WO2000015763A1 - Verwendung von nanocells in kulturmedien-endprodukten - Google Patents

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WO2000015763A1
WO2000015763A1 PCT/CH1999/000420 CH9900420W WO0015763A1 WO 2000015763 A1 WO2000015763 A1 WO 2000015763A1 CH 9900420 W CH9900420 W CH 9900420W WO 0015763 A1 WO0015763 A1 WO 0015763A1
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WO
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nanocell
vitamin
end products
culture media
component
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PCT/CH1999/000420
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Andreas Werner Supersaxo
Marc Antoine Weder
Hans Georg Weder
Hans Konrad Biesalski
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Vesifact Ag
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins

Definitions

  • the present invention relates to the use of NanoCells in culture media end products, culture media end products containing these NanoCells and the various uses of these culture media end products.
  • Culture media end products in the sense of the present invention are e.g. Media for the cultivation and investigation of cells, fungi, bacteria, viruses, bacteriophages, insects and plants, media for the in vitro or ex vivo cultivation and investigation of organs and tissues, media for freezing cells, fungi, bacteria, viruses, bacteriophages , Insects, plants, organs and tissues, embryo transfer freezing media, media for therapy (adoptive immunotherapy, cancer treatment), media for perfusion of organs such as Kidney or liver, media for storing organs until they are transplanted, and supplements for the above media.
  • the invention is based on the object of lipophilic, i.e. to incorporate poorly water-soluble or water-insoluble substances into end products of culture media in such a way that
  • vehicles such as micelles, mixed micelles, liposomes or finely emulsified emulsions are also used to introduce lipophilic substances.
  • these vehicles particularly in high concentrations, are often toxic to cells, fungi, bacteria, viruses, bacteriophages, insects, plants, tissues and organs or influence the function of the biological system kept in culture.
  • the functional influencing of the biological systems kept in culture makes the interpretation of pharmacological, toxicological, metabolic and regulatory examinations impossible or difficult.
  • the low loading capacity with hydrophobic substances as well as the insufficient stability in certain culture media are further reasons which can limit the use of these vehicles.
  • methylbetacyclodextrin has the decisive disadvantage that it "punctures" the cell membrane and, as has been repeatedly found, disregulates calcium flux; i.e. there is an influx of calcium into the cell with all subsequent processes activated by calcium.
  • the invention is also based on the object of incorporating lipophilic compounds into end products of culture media which are particularly suitable for organ storage until their transplantation.
  • Various lipid-soluble compounds are suitable for protecting cells and tissues against transient ischemia, but very particularly also against reperfusion.
  • reperfusion phase With changed oxygen supply.
  • This so-called ischemia / reperfusion due to the breakdown of ATP during ischemia, leads to an activation of enzyme systems which, depending on the availability of oxygen, then metabolize the breakdown products of ATP, with considerable amounts of reactive oxygen compounds being formed.
  • lipid-soluble antioxidants such as 3-carotene, vitamin E, but also water-soluble vitamin C are suitable for suppressing the formation of such reactive oxygen compounds, including their secondary products, which occur in ischemia / reperfusion syndrome.
  • the perfusion media used were either fat solutions or the donor organs were pre-orally given vitamins
  • a lipophilic constituent, lipophilic, ie water-insoluble or sparingly water-soluble substances can be introduced into end products of culture media, so that the cells, fungi, bacteria, viruses, bacteria, viruses, bacteriophages, insects, plants or tissues neither grow nor grow are adversely affected in their functions.
  • the particular advantage of this NanoCell is that it is an extremely physiological form of application that, unlike all other solubilizers of fat-soluble compounds, can also be used easily under in vivo conditions.
  • endothelial cells, but also other cellular compartments such.
  • B. fibroblasts or intestinal mucosa cells absorb vitamins well in this form, also allows use for the application of vitamins in the buccal mucosa.
  • lipophilic compounds such as Bring antioxidants in perfusion solutions that are suitable as
  • Organ preservation solutions to be used So far - available in vitro and in vivo studies, which have been carried out with such antioxidant formulations, show that in this way the antioxidative vitamins in the critical cell compartments, especially the endothelial cells, are actually accumulated. This accumulation was not expected since the cells are normally only supplied via lipo-protein-bound antioxidants. With the available experimental approaches it could also be shown that the infusion of antioxidant vitamins via the NanoCell technology leads to a first pass effect in the organ, i. H. leads in the critical cells of the perfused organ. With this, however, the organ is protected in a physiological manner with the help of the antioxidants so applied, so that the use of antioxidants in this form is suitable for improving organ preservation and preservation.
  • NanoCells are their high loading capacity with lipophilic substances as well as the good stability in the end products of culture media.
  • the present invention therefore relates to the use of a NanoCell containing, as preparative composition (a), a membrane-forming molecule,
  • the NanoCell preferably contains (a) as membrane-forming molecules, substances which are suitable for forming two-layer systems (so-called “bilayers”),
  • the NanoCell preferably contains a phospholipid, a hydrogenated or partially hydrogenated phospholipid, a lysophospholipid or mixtures of these compounds.
  • a phospholipid of the formula is very particularly preferred
  • R 1 C 10 -C 20 acyl
  • R 2 is hydrogen or
  • R3 is hydrogen, 2-trimethylamino-l-ethyl, 2-amino-l-ethyl, unsubstituted or by one or more
  • Carboxy, hydroxy or amino groups substituted C j -C ⁇ alkyl mean the inositol or glyceryl group, or salts of these compounds.
  • Straight chain with an even number of carbon atoms are, for example, n-dodecanoyl, n-tetradecanoyl, n-hexadecanoyl or n-octadecanoyl.
  • Straight chain e i ner double bond and an even number of carbon atoms are 6-cis- or 6-trans-, for example, 9-cis- or 9-trans-dodecenoyl, -Tetradece- noyl, -Hexadecenoyl, -Octadecenoyl or -Icosenoyl, in particular 9-cis-octa-decenoyl (oleoyl), further 9,12-cis-octadecadienoyl or 9, 12, 15-cis-octadecatrienoyl.
  • a phospholipid of the formula (1) in which R is 2-trimethylamino-1-ethyl is designated with the trivial name lecithin and a phospholipid of the formula (1) in which R3 is 2-amino-1-ethyl is designated with the trivial name cephalin.
  • cephalin naturally occurring cephalin or lecithin are suitable, e.g. Kephalin or lecithin from soybeans or hen's egg with different or identical acyl groups or mixtures thereof.
  • the phospholipid of formula (1) can also be of synthetic origin.
  • synthetic phospholipid defines phospholipids which have a uniform composition with respect to R 1 and R 2.
  • Such synthetic phospholipids are preferably the lecithins and cephalins defined above, whose acyl groups R-L and R2 have a defined structure and are derived from a defined fatty acid with a degree of purity higher than approximately 95%.
  • R ⁇ and R2 can be the same or different and unsaturated or saturated.
  • R ⁇ is saturated, e.g. n-hexadecanoyl, and R unsaturated, e.g. 9-cis-octadecenoyl (oleoyl).
  • naturally occurring phospholipid defines phospholipids which have no uniform composition with respect to R ] _ and R2. Such natural phospholipids are also lecithins and kephalins, the acyl groups RL and R2 of which are derived from naturally occurring fatty acid mixtures.
  • the requirement of "essentially pure" phospholipid of the formula (1) defines a degree of purity of more than 90 % By weight, preferably more than 95% by weight. of the phospholipid of the formula (1), which can be detected using suitable determination methods, for example paper or thin-layer chromatography, using HPLC or an enzymatic staining test.
  • R 3 with the meaning C ⁇ -C ⁇ j alkyl, for example methyl or ethyl.
  • the ⁇ meaning methyl is preferred.
  • R with the meanings substituted by one or more carboxy, hydroxyl or amino groups C - ⁇ - C ⁇ alkyl are, for example, 2-hydroxyethyl, 2, 3-dihydroxy-n-propyl,
  • Carboxymethyl 1- or 2-carboxyethyl, dicarboxymethyl, 2-carboxy-2-hydroxyethyl or 3-carboxy-2, 3-dihydroxy-n-propyl, 3-amino-3-carboxy-n-propyl or 2-amino-2 -carboxy- n-propyl, preferably 2-amino-2-carboxyethyl.
  • Phospholipids of formula (1) with these groups can be used in salt form e.g. as sodium or potassium salt.
  • Phospholipids of the formula (1), in which R3 denotes the inositol or the glyceryl group, are known under the names phosphatidylinositol and phosphatidylglycerol.
  • acyl radicals in the phospholipids of the formula (1) the names given in parentheses are also common: 9-cis-dodecenoyl (lauroleoyl), 9-cis-tetradecenoyl (myristoleoyl), 9-cis-hexadecenoyl (palmitoleoyl), 6-cis - octadecenoyl (petroseloyl), 6-trans-octadecenoyl (petrose-laidoyl), 9-cis-octadecenoyl (oleoyl), 9-trans-octadecenoyl (elaidoyl), 9, 12-cis-octadecadienoyl (linoleoyl), 9.12, 15-cis-octadecatrienoyl (linolenoyl), 11-cis-octadecenoyl (
  • a salt of the phospholipid of formula (1) is acceptable. Salts are defined by the existence of salt-forming groups in the substituent R3 and by the free hydroxyl group on the phosphorus. The formation of internal salts is also possible. Alkali metal salts, in particular sodium salts, are preferred.
  • purified lecithin from soybeans of the quality LIPOID S 100 or S75 or a lecithin defined in the monograph of USP23 / NF 18 is used.
  • Component (a) is preferably used in a concentration of approximately 0.1 to 30% by weight, based on the total weight of components (a), (b) and (c).
  • An emulsifier or emulsifier mixtures which preferably form O / W structures are preferably used as component (b).
  • Particularly preferred emulsifiers are:
  • Alkali, ammonium and aminium salts of fatty acids are lithium, sodium, potassium, ammonium, triethylamine, ethanolamine, diethanolamine or triethanolamine salts.
  • the sodium, potassium or ammonium (NR2R2R3) salts are used, where R ⁇ , R and R3 independently of one another are hydrogen, C ⁇ -C ⁇ alkyl or C ⁇ -C ⁇ hydroxyalkyl.
  • Saturated and unsaturated alkyl sulfates such as e.g. Sodium docecyl sulfate and alkane sulfonates such as e.g. Sodium docecansulfona; Salts of bile acid such as Sodium cholate, sodium glycocholate and sodium taurocholate;
  • Invert soaps such as zetylpyridinium chloride; Partial fatty acid esters of sorbitan such as sorbitan monolaurate; Sugar esters such as sucrose monolaurate; Alkyl glucosides, such as n-octyl glucoside or n-dodecyl glucoside;
  • Alkyl maltosides such as n-dodecyl maltoside
  • Fatty acid partial glycerides such as e.g. Lauric acid monoglyceride;
  • Polyglycerol esters of fatty acids - propylene glycol esters of fatty acids;
  • Lactic acid esters of fatty acids such as Sodium stearoyl lactyl-2-lactate
  • Emulsifiers of the polyoxyethylene type are very particularly preferred. Examples of such emulsifiers are:
  • Polyethoxylated sorbitan fatty acid esters such as e.g. Polysorbate 80;
  • Vegetable oils such as polyoxyethylene glycolated natural or hydrogenated castor oils
  • Polyethoxylated fatty acid partial glycerides such as e.g.
