WO2000024891A1 - Nouvelles proteines receptrices couplees aux proteines g et adn de celles-ci - Google Patents

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WO2000024891A1
WO2000024891A1 PCT/JP1999/005938 JP9905938W WO0024891A1 WO 2000024891 A1 WO2000024891 A1 WO 2000024891A1 JP 9905938 W JP9905938 W JP 9905938W WO 0024891 A1 WO0024891 A1 WO 0024891A1
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WO
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protein
receptor protein
present
coupled receptor
salt
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Application number
PCT/JP1999/005938
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French (fr)
Inventor
Takuya Watanabe
Yoshio Matsumoto
Yasuko Terao
Yasushi Shintani
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel G protein-coupled receptor protein derived from the rat brain stem periphery and a human fetus, or a salt thereof, and DNA encoding the same.
  • G protein conjugated guanine nec leoti de-bindng protein
  • G protein-coupled receptor protein a seven-transmembrane receptor protein (7TMR) because of its common structure having seven transmembrane domains that transmit.
  • G protein-coupled receptor protein is present on the surface of each functional cell in living cells and organs, and is a target for molecules that regulate the function of those cells and organs, such as hormones, neurotransmitters, and biologically active substances. Plays a physiologically important role.
  • the receptor transmits a signal into the cell through binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as suppression of activation and activation of the cell.
  • physiological functions are regulated under the control of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or bioactive substances.
  • physiologically active substances are present at various sites in the body, and regulate their physiological functions through the corresponding receptor proteins.
  • receptor proteins In vivo There are still many unknown hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances, and the structure of their receptor proteins has not yet been reported. Furthermore, it is often unknown whether subtypes exist in known receptor proteins.
  • Determining the relationship between substances that regulate complex functions in living organisms and their specific receptor proteins is a very important tool for drug development.
  • the function of the gene for the receptor protein expressed in the living body must be elucidated and the It was necessary to express in an expression system.
  • G-protein coupled receptor Yuichi is a new It is useful for searching for a physiologically active substance (that is, a ligand), and for searching for an agonist or an agonist for the receptor.
  • a physiologically active substance that is, a ligand
  • an agonist or antagonist against the receptor can be identified. It is also possible to produce.
  • These ligands, agonists, and antagonists for these receptors can be expected to be used as preventive Z therapeutics and diagnostics for diseases associated with dysfunction of G protein-coupled receptors.
  • a decrease or enhancement of the function of the receptor in a living organism based on a gene mutation of a G protein-coupled receptor often causes some disease.
  • not only administration of an antagonist or agonist to the receptor, but also introduction of the receptor gene into a living body (or a specific organ) or introduction of an antisense nucleic acid to the receptor gene Can also be applied to gene therapy.
  • the nucleotide sequence of the receptor is indispensable information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene, and the receptor gene is used for the disease associated with the dysfunction of the receptor. It can also be applied to preventive / therapeutic and diagnostic agents. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a novel useful G protein-coupled receptor protein as described above. That is, a novel G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, and a polynucleotide (DNA, RNA and their derivatives) encoding the G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof can be used.
  • the G protein For screening a compound (annogonist, agonist) or a salt thereof that alters the binding to a protein-coupled receptor protein, a screening kit, a ligand obtainable by using the screening method or a screening kit, Compounds (antagonist, agonist) or their salts that change the binding to G protein-coupled receptor protein, and compounds (antagonis) that change the binding of ligand to the G protein-coupled receptor protein And a drug containing a compound that changes the expression level of the
  • the present inventors have conducted intensive studies and as a result, based on EST information generated by the degenerated PCR method, have been able to simply encode cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein derived from the rat brainstem and the human fetus. Then, the entire base sequence was successfully analyzed. When this nucleotide sequence was translated into an amino acid sequence, the first to seventh transmembrane regions were identified on the hydrophobicity plot, and the protein encoded by these cDNAs was conjugated to a seven-transmembrane G protein. It was confirmed that it was a type receptor protein. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • the antibody according to (10) which is a neutralizing antibody that inactivates signal transduction of the G protein-coupled receptor protein according to (1);
  • Binding of the ligand to the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof according to (1) which can be obtained using the screening method according to (16) or the screening kit according to (17).
  • a medicament comprising a compound or a salt thereof,
  • (21) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide according to (4) or a part thereof,
  • a diagnostic agent for a disease associated with the function of a G protein-coupled receptor according to (1) which comprises using the quantification method according to (22) or (23).
  • the protein is: (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably 1 to 9); Amino acid sequence in which about several, more preferably several (1 to 5) amino acids have been deleted, and 2 or more (preferably 1 to 30) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence to which about 1 to 10 amino acids are added, more preferably about 1 to 10 amino acids, and still more preferably several (1 to 5) amino acids. 3 One or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 ( Preferably, about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5) amino acids are substituted with other amino acids.
  • a protein containing the combined amino acid sequence The G protein-coupled receptor protein or its salt described in (1) above,
  • the ligand is, for example, angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasoprescin, oxitocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin Chin, GH RH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal Polypeptide), Somatos-tin, Dopamine, Motilin, Amylin, Bradykinin, CGRP (Calcitonin Gene-Related Peptide), Leukotriene, Pancreastatin , Prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, ⁇ and] 3—chemokine (eg, IL-8, GR ⁇ a, GR ⁇ 3, GR ⁇ , NAP-2, ENA-78, PF4, IP 10,
  • a compound that activates the G protein-coupled receptor protein described in (1) or a salt thereof is contacted with a cell containing the G protein-coupled receptor protein described in (1). And (ii) adding the compound that activates the G protein-coupled receptor protein or the salt thereof described in (1) above and a test compound to cells containing the G protein-coupled receptor protein described in (1) above.
  • the cell stimulating activity mediated by the G protein-coupled receptor protein when contacted is measured and compared with the ligand and the G protein-coupled receptor protein or the G protein-coupled receptor protein described in (1) above.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property to the salt
  • a compound that activates the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof described in (1) above is cultured on the transformant described in (8) above, and the G protein expressed on the cell membrane of the transformant is cultured.
  • the transformant according to (8) is cultivated with the compound that activates the G protein-coupled receptor protein or the salt thereof described in (1) above and the test compound, which are brought into contact with the protein-coupled receptor protein. Therefore, a ligand characterized by measuring and comparing cell stimulating activities mediated by a G protein-coupled receptor protein when brought into contact with a G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane of the transformant.
  • the compound that activates the G protein-coupled receptor protein according to (1) is angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glumin, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, Purin, vasoprescin, oxytocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (vasoactive intestinal polypeptide), somatostatin, dopamine, motilin , Amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline
  • (40) A compound capable of being obtained by the screening method according to any one of (32) to (39) or a compound capable of changing the binding property between the ligand and the G protein-coupled receptor protein according to (1) or a salt thereof. salt,
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein rOT7T009C derived from the periphery of the rat brain stem of the present invention obtained in Example 1, and the amino acid sequence deduced therefrom. (Continued in Figure 2).
  • FIG. 2 shows the G protein-coupled rat derived from the periphery of the rat brainstem of the present invention obtained in Example 1.
  • 1 shows the nucleotide sequence of DN DN encoding the septum protein rOT7T009C, and the amino acid sequence deduced therefrom (continued from FIG. 1, followed by FIG. 3).
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the G protein-coupled receptor protein r ⁇ T 7 T 009 C derived from the rat brain stem region of the present invention obtained in Example 1 and estimated therefrom.
  • the amino acid sequence is shown (continued from Figure 2 and continued to Figure 4).
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein OT7T009C derived from the periphery of the rat brain stem of the present invention obtained in Example 1, and the amino acid sequence deduced therefrom. (Continued from Figure 3).
  • FIG. 5 shows the G protein-coupled receptor Yuichi protein derived from the periphery of the rat brain stem of the present invention obtained in Example 1! ⁇ Shows the nucleotide sequence of the DNA encoding ⁇ T 7 T 009 T and the deduced amino acid sequence (continued from Figure 6).
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the G protein-coupled receptor 1 protein r ⁇ 709009T derived from the peripheral region of the rat brain stem of the present invention obtained in Example 1, and estimated therefrom.
  • the amino acid sequence is shown (continued from FIG. 5, followed by FIG. 7).
  • FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein r ⁇ T7T009 ⁇ derived from the periphery of the rat brain stem obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom. (Continued from Figure 6 and continued to Figure 8).
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein rOT7TO09T derived from the periphery of the rat brain stem of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom ( (Continuation of Figure 7).
  • FIG. 9 shows the hydrophobicity of the G protein-coupled receptor protein rOT7 TO09C and r ⁇ T7T009 ⁇ of the present invention derived from the rat brainstem, based on the amino acid sequences shown in FIGS. 1 to 8. 2 shows a sex plot.
  • FIG. 10 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the novel human fetal-derived G protein-coupled receptor protein h7T7T009 obtained in Example 2 and the amino acid sequence deduced therefrom. 11 follows 1).
  • FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the novel fetal human G protein-coupled receptor protein hOT7T009 obtained in Example 2 and the amino acid sequence deduced therefrom (FIG. 10).
  • FIG. 12 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the novel human fetal G protein-coupled receptor protein hOT7T099 obtained in Example 2 and its estimated value. The amino acid sequence is shown (continuation of FIG. 11).
  • FIG. 13 shows the hydrophobic plot of the human fetal G protein-coupled receptor protein hOT7TO09 of the present invention prepared based on the amino acid sequences shown in FIGS. 10 to 12. Show ⁇ ". BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention may be the same as or similar to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the amino acid sequence in FIGS. 1 to 4).
  • a substantially identical amino acid sequence for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (the amino acid sequence in FIGS. 5 to 8) or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (in FIGS. 10 to 12) Is an amino acid sequence of the receptor.
  • the receptor protein of the present invention can be used, for example, in any cells (eg, spleen cells, nerve cells, glia) of human mammals (eg, guinea pig, rat, mouse, egret, bush, sheep, horse, monkey, etc.).
  • human mammals eg, guinea pig, rat, mouse, egret, bush, sheep, horse, monkey, etc.
  • T cells T cells, bone marrow cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langer's cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells) , B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells , Hepatic or stromal cells, or their precursors, stem cells or cancer cells, etc.), blood cells, or any tissue in which these cells are present, eg , Brain, various parts of the brain (e.g., olfactory bulb, nucleus pulposus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamus nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, oc
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for example, about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Is an amino acid sequence having a homology of about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 The amino acid sequence represented by
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a protein having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • substantially the same activity examples include a ligand binding activity and a signal information transmitting action. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (for example, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • the measurement of the activity such as the ligand binding activity and the signal transduction action can be performed according to a method known per se. For example, it can be measured according to the ligand determination method and screening method described later. .
  • the receptor protein of the present invention includes: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably 1 to 1); An amino acid sequence in which about 0, more preferably several (1 to 5) amino acids have been deleted; (2) 1 or more (preferably 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Degree, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids, 3 sequence number: 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by 1 (Preferably about 1 to 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, and still more preferably several amino acids (1 to 5 amino acids)) Braid Proteins containing the combined amino acid sequence are also used.
  • the receptor protein in the present specification has a ⁇ -terminal (amino terminal) at the left end and a C-terminal (carboxyl terminal) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the receptor protein of the present invention including the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a C-terminus having a normal lipoxyl group (1 C ⁇ H) or a carboxylate (1 CO
  • the C terminal that is O_) may be an amide (—C ⁇ NH 2 ) or an ester (—C ⁇ R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, C i _ 6 alkyl groups such as isopropyl or n- butyl, for example, C 3 cycloalkyl pentyl, cyclo etc.
  • cyclohexyl - 8 cycloalkyl group for example, phenyl, shed - C 6 _ 1 2 ⁇ Li Ichiru groups, naphthyl, for example, benzyl, Fei one naphthyl such as phenyl one 2 alkyl group or single naphthylmethyl such phenethyl - such as C ⁇ z alkyl group
  • a bivaloyloxymethyl group widely used as an oral ester is used.
  • the receptor protein of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus
  • the receptor protein of the present invention includes amidation or esterification of the lipoxyl group.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the receptions evening one protein of the present invention is the protein mentioned above, Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., C i _ 6 such as formyl group, C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru Glyceryl group) protected by N-terminal cleavage in vivo, and the resulting gluminyl group is oxidized by pidal dimamine.
  • Mechionin residues of N-terminal e.g., C i _ 6 such as formyl group, C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru Glyceryl group
  • a suitable protecting group e.g., protected by a formyl group, etc.
  • Ashiru groups such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru
  • complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • receptor protein of the present invention examples include, for example, a receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a receptor protein represented by SEQ ID NO: 2.
  • a receptor protein containing a 1_ amino acid sequence, a receptor protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the like are used.
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention may be any peptide as long as it is the above-mentioned partial peptide of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein molecules of the present invention those which are exposed outside the cell membrane and have receptor binding activity are used.
  • the partial peptide of the receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an extracellular region (hydrophilic site) in the hydrophobicity plot analysis shown in FIG. This is the peptide containing the part that was analyzed. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains simultaneously may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the receptor protein of the present invention.
  • a substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence of about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, and most preferably Indicates an amino acid sequence having about 95% or more homology.
  • “substantially the same activity” has the same meaning as described above.
  • the “substantially the same activity” can be measured in the same manner as described above.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to ⁇ )) amino acids in the above amino acid sequence are deleted.
  • one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence are substituted with other amino acids. May be.
  • the C-terminus usually has a carboxyl group (—COOH) Or, the force of being a carboxylate (one COO one)
  • the C-terminal may be an amide (—CONH 2 ) or an ester (—COOR).
  • the partial peptide of the present invention has an N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected with a protecting group, and the N-terminal side is cleaved in vivo.
  • Py-glutamine oxidation of the generated gin, amino acid in the molecule in which the substituent on the side chain is protected with an appropriate protecting group, or complex peptide such as so-called sugar peptide to which a sugar chain is bound Is also included.
  • the partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (1 C ⁇ H) or a carboxylate (1 C ⁇ —) at the C-terminus. CONH 2 ) or ester (one C ⁇ R).
  • Examples of the salt of the receptor protein or its partial peptide of the present invention include physiologically acceptable salts with acids or bases, and particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or mammalian cells or tissues by a method known per se for purifying the receptor protein, or contains a DNA encoding the receptor protein of the present invention described below. It can also be produced by culturing any transformant. In addition, the protein can also be produced according to the protein synthesis method described below or according to the method.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to reversed phase chromatography, ion exchange chromatography, or the like. Purification and isolation can be carried out by combining mouth chromatography.
  • the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its salt or its For the synthesis of the amide a commercially available resin for protein synthesis can be used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4 — Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl) Lou Fmoc aminoethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid having an appropriately protected amino group and side chain functional group is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or its amide.
  • Activation by these involves the addition of a protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (e.g., HOBt, HOOBt), or as a symmetrical acid anhydride or HOBt ester or H00Bt ester. After the protected amino acid is activated in advance, it can be added to the resin.
  • a racemization inhibitor additive e.g., HOBt, HOOBt
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or a suitable mixture thereof. Used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of about 120 T: to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Bo, and pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, ⁇ -Z, Br-Z, and adamantyl.
  • Oxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, It can be protected by benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopenty
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarponyl group, an ethoxycarbonyl group, and the like are used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz l, C l 2 - Bz l, 2- nitrobenzyl, Br @ - Z, such as evening over tert-butyl is used.
  • Examples of the protecting group for imidazole of histidine include, for example, Tos, 4-methoxy- 2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Tr and Fmoc are used.
  • Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitro Phenol, cyanomethyl alcohol, para-nitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with H0BO], etc.
  • the activated amino group of the raw material is For example, the corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfone, or the like.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally carried out at a temperature of about ⁇ 20 to about 40.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group for histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group for tributofan is 1,2-ethanedithiol
  • it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, after extending the peptide (protein) chain to the desired chain length on the amino group side, The terminal of the peptide chain A protein from which only the protecting group of the terminal ⁇ -amino group has been removed and a protein from which only the protecting group of the C-terminal lipoxyl group has been removed are produced, and both proteins are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein can be obtained. This crude protein is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • ester of a protein for example, after condensing the ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein is obtained in the same manner as the amide of the protein be able to.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the desired peptide. can do.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the peptides can be purified and isolated.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method.
  • the partial peptide is obtained as a salt, it is converted to a free form by a known method. be able to.
  • the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention may be any polynucleotide containing a nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the above-described receptor protein of the present invention. You may.
  • the polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • MRNA of the receptor protein of the present invention can be quantified.
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, a cDNA derived from the above-described cells and tissues, a cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and a synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, it can also be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention includes, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 3, having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8, and having substantially the same activity as the receptor protein of the present invention (eg, , Receptor binding activity, signal transduction, etc.) Any DNA can be used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8 include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8 DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Hybridization is performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). You can do it.
  • a commercially available library it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
  • the high stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 4 OmM, preferably about 19 to 2 OmM, and a temperature of about 50 to 70, preferably about 60 to 65 ° C.
  • a sodium concentration of about 19 to 4 OmM preferably about 19 to 2 OmM
  • a temperature of about 50 to 70 preferably about 60 to 65 ° C.
  • the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the like is used.
  • DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by 2 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is used, and the DNA containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is used.
  • DNA encoding the receptor protein a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and the like are used.
  • polynucleotide comprising a part of the nucleotide sequence of the DNA encoding the receptor protein of the present invention or a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA is a partial peptide of the present invention described below.
  • the term is used to mean not only DNA that encodes but also RNA.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of a G protein-coupled receptor protein gene is cloned. It can be designed and synthesized based on the base sequence information of the DNA encoding the determined or determined G protein-coupled receptor protein.
