WO2000007579A2 - VERWENDUNG VON CYCLOPENTABENZOFURANDERIVATEN ZUR BEKÄMPFUNG VON NF-λB-ABHÄNGIGEN KRANKHEITEN - Google Patents

VERWENDUNG VON CYCLOPENTABENZOFURANDERIVATEN ZUR BEKÄMPFUNG VON NF-λB-ABHÄNGIGEN KRANKHEITEN Download PDF

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Jörg Baumgarten
Axel Kretschmer
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Frank Bohnenstengel
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the invention relates to the use of cyclopentabenzofuran derivatives
  • Extracts from the Aglaia elliptifolia plant show anti-leukemic properties.
  • a dihydrocyclopenta- benzofuranol derivative called rocaglamide was identified as the first active compound (J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1982, 1150; US
  • NF- ⁇ B Protein "Nuclear Factor kappa B", NF- ⁇ B for short, in the cell nucleus and the resulting stimulation of the expression of the genes, the products of which are responsible for inflammatory reactions (Trends Pharmacol. Sci. J_8, 46 (1997)).
  • the non-useful, excessive (non-self-limiting) production of these proteins is responsible for the enhancement and maintenance of the inflammatory process and the associated unpleasant to life-threatening symptoms of this disease.
  • glucocorticoids corresponding to the current state of the art has some disadvantages, NF- ⁇ B is seen as an imperative target for the development of new anti-inflammatory agents against asthma.
  • R 1 represents hydrogen
  • R 2 represents methoxy
  • R 3 represents hydrogen or
  • R and R together represent -OCH 2 O-
  • R 4 represents methoxy
  • R 5 represents hydroxy, OCHO or acetoxy
  • R 6 and R 7 each represent hydrogen or
  • R 5 and R 6 together represent oxygen (oxo) or hydroxyimino
  • R 8 represents -COOR 12 or -CONR 13 R ' 4 , wherein
  • R 12 and R 13 represent hydrogen or methyl
  • R 14 represents hydrogen, methyl, 4-hydroxybutyl or 2-tetrahydrofuryl
  • R 5 and R 8 together for a group of fo ⁇ neln (a) or (b)
  • R 9 represents phenyl
  • R 10 represents methoxy
  • R represents hydrogen, hydroxyl, methoxy or 2-rhamnosyl
  • R 10 and R are adjacent and together represent -OCH 2 O-, or
  • R 15 represents hydroxy, methoxy or ethoxy
  • R 16 represents hydrogen, hydroxy or methoxy
  • R 1 , R 3 and R 8 each represent hydrogen
  • R 2 and R 4 each represent methoxy
  • R 5 represents hydroxy
  • R 6 and R 7 each represent hydrogen or
  • R 5 and R 6 together represent oxygen (oxo group),
  • R 9 represents phenyl
  • R 10 represents methoxy
  • R represents 2-methoxy or 2-rhamnosyl, or R and R are adjacent and together represent -OCH 2 O-,
  • Suitable as inhibitors are the nuclear factor kappa B (NF- ⁇ B) -interrupted gene expression for the therapy of pathophysiological processes.
  • NF- ⁇ B nuclear factor kappa B
  • the substances that can be used according to the invention are from o.a. Literature known.
  • Examples of the substances of the formula (I) which can be used according to the invention are the compounds (1-1) to (1-45), which are listed below.
  • the substances which can be used according to the invention are low molecular weight inhibitors which selectively inhibit nuclear factor kappa B (NF- ⁇ B) -mediated pathophysiological processes.
  • NF- ⁇ B-mediated processes occur in inflammatory diseases, immunological diseases, septic shock, graft rejection, radiation damage, reperfusion injuries after ischemia, thrombosis or in complex, chronic inflammatory diseases such as arteriosclerosis.
  • Nuclear factor kappa B is a dimeric protein complex found in many tissue cells and especially in blood cells. NF- ⁇ B plays a special role in controlling the expression of genes which have an NF- ⁇ B binding sequence in their promoter sequence (5'-GGGPuNNPyPyCC-3 '). In this respect, NF-KB is a transcription factor.
  • the physiological activity of NF- ⁇ B to control gene expression is subject to a regulatory principle in which NF- ⁇ B is released from a complex with the protein I ⁇ B in order to translocate as a transcription factor into the cell nucleus for gene activation.
  • the regulatory principle for the release of active NF- ⁇ B from a complex with the protein I ⁇ B is not yet known in detail.
  • NF- ⁇ B acts as a dimeric transcription factor on gene activation.
  • the dimerization can take place under the structurally related transcription factors Rel A, Rel B, c-Rel, p50 or p52, which form a family of transcription factor proteins.
  • Rel A structurally related transcription factors
  • Rel B c-Rel
  • p50 or p52 which form a family of transcription factor proteins.
  • NF- ⁇ B there can already be a regulatory principle for controlling the genes described in more detail later, which is not yet known.
  • a key feature of NF- ⁇ B over other transcription factors is that NF- ⁇ B is a primary transcription factor. Primary transcription factors are already in the cell in an inactive (mostly complex-bound) form and are released after a corresponding stimulus in order to be able to develop their effects very quickly. Primary transcription factors are not only formed by activating the associated gene and subsequent transcription and translation.
  • NF- ⁇ B genes of the Rel family
  • I ⁇ B proteins genes for the formation of the I ⁇ B proteins
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor- ⁇
  • PMA phorbol myristate acetate
  • NF- ⁇ B can primarily promote all pathophysiological processes in which genes are involved which have the NF- ⁇ B binding sequence in their promoter. These are genes that play a decisive causal role in immunological complications, inflammatory diseases, autoimmune diseases, septic shock, transplant rejection, thrombosis or even in chronic inflammatory diseases such as arteriosclerosis, arthritis, rheumatism and psoriasis.
  • NF- ⁇ B binding sequences contain e.g. the promoters of lymphoid cell receptors (T cell receptors), of MHCI and MHCII genes, of cell adhesion molecules (ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1), of cytokines and growth factors (see also the table below). Furthermore, NF- ⁇ B binding sequences can be found in the promoters of acute phase proteins (angiotensinogen, complement factors, etc.).
  • cytokines of the inflammatory reaction TNF ⁇ , Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-8 and others
  • ELAM-1, ICAM-1, VCAM-1 adhesion molecules
  • Inhibitors that prevent NF- ⁇ B-mediated gene expression intervene very early in the manifestation of pathophysiological changes in some diseases and can therefore be very represent effective therapeutic principle.
  • NF- ⁇ B inhibitors for diseases that are due to overexpression of acute phase proteins are also an example.
  • NF- ⁇ B strongly induces the serum amyloid A precursor protein in the liver by inducing acute phase proteins.
  • Interleukin-2 is a cytokine that i.a. as a hematopoietic growth factor plays a central role in various inflammatory processes (Annu. Rev. Immunol 1994, 12: 141-79).
  • the promoter of the interleukin-2 gene is dependent on NF- ⁇ B.
  • Inhibition of NF- ⁇ B stimulation thus opens up the possibility of preventing oversupply of 11-2 production and thus of treating inflammatory processes.
  • NF- ⁇ B-mediated gene expression can also represent a significant therapeutic advance.
  • NF- ⁇ B-controlled genes are induced by oxidation reactions that lead to oxidative stress after reperfusion of ischemic tissue.
