WO2000022123A1

WO2000022123A1 - Nouvelle proteine war-1 et son gene

Info

Publication number: WO2000022123A1
Application number: PCT/JP1999/005631
Authority: WO
Inventors: Naoki Tohdoh; Tadahiko Yoshima; Kazuo Komiya; Shinichiro Tojo; Kiyomitsu Nemoto; Hironori Ishikawa; Hajime Okuyama
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Priority date: 1998-10-13
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2000-04-20
Also published as: AU6121799A; EP1122312A4; EP1122312A1

Description

明細書新規なタンパク質 WA R— 1及びその遺伝子技術分野

本発明は、 WA R— 1と称される新規なタンパク質およびその遺伝子に関する。さらに詳しくは、癌細胞に対する増殖阻害活性を有する新規なタンパク質 WA R —1、該 WA R— 1をコードする遺伝子、前記 WA R— 1に対する抗体、あるいはこれらの物質の、診断及び治療における用途などに関する。

さらに、本発明は、脳において特異的な発現が認められる小胞体膜タンパク質である WA R— 1ポリぺプチドまたはそれをコードする遺伝子を有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤に関する。

背景技術

近年、制癌剤の開発は、細胞の複製'遺伝子の転写や翻訳というセントラルドダマをターゲットにしたものをはじめ、シグナノレ伝達、分化、細胞周期、代謝、アポトーシス、テロメレース等に着目したものなど、様々な方面からの薬剤の開発が進められている。しカゝし、未だ決定的な薬剤が見出されたとは言えない状況にあり、新たなメ力二ズムに基く制癌剤の創生が望まれている。

ところで、シグナルペプチドを有するタンパク質の m R N Aは、シグナル配列が合成された後に小胞体膜を透過し、その後小胞体内で翻訳の起こることが知られている。この小胞体膜輸送（小胞体膜透過）に関与する因子として、 T R AM と称する因子の存在が知られている（GSrlich et al. , Nature, 357， 47 - 52， 1992)。

通常、小胞体の膜を輸送されるタンパク質の m R NAは、細胞質へ輸送後リボゾームと結合し、翻訳が開始され、膜透過に必要なシグナル配列がシグナル配列認識タンパク質に結合する。その後、複合体はシグナル配列認識タンパク質レセプターに結合し、小胞体膜上に固定される。次いで、シグナル配列認識タンパク質から解離した翻訳タンパク質とリボゾーム複合体は、 S e c 6 1 pと結合し、その際、小胞体膜上に存在する T R AMがシグナル配列を認識して、複合体に会合する。その後、翻訳されたタンパク質は S e c 6 1 pを介して小胞体のルーメン側に輸送されると考えられている（Jungnickel et al. , Cell, 82, 261-270, 1995) 。以上のような小胞体膜輸送のメカニズムには例外もあり、ある種のシグナル配列を有するタンパク質の小胞体膜輸送には、 T RAMは必ずしも必要ではないことも知られている（Voigt et al., J. Cell Biol., 134, 25-35, 1996) 。このような小胞体膜輸送に関与する TRAMに対し、そのアミノ酸配列および塩基配列に相同性（ホモロジ一）を有する因子が存在しているとの報告は、急性骨髄性白血病細胞で見出された K I AA0057遺伝子 (Nomura et al.， DNA Res. , 1， 223 - 229, 1994)以外なされていない。また、それらの因子と前記癌との関連などについても、何ら報告はなされていない。

発明の開示

本発明は、新規なタンパク質 W A R _ 1およびその遺伝子を提供することを目的とする。すなわち本発明は、構造的には TRAMと高い相同性を有しており、機能的には癌細胞に対する増殖阻害活性を有する新規なタンパク質である WAR ー1、該 WAR— 1をコードする遺伝子、前記 WAR— 1に対する抗体、あるいはこれらの物質の、診断及び治療における用途を提供することを目的とする。また、本発明の目的は、小胞体膜タンパク質である WAR— 1ポリペプチドまたはその一部、またはそれらをコードする遺伝子を有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤を提供することである。

本発明者らは、種々の新規な c DN Aのクロ一ニングを目的として、幼若ラット cDNAライブラリ一からランダムにクロ一ンの選択を行っていた。その過程において、シグナルペプチドを有するタンパク質の小胞体膜輸送（小胞体膜透過）に関与する TRAM (Gorlich et al. , Nature, 357, 47-52， 1992) や K I ΑΑΟ 057 (Nomura et al., DNA Res., 1, 223-229, 1994)と高い相同性を有する新規なタンパク質をコードする遺伝子のクローニングに成功した。本発明者らはこの新規なタンパク質を WAR— 1と命名した。該 WAR— 1は前記のように構造上、 TRAMと相同性を有する因子であつたが、機能については皆目不明であった。本発明者らはさらに検討を続けた結果、該 WAR— 1遺伝子を癌細胞内で発現させることにより癌細胞の増殖が阻害されること、すなわち本発明の WA R- 1は癌細胞の増殖阻害活性を有するものであることが明らかとなった。従つて本発明の WA R— 1、又は該 WA R— 1をコードする遺伝子を有効成分として含有する医薬は、新規な抗癌剤として利用できるものと考えられる。ちなみに本発明の WA R— 1は、悪性度の高い肉腫の癌の増殖をも抑制するものであることから、臨床上の有用性が期待される。

さらに、 WA R— 1遺伝子の組織及び種々の癌細胞での発現を検討した結果、該 WA R— 1遺伝子は、肝臓、肺、リンパ系組織（脾臓、胸腺、白血球）などの組織においては通常発現が認められないが、癌化することによって特異的に発現してくることが明らかとなった。従って本発明の WA R— 1遺伝子の部分断片、又は該 WA R— 1に対する抗体などが、これらの癌の診断に利用できるものと考えられる。

また、本発明者らは、分泌タンパク質の小胞体への膜輸送に関わるタンパク質

WA R— 1の遺伝子が成熟したラット脳で過剰に発現していることに着目し、当該遺伝子のグリア細胞における発現上昇により神経突起伸展作用を有するタンパク質の分泌が増大していることを示す事象を捉えた。さらには、該遺伝子の発現増加により、生体内のグリア細胞または神経細胞自身が実際に産生している複数の神経栄養因子の分泌が促進されることを見出した。

より詳細には、本発明者らは、配列番号： 1に記載されたラット型 WA R— 1 (以下、本明細書においては r WA R— 1と略すことがある）遺伝子が脳のみならず網膜でも発現していることを明らかとし、また、配列番号： 2に記載されたヒト型 WA R— 1 (以下、本明細書においては h WA R— 1と略すことがある）遺伝子が脳全体に発現していることに加えて脊髄でも発現が認められること力ら、中枢神経領域のみならず末梢神経領域においても特異的に発現していることを明らかにした。さらに、 h WA R— 1遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクターを感染させたヒトグリア芽細胞腫株である T 9 8 G細胞の培養上清中に、ラット副腎褐色細胞腫由来の P C 1 2細胞に対して神経突起伸長作用を有する神経栄養因子が増加していることを見出した。

本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。

即ち本発明は、

( 1 ) 以下の（a ) 又は（b ) のタンパク質をコードする D NA、 ( a ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質 ( b ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質

(2) 以下の（c) 又は（d) の DNA、

(c) 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DN A

(d) 前記（c) の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力、つ癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコ一ドする D N A

(3) 酉 fi列番号： 1又は配列番号： 3に記載の DN Aの全部又は一部をプロ一ブに用いて染色体 DN Aライブラリ一からクローニングされる、前記（2) 記載の DNA、

(4) プロモーター領域を含むことを特徴とする、前記（3) 記載の DNA、

(5) 受託番号 FERM BP— 6910、又は受託番号 FERM BP— 6 91 1で表示される微生物が有する、前記（1) 又は（2) 記載の DNA、

(6) 前記 (1) 〜（5) いずれか記載の DNAを発現することによって得られるタンパク質、

(7) 前記（1) 〜（5) いずれか記載の DN Aを含有する組換え発現べクタ

(8) 前記（1) 〜（5) いずれか記載の DN Aを含有する組換えアデノウィノレスベクター、

(9) 前記（7) 又は（8) 記載の組換え発現ベクターによって形質転換された形質転換細胞、

(10) 前記 (1) 〜（5) いずれ力、記載の DNAの全部又は一部よりなる 1 本鎖又は 2本鎖 DNAであって、かつ配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列よりなる DNAの発現を特異的に検出し得る、ハイプリダイゼーシヨンプローブ又は PCRプライマー用の DNA、

(1 1) 以下の配列よりなる、前記（10) 記載の DNA、

5，側プラィマー配列； 5' -CACCTGGCTGGATCGCAGAATCGG-3' (配列番号： 7 ) 3，側プラィマー配列； 5' -CTCTTTCCTCTTTGGCGGACAGTC-3' (配列番号： 8 ) (1 2) 前記（10) 又は（1 1) 記載の DNAを、ハイブリダィゼーシヨンプローブ又は PCRプライマ一として用いることを特徴とする、配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列よりなる DN Aの発現の検出方法、

(1 3) 前記（6) 記載のタンパク質に結合する抗体、

(14) 前記 (13) 記載の抗体を用いることを特徴とする、配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列よりなるタンパク質の発現の検出方法、

(1 5) 前記 (12) 又は（14) 記載の検出方法よりなる、癌の診断方法、

(1 6) 前記（1) 〜（5) いずれか記載の DNA、又は前記 (6) 記載のタンパク質のいずれかを有効成分として含有する医薬、

(1 7) 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列よりなる D N Aの発現を増加させることを特徴とする、癌細胞増殖阻害剤、

(1 8) 前記（1) 〜（5) いずれ力記載の DN Aを有効成分とする、癌細胞増殖阻害剤、

(1 9) アデノウイルスベクターを用いることを特徴とする、前記（18) 記載の癌細胞増殖阻害剤、

(20) 以下の（a) 又は（b) のタンパク質をコードする DNAを有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤、

( a ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質

( b ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列のうち 1若しくは数個または複数個のァミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたァミノ酸配列からなり、かつ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質

(21) 以下の（c) 又は（d) の DNAを有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤、

(d) 前記（c) の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力、つ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質をコ一ドする D N A

(22) 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の DN Aの全部又は一部をプロ一ブに用レ、て染色体 D N Aライブラリーからクローニングされる DNAを有効成分とする、前記 (21) 記載の神経栄養因子分泌促進剤、 (23) プロモーター領域を含むことを特徴とする D N Aを有効成分とする、前記（22) 記載の神経栄養因子分泌促進剤、

(24) 受託番号 FERM B P— 6910、又は受託番号 FERM BP—

691 1で表示される微生物が有する DNAを有効成分とする、前記（20) 又は（ 21 ) 記載の神経栄養因子分泌促進剤、

(25) DNAが組換え発現ベクターに含まれていることを特徴とする、前記

(20) 〜 (24) いずれか記載の神経栄養因子分泌促進剤、

(26) DNAがアデノウィルスベクターに含まれていることを特徴とする、前記（25) 記載の神経栄養因子分泌促進剤、

(27) 以下の（a) 又は（b) のタンパク質を有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤、

( a ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質 ( b ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列のうち 1若しくは数個または複数個のァミノ酸が欠失、置換及びノ又は付加されたァミノ酸配列からなり、かつ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質