  • a polynucleotide can hybridize with the RNA of the G protein-coupled receptor protein gene and inhibit the synthesis or function of the RNA, or can inhibit the synthesis or function of the G protein-coupled receptor protein. Through the interaction with protein-related RNA, the expression of the G protein-coupled receptor protein protein gene can be regulated and controlled.
  • Polynucleotides complementary to the selected sequence of G protein-coupled receptor protein-related RNA and polynucleotides capable of specifically hybridizing to G protein-coupled receptor protein-related RNA are available in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of the G protein-coupled receptor protein protein gene, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a nucleotide, base sequence or a specific sequence of a nucleic acid including a gene.
  • the "correspondence" between a nucleotide, a base sequence or a nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) under instructions derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5 'end hairpin loop, 5' end, etc. of G protein-coupled receptor protein gene — base spare 'repeat, 5' end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation, initiation codon, 3
  • the 'untranslated region, the 3' palindromic region, and the 3 'hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the G protein-coupled receptor protein gene may be selected.
  • the relationship between the nucleic acid of interest and a polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be “antisense” when the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide capable of hybridizing with the target object is “antisense”.
  • Antisense polynucleotides are polydeoxynucleotides containing 2-deoxy D-report, polydeoxynucleotides containing D-ribose, N-glycosides of purine or pyrimidine bases.
  • polynucleotides or other polymers with non-nucleotide backbones eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • polymers containing specialized linkages ⁇ eg, the polymer contains nucleotides having a configuration that allows base attachment, such as base pairing found in DNA or RNA).
  • They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides).
  • an intramolecular nucleotide for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, phosphorothioate) , Phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nucleases * inhibitors, toxins, anti- , Signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (eg, monosaccharides), etc., which have side-chain groups, interactive compounds (eg, acridine, psoralen, etc.), chelating compounds (Eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizable metals, etc.), those containing alkyl
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., one or more hydroxyl groups are replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or converted to functional groups such as ethers, amines, etc. May have been.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include those which are resistant to the decomposition of nucleic acid sulfur derivatives ⁇ ⁇ thiophosphate derivatives and polynucleoside amides ⁇ oligonucleoside amides. It is not limited to this.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, are provided in special forms such as ribosomes and microspheres, are applied by gene therapy, or are added. Can be given in a written form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, and lipids, which increase the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acid can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. It is.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the antisense nucleic acid inhibitory activity can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a G protein-coupled receptor protein. it can.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cell-tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can also be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) a partial nucleotide sequence of DNA having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8.
  • DNA or (2) the receptor protein of the present invention, which has a base sequence that hybridizes under high stringent conditions to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8, and
  • a DNA having a partial nucleotide sequence of DNA encoding a receptor protein having substantially the same activity as a peptide eg, ligand binding activity, signaling activity, etc.
  • Examples of the DNA capable of hybridizing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8 include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8.
  • DNA containing a base sequence having a homology of 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
  • the partial base of the receptor protein of the present invention may be used.
  • a DNA fragment which encodes a part or the entire region of the receptor protein of the present invention by amplifying by a PCR method using a synthetic DNA primer having a sequence or by incorporating the DNA into an appropriate vector. Alternatively, selection can be carried out by hybridization with those labeled with synthetic DNA.
  • the method of hybridization is L For example, it can be performed according to the method described in Molecular 'Cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, the procedure can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • Conversion of the nucleotide sequence of DNA can be performed using a known kit, for example, Mutan TM -G (Takara Shuzo), utan TM -K (Takara Shuzo), or the like using the Gupped duplex method or the Kunkel method. It can be carried out according to a known method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned receptor protein can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation start codon and translation stop codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the receptor protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the receptor protein of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment into an appropriate expression vector. It can be produced by ligating downstream of an inner promoter.
  • Examples of the vector include Escherichia coli-derived plasmids (eg, PBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, TP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), bacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, XT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pc DNA I ZNeo is used.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, PBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, TP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, p
  • the promoter used in the present invention may be any promoter suitable for the host used for gene expression.
  • SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. Of these, it is preferable to use CMV Promo One Night, SR Hi promoter and the like.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the trp promoter, lac promoter, recA promoter, promoter, lpp promoter, etc., and if the host is a Bacillus genus, SP01 promoter, SPO2 promoter, etc.
  • yeast such as PENP Promote, PH05 Promote, PGK Promote, GAP promoter, ADH Promote, etc. are preferred.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter, sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired.
  • SV40 ori an SV40 replication origin
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], an ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp), neomycin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne 0 r, G418 resistance), and the like.
  • dh fr gene as a selectable marker one with CH_ ⁇ (dh fr-) cells
  • the target gene can also be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention.
  • the host is a genus Escherichia
  • the PhoA signal sequence and the immediate A signal sequence are used.
  • the host is a Bacillus genus
  • the ⁇ -amylase signal sequence and subtilisin signal sequence are used.
  • the yeast is yeast, MF, signal sequence, SUC2, signal sequence, etc.If the host is an animal cell, insulin, signal sequence, Hiichi interferon, signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Are available respectively.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Specific examples of the bacterium belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli K12 ⁇ DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences' Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Bacillus bacteria include, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry, 95). Vol. 87 (1 984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH 22, AH22R—, ⁇ 87-11A, DKD-5D, 20B—12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris, etc. are used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a night larva of moth larvae (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), Trichoplusia niC MG 1 cell derived from midgut, High derived from egg of Trichoplusia ni Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. If the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N; BmN cell) or the like is used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCCCRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)). Used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-7, Vero, Chinese ham Star cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene deficient Chinese hamster cell CH ⁇ (hereinafter abbreviated as CHO (ci hfr)) cell, mouse L cell, mouse AtT-20, mouse myeloma cell, Rat GH3, human FL cells and the like are used.
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio Z Technology (Bio / Technology), 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium used for culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, Inorganic or organic substances such as peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract, and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal “Ob”, “Extra lime in” Molecular Geetics ( Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, an agent such as 30-indolylacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the culture medium When culturing a transformant in which the host is an insect cell or an insect, the culture medium is 10% immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). A mixture to which additives such as sera are appropriately added is used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEA1 Medium [Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association] 1999-519, 519 ( 1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc. Used.
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be produced on the cell membrane of the transformant.
  • the receptor protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and cell culture. After disrupting the cells or cells by freezing and thawing, a method of obtaining a crude extract of the receptor protein by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • Purification of the receptor protein contained in the culture supernatant or extract thus obtained can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Mainly using difference in molecular weight Method using charge difference such as ion exchange chromatography, Method using specific novelty such as affinity mouth chromatography, Reversed phase high-performance liquid mouth chromatography
  • a method utilizing a difference in hydrophobicity such as a method of isoelectric point electrophoresis, or a method utilizing a difference in isoelectric point, such as isoelectric focusing method, may be used.
  • the receptor protein thus obtained When the receptor protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a method known per se or It can be converted to a free form or another salt by an analogous method.
  • Receptor protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the thus produced receptor protein of the present invention or a salt thereof can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • the antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its salt. There may be.
  • An antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof may be prepared by using the receptor protein of the present invention as an antigen. It can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
  • the receptor protein of the present invention or the like is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration to itself or together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times. Examples of mammals used include monkeys, egrets, and animals. Nus, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats can be mentioned, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a mouse with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • myeloma cells By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled receptor protein or the like described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Keller and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP2Z0 and the like, with P3U1 being preferred.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by incubating at about 20 to 401: preferably at about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes.
  • hybridomas can be cultured on a solid phase (eg, microplate) onto which an antigen such as receptor protein has been directly or adsorbed together with a carrier. Then, add anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice) or protein A, and then add the protein A to the solid phase.
  • a solid phase eg, microplate
  • antigen such as receptor protein has been directly or adsorbed together with a carrier.
  • anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice
  • protein A add the protein A to the solid phase.
  • a method for detecting the bound monoclonal antibody adding the hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, and adding a receptor protein or the like labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like, A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase is exemplified.
  • Monoclonal antibodies are selected according to a method known per se or a method analogous thereto. b) It can be carried out, but usually it can be carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, and GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum
  • SFM-101 Saito Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually from 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as ordinary polyclonal antibodies.
  • immunoglobulin separation and purification eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific purification method in which only antibodies are collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bonds are dissociated to obtain antibodies.
  • an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (an antigen such as a receptor protein) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting the antibody-containing substance against the antibody and the like and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier-protein and the mixing ratio between carrier and hapten depend on the efficiency of antibody against hapten immunized by cross-linking with carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio.
  • a method is used in which min, dysthyroglobulin, keyhole, limpet, hemocyanin and the like are coupled at a weight ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 with respect to 1 hapten.
  • a force that can use various condensing agents a dartalaldehyde / carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the receptor protein or its salt, its partial peptide or its salt, and the DNA encoding the receptor protein or its partial peptide of the present invention are: (1) the G protein-coupled receptor protein of the present invention; Determination of ligand (agonist), (2) preventive and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of G protein-coupled receptor protein of the present invention, (3) gene diagnostic agent, (4) present invention (5) A preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention; ,
  • G protein-coupled receptor protein of the present invention can be used for the production of non-human animals having a DNA encoding a compound (eg, agonist, angonist, etc.) that changes the binding property between the G protein-coupled receptor protein of the present invention and a ligand; (8) the G protein-coupled receptor of the present invention Alters the binding between protein and ligand A prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (agonist, angonist); (9) quantification of the receptor protein of the present invention or its partial peptide or salt thereof; ) A method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane, (11) a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane (12) Neutralization with an antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, (13) G protein-coupled receptor protein of the present invention Can be used for the production of non-human animals having
  • binding of a ligand to a G protein-coupled receptor specific to humans and mammals can be achieved.
  • Compounds that alter the sex eg, agonist, anginaist etc.
  • the agonist or anginaist can be used as a preventive / therapeutic agent for various diseases.
  • DNA encoding the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention, etc.
  • the receptor protein of the present invention or its partial peptide (hereinafter, referred to as The use of the antibody of the present invention (which may be abbreviated as DNA of the present invention) and the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) will be specifically described below.
  • the receptor protein of the present invention or its salt or the partial peptide or its salt of the present invention is useful as a reagent for searching for or determining a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention or its salt. .
  • the present invention provides a method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention, which comprises contacting a receptor compound of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof with a test compound.
  • Test compounds include known ligands (e.g., angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin).
  • Adrenomedullin Adrenomedullin, Somatos, Chitin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Rerated Polypeptide), Somatos, Chitin, Dopamine, Motilin, Amylin, Bradykinin, C GRP (Calcitonin Gene) Relayed peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, ⁇ and / 3-chemokine (eg IL- 8, GRO a, GR ⁇ i3, GR ⁇ T, NAP—2, ENA—78, PF4, IP10, GCP—2, MCP—1, HC 14, MCP—3, 1—309, ⁇ ⁇ 1 ⁇ , MIP-li3, RANTES, etc.), endothelin, enterogastrin, hismin, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide or galanin), as well as human
  • the ligand determination method of the present invention uses the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, or constructs an expression system for a recombinant receptor protein, and By using the receptor-binding Atsei system used, it binds to the receptor protein of the present invention and has a cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation) A compound having an activity of promoting or inhibiting inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc.
  • a cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation
  • the receptor protein of the present invention or its receptor is used.
  • the amount of the test compound bound to the receptor protein or the partial peptide, the cell stimulating activity, and the like are measured.
  • the present invention provides
  • the labeled test compound When the labeled test compound is brought into contact with a receptor protein expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor protein of the present invention, the labeled test compound A method for determining a ligand for a receptor protein of the present invention, which comprises measuring the amount of binding to a receptor protein or a salt thereof;
  • ⁇ Cell stimulating activity via receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, Activities that promote or suppress intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, decrease in pH, etc.
  • receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, Activities that promote or suppress intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, decrease in pH, etc.
  • receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, Activities that promote or suppress intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential
  • ⁇ ⁇ Via the receptor protein when the test compound is brought into contact with the receptor protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the receptor protein of the present invention, Cell stimulating activity (eg arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, Intracellular c GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, c-1: activation of fos, activity that promotes or suppresses pH reduction, etc.) And a method for determining a ligand for the receptor protein or a salt thereof of the present invention.
  • Cell stimulating activity eg arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, Intracellular c GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, c-1: activation of fos, activity that promotes
  • the receptor protein used in the method for determining a ligand may be any one containing the above-described receptor protein of the present invention or the partial peptide of the present invention.
  • Receptor Yuichi protein which is expressed in large amounts using E. coli, is suitable.
  • the above-mentioned expression method is used for producing the receptor protein of the present invention, but it is preferable to express the DNA encoding the receptor protein in mammalian cells or insect cells.
  • Complementary DNA is usually used as the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited to this.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • a nuclear polyhedrosis virus belonging to a baculovirus using the DNA fragment as an insect host is required.
  • NPV Nuclear polyhedrosis virus
  • SV40-derived promoter SV40-derived promoter
  • retrovirus promoter overnight, metamouth thionine promoter overnight, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SR alpha promoter, etc.
  • human heat shock promoter cytomegalovirus promoter
  • SR alpha promoter SR alpha promoter
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, it can be carried out according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992]. .
  • the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof may be a receptor protein or a partial peptide thereof or a purified peptide thereof according to a method known per se. Or a cell containing the receptor protein or a cell thereof.
  • the vesicle fraction may be used.
  • the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the receptor protein of the present invention refers to a host cell expressing the receptor protein of the present invention. Examples of the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like. Is used.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Waring Blender 100 Polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, pressing the cells while pressing with a French press, etc. This includes crushing caused by jetting from a narrow nozzle.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged (150 rpm to 30000 rpm). (000 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the receptor protein of the cells or during the membrane fraction containing the receptions evening over protein is preferably from 1 0 3 to 1 0 8 molecules per cell, which is the one 0 5-1 0 7 molecules Is preferred.
  • the receptor protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor fraction having an activity equivalent thereto.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action and the like.
  • the membrane fraction of a cell or a cell containing the receptor protein of the present invention is suitable for the determination method.
  • the buffer may be any buffer as long as it does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein, such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and a buffer of Tris monohydrochloride.
  • surfactants such as CHAP S, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate are used to buffer various proteins such as serum albumin and gelatin.
  • protease inhibitors such as PMS F, Leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and PeptiSutin may be added in order to suppress receptor degradation and ligand degradation by the protease. it can. 0. to 0 lm l to l the receptions evening over a solution of 0 ml, a certain amount (50 00 c pm ⁇ 500 0 00 c pm) of [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] A test compound labeled with, for example, is allowed to coexist.
  • Non-specific binding N Prepare a reaction tube containing a large excess of unlabeled test compound to determine SB).
  • the reaction is carried out at about 0 ° C. to 50 ° C., preferably about 4 ° C. to 37 ° C., for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the mixture is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radiation activity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or an oven.
  • a test compound having a count (B-NSB) of less than 0 cpm obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B) is used as a ligand (Ago2) for the receptor protein of the present invention or its salt. Strike).
  • the cell stimulating activity via the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2+ release, intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, etc. Or its inhibitory activity
  • the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2+ release, intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, etc. Or its inhibitory activity
  • the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2+ release, intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intra
  • the kit for determining a ligand that binds to the receptor protein of the present invention or a salt thereof includes the receptor protein of the present invention or a salt thereof, the partial peptide of the present invention or a salt thereof, and a cell containing the receptor protein of the present invention. Or a membrane fraction of cells containing the receptor protein of the present invention.
  • Examples of the ligand determination kit of the present invention include the following. 1. Reagent for ligand determination
  • It may be sterilized by filtration through a filter with a pore size of 0.45 ⁇ , and stored in 4 or may be prepared at use.
  • the receptions evening CHO cells expressing an protein of the present invention 12-well plates and passaged 5 10 5 Konoana, 37, 5% C0 2, followed by culturing for 2 days at 95% air.
  • Test compounds that are poorly soluble in water should be dissolved in dimethylformamide, DMS ⁇ , methanol, etc.
  • the same as the labeled compound is prepared at a concentration 100 to 1000 times higher.
  • ⁇ Measure radioactivity using a liquid scintillation counter (Beckman).
  • the ligand capable of binding to the receptor protein or a salt thereof of the present invention include, for example, substances specifically present in the brain, pituitary gland, ligament, and the like.
  • the receptor protein of the present invention or the receptor protein is encoded according to the action of the ligand.
  • DNA can be used as a medicament such as a preventive or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention may (A) administering the DNA encoding the receptor protein of the present invention to the patient and expressing it; or (mouth) producing the target cell. After inserting and expressing the DNA encoding the light receptor protein, the cells are By transplanting into the patient, the amount of receptor protein in the body of the patient can be increased, and the effect of the ligand can be sufficiently exerted. That is, DNA encoding the receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic agent for the prevention and / or treatment of diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention has about 30% homology at the amino acid sequence level to the type I receptor (ATI) of angiotensin II, a G protein-coupled receptor protein.
  • ATI has been reported to be associated with pathological conditions such as arteriosclerosis such as hypertension 'cardiac hypertrophy' [Japanese clinical study 56 No. 7 1906-191 1 (1998)]. Therefore, the receptor of the present invention, which is homologous to AT1, is useful for the prevention and / or treatment of cardiovascular diseases (eg, hypertension 'cardiac hypertrophy' arteriosclerosis, etc.).
  • AT 1-mediated effects include vasopressin ZLHZF SH secretion in the central nervous system-drinking water, salt preference, cerebral blood flow autoregulation, hypertrophy in the heart, enhancement of contraction, remodeling, aldosterone secretion from the adrenal cortex, adrenal medulla
  • catecholamine secretion promotes reabsorption of sodium in the proximal tubule in the kidney, contraction of efferent arterioles, and contraction and hypertrophy in blood vessels.
  • the receptor protein of the present invention which is homologous to ATI, is useful for the prevention and treatment of respiratory diseases, cardiovascular diseases, gastrointestinal diseases, liver / biliary / winning diseases, and endocrine diseases.