  • an overexpression of cytokines and cell adhesion molecules in the ischemic tissue triggers an excessive recruitment of infiltrating lymphocytes.
  • the recruited lymphocytes cause tissue damage.
  • NF- ⁇ B-controlled gene expression in several neurodegenerative diseases is also evident.
  • the selective inhibition of genes with NF- ⁇ B binding sequence becomes therapeutic in particular in the case of nerve diseases in which the redox state of cells of the neuronal tissue is disturbed Attributed benefits.
  • a disrupted redox state of neuronal cells is assumed in amytrophic lateral sclerosis and in Down syndrome.
  • NF- ⁇ B is a common transcription factor in neuronal tissue and that NF- ⁇ B is a redox potential-controlled transcription factor in the brain (PA Bauerle, T. Henkel, Annu. Rev. Immunol. 12, 141-179, 1994 ).
  • a listing of the genes induced by NF- ⁇ B is given in Table 2.
  • T cell receptor ⁇ chain (human)
  • Vascular cell adhesion molecule 1 vascular cell adhesion molecule 1
  • Granulocyte / macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)
  • NF- ⁇ B NF- ⁇ B
  • lymphotropic viruses such as HIV, HTLV and Epstein-Barr virus
  • NF- ⁇ B has a positive effect on gene expression in the cytomegalovirus (CMV) and adenovirus.
  • CMV cytomegalovirus
  • adenovirus Antiviral effects with NF- ⁇ B inhibitors are also conceivable here.
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • the promoter of the human TNF ⁇ gene contains three NF- ⁇ B binding sequences, which are designated as kl, k2 and k3.
  • Lipopolysaccharide or phorbol ester induce NF- ⁇ B release (M.J. Lenardo et al., Cell 58, 227-229, 1989).
  • Donor blood mononuclear cells are isolated using Vacutainer CPT (TM) tubes (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ. 07417-1885) according to the manufacturer's instructions.
  • the Vacutainer CPT tubes contain 1.0 ml of phosphate-buffered saline with 120 USP units of sodium heparin over 3.0 g of a polyester gel that covers 2.0 ml of a Ficoll solution. After centrifugation of the donor blood, the monocytes are taken from a zone above the polyester gel and ind with a cell density of 250 x 10 5 cells per well
  • the cells are kept in medium RPMI-1640 (Gibco BRL, Life
  • TNF ⁇ ELISA for concentration determination are e.g. from Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Grünwalder Weg 30, 82039 Deisenhofen under the name Human TNF ⁇ ELISA Kit, order no .: CKH-200A. According to the manufacturer's instructions for use, the concentration of the TNF ⁇ formed in the culture supernatant of the monocyte culture after LPS stimulation with and without inhibitor substance is determined quantitatively.
  • the results of the TNF ⁇ concentration determination are plotted against each other in an x-y-axis diagram.
  • Inhibitors allows the inhibition of NF- ⁇ B-mediated TNF ⁇ synthesis to be read as a function of the concentration of the inhibitor substance.
  • the active substance concentration of the inhibitor added which, for example, inhibits TNF ⁇ synthesis by 50% can be read off from the diagram.
  • This active ingredient concentration, which causes 50% inhibition, is called the effective inhibitor concentration for 50% inhibition (IC 50 ).
  • the concentrations of the half-maximum TNF ⁇ synthesis inhibition (IC 50 ) of compound 1-2 are 0.3 ⁇ M, for compound 1-15 1.0 ⁇ M and 0.5 ⁇ m for connection 1-21.
  • the compounds thus represent potent inhibitors of NF- ⁇ B-mediated TNF ⁇ synthesis.
  • Tissue factor is a membrane-bound protein that is the primary initiator of the blood coagulation cascade and a key function in cardiovascular diseases such as unstable angina pectoris, acute implications after plaque
  • tissue factor gene is particularly induced in monocytes and endothelial cells by NF- ⁇ B activation.
  • the promoter of the human tissue factor gene contains an NF- ⁇ B binding site which contributes decisively to the activation of the promoter (P. Oeth et al. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17, 365-374, 1997).
  • the promoter fragment of the human tissue factor gene which contains the NF- ⁇ B binding sequence, was with oligonucleotide primers of the sequence 5'-TCC CTC GAG ATC TCC CAG AGG CAA ACT GCC AGA T-3 '(5' primer of the position -925) and 5 '-TCC TCG AGC CAT GGC TAC CAG TTG GGC GGC GAG ATC-3' (3 'primer containing the ATG start codon of the coding sequence of the tissue factor gene) by the polymerase chain reaction (PCR) and fused by Ncol / Xhol cloning with the luciferase start codon in the plasmid pGL3-Basic Vector (Promega Corp.
  • RAW-A3 Refection of Mammalian Cells in Culture, L.G. Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Sei. Publishing Co., New York 1986. After selecting RAW clones that had the expression construct stably integrated into the genome, one of these transfectants, called RAW-A3, was selected for the test of the inhibitors.
  • RAW-A3 cells are sown in each well in 12-well microtiter plates.
  • the serum concentration in RPMI medium is gradually reduced from 10% fetal calf serum to 0.5% and 0.1% serum content in three days in order to minimize the serum-dependent tissue factor promoter activation.
  • the NF- ⁇ B inhibitor is added and then serum is added up to a concentration of 15% in the medium for promoter induction.
  • the culture supernatant is aspirated and the cells are used to measure the luciferase activity in accordance with the "Luciferase Assay System" (Technical Bulletin from Promega, 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 5371 1-5399 USA) E4030, E1483, E1501)
  • the cell lysate is incubated with the luciferase assay substrate and in a luminometer
  • a graph for f (x) results, in which the half-maximum y value of an inhibitor - concentration x is to be assigned, which corresponds to the inhibitory concentration IC 50 in this test.
  • the IC J0 value of compound 1-2 is 0.4 ⁇ M and compound 1-21 4.0 ⁇ M.
  • the NF- ⁇ B-mediated expression of luciferase by the inhibitors according to the invention with a concentration in the lower micromolar or in the submicromolar range indicates the high effectiveness of the
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • NF- ⁇ B-mediated induction of TNF ⁇ synthesis is independent of the different stimuli used by LPS, opsonized zymosan or phorbol myristate acetate (PMA) for the activation of the TNF ⁇ promoter
  • Z4250 and P8139 are available. Zymosan is opsonized in human serum.
  • the NF- ⁇ B inhibitors according to the invention inhibit TNF ⁇ in a comparable manner regardless of the stimulus with IC 50 values in the submicromolar range Synthesis in human monocytes as shown in Example A.
  • the IC 50 value is 0.4 ⁇ M after PMA stimulus and 0.4 ⁇ M after zymosan stimulus.
  • the recruitment of leukocytes from the blood circulation into the extravascular space is essential for inflammatory responses and for the repair of
  • the process of leukocyte immigration involves several steps in series.
  • the initial interaction between leukocytes and the endothelium of the blood vessels is mediated by T ⁇ F and II-1-dependent expression of the adhesion protein ELAM-1 on the endothelium. It mediates the so-called rolling of the leukocytes along the blood vessel wall.
  • the transcriptional regulation of the ELAM-1 expression depends on the nuclear factor- ⁇ B (NF- ⁇ B) activation and binding to the ELAM-1 promoter as well as on the "AP-1 binding site.”