(28) 以下の（c) 又は（d) の DNAによってコードされるタンパク質を有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤、

(d) 前記（c) の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力つ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質をコードする DNA

(29) 受託番号 FERM B P_ 6910、又は受託番号 FERM BP— 691 1で表示される微生物が有する DNAによってコードされるタンパク質を有効成分とする、前記（27) 又は（28) 記載の神経栄養因子分泌促進剤、

(30) 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の DN Aの発現を増強する物質または配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の産生を増強する物質を有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤、

(31) 前記（20) 〜（30) いずれか記載の神経栄養因子分泌促進剤を含有する神経変性疾患治療剤、ならびに

(32) 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列よりなる D N Aの発現を増強すること、または配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の産生を増強することを特徴とする、神経栄養因子の分泌促進方法、に関する。

本発明の第 1の態様は、新規なタンパク質 WAR— 1と該 WAR— 1をコードする DNAに関する。

本発明の DNAのうちタンパク質をコードするものとしては、新規なタンパク質 WAR— 1をコ一ドする DNA、又は該 WAR— 1をコードする DN Aに類似の DN Aであって、かつ癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコードする DNAであれば特に限定されない。具体的には、以下の 1) 〜3) の DNAが例示される。

1) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA、あるいは配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA。

2 ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコードする D N A。

3 ) 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコ一ドする DNA。

以下、これらの DNAにっき順次説明する。

1) WAR— 1をコードする DNA

前記 DNAのうち、「配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA」、「配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA」とは、本発明のラット WAR— 1をコードする DNAである。また「配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA」、「配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA」とは、本発明のヒト WAR— 1をコードする D NAである。このような、本発明のラットおよびヒト WAR— 1をコードする D NAは、以下の如く寄託がなされている。

すなわち、配列番号： 1に記載のラット WAR— 1をコードする DNAをべクター p B 1 u e s c r i p t I Iに組み込んだ p r WAR- 1を含有する大腸菌 E. c o l l DH 5 α ( p r WA R _ 1 ) 、及び、配列番号： 3に記載のヒト WAR— 1をコ一ドする DN Aをベクター p B l u e s c r i p t I Iに組み込んだ p h WAR— 1を含有する大腸菌 E. c o l i DH5 a (p hWAR 一 1 ) は、茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号、工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれ受託番号 FERM P— 1 701 8および FERM P— 1 70 1 9で寄託されている（受託曰：いずれも平成 10年 10月 6日）。その後、国際寄託へ移管された（受託番号： B P— 6910および B P-691 1、国際寄託への変更日：いずれも平成 11年 10月 7日）。

2) WAR— 1の改変体又は変異体をコードする DNA

前記 D N Aのうち、「配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列のうち 1若しくは複数のァミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたァミノ酸配列からなり、かつ癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコードする DNAJ とは、人為的に作製したいわゆる改変体（改変タンパク質）や、生体内に存在する変異体のうち、癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコードする DN A を指す。

前記改変体をコードする DN Aは、例えば制限酵素ゃヌクレアーゼ等を用いる方法、部位特異的変異導入方法 (W. Ito et al.， Gene, 102, 67-70 (1991)) 、または PC R法（Molecular Cloning, 2nd Edt. Cold Spring Harbor

Laboratory Press (1989) ) などによって、当業者ならば容易に作製することができる。

ここで、「欠失、置換及び/又は付加」されるアミノ酸残基の数は、上記部位特異的変異導入法等の周知の方法により欠失、置換及び Z又は付加できる程度の数を指す。

さらに、前記の如き遺伝子工学的手法を用いずに、細胞を変異原物質に曝すことによっても、当該改変体をコードする D N Aを作製することが可能である。前記変異体をコードする D N Aとは、生体内にぉレ、て自然に生じるものを指す。すなわち、塩基及びアミノ酸の欠失、置換または付加は、自然界に存在する、例えば癌のような場合や種差によっても生じることがあり、このような自然に生じた変異体をコードする DNAも、癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコードするものである限り、本発明の DN Aの範疇に含まれる。

前記改変等を施した DN Aが癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコードするものである力否かは、例えば以下の方法により測定することができる。すなわち、前記改変を施した DN A等、本発明の DN Aの候補となる DN Aを発現べクタ一に組み込み、これをヒト由来の癌細胞株に導入する。ここで癌細胞株としては、例えば T98Gなどのヒトグリア芽細胞腫を用いることが好ましい。発現ベクターとしては、非ウィルスベクター、ウィルスベクターのいずれであつても、ヒト由来の癌細胞株において発現可能なベクターであれば特に限定されなレ、（該発現ベクターについては後に詳述する）。該組換え発現ベクターを癌細胞株に導入し、培養した後に、細胞数や細胞の形態変化を観察する。このとき、外来 DN Aを組み込んでいない発現ベクターを用いて全く同じ操作を行うことにより調製された細胞をコントロールとし、比較することが重要である。コントロール細胞と比較して細胞数の減少、あるいは細胞の形態変化が観察された場合は、前記候補 D N Aは癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコードするものであると判断することができる。

さらに、前記の遺伝子導入細胞において³ Hで標識されたチミジンの取り込み能の低下を測定すること（Nagase et al. , Int. J. Cancer, 65, 620-626， 1996) 、あるいは癌細胞を接種したヌ一ドマウスに対して前記候補 DNAを有するアデノウイルスを感染させた後に、腫瘍形成能の低下を測定すること（Cheney et al., Cancer Res. , 58, 2331-2334， 1998) などによっても、癌細胞の増殖阻害活性を有するか否かを測定することができる。

3 ) WA R— 1 DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A 前記 DNAのうち、「配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、かつ癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコードする DNA」とは、例えば、

A) 脊椎動物全ての WAR— 1をコードする c DNA、又は該 WAR— 1の部分タンパク質をコードする c DNA、

B) 脊椎動物全ての WAR— 1をコードする染色体 DNA、のような、配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列からなるラット又はヒト WAR— 1 DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイス、する DN A のうち、癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコードするものを指す。ここで、「ストリンジェント条件下でハイブリダィズする DNA」とは、例えばハイブリダイゼーション緩衝液として 0. 1% SDS、 50 %ホルムァミド、

5 x SSC、 1 X D e n h a r d t試薬、 250 μ g 1サケ精子 D N Aの組成の溶液を用いて、 42 °Cでー晚ハイブリダィズした後、 2 X S SCを用いて室温で 1時間洗浄、 2 x SSC、 0. 1% SDSを用いて室温で 30分間、その後 0. l x SSC、 0. 1 %SDSを用いて 50〜65°Cで 30分洗浄するような条件下でハイブリダイズするような D N Aを指す。

前記 A) の DNAは、例えば配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の DNAの全部又は一部をプローブに用いたハイブリダィゼーシヨン、あるいは配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の DNAの一部をプライマーに用いた PC R等によりクローユングされるものであるが、具体的な c DNAライプラリーの作製、ハイブリダィゼーシヨン、 PCR、ポジティブコロニーの選択、塩基配列の決定等の操作はいずれも公知であり、例えはlolecular Cloning 2nd Edt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等を参照にして行うことができる。以下に、具体的なクローニング方法の一例にっレ、て記載する。

前記 A) の DNAは、例えば以下の工程 a) 〜b) を含む方法により単離することができる。

a) 所望の種由来の組織あるいは培養細胞株より全 RNAを調製し、ポリ（A) RNAを精製し、 cDN Aライブラリ一を作製する工程。

b) 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列の全部又は一部よりなるプローブを調製し、該プローブを用いて前記 a) で作製した c DNAライブラリーとのハイブリダィゼーション反応を行うことにより目的の DN Aを単離する工程。ここで、前記 a) 工程における全 RNAの調製は、常法に従って行えば良いが、例えば S DS、 NP— 40、 T r i t o n-X 100等の界面活性剤もしくはフェノ一ル存在下で細胞を処理することにより、細胞を分解する方法が挙げられる。また、ホモゲナイザー等の物理的方法によって細胞を破砕し、グァニジンチオシァネートで細胞を処理した後、塩化セシウム密度勾配遠心によって全 RNAを沈澱ィ匕させる、または、グァ-ジンチオシァネ一ト存在下で細胞を処理した後、酸性条件下フエノ一ル処理（酸性グァニジンチオシァン酸ーフエノ一ルク口口ホルム法）することによって全 RNAを調製する方法も挙げられる。次に上記方法のいずれかによつて得られた細胞の全 RNAからポリ（A) RNA (mRNA) を精製するには、オリゴ（dT) —セルロース、ポリ Uを結合したポリ U—セファ口一スなどのァフィ二ティ一カラムを用いる力 \ mRNAの長さが判明している場合もしくは更に m R N Aの長さに基づ！/、て分画した!/、場合には、ショ糖密度勾配遠心法、ァガロースゲル電気泳動、カラムによるゲルろ過法等を用いて調製することができる。上記の如くして得られた mRNAより c DNAライブラリ一を作製する方法としては、例えば mRNAを铸型として一本鎖 c DN Aを合成し、次いで二本鎖 c DN Aを合成して適当なベタターに組み込んで宿主大腸菌に組換えベクターを導入する方法が挙げられる。ベクタ一としては、プラスミド及び; L ファージベクターが多用される。以下、該 c DNAライブラリーの作製法につき記述する。

まず、 mRNAを铸型とし、オリゴ（dT) プライマーもしくは末端に適当な配列を付加したオリゴ（dT) プライマーまたは 6塩基からなるランダムプライマ一を用いて、逆転写酵素（トリ骨髄芽球性白血病ウィルス； AMV由来または、マウス白血病ウィルス； Mo— MLV由来）により mRNAと相補的な一本鎖 c DNAを合成する。次いで、アルカリ処理を行うことによって mRNAを分解した後、一本鎖 c DNAを踌型として逆転写酵素もしくは DNAポリメラーゼにより二本鎖 c DN Aを合成する。ここで二本鎖 c DN Aの合成は、直接 RNa s e H及び大腸菌 DNAポリメラーゼ Iを働力せることによつても行い得る。その後、いずれの方法においても、 S 1ヌクレアーゼ、 T4 DN Aポリメラーゼもしくは大腸菌 DN Aポリメラーゼ I (K 1 e n o w断片）等の酵素のいずれかを用いることによって合成された二本鎖 cDNAの両末端を平滑化する。得られた平滑末端化された二本鎖 c DN Aは適当なベクターに挿入する為に、リンカーゃァダプタ一等の化学合成 DNAまたは dG， d C鎖をデォキシターミナルトランスフエラーゼによって付加し、末端修飾を行う。次に、適当なベクターにこの二本鎖 c DN Aを組み込んだ後、大腸菌を形質転換して c DN Aライブラリーを作製する。ここで、プラスミドベクタ一に二本鎖 c DN Aを組み込み宿主大腸菌を形質転換する場合は、この DN Aを取り込むことの出来るコンビテント細胞の対数増殖期における細胞を集め、 Ha n a h a nが詳細に報告している方法

(J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)) に準じて形質転換を行えば良い。また、ファージベクターに二本鎖 c DN Aを組み込み宿主大腸菌を形質転換させる場合は、 T 4 D N Aリガーゼによつて連結された D N Aをインビトロパッケージングによりファージ粒子内に導入し、これを宿主大腸菌に感染させることによつて形質転換を行うことができる。