  • the receptor protein of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • DNA encoding the receptor protein of the present invention may be used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent
  • the DNA of the present invention may be used alone or as a retrovirus.
  • a suitable vector such as a vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with adjuvants for promoting uptake by a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • DNA can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., as needed, orally, or as a sterile solution in water or other pharmaceutically acceptable solutions, or as a suspension. It can be used parenterally in the form of injections, such as suspensions.
  • known carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. which are capable of physiologically accepting the receptor protein of the present invention or the DNA encoding the receptor protein of the present invention.
  • they can be manufactured by mixing them in the unit dose form required for the generally accepted formulation practice. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant e.g, polysorbate preparative 8 0 TM, HCO - 5 0
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, pro-proin hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, Human serum albumin, polyethylene glycol And preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonium chloride, pro-proin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, Human serum albumin, polyethylene glycol And preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (eg, rats, mice, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals eg, rats, mice, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the receptor protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a hypertensive patient (as 60 kg), About 0.1 mg / day: LO Omg, preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-2 Omg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, hypertensive patients (6 O kg)
  • the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration generally, for example, in a hypertensive patient (60 kg), It is about 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0-5 mg, more preferably about 1.0-2 mg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe to detect human or mammals (eg, rat, mouse, egret, sheep, bush, horse, cat, dog, dog, etc.).
  • DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof (gene abnormality) can be detected, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, Increase the DNA or mRNA! ] Or as a gene diagnostic agent for overexpression.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (11989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1 989)).
  • the DNA of the present invention can be used for screening a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the present invention relates to, for example, (i) a non-human mammal's (2) blood, (2) a specific organ, (3) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant of the present invention contained in a transformant or the like.
  • the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide is measured specifically as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerosis Drugs (eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.)
  • blood or specific organs eg, brain, liver, kidney, etc.
  • tissues or cells isolated from the organs are obtained.
  • the mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by a conventional method and using, for example, a technique such as TaqManPCR. It can also be analyzed by performing a Northern blot by a means known per se.
  • a transformant expressing the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is prepared according to the method described above, and the mRNA of the receptor protein of the present invention or the partial peptide thereof contained in the transformant is prepared. Quantification and analysis can be performed in the same manner.
  • Screening for a compound that alters the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention comprises:
  • test compound is administered simultaneously with the drug or physical stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 2 days) After 24 hours to 24 hours), it can be carried out by quantifying and analyzing the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cells,
  • test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium, and after culturing for a certain period of time (1 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 2 to 3 days) This can be performed by quantifying and analyzing the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the transformant.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention has an effect of changing the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein of the present invention.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of the receptor protein of the present invention or the like.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the above-described drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (eg, rats, mice, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals eg, rats, mice, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. About 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. k and ), About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day is administered by intravenous injection. It is convenient. For other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo such as central function. Therefore, the compound that alters the expression level of the receptor protein of the present invention or its partial peptide can be used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. .
  • the compound when used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
  • the compound can be used as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, if necessary, orally sterilized with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by doing. The amount of the active ingredient in these preparations is adjusted so that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • the sterile composition of the present invention can be formulated according to a conventional pharmaceutical preparation such as dissolving or suspending an active substance in a vehicle such as water for injection, or a naturally occurring vegetable oil such as sesame oil or coconut oil.
  • a aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • agents For example, alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate one DOO 80 TM, HCO- 50) including a combination You may.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants and the like examples of the prophylactic / therapeutic agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (eg, rats, mice, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals eg, rats, mice, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. It is about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. (as kg), it is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. .
  • the equivalent dose per 60 kg can be administered.
  • the quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competition method. That is, the ligand concentration in the test sample can be measured by bringing the test sample into contact with the receptor protein of the present invention. Specifically, for example, the method can be used according to the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
  • G protein coupled receptions evening through an cell-stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular C AM P generation, intracellular c
  • an cell-stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular C AM P generation, intracellular c
  • Ligand and G protein-coupled receptor of the present invention Compounds that enhance the binding force to Yuichi protein, or (2) compounds that decrease the binding force between ligand and G protein-coupled receptor Yuichi protein of the present invention, etc. Include (The compound of the above (I) is preferably screened by the ligand determination methods described above).
  • the present invention provides: (i) the receptor protein of the present invention or a part thereof; (Ii) a comparison between the case where the peptide or its salt was brought into contact with the ligand and the case where (ii) the receptor of the present invention or the partial peptide or its salt or its salt was brought into contact with the ligand or the test compound.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof, which alters the binding property between a ligand and the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of a ligand bound to the receptor protein, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • the present invention provides
  • the receptor of the labeled ligand is brought into contact with the receptor protein.
  • the labeled ligand and the test compound are combined with the DNA of the present invention.
  • the amount of the labeled ligand bound to the receptor protein or the like in the case of contacting with the receptor protein or the like of the present invention expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the is measured and compared.
  • a compound that activates the receptor protein of the present invention contains the receptor protein of the present invention.
  • a cell, tissue or cell membrane containing the G protein-coupled receptor receptor protein of a rat or the like is screened.
  • a test to confirm whether the candidate compound actually inhibits the binding of human G protein-coupled receptor protein to the ligand was required. If the cell, tissue, or cell membrane fraction is used as it is, other receptor proteins are also mixed, so it was difficult to actually screen for an agonist or an antagonist for the target receptor protein.
  • the use of the human receptor protein of the present invention eliminates the need for primary screening and efficiently screens compounds that inhibit the binding of ligand to G protein-coupled receptor protein. can do. Further, it is possible to easily evaluate whether the compound screened is an agonist or an engonist.
  • the receptor protein of the present invention used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the above-described receptor protein of the present invention.
  • Cell membrane fractions of mammalian organs containing the receptor protein of the invention and the like are preferred.
  • human-derived receptor proteins and the like which are expressed in large amounts using recombinants, are suitable for screening.
  • the method described above is used for producing the receptor protein of the present invention and the like, but it is preferable to express the DNA of the present invention in mammalian cells and insect cells.
  • the complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited to this.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment In order to introduce a DNA fragment encoding the receptor protein of the present invention into host animal cells and to express them efficiently, the DNA fragment must be expressed in a nuclear polyhedrosis virus belonging to baculovirus using an insect as a host.
  • nh l polyhedros is vi rus; NPV) polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metamouth thionine promoter 1, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, It is preferably incorporated downstream, such as the SR ⁇ promoter.
  • the quantity and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the method is carried out according to the method described in the literature [Namb i, P., et al., The 'Journal of Ob' Biological Chemistry, 267, 19555-19559, 1992]. be able to.
  • the receptor protein or the like of the present invention may be a receptor protein or the like purified according to a method known per se, or the receptor protein or the like.
  • a membrane fraction of cells containing the receptor protein or the like may be used.
  • the cell when a cell containing the receptor protein of the present invention or the like is used, the cell may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the receptor protein or the like of the present invention refers to a host cell that has expressed the receptor protein or the like, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, or the like.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • the cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Warlinda Blender 100 Polytron (manufactured by Kinematica), crushing by ultrasonic waves, or thinning the cells while applying pressure with a French press. Crushing by jetting from a nozzle is one example.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a higher speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes. Centrifuge for ⁇ 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction contains a large amount of expressed receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of receptor protein in cells or membrane fractions containing the receptor protein or the like is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. It is. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction. Become.
  • receptor protein fraction a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto is desirable.
  • equivalent activity means equivalent ligand binding activity, signal transduction action, etc. Is shown.
  • labeled ligand a labeled ligand, a labeled ligand analog compound, or the like is used.
  • ligands labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and the like are used.
  • a cell containing the receptor protein or the like of the present invention or a membrane of the cell is used.
  • Prepare a receptor protein sample by suspending the fraction in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the binding of the ligand to the receptor protein, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and deoxycholate can be added to the buffer for the purpose of reducing non-specific binding.
  • protease inhibitors such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and pepstatin can be added to suppress receptor degradation by proteases and degradation of ligands. . 0. 0 lm 1 ⁇ ; to the receptions evening first solution of 10 m 1, a certain amount (! 50 00 c ⁇ ⁇ 5 OOOOO cm) labeled added ligand, test simultaneously 10 one 4 M ⁇ 10- 1Q M Coexist with compounds. Prepare a reaction tube containing a large excess of unlabeled ligand to determine the amount of non-specific binding (NSB).
  • NBS non-specific binding
  • the reaction is carried out at about 0 to 50 ° C, preferably at about 4 ° C to 37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or an arc counter.
  • the count (B.-NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count when no antagonist is present (B 0 ) is 100%
  • the specific binding amount (B—NSB) ifi For example, a test compound having 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • Cell stimulating activity through protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorus Oxidation, activation of c-fos, activity of promoting or suppressing pH reduction, etc.
  • protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorus Oxidation, activation of c-fos, activity of promoting or suppressing pH reduction, etc.
  • protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorus
  • cells containing the receptor protein or the like of the present invention are cultured on a multiwell plate or the like. Before performing screening, replace the cells with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add the test compound, etc., incubate for a certain period of time, and then extract the cells or collect the supernatant.
  • the products generated are quantified according to the respective method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of the cell stimulating activity is difficult to be assayed by a degrading enzyme contained in the cells, an assay may be performed by adding an inhibitor for the degrading enzyme. . In addition, activities such as inhibition of cAMP production can be detected for inhibiting production of cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • cells expressing an appropriate receptor protein are required.
  • the cells expressing the receptor protein of the present invention and the like a cell line having the natural receptor protein of the present invention and the like and the cell line expressing the above-mentioned recombinant receptor protein and the like are preferable. .
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property of the ligand to the receptor protein of the present invention or the like includes cells containing the receptor protein of the present invention, the receptor protein of the present invention, or the like. And those containing the membrane fraction of cells containing the receptor protein of the invention.
  • screening kit of the present invention examples include the following. 1. Screening reagent 1Measurement buffer and washing buffer
  • CH ⁇ cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 holes, and cultured for 2 days at 37, 5% C 2 and 95% air.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention or the like.
  • cell stimulating activities via G protein-coupled receptors eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular CAMP generation, intracellular cGMP generation, A compound having an activity of promoting or suppressing cytosolic phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, decrease in pH, etc.
  • the so-called receptor protein of the present invention Agonists
  • mouth compounds having no such cell stimulating activity (so-called antagonists for the receptor protein of the present invention)
  • a compound that enhances the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention or (2) a compound that decreases the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention. is there.
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the agonist against the receptor protein or the like of the present invention has the same activity as the physiological activity of the ligand for the receptor protein or the like of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug according to the ligand activity. It is.
  • Antagonists against the receptor protein and the like of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand for the receptor protein and the like of the present invention, and thus are useful as safe and low-toxic drugs for suppressing the ligand activity.
  • the compound that enhances the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention has a physiological activity possessed by the ligand for the receptor protein or the like of the present invention. It is useful as a safe and low toxic drug for potentiation.
  • Compounds that decrease the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention are safe and low-toxic drugs for reducing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention and the like. Useful.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be carried out in a conventional manner.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (eg, rats, mice, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals eg, rats, mice, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a hypertensive patient (as 60 kg), About 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. (as kg), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. .
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (argonist, angonist) which changes the binding property between the G protein-coupled receptor protein and the ligand of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo such as central function. Therefore, the compound (agonist, antagonist) of the present invention that alters the binding between the receptor protein and a ligand can be used to prevent and / or prevent diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. Or it can be used as a therapeutic agent.
  • the compound when used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
  • the compound can be used as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, if necessary, orally sterilized with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. By doing so, it can be manufactured. The amount of the active ingredient in these preparations is adjusted so that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • a swelling agent such as sucrose, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and the like are used.
  • solubilizing agents For example, alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate one preparative 8 0 TM, HCO- 5 0) You may use together with.
  • alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, polysorbate one preparative 8 0 TM, HCO- 5 0
  • solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (eg, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pests, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals eg, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pests, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a hypertensive patient (as 60 kg), About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein or the like of the present invention, it can be used for quantification of the receptor protein or the like of the present invention in a test wave, particularly for quantification by sandwich immunoassay. it can. That is, the present invention provides, for example, (() an antibody of the present invention, a test solution and a labeled receptor protein, etc., are competitively reacted with each other, and the labeled receptor protein, etc., bound to the antibody; A method for quantifying the receptor protein or the like of the present invention in a test wave, comprising measuring the ratio.
  • one of the antibodies is an antibody that recognizes the N-terminal of the receptor protein of the present invention or the like, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the receptor protein or the like of the present invention. Is preferred.
  • the monoclonal antibody of the present invention In addition to measuring the receptor protein of the present invention using a monoclonal antibody against the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), detection by tissue staining or the like is also possible. It can.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the assay method using an antibody against the receptor protein or the like of the present invention is not particularly limited. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferred.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used, and a chemical bond usually used to insolubilize and immobilize proteins or enzymes is used. It may be a method.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cell mouth, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass are used.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction the labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, simultaneously, or at an interval.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having different binding sites for the receptor protein and the like.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the receptor protein, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephelometry method.
  • a competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody. Then (BZF separation), measure the labeling amount of either B or F, and determine the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is carried out using polyethylene glycol
  • a second antibody against the above antibody a liquid phase method
  • an immobilized antibody is used as the first antibody.
  • An immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody and a soluble antibody is used for the first antibody.
  • the antigen in the test wave and the immobilized antigen are labeled with a certain amount.
  • the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is reacted with an excessive amount of the labeled antibody.
  • the solid and liquid phases are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser-nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity.
  • the dysfunction of the receptor protein of the present invention can be determined. Diagnosis of various related diseases can be made.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting the receptor protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the receptor protein of the present invention, etc., detection of the receptor protein of the present invention in each fraction at the time of purification, and detection of the present invention in the test cells It can be used for analysis of the behavior of the receptor protein.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, the antibody of the present invention may be a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane. Can be used for screening.
  • Transformation expressing the receptor protein of the present invention or its partial peptide After the transformants and the like are sectioned, the degree of staining of the receptor protein on the cell surface is quantified by using an immunostaining method, thereby confirming the protein on the cell membrane. And a method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the quantitative determination of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
  • non-human mammals for example, mice, rats, egrets, higgs, bushus, horses, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, Drugs (eg, anti-dementia drugs, anti-hypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.)
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, anti-hypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • the obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.) to destroy the organ, tissue or cell
  • an appropriate buffer for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.
  • a cell membrane fraction is obtained by using a surfactant (for example, Triton X100 TM , Tween 20 TM, etc.) and further using a technique such as centrifugation, filtration, or column fractionation.
  • a surfactant for example, Triton X100 TM , Tween 20 TM, etc.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cell crushing methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Ring Blender ⁇ ⁇ Polytron (manufactured by Kinematica), crushing with ultrasonic waves, and thinning cells while applying pressure with a French press. Crushing by jetting from a nozzle is one example.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a higher speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes. Centrifuge for ⁇ 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction contains a large amount of expressed receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the receptor protein of the present invention contained in the cell membrane fraction or a partial peptide thereof can be quantified by a sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
  • Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western blot can be performed by a means known per se.
  • a transformant expressing the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is prepared according to the method described above, and the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction can be quantified.
  • a given time before drug or physical stress is given to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, Preferably 1 hour to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or drug or physical
  • the test compound is administered at the same time as the stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), It can be performed by quantifying the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide,
  • test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium, and after culturing for a certain period of time (1 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 2 to 3 days) After a day), it can be carried out by quantifying the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane.
  • the confirmation of the protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is specifically carried out as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, sheep, sheep, bush, horses, cats, dogs, monkeys, etc .; more specifically, dementia rats, obese mice, arteries, etc.
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • blood or specific organs eg, brain, liver, kidney, etc.
  • tissues or cells isolated from the organs are obtained.
  • the obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostained using the antibody of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention or its portion in the cell membrane can be quantitatively or qualitatively determined. The amount of the peptide can be confirmed.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in a cell membrane.
  • the cell stimulating activity via G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C Promotes a2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, decrease in pH, etc.
  • G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C Promotes a2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, decrease in pH, etc.
  • Mouth reducing
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein of the present invention or the like.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of the receptor protein of the present invention or the like.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • Tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in human mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, sheep, bush, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals eg, rats, mice, rabbits, sheep, sheep, bush, horses, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a hypertensive patient (as 60 kg), About 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. 0 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 mg per day is administered by intravenous injection. It is convenient to do so.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo, such as central function. Therefore, a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane can be used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the compound when used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
  • the compound can be used as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, if necessary, orally coated with sugar, or sterile with water or other pharmaceutically acceptable liquids.
  • injectable form such as solution or suspension Can be used parenterally.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by doing. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene glycol - le, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant e.g, polysorbate preparative 8 0 TM, HC_ ⁇ - 5 0
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants and the like examples of the prophylactic / therapeutic agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and It can be administered to dairy animals (for example, rats, mice, egrets, sheep, sheep, bush, birds, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • dairy animals for example, rats, mice, egrets, sheep, sheep, bush, birds, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a hypertensive patient (as 60 kg), About 0 per day. 1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. (as kg), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. .
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the neutralizing activity of the antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof against the receptor protein or the like refers to the activity of inactivating the signal transduction function involving the receptor protein.
  • signal transmission involving the receptor protein for example, cell stimulating activity via the receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular release) Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, pH reduction, etc. Activity, etc.) can be inactivated. Therefore, it can be used for prevention and / or treatment of diseases caused by overexpression of the receptor protein.
  • transgenic animals expressing the receptor protein of the present invention and the like can be prepared.
  • Animals include mammals (eg, Rats, mice, egrets, sheep, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc. (hereinafter sometimes abbreviated as animals), and the like, with mice, and egrets being particularly preferred. .
  • the DNA of the present invention In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells.