  • Diethylene glycol monostearate - Polyethoxylated fatty alcohols such as Oleth-20,
  • Polyethoxylated fatty acids such as Polyoxyl 20 stearate,
  • Polyethoxylated lanolin and its derivatives such as e.g.
  • Block polymers of ethylene oxide and propylene oxide e.g. Poloxamer 188
  • Component (b) is present in the NanoCell used according to the invention in a concentration of approximately 1 to approximately 50% by weight, based on the total weight of components (a), (b) and (c).
  • Component (c) is preferably a natural, a synthetic or a partially synthetic di- or triglyceride, a lipophilic substance customary for culture media or mixtures of these substances.
  • suitable substances are e.g. B. essential, the growth of cells, fungi, bacteria, ⁇ viruses, bacteriophages, insects, plants, tissues, etc. supporting substances such as vitamins, amino acids, peptides, natural or recombinant proteins, carbohydrates, lipids, nucleic acids, ribonucleosides, deoxyribonucleosi- de, inorganic salts and trace elements; also natural, semi-synthetic or synthetic active ingredients such as antioxidants, antibiotics, antifungals, hormones; Mixtures of substances for screenings and markers for the investigation of cell biological functions.
  • vitamins are vitamin A, vitamin B and vitamin B 2 , vitamin B 6 , nicotinamide, pantothenic acid, vitamin B 12 , vitamin B 15 , folic acid, biotin, vitamin C, vitamin D, vitamin E, vitamin F, vitamin K and vitamin P.
  • amino acids and peptides are alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine, glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, Histidine, glycyl-L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine and hydroxy-L-proline.
  • EGF epidermal growth factor
  • KGF keratinocyte growth factor
  • aFGF and bFGF acidic and basic fibroblast growth factor
  • IGF-I insulin-like growth factor-I and II
  • IGF-II Nerve Growth Factor
  • PDGFs Platelet-Derived Growth Factors
  • Chemotactic factors such as macrophage / monocyte chemotactic and activating factor (MCAF); Colony-stimulating factors such as granulocyte macro phage colony stimulating factor (GM-CSF) and granulocyte colony stimulating factor (G-CSF); Interferons and interleukins; Cell adhesion and extracellular matrix proteins such as collagens, fibronectins, integrins, laminins, merosins, proteoglycans, RGD adhesion peptides, tenascins, thrombospondins and vitronectins and enzymes such as collagenase, dispase and trypsin. Other examples of proteins are ⁇ insulin, albumin and transferrin.
  • carbohydrates examples include glucose, galactose, fructose, sucrose, maltose, ribose, deoxyribose, trehalose, tryptose and yeastolate.
  • Examples of lipids are saturated and unsaturated fatty acids and derivatives thereof.
  • Examples of saturated fatty acids are myristic acid, palmitic acid, stearic acid.
  • Examples of unsaturated fatty acids are omega-9 fatty acids such as e.g. Oleic acid, omega-6 fatty acids such as Linoleic acid, gamma-linolenic acid, dihommo-gamma-linolenic acid and arachidonic acid and omega-3 fatty acids such as e.g. alpha linolenic acid, stearidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid.
  • Other examples of lipids are cholesterol and derivatives thereof.
  • nucleic acids examples include adenine, guanine, thymidine, uracil, adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 2 '-deoxyadenosine, 2' -deoxyguanosine, 2 '-deoxycytidine, 2' -deoxythymidine, 5-methyl Deoxycytidine and 5-methylcytosine.
  • inorganic salts and trace elements are CaCl 2 , KC1, MgS0 4 , NaCl, NaHC0 3 , NaH 2 P0 4 , Fe (N0 3 ), FeS0 4 , KH 2 P0 4 , MgCl 2 , (NH 4 ) (Mo 7 0 24 ), CuS0 4 , KN0 3 , ZnS0 4 , NiCl 2 , Na 2 Si0 3 , H 2 Se0 3 , MnS0 4 and Ca (N0 3 ) 2 .
  • antioxidants examples include vitamin E and derivatives, tocotrienols, vitamin A and derivatives, vitamin C, beta-carotene, carotenoids, ubiquinones such as coenzyme Q10, flavonoi de, isoflavonoids, polyphenols, phytoestrogens, lycopenes, luteins, lipoic acids, glutathione.
  • antibiotics and antifungals examples include tylocin, gentamycin sulfate, kanamycin sulfate, neomycin sulfate, nystatin, polymixin B sulfate, streptomycin sulfate, actinomycin D, penicillin G, ampicillin, carbenicillin, amphote ⁇ ricin B and Mycophenolic acid.
  • hormones examples include hydrocortisone, progesterone, dexamethasone and triamzinolone.
  • mixtures of substances for screenings are vegetable or animal extracts with bioactive ingredients.
  • markers for examining cell biological functions are fluorescent dyes, immunohistochemical markers and vital markers.
  • substances for culture media are coenzymes such as diphosphopyridine nucleotide (DPN), flavin adenine dinucleotide (FAD), triphosphopyridine nucleotide (TPN) and uridine triphosphate (UTP), coenzyme A, cocarboxylase; Peptones such as meat peptone, casein peptone, soy peptone, bacto peptone and lactalbumin hydrolyzate as well as extracts such as yeast extract, beef pituitary extract, chicken embryo extract or beef extract.
  • DPN diphosphopyridine nucleotide
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • TPN triphosphopyridine nucleotide
  • UDP uridine triphosphate
  • coenzyme A cocarboxylase
  • Peptones such as meat peptone, casein peptone, soy peptone, bacto peptone and lactalbumin hydrolyzate
  • extracts such as yeast extract, beef pitu
  • substances for culture media are putrescine, phenol red, fumaric acid, malic acid, alpha-keto-glutaric acid, succinic acid, lactic acid, DL-68-thiocitinic acid, para-aminobenzoic acid, HEPES, calcium lactate, sodium succinate, Na -Pyruvate, sodium glucuronate, sodium acetate, sodium mucate, D-glucuron lactone, aminopterin, hypoxanthine, xanthine, choline chloride, choline bitartrate, taurine and salmon sulfate.
  • Component (c) is used according to the invention.
  • the NanoCell used according to the invention contains, as optional component (d), a solubilizer, preferably a C 2 -C 8 alcohol, such as ethanol or propylene glycol.
  • a solubilizer preferably a C 2 -C 8 alcohol, such as ethanol or propylene glycol.
  • the NanoCell used according to the invention contains only components (b) and (c).
  • a NanoCell composition with components (a), (b) and (c) is characterized by favorable phase properties when dispersed in an aqueous medium. With opalescence and transparency in the backlight, it can only be seen from an extremely low milky haze that the dispersion still shows physical differences compared to the ideal state of a real molecular solution. Electron microscopic images show that a population of more than 98% is in a Gaussian distribution as a suspension of particles (nanoparticles) with a particle size smaller than approx. 100 nm (nanodispersion), typically smaller than approx. 50 nm. This
  • Differences compared to a real solution are tolerable due to the particularly good homogeneity properties of the dispersion, for example, due to the surprisingly high storage stability, e.g. B. no segregation after storage for several months at temperatures up to room temperature (stability expected by extrapolation longer than two years) are detectable.
  • the two components (b) and (c) are mixed, optionally with heating, to give a homogeneous liquid phase.
  • component (a) is dissolved, if necessary with the aid of a solubilizer such as ethanol.
  • a solubilizer such as ethanol
  • Stirring is carried out using conventional stirrers, such as propellers, inclined blades or magnetic stirrers. Due to the special selection of components (a), (b) and (c), ultrafine, monodisperse NanoCells are created immediately.
  • rotor-stator or ultrasonic homogenizers which have high shear and cavitation can ⁇ to a homogenization by means of nozzles, generate, be dispensed with.
  • NanoCell pre-phase to the aqueous phase is usually carried out at a temperature ⁇ 50 ° C.
  • the NanoCells characterized by the described production process have an average particle diameter of less than 100 nm, typically less than 50 nm.
  • the particle distribution is monodisperse and obeys a Gaussian distribution.
  • Laser light scattering measurements and electron microscopic examinations (Cryo-TEM) confirm the very small size and excellent homogeneity of the NanoCells.
  • the NanoCells are used in end products of culture media.
  • These culture media end products are preferably liquid or semi-solid, but can also be solid.
  • culture media end products are animal sera such as fetal bovine serum, serum from newborn calf, calf serum, sera from other animal species, serous liquids from bovine; synthetic culture media such as serum-free / serum-reduced media, minus media for radioactive installation studies, media for molecular and cytogenetics, selection media, media for the plaque assay, media for the detection of mycoplasma, media for freezing, media for tissue, organ and Embryo transfer, media for therapy, media for perfusion of organs, media for storing organs until their transplantation, media for pharmacological logical, toxicological and metabolic studies, media for absorption and transport studies, media for the investigation of functional and regulatory mechanisms, supplements such as enzyme, amino acid and vitamin solutions; Lipid concentrates, growth stimulating additives, serum replacement products containing growth factors, vitamins, binding proteins, hormones, adhesion factors and trace elements, bouillons, peptones such as meat peptone, casein peptone, soy peptone, bacto peptone and lac
  • the NanoCells are incorporated into the aqueous portion of the end product.
  • the incorporation of the NanoCells is preferably carried out with stirring at room temperature, with conventional stirrers such as Propeller, inclined blade or magnetic stirrers are used.
  • the corresponding NanoCell pre-phase can also be incorporated into the aqueous portion of the culture media end products.
  • the NanoCell pre-phase is added to the aqueous portion of the end products with stirring and preferably at a temperature ⁇ 50 ° C.
  • Solid culture media end products such as Powder media
  • NanoCells are coated or loaded with NanoCells by spraying or soaking.
  • the culture media end products are preferably used for in vitro cultivation and examination of cells, fungi, bacteria, viruses, insects and plants, for in vitro or ex vivo cultivation and examination of tissues and organs, for freezing organs, tissues, cells, Fungi, bacteria, viruses, insects and plants, for the transfer of organs, tissues and embryos, for therapy ⁇ (adoptive immunotherapy, cancer treatment), for perfusion of organs such as kidneys or liver, for the storage of organs until their transplantation, for cytogenetic , molecular genetic, pharmacological, toxicological and metabolic studies, for admission and transport studies or for the investigation of functional and regulatory mechanisms.