  • NF- ⁇ B nuclear factor- ⁇ B
  • ELAM-1 dependent neutrophil adhesion The influence of compound 1-2 on the expression of ELAM-1 was checked in two different test approaches.
  • the adhesion of human neutrophils to TNF- ⁇ stimulated HUVEC cells was measured in a functional approach.
  • the expression of ELAM-1 on the surface of the HEVECs was determined using a fluorescence-labeled ELAM-1-specific monoclonal antibody by means of FACS (cell sorting) analysis.
  • the neutrophils were isolated from human blood (100 ml). For this purpose, 3.5 ml of polyprep was placed in a centrifuge beaker and carefully overlaid with 5 ml of blood. After centrifuging at 2100 min -1 for 30 minutes, the neutrophil band was sucked off in the middle of the centrifuge cup. . After 1: 2 dilutions in Endothelial Cell Basal Medium (EBM) Fa Clonetics again for 20 minutes at 1000 has been min - centrifuged 1 ml and then taken up to a cell concentration of 10 6 cells /.
  • EBM Endothelial Cell Basal Medium
  • the umbilical cord endothelial cells were grown to confluence in 96-well microtiter plates in EBM + 10% FCS. At the start of the test, the medium was exchanged for EBM without FCS and the test substances were then used. After 20 minutes, the HUVECs were stimulated with 10 nM TNF- ⁇ . After 4 hours of incubation, 200 ⁇ l / well of the neutrophil suspension were exchanged. The neutrophils were previously labeled with a 25 ⁇ M BCESP fluorescent dye solution for 20 minutes. After 30 minutes of incubation, the BCECP neutrophil solution was drawn off with excess neutrophils and exchanged for 200 ⁇ l / well of 0.5% NaOH solution. The
  • Fluorescence of the adhering neutrophils was then measured in the fluorescence photometer.
  • Umbilical cord endothelial cells were cultured as described above and incubated for 4 hours in the presence or absence of 10 ng / ml TNF in the presence or absence of test substances.
  • the cells were extracted from the microtiter plates by incubation with 5 mM EDTA in PBS, centrifuged for 5 minutes at 1000 min -1 , and in 100 ⁇ l PBS plus 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich GmbH, order no. A7906) in an anti-EL AM 1 antibody (monoclonal antibody, from Becton and Dickinson,
  • HUVECs stimulated with TNF for 4 hours showed significantly stronger fluorescence signals after incubation with anti-ELAM-1 antibodies than cells, on the other hand, which were not incubated with TMF.
  • Compound 1-2 was able to induce this induced expression of ELAM-1 in a concentration range between
  • a reporter gene cell line which contains the interleukin-2 promoter coupled to the luciferase gene.
  • the promoter contains the DNA sequence from -480 to +4.
  • the vector used is pGL3; the starting cell line into which the entire construct was stably transfected is SS-1.
  • the culture medium for this cell line was RPMI 1640 (Gibco, Rockille). It also contained: 100 ⁇ g / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin, 2 mM L-glutamine, 10% heat-inactivated FBS and
  • the reporter gene test cell line was added to phenol red-free RPMI
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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Cyclopentabenzofuran-Derivaten der Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Nuclear Faktor λB-abhängigen Krankheiten, insbesondere zur Behandlung von Entzündungskrankheiten, immunologisches Erkrankungen, septischem Schock, Transplantatabstossung, Strahlungsschäden, Reperfusionsverletzungen nach Ischämie, Thrombosen oder komplexen, chronisch-entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose sowie Asthma, Arthritis, Rheuma, Psoriasis und Krebs.

Description

Nerwendung von Cyclopentabenzofuran-Derivaten zur Bekämpfung von ΝF-κB abhängigen Krankheiten
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Cyclopentabenzofuran-Derivaten zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von NF-κB abhängigen Krankheiten.
Extrakte aus der Pflanze Aglaia elliptifolia zeigen antileukämische Eigenschaften. Als erste wirksame Verbindung wurde ein Rocaglamid genanntes Dihydrocyclopenta- benzofuranol-Derivat identifiziert (J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1982, 1150; US
4 539 414). Daraufhin erschienen mehrere Arbeiten über schließlich auch erfolgreiche Syntheseversuche. Erst 10 Jahre nach der Isolierung von Rocaglamid wurden seine insektiziden Eigenschaften beschrieben (Pestic. Sei 36, 53 (1992); Phytochemistry 32, 67 (1993)) und darauf in einer anderen Art, Aglaia odorata, noch drei, sich nur in einem Substituenten unterscheidende Derivate gefunden (Phytochemistry 32, 307
(1993)).
Später wurden z.B. aus der Art Aglaia roxburghiana erst vier anellierte Derivate des Rocaglamids isoliert (WO 96/04 284), dann zahlreiche weitere neue Derivate sowie deren pharmakologische Eigenschaften beschrieben (vgl. z.B. J. Nat. Prod 59, 650
(1996); Tetrahedron 52, 6931 (1996); Phytochemistry 44, 1455 (1997); Phytochemistry 45 1579 (1997); Z. Naturforsch., C: Biosci. 52, Tetrahedron 52, 17625 (1997); B.W. Nugroho, Dissertation, Bayer. Julius-Maximilian Univ. Würzburg, 1997, WO 97/08 161 AI, J. Nat. Prod. 6 _, 1482 (1998), Tetrahedron 53, 17625 (1997).).
Ein bedeutender Schritt bei vielen endzündhchen Prozessen ist die Translocation des
Proteins „Nuclear Factor kappa B", kurz NF-κB, in den Zellkern und die hierdurch verursachte Stimmulierung der Expression der Gene, deren Produkt für enzündliche Reaktionen verantwortlich sind (Trends Pharmacol. Sei. J_8, 46 (1997)). Beispiels- weise bei Asthma ist die nicht nützliche, übermäßige (nicht selbstbegrenzende) Produktion dieser Proteine für die Verstärkung und Aufrechterhaltung des entzündlichen Prozesses und die damit verbundenen unangenehmen bis lebensbedrohlichen Symptome dieser Krankheit verantwortlich. Weil die dem heutigen Stand der Technik entsprechende Langzeitbehandlung mit Glucocorticoiden mit einigen Nachteilen behaftet ist, wird NF-κB als ein zwingendes Target gesehen für die Entwicklung von neuen entzündungshemmenden Wirkstoffen gegen Asthma.