  • a gene construct linked to the downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention derived from an animal having high homology with animal cells in an animal cell is used.
  • a DNA-transferred animal that highly produces the Receptor Yuichi protein or the like of the present invention can be produced by microinjection into a fertilized egg of a heron.
  • a ubiquitous expression promoter such as a virus-derived promoter or meta-mouth thionein can be used, but preferably, the NGF gene is specifically expressed in the brain.
  • a promoter or the like is used.
  • Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of the receptor protein of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the receptor protein or the like of the present invention in all of the germ cells and somatic cells. I do.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the gene has the receptor protein of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal of the present invention After confirming that the DNA-transferred animal of the present invention stably retains the gene by crossing, it can be reared and passaged in a normal rearing environment as the DNA-bearing animal. Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, a homozygous animal having the transgene on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing the male and female animals, all progeny have the DNA. They can be bred to subculture.
  • the animal into which the DNA of the present invention has been transferred expresses the receptor protein of the present invention at a high level, it is useful as an animal for screening an agonist or an gonist against the receptor protein of the present invention. It is.
  • the DNA transgenic animal of the present invention may be used as a cell source for tissue culture. it can. For example, by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA transgenic mouse of the present invention, or by analyzing the tissue in which the receptor protein of the present invention expressed by a gene is present, the receptor of the present invention is analyzed. One protein can be analyzed.
  • the cells of a tissue having the receptor protein of the present invention and the like are cultured by standard tissue culture techniques, and the functions of the cells from tissues that are generally difficult to culture, such as those derived from the brain or peripheral tissues, are used. Can study.
  • a drug that enhances the function of various tissues can be selected.
  • the receptor protein of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art.
  • amino acids may have optical isomers, L-form shall be indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • Trt Trityl
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of a novel G protein-coupled receptor protein rOT7T009C derived from the rat brain stem periphery of the present invention.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of a novel G protein-coupled receptor protein rOT7TO09T derived from the rat brain stem periphery of the present invention.
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein r ⁇ 7 ⁇ 009 C derived from the rat brain stem region of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. [SEQ ID NO: 4]
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein ⁇ T7T009T derived from the rat brain stem peripheral region of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • primer 11 used for cloning cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein rOT7T009C and r ⁇ T7 ⁇ 009 ⁇ derived from the rat brain stem periphery of the present invention Show.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of primer 2 used for cloning cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor proteins rOTT7T009C and rOT7T009T derived from the rat brain stem periphery of the present invention.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of a novel fetal G protein-coupled receptor protein h ⁇ T 7 ⁇ 010 derived from human fetal brain of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the novel human fetal brain-derived G protein-coupled receptor protein h ⁇ T7T009 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of primer 13 used to clone cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein hOT7T009 derived from human fetal brain of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of primer 14 used for cloning cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein hOT7T009 derived from human fetal brain of the present invention.
  • Novel G protein-coupled receptor Yuichi protein hOT 7T0 derived from human fetal brain of the present invention
  • the base sequence of primer 15 used for cloning the cDNA encoding 09 is shown.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of primer 6 used for cloning cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein h ⁇ T7TO09 derived from human fetal brain of the present invention.
  • the transformant Escherichia colODHlOB / pAK-rOTO09C obtained in Example 1 described below has been used since October 19, 2001 by the Ministry of International Trade and Industry of Deposited with the National Institute of Fermentation (NI BH) under the deposit number FERM BP-6505 and deposited with the 'Fermentation Research Institute (IFO) as the deposit number IFO 166 08 from October 01, 1999. ing.
  • NI BH National Institute of Fermentation
  • IFO 'Fermentation Research Institute
  • the transformant Escherichia coli DH 10 BZpAK—h ⁇ T 009 obtained in Example 2 described below has been used for the purpose of Deposit No. FERM B P-6610 at the National Institute of Advanced Industrial Science (NI BH), and Deposit No. IF ⁇ 1623 from the Fermentation Research Institute (IFO) from February 07, 2007 Has been deposited.
  • NI BH National Institute of Advanced Industrial Science
  • IFO Fermentation Research Institute
  • the rat brainstem peripheral brainstem peripheral cDNA was designated as type I, and PCR reaction was performed using two primers, primer 1 (SEQ ID NO: 5) and primer 2 (SEQ ID NO: 6).
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was as follows: 1/10 of the above cDNA was used as type III, 1/50 of Advan tagec DNA Polymerase Mix (CLONTECH), and primer 1 ( SEQ ID NO: 5) and Primer 2 (SEQ ID NO: 6) were each added to 0.2 M, dNTPs 200 uM, and the enzyme with the attached buffer to give a solution volume of 501.
  • the PCR reaction is 1 94.
  • Plasmid pAK-rOT009C obtained by subcloning cDNA (SEQ ID NO: 3) encoding a G protein-coupled receptor protein ⁇ T7T009C derived from the rat brainstem periphery and brainstem periphery of the present invention, It was introduced into Escherichiacoli DH10B according to a method known per se to obtain a transformant: Escherichia coli DH10B / pAK-r ⁇ T009C.
  • Example 2 Cloning and Nucleotide Sequence Determination of cDNA of h ⁇ T7T009, a Novel G Protein-Coupled Receptor from Human Fetal Brain
  • a PCR reaction was performed using two primers, Primer 3 (SEQ ID NO: 9) and Primer 4 (SEQ ID NO: 10).
  • the composition of the reaction solution was prepared by using 1/25 of the above-mentioned cDNA as a rust, 1V50 of AdVantagec DNAPo1ymerase Mix (CLONTECH), primer 3 (SEQ ID NO: 9).
  • Primer-4 SEQ ID NO: 10 were added to 0.2 iM each, dNTPs200M, and the buffer attached to the enzyme to give a liquid volume of 251.
  • the PCR reaction was performed after 1 94: 2 minutes, 2 94 ° C for 20 seconds, 70 ° C for 2 minutes. 3 cycles, 3 94 ° C ⁇ 20 seconds, 66 ° C '20 seconds, 68 ° C ⁇ 2 minutes 3 times, 4 94 ⁇ 20 seconds, 62 ° C ⁇ 20 seconds, 68 ⁇ 2 minutes This cycle was repeated 32 times, and finally, an extension reaction was performed at 68 ° C for 7 minutes.
  • the reaction product after the PCR reaction was subcloned into a plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen) according to the prescription of a TA cloning kit (Invitrogen).
  • a plasmid was purified from the above clones in accordance with a method known per se, and the resulting plasmid was subjected to PCR using two primers, primer 5 (SEQ ID NO: 11) and primer 6 (SEQ ID NO: 12) Was done. About 100 pg of the above-mentioned plasmid was used as a type II in the reaction solution for the reaction. Advant age cDNA DNA Polymerase Mix (CLONTECH) 1Z50 amount, primer 1 (SEQ ID NO: 9) and primer 4 (SEQ ID NO: 10) was added to each of 0.2 M, dNTPs 200 M, and the enzyme with the attached buffer to give a solution volume of 25 p.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, and the polynucleotide encoding the receptor protein or its partial peptide include the following: (1) a ligand (agonist); Decision, 2 acquisition of antibodies and antisera, 3 construction of a recombinant receptor protein expression system, ⁇ ⁇ development of a receptor receptor-binding Atsushi system using the same expression system and screening of drug candidate compounds, 5 structural Implementation of drug design based on comparison with ligands and receptors, ⁇ ⁇ Reagents for the preparation of probes and PCR primers in gene diagnosis, 7 Preparation of transgenic animals or ⁇ ⁇ Gene prevention, therapeutic agents, etc. It can be used as a medicine or the like.

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Description

明細書 新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質およびその D N A 技術分野
本発明は、 ラッ卜脳幹周辺部由来およびヒ卜胎児由来の新規 G蛋白質共役型 レセプター蛋白質またはその塩およびそれをコードする D N Aに関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、 細胞膜に存在する特 異的なレセプ夕一蛋白質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプ ター蛋白質のうち多くは共役している guani ne nuc l eo t i de-b i nd i ng pro te i n (以 下、 G蛋白質と略称する場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達 を行ない、 また 7個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質あるいは 7回膜貫通型レセプ夕一蛋白質 （7 TM R ) と総称される。
G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存 在し、 それら細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えばホルモン、 神経伝達物 質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。 レセ プ夕一は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、 このシグ ナルにより細胞の賦活ゃ抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセ プタ一蛋白質、 特には G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との関係を明らかにす ることは、 各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、 それら機能と密接に関連し た医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
例えば、 生体の種々の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝 達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわ れている。 特に、 生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、 それぞれに対 応するレセプ夕一蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。 生体内に は未だ未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、 それらの レセプター蛋白質の構造に関しても、 これまで報告されていないものが多い。 さらに、 既知のレセプター蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかに ついても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ夕一蛋白質と の関係を明らかにすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レセプター蛋白質に対するァゴニスト、 アン夕ゴニス卜を効率よくスクリー二 ングし、 医薬品を開発するためには、 生体内で発現しているレセプ夕一蛋白質 の遺伝子の機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要であ つた。
近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 C D N Aの配列 をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c D N Aの断片配列が Expressed Sequence Tag ( E S T) としてデ一夕ベース に登録され、 公開されている。 しかし、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 その機能を推定することは困難である。
従来、 G蛋白質共役型レセプ夕一と生理活性物質 （即ち、 リガンド） との結 合を阻害する物質や、 結合して生理活性物質 （即ち、 リガンド） と同様なシグ ナル伝達を引き起こす物質は、 これらレセプ夕一の特異的なアン夕ゴニストま たはァゴニストとして、 生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。 従 つて、 このように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、 医薬 品開発の標的ともなりうる G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を新規に見出し、 その遺伝子 （例えば c D N A) をクローニングすることは、 新規 G蛋白質共役 型レセプ夕一蛋白質の特異的リガンドゃ、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストを見出 す際に、 非常に重要な手段となる。
しかし、 G蛋白質共役型レセプ夕一はその全てが見出されているわけではな く、 現時点でもなお、 未知の G蛋白質共役型レセプ夕一、 また対応するリガン ドが同定されていない、 いわゆるォーファンレセプ夕一が多数存在しており、 新たな G蛋白質共役型レセプターの探索および機能解明が切望されている。
G蛋白質共役型レセプ夕一は、 そのシグナル伝達作用を指標とする、 新たな 生理活性物質 （即ち、 リガンド） の探索、 また該レセプターに対するァゴニス トまたはアン夕ゴニスト） の探索に有用である。 一方、 生理的なリガンドが見 出されなくても、 該レセプ夕一の不活化実験 （ノックアウト動物） から該レセ プターの生理作用を解析することにより、 該レセプ夕一に対するァゴニストま たはアンタゴニストを作製することも可能である。 これら該レセプターに対す るリガンド、 ァゴニストまたはアン夕ゴニストなどは、 G蛋白質共役型レセプ 夕一の機能不全に関連する疾患の予防 Z治療薬や診断薬として活用することが 期待できる。
さらにまた、 G蛋白質共役型レセプ夕一の遺伝子変異に基づく、 生体での該 レセプターの機能の低下または昂進が、 何らかの疾患の原因となっている場合 も多い。 この場合には、 該レセプタ一に対するアン夕ゴニストやァゴニストの 投与だけでなく、 該レセプ夕ー遺伝子の生体内 （またはある特定の臓器） への 導入や、 該レセプタ一遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、 遺伝子 治療に応用することもできる。 この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子 上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、 該レセプ夕ー の遺伝子は、 該レセプ夕一の機能不全に関与する疾患の予防/治療薬や診断薬 に応用することもできる。 発明の開示
本発明は、 上記のように有用な新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を提供 するものである。 即ち、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその部分 ペプチドをコードするポリヌクレオチド （D NA、 R N Aおよびそれらの誘導 体） を含有するポリヌクレオチド （D N A、 R N Aおよびそれらの誘導体） 、 該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、 該組換えベクターを保持する 形質転換体、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩の製造法、 該 G 蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体、 該 G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一に対するリガンドの決定方法、 リガンドと該 G蛋白 質共役型レセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） またはその塩のスクリーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて得られうるリガ ンドと該 G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物 （ァ ン夕ゴ二スト、 ァゴニスト） またはその塩、 およびリガンドと該 G蛋白質共役 型レセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アンタゴニス卜、 ァゴニ スト） もしくは該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合 物またはその塩を含有してなる医薬などを提供する。
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 degenerated PCR法によって作成した EST情報に基づいて、 ラット脳幹周辺部およびヒト胎児由来の新規な G蛋白 質共役型レセプター蛋白質をコードする c DNAを単離し、 その全塩基配列を 解析することに成功した。 そして、 この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したと ころ、 第 1〜第 7膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、 これらの cDN Aにコードされる蛋白質が 7回膜貫通型の G蛋白質共役型レセプター蛋白質で あることを確認した。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに研究を 重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有することを特徴とする G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質ま たはその塩、
(2) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 が配列番号： 2または配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列である上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
(3) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の部分ペプチドまた はその塩、
(4) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする塩基配 列を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5) DNAである上記 （4) 記載のポリヌクレオチド、
(6) 配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 8で表される塩基配列を 有する上記 （4) 記載のポリヌクレオチド、
(7) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一、
(8) 上記 （7) 記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
(9) 上記 （8) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役 型レセプ夕一蛋白質を生成せしめることを特徴とする上記 （1) 記載の G蛋白 質共役型レセプター蛋白質またはその塩の製造法、
(10) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分べプチドまたはその塩に対する抗体、
(11) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達を 不活性化する中和抗体である上記 （10) 記載の抗体、
(12) 上記 （10) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(13) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることにより得られうる上記 （1) 記 載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンド、
(14) 上記 （13) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一のリガンドを含有して なる医薬、
(15) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記載 の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
(16) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 リガンドと上記
(1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(17) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 リガンドと上 記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(18) 上記 （16) 記載のスクリーニング方法または上記 （17) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋 b 白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物また はその塩、
(19) 上記 （16) 記載のスクリーニング方法または上記 （17) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋 白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物また はその塩を含有してなる医薬、
(20) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェン卜な条件下 でハイブリダィズするポリヌクレオチド、
(21) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一 部を含有してなるポリヌクレオチド、
(22) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特 徵とする上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の mRNAの定量 方法、
(23) 上記 （10) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の定量方法、
(24) 上記 （22) または上記 （23) 記載の定量方法を用いることを特徴 とする上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診 断剤、
(25) 上記 （22) 記載の定量方法を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、
(26) 上記 （23) 記載の定量方法を用いることを特徴とする、 細胞膜にお ける上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質量を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング方法、
(27)上記（25)記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、上記（1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはそ の塩、
(28) 上記 （26) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 細胞膜 における上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる化 合物またはその塩に関する。
さらには、
(29) 蛋白質が、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列、 配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程 度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のァ ミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜 10個 程度、 さらに好ましくは数個 （1~5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配 列、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 個 （1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 また は④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質である上記 （1) 記 載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩、
(30) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその塩ま たは上記 (3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触さ せることを特徴とする上記 （15) 記載のリガンドの決定方法、
(31) リガンドが例えばアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コ レシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチ ン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GH RH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテ スティナル ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミ リン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび ]3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GR〇a、 GR〇 3、 GR〇了、 NAP— 2、 ENA— 78、 P F 4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP—3、 1— 309、 MI P Iひ、 MI P— l i3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガ ストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリ ぺプタイドまたはガラニンである上記 （30) 記載のリガンドの決定方法、
(32) ( i) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはそ の塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドとを接 触させた場合と、 （ii) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質も しくはその塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガン ドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上 記 （16) 記載のスクリーニング方法、
(33) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ 一蛋白質もしくはその塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩 に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または上記 （3) 記載 の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識したリガンド の上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその塩または上 記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、 比較す ることを特徵とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋 白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ方法、
(34) ( i ) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕 —蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび 試験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細 胞に接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞に対する結合量を測 定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型 レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング方法、
( 35) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ 一蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガン ドおよび試験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質を含 有する細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞の 膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 (1 ) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
(3 6) ( i ) 標識したリガンドを上記 （8) 記載の形質転換体を培養するこ とによって該形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質 に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （8) 記載の形質耘換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に接触させた場合における、 標識したリガンド の該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対する結合量を測定し、 比較すること を特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質ま たはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(3 7) ( i ) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその 塩を活性化する化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を 含有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レ セプター蛋白質またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上記（ 1 ) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細胞に接触させた場合にお ける、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、 比較 することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二 ング方法、
( 3 8 ) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を活 性化する化合物を上記 （8) 記載の形質転換体を培養することによって該形質 転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合 と、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を活性化 する化合物および試験化合物を上記 （8) 記載の形質転換体を培養することに よって該形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質に接 触させた場合における、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を介する細胞刺激活 性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質 共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、 (39) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を活性化する化合 物が、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グ ル夕ミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリ ン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシ卜ニン、 アドレノメジュリン、 ソマトスタチン、 GHRH、 CRF、 A CTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル ポリ ペプチド） 、 ソマトスタチン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニ ン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリエ ン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび /3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 G ROひ、 GRO 3、 GROァ、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP - 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 1—309、 M I P 1ひ、 MI P— 1 /3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒ ス夕ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドま たはガラニンである上記 （37) または （38) 記載のスクリーニング方法、
(40) 上記 （32) 〜 （39) 記載のスクリーニング方法で得られうる、 リ ガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩、
(41) 上記 （32) 〜上記 （39) 記載のスクリーニング方法で得られうる、 リガンドと上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(42) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細胞を 含有することを特徴とする上記 （17) 記載のスクリーニング用キット、
(43) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の 膜画分を含有することを特徴とする上記 （17) 記載のスクリーニング用キッ K
(44) 上記 （8) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の 細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有することを特徴とす る上記 （17) 記載のスクリーニング用キット、 (45) 上記 （42) 〜 （44) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(46) 上記 （42) 〜 （44) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とす る医薬、
(47) 上記 （10) 記載の抗体と、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ ター蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを接触させ ることを特徴とする上記 （1) の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上 記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、
