファージとして以下の実験に使用した。
【００８８】
得られた各腹膜マクロファージをＩＮＦγ（３０ｕｎｉｔ／ｍｌ）の存在下又は非存在下において、１．０ｎｇ／ｍｌの大腸菌由来の合成リピドＡ（５０６化合物；第一化学薬品社製）又はサルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５由来のＬＰＳ（シグマ社製）といっしょに２４時間培養した。なお、かかる合成リピドＡとしては、０．０２５％のトリエチルアミンを含有し、エンドトキシンを全く含有しない水に可溶化したものを用いた。培養後、培養上清中のＩＬ−６（図１７Ａ）、ＴＮＦ−α（図１７Ｂ）、ＮＯ_２ ⁻（図１７Ｃ）の産生量を測定した。なお、ＩＬ−６は固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ；ＥＮＤＯＧＥＮ社製）により、ＴＮＦ−αは製造者（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）の指示に基づきＥＬＳＩＡにより、ＮＯ_２ ⁻はＮＯ_２／ＮＯ_３アッセイキット（同仁科学研究所社製）を使用したＧｒｅｉｓｓ法により測定した。
【００８９】
上記の結果から、野生型マウス及びＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージでは、ＬＰＳやリピドＡに対して同様な応答を示し、ＩＬ−６とＴＮＦ−αを産生していた。また、ＬＰＳやリピドＡにＩＦＮ−γを加え培養することにより、さらなるＴＮＦ−α産生の増大が確認できた。一方、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのマクロファージにおいては、ＩＬ−６とＴＮＦ−αを産生しなかった。また、野生型マウス又はＴＬＲ２ノックアウトマウスから得られたマクロファージをＩＦＮ−γの添加したリピドＡ又はＬＰＳにおいて培養することにより、ＮＯ_２ ⁻の産生が確認できた。また、リピドＡやＬＰＳの投与量を１μｇ／ｍｌとした場合も前記と同様の結果が得られた（図は示さず）。
【００９０】
次に、図１７Ｄに示す各種濃度のサルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５由来のＬＰＳの存在下で、野生型マウス、ＴＬＲ２ノックアウトマウス及びＴＬＲ４ノックアウトマウスの各腹腔マクロファージを培養してＴＮＦ−αの産生を測定した。この結果から、野生型マウス及びＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージは、ＬＰＳの投与量に応じて同様な増加傾向を示すのに対し、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのマクロファージは、いかなる濃度でもＴＮＦ−αを産生しなかった。
【実施例９】
【００９１】
（サルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５のＬＰＳに対する応答性）
サルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５のＬＰＳに対する各種マウス（野生型、ＴＬＲ２−／−、ＴＬＲ４−／−）の脾臓細胞の応答性について調べた。それぞれのマウスの脾臓細胞（１×１０^５）を単離し、図１８Ａに示す各種濃度のＬＰＳにより９６ウェルプレート内で培養して刺激した。培養から４０時間後に１μＣｉの［^３Ｈ］−チミジン（デュポント社製）を添加して更に８時間培養し、［^３Ｈ］の摂取量をβシンチレーションカウンター（パッカード社製）で測定した（図１８Ａ）。この結果から、野生型マウス及びＴＬＲ２ノックアウトマウスの脾臓細胞では、ＬＰＳの投与量に依存して同様に細胞増殖反応を促進していたが、ＴＬＲ４欠損マウスの脾臓細胞では、いかなる濃度のＬＰＳ刺激においてもＬＰＳによる細胞増殖反応は見られなかった。
【００９２】
また、フローサイトメトリーにより、Ｒｅ−５９５のＬＰＳに対する応答におけるＢ細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ（Ｉ−Ａ^ｂ）の発現について調べてみた。野生型マウス、ＴＬＲ２ノックアウトマウス（２−／−）、ＴＬＲ４ノックアウトマウス（４−／−）のそれぞれの脾臓Ｂ細胞（１×１０^５）を単離し、種々の濃度（０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４又は１０^５ｎｇ／ｍｌ）のＬＰＳ又は１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を用いて、９６ウェルプレート内で４８時間培養した。培養後細胞を採取して、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ；ファーミンジェン社製）で標識した抗Ｂ２２０抗体、又はビオチン化抗マウスＩ−Ａ^ｂ抗体（ファーミンジェン社製）に、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ；ファーミンジェン社製）で標識したストレプトアビジンを結合させたＦＩＴＣ標識化抗体により、それらの細胞表面におけるＩ−Ａ^ｂ分子に結合させて細胞を染色した。