JPH06145197A - ヒトＴＧＦ−βの精製法 - Google Patents
ヒトＴＧＦ−βの精製法Info
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- JPH06145197A JPH06145197A JP4322471A JP32247192A JPH06145197A JP H06145197 A JPH06145197 A JP H06145197A JP 4322471 A JP4322471 A JP 4322471A JP 32247192 A JP32247192 A JP 32247192A JP H06145197 A JPH06145197 A JP H06145197A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 種々の生物学的流体から高純度のヒトＴＧＦ
−βを再現性よく、高収率で精製する方法を提供する。 【構成】 生物学的流体、すなわちＴＧＦ−βを高濃度
に含有する細胞及び組織抽出物を、ｐＨ１〜３に調製し
てＴＧＦ−βを活性型へ変換させ、好ましくはゲル濾過
クロマトグラフィーにより分別した後、クロマトグラフ
ィー用担体に、ＳＯ3 -基を導入したアクリルアミドオリ
ゴマーを結合させたカチオン交換クロマトグラフィー、
好ましくは「Fractogel EMD-SO3 --650」（商品名、ＭＥ
ＲＣＫ社製）に負荷して回収し、更に必要に応じて逆相
クロマトグラフィーにより分別して、精製されたＴＧＦ
−βを得る。
−βを再現性よく、高収率で精製する方法を提供する。 【構成】 生物学的流体、すなわちＴＧＦ−βを高濃度
に含有する細胞及び組織抽出物を、ｐＨ１〜３に調製し
てＴＧＦ−βを活性型へ変換させ、好ましくはゲル濾過
クロマトグラフィーにより分別した後、クロマトグラフ
ィー用担体に、ＳＯ3 -基を導入したアクリルアミドオリ
ゴマーを結合させたカチオン交換クロマトグラフィー、
好ましくは「Fractogel EMD-SO3 --650」（商品名、ＭＥ
ＲＣＫ社製）に負荷して回収し、更に必要に応じて逆相
クロマトグラフィーにより分別して、精製されたＴＧＦ
−βを得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、種々の生物学的流体か
ら高純度のヒトＴＧＦ−βを再現性よく、高収率で精製
する方法に関する。
ら高純度のヒトＴＧＦ−βを再現性よく、高収率で精製
する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＴＧＦ−β（Transforming growth fact
or−βの略）は、本来は、軟寒天中で増殖しないマウス
由来の繊維芽細胞である３Ｔ３細胞を癌細胞が増殖する
のと同様に軟寒天中で増殖させる因子として単離され
た、分子量２５ｋＤａの２量体構造をもつ蛋白質である
が、その後、上記の活性よりも各種細胞の増殖阻害因子
として、また、骨形成や分化の制御に重要な役割を果た
していると考えられるようになってきている。ＴＧＦ−
βは、生体中ではＬＡＰ(Latency-associated peputid
e) とＬＴＢＰ(Latent TGF-β binding protein) に結
合した潜在型として産生され、活性型として初めて作用
を発揮する。
or−βの略）は、本来は、軟寒天中で増殖しないマウス
由来の繊維芽細胞である３Ｔ３細胞を癌細胞が増殖する
のと同様に軟寒天中で増殖させる因子として単離され
た、分子量２５ｋＤａの２量体構造をもつ蛋白質である
が、その後、上記の活性よりも各種細胞の増殖阻害因子
として、また、骨形成や分化の制御に重要な役割を果た
していると考えられるようになってきている。ＴＧＦ−
βは、生体中ではＬＡＰ(Latency-associated peputid
e) とＬＴＢＰ(Latent TGF-β binding protein) に結
合した潜在型として産生され、活性型として初めて作用
を発揮する。
【０００３】ＴＧＦ−βの主な作用としては、細胞の増
殖促進活性、増殖抑制活性、分化の調節や細胞外基質の
蓄積、免疫能の抑制、単球の遊走促進等が挙げられ(Pic
her.R., Lawrence.D.A. & Jullien.P. :Cancer Res., 4
4: 5538-5543, 1984, Roberts.A.B., Sporn.M.B. :Hand
book of Experimental Pharmacology, 95: Part I, pp.
