WO1999061474A1 - Activine humaine purifiee et son procede de production - Google Patents

Activine humaine purifiee et son procede de production Download PDF

Info

Publication number
WO1999061474A1
WO1999061474A1 PCT/JP1999/002680 JP9902680W WO9961474A1 WO 1999061474 A1 WO1999061474 A1 WO 1999061474A1 JP 9902680 W JP9902680 W JP 9902680W WO 9961474 A1 WO9961474 A1 WO 9961474A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
human activin
activin
crude
cation exchange
purity
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/002680
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kunio Ono
Shigekatsu Tsuchiya
Daisuke Ejima
Yuzuru Eto
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Priority to DE69905462T priority Critical patent/DE69905462T2/de
Priority to EP99921221A priority patent/EP1081159B1/en
Publication of WO1999061474A1 publication Critical patent/WO1999061474A1/ja
Priority to US09/721,750 priority patent/US6756482B1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel purified human activin, and more particularly to a purified human activin and a method for producing the same, and more particularly, to a method for isolating and purifying human activin A from crude human activin A, and further to a high purity obtained in this manner. It relates to purified human activin and the human activin in the form of a pharmaceutical preparation.
  • Human activin is expected to be developed as a pharmaceutical.
  • Human activin A is a useful substance that can be used for pharmaceuticals and other uses such as osteoporosis improvement therapeutics.
  • Human activin A is a human leukemia cell line THP-1 (IF050147). It is a homodimer protein consisting of two polypeptide chains of 116 amino acids isolated and purified from a culture supernatant. The molecular weight is about 2500 daltons, and there are 9 cysteine residues (Cys) per polypeptide chain (total of 18 dimers), and a total of 9 intramolecular and intermolecular disulfides A bond is formed (see Biochemical and Biophysical Research Communications, 142, 1095-1103, 1987).
  • the present inventors have developed the following four methods as means for producing and purifying human activin A. That is,
  • Human activin A obtained by the above four methods was sufficiently pure as a sample for animal experiments.
  • human activin A in order to develop human activin A as a drug, it is necessary to create a practical purification process capable of industrially producing a drug substance of extremely high purity enough to be administered to humans at an appropriate production cost.
  • An object of the present invention is to develop a method capable of easily isolating and purifying high-purity human activin A suitable for pharmaceutical use from crude human activin, particularly crude human activin A, and producing human activin on an industrial production scale. In production and delivery.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result,
  • crude human activin in particular, crude human activin A solution, if necessary, after removing the refolding reagent by a general method, if necessary, preferably containing a high-concentration organic solvent, A cation-exchange column equilibrated with trobic ions and a very low pH buffer is used to separate and separate analogs with different electrical properties by chaotropic ion elution. Human activin A can be obtained.
  • the present invention relates to a method for producing human activin having improved purity by purifying crude human activin in a purification step containing cation exchange chromatography, particularly cation exchange chromatography by concentration gradient elution. is there .
  • the concentration gradient elution method is preferably a chaotropic ion concentration gradient elution method.
  • a typical example of human activin is human activin A.
  • the present invention includes the following:
  • the organic solvent contains at least one of lower alcohol, acetonitrile, dimethyl sulfoxide and dimethylformamide, and the concentration is at least 20% by volume, more preferably 20% by volume.
  • the above-mentioned manufacturing method which is ⁇ 60% by volume
  • the crude human activin is not refolded during refolding, such as its electrically different analog, host-derived protein, host and / or medium-derived antigenic substance, and pyrogen.
  • the above-mentioned production method comprising at least one of an aggregate, an analog based on an error in gene translation or improper post-translational modification, and a degradation product or modification product of human activin generated in the purification step.
  • the crude human activin is obtained by culturing a microorganism into which the human activin gene has been introduced, solubilizing the produced human activin-insoluble granules, and at least one of the active crude human activin-derived impurities obtained by refolding.
  • the above production method wherein the method is a crude human activin containing a seed.
  • a purification step for removing low molecular impurities is combined as the purification step.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of cation exchange chromatography performed in Example 1 of the present invention.
  • the horizontal axis represents the retention time (minutes).
  • a is N a C 1 gradient elution
  • b by a N a C 10 4 gradient elution.
  • FIG. 9 is a view showing the results of anion exchange chromatography performed in Example 2.
  • the horizontal axis represents the retention time (minutes).
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of the second anion exchange chromatography in Example 2.
  • the horizontal axis represents the retention time (minutes).
  • FIG. 7 is a view showing the results of cation exchange chromatography performed in Example 2.
  • the horizontal axis represents the retention time (minutes).
  • FIG. 7 is a view showing the results of reversed-phase HPLC of the purified human activin A fraction performed in Example 2.
  • the horizontal axis represents the retention time (minutes).
  • the purified human activin A7 / g was loaded on a reverse phase HPLC (Nucleosil C8; GL Science) and subjected to an acetonitrile concentration gradient. The peak detected at a retention time of about 17.5 minutes is due to human activin A.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of cation exchange HPLC of the purified human activin A fraction performed in Example 2.
  • the horizontal axis represents the retention time (minutes).
  • the purified human activin A12 / g was loaded on a cation exchange HPLC (SP-NPR; manufactured by Tosoichi) and subjected to salt concentration gradient elution.
  • SP-NPR cation exchange HPLC
  • the peak detected at a retention time of about 10 minutes is due to human activin A.
  • FIG. 4 shows the results of Yion exchange HPLC of purified human activin A fraction performed in Example 2.
  • the horizontal axis represents the retention time (minutes).
  • the purified human activin A (12 ⁇ g) was loaded on anion-exchange HPLC (DEAE-NPR; manufactured by Tosoh Corporation) and subjected to salt concentration gradient elution. The peak detected at about 7 minutes during the retention was due to human activin A.
  • FIG. 4 is a view showing the results of SDS-PAGE of purified human activin A carried out in Example 2.
  • Purified human activin A2 ljug and 21 ng were subjected to SDC-PAGE according to a standard method. (Phast System; manufactured by Amersham Fulmasia / Ziotec). The band detected at mobility with a molecular weight of about 26000 is due to human activin A.
  • Lane 1 6 types of standard protein (94000, 67000, 43000, 30000, 20000, and 14400) mixed solution (molecular weight calibration kit LMW; Amersham Pharmaciaha, Yotek); Lane 2: purified human activin A 21 ⁇ g, and lane 3; purified human activin A21 ngo (FIG. 9)
  • FIG. 3 is a view showing the results of comparison of protein purity obtained in Example 2 and a conventional method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-25498).
  • Human activin A12 obtained by Example 2 and the conventional method was subjected to ion exchange 1 ⁇ using an 8?- ⁇ ! 1 column to compare protein purity. did.
  • a is Example 2 and b is the conventional method.
  • Embodiments of the present invention will be described in detail below mainly on the production of purified human activin A.
  • Crude human activin as a starting material used in the present invention includes crude products of various activins such as crude human activin A. Therefore, crude human activin containing at least one impurity that is difficult to separate by ordinary purification means among various impurities may be used. Although there is no particular limitation on the type of impurity, it is not necessary to refold at the time of refolding, such as an electrically different analog, a host-derived protein, an antigenic substance derived from the host and / or medium, and a pyrogen. Aggregates, analogues based on mistranslation or improper modification after translation, and human activin degradation products or modifications generated in the purification process are all excellent in that they can be effectively separated. Suitable for advanced separation of analogs.