(48) 上記 （10) 記載の抗体と、 被検波および標識化された上記 （1) 記 載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチド またはその塩とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分べプチ ドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする被検波中の上記 （1) 記載 の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドま たはその塩の定量法、 および
(49) 被検液と担体上に不溶化した上記 （10) 記載の抗体および標識化さ れた上記 （10) 記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶 化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記 （1) 記 載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチド またはその塩の定量法などを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で得られた本発明のラット脳幹周辺部由来新規 G蛋白質共役 型レセプター蛋白質 r OT 7 T 009 Cをコードする DN Aの塩基配列、 およ びそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 2に続く） 。
図 2は実施例 1で得られた本発明のラッ卜脳幹周辺部由来 G蛋白質共役型レ セプター蛋白質 r OT 7 T 009 Cをコードする DN Αの塩基配列、 およびそ れから推定されるアミノ酸配列を示す （図 1の続き、 図 3に続く） 。
図 3は実施例 1で得られた本発明のラット脳幹周辺部由来 G蛋白質共役型レ セプター蛋白質 r〇T 7 T 009 Cをコ一ドする DN Aの塩基配列、 およびそ れから推定されるアミノ酸配列を示す （図 2の続き、 図 4に続く） 。
図 4は実施例 1で得られた本発明のラット脳幹周辺部由来 G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質 r OT7T 009 Cをコードする DNAの塩基配列、 およびそ れから推定されるアミノ酸配列を示す （図 3の続き） 。
図 5は実施例 1で得られた本発明のラット脳幹周辺部由来 G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質！ ·〇T 7 T 009 Tをコードする DNAの塩基配列、 およびそ れから推定されるアミノ酸配列を示す （図 6に続く） 。
図 6は実施例 1で得られた本発明のラット脳幹周辺部由来 G蛋白質共役型レ セプタ一蛋白質 r ΟΤ 7 Τ 009 Tをコ一ドする DN Aの塩基配列、 およびそ れから推定されるアミノ酸配列を示す （図 5の続き、 図 7に続く） 。
図 7は実施例 1で得られた本発明のラット脳幹周辺部由来 G蛋白質共役型レ セプター蛋白質 r〇T 7 T 009 Τをコードする DNAの塩基配列、 およびそ れから推定されるアミノ酸配列を示す （図 6の続き、 図 8に続く） 。
図 8は実施例 1で得られた本発明のラット脳幹周辺部由来 G蛋白質共役型レ セプター蛋白質 rOT 7 TO 09 Tをコードする DNAの塩基配列、 およびそ れから推定されるアミノ酸配列を示す （図 7の続き） 。
図 9は図 1〜図 8に示したアミノ酸配列をもとに作成した、 本発明のラット 脳幹周辺部由来 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 rOT7 TO 09 Cおよび r 〇 T 7 T 009 Τの疎水性プロットを示す。
図 10は実施例 2で得られた本発明のヒト胎児由来新規 G蛋白質共役型レセ プタ一蛋白質 h〇T7T 009をコードする DNAの塩基配列、 およびそれか ら推定されるアミノ酸配列を示す （図 1 1に続く） 。
図 1 1は実施例 2で得られた本発明のヒ卜胎児由来新規 G蛋白質共役型レセ プター蛋白質 hOT7T 009をコードする DNAの塩基配列、 およびそれか ら推定されるアミノ酸配列を示す （図 10の続き、 図 12に続く） 。 1 図 1 2は実施例 2で得られた本発明のヒト胎児由来新規 G蛋白質共役型レセ プター蛋白質 h O T 7 T 0 0 9をコ一ドする D N Aの塩基配列、 およびそれか ら推定されるアミノ酸配列を示す （図 1 1の続き） 。
図 1 3は図 1 0〜図 1 2に示したアミノ酸配列をもとに作成した、 本発明の ヒト胎児由来 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h O T 7 T O 0 9の疎水性プロ ットを示 ^"。 発明の実施をするための最良の形態
本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （以下、 レセプ夕一蛋白質と略記 する場合がある） は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 （図 1〜図 4中 のアミノ酸配列） と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 （例えば、 配列 番号： 2で表わされるアミノ酸配列 （図 5〜図 8中のアミノ酸配列） または配 列番号： 7で表わされるアミノ酸配列 （図 1 0〜図 1 2中のアミノ酸配列） 等） を含有するレセプ夕一蛋白質である。
本発明のレセプター蛋白質は、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モルモッ ト、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細 胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 滕臓 細胞、 骨髄細胞、 メサン ギゥム細胞、 ランゲル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細 胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細 胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞 など） や血球系の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視 床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳 染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に、 脳や脳の各部位） に由来するタンパク質であつ てもよく、 また合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 7 0 %以上、より好ましくは約 8 0 %以上、さらに好ましくは約 9 0 % 以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げ られ、 具体的には、 配列番号： 2または配列番号： 7で表されるアミノ酸配列 などがあげられる。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝 達作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質で あることを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用など の活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 よ り好ましくは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度 やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の 方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後述するリガンドの決定方法や スクリ一二ング方法に従つて測定することができる。
また、 本発明のレセプ夕一蛋白質としては、 ①配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好まし くは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失 したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに 好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番 号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、より好ましくは 1〜1 0個程度、さらに好ましくは数個（1〜5個）） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み 合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本明細書におけるレセプ夕一蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が Ν末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質をはじめとする、 本 発明のレセプ夕一タンパク質は、 C末端が通常力ルポキシル基 （一 C〇〇H) またはカルボキシレート（一 C O O_)であるカ^ C末端がアミド（― C〇NH 2) またはエステル （—C〇〇R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの C i _ 6アルキル基、 例えば、 シクロ ペンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ—ナフチルなどの C 6 _ 1 2ァリ一ル基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどの フエニル一 2アルキル基もしくは 一ナフチルメチルなどのひ一ナフチル — C ^ zアルキル基などの C 7 _ 1 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして 汎用されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のレセプター蛋白質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルボキ シレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化さ れているものも本発明のレセプター蛋白質に含まれる。 この場合のエステルと しては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のレセプ夕一タンパク質には、 上記したタンパク質において、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル などの C 2 _ 6アルカノィル基などの C i _ 6ァシル基など）で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成じたグル夕ミル基がピ口ダル夕ミン酸化したも の、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一 OH、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2_ 6アルカノィル基などの ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの 複合タンパク質なども含まれる。
本発明のレセプター蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わ されるアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質、 配列番号： 2で表わされる 1 _ アミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質、 配列番号： 7で表わされるァミノ 酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質などが用いられる。
本発明のレセプター蛋白質の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略記する 場合がある） としては、 前記した本発明のレセプ夕一蛋白質の部分ペプチドで あれば何れのものであってもよいが、 例えば、 本発明のレセプ夕一蛋白質分子 のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 レセプ夕一結合活性を有す るものなどが用いられる。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するレセプター蛋 白質の部分べプチドとしては、 図 9で示される疎水性プロット解析において細 胞外領域 （親水性 （HydropM l i c) 部位） であると分析された部分を含むぺプチ ドである。 また、 疎水性 （Hydrophobi c) 部位を一部に含むペプチドも同様に用 いることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数 のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明のレセプター蛋白 質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。 実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好 ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。 ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同 質の活性」 の測定は前記と同様に行なうことができる。
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上（好 ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜β個) ） のアミノ酸 が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5 個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜 1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜 5個程度） のァミノ酸が他のァミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （― C O O H) またはカルボキシレート （一 C O O一） である力 前記した本発明のタンパク質 のごとく、 C末端がアミド （― C O N H 2) またはエステル （—C O O R ) であ つてもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明のレセプ夕一蛋白質と 同様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成した Gi nがピログルタミン酸化したもの、分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは 糖鎖が結合したいわゆる糖べプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 C〇〇H) またはカルボキシレート（一 C〇〇—） であるが、 前記した本発明のタンパク質 のごとく、 C末端がアミド （—C O N H 2) またはエステル （一 C〇〇R ) であ つてもよい。
本発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドの塩としては、 酸または 塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される 酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プ ロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用い られる。
本発明のレセプター蛋白質またはその塩は、 前述したヒトゃ哺乳動物の細胞 または組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造すること もできるし、 後述する本発明のレセプター蛋白質をコードする D N Aを含有す る形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述の タンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどのク口マトグラフィ一 を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩またはそ のアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ る。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル 樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル榭脂、 4一ベンジルォキシべ ンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4— ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミ ド樹脂、 4一 （2 ' , 4 ' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹 脂、 4 - (2 ' , 4' -ジメトキシフエ二ルー Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂な どを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひ一ァミノ基と側鎖官能基 を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公知 の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク 質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジス ルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質またはそのアミド体を取得 する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 力ルポ ジイミド類としては、 DCC、 Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル- N' -（3-ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらに よる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOB t , HOOB t)とともに保護アミ ノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HOB tエステルあるい は H00B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂 に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク 質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例え ば、 N， N—ジメチルホルムアミド， N , N—ジメチルァセトアミド， N—メ チルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲ ン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスル ホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフラン などのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢 酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。 反応温度は夕ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られ ている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 T：〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択さ れる。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニン ヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を 行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチ ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Bo 夕一シャリ一ペンチル ォキシカルボニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4—メトキシベンジルォ キシカルボニル、 Π- Z、 Br- Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロ ァセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエニル、 ジフエ ニルホスフィノチオイル、 Fmocなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 ターシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状も しくは環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジル エステル、 4—ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4 一クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステ ル化、 ベンジルォキシカルポニルヒドラジド化、 ターシャリーブトキシカルボ ニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。 セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカル ポニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz l、 C l 2- Bz l、 2—ニトロベンジル、 Br- Z、 夕ーシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 Tos、 4 -メトキシ- 2, 3, 6 -トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Trし Fmocなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4, 5 -トリクロ口フエノール、 2, 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコ —ル、 パラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシ フタルイミド、 H0BO とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活 性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d -黒あるいは P d -炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メ タンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいは これらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチ ルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア 中ナトリウムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一 般に約— 2 0で〜 4 0 の温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオア二ソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイ ド、 1, 4 -ブタンジチオール、 1, 2-エタンジチオールなどのよ うなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保 護基として用いられる 2, 4-ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除 去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上 記の 1, 2 -エタンジチオール、 1， 4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理によ る脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ 処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ 末端アミノ酸の α—カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側に ペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末 端の α—ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端の力ルポキシル基 の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記した ような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての保 護基を除去し、 所望の粗タンパク質を得ることができる。 この粗タンパク質は 既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の タンパク質のアミド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸の α 一カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タンパク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得るこ とができる。
本発明の夕ンパク質の部分べプチドまたはその塩は、 自体公知のぺプチドの 合成法に従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断す ることによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明のタンパ ク質を構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生 成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製 造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下 の①〜⑤に記載された方法が挙げられる。
φΜ. Bodanszky および M. A. 0ndet t i、 ペプチド シンセシス （Pept ide Synthes i s) , Intersc i ence Publ i shers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザ ペプチド（The Pept i de) , Academi c Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年)
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留，カラムクロマト グラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部 分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが 遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述し た本発明のレセプター蛋白質をコードする塩基配列 （DNAまたは RNA、 好 ましくは DNA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該ポ リヌクレオチドとしては、 本発明のレセプター蛋白質をコードする DNA、 m RNA等の RNAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本鎖 の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイブリッド でもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （即ち、 コード鎖） であっても、 アンチ センス鎖 （即ち、 非コード鎖） であってもよい。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、 公知の実験医学増刊 「新 PC Rとその応用」 15(7)、 i 997記載の方法またはそれ に準じた方法により、 本発明のレセプター蛋白質の mRN Aを定量することが できる。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲ ノム DN Aライブラリー、前記した細胞'組織由来の cDNA、前記した細胞 ' 組織由来の cDNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ 一に使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファ —ジミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より totalRN Aまたは m R N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T- P C R法と略称する） によって増幅 することもできる。
具体的には、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAとしては、 例え ば、 配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 8で表わされる塩基配列を 含有する DNA、 または配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 8で表 わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基 配列を有し、 本発明のレセプ夕一蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 リガンド 結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するレセプ夕一蛋白質をコードす る DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 8で表わされる塩基配列とハ ィブリダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 3、 配列番号： 4ま たは配列番号： 8で表わされる塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80 % 以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を 有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えば、 モレキュラー 'クローニング ·（Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行な うことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリン ジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜4 OmM、 好ましくは約 19〜2 OmMで、 温度が約 50〜 70 、 好ましくは 約 60〜65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 65 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ ター蛋白質をコードする DN Aとしては、 配列番号： 3で表わされる塩基配列 を含有する DNAなどが用いられ、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を 含有するレセプター蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 4で表わ される塩基配列を含有する DNAなどが用いられ、 配列番号： 7で表わされる アミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質をコードする DN Aとしては、 配列 番号： 8で表わされる塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DN Aの塩基配列の一部、 または該 DN Aと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記 の本発明の部分べプチドをコードする DNAを包含するだけではなく、 RNA をも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質遺伝子の複製又は発現を 阻害することのできるアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン 化したあるいは決定された G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする D N Aの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核 酸） は、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の R N Aとハイブリダィズす ることができ、 該 R N Aの合成又は機能を阻害することができるか、 あるいは G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質関連 R N Aとの相互作用を介して G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 G蛋白質 共役型レセプター蛋白質関連 R N Aの選択された配列に相補的なポリヌクレオ チド、 及び G蛋白質共役型レセプター蛋白質関連 R N Aと特異的にハイブリダ ィズすることができるポリヌクレオチドは、 生体内及び生体外で G蛋白質共役 型レセプ夕一蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気 などの治療又は診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌ クレオチド、 塩基配列又は核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的 であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列又は核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列又はその相補体から 誘導される指令にあるペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 G蛋 白質共役型レセプター蛋白質遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5 ' 端ら —ベ一 スペア ' リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質 コード領域、 O R F翻訳,開始コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3， 端パリンドロ一 ム領域、 及び 3 ' 端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択し うる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関 係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ·ポリヌクレオチ ドは、 2—デォキシー D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 D—リボースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 プリン又はピリミジ ン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは 非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸及 び合成配列特異的な核酸ポリマー） 又は特殊な結合を含有するその他のポリマ ― (但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリン グゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げら れる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R N A、 1本鎖 R NA、 さらに D NA： R N Aハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌク レオチド （又は非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加され たもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホ スホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合又は硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエー ト、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ*インヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L —リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有して いるもの、 インタ一カレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾され た結合を持つもの （例えば、 αァノマ一型の核酸など） であってもよい。 ここ で 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 及び 「核酸」 とは、 プリン及びピリミ ジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつよう なものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリン及びピリ ミジン、 ァシル化されたプリン及びピリミジン、 あるいはその他の複素環を含 むものであってよい。 修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドは また糖部分が修飾されていてよく、 例えば 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に 変換されていてよい。
本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D N A、 あ るいは修飾された核酸 （R N A、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例と しては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシド アミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 そ れに限定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で 好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定な ものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス 鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチ センス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており。 例えば J. Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992 ; Vo l. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al. ed. , Ant isense Research and Appl i cat ions, CRC Press, 1993 などに 開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステ リルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸 の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオ シド結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一 ゼ、 R N a s eなどのヌクレア一ゼによる分解を阻止するためのものが挙げら れる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエ チレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基 の保護基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは G蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生 体外の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法 で細胞に適用できる。 本発明の部分ペプチドをコードする DN Aとしては、 前述した本発明の部分 ペプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであって もよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 -組 織由来の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 D NAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するべクタ一は、 バクテリオファ —ジ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より mRN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T- P C R法と略称する) によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 (1) 配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 8で表わされる塩基配列 を有する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 または （2) 配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 8で表わされる塩基配列とハイストリンジェン トな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、 本発明のレセプ夕一蛋白質 ペプチドと実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作 用など） を有するレセプ夕一蛋白質をコードする DNAの部分塩基配列を有す る DN Aなどが用いられる。
配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 8で表わされる塩基配列ハイ ブリダィズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 3、 配列番号： 4また は配列番号： 8で表わされる塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以 上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有 する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチド （以下、 本発明のレセプ ター蛋白質と略記する場合がある） を完全にコードする DNAのクローニング の手段としては、 本発明のレセプ夕一蛋白質の部分塩基配列を有する合成 DN Aプライマ一を用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクターに 組み込んだ DN Aを本発明のレセプ夕一蛋白質の一部あるいは全領域をコ一ド する DN A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼ —シヨンによって選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 L 例えば、 モレキュラー 'クロ一ニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説 明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DN Aの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、 Mutan™-G (宝酒造（株） )、 utan™-K (宝酒造 （株） ） などを用いて、 Gupped duplex法や Kunkel法などの 自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。 クローン化されたレセプター蛋白質をコードする DN Aは目的によりそのま ま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用 することができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適 当な合成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のレセプター蛋白質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のレセ プ夕一蛋白質をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN A断片を適当な発現べク夕一中のプロモーターの下流に連結することに より製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 PBR 322, pBR3 25, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0， TP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH19, pSH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 XT1、 p R c/CMV, pRc/RS V, p c DNA I ZN e oなどが用い られる。
本発明で用いられるプロモータ一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモータ一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモーター、 L TRプロモー夕一、 CMVプロモ一ター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げ られる。 これらのうち、 CMVプロモ一夕一、 S Rひプロモーターなどを用いるのが好 ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモータ一、 l a c プロモー夕一、 r e cAプロモータ一、 プロモーター、 l ppプロモータ 一などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SP01プロモーター、 SPO 2プロモータ一、 p e nPプロモー夕一など、 宿主が酵母である場合は、 PH 05プロモ一夕一、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモーター、 ADHプロモ 一夕一などが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモー ター、 P 10プロモータ一などが好ましい。