  • NanoCell Polysorbate 80 and Miglyol 812 are mixed to a homogeneous liquid phase. The soy lecithin dissolved in ethanol is added to this phase. This results in a homogeneous solution, which is added to the phosphate buffer with stirring. The NanoCell obtained is then sterile filtered through a 0.2 ⁇ m filter.
  • Example 2 Egg lecithin 1.4% NanoCell
  • the NanoCell is produced in an analogous manner, for example 1.
  • NanoCell Polysorbate 80, Miglyol 812 and Vitamin E are mixed to a homogeneous liquid phase.
  • the soy lecithin dissolved in ethanol is added to this phase. This results in a homogeneous solution, which is added to the phosphate buffer with stirring.
  • the NanoCell obtained is then sterile filtered through a 0.2 ⁇ m filter.
  • Vitamin E acetate 2.00% soybean lecithin 0.49%
  • NanoCell is produced in an analogous way, for example 3.
  • Example 5 Vitamin E acetate 1.2% NanoCell
  • Vitamin E acetate 1.20%
  • Polysorbate 80 mixed to a homogeneous liquid phase. ⁇ The resulting clear solution is added to the water with stirring. The NanoCell obtained is then sterile filtered through a 0.2 ⁇ m filter.
  • Vitamin A palmitate (1.7 million IU / g) 1.80%
  • Vitamin E acetate 0.10%
  • Miglyol 812 1.80% polysorbate 80 3.15%
  • the NanoCell is produced in an analogous way, for example 3.
  • NanoCell is produced in an analogous way, for example 3.
  • Example 8 Omega-3 fatty acids 3.5% NanoCell
  • Vitamin E acetate 0.60%
  • the omega-3 fatty acids (Incromega E3322, CrodA), vitamin E acetate, polysorbate 80 and soy lecithin are mixed to form a homogeneous liquid phase.
  • the resulting clear solution is added to the phosphate buffer with stirring.
  • the NanoCell obtained is then sterile filtered through a 0.2 ⁇ m filter.
  • Ronoxan A (Röche) 0.02% 10 mM phosphate buffer, pH 6 ad 100.00%
  • NanoCell To produce the NanoCell, Miglyol 812, Polysorbate 80, Propylene Glycol, Ronoxan A and Soy Lecithin are mixed to a homogeneous liquid phase.
  • the coenzyme Q10 is added to this mixture with stirring and heating. This results in a clear liquid that is added to the phosphate buffer, which was previously heated to 50 ° C, with stirring (e.g. magnetic stirrer).
  • the NanoCell obtained is then sterile filtered through a 0.2 ⁇ m filter.
  • NanoCells The particle sizes of NanoCells are summarized in Table 1 below:
  • NanoCells also have excellent storage stability (Table 2) g:
  • the particle diameter and the particle size distributions were determined by means of laser light scattering (Nicomp 370 Submicron Particle Sizer, Volume weighting).
  • the content of vitamin E acetate was determined by means of HPLC Examples of culture media end products containing NanoCells
  • Example 10 Culture medium end product containing vitamin E acetate NanoCells
  • Vitamin E acetate Microvascular endothelial cells of the HMEC-1 cell line were grown to confluence, then washed once and incubated in a medium of the following composition:
  • Vitamin E acetate NanoCell according to example 4 0.0575%
  • the cellular amount of vitamin E was determined.
  • the cells were removed using
  • Vitamin E acetate Microvascular endothelial cells of the HMEC-1 cell line were grown to confluence, then washed once and incubated in a medium of the following composition for 96 hours: Vitamin E acetate NanoCell according to example 4 0.0575%
  • Vitamin E acetate was used to determine the free radicals generated in natural metabolism using a fluorometric method.
  • the cells preincubated in the above medium for 96 hours were loaded with a non-fluorescent dye (carboxy-H 2 DCFDA / AM, Molecular Probes) which reacts intracellularly with free radicals, in particular hydroperoxides, and thereby becomes fluorochrome.
  • the resulting relative fluorescence is a measure of the amount of radicals released.
  • the relative fluorescence was measured over a period of 150 minutes.
  • the results shown in Figure 2 show that the vitamin E acetate NanoCells is a very good antioxidant
  • Vitamin E acetate was added to the medium not in the form of the NanoCell, but as a solution in ethanol or DMSO, as a solubilizate in fetal calf serum or as a cyclodextrin complex.
  • the cell suspensions obtained were then supplemented with 5, 10, 25, 50 and 75 ⁇ M vitamin E acetate, in the form of the vitamin E acetate NanoCells according to Example 4, and incubated for 96 hours.
  • the cytotoxic effect was associated with
  • Microvascular endothelial cells of the HMEC-1 cell line were grown to confluence, then washed once and taken up in a medium of the following composition:
  • Example 11 Culture medium end product containing vitamin A palmitate NanoCells
  • Skin fibroblasts cellular uptake of vitamin A palmitate
  • Human dermal fibroblasts of the cell line HFP-1 were grown to confluence used, then washed once and incubated in egg ⁇ nem medium of the following composition:
  • Vitamin A palmitate NanoCell according to example 6 0.0095% 1% penicillin / streptomycin 0.0050%
  • the cellular amount of vitamin A palmitate was determined.
  • the cells were harvested at the times indicated, washed, extracted with hexane and the concentration of vitamin A palmitate in the hexane extract was determined by means of HPLC. The pellets remaining after the hexane extraction were used for DNA determination.
  • the results shown in FIG. 4 show that vitamin A palmitate is absorbed into the cells quickly and efficiently from the above medium.
  • the cellular vitamin A palmitate concentrations are given in an analogous experiment in which the same amount of vitamin A palmitate was added to the medium not as a NanoCell but as a cyclodextrin complex.
  • Bronchial epithelial cells Cellular uptake of vitamin A palmitate
  • the cellular amount of vitamin A palmitate was determined.
  • the cells were harvested at the specified times, washed, extracted with hexane and the concentration of vitamin A palmitate in the hexane extract was determined by means of HPLC. The pellets remaining after the hexane extraction were used for DNA determination.
  • the results shown in FIG. 5 show that vitamin A palmitate is rapidly and extremely efficiently absorbed into the cells from the above medium.
  • the cellular vitamin A palmitate concentrations are given in an analogous experiment in which the same amount of vitamin E was added to the medium not as a NanoCell but as a cyclodextrin complex.
  • Figure 1 Cellular intake of vitamin E resp. Vitamin E acetate from media, containing different vitamin E_ resp. Vitamin E acetate supplements.
  • the amounts of vitamin E taken up by the cells are expressed as pmol / ⁇ g DNA. The values given are mean values from four independent tests.
  • Figure 2 Antioxidative capacity of various vitamin E resp. Vitamin E acetate supplements against intracellularly generated radicals. The values given are mean values +/- SD from four independent tests.
  • Figure 3 Cytotoxicity of vitamin E acetate NanoCells against HMEC-1 cells. The values given are mean values from four independent tests.
  • Figure 4 Cellular uptake of vitamin A palmitate from media containing vitamin A palmitate NanoCells or vitamin A palmitate cyclodextrin complexes. The amount of vitamin A absorbed by the skin fibroblasts (HFP-1)
  • Palmitate are expressed as ⁇ mol / ⁇ g DNA. The values given are mean values +/- SD from three independent tests.
  • Figure 5 Cellular uptake of vitamin A palmitate from media containing vitamin A palmitate NanoCells or vitamin A palmitate cyclodextrin complexes.
  • the amounts of vitamin A palmitate taken up by the bronchial epithelial cells (NHBE) are expressed as ⁇ mol / ⁇ g DNA.
  • the values given are mean values +/- SD from three independent tests.

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Abstract

Beschrieben wird die Verwendung eines NanoCells, enthaltend als präparative Zusammensetzung: (a) ein membranbildendes Molekül, (b) einen Coemulgator und (c) einen lipophilen Bestandteil in Kulturmedien-Endprodukten. Die erfindungsgemäss eingesetzten NanoCells sind untoxisch und eignen sich als Lösungsvermittler für lipophile Stoffe in Kulturmedien-Endprodukten.

Description

Verwendung von NanoCells in Kulturmedien-Endprodukten
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von NanoCells in Kulturmedien-Endprodukten, Kulturmedien-Endprodukte, enthaltend diese NanoCells sowie die verschiede- nen Verwendungen dieser Kulturmedien-Endprodukte.
Kulturmedien-Endprodukte im Sinne der vorliegenden Erfindung sind z.B. Medien zur Kultivierung und Untersuchung von Zellen, Pilzen, Bakterien, Viren, Bakteriophagen, Insekten und Pflanzen, Medien zur in vitro respektive ex vivo Kulti- vierung und Untersuchung von Organen und Geweben, Medien zum Einfrieren von Zellen, Pilzen, Bakterien, Viren, Bakteriophagen, Insekten, Pflanzen, Organen und Geweben, Embryo- Transfer-Einfriermedien, Medien für die Therapie (adoptive Immuntherapie, Krebsbehandlung), Medien zur Perfusion von Organen wie z.B. Niere oder Leber, Medien zur Aufbewahrung von Organen bis zu ihrer Transplantation sowie Supplemente für obige Medien.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, lipophile, d.h. schwer wasserlösliche oder wasserunlösliche Substanzen derart in Kulturmedien-Endprodukte einzuarbeiten, dass
Zellen, Pilze, Bakterien, Viren, Bakteriophagen, Insekten, Pflanzen, Gewebe, Organe u.a.m. weder in ihrem Wachstum noch in ihren biologischen Funktionen beeinträchtigt werden.
Die Zugabe von lipophilen Substanzen zu Kulturmedien ist bisher nicht zufriedenstellend gelöst. Häufig werden hierfür organische Lösungsmittel wie Ethanol, THF oder DMSO eingesetzt. Der Nachteil dabei besteht darin, dass die gelösten Substanzen bei Zugabe zum Medium, infolge Ver- dünnung des Lösungsmittel, wieder ausfallen können. Ausgefallene hydrophobe Substanzen adherieren häufig an den Wänden der Kulturgefässe und stehen damit den Zellen nicht mehr zur Verfügung. Darüber hinaus zeigen die üblicherweise eingesetzten Endkonzentrationen an Lösungsmitteln von 0.1% schon negative Effekte auf Zellen und andere in Kultur gehaltene biologische Systeme.
Neben organischen Lösungsmitteln werden heute zur Einbringung lipophiler Substanzen auch Vehikel wie Mizellen, Mischmizellen, Liposomen oder fein emulgierte Emulsionen eingesetzt. Obwohl physiologisch günstiger als organische — Lösungsmittel, sind auch diese Vehikel, insbesondere in hoher Konzentration, oft toxisch für Zellen, Pilze, Bakterien, Viren, Bakteriophagen, Insekten, Pflanzen, Gewebe und Organe oder beeinflussen das in Kultur gehaltene biologische System in seiner Funktion. Die funktioneile Beeinflussung der in Kultur gehaltenen biologischen Systeme verunmöglicht oder erschwert die Interpretation pharmakolo- gischer, toxikologischer, metabolischer und regulatorischer Untersuchungen. Die geringe Beladungskapazität mit hydrophoben Substanzen sowie die ungenügende Stabilität in gewissen Kulturmedien sind weitere Gründe, welche den Einsatz dieser Vehikel limitieren können.