  • the analogous substances contained in the humanactivin A purification material are roughly divided into the above-mentioned analogous substances that are already contained at the stage of completion of the culture (for example, Escherichia coli may take in the wrong amino acid, Caused by abnormal modification by enzymes of Escherichia coli after protein is synthesized), which occurs during purification Related substances (refolding ⁇ caused by modification in chromatography).
  • the purification techniques used in the present invention include modifications that occur during refolding (especially deamidation reactions that occur at high pH values, such as those in which asparagine in the molecule has been changed to aspartic acid). Is particularly effective in separating and removing A. from human activin A. Therefore, the purification of the present invention is particularly effective when human activin A is produced by a microorganism in a denatured state and artificially refolded.
  • Crude human activin obtained by reducing and denaturing insoluble granules obtained from a microorganism into which the gene of human activin A has been incorporated, and then refolding based on the method described in WO 97/23638 A solution can be used.
  • a method known as a method for removing low molecular impurities should be adopted.
  • a method generally used for buffer replacement such as ultrafiltration, gel filtration chromatography, or dialysis may be used.
  • the crude human activin A solution is diluted in advance, and the scale-up operation can be performed regardless of the type and content of impurities in the starting material by concentration operation using a membrane with a molecular fraction of about 100,000. Becomes
  • the method for producing purified human activin according to the present invention is a method for producing crude human activin by purifying the crude human activin by cation exchange chromatography using a concentration gradient elution method, in particular, a chaotropic ion concentration gradient elution method, to thereby produce a purified human activin. It is.
  • Chaotropic ions are salts that have the effect of destroying the higher-order structure of proteins.
  • N a SCN or N a C 1 0 4 low molecular non-electrolyte, increasing the solubility against water of proteins and the like, one lifting the nature of such denaturing to destroy the higher-order structure of proteins and nucleic acids ions (Refer to Basic Experimental Methods for Proteins and Enzymes, PP63 (2nd revised edition; Takeshi Horio, ed., Nankodo, 1994.)
  • This property is due to the ions generated by dissociation of salt. This is thought to be because the water structure is destroyed and the water entropy is reduced when the hydrophobic substance comes into contact with water.
  • the fraction from which low molecules have been removed in this way is adjusted under acidic conditions, preferably to a pH of about 2 to 4 (more preferably, to a pH of about 2.5 to 3.5).
  • An organic solvent for example, a 20 to 60% organic solvent, preferably a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms such as ethanol and isopropanol, acetonitrile, dimethyl sulfoxide and dimethylformamide
  • a chaotropic ion of 0.2 M or less salt having the properties e.g., NaC10 4, perchlorate such KC1_rei 4, NaSCN, Chioshian salts such as KS CN
  • acidic conditions comprising, preferably about pH 2 ⁇ 4 (more preferably pH 2.
  • the two-step anion exchange chromatography is used as follows, It is extremely advantageous to substantially remove impurities generated before impurity refolding to increase purification efficiency.
  • lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms such as ethanol, isopropanol, etc., acetonitrile, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, etc.
  • salts of 0.1 M or more for example, use of NaC1, pH 8.5 to 8.5 9.5 buffer solution (E.g., 20 mM 1,3-diaminopropane / HC1) to substantially remove monomers and associated aggregates, and to concentrate human activin A fractions to lmg / ml or more. Can be obtained.
  • a buffer solution having a pH of about 9.5 to 10.5 for example, 2 OmM 1,3-diaminopropane / HC1
  • an organic solvent for example, 5 to 25% of an organic solvent, preferably methanol
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a buffer solution eg, 20 mM
  • a salt of 5 OmM or less for example, using NaCl
  • the purity of the finally obtained fraction was determined by reversed-phase HPLC (for example, NucleosilC8; used by GL Science), anion exchange HPLC (for example, DEAE-NPR; used by Tori-I), It can be confirmed by cation exchange HPLC (for example, SP-NPR; used by Tohoku, NO-) and SDS-PAGE.
  • reversed-phase HPLC for example, NucleosilC8; used by GL Science
  • anion exchange HPLC for example, DEAE-NPR; used by Tori-I
  • cation exchange HPLC for example, SP-NPR; used by Tohoku, NO-
  • SDS-PAGE SDS-PAGE
  • the high-purity human activin thus obtained can be easily used in the form of a pharmaceutical preparation as described above, but the preparation of the preparation uses a preparation technique which is generally available in the field of preparations. Can be done.
  • Modified human activin A obtained from recombinant Escherichia coli into which the human activin A gene was introduced was refolded according to the contents described in WO 97/23638. After the H 2 0 were added in equal amounts to the refolding solution 25 OML (protein 12m g), membrane with a molecular fraction weight 10000 (Filtron Ltd. " And concentrated to about 1/13 of the initial volume using Omega. In this membrane concentration operation, 11.5 mg of the protein was recovered (recovery rate: 96%), and the protein purity of the fraction determined by reverse phase HPLC was 68%.
  • a membrane-enriched fraction of 37.Omg was obtained from the refolding solution. This was loaded onto Sephadex G—25M (1.6 ⁇ ⁇ 10 cm; manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mM 1,3-diaminobutane / HC1 containing 30 mM NaC1, and was subjected to A280. 36.3 mg of the detected protein was recovered (recovery rate 98%). This fraction 36.
  • the protein purity of this fraction was 99% and 88%, respectively, as determined by anion exchange HPLC (DEAE-NPR; Higashi, NO-) and cation exchange HPLC (SP-NPR; Higashi, NO-). It was. This was loaded on a Sephadex G-25M (1.6 ⁇ X 5 cm; Amersham Pharmacia) biotech column equilibrated with 1.8 mM HC1, and 5.4 mg of the protein detected by A280 was loaded. (Recovery 98%). 5 mg of this fraction was loaded onto Resource S (0.50 ⁇ 5 cm; Amersham Pharmaciaha, Iotek) according to Example 1, and 3.9 mg of the protein detected by A280 was recovered (recovery rate 78%; FIG. See 4.) This was purified by Sephadex G—25M equilibrated with 1.8 mM HC1.
  • reversed-phase HPLC NucleosilC 8; manufactured by GL Science
  • anion exchange HPLC DEAE-NPR; manufactured by Toray
  • cation exchange HPLC SP-NPR; manufactured by Higashi, No-
  • 5 and 8 show the results of SDS-PAGE.
  • reverse phase HPLC see Fig. 5
  • cation exchange HPLC see Fig. 6
  • anion exchange HPLC see Fig. 7
  • no peak was observed other than the peak of human activin A. In the method, it was confirmed that no impurities were detected.
  • Table 1 shows the results of this example including the membrane concentration operation described in Example 1, and Table 2 shows the various HPLC and SDS-PAGE analysis conditions shown in FIGS.
  • the protein purity of the purified human activin A obtained by the conventional purification method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-255980) and the protein purity of the purified human activin A obtained in Example 2 were determined by cation exchange HPLC. And used for comparison (see Figure 9).
  • the conventional method (FIG. 9b)
  • about 2% of impurities remained in addition to the purified human activin A.
  • no impurities were detected in the purified human activin A according to the present Example 2 (FIG. 9a), and the purity was low. was considered to be at least 99%, indicating the usefulness of this purification method.
  • HPLC system HPLC system for low pressure gradient (Hitachi)
  • a solvent 40% acetonitrile, 2 OmM sodium citrate (pH 3.0)
  • B solvent 40% acetonitrile, 0.1 M NaC 104, 20 mM
  • the flow rate, detection, and HPLC system are the same as (1) _ above.
  • the flow rate, detection, loading, and HPLC system are the same as (2) above.
  • PhastSystem 7 / manufactured by Yotek Co., Ltd.
  • the method was performed according to the SDS-PAGE method described in the manual (dyeing was carried out using a diamine silver staining method).
  • the crude human activin is subjected to a purification step containing cation exchange chromatography by a concentration gradient elution method
  • high-purity human activin that cannot be obtained by the conventional method is industrially produced. It can be expected to be used for pharmaceutical applications.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

