WO2000018893A1 - Procede de preparation d'un melange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues - Google Patents

Procede de preparation d'un melange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues Download PDF

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WO2000018893A1
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starch
algae
enzymes
mixture
branching enzymes
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Guy Fleche
Philippe Looten
Arnaud Heysen
Steven Ball
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Roquette Freres
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/107—1,4-Alpha-glucan branching enzyme (2.4.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of a mixture of starch branching enzymes extracted from unicellular algae.
  • the present invention also relates to a process for modifying starch and its derivatives using said mixture, as well as the starch and modified starch derivatives thus obtained.
  • starch means natural or hybrid starch derived from potato, from potato with a high amyiopectin content.
  • starch derivatives is understood in particular to mean all of the modified starches resulting from the enzymatic, chemical and / or physical modification, in one or more stages, of this starch.
  • the starch derivatives may in particular be starches modified by at least one of the known techniques of etherification, esterification, crosslinking, oxidation, alkaline treatment, acid and / or enzymatic hydrolysis.
  • the present invention also relates to an enzyme composition containing starch branching enzymes extracted from unicellular algae, significantly depleted in enzymes with amylase activity and debranching starch.
  • branching enzymes also called branching enzymes
  • branching enzymes are found in plants where they help build up the starch reserve polymer. These enzymes are more particularly involved in the synthesis of the branched fraction of starch, 1 amyiopectin, and in the synthesis of a few branching points of the linear fraction of starch, 1 amylose.
  • starch branching enzymes catalyze the hydrolysis of the glucosidic bonds -1,4 and their transformation into glucosidic bonds ⁇ -1,6. These enzymes are therefore transfer enzymes, namely 1,4- -D- glucan: 1, 4- ⁇ -D-glucan 6- -D- (1, 4- -D-glucano) - transferases.
  • Starch branching enzymes are very diverse. They are usually classified into two classes: starch branching enzymes of type I and those of type II. Type I branching enzymes branch linear structures such as amylose at a higher rate than amyiopectin and preferentially transfer long glucosidic chains (Degree of polymerization or average DP of these chains (between 10 and 30).
  • type II branching enzymes branch linear structures such as amylose, at a slower rate than amyiopectin and preferentially transfer shorter glucosidic chains.
  • microbial world all living microorganisms such as in particular bacteria, yeasts, molds and unicellular algae.
  • the branching enzymes which can be isolated from bacteria or yeasts and which are capable of modifying starch and its derivatives are the branching enzymes which participate in the synthesis of another reserve polymer, glycogen. These glycogen branching enzymes belong to the same group as the starch branching enzymes, even if their specificity of action is different, especially in terms of the length of glucosidic chains transferred (average D.P. from 3 to 5).
  • US Pat. No. 4,454,161 describes, for example, a glycogen branching enzyme isolated from Bacill us megateri um, used to improve the quality of starch from different foods, preventing the tendency to downgrade structures prepared from starch and increasing their indigestibility and therefore their properties of dietary fiber.
  • Patent EP 418,945 also claims, for the same application as that mentioned above, the use of a thermostable glycogen branching enzyme isolated from Bacill us stearothermophil us.
  • this type of enzyme is far from equaling the specificity and the diversity of actions of starch branching vegetable enzymes. These enzymes therefore do not meet the ever-increasing demand for a greater variety of branched compounds which are new in their structures and in their properties.
  • an advantageous source of branching enzymes is the unicellular algae, which accumulates starch and therefore, like higher plants, has starch branching enzymes .
  • the branching enzymes that can be isolated from unicellular algae have been described by FREDERICK (1973, Ann. NY Acad. Sci., 210, 254-264), who was one of the first to report the existence of an enzyme Q in the alga Chl orella pyrenoidosa, enzyme capable of transferring on amyloidosis a length distribution of glucosidic chains characteristic of amyiopectin.
  • This enzyme was purified from polyacrylamide gels in which all the enzymes extracted from this alga were migrated by electrophoresis.
  • electrophoretic process pertaining to analytical techniques, cannot in any way lead to the obtaining of a sufficient quantity of enzymes which can make it possible to envisage an industrial application aiming at transforming them, by plugging them in. starch or its derivatives.
  • contaminating enzymes Two categories of contaminating enzymes are generally described during the purification processes of starch branching enzymes which are extracted from higher plants, contaminating enzymes also present in unicellular algae.
  • enzymes with amylase activity and enzymes with starch-disconnecting activity (mainly with isoamylase-type activity which specifically hydrolyze -1,6 bonds).
  • Elimination of enzymes with amylase activity is therefore usually considered as the first operation to be carried out before any purification process proper.
  • the enzymes with debranching activity constitute however the major problem encountered for the isolation of starch branching enzymes.
  • these debranching enzymes are co-purified with the starch branching enzymes, because they have similar physico-chemical properties.
  • starch branching enzymes in order to obtain original starch and starch derivatives both in their structures and in their properties, this in order to find new applications for starch and its derivatives, especially in the food industry, and to prepare these starch branching enzymes in a simple, efficient and industrializable manner.
  • the present invention relates to a process for the preparation of a mixture of starch branching enzymes extracted from unicellular algae, characterized in that: a. modifies a unicellular algae so that it no longer expresses starch disconnecting activity, b. processes this modified unicellular algae so as to obtain a concentrated ⁇ -cellular extract, c. performs a molecular sieving of this concentrated ⁇ -cellular extract so as to obtain said mixture of starch branching enzymes extracted from algae.
  • the mixture of starch branching enzymes according to the invention consists of all the starch branching enzymes of type I and type II of the unicellular alga.
  • the first step of the process according to the invention consists in modifying a unicellular algae so that it no longer expresses the starch disconnecting activity.
  • the Applicant company has overcome a particularly strong technical prejudice, since it has always been recommended to eliminate contaminating amylase activities in the first place. Indeed, these enzymatic activities interfere with the measurements of the starch branching activities carried out in the different fractions sampled during the purification steps.
  • the Applicant company has however found that the use of single-cell algae is suitable advantageously at a preliminary stage of elimination of the debranching activity of the starch, which then makes it possible to efficiently separate the branching enzymes from the starch disconnecting enzymes.
  • the Applicant Company therefore imagined modifying the unicellular algae to eliminate the enzymatic activity of disconnection of the starch rather than using, as usual, a chromatographic separation step.
  • the unicellular alga is modified by mutation, and more particularly still by mutation by insertion at the locus of the gene coding for the starch-unplugging enzyme.