次に工程 b) であるが、 g己列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列の全部又は一部よりなるプローブを調製し、該プローブと前記で作製した c DNAライブラリーとのハイブリダィゼーシヨン反応を行うことにより目的の DN Aを単離することができる。ここでプローブは、例えば配列番号： 1又は配列番号： 3 に記載の塩基配列の適当な部分断片を DN A合成機により合成する力 \ あるいは PCRにより該部分断片を増幅し、その後ニックトランスレーション法又はランダムプライムラべリング法等の常法により該 D N A断片を³² Pで標識することにより作製することができる。ハイブリダィゼーシヨン反応としては、前述の条件が挙げられる。

前記 B) の DNA、すなわち WAR— 1をコードする染色体 DNAは、例えば配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の DN Aの全部又は一部、あるいは前記

A) に記載の DNAの全部又は一部などをプローブに用い、所望の種由来の組織、あるレ、は培養細胞株から調製された染色体 DNAライブラリーとのハイブリダイゼーションを行うことにより、クローニングすることができる。

ここで、染色体 DNAの調製及び染色体 DNAライブラリーの作製は、常法に従って行えば良い。すなわち、所望の種由来の組織もしくは培養細胞株を SDS 存在下で処理し、 RNa s e及びプロティナ一ゼ Kで不必要な RN A及びタンパク質を分解する。その後、フエノール処理を行い、エタノール沈澱もしくは透析によって染色体 DN Aを精製すれば良い。得られた染色体 DN Aを適当な制限酵素を用いて部分的に切断するか、クロ一ユングする断片の長さが判明している場合には、必要な制限酵素によって完全分解させる。クローユング用のベクターに外来遺伝子を導入する際に許容される D N Aの長さに応じて染色体 D N A切断断片を分画するためには、ショ糖密度勾配遠心、ァガロースゲル電気泳動、カラムによるゲルろ過法等を用いることができる。得られた切断断片を; Lファージべクターもしくはコスミドベクタ一に導入し、インビトロパッケージング後、ファージもしくはコスミドを用いた染色体 D N Aライブラリーを作製する。

WA R - 1をコ一ドする染色体 D N Aのクローニングを行うためには、前記のファージもしくはコスミドライブラリーを大腸菌に感染させ、 WA R— 1の c D N Aの全部又は一部をニックトランスレーション法もしくはランダムプライムラベリング法などで³² Pで標識したプローブを用い、常法（Molecular Cloning

2nd Edt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等を参照）に従いプラークもしくはコロニー 'ハイブリダイゼーションなどを行えば良レ、。

なお、以上のような染色体 D NAには、遺伝子の発現調節に関与する、いわゆるプロモーター領域が含まれており、該プロモータ一領域を含有する染色体 D N Aは、上記の手法により容易に取得することができる。

上記した本発明の種々の D N Aを発現ベクターに組み込むことにより、本発明の D NAを含有する組換え発現ベクターを作製することができる。さらに、該組換え発現べクタ一を宿主細胞に導入することにより、本発明の形質転換細胞を作製することができる。

該発現べクタ一は、非ウィルスベクター、ウィルスベクターのいずれかを問わず、本発明の D NAが挿入でき、該 D NAがコードするタンパク質の発現が可能なベクターであれば特に限定されない。ここで非ウィルスベクターとは、一般的な哺乳動物細胞発現プラスミドべクタ一であり、例えば p B K— CMV、 p C A G G S、 p c D NA 3 . 1、 p Z e o S Vなどが挙げられる。本発明の D N Aを組み込んだ非ウィルス性発現べクタ一の宿主細胞への導入法としては、リン酸一カルシウム共沈法、リボソームを用いて D N A分子を導入する方法（リボソーム法、リポフエクチン法、リポフエクトァミン法）、エレクト口ポレーシヨン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガンで坦体とともに D N A分子を細胞に移入する方法等が挙げられる。また宿主細胞としては、例えば H e L a、 C OS l、 A549、 293細胞などが挙げられる。

後者のウィルスベクターとしては、アデノウィルス及びレトロウイルス等のゥィルスべクタ一が代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウイ/レス、ボックスウイノレス、ポリオウイ/レス、シンビスウイ/レス、センダイウィルス、 SV40、免疫不全症ウィルス（H I V) 等の DN Aウィルスまたは RN Aウィルスに当該タンパク質をコードする遺伝子を導入し、細胞に組換えウィルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。その際の宿主細胞としては、例えば 293、 A549、 He La細胞などが挙げられる。

以上のような本発明の形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明の DNAからタンパク質を発現、生産することが可能である。ここで「好適な条件下」とは、その宿主細胞に適した培養用培地により、 37°C、 5%CO ₂存在下で培養するような条件を指す。

このような好適な条件下で培養した形質転換細胞より、前記本発明のタンパク質を単離し、精製することが可能である。ここで、本発明のタンパク質の粗抽出液を得る方法、また、該粗抽出液から本発明のタンパク質を精製する方法としては、例えば日本生化学会編、新生化学実験講座 1、タンパク質 I—分離.精製 - 性質一、 1 990に記載された方法を用いて行うことが可能である。

以上のようにして得られた本発明のタンパク質の具体例としては、例えば配列番号： 2に記載のァミノ酸配列よりなるラット WAR— 1、又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列よりなるヒト W A R— 1が挙げられる。

前記本発明のタンパク質の癌細胞増殖阻害活性は、以下のようにして測定することができる。すなわち、 T 98 Gなどの癌細胞の培養液中に本発明のタンパク質を添加する。その際、本発明のタンパク質を、あらかじめリボソームに封入したり、リピッドを結合させることにより、細胞膜への透過性を増しておく。また、タンパクの C末端に小胞体保持配列である Ly s—As p—G l u— L e u (K DEL) を付加したりすることにより、細胞質に取り込まれたタンパク質を小胞体に輸送できるようにする。このような処理を施した本発明のタンパク質を培養液に添加後、数日間培養し、癌細胞の細胞数や細胞の形態変換を観察することにより、本発明のタンパク質の癌細胞増殖阻害活性を測定することができる。また、 ³Hで標識されたチミジンの取り込み能の低下を測定すること（Nagase et al. , Int. J. Cancer, 65, 620-626, 1996) によっても、癌細胞の増殖阻害活性を測定することができる。

本発明のタンパク質をコードする DN Aの全部又は一部よりなる 1本鎖又は 2 本鎖 DNAを、ハイブリダィゼーションプローブ又は PC Rプライマーに用いて、生体組織、又は培養細胞株などにおける WAR— 1 DNAの発現を特異的に検出することが可能である。該 1本鎖又は 2本鎖 DN Aとしては、 WAR—1 DNA の転写産物である WAR— 1の mRNAを選択的に検出することのできる 1本鎖又は 2本鎖 DNAであれば、特に限定されない。

具体的な検出方法としては、以下の 1) 、 2) の 2つの手法が挙げられる。

1 ) WAR— 1の mRNAを特異的に検出することのできる 2本の 1本鎖 DNA (正鎖及び逆鎖）を PCRプライマーとして用い、被験用の組織又は培養細胞株より得られた全 RNAもしくはポリ（A) RNAを基質として、 PCRにより解析を行う手法。

2) WAR- 1の mRNAを特異的に検出することのできる 1本鎖又は 2本鎖 D NAを放射標識し、これをプローブとして、被験用の組織又は培養細胞株より得られた全 RNAもしくはポリ（A) RNAに対してノーザンブロット解析を行う手法。

以上の 1) 及び 2) の検出法は、例えは Holecular Cloning 2nd Edt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に基づき行うことができる。以下に具体例を示す。

1) の PC Rの具体的な手法としては、例えば以下の方法が挙げられる。まず、 WAR-1の m RNAを特異的に検出することのできる P C Rプライマーを常法により合成する。次に、被験用の組織又は培養細胞株より、前述の方法にて全 R NA又はポリ（A) RNAを調製し、これを铸型として、 MMTV— RT等の逆転写酵素により i本鎖 DN Aを調製する。その後、先の PC Rプライマーを添カロし、常法により PCR反応を行う。 PCR反応の条件としては、例えば 95°C1 分、 60°C1分、 72 °C 2分を 35サイクル行った後に、 72 °Cで 10分加熱するような条件が举げられる。この PC R反応物を適当な濃度のァガロースゲルにて電気泳動することにより、 WAR— lmRN Aの発現の有無を検出することができる。その他、 i n s i t u PCR法 (Fernandez et al. , Mol. Carcinog, 20， 317-326, 1997) を用いることによつても、 WA R _ 1 m R N Aの検出を行うことが可能である。

2) のノーザンプロット解析の具体的な手法としては、例えば以下の方法が挙げられる。まず、 WAR— 1の mRNAを特異的に検出することのできる 1本鎖又は 2本鎖 DNAを放射標識し、プローブを作製する。 2本鎖 DNAの場合は、例えば前記 1) の手法により調製された PC R反応物を、ニックトランスレーション法又はランダムプライムラべリング法などで³² P標識することにより作製される。次に、被験用の組織又は培養細胞株より、前記と同様の手法により全 RN A又はポリ（A) RNAを調製し、常法によりホルムアルデヒドゲル電気泳動及びナイロンメンブレンへのブロッテイングを行う。このメンブレンと、先のプロ —ブとのハイブリダィゼ一シヨンを行うことにより、 WAR— 1 mRNAの発現の有無を検出することができる。ハイプリダイゼーシヨンの条件としては、 2本鎖 DNAをプローブとして用いる場合、例えば 45% (v/v) ホルムアミド、 5 XSS PE、 2 Xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 20 / g Zm 1サケ精子 DNAの条件で 42°C、 16-24時間ハイブリダィズさせた後に、 2 XS S PE、 0. 5%SDS中で室温、 10分間 2— 3回洗浄し、更に 65°C、 2 X

SS PE、 0. 5%SDS中で 20分間 2— 3回洗浄するような条件が挙げられる。

前記検出方法において使用される 1本鎖又は 2本鎖 DN Aとしては、具体的には以下のものが挙げられる。

すなわち図 1に、ヒト WAR— 1 (hWAR— 1 ) 及びラット WAR— 1 (r

WAR- 1) の塩基配列を、小胞体膜輸送に関与する公知の因子であるヒト TR AM (hTRAM) およびヒト K I AA0057の塩基配列と比較した結果を示しているが（図中、黒枠が相同性を有する部分）、ヒト WAR— 1に特異的なプローブ又はプライマ一部分の選択に関しては、ヒト TRAMとヒト WAR— 1の相同性が低い領域を選択することが重要である。この際、両者の cDNAから増幅される DN A断片を区別できるようにするため、一方の配列に一部塩基配列の欠失のある領域を増幅することが好ましい。また、両者の c DNAを特異的に認識するプライマーとして、プライマー配列全領域で相同性がないことが好ましい力特に 3，末端近傍の配列が大きく異なる方が、増幅したくない c DNAに対して伸長反応が進みにくくなるため、特異性が向上すると考えられる。さらに、 3' 末端の塩基が異なるように設定すればより特異的な増幅に効果的である。また、 Na t i o n a l B i o s c i e n c e s社のソフトウェア O l i g o等のプログラムによるプライマ一解析も利用し得る。