明 細 精製ヒトァクチビン及びその製造方法 技術分野
本発明は、 新規精製ヒトァクチビン、 詳しくは純度が改善したヒ トァクチビン 及びその製造方法に関し、 特に、 粗ヒトァクチビン Aからヒトァクチビン Aを単 離、 精製する方法、 更にはこのようにして得られうる高純度に精製されたヒトァ クチビンや医薬製剤の形態にある当該ヒトァクチビンに関するものである。
背景技術
ヒトァクチビンは、 医薬品としての開発が期待されており、 特にヒトァクチビ ン Aは、 骨粗鬆症改善治療薬等医薬品その他の用途が期待できる有用物質である ヒトァクチビン Aはヒト白血病細胞株 THP-1 ( IF0 50147) の培養上清より単離 、 精製されたアミノ酸 1 1 6個のポリペプチド鎖 2本から成るホモダイマータン パク質である。 分子量は、 約 2 5 0 0 0ダルトンであり、 ポリぺプチド鎖毎に 9 個のシスティン残基 （Cys) が存在 （ダイマーで合計 1 8個） 、 合計 9個の分子 内、 分子間ジスルフィ ド結合を形成している （Biochemical and Biophysical Re search Communications, 142, 1095-1103, 1987参照。 ） 。
本発明者等は、 特に、 ヒトァクチビン Aの生産、 精製手段として以下に示した 4種類の方法を発展させてきた。 即ち
( 1 ) ヒト骨髄性白血病細胞 ΊΉΡ- 1 ( IF0 50147) をホルボールエステルを用いて 刺激後に得た培養上清から、 硫安分画と 4段階のカラムクロマトグラフィ一によ り得る方法 （細胞工学、 別冊 4、 P48-58、 1987年参照。 ） ；
( 2 ) ヒトァクチビン Aの c D N Aを組み込んだ発現べクタ一を導入して得たヒ トァクチビン A高生産遺伝子組み換え C H 0細胞由来培養上清から、 酸有機溶媒 沈殿/冷却層分離と逆相 HPLCを組み合わせることにより得る方法 （Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 230-235, 1988；及び特開平 1 - 3 0 0 8 9 8号公報参照。 ） ； ( 3 ) 上記と同じ方法で得られた培養上清から、 ヒ
質であるフォリス夕チンをリガンドに用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィ一 により取得する方法 （特開平 2 _ 2 5 5 0 9 8号公報参照。 ） ；及び
( 4 ) ヒトァクチビン Aの c D N Aを組み込んだ発現べクタ一を導入したヒトァ クチビン A高生産遺伝子組み換え微生物の、 菌体中に蓄積される不溶性顆粒より 可溶化、 リフォ一ルディングして得た粗ヒトァクチビン A溶液から逆相 HPLCによ り得る方法 （国際出願公開第 W O 9 7 / 2 3 6 3 8号公報参照。 ） の 4種類の方 法である。
上記 4種類の方法で得たヒトァクチビン Aは動物実験用サンプルとしては十分 に高純度であった。 しかし、 ヒトァクチビン Aを医薬品として開発するには、 ヒ 卜に投与するに足る極めて高純度の医薬品原体を、 適切な製造コス卜で工業生産 し得る実用的な精製工程を作り上げる必要があるが、 上記方法ではヒトァクチビ ン Aをヒ卜に投与し得るに十分な純度まで精製することが困難であった。 即ち、 上記 4種類の生産方法で使用されたクロマトグラフィ一類をいくら組み合わせて も、 宿主又は培地由来の抗原性物質や発熱性物質等、 ヒトァクチビン A遺伝子の 翻訳ミスや翻訳後修飾不適切に基づく類縁体、 及び精製工程で生じるヒトァクチ ビン A分解物、 修飾物等を高度に除去することは不可能であった。
このような情況下に、 高純度に精製されたヒトァクチビンの製造方法が求めら れている。
発明の課題
本発明の課題は、 粗ヒトァクチビン、 特に粗ヒトァクチビン Aから医薬用途に 適した高純度のヒトァクチビン Aを簡便に単離、 精製でき、 かつ工業生産規模で ヒトァクチビンを製造できる方法の開発並びに高純度ヒトァクチビンの製造、 及 び提供にある。
発明の開示
本発明者等は上記課題解決に向けて鋭意検討を行った結果、 粗ヒ
として粗ヒトァクチビン Aについて検討を行った。
ヒトァクチビン Aの高生産遺伝子組み換え微生物培養中の不溶性顆粒体よりリ フォ一ルディングした粗ヒトァクチビン A溶液から、 ヒトァクチビン Aとその類 縁物質との電気的性質の差異を利用して分離するイオン交換クロマトグラフィー を確立することが最も適当と考えた。 その理由として、 イオン交換クロマトグラ フィ一は、 逆相クロマトグラフィーに比較してスケールアップが容易であり、 夕 ンパク質の工業的な大規模製造に最も適する方法であると考えた。
ところで、 江藤等は粗ヒトァクチビン Aを、 DEAE-トヨパール （東、ノ -製） 、 及 び Mono- Q (アマシャムフアルマシア) Γィォテク製） の 2種類の担体を使用する陰ィオン交換ク口 マ卜グラフィーで精製している (Biochemical and Biophysical Research Co醒 nications, 151, 230-235, 1988参照。 ） 。 しかし、 大量精製用カラム充填剤で ある DEAE— トヨパールを使用して精製した場合、 得られたヒトァクチビン Aの夕 ンパク質純度は約 2。/0と低く、 高性能な高速液体クロマトグラフィー （HPLC) 力 ラムである Mono- Qを使用した場合でも約 5 5 %のタンパク質純度にとどまってい る。 何れも医薬品に適した純度のタンパク質純度を達成するためには全く不充分 な精製能力であった。 加えて、 何れのカラムを用いた場合でもヒトァクチビン A の回収率は低く （前者の回収率約 5 6 %、 後者の回収率約 6 3 %) 、 又希薄な溶 液で回収されるために、 そのまま工業的な生産に使用するのは不可能と結論した 。 以上のように、 従来知られた一般的な精製技術を使用して、 ヒトァクチビン A のイオン交換クロマトグラフィ一を工業的生産規模で実施することが極めて困難 なことは全く明らかだった。
本発明者等は、 上記課題を解決するために、 更に研究を進めた結果、 粗ヒトァ クチビン A溶液から、 必要により低分子不純物を除去後、 陽イオン交換クロマト グラフィ一を含む精製工程を使用することにより、 ヒトァクチビン Aを高度に精 製する方法を見出し、 この知見に基づき本発明を完成するに到った。
より詳しくは、 本発明によれば、 粗ヒトァクチビン、 特に粗ヒトァクチビン A 溶液に、 残留する場合必要によりリフォールディング試薬を一般的な方法により 除去した後、 好ましくは高濃度有機溶媒を含有させて、 カオトロビックイオン、 及び極めて低い pH緩衝液で平衡化された陽イオン交換カラムに負荷し、 カオトロ ピックィオンの濃度勾配溶出法によって、 電気的性質の異なる類縁体を高度に分 離除去し、 高純度のヒトァクチビン Aを得ることができる。
即ち、 ヒトァクチビン A遺伝子を導入した微生物を培養し、 産生されたヒトァ クチビン A不溶性顆粒の可溶化、 リフォールディングより得られた活性な粗ヒト ァクチビン A溶液を精製する場合、 好ましくは低分子不純物を除去した後、 好ま しくは、 これを高濃度の有機溶媒、 極めて低い p H、 及びカオトロピックイオン の性質をもつ塩を組み合わせた条件の陽イオン交換クロマトグラフィ一に負荷し 、 カオトロピックイオン濃度勾配溶出により、 特に好ましくは宿主由来タンパク 質、 リフォールデイングしなかった会合凝集体、 及び電気的性質の異なる類縁体 の何れも効果的に除去することができ、 しかも濃縮ヒトァクチビン Aを高回収率 で取得可能である。
