WO1999060134A1 - Neue peptidfragmente zur reinigung von proteinen - Google Patents

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WO1999060134A1
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arg
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Bernhard Hauer
Rolf D. Schmid
Markus Enzelberger
Stephan Minning
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the invention relates to new peptide fragments, fusion proteins containing the peptide fragments, processes for their preparation and the use of the peptide fragments.
  • the invention also relates to a method for purifying the fusion proteins and a method for the detection of proteins.
  • the invention further relates to nucleic acids which code for the peptide fragments or for the fusion proteins and vectors which contain the nucleic acids.
  • tags such as polyhistidine, His-Trp, His-Tyr or (His-Asp) n have been developed (see Sporeno et al.,
  • X 1 an amino acid selected from the group Ala, Val, Phe, Ser, Met, Trp, Tyr, Asn, Asp or Lys and the variables X 2 to X 6 an amino acid selected from the group Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His or
  • X 2 an amino acid selected from the group Val, Ile, Phe, Pro, Trp, Tyr, Gin, Glu or Arg and the variables X 1 , X 3 to X 6 an amino acid selected from the group Gly, Ala, Val, Leu , Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His or
  • X 3 an amino acid selected from the group Gly, Ile, Thr, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His and the variables X 1 , X 2 , X 4 to X 6 an amino acid selected from the group Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His or
  • X 6 an amino acid selected from the group Phe, Pro, Ser, Cys, Trp, Tyr or Gin and the variables X 1 to X 5 an amino acid selected from the group Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His and
  • At least one of the variables X 1 to X 6 also independently means Lys or Arg.
  • Further advantageous amino acids contained in the variables X 1 to X 6 are Glu, Lys, Arg, Tyr, Cys, Lys, His, Asp or Met.
  • the amino acids Cys, Glu, Lys, Tyr or Arg are preferably contained, particularly preferably Cys. These amino acids contribute to an advantageous binding of the peptide fragments to the immobilized metal ions.
  • the sequence advantageously contains no more than four, preferably three, histidine residues in succession.
  • X 1 an amino acid selected from the group Ala, Val, Phe, Ser, Met, Trp, Tyr, Asn, Asp or Lys, particularly preferably Phe, Ser, Asn, Asp or Lys, very particularly preferably Asn;
  • X 2 an amino acid selected from the group Val, Ile, Phe, Pro, Trp, Tyr, Gin, Glu or Arg, particularly preferably Val, Ile, Phe, Pro, Gin, Glu or Arg, very particularly preferably Gin, Glu or Arg;
  • X 3 an amino acid selected from the group Gly, Ile, Thr, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg or His, particularly preferably Gly, Ile, Thr, Met, Trp, Tyr, Asn , Asp, Glu, Arg or His, very particularly preferably Gly, Thr or Tyr;
  • X 4 an amino acid selected from the group Val, Phe, Pro, Cys, Met, Trp, Asn, Glu, Arg or His, particularly preferably Val, Phe, Cys, Met, Trp, Asn, Arg or His, very particularly preferably Asn or Arg;
  • X 5 an amino acid selected from the group Gly, Ser, Cys, Met, Trp, Asn, Glu, Lys or Arg, particularly preferably Gly, Ser, Cys, Met, Asn, Glu, Lys or Arg, very particularly preferably Gly or Lys;
  • X 6 an amino acid selected from the group Phe, Pro, Ser, Cys, Trp, Tyr or Gin, particularly preferably Phe, Ser, Cys, or Tyr, very particularly preferably Cys.
  • variables X 1 to X 6 in the sequence His-X 1 -His-XX 3 -X-Cys-X 5 - X 6 -Cys can independently have the different preferred meanings, with individual variables up to a maximum of five of the variables being an amino acid selected from the group Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His.
  • Particularly preferred peptide fragments are fragments with the sequences
  • the above-mentioned protein fragment sequence is encoded by the nucleic acid fragments according to the invention.
  • the degenerate genetic code must be taken into account here.
  • the nucleic acid fragments according to the invention can in principle be contained in any nucleic acids.
  • gene constructs can advantageously be placed in a suitable host organism which enables optimal expression of the fusion protein.
  • Suitable vectors are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al.
  • Plasmids also include all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses, transposons, IS elements, plasmids, cosmids, linear or circular DNA. These vectors can replicate autonomously in the host organism or can be replicated chromosomally.
  • the nucleic acid sequences according to the invention are to be understood as sequences which have been functionally linked to one or more regulation signals advantageously to increase gene expression.
  • These sequences can be 3 'and / or 5' terminal regulatory sequences for increasing expression which, depending on the selected host organism and gene, are selected for optimal expression.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acids.
  • the gene construct can also advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable increased expression of the nucleic acid sequence. This can be done, for example, by means of an improved interaction between RNA polymerase and DNA.
  • nucleic acid fragments according to the invention are advantageously inserted in the vector in such a way that they form the N-terminal region of the fusion protein. However, they can also be located at the C-terminus or lie within the protein, although the function of the protein must not be affected and it is no longer possible to cut out of the fusion protein.