以上のようにして選択した部分を基にして、常法により前記 1) のプローブ又は前記 2) のプライマーを作製することができる。

一例としては、以下の配列よりなる 1本鎖 DNA、又はこの 1本鎖 DNAをプライマーとして前記 PC R反応を行うことにより増幅される 2本鎖 DN Aなどが挙げられる。

5 '側プラィマー配列； 5' -CACCTGGCTGGATCGCAGMTCGG- 3' (配列番号： 7 )

3，側プライマー配列； 5' - CTCTTTCCTCTTTGGCGGACAGTC- 3' (配列番号： 8 ) ここで配列番号： 7は、図 1の hWAR— 1 DNAの第 823位〜第 846位の正鎖部分に相当し、配列番号： 8は、図 1の hWAR— 1 DNAの第 1093 位〜第 1 1 16位の逆鎖部分に相当する。

以上のような 1本鎖 DN A又は 2本鎖 DN Aを前記検出方法 1) の PC Rプライマー、又は前記検出方法 2) のハイブリダィゼーシヨンプローブとして用いることにより、 WAR— 1の DNAの特異的な発現を検出することができる。詳しくは実施例 4を参照されたい。なお、このようなプライマーおよびプローブは、天然の WAR— 1由来の配列のみに限定されず、 WAR- 1 DNAの転写産物である WAR— 1の mRNAを特異的に検出することのできる DNAであれば、置換、欠失、付加などの修飾を施したものであっても良レ、。

以上のような WAR— 1 DN Aの発現検出方法の具体的な用途としては、疾患の診断目的の他、 i n s i t uハイブリダィゼーシヨンのような研究目的にも応用される。「課題を解決する手段」において記述したように、 WA R— 1遺伝子は、肝臓、肺、リンパ系組織（脾臓、胸腺、白血球）などの組織においては通常発現が認められないが、これらの組織が癌化することによって、特異的に発現してくることが明らかとなった。従って、前記のような WA R— 1特異的な P C Rプライマ一又はハイブリダィゼーシヨンプローブを用レ、、患者由来の癌組織又は癌細胞に対して前記の如き WA R— 1 m R NAの検出を行うことにより、癌の診断を行うことができる。

本発明において抗体とは、前記した本発明のタンパク質に結合する抗体である。該仇体 fま、例 ·ί 、 Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編、 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社

(1993) などに記載の方法により容易に作製される。すなわち、本発明のタンパク質又はその一部を用いて常法により適宜動物を免疫することにより、本発明のタンパク質に結合する抗体を作製することができる。

ここで、免疫抗原として使用される本発明のタンパク質は、前記したように、本発明の D N Aを含む組換え発現べクターを大腸菌もしくは培養細胞株に導入し、これらの形質転換体より当該ポリぺプチドを大量に調製、精製することにより、得ることができる。また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列の一部よりなるぺプチドを常法により合成し、 B S Aや K L H等にコンジユゲーシヨンを行い、これを免疫抗原とすることも可能である。

免疫感作する種としては、ゥサギ、マウス、ラット、ニヮトリ、ゥシ、ロバ、ヒッジ、ゥマ等何れでも良く、また、当該本発明のタンパク質を認識する抗体であれば、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の何れでも良い。

該抗体は、 WA R— 1タンパク質の発現の検出、又は該タンパク質の分離などに使用される。具体的には、ァフィ二ティークロマトグラフィー、 c D NAライブラリーのスクリーニング、免疫学的診断などに利用することができる。

本発明の抗体を用いることにより、癌の免疫学的診断を行うことができる。すなわち、本発明の抗体を用いることにより、 WA R— 1を産生する癌組織または細胞を検出することが可能となり、癌の診断に適用することが可能となる。具体的な検出法としては、蛍光抗体法、ウェスタン ·プロット法、免疫沈降法、免疫組織染色法が挙げられる。このうち、蛍光抗体法についての具体的な手順は、 Samoszuk et al. , Am. J. Clin. Pathol. , 109, 205-210, 1998^Bernardini et al., Tumor i. , 83, 673-678， 1997に記載された方法に準じて行えばよい。

本宪明の DN A又は本発明のタンパク質は、医薬の有効成分とすることができる。前記したように本発明のタンパク質は、癌細胞に対する増殖阻害活性を有している。従って本発明の DNAを医薬の有効成分として癌患者に投与し、体内で発現させる遺伝子治療剤として使用する力、、又は本発明のタンパク質を医薬の有効成分として癌患者に投与することにより、癌細胞の増殖を阻害し、癌の治療を行うことができる。なお、本発明の DN A又はタンパク質を有効成分として用いる場合のみならず、生体内の WAR— 1遺伝子又はタンパク質の発現を誘導するような因子又は化合物を用いた場合にも同様に、前記癌細胞の増殖阻害効果が認められる。従って、このような WAR— 1遺伝子の発現を誘導するような因子、化合物、又は WAR— 1タンパク質の発現を誘導するような因子、化合物を有効成分とする癌細胞増殖阻害剤もまた、本発明の範疇に含まれる。

本発明のタンパク質を有効成分とする治療剤は、アジュバントとともに投与したり、粒子状の剤形にして投与することができる。剤形として、より具体的には、リボソーム製剤、直径数 μ mのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤等の剤形にすることができる。投与方法としては徐放性のミニペレット製剤などが挙げられる。本発明のタンパク質の様に、小胞体に存在すると予想されるタンパク質を本タンパク質が機能する小胞体に選択的に輸送するためには、小胞体に保持されることが知られるタンパク質の C末端に存在する Ly s - As p-G 1 u-L e u (KDEL) 配列を本タンパク質の C末端に付加することが可能である。 C末端に KDEL配列を有するタンパク質は、ゴルジ体及び小胞体に存在するレセプタータンパク質に結合し、ゴルジ体から小胞体に逆輸送することが知られている（Majoul et al. , J. Cell Biol. , 133, 777-789， 1996) 。更に、特定の糖ぺプチド鎖ゃ糖鎖をタンパク質に付加することゃビォチンを結合させることによって本タンパク質に組織移行選択性をもたらすことが可能である。具体的には、肝細胞に特異的にタンパク質を蓄積させるために、 a s i a 1 o g l y c o p r o t e i n (Merwin et al. , Bioconjug Chem. , 5, 612-620, 1994) や g a l a c t o s e (Chen et al.， Hum Gene Ther.， 5, 429-435, 1994)でポリぺプチドを修飾することが可能である。また、特定の組織や細胞で発現するタンパク質と結合するタンパク質をビォチン化し、ァビジンとビォチン化した本タンパク質とで複合体を形成させることによって組織移行性を高めることが可能である (Saito et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 10227—10231, 1995,

Pardridge et al. , Pharm. Res. , 11, 738-746, 1994) 。

投与量は、癌細胞の特性、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常 0. 00 lmg/KgZ回〜 100 Omg/KgZ回であり、これを初期時には連日投与、その後、数日ないし数ケ月に 1回投与するのが好ましい。投与形態としては、剤形に応じて経口、動脈注射、静脈注射、筋肉注射、癌組織に対する局所注射により投与することが可能である。

本発明の DN Aを有効成分とする遺伝子治療剤は、細胞内で WAR— 1タンパク質を大量に産生させ、癌細胞内においては癌細胞の増殖を阻害することができる。

本発明の DNAを有効成分とする遺伝子治療剤を癌細胞に導入する場合、その投与形態としては非ウィルスベクタ一を用いた場合と、ウィルスベクターを用いた場合の二つに大別される。

より詳細に説明すると、本発明の DNAを細胞内で作用させる手段として、以下の方法が挙げられる。

A. 非ウィルスベクターを用いる場合

遺伝子発現ベクターに本発明の DN Aを導入し、リン酸一カルシウム共沈法、リボソームを用いて DNA分子を導入する方法（リボソーム法、リポフエクチン法、リボフエタトァミン法）、エレクトロポレーシヨン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガンで坦体とともに DN A分子を細胞に移入する方法等の何れかの方法により組換え発現べクターを細胞内に取り込ませることが可能である。ここで用いられる発現ベクターとしては、例えば pBK— CMV、 pCA GGS、 p c DNA3. 1、 p Z e o S V等が挙げられる。

B. ウィルスベクターを用いる場合

ウィルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウイルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウィルス、 SV40、免疫不全症ウィルス（H I V) 等の DNA ウィルスまたは RNAウィルスに本発明の DNAを導入し、細胞に組換えウィルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。前記ウィルスベクターの内、アデノウイルスの感染効率が他のウィルスベクタ一を用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、従って、アデノウィルスベクター系を用いることが好ましい。これらの方法の何れかを用いることによって、 WAR— 1をコードする遺伝子を癌細胞内に導入することが可能である。また、非ウィルスベクターによる遺伝子治療では、局所投与や組織移行性を高めた剤形との組み合わせ等によつて疾患部位の近傍に遺伝子を導くことが好ましいが、ウィルスベクターによる遺伝子治療では、必ずしも局所投与をする必要はなく、静脈内投与も可能である。投与形態としては、製剤形態（例えば液剤など）をとり得るが、必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、疾患部位の近傍に遺伝子を導入し易くするために、徐放性の製剤とすることも可能である。

本発明の遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、 DN Aを直接体内に導入する i n V i V o法、及びヒトからある種の細胞を取り出して体外で D NAを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻す e X v i v o法がある（日経サィエンス、 1 994年 4月号、 20— 45頁、月刊薬事、 36 (1) ， 23— 4 8 (1994) 、実験医学増刊、 1 2 (15) 、（1 994) ) 。本発明では、 i n V i v o法が好ましレヽ。

製剤中の DNAの含量は、治療目的の疾患、患者の年鈴、体重等により適宜調節することができるが、通常、本発明の DN Aとして 0. 0001 _100mg、好ましくは 0. 001— 10mgであり、これを数日ないし数ケ月に 1回投与するのが好ましい。

本発明の第 2の態様は、タンパク質 W A R _ 1または該 W A R _ 1をコードする D N Aを有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤に関する。「神経栄養因子分泌促進剤」とは、インビボあるいはインビトロで神経細胞に接触させた場合、その細胞からの神経栄養因子の分泌を促進する作用を示す薬剤を意味する。神経栄養因子とは、 1 950年に発見された神経成長因子（NG F) のように、神経細胞の生存維持、神経分化促進などの生理作用を有するタンパク質の総称である。

本発明における DN Aのうちタンパク質をコードするものとしては、タンパク質 WAR— 1をコードする DNA、又は該 WAR— 1をコードする DNAに類似の DNAであって、力つ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質をコ一ドする DN Aであれば特に限定されない。具体的には、以下の 1) 〜3) の DN Aが例示される。

2 ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列のうち 1若しくは数個または複数個のァミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたァミノ酸配列からなり、かつ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質をコ一ドする DNA。

3 ) 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質をコードする DNA。

これらの DNAの詳細については、前述したとおりである。ただし、 DNAがコードするタンパク質の生物活性が、癌細胞の増殖阻害活性ではなく、神経栄養因子の分泌促進活性である点で異なる。

前記 DN Aが神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質をコードするものであるか否かは、当該 DN Aを導入した細胞の発現する神経栄養因子を解析しても良く、また、細胞外に放出された神経栄養因子を解析しても良い。例えば、以下の方法により測定することができる。