419-472, Springer-Verlag, Heidelbberg, 1990 参照)
、各種の医薬品、試験薬などへの利用が期待されてい
る。
殖促進活性、増殖抑制活性、分化の調節や細胞外基質の
蓄積、免疫能の抑制、単球の遊走促進等が挙げられ(Pic
her.R., Lawrence.D.A. & Jullien.P. :Cancer Res., 4
4: 5538-5543, 1984, Roberts.A.B., Sporn.M.B. :Hand
book of Experimental Pharmacology, 95: Part I, pp.
419-472, Springer-Verlag, Heidelbberg, 1990 参照)
、各種の医薬品、試験薬などへの利用が期待されてい
る。
【０００４】ＴＧＦ−βの精製法については、これまで
にも多くの報告がなされている(Richard.K.A., Akira.
K., Chester.A.M., Dorothea.M.M. & Michael.B.S. :J
Biol.Chem., 258: 7155-7160, 1983, James.L.C. et a
l, Anal. Biochem. 168, 71-74, 1988 等参照）。この
うち、Richard K.A.らの方法によれば、ＴＧＦ−βを高
濃度に含有する血小板抽出液を酸性エタノール処理し、
その上清に更にエーテルを加えてＴＧＦ−βを沈殿さ
せ、この沈殿からＴＧＦ−βを酢酸で溶出し、これを酢
酸酸性でバイオゲルＰ−６０を用いたゲル濾過に供して
部分精製した後、更に８Ｍ尿素を含んだｐＨ２の酸性条
件下でゲル濾過を繰り返すことにより精製していた。あ
るいは、最初のゲル濾過の後、逆相クロマトグラフィー
に供してＴＧＦ−βを精製していた。
にも多くの報告がなされている(Richard.K.A., Akira.
K., Chester.A.M., Dorothea.M.M. & Michael.B.S. :J
Biol.Chem., 258: 7155-7160, 1983, James.L.C. et a
l, Anal. Biochem. 168, 71-74, 1988 等参照）。この
うち、Richard K.A.らの方法によれば、ＴＧＦ−βを高
濃度に含有する血小板抽出液を酸性エタノール処理し、
その上清に更にエーテルを加えてＴＧＦ−βを沈殿さ
せ、この沈殿からＴＧＦ−βを酢酸で溶出し、これを酢
酸酸性でバイオゲルＰ−６０を用いたゲル濾過に供して
部分精製した後、更に８Ｍ尿素を含んだｐＨ２の酸性条
件下でゲル濾過を繰り返すことにより精製していた。あ
るいは、最初のゲル濾過の後、逆相クロマトグラフィー
に供してＴＧＦ−βを精製していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記Ri
chard K.A.らの方法では、各精製段階で精製度合いの進
んだ画分だけを集めて精製を進めなければ高度に精製さ
れたＴＧＦ−βが得られず、再現性、収率共に改善され
るべき点があった。また、James.L.C.らの方法において
も、その中のTSK-SP-5PWを用いた工程の再現性が無く、
同様の精製ができないという欠点があった。
chard K.A.らの方法では、各精製段階で精製度合いの進
んだ画分だけを集めて精製を進めなければ高度に精製さ
れたＴＧＦ−βが得られず、再現性、収率共に改善され
るべき点があった。また、James.L.C.らの方法において
も、その中のTSK-SP-5PWを用いた工程の再現性が無く、
同様の精製ができないという欠点があった。
【０００６】したがって、本発明の目的は、種々の生物
学的流体から高純度のヒトＴＧＦ−βを再現性よく、高
収率で精製する方法を提供することにある。
学的流体から高純度のヒトＴＧＦ−βを再現性よく、高
収率で精製する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明による生物学的流体からのヒトＴＧＦ−βの
精製法は、ＴＧＦ−βを活性型へ変換させるために前記
生物学的流体をｐＨ１〜３に調整する工程と、活性化さ
れたＴＧＦ−βを、クロマトグラフィー用担体にＳＯ3 -
基を導入したアクリルアミドオリゴマーを結合させたカ
チオン交換樹脂に負荷して回収する工程とを含むことを
特徴とする。
め、本発明による生物学的流体からのヒトＴＧＦ−βの
精製法は、ＴＧＦ−βを活性型へ変換させるために前記
生物学的流体をｐＨ１〜３に調整する工程と、活性化さ
れたＴＧＦ−βを、クロマトグラフィー用担体にＳＯ3 -
基を導入したアクリルアミドオリゴマーを結合させたカ
チオン交換樹脂に負荷して回収する工程とを含むことを