Es wurde nun gefunden, daß die Cyclopentabenzofuran-Derivate der Formel (I)
Figure imgf000004_0001
in welcher
[A] R1 für Wasserstoff steht,
R2 für Methoxy steht,
R3 für Wasserstoff steht oder
R und R gemeinsam für -OCH2O- stehen,
R4 für Methoxy steht,
R5 für Hydroxy, OCHO oder Acetoxy steht, R6 und R7 jeweils für Wasserstoff stehen oder
R5 und R6 gemeinsam für Sauerstoff (Oxo) oder Hydroxyimino stehen,
R8 für -COOR12 oder -CONR13R'4 steht, worin
R12 und R13 für Wasserstoff oder Methyl stehen und
R14 für Wasserstoff, Methyl, 4-Hydroxybutyl oder 2-Tetrahydro- furyl steht,
oder
Rδ für einen Rest der Formel
Figure imgf000005_0001
steht,
R5 und R8 gemeinsam für eine Gruppe der Foπneln (a) oder (b)
Figure imgf000005_0002
stehen, wobei die dem N-Atom benachbarte Verknüpfungsstelle R5 entspricht und darüber hinaus R6 und R7 gemeinsam für eine direkte Bindung stehen,
R9 für Phenyl steht,
R10 für Methoxy steht,
R" für Wasserstoff, Hydroxyl, Methoxy oder 2-Rhamnosyl steht, oder
R10 und R" benachbart und gemeinsam für -OCH2O- stehen, oder
R15 für Hydroxy, Methoxy oder Ethoxy steht,
R16 für Wasserstoff, Hydroxy oder Methoxy steht,
[B] R1, R3 und R8 jeweils für Wasserstoff stehen,
R2 und R4 jeweils für Methoxy stehen,
R5 für Hydroxy steht,
R6 und R7 jeweils für Wasserstoff stehen oder
R5 und R6 gemeinsam für Sauerstoff (Oxo-Gruppe) stehen,
R9 für Phenyl steht,
R10 für Methoxy steht,
R" für 2-Methoxy oder 2-Rhamnosyl steht, oder R und R benachbart und gemeinsam für -OCH2O- stehen,
geeignet sind als Inhibitoren der Nuclear Factor kappa B (NF-κB)-verτnittelten Gen- expression zur Therapie pathophysiologischer Prozesse.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Stoffe sind aus o.a. Literatur bekannt.
Beispiele für die erfindungsgemäß verwendbaren Stoffe der Formel (I) sind die Ver- bindungen (1-1) bis (1-45), die im folgenden aufgeführt sind.
Tabelle 1
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
(1-27) (1-28)
Figure imgf000010_0002
(1-29)
Tabelle 2
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0003
Figure imgf000011_0002
Tabelle 3
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0002
*) Cui et al., Tetrahedron 53_, 17625 (1997)
Tabelle 4
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0003
*) Brader et al., J. Nat. Prod. 61, 1482 (1998).
Figure imgf000013_0002
Von den obengenannten Stoffen der allgemeinen Formel (I) sind die Verbindungen
I-l, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-8, 1-10, 1-12, 1-13, 1-15, 1-19, 1-20, 1-22, 1-26, 1-28. 1-32, 1-33, 1-42 bevorzugt. Die erfindungsgemäß verwendbaren Stoffe sind niedermolekulare Inhibitoren, die selektiv Nuclear Factor kappa B (NF-κB)-vermittelte pathophysiologische Prozesse hemmen. NF-κB-vermittelte Prozesse treten bei Entzündungskrankheiten, immunologischen Erkrankungen, septischem Schock, Transplantatabstoßung, Strahlungsschäden, Reperfusionsverletzungen nach Ischämie, Thrombosen oder bei komplexen, chronisch-entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose auf.
Zur pharmakologischen Wirkung von Inhibitoren des Nuclear Factor kappa B
Nuclear Factor kappa B (NF-κB) ist ein in vielen Gewebezellen und insbesondere in Blutzellen vorkommender dimerer Proteinkomplex. NF-κB nimmt eine besondere Rolle zur Steuerung der Expression von Genen ein, die in ihrer Promotorsequenz eine NF-κB Bindesequenz aufweisen (5'-GGGPuNNPyPyCC-3'). Insofern ist NF- KB ein Transkriptionsfaktor. Die physiologische Aktivität von NF-κB zur Kontrolle der Genexpression unterliegt jedoch einem Regulationsprinzip, bei dem NF-κB aus einem Komplex mit dem Protein IκB freigesetzt wird, um als Transkriptionsfaktor in den Zellkern zur Genaktivierung zu translozieren. Das Regulationsprinzip zur Freisetzung von aktivem NF-κB aus einem Komplex mit dem Protein IκB ist noch nicht in Einzelheiten bekannt.
Ebenso ist nicht bekannt, wie die Bildung von homodimeren und heterodimeren NF- KB Proteinkomplexen erfolgt. NF-κB wirkt als dimerer Transkriptionsfaktor auf die Genaktivierung ein. Die Dimerisierung kann unter den strukturell verwandten Transkriptionsfaktoren Rel A, Rel B, c-Rel, p50 oder p52 erfolgen, die eine Familie von Transkriptionsfaktorproteinen bilden. Auch kann in der Dimerisierung der Untereinheiten zum NF-κB bereits ein Regulationsprinzip zur Steuerung der später näher beschriebenen Gene liegen, das noch nicht bekannt ist. Ein entscheidendes Merkmal von NF-κB gegenüber anderen Transkriptionsfaktoren ist, daß NF-κB ein primärer Transkriptionsfaktor ist. Primäre Transkriptionsfaktoren sind in inaktiver (meist komplexgebundener) Form bereits in der Zelle vorhanden und werden nach einem entsprechenden Stimulus freigesetzt, um ihre Wirkung sehr schnell entfalten zu können. Primäre Transkriptionsfaktoren werden nicht erst durch die Aktivierung des zugehörigen Gens und anschließende Transkription und Translation gebildet.
Diese Eigenschaft des NF-κB, die Ausbildung homodimerer oder heterodimerer Rel- Proteine sowie die Ausbildung eines inaktiven Proteinkomplexes mit einem IκB
Protein, bieten ganz andere Angriffspunkte für pharmakologisch wirksame Substanzen, als die Angriffspunkte der de novo Biosynthese von Transkriptionsfaktoren. Der Vollständigkeit halber sei erwähnt, daß die Gene zur Bildung von NF-κB (Gene der Rel Familie) und die Gene zur Bildung der IκB Proteine (Genfamilie umfassend die Gene für IκB-α, IκB-ß, pl05/IκB-γ, plO0/IκB-δ, IκB-ε u.a.) ihrerseits natürlich auch einer Regulation unterliegen, die Angriffspunkte für pharmazeutisch wirksame Substanzen darstellen können. So ist bekannt, daß die Expression der konsumtiv gebildeten IκB Proteine pl05 und plOO durch Stimuli erhöht wird, die auch NF-κB aktivieren, wie z.B. Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) oder Phorbolmyristatacetat (PMA).
Ein Regulationsmechanismus ist in der Literatur beschrieben, in dem gezeigt wird, daß die Überexpression von IκB aktives NF-κB bindet und damit inaktiviert. Dies gilt auch, wenn das NF-κB bereits eine Komplexbindung mit der DNA eingegangen ist (P.A. Baeuerle, T. Henkel, Annu. Rev. Immunol. 12, 141-179, 1994). Daraus kann geschlossen werden, daß es mehrere spezifische Angriffspunkte in der biochemischen Funktion von NF-κB und IκB Proteinen gibt, die es ermöglichen sollten, eine ungewünschte, pathophysiologische, NF-κB-abhängige Genaktivierung selektiv zu hemmen. Eine chemische Verbindung, die selektiv die Funktion von NF-κB hemmt oder die Funktion von IκB Proteinen oder IκB Genen verstärkt, sollte als Pharmazeutikum zur Unterdrückung von NF-κB-vermittelten Krankheitsprozessen Verwendung finden können.