  • locus is intended to mean the position on the chromosome where the gene coding for the enzyme of interest is located, in this case here the starch-disconnecting enzyme.
  • the insertion mutation known to those skilled in the art, consists in promoting the punctual integration of DNA fragments into the genome of the unicellular alga.
  • the selection of mutants which no longer produce starch but accumulate phytoglycogen makes it possible to isolate the insertion mutants at the locus coding for the starch-unplugging enzyme.
  • the second step of the process according to the invention consists in treating this modified unicellular alga so as to obtain a concentrated ⁇ -cellular extract.
  • the ⁇ -cellular extract is defined as the set of proteins with or without enzymatic activities, which will be extracted from the unicellular algae concentrate. This ⁇ -cellular extract is obtained by first carrying out a culture of this unicellular alga modified on a large scale, so as to obtain a culture of optimal cell density.
  • This culture is to be adapted to the physiology of the unicellular alga considered, in terms of directly assimilable carbon and nitrogen sources, duration and fermentation process.
  • the culture is preferably carried out until the end of the exponential growth phase.
  • the cell suspension obtained at the end of the preceding culture is then concentrated by means of a cell separator, for example by centrifugation or filtration on a support whose porosity is adapted to the size of the cells collected.
  • this concentration step is carried out for example by centrifugation so as to reach a density preferably greater than 10 9 cells / ml, value for which the Applicant company has obtained the mixture of branching enzymes from l starch with the best yield.
  • the a-cellular extract is finally obtained from the unicellular algae concentrate by rupture of the membrane envelopes of the unicellular algae by any lysis method known to those skilled in the art, in particular mechanically, sonically, chemically or enzymatically.
  • a mechanical lysis for example by grinding the concentrated single-cell algae with a FRENCH press and then filtration to remove insoluble debris.
  • the third step of the process according to the invention consists in carrying out molecular sieving of this concentrated ⁇ -cellular extract so as to obtain the mixture of starch branching enzymes extracted from algae.
  • This molecular sieving step can advantageously consist of a chromatographic separation or a separation on an ultrafiltration membrane, preferably a chromatographic separation on gel filtration.
  • hydrophobic compounds capable of reducing the efficiency of the molecular sieving step.
  • These hydrophobic compounds are mainly constituted by the chlorophyll pigments of the unicellular alga.
  • the molecular sieving step makes it possible to fractionate all of the proteins, with or without enzymatic activities, extracted from the unicellular algae concentrate and recover the molecular weight fractions corresponding to the size of the starch branching enzymes, size usually between 70,000 and 90,000 daltons.
  • a column of filtration gel is chosen, the support of which has a porosity which makes it possible to resolve proteins. whose molecular size is that of the starch branching enzymes extracted from algae.
  • an allyl-dextran-sephacryl type gel filtration column can be used, with a fractionation range of 1,000 to 100,000 daltons, which thus results in a single pass in obtaining a mixture of enzymes where the branching activities starch is present in the first elution fractions.
  • the measurement of the amylase activities, but also that of the starch branching activities, is carried out in each of the fractions collected.
  • the process according to the invention in fact leads to a delayed elution of proteins with amylase activities to the benefit of enzymes with starch branching activities.
  • an enzyme composition is thus obtained as a new product, characterized in that it contains a mixture of starch branching enzymes of type I and type II extracted from unicellular algae and in that 'it is significantly, even completely depleted in enzymes with amylase activities and starch debranching.
  • the starch branching enzymes obtained as a mixture and contained in the enzymatic composition according to the invention will then make it possible to carry out the modification of the starches and / or its derivatives.
  • the modification of a polyglucosylated structure of the amyiopectin type is firstly determined by measuring the variation in the wavelength of the maximum absorption of the complex formed between the modified amyiopectin and the iodine, relative to the wavelength of the unmodified amyiopectin control. A variation of more than one indicates a significant modification of the starting structure.
  • the size of the glucosidic chains transferred to the amyiopectin is also measured by carrying out, in vi tro, the incubation of the amyiopectin with the mixture of starch branching enzymes extracted from algae, its treatment with isoamylase of so as to cleave all the connection points at 0-1.6, and the determination of the length of the chains thus released by chromatographic methods, for example by anion chromatography with amperometric detection. A comparison is then made of the lengths of chains thus obtained with those released from standard amyiopectin disconnected by the same technique, which makes it possible to characterize the modified amyiopectin.
  • Chromatograms obtained by anion chromatography with amperometric detection usually indicate a majority of chains of DP 6, DP 7 and DP 8, with very little DP 1 to DP 5 for amyiopectin standard, whereas on the contrary a majority of chains from DP 1 to DP 5 are obtained for the modified amyiopectin.
  • the distribution profiles of the lengths of chains transferred by the starch branching enzymes of higher plants average DP from 10 to 30 for starch branching enzymes of type I and average DP from 6 to 7 for starch branching enzymes type II
  • the products obtained after modification by the mixture of starch branching enzymes extracted from algae are, to the knowledge of the Applicant company, new.
  • Example 1 Obtaining a unicellular alga
  • the strategy chosen is based on the introduction of a chromosomal plasmid insertion mutation in Chlamydomonas reinhardtii, following the protocol established by KINDLE et al., 1989, in The Journ. Cell Biol, 109., 2589-
  • a 15 ml tube 0.5 ml of this cell suspension is mixed with 0.5 ml of glass beads. 1 mm in diameter and 10 ⁇ g of DNA constituted by the plasmid pARG7.8, into which has been introduced a 7.8 kbp sequence derived from the nuclear genome of Chlamydomonas reinhardtii and coding for the argino-succinate lyase.
  • the tubes are then shaken vigorously for 1 min. After adding 10 ml of HSA medium supplemented with arginine, the cells are immediately transferred to a second tube, to remove the glass beads.
  • the cells After centrifugation at 3000 g for 10 min, the cells are taken up in 400 ⁇ l of HSA medium and spread on HSA agar medium without arginine.
  • the 15,000 transformants thus obtained which have become prototrophic for arginine, are then screened to find the strains deficient for the biosynthesis of starch. After 5 days of culture on a nitrogen deficiency agar medium, the colonies are stained with iodine vapor directly on the petri dish. The wild colonies appearing midnight blue, all the other transformants are selected. At the end of this mutagenesis, the strains of a new phenotype are isolated. These present a production of starch reduced to less than 0.1% of that accumulated in the wild strain. This original phenotype results from the alteration of the STA 7 gene, responsible for the synthesis of the starch disconnecting activity.