即ち、 本発明は粗ヒトァクチビンを、 陽イオン交換クロマトグラフィー、 特に 濃度勾配溶出法による陽イオン交換クロマトグラフィ一を含有する精製工程に付 して精製することにより純度が改善されたヒトァクチビンを製造する方法である 。 当該濃度勾配溶出法はカオトロピックイオンの濃度勾配溶出法が好ましい。 ヒトァクチビンの代表例としてヒトァクチビン Aを挙げることができる。 更に、 本発明には下記の内容も含まれる ：
[1] 上記製造方法において、 水溶性有機溶媒の存在下及び/又は酸性下に陽ィ オン交換カラムクロマトグラフィーを行う上記製造方法。
[2] 上記 [1]の精製法において有機溶媒が低級アルコール、 ァセトニトリル、 ジ メチルスルホキシド及びジメチルホルムアミ ドの少なくとも 1種を含み、 その濃 度が低くとも 2 0容量％、 より好ましくは 2 0〜 6 0容量％である上記製造方法
[3] 上記製造方法において、 粗ヒトァクチビンが、 電気的に異なるその類縁体 、 宿主由来タンパク質、 宿主及び/又は培地由来の抗原性物質、 発熱物質等、 リ フオールディングに際してリフォ一ルディングしなかった会合凝集体、 遺伝子翻 訳ミスや翻訳後修飾不適切に基づく類縁体、 及び精製工程で生じるヒトァクチビ ン分解物、 修飾物等の少なくとも 1種を含む上記製造方法。
[4] 上記製造方法において、 粗ヒトァクチビンが、 ヒトァクチビン遺伝子を導 入した微生物を培養し、 産生されたヒトァクチビン不溶性顆粒の可溶化、 リフォ —ルディングより得られた活性な粗ヒトァクチビン由来の不純物の少なくとも 1 種を含有する粗ヒトァクチビンである上記製造方法。 [5] 上記製造方法において、 精製工程として低分子不純物を除去する精製工程 を組合せた上記製造方法。
[6] 精製工程として、 更にアルカリ性下に陰イオン交換クロマトグラフィ一に よる精製工程を含有する上記製造方法。
[7] 上記 [6]の製造方法において、 クロマトグラフィーが天然多糖をベースマト リックスとした陰イオン交換クロマトグラフィーを含む上記製造方法。
[8] ヒトァクチビン遺伝子を導入した微生物を培養し、 産生されたヒトァクチ ビン不溶性顆粒の可溶化、 リフオールディングより得られた活性な粗ヒトァクチ ビン溶液から低分子不純物を除去した後、 これを高濃度の有機溶媒とカオトロピ ックイオンを含む極めて低い p Hで平衡化された陽ィオン交換クロマトグラフィ 一に負荷し、 カオトロピックイオン濃度勾配溶出を行うことにより、 宿主由来夕 ンパク質、 リフォ一ルディングしなかった会合凝集体、 及び電気的性質の異なる 類縁体を効果的かつ高度に除去した濃縮ヒトァクチビンを高回収率で製造する方 法。
[9] 上記 [8]の製造方法において、 低分子物質の不純物を除去した後、 下記 2ェ 程を組み合わせることにより、 更に効率良く精製を行い粗ヒトァクチビン溶液か ら高純度のヒトァクチビンを製造する方法。
( i ) 当該一部精製物を極めて高い p H条件で平衡化された天然多糖をべ一スマ トリックスとした陰イオン交換クロマトグラフィーに負荷し、 塩濃度上昇、 p H 低下、 及び有機溶媒を添加した緩衝液へ置換することにより、 宿主由来タンパク 質、 リフォールデイングしなかった会合凝集体、 電気的性質の異なる類縁体の何 れも概ね除去した濃縮ヒトァクチビン Aを定量的に回収する工程；、
( i i ) 上記 （i ) で得られた回収画分の緩衝液を置換した後、 有機溶媒を含む 極めて高い p Hで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィ一に負荷し、 塩濃 度勾配、 及び p H勾配 （p H低下） を施すことにより、 宿主由来タンパク質、 及 び電気的性質の異なる類縁体の何れも概ね除去した濃縮ヒトァクチビンを高回収 率で得る工程；及び上記 （i i ) で得られた回収画分の緩衝液を置換した後、 前 記陽ィオン交換クロマトグラフィ一の精製工程を行う製造方法。
[10] 上記本発明及び [1]乃至 [9]の製造方法において得られた純度が改善したヒ トァクチビン及び純度が低くとも 99 %の高純度ヒ
[11] その純度が低くとも 99%で、 不純物として電気的性質を異にするヒトァ クチビン類縁体を実質的に含まないヒトァクチビン。
[12] 上記本発明及び [1]乃至 [9]の製造方法並びに上記 [10]及び [11]においてヒ トァクチビンがヒトァクチビン Aである発明。
[13] 上記本発明及び本発明により得られる、 又は得られうる純度が改善したヒ トァクチビン、 特にこのようなヒトァクチビン Aを含有する骨粗鬆症改善治療薬 その他の医薬製剤。
図面の簡単な説明
(図 1)
本発明の実施例 1で実施の陽イオン交換クロマ卜グラフィ一の結果を示す図で ある。 横軸は保持時間 （分） を表す。
1. 8mM HC 1に溶解したヒトァクチビン A6mgを陽イオン交換クロマ トグラフィ一 （リソース— S ；アマシャムフアルマシア/ ィォテク製） に負荷し、 塩濃度勾配溶 出に供した。 図中、 「一」 部分を回収した。
図中、 aは N a C 1濃度勾配溶出法、 bは N a C 104濃度勾配溶出法による。 (図 2)
実施例 2において実施の陰イオン交換クロマトグラフィ一の結果を示す図であ る。 横軸は保持時間 （分） を表す。
2 OmM NaC lを含む 20mM 1 , 3—ジァミノプロパン/ H C丄に溶 解したヒトァクチビン A 36mgを陰イオン交換クロマトグラフィー （Q—セフ ァロース F F；アマシャムフアルマシアハ、、ィォテク製） に負荷し、 12 %ァセトニトリル、 0. 1M NaCl、 2 OmM 1， 3—ジァミノプロパン/ H C 1に置換した。 図 中、 「一」 部分を回収した。
(図 3)
実施例 2において 2回目の実施の陰イオン交換クロマトグラフィ一の結果を示 す図である。 横軸は保持時間 （分） を表す。
2 OmM 1, 3—ジァミノプロパン/ HC 1に溶解したヒトァクチビン A6 m gを陰イオン交換クロマトグラフィー （リソース Q；アマシャムフアルマシアハ、、ィォテク製） に負荷し、 塩濃度と pHの勾配溶出に供した。 図中、 「一」 部分を回収した。 (図 4)
実施例 2において実施の陽イオン交換クロマトグラフィ一の結果を示す図であ. る。 横軸は保持時間 （分） を表す。
1. 8mM HC 1に溶解したヒトァクチビン A6mgを陽イオン交換クロマ トグラフィ一 （リソース一 S ；ァマシャムフアルマシアハ、、ィォテク製） に負荷し、 塩濃度勾配溶 出に供した。 図中、 「―」 部分を回収した。
(図 5)
実施例 2で実施の精製されたヒトァクチビン A画分の逆相 HPLCの結果を示す図 である。 横軸は保持時間 （分） を表す。
精製されたヒトァクチビン A7 /gを逆相 HPLC (NucleosilC 8； GLサイェン ス製） に負荷し、 ァセトニトリル濃度勾配に供した。 保持時間約 1 7. 5分に検 出されたピークはヒトァクチビン Aによる。
(図 6)
実施例 2で実施の精製されたヒトァクチビン A画分の陽イオン交換 HPLCの結果 を示す図である。 横軸は保持時問 （分） を表す。
精製されたヒトァクチビン A 1 2 /gを陽イオン交換 HPLC (SP-NPR；東ソ一製 ) に負荷し、 塩濃度勾配溶出に供した。 保持時間約 1 0分に検出されたピークは ヒトァクチビン Aによる。
(図 7)
実施例 2で実施の精製されたヒトァクチビン A画分の陰ィォン交換 HPLCの結果 を示す図である。 横軸は保持時間 （分） を表す。
精製されたヒトァクチビン A 1 2〃gを陰イオン交換 HPLC (DEAE- NPR；東ソー 製） に負荷し、 塩濃度勾配溶出に供した。 保持時問約 7分に検出されたピークは ヒトァクチビン Aによる。
(図 8)
実施例 2で実施の精製されたヒトァクチビン Aの SDS- PAGEの結果を示す図であ る。