  • the regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the genes and protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • promoters such as cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, - lpp-lac-, lacIQ-- T7-, T5-, T3-, gal- , trc-, ara-, SP6-, ⁇ -P R - or contained in the ⁇ -P L - promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • promoters amy and SP02 in the yeast or fungal promoters ADC1, MF ⁇ , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH or in the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos or contained in the ubiquitin or phaseolin promoter, in this connection are also the promoters of pyruvate decarboxylase and methanol oxidase from, for example, Hansenula advantageous. Artificial promoters for regulation can also be used.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced gene and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as the promoters and / or enhancers mentioned.
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • the nucleic acid sequences according to the invention advantageously also contain signals which enable the proteins to be secreted into the medium or into cell compartments.
  • the typical signal sequences such as the signal sequence of ompA (E. coli membrane protein) may be mentioned as an example of such sequences.
  • the gene constructs according to the invention advantageously also contain sequences which enable the protein fragments according to the invention with the above-mentioned sequence to be cleaved from the N- or C-terminus of the fusion protein, preferably from the N-terminus.
  • sequences code, for example, for interfaces of various proteases such as for example factor Xa, enterokinase, human renin, carboxypeptidase A, thrombin, trypsin, dipeptidyl pepdidases, papain, plasmin, pepsin or other proteases.
  • proteases such as for example factor Xa, enterokinase, human renin, carboxypeptidase A, thrombin, trypsin, dipeptidyl pepdidases, papain, plasmin, pepsin or other proteases.
  • Interfaces for factor Xa, human renin, dipeptidiyl peptides, carboxypeptidase A or enterokinase since these enzymes have a high specificity and so an unwanted digestion of the protein to be purified can be avoided. If other proteins are used, care must be taken to ensure that there are no interfaces within the protein to be purified.
  • the protein fragment can also be removed by cyanogen bromide cleavage [eg 2- (2-nitrqphenylsulfenyl) -3-bromo-3 'methylindolinium, hydroxylamine, etc.] in the presence of formic acid. However, this usually requires the protein to be refolded, which means that this method is less preferred.
  • the protein fragment can also be split off by means of exoprotease digestion (kinetically controlled). However, this usually results in product mixtures. Interfaces are preferably used which enable the protein fragments to be removed without leaving protein fragment residues in the protein to be purified.
  • the protein fragments according to the invention can be used in the fusion protein can be tolerated without loss of function and without other disadvantages, a special place for separating the protein fragment can be dispensed with.
  • vectors which allow expression in pro- or eukaryotic cells are suitable as vectors.
  • Vectors that replicate only in one genus or those that replicate in several genera can be used.
  • Advantageous vectors are beispiels-, plasmids such as the E.
  • plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the above-mentioned book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
  • the nucleic acid sequence according to the invention can also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms come into question as host organisms for the gene construct according to the invention.
  • Microorganisms such as gram-positive or gram-negative bacteria, archaebacteria, fungi, yeasts, animal or plant cells such as Drosophila, in particular D. melanogaster, mouse, zebrafish or tobacco are advantageously used as host organisms.
  • Gram-positive or gram-negative bacteria, fungi or yeasts are preferably used, particularly preferably the genera Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Aspergillus or Saccharomyces, very particularly preferably E. coli.
  • vector and host organism such as Escherichia coli and its plasmids and phages and the associated promoters as well as Bacillus and his are particularly preferred
  • vector and host organism such as Escherichia coli and its plasmids and phages and the associated promoters as well as Bacillus and his are particularly preferred
  • plasmids and promoters Streptomyces and its plasmids and promoters, Aspergillus and its plasmids and promoters or Saccharomyces and its plasmids and promoters.
  • the fusion proteins according to the invention can be produced as described above in one process, the nucleic acid fragments according to the invention, which code for the protein fragments with the above-mentioned sequence, with a gene which codes for the proteins to be purified, and optionally further
  • the protein fragments according to the invention are suitable for the production of fusion proteins which can be purified easily, inexpensively and efficiently with the aid of the protein fragments.
  • the protein fragments and fusion proteins according to the invention can thus advantageously be purified very selectively in good yields and with high purity.
  • the protein fragments according to the invention and thus the fusion proteins produced from them are advantageously characterized by a bond to the ⁇ immobilized metal ions that is at least 1.5 times stronger than that of the Helicobacter pilori ATPase-439 sequence.
  • proteins are suitable for producing the fusion proteins.
  • Proteins are preferably used which have a biological effect in humans, animals or plants or which are of interest for organic synthesis. These are, for example, proteins such as enzymes, hormones, storage or binding or transport proteins.