染色した細胞をセルクエストソフトウェア（ベクトンディッキンソン社製）により蛍光活性化セルソーターキャリバー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）で分析した（図１８Ｂ）。この結果から、Ｒｅ−５９５のＬＰＳは、野生型マウス及びＴＬＲ２ノックアウトマウスの脾臓Ｂ細胞表面でのＩ−Ａ^ｂ分子の発現を増大しているのに対し、ＴＬＲ４欠損マウスの脾臓Ｂ細胞では、高濃度のＬＰＳ（１０^５ｎｇ／ｍｌ）で刺激しても、Ｉ−Ａ^ｂ分子の発現は増大しなかった。以上のことから、ＴＬＲ２ノックアウトマウスは、野生型マウス同様ＬＰＳに対して応答性を示すことがわかった。また、ＩＬ−４で刺激した場合では、脾臓Ｂ細胞表面でのＩ−Ａ^ｂ分子の発現はどのノックアウトマウスにおいても正常であった。
【実施例１０】
【００９３】
（ＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージのグラム陽性菌由来の細胞壁成分不応答性）
上記野生型マウス（野生型）、ＴＬＲ２ノックアウトマウス（ＴＬＲ２−／−）、ＴＬＲ４ノックアウトマウス（ＴＬＲ４−／−）等のそれぞれの腹膜マクロファージのグラム陽性菌由来の細胞壁成分に対する応答性を、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）及びノカルジア・コエリアカ（Ｎ．ｃｏｅｌｉａｃａ）の細胞壁調製物を用いて調べた。細胞調製物は、文献（Ｂｉｋｅｎ Ｊ．１８，７７−９２，１９７５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３８，８１７−８２４、１９８２）記載の方法と同様に、適切な培養条件下で培養した細胞菌体を、ブラウン・メカニカル・セル・ホモジナイザー（ＭＳＫモデル；Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ａｐｐａｒａｔｅｂａｕ社製）又はＤｙｎｏ−Ｍｉｌｌ（タイプＫＤＬ；Ｗｉｌｌｙ Ａ，Ｂｉｏｃｈｏｆｅｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ社製）のいずれかで破壊した。破壊した細胞懸濁液の分画遠心法により得た粗細胞壁画分をプロテアーゼで処理し、細胞壁に元々存在していない成分を除去することにより精製調製した。
【００９４】
それぞれのマウスの腹膜マクロファージを、種々の濃度（０、０．１、１、１０又は１００μｇ／ｍｌ）の上記調製物の存在下で２４時間培養して刺激し、それぞれのマクロファージから放出される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した（図１９）。これらの結果から、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージは、野生型マウス及びＴＬＲ４ノックアウトマウスのものより、グラム陽性菌由来の細胞壁成分に対する応答におけるＴＮＦ−αの産生が損なわれることがわかった。
【実施例１１】
【００９５】
（ＴＬＲ２ノックアウトマウスのグラム陽性菌の細胞壁成分に対する応答性）
次に、グラム陽性菌のどの細胞壁成分がＴＬＲ２を介してマクロファージを活性化するのかを調べてみた。従来、グラム陽性菌の細胞壁成分であるペプチドグリカン（ＰＧＮ）及びリポテイコ酸（ＬＴＡ）が単球／マクロファージを活性化するとの報告がある（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０，３６６４−３６７２，１９９２、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １，５０９−５１６，１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２３３１０−２３３１６，１９９６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４，１９０６−１９１２，１９９６）ことから、１０μｇ／ｍｌのスタフィロコッカス・アウレウスのＰＧＮ（Ｆｌｕｋａ社製；図２０Ａ）又は１０μｇ／ｍｌのスタフィロコッカス・アウレウスのＬＴＡ（シグマ社製；図２０Ｃ）を用いて、実施例８と同様の方法により、各種マウスの腹膜マクロファージに対する応答でのＩＬ−６及びＮＯ_２ ⁻の産生量を測定した。また、実施例１０と同様に、各種マウスの腹膜マクロファージのＰＧＮ（図２０Ｂ）又はＬＴＡ（図２０Ｄ）に対する応答でのＴＮＦ−αの産生を測定した。
【００９６】