特徴とする。
【０００８】以下、本発明の好ましい態様を挙げて更に
詳細に説明する。本発明において、生物学的流体とは、
ＴＧＦ−βを高濃度に含有する細胞及び組織抽出物を意
味し、例えば血液、及び血小板等の血液画分や、脾臓、
肝臓、腎臓、胎盤、骨等の細胞の溶解物又は抽出物が挙
げられる。このような細胞及び組織抽出物は、人体の組
織から公知の種々の方法によって調製することができる
とともに、ＴＧＦ−βを生産するために形質転換された
酵母細胞、動物細胞等の培養上清からも調製することが
できる。なお、上記細胞としては、クローン化されたＤ
ＮＡ配列を発現することができるいずれのタイプの細胞
でも使用できる。
詳細に説明する。本発明において、生物学的流体とは、
ＴＧＦ−βを高濃度に含有する細胞及び組織抽出物を意
味し、例えば血液、及び血小板等の血液画分や、脾臓、
肝臓、腎臓、胎盤、骨等の細胞の溶解物又は抽出物が挙
げられる。このような細胞及び組織抽出物は、人体の組
織から公知の種々の方法によって調製することができる
とともに、ＴＧＦ−βを生産するために形質転換された
酵母細胞、動物細胞等の培養上清からも調製することが
できる。なお、上記細胞としては、クローン化されたＤ
ＮＡ配列を発現することができるいずれのタイプの細胞
でも使用できる。
【０００９】本発明の方法では、まず、上記のような生
物学的流体を、酢酸や塩酸等の酸を用いてｐＨ１〜３に
調製し、数時間以上、好ましくは１晩処理することによ
り、ＴＧＦ−βを活性型へ変換させる。
物学的流体を、酢酸や塩酸等の酸を用いてｐＨ１〜３に
調製し、数時間以上、好ましくは１晩処理することによ
り、ＴＧＦ−βを活性型へ変換させる。
【００１０】酸処理を施した生物学的流体は、高分子量
と低分子量の夾雑物、特に低分子量の夾雑物を除くた
め、酸性条件下で、好ましくは０．１Ｍ酢酸条件下で、
ゲル濾過クロマトグラフィーに供することが好ましい。
このクロマトグラフィー担体としては、例えば架橋され
たデキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド及び
親水性コーティング又は結合された相を有する特殊シリ
カなどが好ましい。特に好ましいのは、「Sephadex G-5
0 」（商品名、Pharmacia 社製）である。
と低分子量の夾雑物、特に低分子量の夾雑物を除くた
め、酸性条件下で、好ましくは０．１Ｍ酢酸条件下で、
ゲル濾過クロマトグラフィーに供することが好ましい。
このクロマトグラフィー担体としては、例えば架橋され
たデキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド及び
親水性コーティング又は結合された相を有する特殊シリ
カなどが好ましい。特に好ましいのは、「Sephadex G-5
0 」（商品名、Pharmacia 社製）である。
【００１１】上記ゲル濾過クロマトグラフィーにより分
取されたＴＧＦ−β含有画分は、酸性条件下で、好まし
くは０．１Ｍ酢酸条件下で、クロマトグラフィー用担体
に、ＳＯ3 -基を導入したアクリルアミドオリゴマーを結
合させたカチオン交換樹脂に供する。溶出は、弱アルカ
リ性のｐＨ条件下で塩濃度の上昇により行う。好ましく
は、５０ｍＭアンモニア存在下における０〜５００ｍＭ
の塩化ナトリウムの塩濃度勾配により行う。
取されたＴＧＦ−β含有画分は、酸性条件下で、好まし
くは０．１Ｍ酢酸条件下で、クロマトグラフィー用担体
に、ＳＯ3 -基を導入したアクリルアミドオリゴマーを結
合させたカチオン交換樹脂に供する。溶出は、弱アルカ
リ性のｐＨ条件下で塩濃度の上昇により行う。好ましく
は、５０ｍＭアンモニア存在下における０〜５００ｍＭ
の塩化ナトリウムの塩濃度勾配により行う。
【００１２】上記カチオン交換樹脂としては、「Fracto
gel EMD-SO3 --650」（商品名、ＭＥＲＣＫ社製）が好ま
しく使用される。このカチオン交換樹脂は、他のカチオ
ン交換樹脂、すなわち、架橋されたデキストラン、アガ
ロース、セルロース、合成樹脂及び親水性コーティング
又は結合された相を有する特殊シリカ等をベースとし、
カルボキシメチル(Carboxymethyl) 、硫化プロピル(Sul
phopropyl)、メチル硫酸(Methylsulphonate)で修飾され
たものなどに比べて、非常にＴＧＦ−βの吸着量が大き
く、かつ強力である。このカチオン交換樹脂は、他のカ
チオン交換クロマトグラフィーではとても保持できない
量のＴＧＦ−βを含有する生物学的流体を負荷しても、
十分に保持することができ、また、酸性条件下では塩濃
度を上げても溶出されない。この特徴を利用してＴＧＦ
−βを精製することが本発明の最大の特徴である。