  • proteins such as hydrolases such as lipases, esterases, amidases, nitrilases, proteases, mediators such as cytokines, for example lymphokines such as MIF, MAF, TNF, 5 interleukins such as interleukin 1, interferons such as ⁇ -interferon, tPA, hormones such as proteohormones, glycohormones, oligo- or polypeptide hormones such as vassopressin, endorphins, endostatin, angiostatin, Growth factors erythropoietin, transcription factors, integrins such as GPIIb / IIIa or O v ßlll, receptors such as the various glutamate receptors, angiogenesis factors such as angiotensin.
  • cytokines for example lymphokines such as MIF, MAF, TNF, 5 interleukins such as interleukin 1, interferons such as ⁇ -interferon, tPA, hormones such as proteohormon
  • the method according to the invention for purifying fusion proteins enables, for example, the purification of proteins from natural sources such as plant or animal extracts, plant or animal cell lysates, from culture media, fermentation broths or from synthetic broths, to name just a few.
  • the process according to the invention comprises the following reaction steps:
  • the fusion protein is advantageously expressed in a suitable host organism (see above) before purification in order to increase the yield of fusion protein.
  • the host organism is grown in a suitable synthetic or complex medium, which contains a carbon source, a nitrogen source and optionally inorganic salts, vitamins and trace elements, at a suitable temperature and aeration.
  • the cells are first disrupted and the cells or cell debris advantageously separated.
  • Methods known to those skilled in the art are used for cell disruption, such as ultrasound, French press, enzyme disruption, osmotic shock and others.
  • the cells or cell debris can be separated off, for example, by centrifugation or filtration. However, it is not absolutely necessary to separate the cells or cell debris.
  • the liquid containing the fusion proteins is then brought into contact with the immobilized metal ions, so that an affinity bond can form between the fusion protein and the metal ions.
  • the binding takes place at pH values greater than 7, for example advantageously at pH 7.0 to 9.0, preferably between pH 7.5 to 8.0.
  • Advantageous buffers are individual buffers or buffer mixtures such as 50 to 1000 mM buffers such as 50 mM Tris / HCl pH 8.0 + 150 mM NaCl, 100 mM NaAcetat pH 7.7 + 500 mM NaCl, 20 mM NaPhosphat pH 7, 7 + 500 mM NaCl or 50 mM Tris / HCl pH 8.0 + 150 mM NH 4 CI.
  • These buffers allow the fusion proteins to be applied to the immobilized metal ions. In the simplest, particularly advantageous case, the fusion proteins are brought into contact with the immobilized metal ions directly in the buffer used for the digestion or in the incubation medium.
  • the liquids and the immobilized metal ions are advantageously brought into contact with one another in a conventional chromatography column. This facilitates the removal of unbound substances, for example proteins, by washing the column with a suitable buffer.
  • Suitable buffers are buffers which do not interfere with the binding of the protein fragments according to the invention or the fusion proteins to the metal ions and can remove impurities.
  • Such buffers preferably have a pH greater than pH7, advantageously a pH between pH 7.0 to 9.0, preferably between pH 7.5 to 8.0.
  • Batch batches in which the immobilized metal ions are placed in a vessel and the liquids are subsequently added or vice versa can also be cleaned in this way.
  • the buffers mentioned can be used for these batch approaches.
  • the batches are advantageously centrifuged or filtered between the individual washing steps.
  • Suitable materials are, for example, commercially available from Pharmacia LKB, Sweden (Sepharose TM 6B or Superose TM), Pierce, USA (immobilized iminodiacetic acid I or II, immobilized tris (carboxymethyl) ethylenediamine), Sigma, USA (immobilized imminodiacetic acid agarose), Boehringer Mannheim, Germany (Zinc chelate agarose) or Toyo Soda, Japan (TSKgel Chelate-5PW).
  • suitable materials are described in EP-B-0 253 303.
  • Other suitable advantageous materials are materials such as Ni-coated microtiter plates (nickel chelate coated Flashplate ® , Nen life science products) or magnetic particles or membranes specially treated and binding with metal ions.
  • Suitable metal ions are Co, Cu, Fe, Ca, Mg, Ni, Al, Cd, Hg or Zn, preferably Fe, Ni or Cu, particularly preferably Ni or Cu, very particularly preferably Ni.
  • the materials are advantageously loaded with metal ions with 0.1 to 0.4 M solutions of the metal salts in aqueous, unbuffered solution.
  • the fusion protein is eluted with a suitable buffer.
  • This buffer breaks the affinity bond between the fusion protein and the immobilized metal ions.
  • the fusion proteins can be eluted via a pH gradient (low pH values ⁇ pH 7.0 have an eluting effect), competitive ligands such as imidazole, organic solvents such as acetone or ethanol, chelating agents such as EDTA or NTA and / or detergents such as Tween 80. Elution via competitive ligands such as imidazole and / or detergents is preferred.
  • Imidazole is used in a range from 0.05 to 0.7 M, preferably from 0.1 to 0.5 M for elution.
  • the competitive ligands and / or detergents are advantageously used in a buffer, but use in water is also possible.
  • Advantageous buffers are buffers which correspond to the buffers used for the application to the immobilized metal ions. This has the advantage that there are no undesirable interactions between the column material, the bound proteins and the buffer.