精製されたヒトァクチビン A2 l jug 及び 2 1 ngを定法に従った SDC- PAGE (Phast System ； アマシャムフアルマシア/ Γィォテク製) に供した。 分子量約 26000の易動 度に検出されたバンドはヒトァクチビン Aによる。
レーン 1 ； 6種分子量の標準タンパク質 （94000, 67000, 43000 , 30000, 20000, 及び 14400) 混合溶液 （分子量キヤリブレーシ ヨンキット LMW；アマシャムフアルマシアハ、、ィォテク製） 、 レーン 2 ；精製されたヒトァクチ ビン A 21〃g、 及びレーン 3 ；精製されたヒトァクチビン A21 ngo (図 9)
実施例 2及び従来法 （特開平 2 _ 255098号公報参照。 ） で得られたタン パク質純度比較の結果を示す図である。
実施例 2及び従来法 （特開平 2— 255098号公報参照。 ） で得られたヒト ァクチビン A 12 を8?-^!1カラムを使用する陽ィォン交換1^ に供し、 タン パク質純度を比較した。
図中、 aは実施例 2, bは従来法による。
実施の形態
本発明の実施の形態について、 以下に精製ヒトァクチビン Aの製造を中心に詳 細に説明する。
本発明に使用する出発物質である粗ヒトァクチビンには、 粗ヒトァクチビン A 等各種ァクチビンの粗生成物が含まれる。 従って、 各種不純物で通常の精製手段 では分離困難な不純物を少なくとも 1種含む粗ヒトァクチビンであればよい。 不 純物の種類としては特に制限されないが、 電気的に異なるその類縁体、 宿主由来 タンパク質、 宿主及び/又は培地由来の抗原性物質、 発熱物質等、 リフォールデ イングに際してリフォールデイングしなかった会合凝集体、 遺伝子翻訳ミスや翻 訳後修飾不適切に基づく類縁体、 及び精製工程で生じるヒトァクチビン分解物、 修飾物等何れも効果的に分離できる点で優れており、 特に電気的性質を異にする 類縁体の高度分離に適している。
上記ヒトァクチビン A精製原料に含有される類縁物質について具体的には、 上 記した通り、 大きく分けて、 培養が終了した段階で既に含まれている類縁物質 （ 大腸菌が誤ったアミノ酸を取り込んだしまったり、 タンパク質が合成された後に 大腸菌の持つ酵素によって異常な修飾を受けることに原因） 、 精製途中に生じる 類縁物質 （リフォールディングゃクロマトグラフィーにおいて修飾を受けること に原因） の 2通りがある。 本発明で使用する精製技術は、 リフォールデイングの 最中に生じてしまう修飾物 （特に高 p H値下で生じる脱アミ ド反応物、 例えば分 子内のァスパラギンがァスパラギン酸に変化したもの） をヒトァクチビン Aから 分離除去するのに、 特に効果を発揮する。 従って、 本発明の精製について、 特に ヒトァクチビン Aを微生物に変性状態で生産させ、 人為的にリフォールディング させた場合に特に有効である。
被精製物としてヒトァクチビン Aの場合を例として、 以下に説明する。
ヒトァクチビン Aの遺伝子を組み込んだ微生物から得られる不溶性顆粒体を還 元変性抽出後、 国際出願公開第 WO 9 7 / 2 3 6 3 8号公報に記載の方法に基づ いてリフォ一ルディングした粗ヒトァクチビン A溶液を使用することができる。 この場合、 まず、 粗ヒトァクチビン A溶液から低分子の不純物を分離する方が好 ましく、 その場合の低分子不純物の除去方法については低分子不純物の除去方法 として知られている方法を採用することができ、 簡便には例えば限外濾過法、 ゲ ル濾過クロマトグラフィー法、 透析法等、 一般的に緩衝液置換する方法を使用す ればよい。 その際、 事前に粗ヒ トァクチビン A溶液を希釈し、 分子分画量 1 0 0 0 0程度の膜を使用した濃縮操作により、 出発原料中の不純物の種類や含量に関 係なくスケールアップが可能となる。
本発明の精製ヒトァクチビンの製造方法は、 粗ヒトァクチビンを、 濃度勾配溶 出法による陽イオン交換クロマトグラフィー、 特にカオトロピックイオンの濃度 勾配溶出法により、 精製して、 純度を改善したヒ トァクチビンを製造する方法で ある。
カオトロピックイオンとはタンパク質の高次構造を壊す効果をもつ塩類のこと である。 N a S C Nや N a C 1 04のように、 低分子非電解質、 蛋白等の水に対 する溶解度を高める、 蛋白や核酸の高次構造を破壊して変性させる等の性質を持 つイオン （蛋白質 ·酵素の基礎実験法、 PP63 (改訂第 2版；堀尾武ー編、 南光堂 、 1994年参照。 ） であり、 このような性質は、 塩が解離して生じたイオンによつ て水の構造が破壊され、 疎水性物質と水が接触したときに生じる、 水のェントロ ピ一の減少が抑制されるためであると考えられている。 このように低分子除去した画分を酸性下、 望ましくは pH2〜4程度 （より望 ましくは pH2. 5〜3. 5程度） に調整した後、 水溶性有機溶媒、 好ましくは 高濃度水溶性有機溶媒 （例えば、 20 ~ 60 %の有機溶媒、 好ましくはエタノー ル、 イソプロパノール等炭素数 1〜4の低級アルコール、 ァセトニトリル、 ジメ チルスルホキシド及びジメチルホルムアミ ド等） と 0. 2M以下のカオトロピッ クイオンの性質をもつ塩 （例えば、 NaC104、 KC1〇4等の過塩素酸塩、 NaSCN、 KS CN等のチォシアン酸塩等） を含む酸性下、 望ましくは pH 2 ~4程度 （より望ましくは pH2. 5〜3. 5程度） で平衡化された陽イオン交 換カラム （例えば、 リソース一 S；ァマシャムフアルマシアハ、'ィォテク製） に負荷し、 塩濃度勾 配によって溶出する。 塩濃度勾配は 10カラム容量以上かけて 0. 2〜0· 4M 程度まで塩濃度を上げることで、 電気的性質の異なる類縁体等が効果的に除去さ れた高濃度のヒトァクチビン Aを高回収、 製造可能となる。
尚、 上記の陽イオン交換クロマトグラフィーでの精製負担を軽減する為、 陽ィ オン交換クロマトグラフィ一適用前に、 好ましくは以下のように 2段階の陰ィォ ン交換クロマトグラフィーを用いて原料由来の不純物ゃリフォールディングまで に生成した不純物を概ね除去しておくことが精製効率を上げるために極めて有利 である。
低分子不純物を除去した後 （望ましくは、 ゲル濾過クロマトグラフィー法によ り、 pH9. 5〜10. 5程度の緩衝液に置換） 、 5 OmM以下の塩 （例えば、 NaC 1使用。 ） を含む pH9. 5〜： L 0. 5程度の緩衝液 （例えば、 20 mM 1, 3-ジァミノプロパン/ HC 1使用。 ） で平衡化された天然多糖をベースマト リックスとした陰イオン交換カラム （例えば、 Q—セファロ一ス FF；アマシャムフアル マシアハ' ォテク製） に 6mg/mlゲル程度負荷し、 5カラム容量程度の平衡化緩衝 液で洗浄した後、 水溶性有機溶媒 （例えば、 5〜 25%の濃度で、 エタノール、 イソプロパノール等炭素数 1〜4の低級アルコール、 ァセトニトリル、 ジメチル スルホキシド及びジメチルホルムアミ ド等の使用。 ） と 0. 1M以上の塩 （例え ば、 NaC 1使用。 ） を含む pH8. 5〜9. 5程度の緩衝液 （例えば、 20m M 1，3-ジァミノプロパン/ HC1) に置換することにより、 モノマ一や会合 凝集体を概ね除去し、 かつ lmg/ml以上に濃縮されたヒトァクチビン A画分 を得ることができる。 この画分を pH9. 5〜10. 5程度の緩衝液 （例えば、 2 OmM 1,3-ジァミノプロパン/ HC 1) に置換した後、 有機溶媒 （例えば 、 5〜25%の有機溶媒、 好ましくはメタノール、 イソプロパノール等低級アル コール、 ァセトニトリル、 ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミ ド等） と 5 OmM以下の塩 （例えば、 NaC l使用。 ） を含む ρΉ9. 5〜10. 5程 度の緩衝液 （例えば、 20mM 1， 3-ジァミノプロパン/ HC 1) で平衡化さ れた陰イオン交換カラム （例えば、 リソース一 Q；アマシャムフアルマシアハ'、ィォテク製） に 5 mg/mlゲル程度負荷する。 10カラム容量以上かけて塩濃度を 0. 1 M以上 に上げるのと同時に pHを 8. 5〜9. 5程度まで下げることにより、 陽イオン 交換クロマトグラフィ一で分離除去困難な類縁体を除去することができる。 最終精製工程として、 この画分を例えば実施例 1に従った陽イオン交換クロマ トグラフィ一精製することにより、 電気的性質が単一なヒトァクチビン Aを高濃 度状態で高回収、 製造できる。 かつ、 これらクロマトグラフィーに用いる充填剤 の粒径は大きく、 直線的にカラム容量を向上させることでスケールアツプが可能 である。