生化学的な解析方法としては、各種の神経栄養因子を認識する抗体を用いたゥエスタンプロット法、 ELISAや RIA等を用いるのが簡便である。さらに、抗体を用いた免疫組織染色に電子顕微鏡技術を応用し、小胞体に神経栄養因子が蓄積していることを確認する方法が挙げられる。この方法は、細胞質中で新たに翻訳されるタンパク質がシグナノレ認識タンパク質や WA R— 1に出会わない場合には細胞質中に大量に存在するタンパク質分解酵素により分解を受ける一方、一旦シグナル認識タンパク質や WA R - 1に結合して粗面小胞体が形成された後は、タンパク質分解酵素の少な、小胞体にタンパク質は安定に存在するという前提に基づくものである。

また、生物学的な解析方法としては、遺伝子導入された形質転換細胞の培養上清中に神経突起伸長作用を持つ神経栄養因子が蓄積しているかをみることが挙げられる。具体的には、各種の神経栄養因子の添加により神経突起伸長作用が認められるラット副腎褐色細胞腫由来の P C 1 2細胞に対し、形質転換細胞の培養上清を作用させることにより、神経突起伸長作用を持つ神経栄養因子が形質転換細胞の培養上清中にコントロールより多く蓄積しているかを調べる。 P C 1 2細胞は、大日本製薬ゃ理研ジーンバンクから容易に入手することができる。第一の選択としては、生物学的な解析方法の方が好ましい。

神経突起伸長作用が認められた場合、どの様な神経栄養因子が増えているかを検討するための次の手段として、生化学的な解析を行うことが必要となる。この場合、多数の抗体を用いて様々な神経栄養因子を検出する必要があるが、未知の因子が含まれる可能性も否定できない。

未知因子の存在の有無を確認する為には、神経栄養因子群やそれらレセプターに結合してそれらの活性を消失させるような様々な、いわゆる中和抗体で培養上清を処理して、神経突起伸長作用の低下を見れば良い。中和抗体の存在下でも顕著な突起伸長作用が残存する場合は、未知の神経栄養因子が含まれている可能性力 Sある。

さらに、 WA R— 1遺伝子の発現を増強することにより、神経栄養因子の分泌が促進されたことを確認するための方法として、例えば特定の神経栄養因子遺伝子を導入した細胞や特定の神経栄養因子の放出が知られている細胞を用いることができる。より簡便には、後者の細胞、特に癌由来の細胞株の利用が好ましい。特定の神経栄養因子を放出するものとして、例えばヒトァスト口サイト由来のダリオ芽細胞 J®である T 9 8 G細胞を用いることができる。 T 9 8 0は大0本製薬社から容易に入手することができる。 T 9 8 G細胞が放出する神経栄養因子として、 NGF (Emmett et al.， Neurochem. Int. , 30, 465-474, 1997) 、 TG F— )3 1、 β 2 (Naganuma et al. , Neurol Med Chir (Tokyo) ， 36， 789 - 795, 1996) 、 PDGF-B (Potopova etal. , Int. J. Cancer, 66, 669-677, 1996) 、 b FGF (Takahashi et al. , FEBS Lett. , 288, 65—71, 1991) 、 I GF— 1

(Ambrose et al. , J. Cell Physiol. , 159, 92-100, 1994) 等の複数の因子が知られている。上記の複数の神経栄養因子を放出していることが判明している T 9 8 G細胞に対して WAR— 1遺伝子を導入し発現させ、得られた形質転換細胞の培養上清を用いて、 P C 1 2細胞の神経突起伸長作用を指標とした生物学的な解析を行うことにより、 WA R— 1タンパク質の産生増加によつて神経栄養因子の分泌が促進したことが示された。

前述した方法により、本発明の DN Aで形質転換された細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明における DN Aからタンパク質を発現、生産することが可能である。ここで「好適な条件下」とは、その宿主細胞に適した培養用培地により、 3 7°C、 5 %C0₂存在下で培養するような条件を指す。

このような好適な条件下で培養した形質転換細胞より、前記本発明のタンパク質を単離し、精製することが可能である。ここで、本発明のタンパク質の粗抽出液を得る方法、また、該粗抽出液から本発明のタンパク質を精製する方法としては、例えば日本生化学会編、新生化学実験講座 1、タンパク質 I —分離 ·精製- 性質一、 1 9 9 0に記載された方法を用いて行うことが可能である。

以上のようにして得られた本発明におけるタンパク質の具体例としては、例えば配列番号： 2に記載のァミノ酸配列よりなるラット WA R— 1、又は配列番号： 4に記載のアミノ酸配列よりなるヒト WAR— 1が挙げられる。

前記本発明におけるタンパク質による、神経栄養因子の分泌促進の活性は、以下のようにして測定することができる。

ヒトグリァ芽細胞腫株 T 9 8 Gなどの細胞の培養液中に該タンパク質を添加する。その際、該タンパク質を、あらかじめリボソームに封入したり、リピッドを結合させることにより、細胞膜への透過性を増しておく。また、タンパクの C末端に小胞体保持配列である L y s— A s p— G l u— L e u (KDE L) を付カロしたりすることにより、細胞質に取り込まれたタンパク質を小胞体に輸送できるようにする。このような処理を施した該タンパク質を培養液に添加後、数日間培養し、培養上清を得る。得られた培養上清を用いて、 D NAによる神経栄養因子の分泌促進の活性を測定した前述の方法と同様にして、神経栄養因子の分泌促進活性を測定する。

本発明の神経栄養因子分泌促進剤には、有効成分として、 WA R— 1遺伝子の発現を増強または WA R— 1タンパク質の産生を増強する物質を含んでも良い。当該物質の神経栄養因子の分泌促進活性の測定には以下の方法が挙げられる。

WA R— 1遺伝子の発現を増強または WA R— 1タンパク質の産生を増強する物質の選別は、 WA R— 1タンパク質に対する抗体を用いて細胞内の WA R— 1 タンパク質の蓄積を直接調べることで実施できる。その際は、 WA R— 1タンパク質に標識となる T a g配列を付加し、抗 T a g抗体を用いることもできる。また、 WA R— 1が関与する特定の分泌タンパク質因子または細胞膜タンパク質因子の小胞体中の蓄積を調べることで行うことができる。特定の分泌タンパク質因子の分泌を指標とする場合は、細胞の培養上清におけるそれらタンパク質の蓄積を ELISA等を用いて調べることができる。また、特定の膜タンパク質因子の細胞膜における蓄積を指標とする場合は、それら因子の抗体を用いたウェスタンプロットゃ FACS解析またはそれらの因子が特定のリガンドのレセプターである場合は、リガンドとの結合能の増加を基に調べることができる。

細胞に対する作用をもって評価することも可能である。例えば、本明細書に記載されたように該物質を作用させた特定の細胞から放出され培養上清に蓄積した因子による生物学的作用、例えば、神経突起伸長作用をもって評価することも可能である。

また、遺伝子の発現が増強されているかを検討するためには、 WA R— 1遺伝子の発現上昇をノーザンブロット解析や RT-PCRによって直接調べることができる。また、 WA R— 1遺伝子のプロモーター領域を含む 5'上流配列を用いて、これを lacZ、ルシフェラーゼ遺伝子または G F P等のレポーター遺伝子に連結した発現べクターを特定の細胞に導入し、レポ一タ一遺伝子の活性を指標に該物質の作用を調べることもできる。本発明における DN A又はタンパク質は、神経栄養因子の分泌促進活性を有するので、神経変性疾患治療剤の有効成分とすることができる。神経変性疾患とは、酸化的ストレス、神経毒、遺伝的素因等による複合的な作用により、神経の変性 ·脱落を伴う疾患であり、具体的には、アルツハイマー病、脳梗塞性痴呆症、パーキンソン病、ハンチントン病、および ALS等が挙げられる。

本発明の神経変性疾患治療剤は、（ 1 ) WAR— 1タンパク質そのものまたははその一部を有効成分とする治療剤として使用しても良く、（2) WAR—1をコ一ドする DNAを有効成分として患者に投与し、体内で発現させる遺伝子治療剤として使用しても良く、また（3) WAR— 1遺伝子の発現又は WAR— 1ポリぺプチドの産生を増強する物質を有効成分としても良い。

神経細胞の生存維持に関わる神経栄養因子の作用は、ダリァ細胞から放出されパラクリン的に神経細胞に働く場合と神経細胞から放出されオートクリン的に働く場合があるが、本発明による神経変性疾患治療剤の標的細胞は、グリア細胞と神経細胞のどちらであっても良い。

(1) WAR— 1タンパク質そのものまたはその一部を有効成分とする神経変性疾患治療剤

WAR— 1そのものまたはその一部を有効成分とする治療剤は、神経変性疾患前述した WAR— 1タンパク質を有効成分とする癌細胞増殖阻害剤と同様に投与される。

(2) WAR—1をコードするDNAを有効成分とする神経変性疾患治療剤遺伝子治療剤として用いる場合、神経変性組織内のグリア細胞や神経細胞内で WAR— 1ポリペプチドを大量に産生させ、神経栄養因子の放出を促進することができる。

WAR— 1をコードする DN Aを有効成分とする遺伝子治療剤を投与する場合、その投与形態としては非ウィルスベクターによる態様及びウィルスベクターを用レ、る態様の二つに大別される。詳細は前述した、癌細胞増殖阻害剤として用いる場合と同様である。

ウィルスベクターのうち、アデノウィルスの感染効率が他のウィルスベクターを用いた場合よりもはる力こ高く、神経細胞等の非分裂細胞においても外来遺伝子を発現することが知られており、従って、アデノウイルスベクター系を用いることが神経変性疾患治療剤として最も好ましい。

また、神経細胞への感染が認められるセンダイウィルスべクタ一系や神経細胞を標的化した場合はへルぺスウィルスべクター系もアデノウィルスべクタ一系に次いで好ましい。

製剤中の DNAの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常、本発明の DN Aとして 0. 0001 _100mg、好ましくは 0. 001— 10m gであり、これを数日ないし数ケ月に 1回投与するのが好ましい。

(3) WAR— 1遺伝子の発現又は WAR— 1ポリペプチドの産生を増強する物質を有効成分とする神経変性疾患治療剤

本発明の D N A又はタンパク質を有効成分とする神経変性疾患治療剤のみならず、生体内の WAR— 1遺伝子の発現又はタンパク質の産生を誘導するような因子又は化合物を有効成分として用いた場合にも同様に、神経栄養因子の分泌促進活性が認められる。従って、このような WAR— 1遺伝子の発現を促進するような物質、又は WAR— 1タンパク質の産生を促進するような物質を有効成分とする神経変性疾患治療剤も本発明の範疇に含まれる。該物質としては、例えば、ぺプチド、ペプチドのアナログ、微生物培養液、合成化合物等が挙げられる。

図面の簡単な説明

図 1は、ヒト由来 TRAM (図中： HTRAM) 、ヒト由来 K I AA0057

(図中： K I AAO 057) , ヒト由来 WAR— 1 (図中： HWAR 1) 及びラット由来 WAR— 1 (図中： RWAR1) をコードする c D N Aの塩基配列の相同性の解析結果を示す図である。