Ein weiterer oft verwendeter Lösungsvermittler ist Methyl- betacyclodextrin. Methylbetacyclodextrin hat jedoch den entscheidenden Nachteil, dass es die Zellmembran "durchlöchert" und so, wie wiederholt festgestellt werden konnte, den Calciumflux disreguliert ; d.h. es kommt zum Influx von Calcium in die Zelle mit allen nachgeschalteten, durch Calcium aktivierten Prozessen.
Der Erfindung liegt auch die Aufgabe zugrunde, lipophile Verbindungen in Kulturmedien-Endprodukte einzuarbeiten, welche speziell zur Organaufbewahrung bis zu ihrer Transplantation geeignet sind. Verschiedene lipidlösliche Ver- bindungen sind geeignet, Zellen und Gewebe vor vorübergehender Ischämie, aber ganz besonders auch vor einer wieder einsetzenden Reperfusion zu schützen. Eine solche Situation ergibt sich, wenn Organe entnommen, vorübergehend aufbewahrt und später wieder implantiert werden. Hier kommt es zunächst zu einer ischämischen Phase, die nach Wiederdurch- blutung von einer sog. Reperfusionsphase mit verändertem Sauerstoffangebot gefolgt wird. Diese sog. Ischämie/Reper- fusion führt, bedingt durch den Abbau von ATP während der Ischämie zu einer Aktivierung von Enzymsystemen, die in Abhängigkeit der Verfügbarkeit von Sauerstoff dann die Abbauprodukte des ATP verstoffwechseln, wobei erhebliche Mengen an reaktiven Sauerstoffverbindungen entstehen. In — mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass verschiedene lipidlösliche Antioxidantien wie 3-Carotin, Vitamin E, aber auch das wasserlösliche Vitamin C geeignet sind, die Bildung solcher beim Ischämie/Reperfusions-syndrom auftretenden reaktiven Sauerstoffverbindungen einschliesslich ihrer Folgeprodukte zu unterdrücken. Die dabei verwendeten Perfusionsmedien waren entweder Fettlösungen oder aber die Spenderorgane wurden durch orale Gabe von Vitaminen vor
Entnahme angereichert. Beide Lösungen sind für eine Organkonservierung ungeeignet. Einen anderen Weg, fettlösliche Antioxidantien in solche Aufbewahrungs- bzw. Konservie- rungslösungen zu bringen, gibt es bisher nicht.
Ueberraschenderweise wurde gefunden, dass mit sogenannten NanoCells, enthaltend
(a) ein membranbildendes Molekül,
(b) einen Coemulgator und
(c) einen lipophilen Bestandteil, lipophile, d.h. wasserunlösliche oder schwer wasserlösliche Substanzen in Kulturmedien-Endprodukte eingebracht werden können, so dass dabei die in Kultur gehaltenen Zellen, Pilze, Bakterien, Viren, Bakteriophagen, Insekten, Pflanzen oder Gewebe weder in Ihrem Wachstum noch in ihren Funktio- nen negativ beeinträchtigt werden. Der besondere Vorteil dieser NanoCell liegt also darin, dass sie eine äusserst physiologische Applikationsform darstellen, die im Gegensatz zu allen anderen Lösungsvermittlern fettlöslicher Verbindungen auch unter in vivo-Bedingungen leicht einsetz- bar sind. Die Tatsache, dass Endothelzellen, aber auch andere zelluläre Kompartimente wie z. B. Fibroblasten oder Darmmucosazellen Vitamine in dieser Form gut aufnehmen, erlaubt auch einen Einsatz zur Applikation von Vitaminen in die buccale Mucosa.
Überraschenderweise gelang es mit Hilfe der NanoCell-Tech- nologie, lipophile Verbindungen wie z.B. Antioxidantien in Perfusionslösungen zu bringen, die geeignet sind, als
Organkonservierungslösungen eingesetzt zu werden. Bisher — vorliegende in vitro- und in vivo-Studien, die mit solchen Antioxidans-Formulierungen durchgeführt wurden, zeigen, daß es auf diese Weise tatsächlich zu einer Anreicherung der antioxidativen Vitamine in den kritischen Zellkompartimen- ten, besonders den Endothelzellen, kommt. Diese Anreicherung war nicht erwartet worden, da die Zellen normalerweise nur auf dem Wege über lipo-proteingebundene Antioxidantien versorgt werden. Mit den vorliegenden experimentellen Ansätzen konnte somit auch gezeigt werden, dass die Infusion von antioxidativen Vitaminen auf dem Wege über die NanoCell-Technologie zu einem First-Pass-Effekt im Organ, d. h. in den kritischen Zellen des perfundierten Organes führt. Damit aber wird das Organ mit Hilfe der so appli- zierten Antioxidantien auf physiologische Weise geschützt, so dass die Anwendung von Antioxidantien in dieser Form geeignet ist, die Organaufbewahrung und -konservierung zu verbessern.
Weitere Vorteile der NanoCells ist deren hohe Beladungs- kapazität mit lipophilen Substanzen sowie die gute Stabilität in Kulturmedien-Endprodukten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung eines NanoCell, enthaltend als präparative Zusammensetzung (a) ein membranbildendes Molekül,
(b) einen Coemulgator und
(c) einen lipophilen Bestandteil in Kulturmedien-Endprodukten.
Vorzugsweise enthält das NanoCell (a) als membranbildende Moleküle Substanzen, die geeignet sind, Zweischichtsysteme (sog. "Bilayer") auszubilden,
(b) als Coemulgatoren Substanzen, die bevorzugt O/W Strukturen ausbilden und (c) als lipophile Komponente einen für Kulturmedien gebräuchlichen lipophilen Stoff.
Vorzugsweise enthält das NanoCell als Komponente (a) ein Phospholipid, ein hydriertes oder teilhydriertes Phospholi- pid, ein Lysophospholipid oder Mischungen aus diesen Ver- bindungen.
Ganz besonders bevorzugt ist dabei ein Phospholipid der Formel
CH^O-R! (1)
R2-0-CH 0
CH2-0-P-0-R3
OH worin
Rl C10-C20-Acyl;
R2 Wasserstoff oder
Figure imgf000007_0001
R3 Wasserstoff, 2-Trimethylamino-l-ethyl, 2-Amino-l- ethyl, nicht substituiertes oder durch eine oder mehrere
Carboxy-, Hydroxy- oder Amino-Gruppen substituiertes Cj-Cς- Alkyl; die Inositol- oder die Glycerylgruppe bedeuten, oder Salze dieser Verbindungen.
Figure imgf000007_0002
ist vorzugsweise ein geradkettiges
Figure imgf000007_0003
Alkanoyl mit einer geraden Anzahl an C-Atomen und geradkettiges C1Q-C2o_Alkenoyl mit einer oder mehreren Doppelbindungen und einer geraden Anzahl an C-Atomen.
Geradkettiges
Figure imgf000007_0004
mit einer geraden Anzahl an C-Atomen sind beispielsweise n-Dodecanoyl, n-Tetradecanoyl, n-Hexadecanoyl oder n-Octadecanoyl . Geradkettiges
Figure imgf000008_0001
einer Doppelbindung und einer geraden Anzahl an C-Atomen sind beispielsweise 6-cis- oder-6-trans-, 9-cis- oder 9-trans- Dodecenoyl, -Tetradece- noyl, -Hexadecenoyl, -Octadecenoyl oder -Icosenoyl, ins- besondere 9-cis-Octa-decenoyl (Oleoyl), ferner 9,12-cis- Octadecadienoyl oder 9 , 12 , 15-cis-octadecatrienoyl.
Ein Phospholipid der Formel (1), worin R 2-Trimethylamino- 1-ethyl bedeutet, wird mit dem Trivialnamen Lecithin und ein Phospholipid der Formel (1), worin R3 2-Amino-l-ethyl bedeutet, mit dem Trivialnamen Kephalin bezeichnet. Geeignet sind beispielsweise natürlich vorkommendes Kephalin oder Lecithin, z.B. Kephalin oder Lecithin aus Sojabohnen oder Hühnerei mit verschiedenen oder identischen Acylgruppen oder Mischungen davon.
Das Phospholipid der Formel (1) kann aber auch synthetischen Ursprungs sein. Unter dem Begriff synthetisches Phospholipid definiert man Phospholipide, welche bezüglich R^ und R2 eine einheitliche Zusammensetzung haben. Solche synthetischen Phospholipide sind vorzugsweise die weiter vorn definierten Lecithine und Kephaline, deren Acylgruppen R-L und R2 eine definierte Struktur haben und von einer definierten Fettsäure mit einem Reinheitsgrad höher als ca. 95% abgeleitet sind. R^ und R2 können gleich oder verschieden und ungesättigt oder gesättigt sein. Bevorzugt ist R^ gesättigt, z.B. n-Hexadecanoyl, und R ungesättigt, z.B. 9- cis-Octadecenoyl (Oleoyl).
Der Begriff "natürlich vorkommendes" Phospholipid definiert Phospholipide, welche bezüglich R]_ und R2 keine einheitliche Zusammensetzung haben. Solche natürlichen Phospholipide sind ebenfalls Lecithine und Kephaline, deren Acylgruppen R-L und R2 von natürlich vorkommenden Fettsäuregemischen abgeleitet sind.
Die Forderung "im wesentlichen reines" Phospholipid der Formel (1) definiert einen Reinheitsgrad von mehr als 90 Gew.-%, vorzugsweise mehr als 95 Gew.-. des Phospholipids der Formel (1), welcher anhand geeigneter Bestimmungsmetho- den, z.B. papier- oder dünnschichtchromatographisch, mit HPLC oder enzymatischem Färbtest, nachweisbar ist.
In einem Phospholipid der Formel (1) ist R3 mit der Bedeutung C^-C^j-Alkyl beispielsweise Methyl oder Ethyl. Die ~~ Bedeutung Methyl ist bevorzugt.
R mit den Bedeutungen durch eine oder mehrere Carboxy-, Hydroxy- oder Amino-Gruppen substituiertes C-^-C^-Alkyl sind beispielsweise 2-Hydroxyethyl, 2 , 3-Dihydroxy-n-propyl,
Carboxymethyl, 1- oder 2-Carboxyethyl, Dicarboxymethyl , 2- Carboxy-2-hydroxyethyl oder 3-Carboxy-2 , 3-dihydroxy-n- propyl, 3-Amino-3-carboxy-n-propyl oder 2-Amino-2-carboxy- n-propyl, vorzugsweise 2-Amino-2-carboxyethyl .
Phospholipide der Formel (1) mit diesen Gruppen können in Salzform, z.B. als Natrium- oder Kaliumsalz, vorliegen.