尚、 最終的に得られた画分の純度について、 逆相 HPLC (例えば、 NucleosilC 8 ； GLサイ Iンス製使用。 ) 、 陰イオン交換 HPLC (例えば、 DEAE- NPR；東リ-製使用。 ) 、 陽イオン交換 HPLC (例えば、 SP- NPR；東、ノ-製使用。 ） 、 及び SDS- PAGE等で確 認できる。
このようにして得られるような高純度のヒトァクチビンは、 前記のような医薬 製剤の形態で容易に使用することができるが、 製剤の製造については製剤の分野 で通常利用可能な製剤技術を使用して行うことができる。
好適な実施の形態
以下、 実施例により本発明を具体的に説明する。
(実施例 1 )
ヒトァクチビン A遺伝子を導入した組み換え大腸菌から得られる変性ヒトァク チビン Aを国際出願公開第 WO 97/23638号公報記載内容に従ってリフォ —ルディングした。 このリフォールデイング溶液 25 Oml (タンパク質 12m g) に H20を等量添加した後、 分子分画量 10000の膜 （フィルトロン製 「 オメガ」 ） を使用して初期容量の約 13分の 1になるまで濃縮した。 この膜濃縮 操作において、 タンパク質を 1 1. 5mg回収し （回収率 96%) 、 逆相 HPLCで 求めた画分のタンパク質純度は 68%であった。
これを 1. 8mM HC 1で平衡化されたセフアデックス G— 25M (2.60 X 20 cm；アマシャムフアルマシア; Γィォテク製) に負荷し、 A280で検出されたタンパク質を 1 1 . 3mg回収した （回収率 98%) 。 この画分 5mgを 40%ァセトニトリル、 0. 18M NaC 104、 20 mMクェン酸ナトリウム、 pH3. 0緩衝液に 平衡化されたリソース一 S (0.5 X 5 cm；アマシャムフアルマシアハ、'ィォテク製） に負荷し、
6 mlの平衡化緩衝液で洗浄した後、 流速 1. 5 m 1 /m i nで 1 1分後に 0. 24 Mになるような N a C 104濃度勾配に供した。 A280にて検出されたタンパ ク質を 3. 7mg回収した （回収率 74%；図 1 bのクロマトグラフィー参照。 尚、 溶出塩として、 NaC 104の代わりに NaC 1を用いた陽イオン交換ク ロマトグラー'ィ一を実施したところ （塩の種類と濃度以外は全て同じ） 、 NaC 104を用いた場合に比べて前方に分離されていた不純物の分離能が低下し （図 1 aのクロマトグラフィ一参照。 ） 、 それだけ回収率も低下した （回収率 51 %
(実施例 2)
実施例 1と同じ条件を使用して、 リフォ一ルディング溶液から膜濃縮画分 37 . Omgを得た。 これを、 30mM N a C 1を含む 20 mM 1 , 3 -ジアミノブ 口パン/ HC 1で平衡化されたセフアデックス G— 25M (1.6^ x 10 cm；アマシ ャムフアルマシア ィォテク製） に負荷し、 A280で検出されたタンパク質を 36. 3mg回収 した （回収率 98%) 。 この画分 36. Omgを 30mM N a C 1を含む 20 mM 1 , 3-ジァミノプロパン/ HC 1 (p H 10 ) で平衡化された Q—セファ ロース FF (1.6 φ X 3 cm；アマシャムファルマシアハ、、ィ才テク製） に負荷し、 置換した。 約 3 Omlの平衡化緩衝液で洗浄した後、 0. 3M NaC Is 12%ァセトニトリ ル、 20mM 1,3-ジァミノプロパン/ HC 1 (pH9. 0 ) 緩衝液へ置換す ることにより、 A280で検出されたタンパク質を 34. 9mg回収した （回収率 9
7 %；図 2参照。 ） 。 この回収画分について、 逆相 HPLC (NucleosilC 8 ； GLサイエンス製） 、 陰イオン交 換 HPLC (DEAE- NPR；東、ノ-製) 、 及び陽イオン交換 HPLC (SP- NPR；東、ノ-製） より得 られるタンパク質純度は各々 97%、 65%、 75%であった。 この画分 34m gを 20mM 1, 3-ジァミノプロパン/ HC 1 ( p H 10 ) で平衡化されたセ フアデックス G— 25M (1.6^ X 17 cm；アマシャムフアルマシア; ィォテク製) に負荷し、 A2 80で検出されたタンパク質 33. 3 mgを回収した （回収率 98%) 。 この画分 5mgを 10%ァセ トニトリル、 30mM NaC l、 2 OmM 1, 3-ジアミ ノプロパン/ HC 1、 H 9. 8で平衡化されたリソース一 Q (0.5 X 5cm；ァ マシャムフアルマシア ィォテク製） に負荷した。
約 6 m 1の平衡化緩衝液で洗浄した後、 流速 1. 5 m 1 /m i nで 1 1分後に 10%ァセ 卜二卜 リル、 0. 3M Na C 1, 20 mM 1, 3-ジァミノプロパ ン /HC 1、 pH9. 0緩衝液組成になるような NaC 1濃度勾配、 及び pH勾 配に供した。 この操作を 2回繰り返し、 A280で検出されたタンパク質を合計で 5 . 5mg回収した （回収率 55%；図 3参照。 ） 。
この画分について、 陰イオン交換 HPLC (DEAE- NPR；東、ノ-製） 、 及び陽イオン交 換 HPLC (SP- NPR；東、ノ-製） で求めたタンパク質純度は各々 99%、 88 %であつ た。 これを 1. 8mM HC 1で平衡化されたセフアデックス G— 25M (1.6 φ X 5 cm；アマシャムフアルマシア) ィォテク製） カラムに負荷することにより、 A280で検出さ れたタンパク質を 5. 4mg得た （回収率 98%) 。 この画分 5mgを実施例 1 に従ってリソース一 S (0.50 X 5 cm；アマシャムフアルマシアハ、、ィォテク製） に負荷し、 A280 で検出されたタンパク質を 3. 9mg回収した （回収率 78%；図 4参照。 ） 。 これを 1. 8mM HC 1で平衡化されたセフアデヅクス G— 25M
5 cm；アマシャムフアルマシアハ、、ィォテク製） に負荷し、 A280で検出されたタンパク質を 3. 9 mg回収した （回収率 99%) 。 この画分について、 逆相 HPLC (NucleosilC 8 ； GLサイ Iンス製） 、 陰イオン交換 HPLC (DEAE-NPR；東リ-製） 、 陽イオン交換 HPLC (S P-NPR;東、ノ -製） 、 及び SDS-PAGEを実施した結果を図 5〜8に示した。 逆相 HPLC (図 5参照。 ） 、 陽イオン交換 HPLC (図 6参照。 ） 、 及び陰イオン交換 HPLC (図 7参照。 ） において、 ヒトァクチビン Aのピーク以外にピークは認められず、 こ れ等分析手法において、 不純物が検出されなかったことを確認した。 又、 SDS-PA GE (図 8参照。 ） においても、 ヒトァクチビン Aを 2 . l〃g負荷したレーンに おいて （レーン 2 ) 、 ヒトァクチビン A以外のバンドは検出されなかった。 ヒト ァクチビン Aを 2 1 n g負荷したレーン 3でヒトァクチビン Aのバンドが検出さ れたことと併せて、 レーン 2に含まれる不純物は 1成分として、 0 . 1 %以下で あることを確認した。