  • Example 2 Culture of the mutant alga and production of the depigmented ⁇ -cell extract.
  • Mutant alga is cultivated in medium HSA until reaching a cell density of 9.10 e cells / ml, characteristic of the stationary phase.
  • the proteins of the extract are measured by the BRADFORD method (Assay kit marketed by the company BIO-RAD).
  • the ⁇ -cellular extracts are subjected to a precipitation of the pigments by treatment with 50 ⁇ lJml of 10% protamine sulfate for 15 min in ice, then centrifuged again at 10,000 g for 15 min at 4 ° C in order to recover the supernatant .
  • said supernatant is precipitated with 35% ammonium sulphate.
  • the depigmentation and precipitation steps with ammonium sulphate led to the recovery of 75 mg of total protein, and made it possible to eliminate 50% of proteins other than enzymes starch connection.
  • Example 3 Chromatographic separation and preparation of the mixture of starch branching enzymes extracted from algae.
  • the 75 mg of proteins in 2 ml of sample are deposited on an SLC / Sephacryl 2.6 x 60 cm FPLC column of PHARMACIA on an allyl dextran support bridged with N, N 'methylene bis-acrylamide in spherical gel of 25 to 75 ⁇ m in diameter, characterized by its fractionation range between 1,000 and 100,000 daltons.
  • the column outlet flow rate is fixed at 2 ml / min and fractions of 2 ml are collected by a collector of fractions marketed by the company PHARMACIA.
  • the elution buffer used is an acetate buffer containing 50 mM sodium acetate and 10 mM dithiothreitol, the pH being adjusted to 6 with acetic acid.
  • the branching activities are assayed in all the fractions collected by the indirect phosphorylase A assay method.
  • the reaction is stopped by adding 800 ⁇ l of 10% trichloroacetic acid.
  • the precipitates after one night at 4 ° C., are filtered on HATMAN paper with a porosity of 1 ⁇ m, rinsed with 5 ml of 5% trichloroacetic acid, with 5 ml of water, and finally with 5 ml of 70% ethanol. .
  • Radioactive counting is carried out by a BECKMAN counter after placing the filters in counting flasks containing 3 ml of scintillating liquid.
  • a branching enzyme unit is defined under such conditions as a nanomole of glucose-1-phosphate incorporated per minute.
  • the assay of the amylase activities is then carried out on each fraction. 100 ⁇ l of each fraction will be subjected to protein denaturation at 100 ° C for 5 min in the presence of 1% sodium dodecyl sulfate and 5% mercaptoethanol in a final volume of 115 ⁇ l, then deposited on a polyacrylamide gel (30 / 1 of acrylamide / bis-acrylamide) at 7.5%, tris HC1 250 mM pH 8.8 and SDS 0.1%, containing 0.3% of soluble potato starch for analysis by following the technique called the starch zymogram.
  • hydrolytic activities will cause local hydrolysis of the starch contained in the gel and are visualized after migration (electrophoresis of 70 min at 15 V cm-1; room temperature; buffer: 25 M tris-glycine pH 8.3, dithiothreitol 1 M, sodium dodecyl sulfate
  • the color of the residual dextrins generated by the action of these enzymes provides information on the nature of the enzymatic activity detected.
  • the first 8 fractions, representing 16 ml, for which the activity of branching enzymes is optimal (of the order of 17,340 units of branching activity), and the minimal amylastic activities (little or no amylastic activity visualized on gel) will constitute the mixture of starch branching enzymes extracted from the alga.
  • Example 4 Modification of the corn amyiopectin by the mixture of starch branching enzymes extracted from the alga.
  • the branching activities of the starch in the mixture of algae enzymes are estimated by measuring the wavelength of the maximum absorption of the complex formed by amyiopectin modified with iodine.
  • 300 ⁇ l of enzyme mixture containing 131 units of branching activity are added to 10 ⁇ l of a 15 ⁇ g / ⁇ l solution of commercial corn amyiopectin obtained by dissolving 225 mg in 12 ml of 90% dimethyl sulfide for 10 min at 100 ° C, followed by precipitation with 36 ml of ethanol overnight at 4 ° C, centrifugation for 15 min at 4,000 g and resuspension in 15 ml of water, the pH being adjusted to 7 to promote branching reactions).
  • the connected product is precipitated with 3 volumes of ethanol for 12 h at 4 ° C and then it is centrifuged at 10,000 g for 15 min at 4 ° C.
  • the determination of the chain lengths resulting from the treatment of amyiopectin by the mixture of starch branching enzymes extracted from algae was carried out as follows: 17.6 mg of amyiopectin are incubated with 17000 units of activity of connection in a volume of 21 ml, adjusted to pH 7.5. After an incubation for 6 h. at 30 ° C., the connected product is precipitated with 3 volumes of ethanol overnight at 4 ° C. then it is centrifuged at 10,000 g for 15 min at 4 ° C.
  • the hydrolysis tube is then placed in another REACTI-THERM water bath, with stirring, at a temperature of 45 ° C., then, after stabilization at this temperature, add 0.08 ml of IN sodium acetate buffer, brought to pH 3.5 with acetic acid. 5 ⁇ l of isoamylase are added at 59,000 U / ml (enzyme isolated from Pseudomonas amyloderamosa from HAYASHIBARA) and incubation is carried out at 45 ° C. for 2 h 30 min. The reaction is then stopped by bringing the reaction medium to 100 ° C for 3 min.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'obtention d'un mélange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues unicellulaires caractérisé par le fait que l'on modifie une algue unicellulaire de manière à ce qu'elle n'exprime plus d'activité débranchante de l'amidon, traite cette algue unicellulaire modifiée de manière à obtenir un extrait a-cellulaire concentré, et effectue un tamisage moléculaire de cet extrait a-cellulaire concentré de manière à obtenir ledit mélange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'UN MELANGE D'ENZYMES DE BRANCHEMENT DE L'AMIDON EXTRAITES D'ALGUES
La présente invention est relative à un procédé de préparation d'un mélange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues unicellulaires .
La présente invention a également pour objet un procédé de modification de l'amidon et de ses dérivés mettant en oeuvre ledit mélange, ainsi que l'amidon et les dérivés d'amidon modifiés ainsi obtenus. On entend par "amidon", au sens de la présente invention, l'amidon naturel ou hybride issu de pomme de terre, de pomme de terre à haute teneur à amyiopectine
(fécule axy) , de maïs, de blé, de maïs à haute teneur en amyiopectine (maïs waxy) , de maïs à haute teneur en amylose, de riz, de pois ou de manioc, les coupes ou fractions qui peuvent être faites ou obtenues des amidons, telles que l' amylose, 1 ' amyiopectine, les coupes granulorαétriques connues de l'homme de l'art sous les vocables d'amidon de blé "A" et amidon de blé "B" , et les mélanges quelconques d'au moins deux quelconques des produits susmentionnés .