gel EMD-SO3 --650」（商品名、ＭＥＲＣＫ社製）が好ま
しく使用される。このカチオン交換樹脂は、他のカチオ
ン交換樹脂、すなわち、架橋されたデキストラン、アガ
ロース、セルロース、合成樹脂及び親水性コーティング
又は結合された相を有する特殊シリカ等をベースとし、
カルボキシメチル(Carboxymethyl) 、硫化プロピル(Sul
phopropyl)、メチル硫酸(Methylsulphonate)で修飾され
たものなどに比べて、非常にＴＧＦ−βの吸着量が大き
く、かつ強力である。このカチオン交換樹脂は、他のカ
チオン交換クロマトグラフィーではとても保持できない
量のＴＧＦ−βを含有する生物学的流体を負荷しても、
十分に保持することができ、また、酸性条件下では塩濃
度を上げても溶出されない。この特徴を利用してＴＧＦ
−βを精製することが本発明の最大の特徴である。
【００１３】しかし、上記カチオン交換樹脂による分画
だけでは、ＴＧＦ−βを純粋にすることは困難なので、
更に酸性条件下で、好ましくは０．１〜０．２％トリフ
ルオロ酢酸の条件下で、逆相クロマトグラフィーに供す
ることが好ましい。この場合の溶出は、０．１％トリフ
ルオロ酢酸条件下でアセトニトリルの濃度を０〜６０％
に変化させることで行うことが好ましい。また、適切な
クロマトグラフィー担体としては、親水性コーティング
又は結合された相を有する特殊シリカ又は親水性ポリマ
ーゲルにオクタデシルシリル基、フェニル基等を導入し
たものが挙げられる。特に好ましいのは、「Vydac C
-18」（商品名、セパレーショングループ社製）であ
る。
だけでは、ＴＧＦ−βを純粋にすることは困難なので、
更に酸性条件下で、好ましくは０．１〜０．２％トリフ
ルオロ酢酸の条件下で、逆相クロマトグラフィーに供す
ることが好ましい。この場合の溶出は、０．１％トリフ
ルオロ酢酸条件下でアセトニトリルの濃度を０〜６０％
に変化させることで行うことが好ましい。また、適切な
クロマトグラフィー担体としては、親水性コーティング
又は結合された相を有する特殊シリカ又は親水性ポリマ
ーゲルにオクタデシルシリル基、フェニル基等を導入し
たものが挙げられる。特に好ましいのは、「Vydac C
-18」（商品名、セパレーショングループ社製）であ
る。
【００１４】なお、本発明は、前述したように、特定の
構造を有するカチオン交換樹脂の特徴を利用してＴＧＦ
−βを精製することを最大の特徴とし、ゲル濾過クロマ
トグラフィーによる分画や、逆相クロマトグラフィーに
よる分画は、必ずしも必要なものではない。
構造を有するカチオン交換樹脂の特徴を利用してＴＧＦ
−βを精製することを最大の特徴とし、ゲル濾過クロマ
トグラフィーによる分画や、逆相クロマトグラフィーに
よる分画は、必ずしも必要なものではない。
【００１５】
【作用】前述したように、クロマトグラフィー用担体に
ＳＯ3 -基を導入したアクリルアミドオリゴマーを結合さ
せたカチオン交換樹脂、例えば「Fractogel EMD-SO3 --6
50」は、他のカチオン交換樹脂ではとても保持できない
量のＴＧＦ−βを負荷しても（含まれているＴＧＦ−β
が素通りする程の量を負荷してもという意味）、ＴＧＦ
−βを保持することができ、しかも酸性条件下では塩濃
度を上げても溶出されない。これは、上記カチオン交換
樹脂には、純粋な意味でのイオン交換作用だけでなく、
ＴＧＦ−βに対する理由不明の親和性があるためと推測
される。このため、生物学的流体を上記カチオン交換樹
脂に負荷して回収することにより、ＴＧＦ−β以外の夾
雑物を効果的に除去して、ＴＧＦ−βを効率よく精製す
ることができる。
ＳＯ3 -基を導入したアクリルアミドオリゴマーを結合さ
せたカチオン交換樹脂、例えば「Fractogel EMD-SO3 --6
50」は、他のカチオン交換樹脂ではとても保持できない
量のＴＧＦ−βを負荷しても（含まれているＴＧＦ−β
が素通りする程の量を負荷してもという意味）、ＴＧＦ
−βを保持することができ、しかも酸性条件下では塩濃
度を上げても溶出されない。これは、上記カチオン交換
樹脂には、純粋な意味でのイオン交換作用だけでなく、
ＴＧＦ−βに対する理由不明の親和性があるためと推測
される。このため、生物学的流体を上記カチオン交換樹
脂に負荷して回収することにより、ＴＧＦ−β以外の夾
雑物を効果的に除去して、ＴＧＦ−βを効率よく精製す
ることができる。
【００１６】上記カチオン交換樹脂による分画工程に先
立って、生物学的流体をゲル濾過クロマトグラフィーに
より分別することにより、高分子量と低分子量の夾雑
物、特に低分子量の夾雑物を除くことができ、より高純
度にＴＧＦ−βを精製することができる。