図 2は、ヒト由来 TRAM (図中： HTRAM) 、ヒト由来 K I AA 0057 (図中： K I AA0057) 、ヒト由来 WAR— 1 (図中： HWA R 1 ) 及びラット由来 WAR— 1 (図中： RWAR1) をコードする c DN Aの塩基配列から推定されるアミノ酸配列の相同性の解析結果を示す図である。

図 3は、ヒト由来の各種癌細胞株における h WAR— 1遺伝子の発現を RT— PCR法によって解析した結果を示す電気泳動写真である。上のレーンは hWA R— 1の RT—PCRの結果を、下のレーンは hTRAMの RT— PCRの結果を、それぞれ示す。

図 4は、ヒト各種組織における h WAR— 1遺伝子の発現をノーザンハイプリダイゼ一シヨンによって解析した結果を示す電気泳動写真である。各写真の右に記載した数字は、 RN A分子量マーカーのサイズ（Kb) を示している。

図 5は、ヒト各種組織における h TRAM遺伝子の発現をノーザンハイブリダィゼ一シヨンによって解析した結果を示す電気泳動写真である。各写真の右に記載した数字は、 RNA分子量マーカーのサイズ（Kb) を示している。

図 6は、ヒトグリア芽細胞腫 T 98 Gに、 hWAR— 1遺伝子を挿入したアデノウィルスを感染させ、形態変化を観察した結果を示す顕微鏡写真である。 A : アデノウィルス非感染細胞、 B ：アデノウィルスベクターのみのアデノウィルス感染細胞、 C： hWAR— 1のセンス鎖を発現する組換えアデノウィルス感染細胞、 D： hWAR- 1のアンチセンス鎖を発現する組換えアデノウィルス感染細胞。

図 7は、アデノウイルスベクタ一 Ax CAw tを感染させた T 98 G細胞の経時的な形態変化を示す顕微鏡写真である。 A：感染直後、 B :感染 8時間後、 C _:感染 21時間後（約 1日後）、 D：感染 31時間後（約 1. 5日後）、 E：感染 46時間後（約 2曰後）、 F：感染 70時間後（約 3日後）。

図 8は、 hWAR— 1のセンス鎖を発現する組换ぇアデノウィルス Ax CAW A R 1— Lを感染させた T 98 G細胞の経時的な形態変化を示す顕微鏡写真である。 A：感染直後、 B：感染 8時間後、 C：感染 21時間後（約 1日後）、 D：感染 31時間後（約 1. 5日後）、 E :感染 46時間後（約 2日後）、 F ··感染 70時間後（約 3日後）。

図 9はラット由来 r WAR— 1遺伝子を検出するオリゴヌクレオチドプローブを用いたラット各種組織における r WAR— 1遺伝子の発現を示したノーザンハイブリダイゼーシヨンの結果を示す電気泳動写真である。発現している組織では、約 2. 4 Kbの 2本の転写産物が検出されている。

図 10はラット由来 r WAR— 1遺伝子を検出する 1.9Kb EcoRIフラグメントをプローブとして用いたノーザンハイブリダィゼーシヨンによって解析した結果を示す電気泳動写真である。 Lane 1 ：ラット幼若脳海馬組織 poly(A) mRNA； Lane 2：成熟ラット脳 poly(A) mRNA； Lane 3:ラット網膜 pol A) mRNA。

図丄 1はヒト脳由来の各部位から調製された poly(A) mRNAに対して、ヒト由来 hWAR_ 1遺伝子を特異的に検出する DNAフラグメントをプローブとして用いたノーザンハイブリダィゼ一シヨンの結果を示す電気泳動写真である。各写真の右に記載した数字は、 RNA分子量マ一カーのサイズ（Kb) を示している。実施例

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

実施例 1

ラット c DN Aライブラリーの作製

種々の新規な c DNAのクローユングを目的として、以下の手法により幼若ラットの cDN Aライブラリーを作製した。

まず生後 1 2日令の幼若ラットの組織を摘出し、常法によりグァニジンチオシアン酸溶液を加えてホモゲナイズした後、塩化セシウム密度勾配遠心法により 2 mgの全RNAを調製した。

この全 RNAをオリゴ（dT) セルロースカラム（フアルマシア社製）にかけることにより、ポリ（A) 付加配列を有する 103 / gの mRNAを精製した。このうち 16 / gの mRNAをオリゴ（d T) プライマー及びランダムプライマ —を用いて、逆転写酵素によって一本鎖相補 DN Aを合成した。次いで RNa s eH及び E. c o l i DNAポリメラーゼ Iを反応させることにより、二本鎖 c DN Aを合成した。得られた二本鎖 c DN Aの末端を平滑化するために T 4 DNAポリメラーゼで処理し、両末端に E c oR Iアダプターを付カ卩した。最終的な cDNA量は、オリゴ（dT) プライマー及びランダムプライマーを用いた場合、各々 2// gと 1. 3 gであった。その内の一部を Lファージベクターである； L g t l Oの E c oR I切断部位に挿入後、インビトロパッケージングキット（ストラタジーン社製）により； Lファージ粒子内に導入し、これを大腸菌 C 6 00" ¹ (ストラタジーン社製）に感染させることにより、目的とする幼若ラット c DNAライブラリ一を調製した。 p l a q u e f o rm i n g un i t s (p f u) は、先にオリゴ（dT) プライマー及びランダムプライマーを用いて合成された cDNA l ^u g当たり、各々 8. 8 X 10⁷p f u及び 2. 5 X 10⁷ p f uであった。

実施例 2

r WAR- 1をコ一ドする c DN A塩基配列の決定

実施例 1で得られた c DNAライプラリーよりランダムにクローンを選別し、通常のプレートライセ一ト法により λファージ DNAを回収し、制限酵素 E c o R Iで切断後、挿入 cDNA部分を Ml 3ファージベクターにサブクロー-ングした。そのうちの一つについて挿入 c DN A部分の塩基配列を決定した結果、クローニングされた c DNAの長さは約 2. 2Kbであり、約 1 Kbに亘りオーブン · リーディング'フレームが存在していることが明らかとなった。 1. 8Kb からなる E c o R I断片をプローブに用いて常法によりノーザン解析を行った結果、この c DNAの対応 mRNAのサイズは 2. 4 K b程度と推定されたため、 p o l y (A) 配列の長さを加味すると、ほぼ全長の c DN Aが得られたと予想された。得られたクローンをクローン 12と命名した。クローン 1 2の有する c

DNAの塩基配列を G e n B a n kデータベースで検索したところ、ヒト由来の小胞体膜輸送関連タンパク質である TRAM(G e nB a n k Ac c e s s i o n No. X 63679)と塩基配列上 59. 7 %、ァミノ酸配列上 57. 0 %の相同性が認められ、また、 K I AA0057 (G e nB a n k Ac c e s s i o n No. D31 762)と塩基配列上 53. 7 <½、ァミノ酸配列上 41. 0 %の相同性が認められたが（表 1) 、完全に一致する配列は見出されなかったこと力ら、クロ一ン 1 2の有する c DNAは新規な c DNAであることが明らかとなつた。この新規な c DNAによりコードされるタンパク質を、ラット WAR— 1 (r WAR- 1) と命名した。 r WAR— 1の塩基配列及び推定上のアミノ酸配列を、配列番号： 1及び 2に示した。また、公知のヒト TRAM (hTRAM) の塩基配列及びァミノ酸配列を、配列番号： 5および 6に、また、ヒト K I AA 0057の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号： 1 2および 13に示した。表 1

ヒト WAR— 1、ヒト TRAM、ラット WAR— 1および K I AA0057の相同性（％)

なお、上記 r WAR— 1の c DNA断片をベクター p B 1 u e s c r i p t I Iに組み込んだプラスミド、 p r WAR— 1を含有する大腸菌 E. c o l l DH 5 a (p rWAR- 1 ) は、茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（微生物の表示： E. c o l l DH 5 a (p rWAR- 1 ) ；受領日：平成 1 0年 1 0月 6日；受託番号： F E RM P- 1 70 1 8)。

実施例 3

hWAR- 1をコードする c DNAのクローユングと塩基配列の決定

r WAR— 1のオープン ' リーディング 'フレームに相当する 0. 8 Kbからなる E c o R I — Xh o l DNA断片をプローブに用いて、常法により、ヒト c DNAライブラリー（クロンテック社製）からヒト型 WAR— 1の c DNAを有するクローンのスクリーニングを行った。その結果、 l x l 0⁶ p f uのヒト c DNAライブラリーから 1クロ一ンが単離された。塩基配列を決定した結果、実施例 2で得られた r WA R— 1と塩基配列上 7 2. 4 %、ァミノ酸配列上 7 2.

7%の相同性を示したため、これをヒト型 WAR— 1 (hWAR— 1) をコードする c DNAであると結論した（表 1 ) 。決定された塩基配列及び推定上のアミノ酸配列を、配列番号： 3および 4に示す。この hWAR_ lは、先の hTRA Mと塩基配列上 76. 3 %、アミノ酸配列上 70. 7 %の相同性を示し、 K I A AO 057と塩基配列上 64. 1 %、ァミノ酸配列上 44. 1 %の相同性を示した（表 1) 。

なお、上記 h WAR— 1の c DNA断片をベクター p B 1 u e s c r i p t I Iに組み込んだプラスミド、 p hWAR- 1を含有する大腸菌 E. c o l l DH5 α (p hWAR-l) は、茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（微生物の表示： E. c o l l DH 5 a (p hWAR- 1) ；受領日：平成 10年 10月 6日；受託番号： F E RM P- 1 7019) 。

これら hWAR—l、 r WAR- 1 , h T R AM及び K I AA 0057をコードする c DNAの塩基配列を比較した結果を、図 1に示す。また、 hWAR— 1、 r WAR- 1、 h TRAM及び K I AAO 057のアミノ酸配列を比較した結果を、図 2に示す。

実施例 4

各種ヒト癌細胞樹立株における hWAR— 1をコードする遺伝子の発現の検討 hWAR- 1と hTRAMをコードする遺伝子のヒト各種癌細胞での発現を検討する目的で、 hWAR— 1 mRNAと hTRAM mRNAを各々特異的に増幅するプライマーを設定し、以下の条件にて R T _ P C Rを行つた。

hWAR- 1 mRNAを増幅するための 5'側のプライマーとして、図 1の h WAR- 1の塩基配列の第 823位〜第 846位（配列番号： 7) の部分を用い、 3'側のプライマーとして、第 1093位〜第 1 1 16位（配列番号： 8) の部分を用いた。また、 hTRAM mRN Aを増幅するための 5'側のプライマーとして、図 1の h T RAMの塩基配列の第 823位〜第 846位（配列番号： 9 ) の部分を用い、 3，側のプライマーとして、第 1087位〜第 1 1 10位（配列番号： 10) の部分を用いた。

ヒト由来の癌細胞株として、子宮頸部癌細胞株 H e L a、肺癌細胞株 A 549、膀胱癌細胞株 T 24、大腸癌細胞株 S W480、グリア芽細胞腫株 T 98 G、肝癌細胞株 H e p G 2、ウイルムス腫瘍：腎癌細胞株 G 401、バーキットリンパ腫： Bリンパ腫細胞株 D a u d i , 及び Tリンパ腫細胞株 MO L T 4、 J u r k a tを用いた。これらの細胞株のうち、理研ジーンバンクより入手される T 24 細胞以外のものは全て、大日本製薬より入手し得る。