図２０Ａの結果から、野生型マウス及びＴＬＲ４ノックアウトマウスの腹膜マクロファージでは、ＰＧＮに対する応答によりＩＬ−６を産生するのに対し、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのものでは産生しないことがわかった。また、野生型マウス及びＴＬＲ４ノックアウトマウスの腹膜マクロファージをＩＦＮ−γの存在下でＰＧＮといっしょに培養するとＮＯ_２ ⁻を産生するのに対して、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのものでは産生しないことがわかった。一方、野生型マウス及びＴＬＲ２ノックアウトマウスの腹膜マクロファージでは、ＬＴＡに対する応答によりＩＬ−６を産生するのに対し、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのものでは産生しないことがわかった（図２０Ｃ）。また、野生型マウス及びＴＬＲ２ノックアウトマウスの腹膜マクロファージをＩＦＮ−γの存在下でＬＴＡといっしょに培養するとＮＯ_２ ⁻を産生するのに対して、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのものでは産生しないことがわかった（図２０Ｃ）。
【００９７】
図２０Ｂに示されているように、ＴＬＲ４ノックアウトマウスの腹膜マクロファージは、野生型マウスのものと同様に、ＰＧＮの投与量に応じてＴＮＦ−αの産生を増加させるのに対して、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのものでは、ＴＮＦ−α産生が実質的に損なわれており、ＰＧＮ不応答性であることがわかった。一方、図２０Ｄに示されているように、ＴＬＲ２ノックアウトマウスの腹膜マクロファージは野生型マウスのものと同様に、ＬＴＡの投与量に応じてＴＮＦ−αの産生を誘導するのに対し、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのものでは、ＴＮＦ−α産生がなく、ＬＴＡ不応答性であることがわかった。以上のことから、グラム陽性菌の細胞壁成分であるＰＧＮがＴＬＲ２を介してマクロファージを活性することや、ＬＴＡがＴＬＲ４を介してマクロファージを活性することがわかった。
【実施例１２】
【００９８】
（ＬＰＳ又はＰＧＮ刺激によるインビトロでのキナーゼアッセイ及びウェスタンブロット）
ＴＬＲファミリーメンバーは、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８を介してセリン／トレオニンキナーゼであるＩＲＡＫを活性化し、次いでｒｅｌ型転写因子であるＮＦ−κＢを活性化する、細胞内シグナル伝達分子として知られている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２，２５３−２５８，１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，２０９７−２１０１，１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１，１１５−１２２，１９９９）。ＬＰＳ及びＰＧＮが、かかる細胞内シグナル伝達分子を活性化するかどうかを次のようにして調べた。各種マウスの腹腔マクロファージ（１×１０^６）を、１ｎｇ／ｍｌのサルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５のＬＰＳ又は１０μｇ／ｍｌのスタフィロコッカス・アウレウスのＰＧＮで図２１に示された時間刺激し、これらの細胞菌体を、溶解緩衝液（最終濃度で１．０％のトリトンＸ−１００、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４及び１０ｍＭのβ−グリセロリン酸を含有する緩衝液：ｐＨ８．０）中にて溶解し、抗ＩＲＡＫ抗体（林原生化学研究所株式会社）で免疫沈降して、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３４，１８３−１９６，１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１，１１５−１２２，１９９９）記載のように、インビトロキナーゼアッセイを行い、ＩＲＡＫの自己リン酸化を測定した（図２１Ａ，ＢにおけるＡｕｔｏ）。
また、上記溶解物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離させ、ニトロセルロース膜に移し、この膜を抗ＩＲＡＫ抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）でブロットして、エンハンスド・ケミルミネッセンス装置（デュポント社製）を使用して視覚化した（図２１Ａ，ＢにおけるＷＢ）。以上の結果から、ＬＰＳに対する応答でのＩＲＡＫ活性化は、野生型マウス（野生型）及びＴＬＲ２ノックアウトマウス（ＴＬＲ２−／−）において観察できたが、ＴＬＲ４ノックアウトマウス（ＴＬＲ４−／−）では観察できなかった。一方、ＰＧＮに対する応答でのＩＲＡＫ活性化は、野生型マウス及びＴＬＲ４ノックアウトマウスのみにおいて確認することができた。これらのことから、ＬＰＳはＴＬＲ４を、ＰＧＮはＴＬＲ２をそれぞれ介し認識されることがわかった。
【００９９】