Phospholipide der Formel (1), worin R3 die Inositol- oder die Glycerylgruppe bedeutet, sind unter den Bezeichnungen Phosphatidylinositol und Phosphatidylglycerol bekannt.
Für die Acylreste in den Phospholipiden der Formel (1) sind auch die in Klammern angegebenen Bezeichnungen gebräuchlich: 9-cis-Dodecenoyl (Lauroleoyl ) , 9-Cis-Tetradecenoyl (Myristoleoyl) , 9-cis-Hexadecenoyl (Palmitoleoyl) , 6-cis- Octadecenoyl (Petroseloyl ) , 6-trans-Octadecenoyl (Petrose- laidoyl), 9-cis-Octadecenoyl (Oleoyl), 9-trans-Octadecenoyl (Elaidoyl), 9 , 12-cis-Octadecadienoyl (Linoleoyl), 9,12,15- cis-Octadecatrienoyl (Linolenoyl ) , 11-cis-Octadecenoyl (Vaccenoyl), 9-cis-Icosenoyl (Gadoleoyl), 5 , 8 , 11 , 14-cis- Eicosatetraenoyl (Arachidonoyl) , n-Dodecanoyl, (Lauroyl), n-Tetradecanoyl (Myristoyl), n-Hexadecanoyl (Palmitoyl), n- Octadecanoyl (Stearoyl), n-Icosanoyl (Arachidoyl ) , n-Doco- sanoyl (Behenoyl), n-Tetracosanoyl (Lignoceroyl ) . Ein Salz des Phospholipids der Formel (1) ist annehmbar. Salze definieren sich durch die Existenz von salzbildenden Gruppen im Substituenten R3 sowie durch die freie Hydroxy- gruppe am Phosphor. Möglich ist ebenfalls die Bildung von inneren Salzen. Bevorzugt sind Alkalimetallsalze, insbesondere Natriumsalze.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verwendet man gereinigtes Lecithin aus Sojabohnen der Qualität LIPOID S 100 oder S75 oder ein Lecithin definiert in der Monogra- phie der USP23 / NF 18.
Die Komponente (a) wird vorzugsweise in einer Konzentration von ca. 0,1 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Komponenten (a), (b) und (c), eingesetzt.
Als Komponente (b) wird vorzugsweise ein Emulgator oder Emulgatormischungen verwendet, der/die bevorzugt O/W-Struk- turen ausbildet (n) .
Speziell bevorzugte Emulgatoren sind:
Alkali-, Ammonium- und Aminiumsalze von Fettsäuren. Beispiele für solche Salze sind Lithium-, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Triethylamin-, Ethanolamin-, Diet- hanolamin- oder Triethanolaminsalze . Insbesondere werden die Natrium-, Kalium- oder Ammonium- (NR2R2R3 )- salze verwendet, wobei R^, R und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff, C^-C^-Alkyl oder C^-C^-Hydroxy- alkyl bedeuten.
Gesättigte und ungesättigte Alkylsulfate wie z.B. Natriumdocecylsulfat und Alkansulfonate wie z.B. Na- triumdocecansulfona ; Salze der Gallensäure wie z.B. Natriumcholat , Natrium- glycocholat und Natriumtaurocholat ;
Invertseifen (Quats) wie z.B. Zetylpyridiniumchlorid; Partialfettsäureester des Sorbitans wie z.B. Sorbitan- monolaurat ; Zuckerester wie z.B. Sucrosemonolaurat ; Alkylglucoside, wie z.B. n-Octylglucosid oder n-Dode- cylglucosid;
Alkylmaltoside wie z.B. n-Dodecylmaltosid;
Fettsäurepartialglyceride wie z.B. Laurinsäuremonogly- cerid;
Cg-C^g-Betaine, Cg-C24-Alkylamido-C^-C4-alkylenbetaine und Cg-C ^ g-Sulfobetaine ; ~~
Fettalkoholphosphorsäureester
Polyglycerinester von Fettsäuren; - Propylenglycolester von Fettsäuren;
Milchsäureester von Fettsäuren wie z.B. Natriumstea- royl-lactyl-2-lactat
Proteine wie z.B. Kasein. Emulgatoren vom Polyoxyethylen Typ sind ganz besonders bevorzugt. Beispiele solcher Emulgatoren sind:
Polyethoxylierte Sorbitanfettsäureester wie z.B. Poly- sorbat 80;
Polyethoxyliertes Vitamin E Derivate wie z.B. Vitamin
E Polyethylen Glycol 1000 Succinat; - Polyoxyethylenglykolierte natürliche oder hydrierte
Pflanzenöle wie z.B. polyoxyethylen-glykolierte natürliche oder hydrierte Rizinusöle;
Polyethoxylierte Fettsäurepartialglyceride wie z.B.
Diethylenglykolmonostearat ; - Polyethoxylierte Fettalkohole wie z.B. Oleth-20,
Polyethoxylierte Fettsäuren wie z.B. Polyoxyl 20 Stea- rat ,
Polyethoxyliertes Lanolin und dessen Derivate wie z.B.
Laneth-20, - Polyethoxylierte Kohlenhydrate;
Blockpolymerisate von Ethylenoxid und Propylenoxid, wie z.B. Poloxamer 188
Die Komponente (b) ist im erfindungsgemäss verwendeten NanoCell in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 50 Gew.- %, bezogen auf das Gesamtgewicht der Komponenten (a), (b) und (c) vorhanden. Die Komponente (c) ist vorzugsweise ein natürliches, ein synthetisches oder ein partialsynthetisches Di- oder Tri- glycerid, ein für Kulturmedien gebräuchlicher lipophiler Stoff oder Mischungen dieser Stoffe.
Für Kulturmedien-Endprodukte geeignete Stoffe sind z. B. essentielle, das Wachstum von Zellen, Pilzen, Bakterien, ~~ Viren, Bakteriophagen, Insekten, Pflanzen, Gewebe, u.a.m unterstützende Stoffe wie Vitamine, Aminosäuren, Peptide, natürliche oder rekombinante Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Nukleinsäuren, Ribonukleoside, Desoxyribonukleosi- de, anorganische Salze und Spurenelemente; ferner natürliche, halbsynthetische oder synthetische Wirkstoffe wie Antioxidantien, Antibiotika, Antimykotika, Hormone; Stoffgemische für Screenings und Marker zur Untersuchung zell- biologischer Funktionen.
Beispiele von Vitaminen sind Vitamin A, Vitamin Blf Vitamin B2, Vitamin B6, Nicotinamid, Pantothensäure, Vitamin B12, Vitamin B15, Folsäure, Biotin, Vitamin C, Vitamin D, Vitamin E, Vitamin F, Vitamin K und Vitamin P.
Beispiele von Aminosäuren und Peptiden sind Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Met- hionin, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Aspara- gin, Glutamin, Aspartinsäure, Glutaminsäure, Lysin, Argi- nin, Histidin, Glycyl-L-Glutamin, L-Alanyl-L-Glutamin und Hydroxy-L-Prolin.
Beispiele von natürlichen und rekombinanten Proteinen sind Wachstumsfaktoren wie Epidermal Growth Factor (EGF), Kera- tinocyte Growth Factor (KGF), Acidic und Basic Fibroblast Growth Factor (aFGF und bFGF), Insulin-Like Growth Factor-I und II (IGF-I und IGF-II), Nerve Growth Factor (NGF),
Platelet-Derived Growth Factors (PDGFs), Stern Cell Factors und Transforming Growth Factors; Chemotaktische Faktoren wie Macrophage/ Monocyte Chemotactic and Activating Factor (MCAF); Colony-Stimulating Faktoren wie Granulocyte-Macro- phage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF) und Granulocyte- Colony-Stimulating Factor (G-CSF); Interferone und Inter- leukine; Zelladhäsions- und Extracelluläre Matrix Proteine wie Kollagene, Fibronektine, Integrine, Laminine, Merosine, Proteoglykane, RGD-Adhäsionspeptide, Tenascine, Thrombo- spondine und Vitronektine und Enzyme wie Collagenase, Dispase und Trypsin. Weitere Beispiele von Proteinen sind ~~ Insulin, Albumin und Transferrin.
Beispiele von Kohlenhydraten sind Glucose, Galactose, Fructose, Sucrose, Maltose, Ribose, Desoxyribose, Trehalo- se, Tryptose und Yeastolate.
Beispiele von Lipiden sind gesättigte und ungesättigte Fettsäuren sowie Derivate davon. Beispiele von gesättigten Fettsäuren sind Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure. Beispiele von ungesättigten Fettsäuren sind Omega-9-Fett- säuren wie z.B. Oelsäure, Omega-6-Fettsäuren wie z.B. Linolsäure, gamma-Linolensäure, dihommo-gamma-Linolensäure und Arachidonsäure und Omega-3-Fettsäuren wie z.B. alpha Linolensäure, Stearidonsäure, Eicosapentaensäure und Doco- sahexaensäure. Weitere Beispiele von Lipiden sind Choleste- rol und Derivate davon.
Beispiele von Nukleinsäuren, Ribonukleosiden und Desoxy- ribonukleosiden sind Adenin, Guanin, Thymidin, Uracil, Adenosin, Guanosin, Cytidin, Uridin, 2 ' -Desoxyadenosin, 2 ' -Desoxyguanosin, 2 ' -Desoxycytidin, 2 ' -Desoxythymidin, 5- Methyl-Desoxycytidin und 5-Methylcytosin.
Beispiele von anorganischen Salzen und Spurenelementen sind CaCl2, KC1, MgS04, NaCl, NaHC03, NaH2P04, Fe(N03), FeS04, KH2P04, MgCl2, (NH4 ) (Mo7024 ) , CuS04 , KN03, ZnS04, NiCl2, Na2Si03, H2Se03, MnS04 und Ca(N03) 2.
Beispiele von Antioxidantien sind Vitamin E und Derivate, Tocotrienole, Vitamin A und Derivate, Vitamin C, Beta- Carotin, Carotinoide, Ubiquinone wie Coenzym Q10, Flavonoi- de, Isoflavonoide, Polyphenole, Phytoöstrogene, Lycopene, Luteine, Liponsäuren, Glutathion.
Beispiele von Antibiotika und Antimykotika sind Tylocin, Gentamycin-Sulfat , Kanamycin-Sulfat , Neomycin-Sulfat , Nystatin, Polymixin B-Sulfat, Streptomycin-Sulfat , Actino- mycin D, Penicillin G, Ampicillin, Carbenicillin, Amphote- ~~ ricin B und Mycophenolsäure.
Beispiele von Hormonen sind Hydrocortison, Progesteron, Dexamethason und Triamzinolon.
Beispiele von Stoffgemischen für Screenings sind pflanzliche oder tierische Extrakte mit bioaktiven Inhaltsstoffen.
Beispiele von Markern zur Untersuchung zellbiologiεcher Funktionen sind Fluoreszenz-farbstoffe, immunhistochemische Marker und Vitalmarker.