Au sens de l'invention, on entend en particulier par "dérivés d'amidon", l'ensemble des amidons modifiés issus de la modification enzymatique, chimique et/ou physique, en une ou plusieurs étapes, de cet amidon.
Les dérivés d'amidon peuvent notamment être les amidons modifiés par l'une au moins des techniques connues d'éthérification, d' estérification, de réticulation, d'oxydation, de traitement alcalin, d'hydrolyse acide et/ou enzymatique.
La présente invention concerne également une composition enzymatique contenant des enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues unicellulaires, significativement appauvrie en enzymes à activité amylasique et débranchante de l'amidon.
Habituellement, les sources les plus importantes et les plus variées d'enzymes de branchement, encore appelées enzymes de ramification, se trouvent chez les plantes où elles participent à l'édification du polymère de réserve qu'est l'amidon. Ces enzymes sont plus particulièrement impliquées dans la synthèse de la fraction ramifiée de l'amidon, 1 ' amyiopectine, et dans la synthèse des quelques points de branchement de la fraction linéaire de l'amidon, 1 ' amylose.
Ces enzymes de branchement de l'amidon catalysent l'hydrolyse des liaisons glucosidiques -1,4 et leur transformation en liaisons glucosidiques α-1,6. Ces enzymes sont donc des enzymes de transfert, nommément des 1,4- -D- glucan : 1, 4-α-D-glucan 6- -D- (1, 4- -D-glucano) - transférases .
Ces enzymes sont donc avantageusement utilisées dans les domaines d'application où il y a nécessité de disposer d'amidon ou de dérivés d'amidon présentant une structure plus ramifiée que celle des amidons ou des dérivés d'amidons standards, par exemple dans des applications où 1 ' indigestibilité et/ou l'absence de tendance à la rétrogradation de l'amidon ou de ses dérivés sont recherchées.
Les enzymes de branchement de l'amidon sont d'une grande diversité. On les range habituellement en deux classes : les enzymes de branchement de l'amidon de type I et celles de type II. Les enzymes de branchement de type I branchent les structures linéaires telles que l' amylose, à une vitesse plus élevée que 1 ' amyiopectine et elles transfèrent préférentielle ent de longues chaînes glucosidiques (Degré de Polymérisation ou D.P. moyen de ces chaînes compris entre 10 et 30) .
A l'inverse, les enzymes de branchement de type II branchent les structures linéaires telles que l' amylose, à une vitesse plus basse que 1 ' amyiopectine et transfèrent préférentiellement de plus courtes chaînes glucosidiques
(D.P. moyen compris entre 3 et 9, et notamment D.P. 6 et
D.P. 7) .
Les spécialistes dans le domaine de l'utilisation des enzymes de ramification s'accordent à dire que la préparation des enzymes de branchement de l'amidon à partir des plantes supérieures n'est réalisable industriellement qu'en ayant recours aux techniques de l'ADN recombinant, qui nécessitent cependant de mettre en oeuvre des travaux longs et coûteux.
Dans ces conditions, il est souvent décidé d'entreprendre les recherches des enzymes de ramification dans le monde microbien où l'accessibilité auxdites enzymes est plus aisée qu'à partir des plantes supérieures. On entend par monde microbien l'ensemble des microorganismes vivants tels que notamment les bactéries, les levures, les moisissures et les algues unicellulaires.
Les enzymes de branchement que l'on peut isoler des bactéries ou des levures et qui sont capables de modifier l'amidon et ses dérivés sont les enzymes de branchement qui participent à la synthèse d'un autre polymère de réserve, le glycogène. Ces enzymes de branchement du glycogène appartiennent au même groupe que les enzymes de branchement de l'amidon, même si leur spécificité d'action est différente, et ce surtout en termes de longueur de chaînes glucosidiques transférées (D.P. moyen de 3 à 5) .
Le brevet US 4 454 161 décrit par exemple une enzyme de branchement du glycogène isolée de Bacill us megateri um, utilisée pour améliorer la qualité de l'amidon de différents aliments, en empêchant la tendance à la rétrogradation des structures préparées à partir de l'amidon et en augmentant leur indigestibilité et donc leurs propriétés de fibres alimentaires.
Le brevet EP 418 945 revendique également, pour la même application que celle mentionnée ci-dessus, l'utilisation d'une enzyme de branchement du glycogène thermostable et isolée de Bacill us stearothermophil us . Cependant, si ces deux brevets montrent que l'on peut aisément produire et utiliser les enzymes de branchement du glycogène pour modifier l'amidon et ses dérivés, ce type d'enzyme est loin d'égaler la spécificité et la diversité d'actions des enzymes végétales de branchement de l'amidon. Ces enzymes ne répondent donc pas à la demande sans cesse croissante d'une plus grande variété de composés ramifiés nouveaux dans leurs structures et dans leurs propriétés.
Pour remédier aux inconvénients des enzymes de branchement du glycogène, une source avantageuse d'enzymes de ramification consiste en l'algue unicellulaire, qui accumule de l'amidon et possède donc, tout comme les plantes supérieures, des enzymes de branchement de l'amidon.
Les enzymes de branchement que l'on peut isoler des algues unicellulaires ont été décrites par FREDERICK (1973, Ann . N. Y. Acad. Sci . , 210, 254-264), qui a été l'un des premiers à rapporter l'existence d'une enzyme Q dans l'algue Chl orella pyrenoidosa, enzyme capable de transférer sur 1' amylose une distribution de longueur de chaînes glucosidiques caractéristique de 1 ' amyiopectine . Cette enzyme a été purifiée à partir de gels de polyacrylamide dans lesquels on a fait migrer par électrophorèse toutes les enzymes extraites de cette algue. Cependant, un tel procédé électrophorétique, relevant des techniques analytiques, ne peut en aucune manière conduire à l'obtention d'une quantité suffisante d'enzymes qui puisse permettre d'en envisager une application industrielle visant à transformer, en les branchant, de l'amidon ou ses dérivés.
Il est donc nécessaire d'avoir recours aux techniques classiques de purification des enzymes de branchement de l'amidon à partir des plantes supérieures, si l'on souhaite disposer de quantités plus importantes d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues unicellulaires.