さらに、ＬＰＳ又はＰＧＮに対する応答によるＮＦ−κＢの活性化についも調べてみた。上記ＬＰＳ又はＰＧＮで刺激した各種マウスのマクロファージから核抽出物を精製し、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合部位に対する特異的プローブといっしょにインキュベートし、文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９，１４３−１５０，１９９８）記載の電気泳動移動度シフト分析により視覚化した。その結果を図２１Ｃ，Ｄに示す。なお、図中の矢印はＮＦ−κＢと特異的プローブとの複合物の位置を示し、矢頭は特異的プローブのみの位置を示している。これらの結果から、ＬＰＳに対する応答によるＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を、野生型マウス及びＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージの核抽出物において検出できたが、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのものではかかる活性を検出できなかった。一方、ＰＧＮに対する応答によるＮＦ−κＢ活性化は、野生型マウスとＴＬＲ４ノックアウトマウスのマクロファージで確認できたが、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのものでは確認できなかった。これらのことから、ＴＬＲ４はＬＰＳ誘導ＮＦ−κＢ活性化に、ＴＬＲ２はＰＧＮ誘導ＮＦ−κＢ活性化に不可欠であることがわかった。
【実施例１３】
【０１００】
（Ｒ−ＭＡＬＰ−２とＳ−ＭＡＬＰ−２の立体特異的リポペプチド合成及びＨＰＬＣ精製）
出発原料として、各々９９％以上の純粋なエナンチオマーを含有する（Ｓ）−（−）−グリシドール及び（Ｒ）−（＋）−グリシドール（シグマ−アルドリッチ社製）の２つの試薬を用いて文献（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｒｅｓ．３８５４５，１９９１）記載の方法により、Ｓ−（２，３−ジハイドロオキシプロピル）−Ｌ−システインの立体異性体を合成した。これら立体異性体からＮ_α−フルオレニルメトキシカルボニル基で保護されたＳ−［２（Ｓ），３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］−Ｌ−システインとＳ−［２（Ｒ），３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］−Ｌ−システインとの異性体をそれぞれ合成し、上記文献記載の方法でカップリングし、担体に結合したフルオレニルメトキシカルボニル基で保護されたペプチドを得た。１０ｍｇの粗精製ＭＡＬＰ−２を、ＳＰ２５０／１０ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ３００−７ Ｃ８ ｃｏｌｕｍｎ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ社製）を用いて逆相ＨＰＬＣによりバッチ処理してさらに精製し、０．１％のトリフルオロ酢酸を含んだ水／２−プロパノールの直線的グラジエントにより４０℃で溶出し、活性溶出画分をＮＯ解離分析によりモニターし、最終生成物は質量分析、及び、正確なペプチド含量を決定するためのをアミノ酸分析により特徴づけられた。これらＭＡＬＰ−２を水／２−プロパノール１：１（容積比）の溶液を用い１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、４℃で保存した。
【実施例１４】
【０１０１】
（ＣＨ３／ＨｅＪマウスの腹腔マクロファージのリポタンパク／リポペプチドに対する応答性）
ＣＨ３／ＨｅＪ由来のエンドトキシン低応答性マウスからＰＥＣ（腹腔滲出細胞）を単離し、これらＰＥＣ（６×１０^５）を５％のＦＣＳと２５μＭの２−メルカプトエタノールを含んだダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）１．２５ｍｌの入った２４穴細胞培養プレート中で３７℃にて一晩培養した。この培養物から非付着細胞を取り除き、新しい培養液に交換して腹膜マクロファージを調製した。各種濃度（０．１、１、１０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５又は１０^６ｐｇ／ｍｌ）の実施例８の方法により得られたＲ−ＭＡＬＰ−２又はＳ−ＭＡＬＰ−２と、濃度３０ｕｎｉｔ／ｍｌの組換えインターフェロン−γ（ｒＩＦＮ−γ）の共存下に、上記腹膜マクロファージを培養し、培養上清中のＮＯ_２ ⁻、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生量を測定した（図２２）。ＴＮＦ−αは培養から３時間後にＥＬＩＳＡ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）によって、ＩＬ−６は培養から２１時間後にＥＬＩＳＡ（ＥＮＤＯＧＥＮ社製）によって、ＮＯ_２ ⁻は培養から４６時間後にＮＯ_２／ＮＯ_３アッセイキット（同仁科学研究所社製）を使用したＧｒｅｉｓｓ法によってそれぞれ測定した。これらの結果から、Ｓ−ＭＡＬＰ−２よりＲ−ＭＡＬＰ−２の方が、腹膜マクロファージに対してより高い特異活性を示すことがわかった。