Primär kann NF-κB alle pathophysiologischen Prozesse fördern, an denen Gene beteiligt sind, die in ihrem Promotor die NF-κB Bindesequenz aufweisen. Namentlich sind dies Gene, die bei immunologischen Komplikationen, bei Entzündungskrankheiten, Autoimmunerkrankungen, septischem Schock, Transplantatabstoßung, Thrombosen oder aber auch bei chronisch-entzündlichen Krankheiten wie Arterio- sklerose, Arthritis, Rheuma und Psoriasis eine entscheidende ursächliche Rolle spielen.
NF-κB Bindesequenzen enthalten z.B. die Promotoren von Rezeptoren lymphoider Zellen (T-Zellrezeptoren), von MHCI- und MHCII-Genen, von Zeiladhäsionsmolekülen (ELAM-1 , VCAM-1, ICAM-1), von Zytokinen und Wachstumsfaktoren (siehe auch nachfolgende Tabelle). Weiterhin finden sich NF-κB Bindesequenzen in den Promotoren von Akutphasenproteinen (Angiotensinogen, Komplementfaktoren u.a.).
Eine chronisch erhöhte oder akut überschießende Aktivierung der genannten Gene führt zu vielfältigen pathophysiologischen Prozessen und Syndromen.
So ist die schnelle und überschießende Produktion von Zytokinen der Entzündungsreaktion (TNFα, Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-8 u.a.) und der Adhäsions- moleküle (ELAM-1 , ICAM-1, VCAM-1) in Leukozyten, insbesondere in Makro- phagen und auch in Endothelzellen, ein ursächliches Merkmal für oft tödlich verlaufende Prozesse bei septischem Schock; oder führt bei Strahlungsschäden und bei Transplantatabstoßung zu erheblichen Komplikationen. Hemmstoffe, die die NF-κB- vermittelte Genexpression verhindern, greifen bei einigen Krankheiten sehr früh in die Ausprägung pathophysiologischer Veränderungen ein und können daher ein sehr wirkungsvolles therapeutisches Prinzip darstellen. Ein Beispiel sind auch NF-κB Inhibitoren für Krankheiten, die auf eine Überexpression von Akutphasenproteinen zurückzuführen sind. Eine ungewünschte Überexpression von Akutphasenproteinen kann eine komplexe Allgemeinreaktion hervorrufen, bei der Gewebeschäden ver- schiedenster Art, Fieber und lokale Symptome wie Entzündungen und Nekrosen auftreten können. Meist ist das Blutbild verändert. NF-κB induziert zum Beispiel stark das Serum Amyloid A Vorläuferprotein in der Leber im Zuge einer Induktion von Akutphasenproteinen.
Beispielsweise kann die NF-κB-vermittelte Genexpression des Interleukin-2-
(Il-2)Gens gehemmt werden.
Interleukin-2 ist ein Cytokin das u.a. als hämatopoetischer Wachstumsfaktor eine zentrale Rolle bei diversen entzündlichen Prozessen spielt (Annu. Rev. Immunol 1994, 12:141-79). Der Promotor des Interleukin-2 Gens ist NF-κB abhängig. Eine
Inhibition der NF-κB Stimulierung eröffnet somit die Möglichkeit, ein Überschießen der 11-2 Produktion zu verhindern und somit entzündliche Prozesse zu therapieren.
Bei anderen Krankheitsbildern wie Gewebeschädigung nach Reperfusion oder Leber- zirrhose können Hemmstoffe der NF-κB -vermittelten Genexpression ebenfalls einen bedeutenden Therapiefortschritt darstellen. Es gibt Evidenzen, daß durch Oxidations- reaktionen, die zu oxidativem Streß nach Reperfusion von ischämischem Gewebe führen, NF-κB-gesteuerte Gene induziert werden. Auf diese Weise wird eine Überexpression von Zytokinen und Zelladhäsionsmolekülen im ischämischen Gewebe eine übermäßige Rekrutierung von infiltrierenden Lymphozyten ausgelöst. Die rekrutierten Lymphozyten tragen ursächlich zur Gewebeschädigung bei.
Ebenso ist die Beteiligung der NF-κB-gesteuerten Genexpression bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen evident. Insbesondere bei Nervenkrankheiten, bei denen der Redoxzustand von Zellen des neuronalen Gewebes gestört ist, wird der selektiven Hemmung von Genen mit NF-κB Bindesequenz ein therapeutischer Nutzen beigemessen. Ein gestörter Redoxzustand neuronaler Zellen wird bei amytropher Lateralsklerose und bei Down-Syndrom angenommen.
Es ist bekannt, daß NF-κB ein häufig anzutreffender Transkriptionsfaktor in neuronalem Gewebe ist und daß NF-κB im Gehirn ein Redoxpotential-gesteuerter Transkriptionsfaktor ist (P.A. Bauerle, T. Henkel, Annu. Rev. Immunol. 12, 141-179, 1994). Ein Aufstellung Der Gene, die durch NF-κB induziert werden ist in Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2
Gene, die durch NF-κB induziert werden (P.A. Bauerle, T. Henkel, Annu. Rev. Immunol. 12, 141-179, 1994)
Immunorezeptoren Immunoglobulin K light chain
T cell receptor ß
T cell receptor α chain (human)
Major histocompatibility complex class I
(H-2K) ß2-Microglobulin
Invariant chain I
Tissue factor- 1
Zelladhäsionsmoleküle Endothelial leukocyte adhesion molecule 1
(ELAM-1)
Vascular cell adhesion molecule 1
(VCAM-1)
Intercellular cell adhesion molecule 1
(ICAM-1)*
Zytokine und Wachstumsfaktoren ß-Interferon
Granulocyte/macrophage colony- stimulating factor (GM-CSF)
Granulocyte colony-stimulating factor
(G-CSF)
Macrophage colony-stimulating actor
(M-CSF)
Melanoma growth stimulating activity
(groα-γ/MGSA)
Interleukin-2
Interleukin-6
Interleukin-8
TNFα
Lymphotoxin (TNF-ß)
Proenkephalin
MPC-l/JE*
Akutphasenproteine Angiotensinogen
Serum amyloid A precursor
Complement factor B
Complement factor c4
Urokinase-type plasminogen activator*
*Die Bindung von NF-κB an den Promotor des genannten Gens ist noch nicht schlüssig experimentell nachgewiesen. Neben den bereits genannten Genen, deren Aktivität mit der Freisetzung des NF-κB gesteuert wird und die besonders bei Entzündungsprozessen, septischem Schock und Transplantatabstoßung eine Rolle spielen, seien auch noch NF-κB-gesteuerte Gene in Viren erwähnt und solche, die oncogene zelluläre Veränderungen hervorrufen
(Oncogene wie c-myc, c-rel, Melanoma Growth Stimulating Activity MGSA). Auch bei diesen Genen stellt eine selektive Hemmung der NF-κB Bindung ein vielversprechendes, therapeutisch nutzbares Konzept dar. Die Genexpression lympho- tropher Viren wie HIV, HTLV und Epstein-Barr Virus wird entweder direkt oder durch NF-κB aktiviert oder in der infizierten Wirtszelle wird NF-κB induziert, was der Virusreplikation förderlich ist. Neben HIV wirkt NF-κB positiv auf die Genexpression im Zytomegalievirus (CMV) und Adenovirus. Auch hier sind antivirale Effekte mit NF-κB Inhibitoren denkbar.
Die Verwendung der erfindungsgemäß verwendbaren Stoffe geht aus den nachfolgenden Beispielen hervor.