立って、生物学的流体をゲル濾過クロマトグラフィーに
より分別することにより、高分子量と低分子量の夾雑
物、特に低分子量の夾雑物を除くことができ、より高純
度にＴＧＦ−βを精製することができる。
【００１７】また、上記カチオン交換樹脂による分画工
程の後、得られた画分を更に逆相クロマトグラフィーに
より分別することにより、ほぼ純粋なＴＧＦ−βを得る
ことができる。
程の後、得られた画分を更に逆相クロマトグラフィーに
より分別することにより、ほぼ純粋なＴＧＦ−βを得る
ことができる。
【００１８】
【実施例】以下、本発明の実施例を挙げて説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】実施例１ (1) 酸性メタノールを用いた抽出及びＴＧＦ−βの活性
化 −８０℃に保存していたヒト血小板１８０Ｕ（１Ｕは４
００ｍｌの血液から得られる血小板量）を、終濃度１２
０ｍＭ塩酸、０．６６ｍＭフッ化フェニルメチルスルホ
ニル、８０％メタノール中で一晩攪拌した。
化 −８０℃に保存していたヒト血小板１８０Ｕ（１Ｕは４
００ｍｌの血液から得られる血小板量）を、終濃度１２
０ｍＭ塩酸、０．６６ｍＭフッ化フェニルメチルスルホ
ニル、８０％メタノール中で一晩攪拌した。
【００２０】上記の酸性メタノールで処理した血小板
を、Ｂｅｃｋｍａｎ社製の遠心分離機（商品名 Beckma
n model J2-21 ）で、ＪＡ−１０型ロータを用い、10,0
00回転で３０分間遠心分離をして、上清を得た。得られ
た上清のｐＨを２８％アンモニアを用いて約３にあわ
せ、ロータリーエバポレータを用いて抽出前の容量にま
で濃縮した。
を、Ｂｅｃｋｍａｎ社製の遠心分離機（商品名 Beckma
n model J2-21 ）で、ＪＡ−１０型ロータを用い、10,0
00回転で３０分間遠心分離をして、上清を得た。得られ
た上清のｐＨを２８％アンモニアを用いて約３にあわ
せ、ロータリーエバポレータを用いて抽出前の容量にま
で濃縮した。
【００２１】(2) ゲル濾過クロマトグラフィー 予め０．１Ｍ酢酸で平衡化しておいた「Sephadex G-50
」（商品名、９×８０cm、Pharmacia 社製）に、上記
抽出液を２ml/minの流速で負荷し、０．１Ｍ酢酸を用い
て溶出した。溶出液を30mlずつのフラクションに分けて
採取し、これらのフラクションについてＯ．Ｄ．280 に
よる蛋白量と、生物学的活性測定法によるＴＧＦ−β活
性の測定を行った。この結果を図１に示す。また、上記
に加えてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、
ＴＧＦ−βの溶出が確認されたフラクションをプールし
た。
」（商品名、９×８０cm、Pharmacia 社製）に、上記
抽出液を２ml/minの流速で負荷し、０．１Ｍ酢酸を用い
て溶出した。溶出液を30mlずつのフラクションに分けて
採取し、これらのフラクションについてＯ．Ｄ．280 に
よる蛋白量と、生物学的活性測定法によるＴＧＦ−β活
性の測定を行った。この結果を図１に示す。また、上記
に加えてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、
ＴＧＦ−βの溶出が確認されたフラクションをプールし
た。
【００２２】(3) カチオン交換クロマトグラフィー 予め０．１Ｍ酢酸で平衡化しておいた「Fractogel EMD-
SO3 --650」（商品名、０．５×１０cm、１ml、ＭＥＲＣ
Ｋ社製）に、上記ゲル濾過クロマトグラフィーでプール
された画分を１ml/min. の流速で負荷した。そして、
０．１Ｍ酢酸と、２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢
酸と、５０ｍＭアンモニアとで順次洗浄した後、０．５
ml/min. の流速で、５０ｍＭアンモニア存在下０〜５０
０ｍＭ塩化ナトリウムの直線濃度勾配（１００分）によ
り溶出した。
SO3 --650」（商品名、０．５×１０cm、１ml、ＭＥＲＣ
Ｋ社製）に、上記ゲル濾過クロマトグラフィーでプール
された画分を１ml/min. の流速で負荷した。そして、
０．１Ｍ酢酸と、２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢
酸と、５０ｍＭアンモニアとで順次洗浄した後、０．５
ml/min. の流速で、５０ｍＭアンモニア存在下０〜５０
０ｍＭ塩化ナトリウムの直線濃度勾配（１００分）によ
り溶出した。
【００２３】この溶出液のフラクションについてＯ．
Ｄ．280 による蛋白量と、生物学的活性測定法によるＴ
ＧＦ−β活性の測定を行った。この結果を図２に示す。