RT— PC Rの反応は以下のように行った。

まず、上記各癌細胞株より二ツボンジーン社の全 RNA精製キット（I SOG EN) を用いて、全 RNAを調製した。この全 RNA 4 μ g (9. 5 μ I ) に対し、 1 0 OmM DTT 2. Ο μ 1、 5 X F i r s t S t r a n d B u f f e r (G i b c o B RL社） 4. Ο μ 1、 4 Ο /μ 1 RN a s e i n (P r ome g a社） 0. 5 // 1、 1 0 mM d NTP 2. 0 μ \ , 0. 2 μ g/ 1 p d (N) ₆プライマー 1. 0 μ 1、 20 OU/μ 1 MMTV— RT (G i b c o BRL社） 1. 0 1を加え、 3 7 で4 5分加温し、 9 5°Cで 5分間加熱することによって酵素を失活させた。次に、反応液から 1 6 1を分取し、 H₂0を 24 μ 1加えた。その内、 2. 0 1の反応液に 1 0 X P C R B u f f e r (P e r k i n E l me r社） 2. 5 し 2. 0 mM d NTP 2. 5 z 1、 2 5 μΜ各 5'プライマー、 2 5 各 3'プライマー、 Η₂01 6. 8 7 5 μ 1、及ぴ 5υΖμ 1 Amp 1 i T a q G o l d (P e r k i n E l me r社） 0. 1 2 5 μ 1を加え、 9 5 °Cで 9分加熱後、 9 5°C 1分、 60。C

1分、 7 2°C 2分の反応を 3 5回行い、最後に 7 2°Cで 1 0分間加熱した後、反応液 3 μ 1を 2 %ァガロースゲル電気泳動に供した。結果を図 3に示す。

h TRAMは全ての癌細胞で発現していることが確認されたが、 hWAR— 1 では、 J u r k a t等で h TRAMよりも幾分発現の低いことが示され、 hTR AM遺伝子の発現様式と異なることが示された（図 3) 。

実施例 5

ヒト正常組織における h WAR— 1をコ一ドする遺伝子の発現の検討

hWAR- 1遺伝子と h TRAM遺伝子の組織での発現性を検討するために、以下の実験を行った。

まず、前記した hWAR— 1特異的なプライマー配列（配列番号： 7及び 8) を用いて実施例 4と同様の RT— P CRを行うことにより、 hWAR— 1遺伝子の目的断片を増幅し、これを ρ T 7 B 1 u e (R) T v e c t o r (No v a g e n社）にクローユングした。同様に、 h TRAM特異的なプライマー配列 (配列番号： 9及び 10) を用いた RT— PC Rにより TRAM遺伝子の目的断片を増幅し、クローニングを行った。その後、これらのプラスミドを铸型としてプライマー配列（配列番号： 7及び 8) を用いて RT— PCRを行い、ポリアクリルァミドゲル電気泳動にて増幅 DN A断片を回収した。

次に、得られた DN A断片をマルチプライムラベル法により³² Pで標識してプローブを調製し、 C 1 o n t e c h社より購入した MTNブロットフィルター

(h uma n MTN b l o t I及び huma n MTN b 1 o t II) に対して常法によりハイブリダィゼーシヨンを行った。また、コントロールプローブとして C 1 o n t e c h社より購入した ]3—ァクチンを用いた。図 4、図 5にそれぞれ h W A R— 1遺伝子と T R AM遺伝子の組織発現の結果を示す。 hTRA Mはあらゆる組織で発現しているのに対して（図 5) 、 hWAR— 1はリンパ系組織（脾臓、胸腺、白血球）、肺、肝臓などの組織では発現が認められなかった

(図 4) 。先の実施例 4の結果より、肺癌 (A459) 、 Tリンパ fl重 (MOLT 4、 J u r k a t ) 、肝癌 (He pG2) の各細胞株では h T RAM遺伝子が発現していたことから（図 3) 、これらの組織においては癌化に伴って h TRAM が発現してくることが示された。

また、得られたオートラジオグラムのバンドの強度を解析し、 β—ァクチンの強度を基準として、各臓器における発現性を検討した。検討した結果を、表 2に示した。なお、示された数値は、精巣での発現を 1. 00とし、標準化した値である。

表 2 ―

組織 h AR-l/j3-actin 組織 hWAR-1/ jS -actin 心臓 0.56 脾臓 0.00 脳 1.47 胸腺 0.00 胎盤 0.00 腺 0.28 肺 0.00 1.00 肝臓 0.00 卵巣 0.25 骨格筋 0.00 小腸 0.15 腎臓 0.74 大腸 0.12 隱 1.21 末梢白血球 0.00 表 2に明らかなように、 h WAR— 1遺伝子は r WAR— 1と同様に脳での発現が最も高く、脾臓、腎臓、精巣の発現も比較的高いことが示された。

実施例 6

組換えコスミドベクターの作製

hWAR- 1をコードする c DNA遺伝子（配列番号： 3) の開始コドンの A TG配列の 36塩基対上流の P V u I I切断部位から終始コドン T A Aから 13 9塩基対下流の D r a I切断部位までの約 1. 3 K bの D N A断片を用いて、 h WAR— 1のセンス鎖、アンチセンス鎖が挿入されたコスミドベクターを作製した。具体的には、 S wa Iで切断した p Ax CAw tコスミドベクター（Ka n e g a e e t a 1. , 1 995、 Nu c l e i c Ac i d Re s. , 23, 3 816— 3821に ii載、また Adenovirus Expression vector kitとして宝酒造より購入可能）に、前記 hWAR— 1 1. 3Kb Pv u I lZDr a l断片を連結後、挿入断片を含まないコスミドベクターを Sw a Iで消化し、反応液の一部を常法によりインビトロパッケージングした。大腸菌 DH5ひに感染後、出現したコロニーからコスミド DNAを回収し、 E c o R I/Xh o Iで切断後、 1%ァガロースゲル電気泳動にて解析した。その結果、センス鎖 RNAを発現するクローンが 9種、アンチセンス鎖を発現するクローンが 6種得られた。その内各々 3種を選別し、センス鎖の RNAを発現するものは、 E c oR I/Xb a l または B g 1 I Iによって、またアンチセンス鎖の RNAを発現するものは、 S t u I /X b a Iまたは E c o R I /Xh o Iにより切断し、 DNA断片の方向性の確認と挿入断片に異常のないことを確認した。

実施例 7

組換えアデノウィルスの作製

ヒトアデノウイルス 5型由来非増殖型組換えアデノウイルスベクター（E 1及び E 3遺伝子を欠失）の E 1遺伝子欠失部位に、実施例 6で作製した h WA R _ 1遺伝子（センス Zアンチセンス）の発現単位を挿入した組換えアデノウイルスベクターを作製するために、以下の操作を行った。なお、プロモーターは高発現プロモーターとして特開平 3— 168087号公報に開示されている C AGプロモータ一を用い、また組換えアデノウィルスの作製は既存の方法（M i y a k e e t a 1. ， P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . ， Vo l . 93， 1 3 20-1324 (1 996) 、及び特開平 7— 298877) に従った。

アデノウィルスの E 1遺伝子欠失部位に C AGプロモーターのみが挿入された組換えアデノウイルスベクタ一 Ax CAw t (Ka n e g a e e t a 1. ,

1995、 Nu c l e i c Ac i d Re s. , 23, 3816-3821に記載、また Adenovirus Expression vector kitとして宝酒造より購入可能）から、既存の方法（特開平 7— 298877) に従いウィルス D N A—末端蛋白質複合体を調製し、制限酵素 E c oT22 I及び C 1 a Iで同時消化した。この制限酵素消化ウィルス DNA—末端蛋白質複合体と、実施例 6で作製した h WAR— 1センス鎖、もしくはアンチセンス鎖を挿入したコスミドベクターとを用い、リン酸カルシウム共沈法で 293細胞を形質転換した。生じた組換えアデノウィルスをクローユング後、ウィルス DNAを Xh o I及び C I a Iで消化することより目的ウィルスを選別し、組換えアデノウイルスベクター Ax CAWAR 1—L (センス鎖）と Ax CAWAR l— R (アンチセンス鎖）を得た。この組換えウィルスを継代した 4次ウィルス液の力価を既存の方法（特開平 7— 298877) により測定し、以後の実験に用いた。

実施例 8

組換えアデノウィルスベクター感染による h WAR— 1遺伝子の発現

実施例 7で作製したアデノウィルスベクター Ax CAWAR 1 _Lまたは Ax

CAWAR1— R、および Ax CAw t (コントローノレウイノレス）をヒトグリア芽細胞腫株 T 98 Gに重複感染度 10で 37 °C、 1時間感染させ、その後 5 % FCS含有最小栄養培地で培養した。感染翌日に培地を低血清培地（0. 5% FCS) に交換した。感染 2日後において、いずれのアデノウイルスベクターを感染させた細胞においても、培地のみで感染操作を行った細胞と比べて変性しており、アデノウイルス感染の影響が若干認められたものの、センス鎖を発現する Ax CAWAR 1一 Lを感染させた細胞にのみ顕著な形態変化が観察された（図 6) 。また、 Ax CAWAR 1—R感染細胞の形態は Ax CAw t感染細胞と差は認められなかった。さらに、 AxCAWARl—Lを感染させた T 98 G細胞は、感染 3日後より細胞死を起こし始めた。

実施例 9

WAR- 1センス RN A発現による T 98 G細胞の形態変化

形態の変化を観察し易いように感染時の細胞密度を低くし（実施例 8におけるコンフルェント状態の細胞の約 lZl 0の細胞密度）、アデノウイルスベクター Ax CAWAR l— L (センス鎖）または A x C AWA R 1— R (アンチセンス鎖）、および Ax C Aw t (コントロール）を実施例 8と同様に T 98 G細胞に感染させ、細胞の形態変化を経時的に観察した。感染翌日にはコントロールである Ax C Aw t感染細胞においても、培地のみで感染操作を行った細胞と比べて変性し始めており、アデノウイルス感染による影響が若干認められた（図 7) 。し力し、 Ax C Aw t感染細胞と比べて、 hWAR— 1のセンス鎖を発現する A X C AWA R 1— Lを感染させた細胞は、感染翌日（感染 21〜 31時間後）には顕著な形態変化が観察され、感染 3日後には細胞死を迎え始めた（図 8) 。なお、アンチセンス RNAを発現する Ax CAWAR 1— R感染細胞の形態は、 A X C Aw t感染細胞と差は認められなかった。

実施例 10

WAR— 1タンパク質添加による T 98 G細胞の形態変化

WAR— 1タンパク質を、あらかじめリボソームに封入したり、リピッドを結合させることにより、細胞膜への透過性を増しておく。また、タンパクの C末端に小胞体保持配列である Ly s— As p— G 1 u— Le u (KDEL) を付加したりすることにより、細胞質に取り込まれたタンパク質を小胞体に輸送できるようにする。このような処理を施した本発明のタンパク質を、実施例 8及び 9で用いた T 98 Gの培養液中に添加後、数 S間培養する。その後、 T98Gの細胞数や細胞の形態変換を観察することにより、癌細胞増殖阻害活性を測定することができる。また、 ³Hで標識されたチミジンの取り込み能の低下を測定すること