Amvendungsbeispiele
Beispiel A
Hemmung der NF-κB-vermittelten Genexpression des Tumor Nekrose Faktor-α (TNFα) Gens in menschlichen Monozyten
Der Promotor des humanen TNFα Gens enthält drei NF-κB Bindesequenzen, die als kl, k2 und k3 bezeichnet werden. Die NF-κB Bindesequenzen finden sich im Promotor des TNFα Gens an den Nukleotid-Positionen kl = -587 bis -577, k2 = -210 bis -202 und k3 = -98 bis -87 und diese DNA Sequenzen binden spezifisch NF-κB (A.E.
Goldfield et al., Proc. Natl. Acad. Scri. USA 87, 9769-9773, 1990). Lipopoly- saccharid oder Phorbolester (wie z.B. Phorbolmyristatacetat) induzieren die NF-κB Freisetzung (M.J. Lenardo et al., Cell 58, 227-229, 1989).
Daher wird zum Nachweis der Inhibition der NF-κB-vermittelten TNFα Genexpression durch die hier beschriebenen Substanzen folgender biologischer Test durchgeführt.
Mononukleare Zellen aus Spenderblut werden mit Vacutainer CPT(™) Röhrchen (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ. 07417-1885) isoliert, entsprechend den Vorschriften des Herstellers. Die Vacutainer CPT Röhrchen enthalten 1 ,0 ml phosphatgepufferte Saline mit 120 USP Einheiten Natriumheparin über 3,0 g eines Polyestergels, das 2,0 ml einer Ficoll-Lösung überschichtet. Nach der Zentri- fugation des Spenderbluts werden die Monozyten aus einer Zone oberhalb des Poly- estergels genommen und mit einer Zelldichte von 250 x 105 Zellen pro well ind
96-well Mikrotiterplatten für die Zellkultur ausgesät.
Die Zellen werden 4-6 Stunden in Medium RPMI-1640 (Gibco BRL, Life
Technologies GmbH, Dieselstr. 5, 76344 Eggenstein) inkubiert. Anschließend wird der Kulturüberstand abgesaugt, es wird erneut Medium RPMI-1640 hinzugefügt und die zu testenden Substanzen werden in Konzentrationen üblicherweise zwischen 0 μM (Negativ-Kontrolle) und 20 μM zugesetzt. Direkt anschließend wird bakterielles Lipopolysaccharid (LPS), Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Grünwalder Weg 30, 82039 Deisenhofen, Best.-Nr.: L 4391, in einer Konzentration von 125 ng/ml zur Stimulierung der NF-κB-vermittelten TNFα Genexpression zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation von 18 Stunden bei 37°C in 5 % CO2 Atmosphäre wird aus den Mikrotiterplatten Kulturüberstand entnommen und darin der TNFα Gehalt quantitativ bestimmt mit kommerziell verfügbaren enzymgebundenen Immunosorbent- assays (ELI SA).
TNFα ELISA zur Konzentrationsbestimmung werden z.B. von Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Grünwalder Weg 30, 82039 Deisenhofen unter der Bezeichnung Human TNFα ELISA Kit, Best.-Nr.: CKH-200A, vertrieben. Entsprechend der Gebrauchsanweisung des Herstellers wird die Konzentration des gebildeten TNFα im Kulturüberstand der Monozytenkultur nach LPS Stimulation mit und ohne Inhibitorsubstanz quantitativ bestimmt.
Die Ergebnisse der TNFα-Konzentrationsbestimmung werden in einem x-y-Achsen- diagramm gegeneinander aufgetragen. Der Graph der y-Koordinaten (TNFα-Konzen- tration im Kulturüberstand) und der x-Koordinaten (Konzentration des eingesetzten
Inhibitors) erlaubt es, die Hemmung der NF-κB-vermittelten TNFα Synthese in Abhängigkeit von der Konzentration der Inhibitorsubstanz abzulesen. Auf diese Weise kann diejenige Wirkstoffkonzentration des zugesetzten Inhibitors aus dem Diagramm abgelesen werden, die z.B. die TNFα Synthese um 50 % hemmt. Diese Wirkstoff- konzentration, die eine 50 %-ige Hemmung hervorruft, wird effektive Hemmstoffkonzentration für 50 %-Hemmung (IC50) genannt.
Beispielsweise betragen die Konzentrationen der halbmaximalen TNFα Synthese- Inhibition (IC50) der Verbindung 1-2 (aus Tabelle 1) 0,3 μM, bei Verbindung 1-15 1,0 μM und bei Verbindung 1-21 0,5 μm. Die Verbindungen stellen damit potente Inhibitoren der NF-κB-vermittelten TNFα Synthese dar.
Beispiel B Hemmung der NF-κB-vermittelten Genexpression des menschlichen Tissue-
Factor Gens in Monozyten
Tissue Factor ist ein membranständiges Protein, das den primären Initiator der Blut- Koagulationskaskade darstellt und eine Schlüsselfunktion bei Herzkreislaufer- krankungen wie unstabiler Angina pectoris, akuten Implikationen nach Plaque-
Ruptur, Gefäßocclusionen verschiedener Ätiologie, arteriosklerotischen Prozessen und anderen Krankheiten wie septischem Schock oder Krebs einnimmt. Das Tissue Factor Gen wird insbesondere in Monozyten und Endothelzellen durch NF-κB- Aktivierung induziert. Der Promotor des humanen Tissue Factor Gens enthält eine NF-κB Bindestelle, die entscheidend zur Aktivierung des Promotors beiträgt (P. Oeth et al. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17, 365-374, 1997).
Daher wurde zum weiteren Nachweis der Hemmung der NF-κB-vermittelten Genexpression durch die erfindungsgemäßen Inhibitoren folgender biologisch Test durchgeführt:
Das Promotor-Fragment des humanen Tissue Factor Gens, das die NF-κB Bindesequenz enthält, wurde mit Oligonukleotid-Primern der Sequenz 5'-TCC CTC GAG ATC TCC CAG AGG CAA ACT GCC AGA T-3' (5 '-Primer der Position -925) und 5' -TCC TCG AGC CAT GGC TAC CAG TTG GGC GGC GAG ATC-3' (3' -Primer enthaltend das ATG-Startcodon der kodierenden Sequenz des Tissue-Factor Gens) durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kloniert und durch eine Ncol-/ Xhol- Klonierung mit dem Luciferase Startcodon im Plasmid pGL3-Basic Vector (Promega Corp. 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 5371 1-5399 USA) fusioniert. Dadurch wird die Expression der Luciferase im so entstandenen rekombinanten Plasmid durch den humanen Tissue Factor Promoter reguliert. Dieses Expressions- konstrukt wurde zur Analyse der DNA-Sequenzierung unterworfen und in die Mono- zytenzellinie RAW 264.7 (American Type Culture Collection 12301 Parklane Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) transfiziert. Die Transfektion, Selektion und Klon-Analyse erfolgte nach Standardmethoden, wie sie beschrieben sind (siehe
Transfection of Mammalian Cells in Culture, L.G. Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Sei. Publishing Co., New York 1986). Nach der Selektion von RAW-Klonen, die das Expressionskonstrukt stabil im Genom integriert hatten, wurde eine dieser Transfektanten, genannt RAW-A3, für den Test der Inhibitoren ausgewählt.