Cependant, la mise en oeuvre des méthodes d'extraction et de purification des enzymes de branchement de l'amidon s'accompagne d'un certain nombre de difficultés, liées à la présence d'enzymes contaminantes qui perturbent, voire inhibent l'activité desdites enzymes de branchement.
Deux catégories d'enzymes contaminantes sont généralement décrites lors des procédés de purification des enzymes de branchement de l'amidon que l'on extrait à partir des plantes supérieures, enzymes contaminantes présentes également chez les algues unicellulaires.
Il s'agit des enzymes à activité amylasique et des enzymes à activité débranchante de l'amidon (principalement à activité de type isoamylase qui hydrolysent spécifiquement les liaisons -1,6).
L'élimination des activités amylasiques contaminantes conditionne la stabilité des produits branchés que l'on obtient après avoir fait agir les enzymes de branchement sur les amidons ou ses dérivés. Sans cette précaution, les produits de branchement seraient partiellement ou totalement dégradés .
L'élimination des enzymes à activité amylasique est donc habituellement considérée comme la première opération à réaliser en préalable à tout procédé de purification proprement dit.
Cette élimination des activités amylasiques est effectuée par séparation chromatographique, généralement par chromatographie échangeuse d'anions (Mac DONALD et PREISS,
1983, Plant Physiol . , 73, 175-178 et 1985, Plant Physiol . ,
78., 849-852) .
Les enzymes à activité débranchante constituent cependant le problème majeur rencontré pour l'isolement des enzymes de branchement de l'amidon. En effet, ces enzymes débranchantes sont co-purifiées avec les enzymes de branchement de l'amidon, car elles possèdent des propriétés physico-chimiques voisines.
Dans ces conditions, pour préparer sélectivement les enzymes de branchement de l'amidon, et quelle que soit la méthode de purification employée, il faut avoir recours à des conditions opératoires et des étapes de séparation chromatographique supplémentaires tout à fait particulières et lourdes, ce qui complique alors les procédés de préparation des enzymes de branchement de l'amidon.
On constate donc que les procédés permettant de préparer les enzymes végétales de branchement de l'amidon décrits dans l'état de la technique présentent tous l'inconvénient de nécessiter de multiples étapes de purification longues et fastidieuses.
Il résulte de ce qui précède qu'il y a donc nécessité de trouver un moyen permettant :
- de disposer d'une plus grande variété d'enzymes de branchement de l'amidon, afin de conduire à l'obtention d'amidon et de dérivés d'amidon originaux tant dans leurs structures que dans leurs propriétés, ceci de manière à trouver de nouvelles applications à l'amidon et ses dérivés notamment en industrie alimentaire, et de préparer de manière simple, efficace et industrialisable ces enzymes de branchement de l'amidon.
La société Demanderesse a trouvé, après de nombreuses recherches, qu'un tel moyen pouvait consister en un procédé particulier de préparation d'enzymes de branchement de l'amidon à partir d'algues unicellulaires.
De manière plus précise, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un mélange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues unicellulaires, caractérisé par le fait que l'on : a. modifie une algue unicellulaire de manière à ce qu'elle n'exprime plus d'activité débranchante de l'amidon, b. traite cette algue unicellulaire modifiée de manière à obtenir un extrait a-cellulaire concentré, c. effectue un tamisage moléculaire de cet extrait a- cellulaire concentré de manière à obtenir ledit mélange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues.
Le mélange d'enzymes de branchement de l'amidon selon l'invention est constitué de l'ensemble des enzymes de branchement de l'amidon de type I et de type II de l'algue unicellulaire .
La première étape du procédé conforme à l'invention consiste à modifier une algue unicellulaire de manière à ce quelle n'exprime plus d'activité débranchante de l'amidon. Ce faisant, la société Demanderesse a vaincu un préjugé technique particulièrement fort, puisqu'il a toujours été recommandé d'éliminer en premier lieu les activités amylasiques contaminantes. En effet, ces activités enzymatiques gênent les mesures des activités de branchement de l'amidon effectuées dans les différentes fractions prélevées au cours des étapes de purification.
La société Demanderesse a cependant trouvé que l'utilisation d'algues unicellulaires se prêtait avantageusement à une étape préalable d'élimination de l'activité débranchante de l'amidon, ce qui permet alors de séparer efficacement les enzymes de branchement des enzymes de débranchement de l'amidon. La société Demanderesse a donc imaginé de modifier l'algue unicellulaire pour en éliminer l'activité enzymatique de débranchement de l'amidon plutôt que de mettre en oeuvre comme habituellement une étape de séparation chromatographique. De manière préférentielle, on modifie l'algue unicellulaire par mutation, et plus particulièrement encore par mutation par insertion au locus du gène codant pour l'enzyme débranchante de l'amidon.
On entend par locus, la position sur le chromosome où est localisé le gène codant pour l'enzyme d'intérêt, en l'occurrence ici l'enzyme de débranchement de l'amidon.
La mutation par insertion, connue de l'homme du métier, consiste à favoriser l'intégration ponctuelle de fragments d'ADN dans le génome de l'algue unicellulaire. La sélection des mutants qui ne produisent plus d'amidon mais accumulent du phytoglycogène permet d'isoler les mutants d'insertion au locus codant pour l'enzyme débranchante de l'amidon.
On choisit comme algue unicellulaire, une algue de l'ordre de volvocales, préférentiellement de la famille des chlorophycae et avantageusement l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii . De manière encore plus préférentielle, on choisit une algue verte Chlamydomonas reinhardtii dépourvue d'activité débranchante de l'amidon par mutation par insertion au niveau du locus sta 7. La deuxième étape du procédé conforme à l'invention consiste à traiter cette algue unicellulaire modifiée de manière à obtenir un extrait a-cellulaire concentré. Dans le cadre de la présente invention, l'extrait a- cellulaire est défini comme l'ensemble des protéines à activités enzymatiques ou non, qui seront extraites du concentrât d'algues unicellulaires. On obtient cet extrait a-cellulaire en réalisant tout dabord une culture de cette algue unicellulaire modifiée à grande échelle, de manière à obtenir une culture de densité cellulaire optimale.
Cette culture est à adapter à la physiologie de l'algue unicellulaire considérée, en termes de sources carbonées et azotées directement assimilables, de durée et de conduite de fermentation.
Pour l'algue mutante Chlamydomonas reinhardtii , on conduit la culture de préférence jusqu'à la fin de la phase exponentielle de croissance.