  • Advantageous buffers preferably have a pH greater than pH7, advantageously a pH between pH 7.0 and 9.0, preferably between pH 7.5 and 8.0. These buffers are preferably applied via an increasing gradient. In the event that elution is carried out with a pH gradient, buffers with a pH of less than pH 7.0 and / or acids can be used. The eluted fusion protein is collected and can be used immediately ', or can be further treated if necessary and desired. Suitable application and elution buffers are, for example, the textbook Protein Purification (Eds. JC Janson, L.
  • the protein fragment according to the invention can be removed using the methods described above, such as cyanogen bromide or protease cleavage.
  • residues of the protein fragment can remain in the molecule or entirely from the protein to be purified be split off.
  • the protein fragment is advantageously removed from the protein without residue.
  • Protein fragments which are advantageously suitable for the production of fusion proteins can be screened by the following method according to the invention.
  • the invention relates to a process for the production of protein fragments which are able to enter into a reversible affinity bond with immobilized metal ions, characterized in that the following steps are carried out:
  • the nucleic acid library can be created using methods known to those skilled in the art for mutagenesis.
  • the sequence can be subjected, for example, to a "site directed mutagenesis" as described in D.M. Glover et al. , DNA Cloning Vol.l, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), Chapter 6, page 193 ff.
  • nucleic acid fragment according to the invention which codes for the protein fragment, is fused to a reporter gene
  • Advantageous reporter genes enable easy detection of the binding to the immobilized metal ions by, for example, binding antibodies labeled with a fluorescent dye, which are directed against the reporter gene, or by self-fluorescent proteins such as the advantageous one
  • inclusion bodies 40 does not form so-called "inclusion bodies".
  • the use of the egfp protein enables the localization and quantification of the protein concentration in every phase of the purification of the proteins without intervention in the purification and without the use of further cofactors or substrates (Poppenborg et al., J. Biotechnol.,
  • the egfp protein is characterized by high stability towards a wide pH range (pH 5.5 to 12), bleaching by photo-oxidation, oxidizing and weakly reducing agents such as 2% mercaptoethanol.
  • the protein shows a decrease in fluorescence above 37 ° C.
  • the gfp-uv (blue fluorescence) and eyfp (yellow fluorescence) proteins are also suitable as reporter genes.
  • the selection of the suitable sequences is made in comparison to the binding affinity to the immobilized metal ions of the following natural Helicobacter pilori ATPase-439 sequence His-Ile-His-Asn-Leu-Asp-Cys-Pro-Asp-Cys.
  • the protein fragment sequences according to the invention have a reversible bond to the immobilized metal ions that is at least 1.5 times stronger, preferably an at least twice, particularly preferably at least three times stronger reversible bond.
  • Advantageous sequences enable a protein yield after purification of at least 20%, preferably at least 30%, particularly preferably at least 40%, very particularly preferably at least 50%.
  • the method according to the invention for screening the nucleic acid library is advantageously suitable for automation. With this method, a large number of nucleic acid fragments or protein fragments can be tested for their affinity for metal ions in a so-called "high-throughput screening".
  • Proteins can be easily detected with the protein fragments according to the invention.
  • individual proteins which contain a protein fragment with the above-mentioned protein fragments according to the invention are detected from a protein mixture by means of antibodies which are directed against the protein fragment.
  • the membrane is advantageously washed several times and then the bound antibodies are detected in a so-called western or immunoblot by means of a specific reaction with, for example, an enzyme-conjugated (for example alkaline phosphatase, peroxidase, etc.) second antibody which is directed against the constant region of the first .
  • an enzyme-conjugated (for example alkaline phosphatase, peroxidase, etc.) second antibody which is directed against the constant region of the first .
  • Corresponding antibodies are commercially available. If magnetic particles are used, washing can be dispensed with; the magnetic particles coated with antibodies can be cleaned by fishing with magnets.
  • the protein fragments according to the invention have the advantage over the conventional His tags in protein detection in that they have a stronger antigenic action and are therefore more suitable for producing antibodies against the tag.
  • the E. coli strain DH5 ⁇ (F ⁇ endAl hsdR17 [rk-, mk + ] supE44 thil ⁇ gyrA96 relAl ⁇ (argF laczya) U169) was used for the cloning experiments.
  • the plasmids containing the gene for the egf protein were purchased from Clonetech USA.
  • the PCR products were digested with Ncol and Notl, respectively, and alloyed into the egfp vector, which had been digested with the same enzymes in order to exclude mutations in the vector (see FIG. 1).
  • the PCR vector ligations were used to transform E. coli.
  • the transformants were plated on LB agar with 100 ⁇ g / ml ampicillin and incubated at 37 ° C.