Testdurchführung:
In 12-well Mikrotiterplatten werden in jede Vertiefung 106 RAW-A3 Zellen ausgesät. Schrittweise wird die Serum-Konzentration in drei Tagen im RPMI Medium von 10 % fötalem Kälberserum auf 0,5 % und 0,1 % Serum-Anteil abgesenkt, um die serum-abhängige Tissue Factor Promotor Aktivierung auf ein Minimum zu senken. Nach 24 Stunden Kultur in Medium mit 0,1 % Serum wird der NF-κB Inhibitor zugesetzt und anschließend Serum bis zu einer Konzentration von 15 % im Medium zur Promotor-Induktion zugesetzt.
Nach weiteren 6 Stunden wird der Kulturüberstand abgesaugt und die Zellen werden zur Messung der Luciferase-Aktivität gemäß der Vorschrift des „Luciferase Assay System" (Technical Bulletin der Fa. Promega, 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 5371 1-5399 USA, Produkte E4030, E1483, E1501) verarbeitet. Das Zelllysat wird mit dem Luciferase Assay Substrat inkubiert und in einem Luminometer zur
Messung des emittierten Lichts vermessen. Bei einer Auftragung in einem x-y- Achsendiagramm mit dem jeweils emittierten Licht (angegeben in relative light units) als y-Koordinate und den Inhibitorkonzentrationen als x-Koordinaten ergibt sich ein Graph für f(x), bei dem der halbmaximale y-Wert einer Inhibitor- konzentration x zuzuordnen ist, die der Hemmkonzentration IC50 in diesem Test entspricht. Zum Beispiel beträgt der ICJ0-Wert der Verbindung 1-2 (aus Tabelle 1) 0,4 μM und der Verbindung 1-21 4,0 μM. Die NF-κB-vermittelte Expression der Luciferase durch die erfindungsgemäßen Inhibitoren mit einer Konzentration im unteren mikromolaren oder im submikromolaren Bereich weist auf die hohe Wirksamkeit der
Hemmung einer NF-κB-vermittelten Genexpression hin.
Beispiel C
Hemmung der NF-κB-vermittelten Genexpression des Tumor Nekrose Faktor-α (TNFα) Gens in menschlichen Monozyten in Abhängigkeit von drei verschiedenen TNFα Synthesestimuli
Die NF-κB-vermittelte Induktion der TNFα-Synthese ist unabhängig von den unterschiedlichen Stimuli, die durch LPS, opsonisiertem Zymosan oder Phorbol- myristatacetat (PMA) für die Aktivierung des TNFα Promotors eingesetzt werden
(A. Baldwin, Annual Rev. Immunology 14, 649, 1996). Daher sollte der Einsatz der erfindungsgemäßen Inhibitoren auch zu einer vergleichbar starken Hemmung der TNFα Synthese führen unabhängig von der Art der Stimulierung der TNFα Synthese.
Die Tests für diesen Nachweis der stimulusunabhängigen Hemmung der TNFα Synthese erfolgten von der Art der Testdurchführung genauso wie es unter Beispiel A beschrieben ist mit dem Unterschied, daß neben LPS als Stimulus auch Zellkulturansätze mit 100 nM PMA oder mit 100 μg/ml opsonisiertem Zymosan stimuliert wurden. Zymosan und Phorbolmyristatacetat (PMA) können von der Firma Sigma,
Grünwalder Weg 30, 82041 Deisenhofen, Deutschland unter den Bestell-Nrn. Z4250 und P8139 bezogen werden. Zymosan wird in humanem Serum opsonisiert.
Die erfindungsgemäßen NF-κB-Inhibitoren hemmen unabhängig vom Stimulus mit IC50 Werten im submikromolaren Bereich in vergleichbarer Weise die TNFα Synthese in humanen Monozyten wie es im Beispiel A gezeigt wurde. So ist für Verbindung 1-2 der IC50-Wert nach PMA-Stimulus 0,4 μM und nach Zymosan- Stimulus 0,4 μM.
Beispiel D
Hemmung der NF-κB vermittleten Genexpression des Adhäsionsproteins ELAM-1 an humanen Nabelschnurendothelzellen (HUNEC)
Die Rekrutierung von Leukozyten aus der Blutzirkulation in den extravaskulären Raum ist essentiell bei inflammatorischen Antworten und bei derReparierung von
Ge ebeschäden. Der Prozeß der Leukozyteneinwanderung beinhaltet mehrere hintereinander geschaltete Schritte. Die initiale Interaktion zwischen Leukozyten und dem Endothel der Blutgefäße wird durch TΝF und II- 1 abhängige Expression des Adhäsionsproteins ELAM-1 am Endothel vermittelt. Sie vermittelt das sogenannte Rolling der Leukozyten entlang der Blutgefäßwand. Die transskriptionale Regulation der ELAM-1 Expression ist abhängig sowohl von der Nuclear Faktor-κB (NF-κB) Aktivierung und Bindung am ELAM-1 Promotor als auch von der "AP-1 binding site." MA. Read et al., J. Biol. Chem. Vol. 272, 2753-2761, (1997).
Der Einfluß von Verbindung 1-2 auf die Expression von ELAM-1 wurde in zwei unterschiedlichen Testansätzen überprüft. Es wurde in einem funktioneilen Ansatz die Adhäsion von humanen Neutrophilen an TNF-α stimulierten HUVEC-Zellen gemessen. Die Expression von ELAM-1 an der Oberfläche der HEVECs wurde mit einem fluoreszenz-markierten ELAM-1 spezifischen monoklonalen Antikörper mittels FACS-(Cell Sorting) Analyse bestimmt. Versuchsdurchführung : ELAM-1 abhängige Neutrophilen-Adhäsion an
Endothelzellen
Die Neutrophilen wurden aus menschlichem Blut (100 ml) isoliert. Dazu wurde in einem Zentrifugenbecher 3,5 ml Polyprep vorgelegt und mit 5 ml Blut vorsichtig überschichtet. Nach 30 Minuten Zentrifugieren bei 2100 min- 1 wurde die Neutro- philenbande in der Mitte des Zentrifugenbechers abgesaugt. Nach 1 :2 Verdünnungen in Endothelial Cell Basal Medium (EBM) Fa. Clonetics wurde wiederum 20 Minuten bei 1000 min- 1 zentrifugiert und anschließend zu einer Zellkonzentration von 106 Zellen/ml aufgenommen.
Die Nabelschnur-Endothelzellen wurden in 96 Well-Mikrotiterplatten in EBM + 10 % FCS zur Konfluenz angezogen. Bei Versuchsbeginn wurde das Medium gegen EBM ohne FCS ausgetauscht und anschließend die Versuchssub- stanzen eingesetzt. Nach 20 Minuten wurden die HUVECs mit lO nM TNF-α stimuliert. Nach 4 Stunden Inkubation wurden gegen 200 μl/Well der Neutrophilensuspension ausgetauscht. Die Neutrophilen wurden vorher 20 Minuten mit einer 25 μM BCESP-Fluoreszenzfarbstofflösung markiert. Nach 30 Minuten Inkubation wurde die BCECP-Neutrophilen-Lösung mit überschüssigen Neutro- philen abgezogen und gegen 200 μl/Well 0,5 %iger NaOH-Lösung ausgetauscht. Die
Fluoreszenz der anhaftenden Neutrophilen wurde anschließend im Fluoreszenzphotometer gemessen.