また、上記に加えてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動を行ってＴＧＦ−βを含むフラクションを確認し、プ
ールした。
Ｄ．280 による蛋白量と、生物学的活性測定法によるＴ
ＧＦ−β活性の測定を行った。この結果を図２に示す。
また、上記に加えてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動を行ってＴＧＦ−βを含むフラクションを確認し、プ
ールした。
【００２４】(4) 逆相クロマトグラフィー 予め０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化しておいた「Vy
dac C18 」（商品名、０．４６×２８cm、４．０ml、セ
パレーショングループ社製）に、上記カチオン交換クロ
マトグラフィーによりプールした画分を１ml/min. の流
速で負荷した。そして、０．１％トリフルオロ酢酸存在
下０〜６０％アセトニトリルの直線濃度勾配（１２０
分）により溶出した。
dac C18 」（商品名、０．４６×２８cm、４．０ml、セ
パレーショングループ社製）に、上記カチオン交換クロ
マトグラフィーによりプールした画分を１ml/min. の流
速で負荷した。そして、０．１％トリフルオロ酢酸存在
下０〜６０％アセトニトリルの直線濃度勾配（１２０
分）により溶出した。
【００２５】この溶出液のフラクションについてＯ．
Ｄ．280 による蛋白量と、生物学的活性測定法によるＴ
ＧＦ−β活性の測定を行った。この結果を図３に示す。
また、上記に加えてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動を行い、ＴＧＦ−βを含むフラクションを確認してプ
ールした。
Ｄ．280 による蛋白量と、生物学的活性測定法によるＴ
ＧＦ−β活性の測定を行った。この結果を図３に示す。
また、上記に加えてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動を行い、ＴＧＦ−βを含むフラクションを確認してプ
ールした。
【００２６】以上の操作により、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動上単一なＴＧＦ−βを得ることができ
た。なお、上記において、生物学的活性測定法は、Mv1L
u 細胞成長阻害活性法（池田ら、Biochemistry 26. 240
6-2410, 1987) によって行い、収量及び収率は、活性と
容量の積により計算した。以上の操作を２回繰り返して
行い、ＴＧＦ−βの収量と収率を測定した結果を表１に
示す。
アミド電気泳動上単一なＴＧＦ−βを得ることができ
た。なお、上記において、生物学的活性測定法は、Mv1L
u 細胞成長阻害活性法（池田ら、Biochemistry 26. 240
6-2410, 1987) によって行い、収量及び収率は、活性と
容量の積により計算した。以上の操作を２回繰り返して
行い、ＴＧＦ−βの収量と収率を測定した結果を表１に
示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】なお、上記表１中、収率が１００％を超え
ているのは、原料の血小板抽出液中にＴＧＦ−βの生物
学的活性を阻害する物質が含まれているためで、上記収
率が物質としての収支を表すものではなく、活性に基づ
いて計算されたものであるためである。
ているのは、原料の血小板抽出液中にＴＧＦ−βの生物
学的活性を阻害する物質が含まれているためで、上記収
率が物質としての収支を表すものではなく、活性に基づ
いて計算されたものであるためである。
【００２９】実施例２ ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣由来の細
胞）に、ＴＧＦ−βの遺伝子を組み込んで形質転換させ
た細胞（Gentry.L.E., Lioubin.M.N., Durchio.a.f., M
arquard.H. :Mol. Cell. Biol., 8, 4162〜4168(1988)
参照) を、牛胎児血清を含む血清で培養し、その後、血
清を含まない培地で維持することにより、ＴＧＦ−βを
分泌させた培養液を得た。
胞）に、ＴＧＦ−βの遺伝子を組み込んで形質転換させ
た細胞（Gentry.L.E., Lioubin.M.N., Durchio.a.f., M
arquard.H. :Mol. Cell. Biol., 8, 4162〜4168(1988)
参照) を、牛胎児血清を含む血清で培養し、その後、血
清を含まない培地で維持することにより、ＴＧＦ−βを
分泌させた培養液を得た。