On concentre ensuite la suspension cellulaire obtenue au terme de la culture précédente par le moyen d'un séparateur de cellules, par exemple par centrifugation ou filtration sur un support dont la porosité est adaptée à la taille des cellules collectées.
Pour l'algue mutante Chlamydomonas reinhardtii , on conduit par exemple cette étape de concentration par centrifugation de manière à atteindre une densité préférentiellement supérieure à 109 cellules/ml, valeur pour laquelle la société Demanderesse a obtenu le mélange d'enzymes de branchement de l'amidon avec le meilleur rendement .
L'extrait a-cellulaire est enfin obtenu à partir du concentrât d'algues unicellulaires par rupture des enveloppes membranaires des algues unicellulaires par toute méthode de lyse connue de l'homme du métier, notamment de manière mécanique, sonique, chimique ou enzymatique. Selon un mode préférentiel de réalisation conforme à l'invention, on choisit d'effectuer une lyse mécanique, par exemple par le broyage des algues unicellulaires concentrées à la presse de FRENCH puis filtration pour éliminer les débris insolubles . La troisième étape du procédé conforme à l'invention consiste à effectuer un tamisage moléculaire de cet extrait a-cellulaire concentré de manière à obtenir le mélange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues.
Cette étape de tamisage moléculaire peut consister avantageusement en une séparation chromatographique ou en une séparation sur membrane d'ultrafiltration, de préférence une séparation chromatographique sur gel filtration..
Préalablement à cette étape, il peut être avantageux d'éliminer les composés hydrophobes susceptibles de diminuer l'efficacité de l'étape de tamisage moléculaire. Ces composés hydrophobes sont principalement constitués par les pigments chlorophylliens de l'algue unicellulaire.
Ce résultat est obtenu par exemple par précipitation ou par traitement chromatographique desdits pigments. On choisit avantageusement, afin de limiter au maximum les étapes de séparations chromatographiques, la précipitation des pigments au polyéthylène glycol et préférentielle ent, à la protamine sulfate.
L'étape de tamisage moléculaire permet de fractionner l'ensemble des protéines, à activités enzymatiques ou non, extraites du concentrât d'algues unicellulaires et de récupérer les fractions de poids moléculaires correspondant à la taille des enzymes de branchement de l'amidon, taille habituellement comprise entre 70 000 et 90 000 daltons . Selon un mode préférentiel conforme à l'invention, on choisit une colonne de gel filtration dont le support présente une porosité qui permet de résoudre des protéines dont la taille moléculaire est celle des enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues.
Pour ce faire, on peut utiliser une colonne de gel filtration de type allyl-dextran-séphacryl, de gamme de fractionnement 1 000 à 100 000 daltons, qui conduit ainsi en un seul passage à obtenir un mélange d'enzymes où les activités de branchement de l'amidon sont présentes dans les premières fractions d'élution.
La mesure des activités amylasiques, mais aussi celle des activités de branchement de l'amidon, est effectuée dans chacune des fractions collectées.
De manière surprenante et inattendue, . la ' société Demanderesse a constaté que l'on obtient ainsi, par la récupération des toutes premières fractions éluées, le mélange des enzymes de branchement de l'amidon débarrassé également de tout ou grande partie des activités amylasiques .
Le procédé conforme à l'invention conduit en fait à une élution retardée des protéines à activités amylasiques au bénéfice des enzymes à activités de branchement de l'amidon.
Toutes les fractions enrichies en activités de branchement, et débarrassées de tout ou grande partie des activités amylasiques sont finalement rassemblées et constituent le mélange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues unicellulaires conforme à l'invention.
De manière générale, on obtient ainsi en tant que produit nouveau, une composition enzymatique caractérisée en ce qu'elle contient un mélange d'enzymes de branchement de l'amidon de type I et de type II extraites d'algues unicellulaires et en ce qu'elle est significativement, voire totalement appauvrie en enzymes à activités amylasique et débranchante de l'amidon. Les enzymes de branchement de l'amidon obtenues en mélange et contenues dans la composition enzymatique selon l'invention vont ensuite permettre d'effectuer la modification des amidons et/ou ses dérivés. De manière préférentielle, on choisit de modifier une structure dérivée de l'amidon déjà branchée, et plus préférentiellement 1 ' amyiopectine .
La modification d'une structure polyglucosylée de type amyiopectine est déterminée dans un premier temps par la mesure de la variation de la longueur d'onde du maximum d'absorption du complexe formé entre l' amyiopectine modifiée et l'iode, par rapport à la longueur d'onde du témoin amyiopectine non modifiée. Une variation de plus de lOn traduit une modification significative de la structure de départ.
On mesure également la taille des chaînes glucosidiques transférées sur 1 ' amyiopectine en réalisant, in vi tro, l'incubation de 1 ' amyiopectine avec le mélange des enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues, son traitement à l'isoamylase de manière à cliver tous les points de branchement en 0-1,6, et la détermination de la longueur des chaînes ainsi libérées par méthodes chromatographiques, par exemple par chromatographie anionique avec détection ampérométrique. On réalise ensuite la comparaison des longueurs de chaînes ainsi obtenues avec celles libérées de 1 ' amyiopectine standard débranchée par la même technique, ce qui permet de caractériser 1 ' amyiopectine modifiée.
Les chromatogrammes obtenus par chromatographie anionique avec détection ampérométrique (DIONEX) indiquent habituellement une majorité de chaînes de D.P. 6, D.P. 7 et D.P. 8, avec très peu de D.P. 1 à D.P. 5 pour 1 ' amyiopectine standard, alors que l'on obtient au contraire une majorité de chaînes de D.P. 1 à D.P. 5 pour 1 ' amyiopectine modifiée. En regard des profils de distribution des longueurs de chaînes transférées par les enzymes de branchement de l'amidon des plantes supérieures (D.P. moyen de 10 à 30 pour les enzymes de branchement de l'amidon de type I et D.P. moyen de 6 à 7 pour les enzymes de branchement de l'amidon de type II) , les produits obtenus après modification par le mélange des enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues sont, à la connaissance de la société Demanderesse, nouveaux.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples non limitatifs décrits ci-dessous. Exemple 1. Obtention d'une algue unicellulaire
Chl amydomonas reinhardtii dépourvue d'activités débranchantes de l'amidon.
La stratégie choisie repose sur l'introduction d'une mutation par insertion chromosomique de plasmide dans Chlamydomonas reinhardtii , en suivant le protocole établi par KINDLE et al., 1989, in The Journ . Cell Biol, 109., 2589-
2601.