Ebenfalls Beispiele von Substanzen für Kulturmedien sind Coenzyme wie Diphosphopyridin-Nukleotid (DPN), Flavin- Adenin-Dinukleotid (FAD), Triphosphopyridin-Nukleotid (TPN) und Uridintriphosphat (UTP), Coenzym A, Cocarboxylase; Peptone wie Fleischpepton, Kaseinpepton, Soja-Pepton, Bacto-Pepton und Laktalbuminhydrolysat sowie Extrakte wie Hefeextrakt, Rinderhypophysenextrakt, Hühnerembryoextrakt oder Rindfleischextrakt.
Weitere Beispiele von Substanzen für Kulturmedien sind Putrescin, Phenolrot, Fumarsäure, Apfelsäure, alpha-Keto- glutarsaure, Bernsteinsäure, Milchsäure, DL-68-Thiocitin- säure, para-Aminobenzoesäure, HEPES, Ca-Lactat, Na-Succi- nat, Na-Pyruvat, Na-Glukuronat , Na-Acetat, Na-Mucat, D- Glukuronlacton, Aminopterin, Hypoxanthin, Xanthin, Cholin- chlorid, Cholinbitartrat , Taurin und Salminsulfat .
Die Komponente (c) ist im erfindungsgemäss eingesetzten
NanoCell in einer bevorzugten Konzentration von 0,1 bis 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Komponenten (a), (b) und (c) vorhanden.
Gegebenenfalls enthält das erfindungsgemäss eingesetzte NanoCell als fakultative Komponente (d) einen Lösungsver- mittler, vorzugsweise einen C2-C8 Alkohol wie z.B. Ethanol oder Propylenglykol . ~~
In einigen speziellen Fällen enthält das erfindungsgemäss eingesetzte NanoCell nur die Komponenten (b) und (c).
Eine NanoCell-Zusammensetzung mit den Komponenten (a), (b) und (c) zeichnet sich bei Dispersion im wässrigen Medium durch günstige Phaseneigenschaften aus. So ist bei vorhandener Opaleszenz und Transparenz im Gegenlicht nur an einer äusserst geringen milchigen Trübung zu erkennen, dass die Dispersion noch physikalische Unterschiede gegenüber dem Idealzustand einer echten molekularen Lösung aufweist. Elektronen-mikroskopische Abbildungen zeigen, dass eine Population von mehr als 98 % in einer Gaussschen Verteilung als Suspension von Partikeln (Nanopartikel ) mit einer Teilchengrösse kleiner als ca. 100 nm (Nanodispersion) , typischerweise kleiner als ca. 50 nm, vorliegt. Diese
Unterschiede gegenüber einer echten Lösung sind aber aufgrund der besonders guten Homogenitätseigenschaften der Dispersion tolerierbar, die beispielsweise an einer überraschend hohen Lagerstabilität, z. B. keine Entmischung nach mehrmonatiger Lagerung bei Temperaturen bis Raumtemperatur (durch Extrapolation zu erwartende Stabilität länger als zwei Jahre), nachweisbar sind.
Zur Herstellung der NanoCells werden die beiden Komponenten (b) und (c), gegebenenfalls unter Erwärmen zu einer homoge- nen flüssigen Phase gemischt. In dieser Phase wird die Komponente (a), gegebenenfalls unter Zuhilfenahme eines Lösungsvermittlers wie Ethanol, gelöst. Daraus resultiert eine klare Flüssigkeit, die sogenannte NanoCell-Vorphase. Diese wird der wässrigen Phase, welche gegebenenfalls wasserlösliche Substanzen enthält, unter Rühren zugegeben. Das Rühren erfolgt mit gewöhnlichen Rührapparaten, wie z.B. Propeller-, Schrägblatt- oder Magnetrührwerken. Durch die besondere Auswahl der Komponenten (a), (b) und (c) ent- stehen dabei unmittelbar ultrafeine, monodisperse NanoCells. Dabei kann auf eine Homogenisierung mittels Düsen-, Rotor-Stator- oder Ultraschallhomogenisatoren, welche hohe ~~ Scher- und Kavitationskräfte erzeugen, verzichtet werden.
Die Zugabe der NanoCell-Vorphase zur wässrigen Phase wird gewöhnlich bei einer Temperaturen < 50 °C durchgeführt.
Die durch das beschriebene Herstellungsverfahren charakterisierten NanoCells weisen einen mittleren Partikeldurchmesser von kleiner 100 nm, typischerweise kleiner 50 nm, auf. Die Partikelverteilung ist monodispers und gehorcht einer Gauss-Verteilung. Laser-Lichtstreumessungen und elektronenmikroskopische Untersuchungen (Cryo-TEM) bestätigen die sehr kleine Grosse und hervorragende Homogenität der NanoCells.
Die NanoCells werden erfindungsgemäss in Kulturmedien- Endprodukten verwendet.
Diese Kulturmedien-Endprodukte sind vorzugsweise flüssig oder halbfest, können jedoch auch fest sein.
Beispiele von Kulturmedien-Endprodukten sind Tierseren wie fötales Rinderserum, Serum vom neugeborenen Kalb, Kälberse- rum, Seren von anderen Tierarten, seröse Flüssigkeiten vom Rind; synthetische Kulturmedien wie serumfreie/serumreduzierte Medien, Minus-Medien für radioaktive Einbaustudien, Medien für die Molekular- und Zytogenetik, Selektionsmedien, Medien für den Plaque Assay, Medien zum Nachweis von Mycoplasmen, Medien zum Einfrieren, Medien für den Gewebe-, Organ- und Embryo-Transfer, Medien für die Therapie, Medien für die Perfusion von Organen, Medien zur Aufbewahrung von Organen bis zu ihrer Transplantation, Medien für pharmako- logische, toxikologische und metabolische Studien, Medien für Aufnahme und Transportstudien, Medien zur Untersuchung funktioneller und regulatorischer Mechanismen, Supplemente wie Enzym- Aminosäuren- und Vitaminlösungen; Lipidkonzen- träte, wachstumsstimulierende Zusätze, Serumersatz-Produkte enthaltend Wachstumsfaktoren, Vitamine, Bindungsproteine, Hormone, Adhäsionsfaktoren und Spurenelemente, Bouillons, — Peptone wie Fleischpepton, Kaseinpepton, Soja-Pepton, Bacto-Pepton und Laktalbuminhydrolysat , Extrakte wie He- feextrakt, Rinderhypophysenextrakt, Hühnerembryoextrakt oder Rindfleischextrakt, Pfufferlösungen und Agarose Gele. Diese Kulturmedien-Endprodukte enthaltend NanoCells bilden einen weiteren Erfindungsgegenstand.
Zur Herstellung von flüssigen und halbfesten Kulturmedien- Endprodukten werden die NanoCells in den wässrigen Anteil des Endproduktes eingearbeitet. Die Einarbeitung der NanoCells erfolgt vorzugsweise unter Rühren bei Raumtemperatur, wobei gewöhnliche Rührapparate wie z.B. Propeller-, Schrägblatt- oder Magnetrührwerke eingesetzt werden.
Anstelle des NanoCells kann auch die entsprechende Nano- Cell-Vorphase in den wässrigen Anteil der Kulturmedien- Endprodukte eingearbeitet werden. Die Zugabe der NanoCell- Vorphase in den wässrigen Anteil der Endprodukte erfolgt unter Rühren und vorzugsweise bei einer Temperatur < 50°C.
Feste Kulturmedien-Endprodukte wie z.B. Pulvermedien,
Granulate, Tabletten und Lyophilisate werden durch Besprühen oder Tränken mit NanoCells gecoatet oder beladen. Für gewisse feste Kulturmedien-Endprodukte ist es vorteilhaft, das NanoCell in dehydratisierter Form dem festen Stoff- gemisch beizumischen, wobei die Dehydratisierung des NanoCell im allgemeinen durch Gefrier- oder Sprühtrocknung in Gegenwart gebräuchhlicher Hilfsstoffe wie z.B. Maltodextri- ne erfolgt. Die Kulturmedien-Endprodukte werden vorzugsweise zur in vitro Kultivierung und Untersuchung von Zellen, Pilzen, Bakterien, Viren, Insekten und Pflanzen, zur in vitro respektive ex vivo Kultivierung und Untersuchung von Gewe- ben und Organen, zum Einfrieren von Organen, Geweben, Zellen, Pilzen, Bakterien, Viren, Insekten und Pflanzen, zum Transfer von Organen, Geweben und Embryos, zur Therapie^ (adoptive Immuntherapie, Krebsbehandlung), zur Perfusion von Organen wie z.B. Niere oder Leber, zur Aufbewahrung von Organen bis zu ihrer Transplantation, für zytogenetische, molekulargenetische, pharmakologische, toxikologische und metabolische Untersuchungen, für Aufnahme und Transportstudien oder zur Untersuchung funktioneller und regulatorischer Mechanismen verwendet.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert.
NanoCell Herstellungsbeispiele:
Beispiel 1: Soja Lecithin 1.7% NanoCell
Soja Lecithin 1.70 % Miglyol 812 3.45 %
Polysorbat 80 3.40 %
Ethanol 1.40 %
10 mM Phosphatpuffer, pH 6.0 ad 100.00 %
Zur Herstellung des NanoCells werden Polysorbat 80 und Miglyol 812 zu einer homogenen flüssigen Phase gemischt. Zu dieser Phase gibt man das in Ethanol gelöste Soja Lecithin hinzu. Daraus resultiert eine homogene Lösung, welche unter Rühren zum Phosphatpuffer gegeben wird. Das erhaltene NanoCell wird anschliessend über einen 0.2 μm Filter ste- rilfiltriert . Beispiel 2: Ei Lecithin 1.4% NanoCell
Ei Lecithin 1.40 %
Miglyol 812 2.85 %
Polysorbat 80 4.00 % Ethanol 1.40 %
10 mM Phosphatpuffer, pH 6.0 ad 100.00 %
Die Herstellung des NanoCells erfolgt in zum Beispiel 1 analoger Weise.
Beispiel 3: Vitamin E 0.45% NanoCell Vitamin E 0.45 %
Soja Lecithin 1.20 %
Miglyol 812 3.00 %
Polysorbat 80 2.90 %
Ethanol 1.00 % 10 mM Phosphatpuffer, pH 6.0 ad 100.00 %
Zur Herstellung des NanoCells werden Polysorbat 80, Miglyol 812 und Vitamin E zu einer homogenen flüssigen Phase gemischt. Zu dieser Phase gibt man das in Ethanol gelöste Soja Lecithin hinzu. Daraus resultiert eine homogene Lö- sung, welche unter Rühren zum Phosphatpuffer gegeben wird. Das erhaltene NanoCell wird anschliessend über einen 0.2 μm Filter sterilfiltriert.