【００３０】この培養液上清６００mlに、終濃度０．１
Ｍになるように酢酸を加えて一晩攪拌した。こうして酸
処理した培養液上清をＢｅｃｋｍａｎ社製の遠心分離機
（商品名 Beckman model J2-21 ）で、ＪＡ−１０型ロ
ータを用い、10,000回転で３０分間遠心分離をして、上
清を得た。
Ｍになるように酢酸を加えて一晩攪拌した。こうして酸
処理した培養液上清をＢｅｃｋｍａｎ社製の遠心分離機
（商品名 Beckman model J2-21 ）で、ＪＡ−１０型ロ
ータを用い、10,000回転で３０分間遠心分離をして、上
清を得た。
【００３１】この上清について、上記実施例１の(2) 以
降の工程を行うことにより、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動上単一なＴＧＦ−βを得ることができた。
降の工程を行うことにより、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動上単一なＴＧＦ−βを得ることができた。
【００３２】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
ＴＧＦ−βを含む生物学的流体を、クロマトグラフィー
用担体にＳＯ3 -基を導入したアクリルアミドオリゴマー
を結合させたカチオン交換樹脂に負荷して回収すること
により、種々の生物学的流体から高純度のヒトＴＧＦ−
βを再現性よく、高収率で精製することができる。
ＴＧＦ−βを含む生物学的流体を、クロマトグラフィー
用担体にＳＯ3 -基を導入したアクリルアミドオリゴマー
を結合させたカチオン交換樹脂に負荷して回収すること
により、種々の生物学的流体から高純度のヒトＴＧＦ−
βを再現性よく、高収率で精製することができる。
【図１】血小板抽出液をゲル濾過クロマトグラフィー
「Sephadex G-50 」にかけ、溶出したフラクションにつ
いてＯ．Ｄ．280 による蛋白量と、生物学的活性測定法
によるＴＧＦ−β活性の測定を行った結果を示す図表で
ある。
「Sephadex G-50 」にかけ、溶出したフラクションにつ
いてＯ．Ｄ．280 による蛋白量と、生物学的活性測定法
によるＴＧＦ−β活性の測定を行った結果を示す図表で
ある。
【図２】ゲル濾過クロマトグラフィーでプールされた活
性画分をカチオン交換クロマトグラフィー「Fractogel
EMD-SO3 --650」にかけ、溶出したフラクションについて
Ｏ．Ｄ．280 による蛋白量と、生物学的活性測定法によ
るＴＧＦ−β活性の測定を行った結果を示す図表であ
る。
性画分をカチオン交換クロマトグラフィー「Fractogel
EMD-SO3 --650」にかけ、溶出したフラクションについて
Ｏ．Ｄ．280 による蛋白量と、生物学的活性測定法によ
るＴＧＦ−β活性の測定を行った結果を示す図表であ
る。
【図３】カチオン交換クロマトグラフィーでプールされ
た活性画分を逆相クロマトグラフィー「Vydac C18 」に
かけ、溶出したフラクションについてＯ．Ｄ．280 によ
る蛋白量と、生物学的活性測定法によるＴＧＦ−β活性
の測定を行った結果を示す図表である。
た活性画分を逆相クロマトグラフィー「Vydac C18 」に
かけ、溶出したフラクションについてＯ．Ｄ．280 によ
る蛋白量と、生物学的活性測定法によるＴＧＦ−β活性
の測定を行った結果を示す図表である。
Claims (4)
- 【請求項１】 生物学的流体からのヒトＴＧＦ−βの精
製法において、ＴＧＦ−βを活性型へ変換させるために
前記生物学的流体をｐＨ１〜３に調整する工程と、活性
化されたＴＧＦ−βを、クロマトグラフィー用担体にＳ
Ｏ3 -基を導入したアクリルアミドオリゴマーを結合させ
たカチオン交換樹脂に負荷して回収する工程とを含むこ
とを特徴とするヒトＴＧＦ−βの精製法。 - 【請求項２】 前記カチオン交換樹脂が「Fractogel EM
D-SO3 --650」（商品名、ＭＥＲＣＫ社製）である請求項
１記載のヒトＴＧＦ−βの精製法。 - 【請求項３】 前記生物学的流体をゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより分別した後、得られた画分を前記カチオ
ン交換樹脂に負荷して回収する請求項１又は２記載のヒ
トＴＧＦ−βの精製法。 - 【請求項４】 前記カチオン交換樹脂に負荷して回収さ
れた画分を、逆相クロマトグラフィーにより分別する請
求項１〜３のいずれか１つに記載のヒトＴＧＦ−βの精