発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いること ができる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp「と略称する場合がある） 、 ネオマイシ ン耐性遺伝子 （以下、 Ne 0 rと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げ られる。 特に、 CH〇 (dh f r— ) 細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マーカ 一として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択 できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のレセプ夕一蛋 白質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シ グナル配列、 0即 A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が 酵母である場合は、 MFひ · シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿 主が動物細胞である場合には、 インシュリン · シグナル配列、 ひ一インターフ エロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。 このようにして構築された本発明のレセプター蛋白質をコードする DN Aを 含有するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。 ェシエリヒア属菌の具体例としては、ェシエリヒア'コリ （Escherichia coli) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォ ブ 'サイェンシィズ'ォブ'ザ 'ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. US A) , 60巻， 160 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック 'ァシッズ · リサーチ， （Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1 98 1)〕 ， J A 2 2 1 〔ジャーナル ·ォブ'モレキュラー 'ノ イォロジ一 (Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 10 1 〔ジャーナル'ォブ · モレキュラー .バイオロジー， 41卷， 459 (1 969)〕 ， C 600 〔ジェ ネティックス （Genetics) ， 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。 バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·ズブチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1 983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナ ル ·ォブ ·バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (1 984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH22R— , ΝΑ 87 - 1 1 A, DKD- 5 D, 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NC YC 19 13, NCYC 2036、 ピキア パス卜リス （Pichia pastoris) な どが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niC 中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM 細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCCCRL1711)、 S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J. L. ら、 イン ' ヴィポ （In Vivo) , 13, 213- 217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ 一 (Nature) ， 31 5巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Vero, チャイニーズハム スター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CH〇 （以下、 CHO (ci h f r") 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3, ヒト F L細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシ一ジングズ 'ォブ- ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ 一 （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 21 10 (1972)やジーン (Gene) ， 1 7巻， 107 (1 982)などに記載の方法に従って行なうことが できる。 バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー 'アンド · ジェネラル 'ジェネティックス （Molecular & General Genet ics) ， 168巻， 1 1 1 (1 979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ 'イン'ェンザィモロジ一（Me t hod s inEnzymology) , 194卷， 1 82— 187 ( 1991 ) 、 プロシ一ジングズ' ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75卷， 1 929 (1 978) などに記載の方法に従つて行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジー (Bio/Technology) ,6， 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことが できる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロ トコール. 263— 267 (1995) (秀潤社発行）、ヴイロロジー（V ology)， 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする DN Aを含 有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進 因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) ， ジャーナル 'ォブ 'ェクスぺリメ ンッ ·イン 'モレキュラー · ジェ不ティックス (Journal of Experiments in Molecular Genet ics) , 43 1—433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモータ一を効率よく働かせ るために、 例えば、 30—インドリル アクリル酸のような薬剤を加えること ができる。 宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43でで約 3〜24時間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30 ~ 40 で約 6〜 24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダー （Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L. ら、 「プロシ一ジングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77卷， 4505 (1980)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 「プロシ一ジン グズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一 ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 81巻， 5330 ( 1 98 4) 〕 が挙げられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は 通常約 20°C〜35でで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を 力 Qえる。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. ,ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788 (1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 で約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 122巻， 501 (1 952)] , DMEA1培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) ， 8巻， 39 6 (1 959)) , RPMI 1640培地〔ジャーナル ·ォブ 'ザ-ァメリカン . メディカル - アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 1 99巻， 519 (1967)〕 ， 1 99培地 〔プロシ一ジング- ォブ 'ザ'ソサイエティ ·フォー 'ザ'バイオロジカル ·メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73巻， 1 ( 1 950)〕 な どが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30°C〜 40°Cで約 1 5〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞膜に本発明の G蛋白質共役型レセプ夕 一蛋白質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のレセプター蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下 記の方法により行なうことができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチ一ムおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を 破壊したのち、 遠心分離やろ過によりレセプター蛋白質の粗抽出液を得る方法 などが適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性 剤や、 トリトン X— 100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液 中にレセプ夕一蛋白質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方 法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるレセプタ一 蛋白質の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことが できる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解 度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリア クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 ィォ ン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク 口マトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マト 一などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点 の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるレセプ夕一蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体公知 の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で 得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体ま たは他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するレセプ夕一蛋白質を、 精製前または精製後に適当 な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリべプチ ドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプ シン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のレセプター蛋白質またはその塩の活性は、 標識し たリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアツセィな どにより測定することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する 抗体は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れで あってもよい。
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発明のレセプ夕一蛋白質等と略記する場合がある） に対する抗体は、 本発明 のレセプ夕一蛋白質等を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造 法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナ一ル抗体産生細胞の作製
本発明のレセプ夕一蛋白質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可 能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して 抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントァ ジュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0 回程度行なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィ ヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよ びラッ卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に 脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と 融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製するこ とができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化レセプター蛋 白質等と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーと ミルスタインの方法〔ネィチヤ一（Nature), 256巻、 495頁（1975年）〕 に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレング リコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PE Gが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U 1、 SP 2Z0などが挙げ られるが、 P 3U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細 胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PE G (好ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜80 %程度の濃 度で添加され、 約 20〜 401：、 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜 10分間 インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリド一マのスクリーニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 レセプ夕一蛋白質等の抗原を直接あるいは担体ととも に吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加 し、.次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に 用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロプリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方 法、 抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリド —マ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したレセプ夕一蛋白質等 を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。 モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って b , 行なうことができるが、 通常は H A T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チ ミジン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育 種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を 用いても良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を 含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光 純薬工業 （株） ） またはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 曰水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週 間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイ プリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして 測定できる。
( b ) モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と 同様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点 沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心 法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなど の活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精 製法〕 に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に したがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （レセプタ一蛋白質等の 抗原） とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の 製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のレセプ夕一 蛋白質等に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより 製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一蛋白質との複合 体に関し、キャリア一蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブ ミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール · リンペット ·へモシァニン等を重 量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプル させる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができる力 ダルタルアルデヒドゃカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なうことが できる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ一 ナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこと ができる。
本発明のレセプター蛋白質またはその塩、 その部分ペプチドまたはその塩、 および該レセプ夕一蛋白質またはその部分べプチドをコ一ドする D N Aは、 ( 1 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンド （ァゴニス ト） の決定、 （2 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の機能不全に関 連する疾患の予防および/または治療剤、 （3 ) 遺伝子診断剤、 （4 ) 本発明 のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のス クリーニング方法、 （5 ) 本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチド の発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤、
( 6 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドの定量法、
( 7 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合性を変化 させる化合物（ァゴ二スト、 アン夕ゴニストなど）のスクリーニング方法、 （8 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる 化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト） を含有する各種疾病の予防および Zま たは治療剤、 （9 ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の定量、 （1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはそ の部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、 （1 1 ) 細胞 膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させ る化合物を含有する各種疾病の予防および/または治療剤、 （1 2 ) 本発明の レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体による 中和、 （1 3 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする D NA を有する非ヒト動物の作製などに用いることができる。
特に、 本発明の組換え型 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現系を用いた レセプ夕一結合アツセィ系を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な G蛋白質共役型レセプターに対するリガンドの結合性を変化させる化合物（例、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストなど） をスクリーニングすることができ、 該ァゴ 二ストまたはアン夕ゴニストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用するこ とができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発 明のレセプ夕一タンパク質等と略記する場合がある） 、 本発明のレセプター蛋 白質またはその部分ペプチドをコードする D N A (以下、 本発明の D NAと略 記する場合がある） および本発明のレセプター蛋白質等に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） の用途について、 以下に具体的に説明す る。
( 1 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド （ァゴニス ト） の決定
本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明の部分べプチドもし くはその塩は、 本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァ ゴニスト） を探索し、 または決定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩または本発 明の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴と する本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンドの決定方法を提供する。 試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべ シン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニ ン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシ ン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジユリ ン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリべプチ ド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 C GRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パ ンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アド レナリン、 αおよび /3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I.L— 8、 GRO a、 GR〇i3、 GR〇T、 NAP— 2、 ENA— 78、 P F 4、 I P 1 0、 G CP— 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 1—309、 ΜΙ Ρ 1 α、 M I P— l i3、 R ANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒス 夕ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまた はガラニンなど） の他に、 例えば、 ヒトまたは哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラ ット、 ブ夕、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組織抽出物、 細胞培養上清などが用 いられる。 例えば、 該組織抽出物、 細胞培養上清などを本発明のレセプ夕ー蛋 白質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しながら分画し、 最終的に単一のリガ ンドを得ることができる。
具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もし くはその部分ペプチドもしくはその塩を用いるか、 または組換え型レセプター 蛋白質の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプター結合アツセィ系を用い ることによって、 本発明のレセプター蛋白質に結合して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP 生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞 内蛋白質のリン酸化、 c一 ; f o s活性化、 pHの低下などを促進する活性また は抑制する活性） を有する化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性 化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を決定する方法である。 本発明のリガンド決定方法においては、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはそ の部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、 例えば、 該レセプ夕ー蛋 白質または該部分べプチドに対する試験化合物の結合量や、 細胞刺激活性など を測定することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩または本 発明の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識した試験 化合物の該蛋白質もしくはその塩、 または該部分べプチドもしくはその塩に対 する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプター蛋白質またはその 塩に対するリガンドの決定方法、
②標識した試験化合物を、 本発明のレセプタ一蛋白質を含有する細胞または該 細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞または 該膜画分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白 質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
③標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N Aを含 有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白 質に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該レセプター蛋白質また はその塩に対する結合量を測定しすることを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋 白質に対するリガンドの決定方法、
④試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合 における、 レセプ夕一蛋白質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊 離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン 酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活 性など） を測定することを特徴とする本発明のレセプター蛋白質またはその塩 に対するリガンドの決定方法、 および
⑤試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N Aを含有する形 質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプ夕一蛋白質に接触 させた場合における、 レセプ夕一蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラ キドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白 質のリン酸化、 c一 : f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑 制する活性など） を測定することを特徴とする本発明のレセプター蛋白質また はその塩に対するリガンドの決定方法を提供する。
特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明のレセプ夕一蛋白質 に結合することを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ましい。 まず、 リガンド決定方法に用いるレセプ夕一蛋白質としては、 上記した本発 明のレセプ夕一蛋白質または本発明の部分ペプチドを含有するものであれば何 れのものであってもよいが、 動物細胞を用いて大量発現させたレセプ夕一蛋白 質が適している。
本発明のレセプター蛋白質を製造するには、 前述の発現方法が用いられるが、 該レセプ夕ー蛋白質をコードする D N Aを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現する ことにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする DNA 断片には、 通常、 相補 DNAが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるもの ではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 DN Aを用いてもよい。 本発明のレセプ 夕一蛋白質をコードする DNA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よ く発現させるためには、 該 DN A断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに 属する核多角体病ウィルス （nuclear polyhedrosis virus； N P V) のポリへ ドリンプロモータ一、 SV40由来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモ 一夕一、 メタ口チォネインプロモ一夕一、 ヒトヒートショックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S R αプロモー夕一などの下流に組み込 むのが好ましい。 発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で 行うことができる。 例えば、 文献 〔Nambi， P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ -バ ィォロジカル ·ケミストリー （J. Biol. Chem. ) , 267巻， 19555〜19559頁， 1992 年〕 に記載の方法に従って行うことができる。
したがって、 本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプター蛋白 質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有するものとしては、 それ自体 公知の方法に従って精製したレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩であってもよいし、 該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細 胞膜画分を用いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する 細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化し てもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞としては、 本発明のレセプタ一蛋 白質を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵 母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Pot ter— Elvehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリングブレンダ一ゃポ リトロン （Kinemat ica社製） による破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙 げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清を さらに高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠 心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプタ一蛋 白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプ夕ー蛋白質を含有する細胞やその膜画分中のレセプター蛋白質の量 は、 1細胞当たり 1 0 3〜1 0 8分子であるのが好ましく、 1 0 5〜1 0 7分子で あるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活 性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか りでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるようになる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の ①〜③の方法を実施するためには、 適当なレセプ夕一蛋白質画分と、 標識した 試験化合物が必要である。
レセプター蛋白質画分としては、 天然型のレセプター蛋白質画分か、 または それと同等の活性を有する組換え型レセプター画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。 標識した試験化合物としては、 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 な どで標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキ二 ン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴ ン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル ァ ンド リイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドぺプ チド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロン ボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひおよび) 3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROひ、 GR〇i3、 GR〇ァ、 NAP— 2、 ENA— 7 8、 PF 4、 I P 1 0、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC 1 4、 MCP— 3、 1— 30 9、 M I P 1 a M I P— 1 ]3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアテ ィックポリぺプタイドまたはガラニンなどが好適である。
具体的には、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドの決 定方法を行なうには、 まず本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞または細 胞の膜画分を、 決定方法に適したバッファーに懸濁することによりレセプ夕一 標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜 1 0 (望ましくは pH6〜8) の リン酸バッファー、 トリス一塩酸バッファ一などのリガンドとレセプ夕一蛋白 質との結合を阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。 また、 非特異的 結合を低減させる目的で、 CHAP S、 Twe e n - 8 0™ (花王—アトラス 社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミン やゼラチンなどの各種蛋白質をバッファ一に加えることもできる。 さらに、 プ 口テア一ゼによるリセプ夕ーやリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイ ぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテアーゼ 阻害剤を添加することもできる。 0. 0 lm l〜 l 0mlの該レセプ夕ー溶液に、 一定量 （50 00 c pm〜500 0 00 c pm) の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14 C〕 、 〔35S〕 などで標識した試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （N S B ) を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意 する。 反応は約 0 °Cから 5 0 °C、 望ましくは約 4 °Cから 3 7 °Cで、 約 2 0分か ら 2 4時間、 望ましくは約 3 0分から 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙 等で濾過し、 適量の同バッファ一で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放 射活性を液体シンチレーシヨンカウンターあるいはァーカウン夕一で計測する。 全結合量 （B ) から非特異的結合量 （N S B ) を引いたカウント （B— N S B ) が 0 c p mを越える試験化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対 するリガンド （ァゴ二スト） として選択することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の ④〜⑤の方法を実施するためには、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞 内 C AM P生成、 細胞内 c G M P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c 一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進 する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを 用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 レセプ夕一蛋白質を含有す る細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 リガンド決定を行なうにあたつ ては前もつて新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交 換し、 試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出 あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞 が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を 添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性につ いては、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に 対する産生抑制作用として検出することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に結合するリガンド決定用キットは、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩、 本発明の部分べプチドもしくはそ の塩、 本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞、 または本発明のレセプター 蛋白質を含有する細胞の膜画分などを含有するものである。
本発明のリガンド決定用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 1. リガンド決定用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 μιηのフィルタ一で濾過滅菌し、 4 で保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプター蛋白質標品
本発明のレセプ夕一蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 105個ノ穴で継代し、 37 、 5%C02、 95 % a i rで 2日間培養した もの。
③標識試験化合物
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 ま たは適当な方法で標識化したもの
水溶液の状態のものを 4 あるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝 液にて 1 Mに希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチル ホルムアミド、 DMS〇、 メタノール等に溶解する。
④非標識試験化合物
標識化合物と同じものを 100〜1000倍濃い濃度に調製する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプター蛋白質発現 CH O細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液 を各穴に加える。
②標識試験化合物を 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量 を知るためには非標識試験化合物を 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識試験化合物を 0.2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチ レーター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定する。 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に結合することができるリガンドと しては、 例えば、 脳、 下垂体、 滕臓などに特異的に存在する物質などが挙げら れ、 具体的には、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシスト キニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオ イド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グ ルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティ ナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーテ イツドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアス夕チン、 プロスタグランジ ン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび 3—ケモカイン (chemokine) (例えば、 I L— 8、 GRO a, GROi3、 GROァ、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP-2, MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 1— 309、 ΜΙ Ρ 1 α、 M I P— 1 /3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニンなどが用いられる。
(2) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の 予防および Zまたは治療剤
上記 （1) の方法において、 本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドが 明らかになれば、 該リガンドが有する作用に応じて、 ①本発明のレセプタ一蛋 白質または②該レセプ夕一蛋白質をコ一ドする DNAを、 本発明のレセプター 蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およびノまたは治療剤などの医薬とし て使用することができる。