【実施例１５】
【０１０２】
（ヒト単球のリポタンパク／リポペプチドに対する応答性）
健康なヒトから得られた単球を洗浄後、実験に用いた。実施例１３の方法により得られたＲ−ＭＡＬＰ−２又はＳ−ＭＡＬＰ−２の各種濃度（０．１、１、１０、１０^２、１０^３、１０^４又は１０^５ｐｇ／ｍｌ）下、ヒト単球（７．５×１０^５）を２０時間刺激した。刺激後、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＴＮＦ−αの産生量をＥＬＩＳＡにより測定した（図２３）。この結果から、実施例１４のマウス由来のマクロファージの場合と同様に、Ｓ−ＭＡＬＰ−２よりＲ−ＭＡＬＰ−２の方がマクロファージ等に分化する前のヒト単球に対してより高い特異活性を示すことがわかった。
【実施例１６】
【０１０３】
（ＴＬＲ２ノックアウトマウスのリポタンパク／リポペプチド不応答性）
野生型マウス（野生型）、ＴＬＲ２ノックアウトマウス（ＴＬＲ２−／−）、ＴＬＲ４ノックアウトマウス（ＴＬＲ４−／−）、ＭｙＤ８８ノックアウトマウス（ＭｙＤ８８−／−）のそれぞれの腹膜マクロファージのリポタンパク／リポペプチドに対する応答性を、マイコプラズマ由来のＭＡＬＰ−２を用いて調べた。それぞれのマウスの腹膜マクロファージを実施例１４と同様の方法により単離し、各腹膜マクロファージをｒＩＮＦγ（３０ｕｎｉｔ／ｍｌ）の存在下（図２４Ｂ及びＤ）又は非存在下（図２４Ａ及びＣ）において、実施例１３より得られた各種濃度（０、０．１、１、１０、１０^２、１０^３又は１０^４ｐｇ／ｍｌ）のＲ−ＭＡＬＰ−２又はＳ−ＭＡＬＰ−２といっしょに２４時間培養した。培養後、培養上清中のＴＮＦ−α及びＮＯ_２ ⁻の産生量を測定した（図２４）。
【０１０４】
上記の結果から、野生型マウス及びＴＬＲ４欠損マウスの腹膜マクロファージは、Ｒ−ＭＡＬＰ−２の投与量に応じてＴＮＦ−αやＮＯ_２ ⁻の産生を増加しているのに対して、ＴＬＲ２欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスの腹腔マクロファージではＴＮＦ−αもＮＯ_２ ⁻も産生していなかった（図２４Ａ及びＢ）。また、Ｓ−ＭＡＬＰ−２においても同様の結果が得られた（図２４Ｃ及びＤ）。その他、Ｒ−ＭＡＬＰ−２又はＳ−ＭＡＬＰ−２刺激によるＩＬ−６産生も、ＴＬＲ２欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスの腹腔マクロファージでは不応答性であることが確認された（図示せず）。以上のことから、Ｒ−ＭＡＬＰ−２等のマイコプラズマ由来のリポタンパク／リポペプチドがＴＬＲ２及びＭｙＤ８８を介してマクロファージを活性化することがわかった。
【実施例１７】
【０１０５】
（リポタンパク／リポペプチド刺激によるインビトロでのキナーゼアッセイ及びウェスタンブロット）
実施例１６の結果から、リポタンパク／リポペプチドが細胞内シグナル伝達分子を活性化するかどうかを調べるために、上記４種のマウスの腹腔マクロファージ（１×１０^６）を、０．３ｎｇ／ｍｌのＲ−ＭＡＬＰ−２で１０分間刺激し、実施例１２と同様に抗ＩＲＡＫ抗体を用いてインビトロキナーゼアッセイ（図２５ＡのＡｕｔｏ）及びウエスタンブロット分析（図２５ＡのＷＢ）や電気泳動移動度シフト分析（図２５Ｂ）を行った。また、抗ＪＮＫ１抗体を用いたインビトロキナーゼアッセイ（図２５ＣのＡｕｔｏ）及びウエスタンブロット分析（図２５ＣのＷＢ）を行った。これらの結果から、ＴＬＲ２ノックアウトマウス及びＭｙＤ８８ノックアウトマウスのマクロファージにおいて、ＭＡＬＰに対するＩＲＡＫ、ＮＦ−κＢ及びＪＮＫの活性化が確認できなかった。以上のことから、マイコプラズマ由来のリポタンパク／リポペプチドは、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８シグナル伝達経路を介して生体反応を引き起こしていることが明かとなった。
【図面の簡単な説明】
【００１０６】
【図１】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図を示す図である。
【図２】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスと野生型マウスに大腸菌由来のＬＰＳを投与した場合の生存率を示す図である。
【図３】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスと野生型マウスにおけるＩＬ−１を介してのＴ細胞増殖の結果を示す図である。
【図４】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスと野生型マウスにおけるＩＬ−１誘導による血中のＴＮＦ−αとＩＬ−６のレベル結果を示す図である。
【図５】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスと野生型マウスにおけるＩＬ−１８を介してのＮＫ細胞の活性化の結果を示す図である。