Beispiel 4: Vitamin E Acetat 2% NanoCell
Vitamin E Acetat 2.00 % Soja Lecithin 0.49 %
Miglyol 812 0.71 %
Polysorbat 80 1.86 %
Ethanol 0.40 %
10 mM Phosphatpuffer, pH 6.0 ad 100.00 %
Die Herstellung des NanoCells erfolgt in zum Beispiel 3 analoger Weise. Beispiel 5: Vitamin E Acetat 1.2% NanoCell
Vitamin E Acetat 1.20 %
Polysorbat 80 0.98 %
10 mM Phosphatpuffer, pH 6.0 ad 100.00 %
Zur Herstellung des NanoCells werden Vitamin E Acetat und
Polysorbat 80 zu einer homogenen flüssigen Phase gemischt. ~~ Die resultierende klare Lösung wird unter Rühren zum Wasser gegeben. Das erhaltene NanoCell wird anschliessend über einen 0.2 μm Filter sterilfiltriert.
Beispiel 6: Vitamin A Palmitat 1.8% NanoCell
Vitamin A Palmitat (1.7 Mio IU/g) 1.80 %
Vitamin E Acetat 0.10 %
Soja Lecithin 1.70 %
Miglyol 812 1.80 % Polysorbat 80 3.15 %
Ethanol 1.40 %
10 M Phosphatpuffer, pH 6.0 ad 100.00 %
Die Herstellung des NanoCells erfolgt in zum Beispiel 3 analoger Weise.
Beispiel 7: Hydrocortison 0.05% NanoCell
Hydrocortison 0.05 %
Soja Lecithin 0.36 %
Miglyol 812 0.72 %
Polysorbat 80 0.71 % Ethanol 0.30 %
10 mM Phosphatpuffer, pH 6.0 ad 100.00 %
Die Herstellung des NanoCells erfolgt in zum Beispiel 3 analoger Weise. Beispiel 8: Omega-3 Fettsäuren 3.5% NanoCell
Incromega E3322 (Croda) 5.50 %
Vitamin E Acetat 0.60 %
Soja Lecithin 0.30 % Polysorbat 80 3.60 %
10 mM Phosphatpuffer, pH 6 ad 100.00 %
Zur Herstellung des NanoCells werden die Omega-3 Fettsäuren (Incromega E3322, CrodA) , Vitamin E Acetat, Polysorbat 80 und Soja Lecithin zu einer homogenen flüssigen Phase ge- mischt. Die resultierende klare Lösung wird unter Rühren zum Phosphatpuffer gegeben. Das erhaltene NanoCell wird anschliessend über einen 0.2 μm Filter sterilfiltriert.
Beispiel 9: Coenzym Q10 0.5% NanoCell
Coenzym Q10 0.50 % Soja-Lecithin 1.10 %
Miglyol 812 4.50 %
Polysorbat 80 3.40 %
Propylenglykol 0.48 %
Ronoxan A (Röche) 0.02 % 10 mM Phosphatpuffer, pH 6 ad 100.00 %
Zur Herstellung des NanoCells werden Miglyol 812, Polysorbat 80, Propylenglykol, Ronoxan A und Soja Lecithin zu einer homogenen flüssigen Phase gemischt. Zu dieser Mischung wird unter Rühren und Erwärmen das Coenzym Q10 hinzugegeben. Daraus resultiert eine klare Flüssigkeit, die unter Rühren (z.B. Magnetrührwerk) dem Phosphatpuffer, welcher zuvor auf 50°C erwärmt wurde, zugesetzt wird. Das erhaltene NanoCell wird anschliessend über einen 0.2 μm Filter sterilfiltriert.
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Partikelgrössen von NanoCells zusammengestellt:
Figure imgf000022_0001
Die Partikeldurchmesser und die Partikelgrössenverteilungen wurden mittels Laserlight Scattering bestimmt (Nicomp 370 Submicron Particle Sizer, Volume weighting) Wie nachfolgendes Beispiel zeigt, weisen NanoCells auch eine exzellente Lagerstabilität auf (Tabelle 2)g:
Vitamin E Acetat 2% NanoCell (Beispiel 4)
Figure imgf000023_0001
Die Partikeldurchmesser und die Partikelgrössenverteilungen wurden mittels Laserlight Scattering bestimmt (Nicomp 370 Submicron Particle Sizer, Volume weighting) Der Gehalt an Vitamin E Acetat wurde mittels HPLC bestimmt Beispiele für Kulturmedien-Endprodukte enthaltend NanoCells
Beispiel 10: Kulturmedium-Endprodukt enthaltend Vitamin E Acetat NanoCells
Zelluläre Aufnahme von Vitamin E resp. Vitamin E Acetat Mikrovaskuläre Endothelzellen der Zelllinie HMEC-1 wurden — bis zur Konfluenz herangezogen, danach einmal gewaschen und in einem Medium folgender Zusammensetzung inkubiert:
Vitamin E Acetat NanoCell gemass Beispiel 4 0.0575 %
EGF (Laboserv, Staufenberg, Deutschland) 0.0050 % Hydrocortison (Sigma, München, Deutschland) 0.0001 %
Fötales Kälberserum 10.0000 % (Biochrom, Berlin, Deutschland)
MCDB-131 (Biochrom, Berlin, Deutschland) ad 100.0000 %
Nach 96 Stunden wurde die zellulär aufgenommene Vitamin E Menge bestimmt. Hierzu wurden die Zellen mit Hilfe von
Trypsin/EDTA geerntet, gewaschen, mit Hexan extrahiert und die Konzentration von Vitamin E im Hexanextrakt mittels HPLC bestimmt. Die nach der Hexanexktration verbliebenen Pellets wurden zur DNA-Bestimmung herangezogen. Die in Figur 1 dargestellten Resultate zeigen, dass Vitamin E aus obigem Medium effizient in die Zellen aufgenommen wird. Zum Vergleich sind die zellulären Vitamin E Konzentrationen analoger Versuche angeführt, in welchen die gleiche Menge Vitamin E resp. Vitamin E Acetat dem Medium nicht in Form des NanoCells, sondern als Lösung in Ethanol oder DMSO, als Solubilisat in fötalem Kälberserum oder als Cyclodextrin- komplex zugegeben wurde.
Antioxidative Kapazität von Vitamin E resp. Vitamin E Acetat Mikrovaskuläre Endothelzellen der Zelllinie HMEC-1 wurden bis zur Konfluenz herangezogen, danach einmal gewaschen und in einem Medium folgender Zusammensetzung für 96 Stunden inkubiert: Vitamin E Acetat NanoCell gemass Beispiel 4 0.0575 %
EGF (Laboserv, Staufenberg, Deutschland) 0.0050 %
Hydrocortison (Sigma, München, Deutschland) 0.0001 %
Fötales Kälberserum 10.0000 % (Biochrom, Berlin, Deutschland)
MCDB-131 (Biochrom, Berlin, Deutschland) ad 100.0000 %
Zur Ermittlung der antioxidativen Schutzwirkung von Vitamin E resp. Vitamin E Acetat wurden die im natürlichen Stoffwechsel generierten freien Radikale mittels eines fluorome- trischen Verfahrens bestimmt. Hierzu wurden die in obigem Medium für 96 Stunden vorinkubierten Zellen mit einem nicht fluoreszierenden Farbstoff (Carboxy-H2DCFDA/AM, Molecular Probes) beladen, der intrazellulär mit freien Radikalen, insbesondere Hydroperoxiden, reagiert und dadurch zum Fluorochrom wird. Die dabei entstehende relative Fluoreszenz stellt ein Mass für die Menge an freigesetzten Radikalen dar. Im vorliegenden Experiment wurde die relative Fluoreszenz über einen Zeitraum von 150 Minuten gemessen. Die in Figur 2 dargestellten Resultate zeigen, dass das Vitamin E Acetat NanoCells eine sehr gute antioxidative
Schutzwirkung gegenüber intrazellulär generierten Radikalen aufweist. Zum Vergleich sind die relativen Fluoreszenzwerte analoger Versuche angeführt, in welchen die gleiche Menge Vitamin E resp. Vitamin E Acetat dem Medium nicht in Form des NanoCells, sondern als Lösung in Ethanol oder DMSO, als Solubilisat in fötalem Kälberserum oder als Cyclodextrin- komplex zugegeben wurde.
Zytotoxizität von Vitamin E Acetat NanoCells Mikrovaskuläre Endothelzellen der Zelllinie HMEC-1 wurden bis zur Konfluenz herangezogen, danach einmal gewaschen und in einem Medium folgender Zusammensetzung aufgenommen.
EGF (Laboserv, Staufenberg, Deutschland) 0.0050 %
Hydrocortison (Sigma, München, Deutschland) 0.0001 %
Fötales Kälberserum 10.0000 % (Biochrom, Berlin, Deutschland) MCDB-131 (Biochrom, Berlin, Deutschland) ad 100.0000 %
Die erhaltenen Zellsuspensionen wurden hierauf mit 5, 10, 25, 50 und 75 μM Vitamin E Acetat, in Form des Vitamin E Acetat NanoCells gemass Beispiel 4, supplementiert und für 96 Stunden inkubiert. Der cytotoxische Effekt wurde mit
Hilfe des LDA-Assays bestimmt. Dabei wird die Freisetzung — des Enzyms Lactatdehydrogenase aus absterbenden Zellen im Ueberstand gemessen und als Prozent zur Kontrolle dargestellt. Die in Figur 3 dargestellten Resultate zeigen, dass das Vitamin E Acetat NanoCell, selbst in hohen Konzentrationen, untoxisch ist.
Stabilität von Vitamin E Acetat NanoCells
Mikrovaskuläre Endothelzellen der Zelllinie HMEC-1 wurden bis zur Konfluenz herangezogen, danach einmal gewaschen und in einem Medium folgender Zusammensetzung aufgenommen:
EGF (Laboserv, Staufenberg, Deutschland) 0.0050 %
Hydrocortison (Sigma, München, Deutschland) 0.0001 %
Fötales Kälberserum 10.0000 % (Biochrom, Berlin, Deutschland) MCDB-131 (Biochrom, Berlin, Deutschland) ad 100.0000 %
Die erhaltenen Zellsuspensionen wurden hierauf mit 5, 10, 25, 50 und 75 μM Vitamin E Acetat, in Form des Vitamin E Acetat NanoCells gemass Beispiel 4, supplementiert. Zum Zeitpunkt 0 und nach 96 Stunden wurde mittels HPLC der Gehalt an Vitamin E Acetat im Medium bestimmt. Die Abnahme der Vitamin E Acetat Konzentration schwankte, je nach zugegebener Konzentration, zwischen 7 und 29%. Diese Abnahme ist im Gegensatz zu anderen Lösungsvermittlern äus- serst gering. Beispiel 11: Kulturmedium-Endprodukt enthaltend Vitamin A Palmitat NanoCells
Hautfibroblasten: Zelluläre Aufnahme von Vitamin A Palmitat
Humane Hautfibroblasten der Zellinie HFP-1 wurden bis zur Konfluenz herangezogen, danach einmal gewaschen und in ei- ~~ nem Medium folgender Zusammensetzung inkubiert:
Vitamin A Palmitat NanoCell gemass Beispiel 6 0.0095 % 1% Penicillin/Streptomycin 0.0050 %
(Biochrom, Berlin, Deutschland) Fötales Kälberserum 10.0000 %
(Biochrom, Berlin, Deutschland)
DMEM ad 100.0000 %
(Dulbeccos's modified Eagle Medium, Biochrom, Berlin, Deutschland)
Nach 15 Minuten, 2, 8 und 24 Stunden wurde die zellulär aufgenommene Vitamin A Palmitat Menge bestimmt. Hierzu wurden die Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet, gewaschen, mit Hexan extrahiert und die Konzentration von Vitamin A Palmitat im Hexanextrakt mittels HPLC bestimmt. Die nach der Hexanexktration verbliebenen Pellets wurden zur DNA-Bestimmung herangezogen. Die in Figur 4 dargestellten Resultate zeigen, dass Vitamin A Palmitat aus obigem Medium rasch und effizient in die Zellen aufgenommen wird. Zum Vergleich sind die zellulären Vitamin A Palmitat Kon- zentrationen eines analogen Versuches angeführt, in welchem die gleiche Menge Vitamin A Palmitat dem Medium nicht in Form des NanoCells, sondern als Cyclodextrinkomplex zugegeben wurde.