例えば、 生体内において本発明のレセプター蛋白質が減少しているためにリ ガンドの生理作用が期待できない （該レセプター蛋白質の欠乏症） 患者がいる 場合に、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質を該患者に投与し該レセプタ一蛋白質の 量を補充したり、 ② （ィ） 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAを該 患者に投与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に本発 明のレセプター蛋白質をコードする DNAを挿入し発現させた後に、 該細胞を 該患者に移植することなどによって、 患者の体内におけるレセプ夕一蛋白質の 量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させることができる。 即ち、 本発 明のレセプ夕一蛋白質をコ一ドする DNAは、 安全で低毒性な本発明のレセプ 夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およびノまたは治療剤として有用 である。
本発明のレセプター蛋白質は、 G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質である アンジ ォテンシン Πのタイプ I受容体 （ATI) にアミノ酸配列レベルで約 30 %の 相同性が認められる。 ATIは、 高血圧症 '心肥大'動脈硬化等の病態に関連し ていると報告されている [日本臨床 56巻 7号 1906— 191 1 (1998) ]。 従って、 AT 1と相同性が認められる本発明のレセプ夕一は、 循環器疾患 (例え ば高血圧症 '心肥大'動脈硬化等）の予防および Zまたは治療に有用である。 また、 AT 1を介する作用としては、 中枢においてバソプレツシン ZLHZF SH分 泌-飲水 ·食塩嗜好 ·脳血流自動調節、心臓において肥大 ·収縮増強 ·リモデリング、 副腎皮質からのアルドステロン分泌、 副腎髄質からのカテコールアミン分泌、 腎臓において近位尿細管におけるナトリゥムの再吸収の促進'輸出ノ入細動脈 収縮、 血管において収縮 ·肥厚促進等の作用が知られている [現代の神経内分泌 学 (吉田尚 監修）、 75 - 83ページ]。 従って、 AT Iと相同性が認められる 本発明のレセプター蛋白質は、呼吸器疾患'循環器疾患 '消化管疾患 ·肝/胆 /勝疾 患 ·内分泌疾患の予防およびノまたは治療に有用である。
本発明のレセプター蛋白質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套 手段に従って製剤化することができる。
一方、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNA (以下、 本発明の DN Aと略記する場合がある） を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明 の DN Aを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿 入した後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の DNAは、 その ままで、 あるいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイド口ゲル カテ一テルのようなカテ一テルによって投与できる。
例えば、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質または②該レセプ夕一蛋白質をコード する D N Aは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学 的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口 的に使用できる。 例えば、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質または②該レセプ夕一 蛋白質をコードする D N Aを生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形 剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実 施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるよう にするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に 従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マ ンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例え ば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコ ール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベー ト 8 0 TM、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ卜血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一 ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方 法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 高血圧症患者 (60 k gとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜： L O Omg、 好まし くは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口 的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 高血圧症患者 (6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ま しくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を静 脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たり に換算した量を投与することができる。
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによ り差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 高血圧症患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. lmg〜l 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 高血圧症患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
(3) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは哺乳動 物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） における本発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドをコード する DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増力！]あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用で ある。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン ハイブリダィゼーシヨンや PCR— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) ， 第 5巻， 874〜 879頁 （ 1 989年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナ ショナル*アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ 'ュ一エスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) , 第 86巻， 2766〜2770頁 （1 989年） ） などにより実施することが できる。
(4) 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分べプチドの発現量を変化させ る化合物のスクリーニング方法
本発明の DN Aは、 プロ一ブとして用いることにより、 本発明のレセプター 蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング に用いることができる。
すなわち本発明は、 例えば、 （ i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の 臓器、 ③臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （ii) 形質転換体等 に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分べプチドの mRNA 量を測定することによる、 本発明のレセプター蛋白質またはその部分ぺプ チドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの m R N A量の測定は具 体的には以下のようにして行なう。
( i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラッ ト、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例 えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間 経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のレセプター蛋白質またはその部分ぺプ チドの m R N Aは、 例えば、 通常の方法により細胞等から m R N Aを抽出 し、 例えば TaqManPCRなどの手法を用いることにより定量することができ、 自体公知の手段によりノザンブロットを行うことにより解析することもで さる。
(i i ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体を前述の方法に従い作製し、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプ夕一 蛋白質またはその部分ペプチドの mR N Aを同様にして定量、 解析することが できる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化 合物のスクリーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前ないし 2 4時間前、 好ましくは 3
0分前ないし 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前） もしくは 一定時間後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より 好ましぐは 1時間後ないし 2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレス と同時に被検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、より好ましくは 1時間後ないし 2 4時間後）、 細胞に含まれる本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの mR N A 量を定量、 解析することにより行なうことができ、
(i i ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後ないし 7日後、 好ましくは 1日後ないし 3日後、 より 好ましくは 2日後ないし 3日後） 、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプ夕 一蛋白質またはその部分べプチドの mR N A量を定量、 解析することにより行 なうことができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 本発 明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用を有 する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその 部分べプチドの発現量を増加させることにより、 G蛋白質共役型レセプターを 介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞 内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C一 ί O Sの活性化、 p
Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合物、 (口） 本発明のレセプタ一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させ ることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等の生理 活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等の生理 活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組 成物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプター蛋白質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カブ セル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとす ることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 高血圧患者 （6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 高血圧患者 （6 O k と して） においては、 一日につき約 0 . 0 1〜3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g程度、 より好ましくは約 0 . 1〜 1 O m g程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
( 5 ) 本発明のレセブ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ る化合物を含有する各種疾病の予防および/または治療剤
本発明のレセプター蛋白質は前述のとおり、 例えば中枢機能など生体内で何 らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 本発明のレセプ夕一 蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、 本発明のレセ プ夕ー蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およびノまたは治療剤として用 いることができる。
該化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およ び Zまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従つて製剤化することが できる。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキ シル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形 で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担 体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に 認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容 量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に 従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マ ンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例え ば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコ ール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ一 ト 80TM、 HCO- 50) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一 ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 高血圧症患者 （6 Okgとして） においては、 一日につき約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1· 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 高血圧症患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量 を投与することができる。 ( 6 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプ夕一蛋白質等は、 リガンドに対して結合性を有しているので、 生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いること ができる。 すなわち、 被検体を本発明のレセプタ一蛋白質等と接触させること によって被検体中のリガンド濃度を測定することができる。 具体的には、 例え ば、 以下の①または②などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用 いることができる。
①入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行）
( 7 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化 させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニストなど） のスクリーニング方法 本発明のレセプター蛋白質等を用いるか、 または組換え型レセプ夕一蛋白質 等の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプター結合アツセィ系を用いるこ とによって、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる 化'合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵 生産物など） またはその塩を効率よくスクリ一ニングすることができる。
このような化合物には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ夕一を介して細胞刺激 活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c G M P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜 電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一: f o sの活性化、 p Hの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明の レセプター蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化 合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 （八） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を増強する化 合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質と の結合力を減少させる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物は、 上記したリガンド決定方法によってスクリーニングすることが好ましい） 。 すなわち、 本発明は、 （ i ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と （i i ) 本発明のレセプ 夕一蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と、 リガンドおよび試験化 合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明 のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （ i ) と （i i ) の場合における、 例えば、 該レセプ夕ー蛋白質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性など を測定して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合と、 標 識したリガンドおよび試験化合物を本発明のレセプター蛋白質等に接触させた 場合における、 標識したリガンドの該レセプ夕一蛋白質等に対する結合量を測 定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
②標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞または該 細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発 明のレセプター蛋白質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場 合における、 標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定 し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結 合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
③標識したリガンドを、 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現したレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合と、 標識し たリガンドおよび試験化合物を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養す ることによって細胞膜上に発現した本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた 場合における、 標識したリガンドの該レセプター蛋白質等に対する結合量を測 定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
④本発明のレセプ夕一蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプ 夕一蛋白質等に対するリガンドなど） を本発明のレセプター蛋白質等を含有す る細胞に接触させた場合と、 本発明のレセプター蛋白質等を活性化する化合物 および試験化合物を本発明のレセプター蛋白質等を含有する細胞に接触させた 場合における、 レセプターを介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等 との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および ⑤本発明のレセプ夕一蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプ ター蛋白質等に対するリガンドなど） を本発明の D N Aを含有する形質転換体 を培養することによつて細胞膜上に発現した本発明のレセプ夕一蛋白質等に接 触させた場合と、 本発明のレセプター蛋白質等を活性化する化合物および試験 化合物を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜 上に発現した本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合における、 レセプ ターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシ] ル リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較する ことを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のレセプ夕一蛋白質等が得られる以前は、 G蛋白質共役型レセプター ァゴニストまたはアン夕ゴニストをスクリーニングする場合、 まずラットなど の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含む細胞、 組織またはその細胞膜画分を 用いて候補化合物を得て （一次スクリーニング） 、 その後に該候補化合物が実 際にヒ卜の G蛋白質共役型レセブ夕一蛋白質とリガンドとの結合を阻害するか 否かを確認する試験 （二次スクリーニング） が必要であった。 細胞、 組織また は細胞膜画分をそのまま用いれば他のレセプ夕一蛋白質も混在するために、 目 的とするレセプター蛋白質に対するァゴニストまたはアン夕ゴニストを実際に スクリーニングすることは困難であった。 しかしながら、 例えば、 本発明のヒト由来レセプ夕一蛋白質を用いることに よって、 一次スクリーニングの必要がなくなり、 リガンドと G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリ一ニングすること ができる。 さらに、 スクリーニングされた化合物がァゴニストかアン夕ゴニス トかを簡便に評価することができる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプ夕一蛋白質等と しては、 上記した本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有するものであれば何れの ものであってもよいが、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する哺乳動物の臓 器の細胞膜画分が好適である。 しかし、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困 難なことから、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて 大量発現させたヒト由来のレセプ夕一蛋白質等などが適している。
本発明のレセプ夕一蛋白質等を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 本発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ま しい。 目的とする蛋白質部分をコードする D N A断片には相補 D N Aが用いら れるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D N Aを用いてもよい。 本発明のレセプタ一蛋白質をコ一ドする D N A断片を 宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D N A断片 を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuc l ear polyhedros i s vi rus； N P V) のポリヘドリンプロモーター、 S V 4 0由来の プロモーター、 レトロウイルスのプロモー夕一、 メタ口チォネインプロモータ 一、 ヒトヒートショックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモ一夕一、 S R αプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプター の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Namb i， P.ら、ザ'ジャーナル'ォブ 'バイオロジカリぃケミストリ一（J. Bi o l. Chem. ) , 267 巻， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプター蛋 白質等を含有するものとしては、 それ自体公知の方法に従って精製したレセプ 夕一蛋白質等であってもよいし、 該レセプ夕ー蛋白質等を含有する細胞を用い てもよく、 また該レセプター蛋白質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。 .本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有 する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定 化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。 本発明のレセプター蛋白質等を含有する細胞としては、 該レセプター蛋白質 等を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵«：、 昆虫細胞、 動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダ一ゃポ リトロン （Kinematica社製） のよる破砕、 超音波による破碎、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙 げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm~3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清を さらに高速 （15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠 心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕ー蛋 白質等と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプ夕ー蛋白質等を含有する細胞や膜画分中のレセプ夕一蛋白質の量は、 1細胞当たり 103~108分子であるのが好ましく、 105〜107分子である のが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比 活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでな く、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる化合物をス クリーニングする上記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当なレセプ夕 一蛋白質画分と、 標識したリガンドが必要である。
レセプ夕一蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 または それと同等の活性を有する組換え型レセプター蛋白質画分などが望ましい。 こ こで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など を示す。
標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ 化合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 な どで標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させ る化合物のスクリ一ニングを行なうには、 まず本発明のレセプ夕一蛋白質等を 含有する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファ一に懸 濁することによりレセプ夕一蛋白質標品を調製する。 バッファーには、 pH4 〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファ一、 トリスー塩酸バッファ 一などのリガンドとレセプ夕一蛋白質との結合を阻害しないバッファーであれ ばいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 T we e n— 80 TM (花王—アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなど の界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによ るレセプ夕一やリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加す ることもできる。 0. 0 lm 1〜； 10m 1の該レセプ夕一溶液に、 一定量 （50 00 c ρπ！〜 5 O O O O O c m) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10一 4M〜10— 1QMの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知る ために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0でから 50 °C、 望ましくは約 4 °Cから 37 °Cで、 約 20分から 24時間、 望 ましくは約 30分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量 の同バッファ一で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シン チレ一シヨンカウン夕一またはァ—カウン夕一で計測する。 拮抗する物質がな い場合のカウント（B0) から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （B。 -NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 （B— NSB) ifi、 例えば、 5 0%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択すること ができる。
リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる化合物スク リーニングする上記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 レセプ夕一 蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 C a遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c G M P生成、 イノシトー ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性 化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法ま たは市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 本発明のレセプター蛋白質等を含有する細胞をマルチウ エルプレート等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新 鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファ一に交換し、 試験化合 物などを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液 を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性 の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分 解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツ セィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フォ ルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑 制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当なレセプタ一蛋 白質を発現した細胞が必要である。 本発明のレセプ夕一蛋白質等を発現した細 胞としては、 天然型の本発明のレセプ夕一蛋白質等を有する細胞株、 前述の組 換え型レセプ夕一蛋白質等を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用 いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング用キットは、 本発明のレセプ夕一蛋白質等、 本発明 のレセプター蛋白質等を含有する細胞、 または本発明のレセプター蛋白質等を 含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 1 . スクリーニング用試薬 ①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 のフィルターで濾過滅菌し、 4でで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプター標品
本発明のレセプター蛋白質を発現させた CH〇細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 穴で継代し、 37 、 5%C〇2、 95%a i rで 2日間培養した もの。
③標識リガンド
市販の 〔3H〕、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水 溶液の状態のものを 4 あるいは一 20 にて保存し、 用時に測定用緩衝液に て 1 6Mに希釈する。
④リガンド標準液
リガンドをひ. 1%ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで ImM となるように溶解し、 —20 で保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプタ一蛋白質発現 C H O細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液 を各穴に加える。
©10— 3〜 10— 1QMの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識リガンドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化 合物の代わりに 10— 3Mのリガンドを 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識リガンドを 0.2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ 一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンタ一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。 PMB= [ (B-NS B) / (B。― NSB) ] X 1 00
PMB ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB ： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B。 ：最大結合量 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性 を変化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） G蛋白質共役型 レセプターを介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリ ン遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 CAM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノ シトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o s の活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を有する 化合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわゆる、 本発明のレセプター蛋白質に対 するアン夕ゴニスト） 、 （八） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター 蛋白質との結合力を増強する化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の G蛋 白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
本発明のレセプター蛋白質等に対するァゴニストは、 本発明のレセプ夕一蛋 白質等に対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該 リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のレセプター蛋白質等に対するアンタゴニス卜は、 本発明のレセプ夕 一蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を増強する 化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を 増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を減少させ る化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性 を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従 つて実施することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプ夕一蛋白質を含 有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセ ル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 高血圧症患者 （6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜： 100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0~20mgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 高血圧症患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜 1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
(8) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化 させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト） を含有する各種疾病の予防およ び Zまたは治療剤
本発明のレセプター蛋白質は前述のとおり、 例えば中枢機能など生体内で何 らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 本発明のレセプ夕一 蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴニス卜、 アンタゴニス ト） は、 本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および/ または治療剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプ夕ー蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およ び Zまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することが できる。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキ シル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形 で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担 体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に 認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容 量が得られるようにするものである。
錠剤、 力プセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に 従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マ ンニトール、 塩化ナトリウムなど） な,どが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例え ば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコ ール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ一 ト 8 0 TM、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。 また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコー ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 高血圧症患者 （6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 高血圧症患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 01~30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
(9 ) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定 量
本発明の抗体は、 本発明のレセプター蛋白質等を特異的に認識することがで きるので、 被検波中の本発明のレセプター蛋白質等の定量、 特にサンドイッチ 免疫測定法による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例 えば、 （ Π 本発明の抗体と、 被検液および標識化レセプ夕一蛋白質等とを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化レセプ夕一蛋白質等の割合を測定す ることを特徴とする被検波中の本発明のレセプ夕一蛋白質等の定量法、
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検波中の本発明のレセプ夕一蛋白質等の定量法 を提供する。
上記 （i i ) においては、 一方の抗体が本発明のレセプ夕一蛋白質等の N端部 を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のレセプター蛋白質等の C端部に反応 する抗体であることが好ましい。
本発明のレセプター蛋白質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明の モノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のレセプ夕一蛋白質 等の測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これ らの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b ' , あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明のレセプター蛋白質 等に対する抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定 液中の抗原量 （例えば、 レセプター蛋白質量） に対応した抗体、 抗原もしくは 抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量 の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィムノメ トリック法およびサンドィツチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記 酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ）3—ガラクト シダーゼ、 3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パ一ォキシダ一 ゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フル ォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物 質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲ ニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチ ン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セル口一 スなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合 成樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することによ り被検液中の本発明のレセプター蛋白質量を定量することができる。 1次反応 と 2次反応は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をず らして行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じる ことができる。