  • Example 2 Cultivation conditions and preparation of the cell lysates
  • Transformed colonies were selected and grown in 50 ml LB medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin. Colonies that showed fluorescence were selected for high-throughput screening and incubated in sterile microtiter plates containing 250 ⁇ l LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin. After incubation, the cultures were centrifuged. The pellets were resuspended in 2 ml lysis buffer, incubated for 20 minutes on ice and then disrupted using ultrasound (twice, 5 minutes with a Branson Sonifier 250).
  • 600 ⁇ l of the lysed cells were applied to a Ni-NTA column, washed twice with 600 ⁇ l of a washing solution (50 mM Na phosphate buffer, pH 8.0, 250 mM NaCl) and then eluted with a 0.7 M imidazole solution.
  • a washing solution 50 mM Na phosphate buffer, pH 8.0, 250 mM NaCl
  • membrane filter micro-titer plates (MultiScreen 5 ⁇ m; Millipore, Molsheim, Germany) were used. 250 ⁇ l of a stirred chelate sepharose suspension were added to each “well” of the membrane filter plates three times. After each addition, the Sepharose was centrifuged off (2 min, 23 ° C., 350 rpm). All further steps were carried out in a Beckmann Biomek 2000 robot. The mini columns in the wells were washed twice with 250 ul water. The Sepharose was then loaded with 250 ⁇ l of a metal salt solution and equilibrated three times with 200 ⁇ l buffer (50 mM Na phosphate, pH 8.0, 250 mM NaCl).
  • a conventional chromatography setup was chosen from a glass column, two peristaltic pumps for applying the solutions, a UV detector (LKBUV-MII), a printer (LKB RIC 102) and a fraction collector (LKB FRAC-200). All devices came from the company Pharmacia.
  • the column was filled with chelating Sepharose Fast-Flow Gel (Pharmacia), washed with 15 7 bed volumes of de-metered water and loaded with the metal ions with 7 bed volumes of 0.3 M NiCl 2 solution. The column was then washed with 7 bed volumes of IMAC buffer (50 mM Na phosphate, pH 8.0, 250 mM NaCl) and equilibrated.
  • IMAC buffer 50 mM Na phosphate, pH 8.0, 250 mM NaCl
  • Washing step removes the metal, bound cell residues and proteins from the column.
  • the eluted fractions were examined both optically and spectroscopically.
  • Clones M13 and Z5 eluted in a sharp
  • the clone Ml3 was compared in a comparative experiment with the egfp wild type protein and the usual his-tags.
  • the egfp wild type protein does not bind to the metal chelate columns. After washing the column, fluorescence was no longer detectable on the column.
  • the clone M13 binds in a sharp band on the column while the his-tag proteins bind over the entire column. This is due to a lower affinity, which ultimately leads to a lower capacity of the column.
  • the protein yield in the case of M13 with 56% is higher than 5 with the his-tags with 48%.
  • Table I Binding experiments on Ni metal chelate columns
  • Clones A6, AlO, M13, Z5 and Z7 bind well to the metal chelate column, while clones M14, Ml5 and M16 showed no binding.
  • Example 8 Comparison test between sequence of ATPase-439 and protein fragments according to the invention
  • the comparison clone of ATPase-439 was carried out analogously to Examples 1 and 6.
  • the following primer was used as a primer

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Peptidfragmente, Fusionsproteine enthaltend die Peptidfragmente, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie die Verwendung der Peptidfragmente. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Reinigung der Fusionsproteine und ein Verfahren zur Detektion von Proteinen. Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäuren, die für die Peptidfragmente oder für die Fusionsproteine kodieren und Vektoren, die die Nukleinsäuren enthalten.

Description

Neue Peptidfragmente zur Reinigung von Proteinen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neue Peptidfragmente, Fusionsproteine enthaltend die Peptidfragmente, Verfahren zur ihrer Herstellung sowie die Verwendung der Peptidfragmente. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Reinigung der Fusionsproteine und ein Verfahren zur Detektion von Proteinen.
Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäuren, die für die Peptidfragmente oder für die Fusionsproteine kodieren und Vektoren, die die Nukleinsäuren enthalten.
Durch die moderne Molekularbiologie ist es möglich geworden fast beliebige Proteine, Peptide oder deren Derivate in nahezu unbegrenzten Mengen herzustellen. Die Proteinreinigung erweist sich dabei häufig als der limitierende und nicht selten ineffiziente und damit letztlich kostenbestimmende Faktor.