Bronchialepithelzellen: Zelluläre Aufnahme von Vitamin A Palmitat
Humane Bronchialepithelzellen der Zellinie NHBE wurden bis zur Konfluenz herangezogen, danach einmal gewaschen und in einem Medium folgender Zusammensetzung inkubiert: Vitamin A Palmitat NanoCell gemass Beispiel 6 0.0095 % BEGM BulletKit ad 100.0000 %
(Bronchial epithelial growth media, Clonetics)
Nach 15 Minuten, 2, 8 und 24 Stunden wurde die zellulär aufgenommene Vitamin A Palmitat Menge bestimmt. Hierzu wurden die Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet, — gewaschen, mit Hexan extrahiert und die Konzentration von Vitamin A Palmitat im Hexanextrakt mittels HPLC bestimmt. Die nach der Hexanexktration verbliebenen Pellets wurden zur DNA-Bestimmung herangezogen. Die in Figur 5 dargestellten Resultate zeigen, dass Vitamin A Palmitat aus obigem Medium rasch und ausserst effizient in die Zellen aufgenommen wird. Zum Vergleich sind die zellulären Vitamin A Palmitat Konzentrationen eines analogen Versuches ange- führt, in welchem die gleiche Menge Vitamin E dem Medium nicht in Form des NanoCells, sondern als Cyclodextrinkom- plex zugegeben wurde.
Die in den vorstehenden Beispielen 10 und 11 erwähnten Figuren der Zeichnung zeigen im einzelnen folgendes:
Figur 1: Zelluläre Aufnahme von Vitamin E resp. Vitamin E Acetat aus Medien, enthaltend unterschiedliche Vitamin E_ resp. Vitamin E Acetat Supplemente. Die von den Zellen aufgenommenen Mengen an Vitamin E sind als pmol/μg DNA ausgedrückt. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte von vier unabhängigen Versuchen.
Figur 2: Antioxidative Kapazität verschiedener Vitamin E resp. Vitamin E Acetat Supplemente gegen intrazellulär generierte Radikale. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte +/- SD von vier unabhängigen Versuchen.
Figur 3: Zytotoxizität von Vitamin E Acetat NanoCells gegenüber HMEC-1 Zellen. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte von vier unabhängigen Versuchen.
Figur 4 : Zelluläre Aufnahme von Vitamin A Palmitat aus Medien enthaltend Vitamin A Palmitat NanoCells oder Vitamin A Palmitat-Cyclodextrin-Komplexe . Die von den Hautfi- broblasten (HFP-1) aufgenommenen Mengen an Vitamin A
Palmitat sind als μmol/μg DNA ausgedrückt. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte +/- SD von drei unabhängigen Versuchen.
Figur 5 : Zelluläre Aufnahme von Vitamin A Palmitat aus Medien enthaltend Vitamin A Palmitat NanoCells oder Vitamin A Palmitat-Cyclodextrin-Komplexe. Die von den Bronchialepithelzellen (NHBE) aufgenommenen Mengen an Vitamin A Palmitat sind als μmol/μg DNA ausgedrückt. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte +/- SD von drei unabhängigen Versuchen.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines NanoCell, enthaltend als präparative Zusammensetzung
(a) ein membranbildendes Molekül, (b) einen Coemulgator und
(c) einen lipophilen Bestandteil __ in Kulturmedien-Endprodukten.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das NanoCell enthält: (a) als membranbildende Moleküle Substanzen, die geeignet sind, Zweischichtensysteme auszubilden,
(b) als Coemulgatoren Substanzen, die bevorzugt O/W Strukturen ausbilden und
(c) als lipophile Komponente einen für Kulturmedien-End- produkte gebräuchlichen lipophilen Stoff.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das NanoCell als Komponente
(a) ein natürliches oder synthetisches Phospholipid, ein hydriertes oder teilhydriertes Phospholipid oder Mi- schungen aus diesen enthält.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (a) im erfindungsgemäss verwendeten NanoCell in einer Konzentration von 0,1 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Komponenten (a), (b) und (c) vorhanden ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das NanoCell als Komponente
(b) Alkalimetall-, Ammonium- oder Aminumsalze von C3-C20- Fettsäuren, gesättigte und ungesättigte Cg-C-^g-Alkyl- sulfate, Cg-C2o~Alkansulfonate , Fettalkoholphosphor- säureester, Salze der Gallensäure, Invertseifen (Quats); Partialfettsäureester des Sorbitans, Zuckerester von Fettsäuren, Fettsäurepartialglyceride, Alkyl- maltoside, Alkylglucoside , Cg-C^g-Betaine ' ^8 -(-l 8 - Sulfobetaine oder Cg-C24-Alkylamido-C1-C4-alkylenbe- taine, Polyglycerinester von Fettsäuren, Propylengylko- lester vor. Fettsäuren, Milchsäureester von Fettsäuren, Proteine, Emulgatoren vom Poly'oxyethyler. Typ oder Mischungen dieser Stoffe enthält.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das NanoCell als Komponente (b) Emulgatoren vom Polyoxyethylen Typ enthält.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das NanoCell als Komponente
(b) Polyethoxylierte Sorbitanfettsäureester , Polyethoxylierte Vitamin E Derivate, Polyoxye-hylenglykolierte natürliche oder hydrierte Pflanzenöle, Polyethoxylierte Fettalkohole, Polyethoxylierte Fettsäuren, Polyethoxylierte Fettsäurepartialglyceride, Polyethoxyliertes Lanolin und dessen Derivate, Polyethoxylierte Kohlenhydrate, Blockpolymerisate von Ethylenoxid und Propylen- oxid oder Mischungen dieser Stoffe enthält.
S. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (b) irr. erfindur.gsger.äss verwendeten NanoCell in einer Konzentration von 1 bis 5C Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Komponenten (ε),
(b) und (c) vorhanden ist.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente
(c) ein natürliches, ein synthetisches oder ein partialεyn- thetisches Di- oder Triglycerid, einen für Kulturmedien-Endprodukte gebräuchlichen lipophilen Stoff oder Mischunger. dieser Stoffe enthält.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, cass das Nanc ell als Komponente (c) ein fettlösliches Vitamin, ein Carotinoid, ein Ubiqui- non, ein Flavσnoid, ein Isoflavonoid, ein Polyphenol, ein Phytoöstrogen, eine lipophile Aminosäure, eine gesättigte oder ungesättigte Fettsäure, eine essentiel- le Fettsäure, ein Lipid, ein lipophiles Antibiotikum oder Antimykotikum, ein lipophiles Hormon, einen lipophilen Marker zur Untersuchung biologischer Funktionen^ oder eine Mischung dieser Stoffe enthält.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (c) im erfindungsgemäss eingesetzten NanoCell in einer Konzentration von 0,1 bis 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Komponenten (a), (b) und (c), vorhanden ist.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das NanoCell als Komponente
(d) einen C2-C8 Alkohol enthält.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium-Endprodukt flüssig, fest oder halbfest ist.
14. Flüssige oder halbfeste Kulturmedien-Endprodukte enthaltend ein NanoCell wie in Anspruch 1 definiert.
15. Feste Kulturmedien-Endprodukte enthaltend ein NanoCell wie in Anspruch 1 definiert.
16. Kulturmedium-Endprodukt nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das NanoCell in der wässrigen Phase des Kulturmedium-Endproduktes vorhanden ist.
17. Kulturmedium-Endprodukte nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das NanoCell in dehydratisierter Form vorhanden ist.
18. Verfahren zur Herstellung der flüssigen oder halbfesten Kulturmedien-Endprodukte nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die NanoCells in den wässrigen Anteil der Endprodukte eingearbeitet werden.
19. Verfahren zur Herstellung der festen Kulturmedien- Endprodukte nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturmedien-Endprodukte mit dem NanoCell überzogen oder beladen werden.
20. Verfahren zur Herstellung der festen Kulturmedien- Endprodukte nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die NanoCells in dehydratisierter Form dem festen Stoff- gemisch beigemischt werden.
21. Verwendung der Kulturmedien-Endprodukte nach einem der Ansprüche 13 bis 17 zur in vitro Kultivierung und Unter- suchung von Zellen, Pilzen, Bakterien, Viren, Bakteriophagen, Insekten und Pflanzen, zur in vitro respektive ex vivo Kultivierung und Untersuchung von Geweben und Organen, zum Einfrieren von Organen, Geweben, Zellen, Pilzen, Bakterien, Viren, Bakteriophagen, Insekten und Pflanzen, zum Tranfer von Organen, Geweben und Embryos, zur Therapie (adoptive
Immuntherapie, Krebsbehanclung ) , zur Perfusion von Organen, zur Aufbewahrung von Organen bis zu ihrer Transplantation, für zytogenetische, molekulargenetische, pr.εrmakolcgische , toxikologische und metabolische Untersuchungen, für Auf- nähme und Trεnsportstudien oder zur Untersuchung funktio- neller und regulatorischer Mechanismen.
22. Verwendung eines NanoCell, enthaltend
(a) ein membranbildendes Molekül,
(b) einen Coemulgator und (c) einen lipophilen Bestandteil in Kulturmedien-Endprodukten, wobei das NanoCell erhältlich ist durch (α) Mischen der Komponenten (a), (b) und (c) bis eine homogene, klare Flüssigkeit, NanoCell-Vorphase genannt, entsteht, und
(/3) Zugabe der im Schritt (α) erhaltenen Flüssigkeit in den wässrigen Anteil der Nahrungsmittel-Endprodukte, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (α) und (3) ohne weiteren Energieeintrag erfolgen. __
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