また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識 用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上 させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法によるレセプ夕一蛋白質等の測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプ夕一蛋白 質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応お よび 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 レ セプ夕一蛋白質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ま しくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることができ る。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応さ せたのち、 未反応の標識抗原と（F ) と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離 し （B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定 量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリェチ レングリコール、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用 い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
トリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量 の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザ一ネフロメ トリ一などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプター蛋白質 またはその塩の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細に ついては、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラ ジオイムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィ ムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 (医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） (医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） (医学書院、 昭和 62年発行） 、 「メソッズ ·イン 'ェンジモノジー （Methods in ENZYMOLOGY) J Vol. 70 (I腿 unochemical Techniques (Par t A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part 0) 、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybr idoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のレセプ夕ー蛋 白質またはその塩を感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のレセプ夕一蛋白質また はその塩を定量することによって、 本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関 連する各種疾患の診断をすることができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセ プター蛋白質等を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発 明のレセプ夕一蛋白質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時 の各分画中の本発明のレセプ夕一蛋白質等の検出、 被検細胞内における本発明 のレセプ夕一蛋白質の挙動の分析などのために使用することができる。
( 1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプタ一蛋白質またはその部分ペプチドの 量を変化させる化合物のスクリーニング方法
本発明の抗体は、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩を特異的に認識することができるので、 細胞膜における本発明のレセ プタ一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニン グに用いることができる。
すなわち本発明は、 例えば、
( i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もし くは細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明 のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜に おける本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化 合物のスクリーニング方法、
( Π ) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレ セプター蛋白質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜におけ る本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物 のスクリーニング方法、
( i i i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もし くは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該 受容体夕ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該夕ンパ ク質を確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質または その部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
( iv) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドを発現する形質転 換体等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該受容 体夕ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該夕ンパク質 を確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその 部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの 定量は具体的には以下のようにして行なう。
(i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラッ卜、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラッ 卜、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例 えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間 経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織また は細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝 液、 へぺス緩衝液など） 等に懸濁し、 臓器、 組織あるいは細胞を破壊し、 界面 活性剤 （例えば、 トリトン X100TM、 ツイ一ン 20TMなど） などを用い、 さ らに遠心分離や濾過、 カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮ一リングプレンダ一ゃポ リトロン （Kinematica社製） のよる破碎、 超音波による破砕、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙 げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清を さらに高速 （15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠 心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕ー蛋 白質等と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドは、 例えば、 本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、 ウエスタンプロット 解析などにより定量することができる。
かかるサンドィツチ免疫測定法は前述の方法と同様にして行なうことができ、 ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。
(i i ) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体を前述の方法に従い作製し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター蛋 白質またはその部分べプチドを定量することができる。
細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を変 化させる化合物のスクリ一ニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前ないし 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前ないし 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前） もしくは 一定時間後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より 好ましくは 1時間後ないし 2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレス と同時に被検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後ないし 3曰後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、より好ましくは 1時間後ないし 2 4時間後）、 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を定量 することにより行なうことができ、
(i i ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後ないし 7日後、 好ましくは 1日後ないし 3日後、 より 好ましくは 2日後ないし 3日後） 、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質 またはその部分べプチドの量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセブ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの 確認は具体的には以下のようにして行なう。
(i i i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラッ ト、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例 えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間 経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織また は細胞等を、 常法に従い組織切片とし、 本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。 細胞表層での該受容体夕ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞 膜上の該タンパク質を確認することにより、 定量的または定性的に、 細胞膜に おける本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を確認すること ができる。
(ίν) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞 膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させ る作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 細胞膜における本発明のレ セプ夕一蛋白質またはその部分べプチドの量を増加させることにより、 G蛋白 質共役型レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセ チルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生 成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合物、 （口） 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質または その部分べプチドの量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる 化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であつてもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等の生理 活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等の生理 活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組 成物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カブ セル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとす ることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ卜ゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 高血圧症患者 （6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 O m gである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 高血圧症患者 （6 0 k g として） においては、 一日につき約 0 . 0 1〜3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g程度、 より好ましくは約 0 . 1〜1 O m g程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
( 1 1 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの 量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防およびノまたは治療剤
本発明のレセプ夕一蛋白質は前述のとおり、 例えば中枢機能など生体内で何 らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 細胞膜における本発 明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物は、 本 発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療 剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およ び/または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することが できる。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキ シル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形 で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担 体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に 認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容 量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に 従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マ ンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例え ば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコ —ル、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベー ト 8 0 TM、 H C〇— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一 ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 高血圧症患者 （6 0 kgとして） においては、 一日につき約 0。 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 高血圧症患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
(12) 本発明のレセプ夕一蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対 する抗体による中和
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する 抗体の、 それらレセプ夕一蛋白質などに対する中和活性とは、 即ち、 該レセプ 夕一蛋白質の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。 従つ て、 該抗体が中和活性を有する場合は、 該レセプ夕一蛋白質の関与するシグナ ル伝達、 例えば、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白 質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑 制する活性など） を不活性化することができる。 従って、 該レセプタ一蛋白質 の過剰発現などに起因する疾患の予防および または治療に用いることができ る。
(13) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする DNAを有す る動物の作製
本発明の DNAを用いて、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を発現するトランス ジエニック動物を作製することができる。 動物としては、 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など (以下、 動物と略記する場合がある） が挙げれるが、 特に、 マウス、 ゥサギな どが好適である。
本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 D N Aを動物細胞 で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用 いるのが一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の D NAを転移させ る場合、 これと相同性が高い動物由来の本発明の D N Aを動物細胞で発現させ うる各種プロモ一夕一の下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥ サギ受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のレセプ夕一 蛋白質等を高産生する D N A転移動物を作出できる。 このプロモーターとして は、 例えば、 ウィルス由来プロモーター、 メタ口チォネイン等のュビキアスな 発現プロモー夕一も使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現する N G F遺 伝子プ口モータ一ゃェノラ一ゼ遺伝子プロモータ一などが用いられる。
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 対象動物の胚芽細胞およ び体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽 細胞において本発明のレセプ夕一蛋白質等が存在することは、 作出動物の子孫 が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明のレセプター蛋白質等を有する ことを意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞およ び体細胞の全てに本発明のレセプ夕一蛋白質等を有する。
本発明の D N A転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認 して、該 D N A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さらに、 目的 D N Aを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子 を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交 配することによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することが できる。
本発明の D N Aが転移された動物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等が高発現 させられているので、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するァゴニストまたは アン夕ゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用である。
本発明の D N A転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することも できる。 例えば、 本発明の DNA転移マウスの組織中の DNAもしくは RNA を直接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプ夕一蛋白 質が存在する組織を分析することにより、 本発明のレセプ夕一蛋白質等につい て分析することができる。 本発明のレセプ夕一蛋白質等を有する組織の細胞を 標準組織培養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由 来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。 また、 その細胞を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高めるような 医薬の選択も可能である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明の レセプター蛋白質等を単離精製することも可能である。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あ るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 ま たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示 すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸
c DNA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シ卜シン
RNA ： リボ核酸
mRNA ：メッセンジャーリポ核酸
dATP
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸
d CTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ： ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 バリン
L e u ロイシン
l i e
S e r セリン
Th r ス,レオニン
C y s システィン
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
A s ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリプトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G i n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
Me メチル基
E t ェチル基
Bu ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン— 4 (R) 力ルポキサミド基
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記
する, To s ： p—トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
B z 1 ：ベンジル
Cl¾Bzl ： 2， 6—ジクロ口べンジル
Bom ：ベンジルォキシメチル
Z ：ベンジルォキシカルボニル
C 1 -Z ： 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r -Z ： 2—プロモペンジルォキシカルポニル
B 0 c ： t _ブトキシカルボニル
DNP ：ジニトロフエノール
T r t ： トリチル
Bum ： t一ブトキシメチル
Fmo c ： N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズ卜リアゾ一ル
HOOB t ： 3， 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一
1, 2, 3—ベンゾトリアジン
HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルボルネン- 2, 3-ジカルボキシイミド
DCC ： N、 N' —ジシクロへキシルカルポジイミド
本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のラット脳幹周辺部由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 r OT 7T009 Cのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
本発明のラット脳幹周辺部由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 r OT 7 TO 09 Tのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のラット脳幹周辺部 由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 r ΟΤ7Τ 009 Cをコードする c DN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 4〕
配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のラット脳幹周辺部 由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 r〇T7T 009 Tをコードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
本発明のラット脳幹周辺部由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 rOT 7 T 009 Cおよび r〇T 7Τ009Τをコ一ドする c DNAをクロ一ニング するために使用したプライマ一 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
本発明のラット脳幹周辺部由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 r〇T 7 T 009 Cおよび r OT7T 009 Tをコードする c DNAをクローニング するために使用したブライマー 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
本発明のヒト胎児脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h〇T 7Τ0 09のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のヒト胎児脳由来新 規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 h〇T 7 T 009をコードする c DNAの 塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
本発明のヒト胎児脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 hOT 7 T 0 09をコードする c DNAをクロ一ニングするために使用したプライマ一 3の 塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
本発明のヒト胎児脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 hOT 7T0 09をコードする c DNAをクローニングするために使用したプライマ一 4の 塩基配列を示す。
〔配列番号： 11〕
本発明のヒト胎児脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 hOT 7T0 09をコ一ドする c DNAをクローニングするために使用したプライマ一 5の 塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 2〕
本発明のヒト胎児脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h〇T 7 TO 0 9をコードする c DNAをクローニングするために使用したプライマー 6の 塩基配列を示す。
後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia colODH l O B/pAK— rOTO 0 9 Cは、平成 1 0年 1 0月 1 9日から通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6 5 50として、平成 1 0年 1 0月 0 1日から財団法人 '発酵研究所（ I FO) に寄託番号 I FO 1 62 0 8として寄託されている。
後述の実施例 2で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli)DH 1 0 BZpAK— h〇T 0 0 9は、平成 1 0年 1 2月 2 1日から通商 産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM B P- 66 1 0として、 平成 1 0年 1 2月 0 7日から財団法人 ·発酵研究所 （ I FO) に寄託番号 I F〇 1 622 3として寄託されている。
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の 範囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレ キユラ— .クロ—ニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 実施例 1 ラット脳幹周辺部脳幹周辺部の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 をコ一ドする c DN Aのクローニングと塩基配列の決定
ラット脳幹周辺部脳幹周辺部 cDNAを銬型とし、 2個のプライマ一、 ブラ イマ一 1 (配列番号： 5) およびプライマー 2 (配列番号： 6) を用いて PC R反応を行った。 該反応における反応液の組成は上記 c DNAの 1 0分の 1量 を铸型として使用し、 Ad v an t a g e c DNA P o l yme r a s e M i x (CLONTECH社） 1/5 0量、 プライマ一 1 (配列番号： 5) およ びプライマー 2 (配列番号： 6) を 各 0. 2 M、 dNTP s 2 0 0 uM, および酵素に添付のバッファーを加え、 5 0 1の液量とした。 PCR反応は、 ① 94。C · 2分の後、 ② 94°C · 30秒、 72°C · 2分のサイクルを 3回、 ③ 94°C · 30秒、 68°C · 2分のサイクルを 3回、 ④ 94で · 30秒、 6 4T: · 30秒、 68 °C 2分のサイクルを 30回繰り返し、 ⑤最後に 68°C · 8 分の伸長反応を行った。 該 PC R反応後の反応産物を TAクローニングキット ( I n V i t r o g e n社）の処方に従いプラスミドベクタ一 p CR 2. 1 ( I n v i t r o g e n社)へサブクローニングした。 これを大腸菌 DH 5ひに導入 し、 cDNAをもつクローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した 後、 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白質共役型レセプタ一蛋 白質をコードする cDNA配列 （配列番号： 3および 4) を得た。 この cDN Aより導き出されるアミノ酸配列 （配列番号： 1および 2) を含有する新規 G 蛋白質共役型レセプター蛋白質を rOT7T 009 (配列番号： 1を含有する 蛋白： r OT 7 T 009 C ；配列番号： 2を含有する蛋白： r〇T 7 T 009 Τ) と命名した。
本発明のラット脳幹周辺部脳幹周辺部由来の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白 質 r〇T7T009 Cをコードする cDNA (配列番号： 3 ) がサブクロ一二 ングされたプラスミド pAK— r OT009 Cを、 自体公知の方法に従い大腸 菌（Escherichiacoli) DH 10 Bに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli) DH 10 B/p AK— r〇T 009 Cを得た。 実施例 2 ヒト胎児脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h〇T 7 T 009の c DN Aのクローニングと塩基配列の決定
ヒト胎児脳 cDNA (CLONTECH社） を铸型とし、 2個のプライマー、 プライマ一 3 (配列番号： 9) およびプライマー 4 (配列番号： 10) を用い て PC R反応を行った。 該反応における反応液の組成は上記 c DN Aの 25分 の 1量を銹型として使用し、 Ad V a n t a g e c DNA P o 1 yme r a s e Mi x (CLONTECH社） 1Z50量、 プライマー 3 (配列番号： 9) およびプライマ一 4 (配列番号： 1 0) を 各 0. 2 iM、 dNTP s 2 00 M、 および酵素に添付のバッファ一を加え、 25 1の液量とした。 P CR反応は、 ① 94 : · 2分の後、 ② 94°C · 20秒、 70°C · 2分のサイ クルを 3回、 ③ 94°C · 20秒、 66°C ' 20秒、 68 °C · 2分のサイクルを 3回、 ④ 94 · 20秒、 62°C · 20秒、 68で · 2分のサイクルを 32回 繰り返し、 ⑤最後に 68°C · 7分の伸長反応を行った。 該 PC R反応後の反応 産物を TAクローニングキット（I nv i t r og e n社）の処方に従いプラス ミドベクター p CR 2. 1 ( I n V i t r o g e n社）へ サブクロ一ニングした。 これを大腸菌 DH 5 αに導入し、 c DNAをもつクローンをアンピシリンを含 む LB寒天培地中で選択した後、 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする cDNA配列 （配列番号： 8) を得た。 この cDN Aより導き出されるアミノ酸配列 （配列番号： 7を含有す る新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質を h〇T7T009と命名した。
上記クローンから自体公知の方法に従いプラスミドを精製し、 それを铸型と して、 2個のプライマ一、 プライマー 5 (配列番号： 11) およびプライマ一 6 (配列番号： 12) を用いて PCR反応を行った。 該反応における反応液の 組成は上記プラスミド約 100 p gを铸型として使用し、 Adv an t age c DNA Po l yme r a s e M i x (CLONTECH社） 1Z50量、 プライマ一 3 (配列番号： 9) およびプライマー 4 (配列番号： 10) を 各 0. 2 M、 dNTP s 200 M、 および酵素に添付のバッファーを加え、 2 5 p.1の液量とした。 PCR反応は、 ① 94°C · 2分の後、 ② 94 · 20 秒、 72 · 2分のサイクルを 3回、 ③ 94°C · 20秒、 68 °C ' 2分のサイ クルを 3回、 ④ 94°C · 20秒、 64°C · 20秒、 68°C · 2分のサイクルを 25回繰り返し、 ⑤最後に 68で · 7分の伸長反応を行った。 該 PC R反応後 の反応産物を T Aクロ一ニングキッ卜（ I n V i t r 0 g e n社）の処方に従い プラスミドベクター p CR 2. 1 ( I n V i t r oge n社）へ サブクロ一ニン グした。
これを自体公知の方法に従い大腸菌 （Escherichia coli) DH5 aに導入し て、 形質転換体：大腸菌 （Escherichia col i) DH5 a/pCR2. 1 -hO TO O 9を得た。 さらにこのプラスミドから制限酵素 SallZSpelによって切り 出した本発明のヒト胎児脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h〇T 7 TO 09をコードする c DNA (配列番号： 8) がサブクローニングされたプ ラスミド pAK— hOTO 09を、 自体公知の方法に従い大腸菌 （Escherichia coli) DH10Bに導入して、 形質転換体：大腸菌 （Escherichia coli) DH 10 B/pAK-hOT 009を得た。 実施例 3 ΓΟΤ7Τ009発現 CH〇細胞の樹立
直径 1 0 cmの組織培養用シャーレに 5 X 1 05個の CHO dhfr細胞を播 種し、 24時間培養した。 実施例 1で得られた rOT7T009C 発現ベクター pAK-rOT009C を 1 0 g 用い、 非リボソーム法による遺伝子導入キット (FuGENE6 トランスフエクシヨンリージェント、 ベーリンガーマンハイム 社） を用いて、 DNA*試薬の複合体を形成させた。 培地を新鮮なものに交換 し、 これに DNA*試薬の複合体を添加して 3 0時間ィンキュベートした。 そ の後、 トリプシン- EDTA処理によってシャーレ内の細胞を回収し、 形質 転換体選択用の培地で、 細胞密度が希薄な状態にて再培養を行うことによ つて、 形質転換体の割合の増加を図った。 これにより、 rOT7T009Cを安定に 高発現する細胞株 CH〇— Γ ΟΤ 7 Τ 00 9 Cのクローンを得た。
選択した Γ0Τ7Τ009発現 CHO細胞から常法に従い、 全 RNAを抽出した後、 T a qM a n法により r〇T 7 T 0 0 9 Cの mRNA量を測定'コピー数を算 出した。 結果を下表に示す。
クローン No. 発現量 （コピー Zng全 RNA)
3 6335
5 4669
14 4678
18 5852
20 7602
21 3400
28 5500
29 4917 産業上の利用可能性
本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたは その塩、 該レセプタ一蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレ ォチド （例えば、 D N A、 R N Aおよびそれらの誘導体） は、 ①リガンド （ァ ゴニスト） の決定、 ②抗体および抗血清の入手、 ③組換え型レセプ夕一蛋白質 の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系の開発と医薬 品候補化合物のスクリーニング、 ⑤構造的に類似したリガンド · レセプターと の比較にもとづいたドラッグデザインの実施、 ⑥遺伝子診断におけるプローブ や P C Rプライマーの作成のための試薬、 ⑦トランスジエニック動物の作製ま たは⑧遺伝子予防 ·治療剤等の医薬等として用いることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有することを特徴とする G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質また はその塩。
2 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が 配列番号： 2または配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列である請求項 1記 載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩。
3 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分べプチドまたはそ の塩。
4 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列を 有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
5 . D N Aである請求項 4記載のポリヌクレオチド。
6 . 配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 8で表される塩基配列を有 する請求項 4記載のポリヌクレオチド。
7 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一。
8 . 請求項 7記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
9 . 請求項 8記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセ プ夕ー蛋白質を生成せしめることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質共役型 レセプター蛋白質またはその塩の製造法。
1 0 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載 の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
1 1 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達を不活 性化する中和抗体である請求項 1 0記載の抗体。
1 2 . 請求項 1 0記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 3 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載 の部分ペプチドまたはその塩を用いることにより得られうる請求項 1記載の G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド。
1 4 . 請求項 1 3記載の G蛋白質共役型レセプターのリガンドを含有してなる 医薬。
1 5 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは請求項 3記載 の部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 請求項 1記載の G蛋 白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法。
1 6 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載 の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 リガンドと請求項 1 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる 化合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 7 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載 の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 リガンドと請求項
1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させ る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 8 . 請求項 1 6記載のスクリーニング方法または請求項 1 7記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役 型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
1 9 . 請求項 1 6記載のスクリーニング方法または請求項 1 7記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役 型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩 を含有してなる医薬。
2 0 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェン卜な条件下でハ ィブリダイズするポリヌクレオチド。
2 1 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を 含有してなるポリヌクレオチド。
2 2 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴と する請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の m R N Aの定量方法。
2 3 . 請求項 1 0記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白 質共役型レセプタ一蛋白質の定量方法。
2 4 . 請求項 2 2または請求項 2 3記載の定量方法を用いることを特徴とする 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診断剤。
2 5 . 請求項 2 2記載の定量方法を用いることを特徴とする、 請求項 1記載の , G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング方法。
2 6 . 請求項 2 3記載の定量方法を用いることを特徴とする、 細胞膜における 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質量を変化させる化合物または その塩のスクリ一ニング方法。
2 7 . 請求項 2 5記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 請求項 1記 載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその 2 8 . 請求項 2 6記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 細胞膜にお ける請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質量を変化させる化合物ま たはその塩。
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