Une souche sauvage de Chlamydomonas reinhardtii sans paroi, défectueuse pour 1 ' arginosuccinate lyase, est cultivée sur milieu HSA (E. HARRIS Ed., 1989, 25-63.
Académie Press, San Diego, Calif.) complémenté en arginine à raison de 1 ml de solution à 100 mg/1 d' arginine stérile par litre de culture. Les cultures sont stoppées en phase exponentielle de croissance, à la densité cellulaire de 2.106 cellules/ml et concentrées à 2.10 êellules/ml par centrifugation à 3 000 g pendant 10 min.
Dans un tube de 15 ml, 0,5 ml de cette suspension cellulaire sont mélangés avec 0,5 ml de billes de verre de 1 mm de diamètre et 10 μg d'ADN constitués par le plasmide pARG7.8, dans lequel a été introduit une séquence de 7,8 kbp issue du génome nucléaire de Chlamydomonas reinhardtii et codant pour 1 ' argino-succinate lyase. Les tubes sont ensuite agités vigoureusement pendant 1 min. Après ajout de 10 ml de milieu HSA complémenté en arginine, les cellules sont immédiatement transférées dans un second tube, pour éliminer les billes de verre.
Après centrifugation à 3 000 g pendant 10 min, les cellules sont reprises dans 400 μl du milieu HSA et étalées sur milieu gélose HSA sans arginine.
Les 15 000 transformants ainsi obtenus, ' devenus prototrophes pour l' arginine, sont ensuite criblés afin de trouver les souches déficientes pour la biosynthèse de l'amidon. Après 5 jours de culture sur milieu gélose carence en azote, les colonies sont colorées par les vapeurs d'iode directement sur la boîte de Pétri. Les colonies sauvages apparaissant bleu-nuit, tous les autres transformants sont sélectionnés . A l'issue de cette mutagenèse, les souches d'un phénotype nouveau sont isolées. Celles-ci présentent une production d'amidon réduite à moins de 0,1% de celle accumulée chez la souche sauvage. Ce phénotype original résulte de l'altération du gène STA 7, responsable de la synthèse de l'activité débranchante de l'amidon.
Exemple 2. Culture de l'algue mutante et obtention de l'extrait a-cellulaire dépigmenté.
On cultive l'algue mutante en milieu' HSA jusqu'à atteindre une densité cellulaire de 9.10e cellules/ml, caractéristique de la phase stationnaire .
On inocule ensuite 10 litres de milieu HSA avec la culture précédente de manière à obtenir une densité cellulaire initiale de 5.104 cellules/ml, en maintenant une agitation constante et sous lumière continue de 2 000 à 4 000 lux. Les cultures sont arrêtées lorsque leur concentration finale est de 4.106 cellules/ml. On concentre les algues unicellulaires à 4,5.109 cellules/ml. Les cellules ainsi récupérées sont lysées mécaniquement par deux passages à la presse de FRENCH à une pression de 7.107 Pa.
Les protéines de l'extrait sont dosées par la méthode de BRADFORD (Kit de dosage commercialisé par la société BIO- RAD) .
Les extraits a-cellulaires sont soumis à une précipitation des pigments par traitement à 50 μlJml de protamine sulfate à 10 % pendant 15 mn dans la glace, puis centrifugés à nouveau à 10 000 g pendant 15 min à 4°C afin de récupérer le surnageant. Pour amener le volume d'extrait à 2 ml, on précipite ledit surnageant au sulfate d'ammonium à 35 %. Sur les 287 mg de protéines totales obtenus dans l'extrait brut, les étapes de dépigmentation et de précipitation au sulfate d'ammonium ont conduit à récupérer 75 mg de protéines totales, et ont permis d'éliminer 50 % des protéines autres que les enzymes de branchement de 1 ' amidon.
Exemple 3. Séparation chromatographique et préparation du mélange des enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues.
Les 75 mg de protéines dans 2 ml d'échantillon sont déposés sur une colonne FPLC S100 / séphacryl 2,6 x 60 cm de PHARMACIA sur un support allyle dextran ponté par du N,N' méthylène bis-acrylamide en gel sphérique d'un diamètre de 25 à 75 μm caractérisé par sa gamme de fractionnement comprise entre 1 000 et 100 000 daltons.
Le débit de sortie de la colonne est fixé à 2 ml/min et des fractions de 2 ml sont récupérées par un collecteur de fractions commercialisé par la société PHARMACIA. Le tampon d'élution utilisé est un tampon Acétate renfermant de l'acétate de sodium 50 mM et du dithiothreitol 10 mM, le pH étant ajusté à 6 par l'acide acétique. On réalise le dosage des activités de branchement dans toutes les fractions collectées par la méthode de dosage indirecte à la phosphorylase A.
20 μl d'échantillons sont ajoutés à 180 μl d'un mélange réactionnel renfermant du citrate de sodium 250 mM à pH 7, de l'adénosine 5' monophosphate 1 mM, de la phosphorylase A de muscle de lapin à 0,2 μg/μl, du glucose-1-phosphate 45 mM et du [U-14C] glucose-1-phosphate à 3,8 ^μM ('dont la radioactivité spécifique est de 10,5 . 109 Bq/mmol) .
Après une heure à 30°C, la réaction est arrêtée par ajout de 800 μl d'acide trichloroacétique 10 %. Les précipités, après une nuit à 4°C, sont filtrés sur papier HATMAN de porosité 1 μm, rincés par 5 ml d'acide trichloroacétique 5%, par 5 ml d'eau, et enfin par 5 ml d'éthanol à 70 %. Le comptage radioactif est réalisé par un compteur BECKMAN après avoir placé les filtres dans des fioles de comptage contenant 3 ml de liquide scintillant.
Une unité d'enzyme de branchement se définit dans de telles conditions comme une nanomole de glucose-1-phosphate incorporée par minute. On réalise ensuite le dosage des activités amylasiques sur chaque fraction. 100 μl de chaque fraction vont être soumis à une dénaturation des protéines à 100°C pendant 5 mn en présence de sodium dodécyl-sulfate 1% et mercaptoéthanol 5% dans un volume final de 115 μl, puis déposés sur un gel de polyacrylamide (30/1 de acrylamide/bis-acrylamide) à 7,5 % , tris HC1 250 mM pH 8,8 et SDS 0,1 %, contenant 0,3 % d'amidon soluble de pomme de terre pour l'analyse en suivant la technique dite du zymogramme amidon. Les activités hydrolytiques vont entraîner une hydrolyse locale de l'amidon contenu dans le gel et sont visualisées après migration (electrophorèse de 70 mn à 15 V cm-1 ; température ambiante; tampon : tris-glycine 25 M pH 8,3 , dithiothreitol 1 M, sodium dodécyl-sulfate
0,1 %) , renaturation (2 heures sous agitation lente; température ambiante; tampon tris 40 mM) , incubation (une nuit sous agitation lente à température ambiante en tampon tris-glycine 25 mM à pH 8,3 et dithiothreitol 20 mM) et enfin coloration à l'iode.