【図６】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウスと野生型マウスにおけるＩＬ−１２とＩＬ−１８の刺激によるＩＦＮ−γの産生の結果を示す図である。
【図７】ドミナントネガティブＭｙＤ８８の突然変異が、ＩＬ−１８誘導ＮＦ−κＢ活性及びＡＰ−１活性に関与していることを示す図である。
【図８】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓Ｂ細胞のサルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５に対する応答性の結果を示す図である。
【図９】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓Ｂ細胞のＩＬ−４やインターフェロン−γに対する応答性の結果を示す図である。
【図１０】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓Ｂ細胞のポルフィロモナス・ジンジバリスに対する応答性の結果を示す図である。
【図１１】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓Ｂ細胞のエシェリキア・コリＯ５５：Ｂ５に対する応答性の結果を示す図である。
【図１２】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓Ｂ細胞のペプチドグリカンに対する応答性の結果を示す図である。
【図１３】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓Ｂ細胞のリポテイコ酸に対する応答性の結果を示す図である。
【図１４】本発明のＭｙＤ８８ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスのマクロファージ及び脾臓Ｂ細胞の結核菌全細胞溶解物に対する応答性の結果を示す図である。
【図１５】本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図を示す図である。
【図１６】本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウスと野生型マウスに大腸菌由来のＬＰＳを投与した場合の生存率を示す図である。
【図１７】本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスにおけるリピドＡ又はＬＰＳ誘導によるＩＬ−６、ＴＮＦ−α又はＮＯ_２ ⁻の産生量を示す図である。
【図１８】本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスの脾臓Ｂ細胞のサルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５由来ＬＰＳに対する応答性の結果を示す図である。
【図１９】本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスの腹腔マクロファージのグラム陽性菌の細胞壁成分に対する応答性の結果を示す図である。
【図２０】本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスにおけるＰＧＮ又はＬＴＡ誘導によるＩＬ−６、ＮＯ_２ ⁻又はＴＮＦ−αの産生量を示す図である。
【図２１】本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウスにおいて、ＬＰＳ又はＰＧＮ刺激によるインビトロでのキナーゼアッセイ、ウエスタンブロット分析及び電気泳動移動度分析の結果を示す図である。
【図２２】ＣＨ３／ＨｅＪマウスの腹腔マクロファージのリポペプチドＭＡＬＰ−２に対する応答性の結果を示す図である。
【図２３】ヒト単核細胞のリポペプチドＭＡＬＰ−２に対する応答性の結果を示す図である。
【図２４】本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウス、ＭｙＤ８８ノックアウトマウスの腹腔マクロファージのリポペプチドＭＡＬＰ−２に対する応答性の結果を示す図である。
【図２５】本発明のＴＬＲ２ノックアウトマウス、野生型マウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウス、ＭｙＤ８８ノックアウトマウスにおいて、リポペプチドＭＡＬＰ−２刺激によるインビトロでのキナーゼアッセイ、ウエスタンブロット分析及び電気泳動移動度分析の結果を示す図である。

Claims (3)

1. ＴＬＲ２をコードする遺伝子の機能を染色体上で欠損せしめた非ヒト動物を、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル動物として使用する方法。
2. 非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 齧歯目動物がマウスであることを特徴とする請求項２記載の方法。