(Nagase et al. , Int. J. Cancer, 65， 620-626, 1996) によっても、癌細胞の増殖阻害活性を測定することができる。

実施例 1 1

ラット WAR— 1遺伝子の組織発 ¾の¾¾ r WAR— 1遺伝子を特異的に検出するオリゴヌクレオチドプローブを用いて C 1 o n t e c h社より購入したラット MTNブロットフィルターに対してハイブリダィゼーシヨンを行った。用いたプローブの塩基配列は、配列番号： 1 1に記載した ATTTTCTGTGCCTTTTCTCGACCTGGACCGTCTCTTCCTCCCACAGACAである。ハイブリダィゼ一シヨンの条件は、 C 1 o n t e c h社のプロトコールに従った。その結果、図 9に示されるように、 rWAR_l遺伝子は、脳で強く発現していた。また、精巣での発現が認められ、肺、腎臓での発現は微弱であった。

実施例 1 2

ヒト及びラット WAR— 1の神経関連部位での発現の検討

r WAR— 1遺伝子をプローブとして 1.7Kbの EcoRI断片を用いて幼若ラット脳海馬組織より常法により調製した poly(A) mRNA及ぴ C 1 o n t e c h社より購入した成熟ラット脳並びに網膜の poly(A) mRNAに対してノーザンハイブリダィゼーシヨンを行った。その結果、図 10に示されるように網膜でも発現が認められた。検出されたバンドの強度が低いのは poly(A) mRNAが幾分分解を受けているためと考えられる。

また、実施例 5で用いた h WAR— 1を検出するプローブを用いて C 1 o n t e c h社より購入した MTNプロットフィルター（h um a n b r a i n M TN b i o t il及び III) に対してハイプリダイゼーシヨンを行った（図 1 1) 。その結果、脳内のどの部位においても h WAR— 1の発現が認められた。また、脊髄においても本遺伝子の発現が認められた。このことより、末梢における神経部位においても hWAR_l遺伝子が発現していることが示唆された。実施例 13

組換えアデノウィルスべクター感染細胞の培養上清を用いた PC 1 2細胞に対する神経突起伸長作用の検討

実施例 7で作製したアデノウイノレスベクター Ax CAWAR 1—Lまたは Ax

CAWAR1— R、もしくは AxCAw t (コントロールウィルス）をヒトグリァ芽細胞腫株 T 98 Gに重複感染度 10で 37 °C、 1時間感染させ、その後 5 % FCS含有最小栄養培地で培養した。また、ネガティブコント口ールとして非神経系培養であるヒト肺癌由来 A 549細胞に対しても同様のウィルス感染実験を染 20後の各々の培養上清を回収し、遠心後、上清を 0.22ミクロン孔のメンブレンフィルターを通して細胞の残骸を除去した。

得られた培養上清は、場合によってアミコン社のセントリプレソプ（3000Kd力ット）を用いて 5倍に濃縮した。

96穴コラーゲンコートプレ一トに 1ゥエルあたり 100// 1の DMEM_10%FCS培地で 1〜5 xlO⁴細胞 Zmlとなるよう PC12細胞を撒き込み、 4日間培養を続けた。培養上清をすて、組換えアデノウイルス感染細胞の培養上清を表 3及び表 4 に示したように最終容量が約 ΙΟΟμΙとなるように添カ卩した。また、培養中の血清濃度は最終 10%FCSとした。添加した試料として、培地（Medium) 、非感染細胞の培養上清（Mock) 、 AxCAWARl— L感染細胞の培養上清（WAR(+)) 、 A x C AW A R 1 - R感染細胞の培養上清（WAR (-) ) 、及び A x CAw t感染細胞の培養上清（Control) を用いた。アツセィ系のポジティブコントロールとして、 10〃1の 500 ng/ml ]3- NGFを添加した。

培養上清添加後、 2日問培養を続け P C 1 2細胞の神経突起伸長作用を顕微鏡下で観察した。その結果、表 3に示されるように h WAR— 1のセンス鎖を発現するアデノウィルスを感染させた T 98 G細胞の培養上清を P C 12に添加した場合にのみ、強い神経突起伸長作用が認められた。また、 A 549細胞の培養上清を用いた実験では何れの場合も神経突起伸長作用は認められなかった。更に、表 4に示された結果から、神経突起伸長作用を起こすのに必要な Ax CAWAR 1一 L感染細胞の培養上清は 50 μ 1以上であれば良いことが確認された。

以上の結果は、 WAR— 1遺伝子の発現により、 T 98 G細胞の産生する神経栄養因子の細胞外への分泌が促進されたことを明らかに示すものである。表 2は、アデノウィルス感染 T 98 G及び A 549細胞の培養上清を用いた P C 1 2アツセィの結果（感染細胞培養上清 100 jul添加）を示す。表 3中、 + + +、 + +、十、 —はこの順に、 PC 1 2細胞の神経突起伸長が大きいことを示す。表 3

表 4は、アデノウイルス感染 T 98 G細胞の培養上清を用いた PC 12アツセィの結果を示す。表 4中、 + + +、 +十、十、一 / +、一はこの順に、 PC1 2細胞の神経突起伸長が大きいことを示す。

表 4

産業上の利用の可能性

本発明の DN Aは、癌細胞増殖阻害効果を示す WAR— 1をコードするものであり、該 DN Aにコードされる WAR— 1ポリペプチドを細胞内で産生または産生誘導させることにより、癌細胞の増殖を阻害し、癌細胞に細胞死を起こさせることができる。本発明はこのような WAR— 1の効果に基く新しい癌治療方法を提供することができる。また、本発明の小胞体膜タンパク質 WA R— 1遺伝子にコードされる WA R— 1ポリペプチドを細胞内で産生または、産生誘導させることにより、中枢及び末梢神経変性疾患領域において神経細胞の脱落を防ぎ、更に細胞死を迎える直前の細胞を活性化し正常な神経伝達機能を回復させるに有用な複数の神経栄養因子の分泌を同時に促進することができる。本発明により、神経変性疾患に対する新しい治療方法が提供される。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（a) 又は（b) のタンパク質をコードする DNA。

( a ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質 ( b ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたァミノ酸配列からなり、かつ癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質

2. 以下の（c) 又は（d) の DNA。

(d) 前記（c) の DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、力つ癌細胞の増殖阻害活性を有するタンパク質をコードする D N A

3. 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の DN Aの全部又は一部をプローブに用いて染色体 DNAライブラリーからクローニングされる、請求項 2記載の D MA。

4. プロモーター領域を含むことを特徴とする、請求項 3記載の DNA。

5. 受託番号 FERM BP— 6910、又は受託番号 FERM BP— 69 1 1で表示される微生物が有する、請求項 1又は 2記載の DNA。

6. 請求項 1〜 5レ、ずれか記載の D N Aを発現することによって得られるタンパク質。

7. 請求項 1〜 5いずれか記載の DN Aを含有する組換え発現ベクター。

8. 請求項 1〜5いずれか記載の DN Aを含有する組換えアデノウィルスべクター。

9. 請求項 7又は 8記載の組換え発現べクターによつて形質転換された形質転換細胞。

10. 請求項 1〜 5いずれか記載の DNAの全部又は一部よりなる 1本鎖又は

2本鎖 DNAであって、かつ配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列よりなる D N Aの発現を特異的に検出し得る、ハイブリダイゼーションプローブ又は PCRプライマー用の DNA。

1 1. 以下の配列よりなる、請求項 10記載の D N A。 5 '側プラィマー配列； 5' -CACCTGGCTGGATCGCAGAATCGG-3 ' (配列番号： 7 ) 3 '側プラィマー配列； 5' -CTCTTTCCTCTTTGGCGGACAGTC-3' (配列番号： 8 )

1 2. 請求項 10又は 1 1記載の DNAを、ハイブリダィゼーシヨンプローブ又は PCRプライマーとして用いることを特徴とする、配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列よりなる D N Aの発現の検出方法。

1 3. 請求項 6記載のタンパク質に結合する抗体。

14. 請求項 13記載の抗体を用いることを特徴とする、配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列よりなるタンパク質の発現の検出方法。

1 5. 請^項 1 2又は 14記載の検出方法よりなる、癌の診断方法。

16. 請求項 1〜5いずれか記載の DNA、又は請求項 6記載のタンパク質のいずれかを有効成分として含有する医薬。

1 7. 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列よりなる DN Aの発現を増加させることを特徴とする、癌細胞増殖阻害剤。

1 8. 請求項 1〜 51/、ずれか記載の D N Aを有効成分とする、癌細胞増殖阻害剤。

1 9. アデノウイルスベクターを用いることを特徴とする、請求項 18記載の癌細胞増殖阻害剤。

20. 以下の（a) 又は（b) のタンパク質をコードする DNAを有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤。

(a) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質。

( b ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列のうち 1若しくは数個または複数個のァミノ酸が欠失、置換及び又は付加されたァミノ酸配列からなり、かつ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質。

21. 以下の（c) 又は（d) の DNAを有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤。

(c) 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA。

(d) 前記（c) の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力、つ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質をコードする D N A。

22. 酉己列番号： 1又は配列番号： 3に記載の DN Aの全部又は一部をプロ一ブに用いて染色体 DNAライブラリーからクローニングされる DNAを有効成分とする、請求項 21記載の神経栄養因子分泌促進剤。

23. プロモーター領域を含むことを特徴とする DNAを有効成分とする、請求項 22記載の神経栄養因子分泌促進剤。

24. 受託番号 FERM B P— 6910、又は受託番号 F E RM BP— 6

91 1で表示される微生物が有する DNAを有効成分とする、請求項 20又は 2 1記載の神経栄養因子分泌促進剤。

25. DNAが組換え発現ベクターに含まれていることを特徴とする、請求項 20〜 24いずれか記載の神経栄養因子分泌促進剤。

26. DNAがアデノウイルスベクターに含まれていることを特徴とする、請求項 25記載の神経栄養因子分泌促進剤。

27. 以下の（a) 又は（b) のタンパク質を有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤。

( a ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質 ( b ) 配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列のうち 1若しくは数個または複数個のァミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたァミノ酸配列からなり、かつ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質。

28. 以下の（c) 又は（d) の DNAによってコードされるタンパク質を有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤。

( c ) 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の塩基配列からなる D N A。

(d) 前記 (c) の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力、つ神経栄養因子の分泌促進活性を有するタンパク質をコードする DN A。

29. 受託番号 FERM BP— 6910、又は受託番号 FERM BP— 6 91 1で表示される微生物が有する DNAによってコードされるタンパク質を有効成分とする、請求項 27又は 28記載の神経栄養因子分泌促進剤。

30. 配列番号： 1又は配列番号： 3に記載の DN Aの発現を増強する物質または配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質の産生を増強する物質を有効成分とする神経栄養因子分泌促進剤。

3 1. 請求項 20〜 30いずれか記載の神経栄養因子分泌促進剤を含有する神経変性疾患治療剤。

3 2 . 配列番号： 1又は配列番号 3に記載の塩基配列よりなる D N Aの発現を増強すること、または配列番号： 2又は配列番号： 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質の産生を増強することを特徴とする、神経栄養因子の分泌促進方法。