Es wurden deshalb eine Reihe von Techniken zur Reinigung von Proteinen entwickelt. Für die Reinigung von Proteinen aus Zell- überständen, Zeilrohextrakten oder Zellen werden üblicherweise Techniken wie Salzpräzipitation oder Präzipitation mit organischen Lösungsmitteln, Ultrafiltration, Dialyse, Gelelektrophorese, Isoelektrische Fokusierung, Chromatofokusierung, Ionenaustauscher- oder Gelchromatographie, Hydrophobe Chromatographie, Immunopräzipitation oder IMAC (= Immobilized Metal Affinity Chromatographie) verwendet. Es können einzelne Methoden zur Reinigung verwendet werden, in der Regel ist aber eine Kombination verschiedener Techniken erforderlich. Eine Übersicht über übliche Reinigungsmethoden ist beispielsweise den Lehrbüchern Protein Purification Process Engineering (Ed. R.G. Harrison, 1994, Marcel Dekker, Inc., New York, page 209 - 316, ISBN 0-8247-9009-X) , Protein Purification (Ed. R.K. Scopes, 1994,
Springer Verlag New York, chapter 4 - 7, ISBN 0-387-94072-3) und Methods for Protein Analysis (Ed. R.A. Copeland, 1994 Chapman & Hall, page 59 - 112, ISBN 0-412-03741-6) zu entnehmen. Für die Proteinreinigung ist es wichtig, daß die Reinigung so schonend wie möglich, so selektiv wie möglich und möglichst rasch erfolgt. Dabei sollen die Proteinverluste so gering wie irgend möglich gehalten werden. Viele der Proteinreinigungsmethoden sind nicht ausreichend selektiv, für nur geringe Proteinmengen geeignet und/oder sehr teuer.
BESTÄT1GUNGSK0PI6 Die von Porath et al . (Nature, Vol.258, 1975: 598 - 599) beschriebene Methode zur Proteinreinigung mit Hilfe der IMAC (= Immobilized Metal Affinity Chromatographie) ist ein guter Kompromiss zwischen den genannten Anforderungen an eine optimale 5 Reinigung. Diese Methode hat jedoch noch einige Nachteile. So binden beispielsweise nicht alle Metallionen gleich gut an das Trägermaterial, so daß die Ionen zum Teil ausgewaschen werden und so das Wertprodukt verunreinigen. Viele Proteine binden gar nicht an das Chromatographiematerial und lassen sich so nicht reinigen 10 oder binden zu schwach, so daß sie bei den erforderlichen Waschschritten des Säulenmaterials schon eluiert werden. Dies führt zu unerwünschten Produktverluste . Da die Selektivität in der Regel für eine "Ein-Schritt-Reinigung" nicht ausreichend ist, im Gegensatz zur Reinigung über biospezifische Affinitätsreinigungs-
15 methoden wie beispielsweise eine Reinigung über Antikörper, sind weitere Reinigunsschritte erforderlich.
Um eine breitere Palette an Proteinen mit dieser Methode reinigen zu können, wurde verschieden sogenannte Tags wie Polyhistidin, His-Trp, His-Tyr oder (His-Asp)n entwickelt (siehe Sporeno et al . ,
20 J. Biol. Chem. 269 (15), 1994: 10991 - 10995, Le Grice et al . , Eur. J. Biochem. , 187 (2), 1990: 307 - 314, Reece et al . , Gene, 126 (1), 1993: 105 - 107, De Vos et al . , Nucl. Acid. Res., 22 (7), 1994: 1161 - 1166, Feng et al., J. Biol. Chem. 269 (3), 1994: 2342 - 2348, Hochuli et al., Biotechnology, 1988: 1321 -
25 1325, Patwardhan et al . , J. Chromatography A, 787, 1997: 91 - 100, Hutchens et al., J. Chromatography, 604, 1992: 133 - 141). Diese Tags werden mit den zu reinigenden Protein mit Hilfe der Molekularbiologie auf Nukleinsäureebene verbunden. Durch diese Tags konnte die Proteinreinigung in einigen Bereichen weiter ver¬
30 bessert werden. Jedoch auch diese Methode hat nach wie vor einige Nachteile. Nach wie vor läßt sich nicht sicher Vorhersagen, ob ein Protein über diese Methode aufgereinigt werden kann (siehe Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, L. Kagedal, page 227 - 251 in Protein Purification, Eds. J.C. Janson, L. Ryden,
35 1989, VCH Publisherε, Inc., New York, ISBN 0-89573-122-3), das heißt auch diese Methode ist nicht auf jedes Protein anwendbar. Auch hier können Metallionen ausgewaschen werden oder Proteine so schwach binden, daß sie während der Waschschritte zum Teil verloren gehen. Auch die Selektivität läßt noch zu wünschen übrig. 0 Außerdem ist die Beladungskapazität des Säulenmaterials mit den zu reinigenden Proteinen teilweise noch zu gering, so daß für eine Reinigung viel Säulenmaterial verwendet werden muß. Auch die Proteinausbeute ist noch nicht ausreichend. Dies führt zu unnötigen Kosten. 5 Von Volz et al. wurde die Reinigung zweier ATPasen von Helico- bacter pylori ohne die Verwendung einer zusätzlichen His-Tag- Sequenz beschrieben. Diese ATPasen enthalten natürliche Metallbindungsstellen, die eine Reinigung über IMAC ermöglichen. Eigene Arbeiten zeigten, daß diese Bindungsstellen für eine effiziente Aufreinigung beliebiger Proteine eine zu geringe Bindungsaffinität aufweisen.