尚、 表 1には実施例 1に記載した膜濃縮操作を含めた本実施例の結果概要、 表 2には図 5〜 8の各種 HPLC、 及び SDS- PAGE分析条件をそれぞれ示した。
従来の精製法 （特開平 2— 2 5 5 0 9 8号公報参照。 ) により得られた精製ヒ トァクチビン Aと本実施例 2で得られた精製ヒトァクチビン Aのタンパク質純度 を、 陽イオン交換 HPLCを使用して比較した （図 9参照。 ） 。 従来法 （図 9 b ) で は、 精製ヒ トァクチビン Aの他に約 2 %の不純物が残留したが、 本実施例 2 (図 9 a ) による精製ヒ トァクチビン Aには不純物は検出されず、 純度は低くとも 9 9 %と考えられ、 本精製法の有用性が示された。
【表 1】 ヒ
Figure imgf000016_0001
(*)；実施例 1に従って膜濃縮を実施した精製結果 【表 2】 各種 HPLC分析、 及び SDS- PAGE分析条件
( 1 ) 逆相 HPLC
カラム ： Nucleosil 300-5C8 (4.6 瞧 φ X 100腿 ; GLサ仃ンス製)
Α溶媒： 0. 1 3%ヘプ夕フルォロ酪酸
B溶媒： 0. 1 3%ヘプタフルォロ酪酸、 80%ァセトニトリリレ
溶出プログラム ： —時間 一 A溶媒 B溶媒 ―
0分 6 5% 35%
1 6 2 5 75
1 7 1 0 90
18 0 1 00
22 0 1 0 0
^i ： 1 m 1/m l n
負荷量：ヒトァクチビン A Ί S
検出： UV吸収 （280nm)
HPLCシステム：低圧グラジ. ント用 HPLCシステム （日立製作所製）
(2) 陽イオン交換 HPLC
カラム ： SP- NPR (4.6 腿 φ X 30 mm；東ソ-製）
A溶媒： 40%ァセトニトリル、 2 OmMクェン酸ナ卜リウム （pH 3. 0) B溶媒： 40%ァセトニトリル、 0. 1M NaC 104、 2 0 mM
クェン酸ナトリウム （pH 3. 0)
溶出プログラム ： —時間 一 A溶媒 ― B溶媒
0分 7 0% 3 0%
1 70 30
5 0 50
0 1 0 0
1 3 0 1 00
ヒトァクチビン A 7 g
流速、 検出、 HPLCシステムは上記 （ 1 ) _と同じ。
(3) ：換 HPLC
カラム DEAE-NPR (4.6 匪 φ χ 30 匪、 東リ-製）
A溶媒 1 0%ァセトニトリル、 2 OmM 1 , 3- d i ami no p r o p an e/HC l ( H 1 0 )
B溶媒 1 0%ァセトニトリル、 0. 5M NaC l、 20 mM
1， 3 - d i am l n o p r o p a n e H C 1 vp H 9 ) 溶出プログラム：一時間 ― A溶媒— B溶媒 _
0分 1 0 0% 0%
1 1 00 0
1 1 0 1 00
1 3 0 1 00
流速、 検出、 負荷量、 及び HPLCシステムは上記 （2) と同じ。
(4) SDS-PAGE
全自動電気泳動システム、 PhastSystem ( シャムフアル 7シ)7 /、ィォテク製） ュ- -ザ一マ二ユア ルに記載された SDS- PAGE法に従った （染色はジァミン銀染色法） 。 ―
上記図 8、 表 1及び 2の結果から明らかなように、 本発明の製造方法における 精製法を利用すれば高純度に精製されたヒトァクチビンを製造、 取得できること が分かる。 その純度についても、 図 8の電気泳動分析の結果からは、 1， 000 分の 1のオーダ一で不純物を含まないと考えられるので、 その純度は低くとも 9 9. 9%、 即ち 99. 9%以上の高純度と考えられる。
発明の効果
粗ヒ卜ァクチビンを、 濃度勾配溶出法による陽イオン交換クロマトグラフィー を含有する精製工程に付する本発明の製造方法により、 従来法では得られなかつ たような高純度のヒトァクチビンを工業的に製造することができるので、 医薬用 途への使用が期待できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 粗ヒトァクチビンを、 濃度勾配溶出法による陽イオン交換クロマトグラ フィ一を含有する精製工程に付することを特徴とする純度が改善したヒトァクチ ビンの製造方法。
2 . 当該濃度勾配溶出法がカオトロピックィオンの濃度勾配溶出法である請 求項 1記載の製造方法。
3 . 当該クロマトグラフィ一が水溶性有機溶媒の存在下及び/又は酸性下に 実施される陽イオン交換クロマトグラフィ一である請求項 1記載の製造方法。
4 . 有機溶媒が低級アルコール、 ァセトニトリル、 ジメチルスルホキシド及 びジメチルホルムアミ ドの少なくとも 1種を含み、 その濃度が低くとも 2 0容量 %である請求項 3記載の製造方法。
5 . 粗ヒトァクチビンが、 電気的に異なるその類縁体、 宿主由来タンパク質 、 宿主及び/又は培地由来の抗原性物質、 発熱物質等、 リフォールデイングに際 してリフォールディングしなかつた会合凝集体、 遺伝子翻訳ミスや翻訳後修飾不 適切に基づく類縁体、 及び精製工程で生じるヒトァクチビン分解物、 修飾物等の 少なくとも 1種を含む請求項 1記載の製造方法。
6 . 請求項 1〜 5何れか記載の製造方法により得られえ、 又は得られた純度 が改善したヒ
7 . 当該純度が低くとも 9 9 %である請求項 6記載のヒ
8 . 医薬製剤の形態にある請求項 6又は 7記載のヒ
9 . ヒトァクチビン Aである請求項 6〜8記載のヒトァクチビン (
PCT/JP1999/002680 1998-05-25 1999-05-20 Activine humaine purifiee et son procede de production WO1999061474A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE69905462T DE69905462T2 (de) 1998-05-25 1999-05-20 Gereinigtes menschliches activin, und verfahren für seine herstellung
EP99921221A EP1081159B1 (en) 1998-05-25 1999-05-20 Purified human activin and process for producing the same
US09/721,750 US6756482B1 (en) 1998-05-25 2000-11-27 Purified human activin and process for producing the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10/159943 1998-05-25
JP15994398A JP4055248B2 (ja) 1998-05-25 1998-05-25 精製ヒトアクチビン及びその製造方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09/721,750 Continuation US6756482B1 (en) 1998-05-25 2000-11-27 Purified human activin and process for producing the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1999061474A1 true WO1999061474A1 (fr) 1999-12-02