La couleur des dextrines résiduelles engendrée par l'action de ces enzymes renseigne sur la, nature de l'activité enzymatique détectée.
Les 8 premières fractions, représentant 16 ml, pour lesquelles l'activité des enzymes de branchement est optimale (de l'ordre de 17 340 unités d'activité de branchement) , et les activités amylasiques minimales (peu ou pas d'activité amylasique visualisée sur gel) constitueront le mélange des enzymes de branchement de l'amidon extraites de l'algue.
Exemple 4. Modification de 1 ' amyiopectine de maïs par le mélange des enzymes de branchement de l'amidon extraites de l'algue.
On réalise d'abord l'estimation des activités branchantes de l'amidon du mélange des enzymes d'algues, par la mesure de la longueur d'onde du maximum d'absorption du complexe formé par 1 ' amyiopectine modifié avec l'iode. 300 μl de mélange d'enzymes contenant 131 unités d'activité de branchement sont ajoutés à 10 μl d'une solution à 15 μg/μl d' amyiopectine commerciale de maïs obtenue par dissolution de 225 mg dans 12 ml de diméthylsuifoxyde 90 % pendant 10 mn à 100°C, suivi de la précipitation par 36 ml d'éthanol une nuit à 4°C, centrifugation 15 mn à 4 000 g et resuspension dans 15 ml d'eau, le pH étant ajusté à 7 pour favoriser les réactions de branchement) .
Après incubation une nuit à 30°C, le produit branché est précipité par 3 volumes d'éthanol durant 12h à 4°C puis il est centrifugé à 10 000 g pendant 15 mn à 4°C.
Un spectre d'absorption entre 400 et 700 nm est réalisé à partir du produit branché qui est redissout dans 100 μl de soude 0,01 N puis 60 μl de cette solution est mélangé à 400 μl d'iode IX (0,0025% de 12 ; 0,25 % de IK) . La longueur d'onde du complexe amyiopectine de maïs avec l'iode est de 530 nm, et celui du complexe amyiopectine de maïs modifiée par le mélange d'enzymes de .branchement d'amidon extraites d'algues avec l'iode est de 505 nm. La différence de 25 nm traduit bien une modification significative de l' amyiopectine et l'apparition de nouveaux branchements de cette structure.
La détermination des longueurs de chaînes résultantes du traitement de 1 ' amyiopectine par le mélange des enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues a été effectuée comme suit : 17,6 mg d' amyiopectine sont incubés avec 17000 unités d'activités de branchement dans un volume de 21 ml, ajusté à pH 7,5. Après une incubation pendant 6 h. à 30°C, le produit branché est précipité par 3 volumes d'éthanol durant une nuit à 4°C puis il est centrifugé à 10000 g pendant 15 mn à 4°C.
17,6 mg d' amyiopectine ainsi modifiée sont repris dans 1,1 ml d'eau et agités vigoureusement, puis on ajoute 0, 17 ml de DMSO et porte le mélange à 100°C dans un tube à hydrolyse au bain-marie REACTI-THERM, avec agitation, sans vide, pendant 6 min.
On place ensuite le tube à hydrolyse dans un autre bain-marie REACTI-THERM, avec agitation, à une température de 45°C, puis, après stabilisation à cette température, on ajoute 0,08 ml de tampon acétate de sodium IN, amené à pH 3,5 avec de l'acide acétique. On ajoute 5 μl d'isoamylase à 59000 U/ml (enzyme isolée de Pseudomonas amyloderamosa de HAYASHIBARA) et on incube à 45°C pendant 2h30. On arrête ensuite la réaction en portant le milieu réactionnel à 100°C pendant 3 min.
On réalise en parallèle une opération identique sur 17,6 mg d' amyiopectine non modifiée, ce qui constitue le témoin de la réaction. Les résultats obtenus par chromatographie anionique avec détection ampérométrique (DIONEX) indiquent une majorité de chaînes de D.P. 6, D.P. 7 et D. P.- 8, avec très peu de D.P. 1 à D.P. 5 pour 1 ' amyiopectine standard, tandis que les résultats correspondant à 1 ' amyiopectine modifiée indiquent au contraire une majorité de chaînes de D.P. 1 à D.P. 5, ce qui traduit une redistribution des longueurs de chaînes glucosidiques.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un mélange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues unicellulaires caractérisé par le fait que l'on : a. modifie une algue unicellulaire de manière à ce qu'elle n'exprime plus d'activité débranchante de l'amidon, b. traite cette algue unicellulaire modifiée de manière à obtenir un extrait a-cellulaire concentré, c. effectue un tamisage moléculaire de cet extrait a- cellulaire concentré de manière à obtenir ledit mélange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé -par le fait que l'on conduit l'étape a en modifiant l'algue unicellulaire par une technique de mutation par insertion.
3. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'on conduit l'étape b en effectuant une lyse de l'algue unicellulaire de manière mécanique, sonique, chimique ou enzymatique, de préférence de manière mécanique.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on conduit l'étape c en effectuant un tamisage moléculaire par une technique de séparation chromatographique ou de séparation sur membrane d'ultrafiltration , de préférence par une technique de séparation chromatographique sur gel filtration.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'algue unicellulaire est l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii .
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii est dépourvue d'activité débranchante de l'amidon par mutation par insertion au niveau du locus sta7 .
7. Composition enzymatique caractérisée en ce qu'elle contient un mélange d'enzymes de branchement de l'amidon de type I et de type II extraites d'algues unicellulaires et en ce qu'elle est significativement, voire totalement appauvrie en enzymes à activités amylasique et débranchante de 1 ' amidon
8. Procédé de modification de l'amidon et de ses dérivés, caractérisé par le fait que l'on fait agir sur l'amidon et/ou sur l'un au moins de ses dérivés un mélange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues unicellulaires obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à '6.ou une composition enzymatique conforme à la revendication 7.
9. Amidons et dérivés d'amidon modifiés susceptibles d'être obtenus par la mise en oeuvre d'un procédé conforme à la revendication 8.
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