Es bestand daher die Aufgabe weitere Tags für die Protein- reinigung mittels IMAC zur Verfügung zu stellen, die die oben genannten Nachteile nicht besitzen und dadurch beispielsweise eine breitere Anwendung der Tags und/oder eine höhere Beladungsdichte der des Säulenmaterials ermöglichen. Die eine höhere Selektivität zeigen und so die Reinigung vereinfachen.
Die Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäßen Peptidfragmente mit der allgemeinen Sequenz
His-X1-His-X2-X3-X-Cys-X5-X6-Cys gelöst,
wobei die Variablen X1 bis X6 in der Sequenz die folgende Bedeutung haben:
X1 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Ala, Val, Phe, Ser, Met, Trp, Tyr, Asn, Asp oder Lys und die Variablen X2 bis X6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His oder
X2 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Val, Ile, Phe, Pro, Trp, Tyr, Gin, Glu oder Arg und die Variablen X1, X3 bis X6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His oder
X3 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ile, Thr, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His und die Variablen X1, X2, X4 bis X6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His oder
X4 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Val, Phe, Pro, Cys, Met, Trp, Asn, Glu, Arg oder His und die Variablen X1 bis X3, X5' X6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His oder X5 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ser, Cys, Met, Trp, Asn, Glu, Lys oder Arg und die Variablen X1 bis X4, X6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His oder
X6 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Phe, Pro, Ser, Cys, Trp, Tyr oder Gin und die Variablen X1 bis X5 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His und
wobei mindestens eine der Variablen X1 bis X6 in der Sequenz unabhängig voneinander Gin oder Asn bedeutet.
Vorteilhafterweise bedeutet in der Sequenz mindestens eine der Variablen X1 bis X6 außerdem unabhängig voneinander Lys oder Arg. Weitere vorteilhafte in den Variablen X1 bis X6 enthaltene Aminosäuren sind Glu, Lys, Arg, Tyr, Cys, Lys, His, Asp oder Met. Be- vorzugt sind die Aminosäuren Cys, Glu, Lys, Tyr oder Arg enthalten, besonders bevorzugt Cys. Diese Aminosäuren tragen zu einer vorteilhaften Bindung der Peptidfragmente an die immobilisierten Metallionen bei. Außerdem sind vorteilhafterweise nicht mehr als vier bevorzugt drei Histidinreste in Folge in der Sequenz ent- halten.
Weiter haben die Variablen X1 bis X6 in der Sequenz unabhängig voneinander folgende vorteilhafte bevorzugte Bedeutung:
X1 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Ala, Val, Phe, Ser, Met, Trp, Tyr, Asn, Asp oder Lys, besonders bevorzugt Phe, Ser, Asn, Asp oder Lys, ganz besonders bevorzugt Asn;
X2 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Val, Ile, Phe, Pro, Trp, Tyr, Gin, Glu oder Arg, besonders bevorzugt Val, Ile, Phe, Pro, Gin, Glu oder Arg, ganz besonders bevorzugt Gin, Glu oder Arg;
X3 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ile, Thr, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg oder His, besonders bevorzugt Gly, Ile, Thr, Met, Trp, Tyr, Asn, Asp, Glu, Arg oder His, ganz besonders bevorzugt Gly, Thr oder Tyr; X4 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Val, Phe, Pro, Cys, Met, Trp, Asn, Glu, Arg oder His, besonders bevorzugt Val, Phe, Cys, Met, Trp, Asn, Arg oder His, ganz besonders bevorzugt Asn oder Arg;
X5 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ser, Cys, Met, Trp, Asn, Glu, Lys oder Arg, besonders bevorzugt Gly, Ser, Cys, Met, Asn, Glu, Lys oder Arg, ganz besonders bevorzugt Gly oder Lys;
X6 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Phe, Pro, Ser, Cys, Trp, Tyr oder Gin, besonders bevorzugt Phe, Ser, Cys, oder Tyr, ganz besonders bevorzugt Cys.
Die Variablen X1 bis X6 in der Sequenz His-X1-His-X-X3-X-Cys-X5- X6-Cys können unabhängig voneinander die verschiedenen bevorzugten Bedeutungen haben, wobei einzelne Variablen bis maximal fünf der Variablen eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His bedeuten.
Besonders bevorzugte Peptidfragmente sind Fragmente mit den Sequenzen
His-Gln-His-Glu-Gly-Arg-Cys-Lys-Glu-Cys
His-Asn-His-Arg-Tyr-Gly-Cys-Gly-Cys-Cys
His-Arg-His-Gly-Thr-Asn-Cys-Leu-Lys-Cys
His-Ile-His-Gln-Ser-Asn-Cys-Gln-Val-Cys.