Family

ID=15704554

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1999/002680 WO1999061474A1 (fr) 1998-05-25 1999-05-20 Activine humaine purifiee et son procede de production

Country Status (5)

Country Link
US (1) US6756482B1 (ja)
EP (1) EP1081159B1 (ja)
JP (1) JP4055248B2 (ja)
DE (1) DE69905462T2 (ja)
WO (1) WO1999061474A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009136568A1 (ja) * 2008-05-08 2009-11-12 味の素株式会社 タンパク質のリフォールディング方法
US8987203B2 (en) 2006-11-17 2015-03-24 Arcarios B.V. Methods for controlling mineralization of extracellular matrix, therapeutic methods based thereon and medicaments for use therein

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4827664B2 (ja) * 2006-09-04 2011-11-30 東ソー株式会社 イオン交換クロマトグラフィーによる高比重リポ蛋白（ｈｄｌ）および低比重リポ蛋白（ｌｄｌ）の亜分画の測定方法
US8129139B2 (en) 2009-07-13 2012-03-06 Allergan, Inc. Process for obtaining botulinum neurotoxin

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01230522A (ja) * 1988-01-07 1989-09-14 Otsuka Pharmaceut Co Ltd トランスフォーミンググロウスファクター―βの精製方法
JPH06145197A (ja) * 1992-11-06 1994-05-24 Morinaga & Co Ltd ヒトＴＧＦ−βの精製法
JPH06511233A (ja) * 1991-05-03 1994-12-15 セルトリックス　ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 骨の形成を促進するための骨成長因子および骨吸収阻害剤
WO1997023638A1 (fr) * 1995-12-21 1997-07-03 Ajinomoto Co., Inc. Procede pour replier l'activine a humaine

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0169016B2 (en) * 1984-07-16 2004-04-28 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Polypeptide cartilage-inducing factors found in bone
US5047510A (en) * 1988-01-07 1991-09-10 Ostuka Pharmaceutical Co. Ltd. Method of purification of transforming growth factor-beta
US5208219A (en) * 1991-02-14 1993-05-04 Celtrix Pharmaceuticals Inc. Method for inducing bone growth
JP2002507186A (ja) 1991-05-09 2002-03-05 テンプル ユニバーシティ−オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション ｃ−ｋｉｔプロト−オンコ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用
EP0868518A1 (en) 1995-12-22 1998-10-07 The University Of British Columbia Staphylococcus aureus coenzyme a disulfide reductase, and inhibitors thereof useful as antimicrobial agents

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01230522A (ja) * 1988-01-07 1989-09-14 Otsuka Pharmaceut Co Ltd トランスフォーミンググロウスファクター―βの精製方法
JPH06511233A (ja) * 1991-05-03 1994-12-15 セルトリックス　ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 骨の形成を促進するための骨成長因子および骨吸収阻害剤
JPH06145197A (ja) * 1992-11-06 1994-05-24 Morinaga & Co Ltd ヒトＴＧＦ−βの精製法
WO1997023638A1 (fr) * 1995-12-21 1997-07-03 Ajinomoto Co., Inc. Procede pour replier l'activine a humaine

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1081159A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8987203B2 (en) 2006-11-17 2015-03-24 Arcarios B.V. Methods for controlling mineralization of extracellular matrix, therapeutic methods based thereon and medicaments for use therein
WO2009136568A1 (ja) * 2008-05-08 2009-11-12 味の素株式会社 タンパク質のリフォールディング方法
JP5168604B2 (ja) * 2008-05-08 2013-03-21 味の素株式会社 タンパク質のリフォールディング方法
US8975383B2 (en) 2008-05-08 2015-03-10 Ajinomoto Co., Inc. Protein refolding method

Also Published As

Publication number Publication date
JP4055248B2 (ja) 2008-03-05
DE69905462T2 (de) 2004-01-15
US6756482B1 (en) 2004-06-29
JPH11335395A (ja) 1999-12-07
EP1081159A4 (en) 2001-10-31
EP1081159A1 (en) 2001-03-07
DE69905462D1 (de) 2003-03-27
EP1081159B1 (en) 2003-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2019038817A (ja) 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト
JP2008115176A (ja) タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法
Darrington et al. Evidence for a common intermediate in insulin deamidation and covalent dimer formation: effects of pH and aniline trapping in dilute acidic solutions
WO1993000443A1 (en) Purification of recombinant apolipoprotein e from bacteria
CN102448979A (zh) 纯化重组促卵泡激素的方法
EP0228452B1 (en) Protein purification
PL209954B1 (pl) Sposób oczyszczania białek interferonu i jego zastosowanie
JP3110078B2 (ja) 高純度抗菌性ペプチドの大量製造法
PL207775B1 (pl) Sposób izolowania biologicznie czynnego poprawnie zwiniętego czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF)
ES2373035T3 (es) Método para eliminar polímeros de seroalbúmina humana.
US20220009958A1 (en) Methods of purification of albumin fusion proteins
WO1999061474A1 (fr) Activine humaine purifiee et son procede de production
CN102309764A (zh) 有机溶剂辅助peg修饰蛋白质药物的方法
WO2021053578A1 (en) Improved purification processes for liraglutide
JPH08510762A (ja) 塩基性線維芽細胞成長因子の精製プロセス
JP3130313B2 (ja) ヒトｂＦＧＦムテインの製造法
JP3200850B2 (ja) ヒトｂｃｄｆの精製法
Romanov et al. Isolation of human interferon β1b (Ser17) expressed in E. coli with the use of ion-exchange chromatography
EP2220108A2 (en) Protein purification and endotoxin removal
ES2341270T3 (es) Complejos rhigf-i/rhigfbp-3 purificados y procedimientos de fabricacion de los mismos.
WO2019077432A1 (en) IMPROVED PURIFICATION METHOD OF RECOMBINANT PTH (1-34)
JPH03175994A (ja) 治療上活性のある組換え体酸性繊維芽細胞成長因子の精製方法
JP6647220B2 (ja) Ｈｍｇ−ｕｐ（超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン）を得るための方法及び夾雑物を含まない組成物
JPH04299990A (ja) モチリンアナログの精製方法
KR100400638B1 (ko) 재조합 인간 성장호르몬 유사체의 분리방법

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1999921221

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09721750

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1999921221

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1999921221

Country of ref document: EP