製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32247192A JP3386498B2 (ja) | 1992-11-06 | 1992-11-06 | ヒトＴＧＦ−βの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32247192A JP3386498B2 (ja) | 1992-11-06 | 1992-11-06 | ヒトＴＧＦ−βの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06145197A true JPH06145197A (ja) | 1994-05-24 |
| JP3386498B2 JP3386498B2 (ja) | 2003-03-17 |
Family
ID=18144014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32247192A Expired - Fee Related JP3386498B2 (ja) | 1992-11-06 | 1992-11-06 | ヒトＴＧＦ−βの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3386498B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999061474A1 (fr) * | 1998-05-25 | 1999-12-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Activine humaine purifiee et son procede de production |
| JP2007143881A (ja) * | 2005-11-28 | 2007-06-14 | Toshiba Corp | マンモグラフィ装置および方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61126105A (ja) * | 1984-11-21 | 1986-06-13 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | 架橋を伴う陽イオン交換基の導入方法 |
| JPH01310744A (ja) * | 1988-03-31 | 1989-12-14 | Merck Patent Gmbh | 分離材料 |
| WO1991004267A1 (en) * | 1989-09-11 | 1991-04-04 | Codon | A method for the purification of transforming growth factor (tgf-) |
| JPH03101699A (ja) * | 1989-06-28 | 1991-04-26 | Bio Kagaku Kenkyusho:Kk | 蛋白質性成長因子の製法 |
-
1992
- 1992-11-06 JP JP32247192A patent/JP3386498B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61126105A (ja) * | 1984-11-21 | 1986-06-13 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | 架橋を伴う陽イオン交換基の導入方法 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999061474A1 (fr) * | 1998-05-25 | 1999-12-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Activine humaine purifiee et son procede de production |
| US6756482B1 (en) | 1998-05-25 | 2004-06-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Purified human activin and process for producing the same |
| JP2007143881A (ja) * | 2005-11-28 | 2007-06-14 | Toshiba Corp | マンモグラフィ装置および方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3386498B2 (ja) | 2003-03-17 |
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