Sowohl die Adhäsion der Neutrophilen an TNF-α stimulierten HUVECs, als auch die Expression von ELAM-1 an der Zelloberfläche konnte durch die Verbindungen zu 50 % inhibiert werden. Die maximale Inhibition der Zelladhäsion wurde mit 10 nM für Verbindung 1-2 bestimmt. Die maximale 50 %ige Hemmung der ELAM-1 Expression steht in guter Übereinstimmung mit der gleichzeitig NF-κB und AP-1 abhängigen Regulation des ELAM-1 -Promotors. Versuchsdurchführung : Quantitative Messung der TNF-induzierten Expression von ELAM-1 in HUVECs:
Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) wurden wie oben beschrieben kultiviert und in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml TNF in Gegenwart oder Abwesenheit von Testsubstanzen für 4 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden aus den Mikrotiterplatten durch Inkubation mit 5 mM EDTA in PBS herausgelöst, für 5 Minuten bei 1000 min- 1 zentrifugiert, und in 100 μl PBS plus 1 % Rinderserum Albumin (BSA, Fa. Sigma-Aldrich GmbH, Best. Nr. A7906) in einem Anti- EL AM 1 Antikörper (monoklonaler Antikörper, Fa. Becton and Dickinson,
Erembodegem, Belgien, Best. Nr. 550 023, 30 μg/ml) bei RT inkubiert. Nach 15 Minuten wurden die Zellen erneut zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in PBS plus 1 % BSA gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurde das erhaltene Zellpellet in PBS plus 1 % BAS und einem Ziege-anti-Maus Antikörper (Fa. Dianova, Raboisen 5, Hamburg, Best. Nr. 1 15-096-062; 30 μg/ml) für die Dauer von 15 Minuten inkubiert. Nach erneutem Zentrifugieren und Waschen wurden die Zellen in 1 ml PBS plus 1 % BSA aufgenommen und in einem Flow- Cytometer (Fa. Becton and Dickinson) bei 488 nm vermessen. Gemessen wird mit diesem Verfahren die Intensität der Fluoreszenz in Abhängigkeit von gebundenem anti-ELAM-1 -Antikörper pro Zelle- Für jeden Wert wurden 5000 Zellen vermessen.
HUVECs, die mit TNF für 4 Stunden stimuliert wurden, zeigten nach Inkubation mit anti-ELAM-1 -Antikörpern deutlich stärkere Floureszenzsignale als Zellen, die demgegenüber nicht mit TMF inkubiert wurden. Die Verbindung 1-2 vermochte diese induzierte Expression von ELAM-1 in einem Konzentrationsbereich zwischen
0,05 μM und 5 μM signifikant zu inhibieren, die Expression von ELAM-1 wurde allerdings bei keiner der untersuchten Konzentrationen vollständig inhibiert. Beispiel E
Hemmung der Interleukin-2-Synthese
Zur Testung der Hemmwirkung von Cyclopentabenzol-Derivaten auf die Interleukin- 2-Synthese wurde eine Reportergenzellinie benutzt, die den Interleukin-2-Promotor gekoppelt an das Luciferasegen enthält. Der Promotor enthält die DNA-Sequenz von -480 bis +4. Der eingesetzte Vektor ist pGL3; die Ausgangszellinie, in die das gesamte Kontrukt stabil transfiziert wurde, ist SS-1. Das Kulturmedium für diese Zellinie war RPMI 1640 (Gibco, Rockille). Es enthielt zusätzlich: 100 μg/ml Strepto- mycin, 100 U/ml Penicillin, 2 mM L-Glutamin, 10 % Hitze-inaktiviertes FBS und
800 μg/ml G418 Sulfat.
Testdurchführung
Die Reportergen-Testzellinie wurde in Phenolrot-freies RPMI mit den Zusätzen zu
1 x 106 Zellen pro Well in 96-Well-Platten ausgesäht und mit Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA; 5 ng/ml) und Ionomycin (10 M; 0,4 μg/ml) für 24 Stunden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5 % CO2, 95 % Luft inkubiert. Die Testsubstanzen wurden gleichzeitig mit PMA zugesetzt.
Messung der Luciferaseaktivität:
Zur Generierung der Lumineszenz wurde LucLite™ Lösung (Packard, Meriden, CT) zu einer Konzentration von 100 μl/Well zugesetzt und sofort nach Zugabe die Lumineszenz im Luminometer (Luminoskan, Labsystems) gemessen.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Cyclopentabenzofuran-Derivaten der Formel (I)
Figure imgf000030_0001
in welcher
[A] R1 für Wasserstoff steht,
R2 für Methoxy steht,
R3 für Wasserstoff steht oder
R2 und R3 gemeinsam für -OCH2O- stehen,
R4 für Methoxy steht,
R5 für Hydroxy, OCHO oder Acetoxy steht,
R6 und R7 jeweils für Wasserstoff stehen oder
R5 und R6 gemeinsam für Sauerstoff (Oxo) oder Hydroxyimino stehen,
R8 für -COOR12 oder -CONR13R14 steht, worin R12 und R'3 für Wasserstoff oder Methyl stehen und
R14 für Wasserstoff, Methyl, 4-Hydroxybutyl oder 2-Tetra- hydrofuryl steht oder
oder
R8 für einen Rest der Formel
Figure imgf000031_0001
steht,
R5 und R8 gemeinsam für eine Gruppe der Formeln (a) oder (b)
Figure imgf000031_0002
stehen, wobei die dem N-Atom benachbarte Verknüpfungsstelle R5 entspricht und darüber hinaus R6 und R7 ge- meinsam für eine direkte Bindung stehen,
R9 für Phenyl steht,
R10 für Methoxy steht, R1 ' für Wasserstoff, Hydroxy, 2-Methoxy oder 2-Rhamnosyl steht, oder
R10 und R11 benachbart und gemeinsam für -OCH2O- stehen, oder
R15 für Hydroxy, Methoxy oder Ethoxy steht,
R16 für Wasserstoff, Hydroxy oder Methoxy steht,
[B] R1, R3 und R8 jeweils für Wasserstoff stehen,
R2 und R4 jeweils für Methoxy stehen,
R5 für Hydroxy steht,
R6 und R7 jeweils für Wasserstoff stehen oder
R5 und R6 gemeinsam für Sauerstoff (Oxo-Gruppe) stehen,
R9 für Phenyl steht,
R10 für Methoxy steht,
R" für 2-Methoxy oder 2-Rhamnosyl steht, oder
R10 und R' ' benachbart und gemeinsam für -OCH2O- stehen,
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Nuclear Faktor KB -abhängigen Krankheiten. O 00/07579
- J 1 -
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß ein Arzneimittel zur Behandlung von Entzündungskrankheiten, immunologischen Erkrankungen, septischem Schock, Transplantatabstoßung, Strahlungsschäden, Reperfusionsverletzungen nach Ischämie, Thrombosen oder komplexen, chronisch-entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose hergestellt wird.
PCT/EP1999/005426 1998-08-05 1999-07-29 VERWENDUNG VON CYCLOPENTABENZOFURANDERIVATEN ZUR BEKÄMPFUNG VON NF-λB-ABHÄNGIGEN KRANKHEITEN WO2000007579A2 (de)

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