Die oben genannte Proteinfragmentsequenz wird durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente kodiert. Hierbei ist der degenerierte genetische Code zu berücksichtigen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente können prinzipiell in beliebigen Nukleinsäuren enthalten sein. Vorteilhafterweise werden die Nukleinsäurefragemente in Vektoren so inseriert, daß die Herstellung von zusammengesetzten Nukleinsäuresequenzen (= Gen- konstrukte) , die für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine kodieren, ermöglicht wird. Diese Genkonstrukte können zur Expression vorteilhaft in einen geeigneten Wirtsorganismus verbracht werden, der eine optimale Expression des Fusionsproteins ermöglicht. Geeignete Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren, Transposons, IS-Elemente, Plasmide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können sich autonom im Wirtsorganismus replizieren oder chromo- somal repliziert werden.
Unter den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen sind Sequenzen zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Diese Sequenzen können 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression sein, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen für eine optimale Expression ausgewählt werden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäuren regulieren. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Dies kann bei- spielsweise über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA- Polymerase und DNA erfolgen. Auch am 3 '-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente werden vorteilhaft im Vektor so inseriert, daß sie die N-terminale Region des Fusionsproteins bilden. Sie können jedoch auch am C-Terminus lokalisiert sein oder aber innerhalb des Proteins liegen, wobei jedoch die Funktion des Proteins nicht beeinflußt sein darf und ein Ausschneiden aus dem Fusionsprotein nicht mehr möglich ist.
Die regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-,- lpp-lac-, lacIQ-- T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL- Promotor enthalten, die vorteilhaf erweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten, in diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanol- oxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs- weise die Genexpression des eingeführten Gens positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie die genannten Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Vorteilhaf erweise enthalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sequenzen auch Signale, die eine Sekretion der Proteine ins Medium oder in Zellkompartimente ermöglichen. Als Beispiel für derartige Sequenzen seien die typischen Signalsequenzen wie beispielsweise die Signalsequenz von ompA (E. coli-Membranprotein) genannt. Daneben können weitere vorteilhafte Sequenzen wie die Sequenz des α-Faktor enthalten sein oder sog. YACS (= Yeast artifial chromosomes) verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte (= Nukleinsäuresequenzen) enthalten vorteilhaf erweise außerdem noch Sequenzen, die eine Abspaltung der erfindungsgemäßen Proteinfragmente mit der oben genannten Sequenz vom N- oder C-Terminus des Fusionsproteins bevorzugt vom N-Terminus ermöglichen. Diese Sequenzen kodieren beispielsweise für Schnittstellen verschiedenster Proteasen wie beispielsweise für Faktor Xa, Enterokinase, humanen Renin, Carboxy- peptidase A, Thrombin, Trypsin, Dipeptidylpepdidasen, Papain, Plasmin, Pepsin oder sonstigen Proteasen. Bevorzugt werden
Schnittstellen für Faktor Xa, humanen Renin, Dipeptidiylpepti- dasen, Carboxypeptidase A oder Enterokinase, da diese Enzyme eine hohe Spezifität besitzen und so ein unerwünschter Verdau des zu reinigenden Proteins vermieden werden kann. Werden andere Prote- äsen verwandt, so ist darauf zu achten, daß keine Schnittstellen innerhalb des zu reinigenden Proteins sind. Das Proteinfragment kann auch über eine Bromcyanspaltung [z.B 2- (2-Nitrqphenyl- sulfenyl)-3-brom-3 '-methylindolinium, Hydoxylamin etc.] in Gegenwart von Ameisensäure entfernt werden. Hierbei ist jedoch in der Regel eine Rückfaltung des Proteins erforderlich, was dazu führt, daß diese Methode weniger bevorzugt ist. Auch eine Abspaltung des Proteinfragments über einen Exoproteaseverdau (kinetisch kontrolliert) ist möglich. Hierbei entstehen jedoch in der Regel Produktgemische. Bevorzugt werden Schnittstellen verwendet, die eine Entfernung der Proteinfragmente ohne das Zurücklassen von Proteinfragmentresten im zu reinigenden Protein ermöglichen. Können im Fusionsprotein die erfindungsgemäßen Proteinfragmente ohne Funktionsverlust und ohne sonstige Nachteile toleriert werden, so kann auf eine spezielle Stelle zur Abtrennung des Proteinfragments verzichtet werden.
Als Vektoren sind prinzipiell alle Vektoren geeignet, die eine Expression in pro- oder eukaryontisehen Zellen ermöglichen. Dabei können Vektoren verwendet werden, die nur in einer Gattung replizieren oder solche, die in mehreren Gattungen replizieren (= sog. shuttle-vectoren) . Vorteilhafte Vektoren sind beispiels- weise Plasmide wie die E. coli-Plasmide pEGFP, pLG338, pACYC184, pBR322, pUClδ, pUC19, pKC30, pRep , pHSl, pHS2 , pPLc236, pMBL24, PLG200, pUR290, pIN-III113-Bl , λgtll oder pBdCI, bevorzugt pEGFP, in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBHO, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2μM, pAG-1, YEp6, YEpl3 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem oben genannten Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindüngεgemäße Nukleinsäuresequenz auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus der Nukleinsäure, d.h. dem Nukleinsäurefragment und dem Gen für das Protein (= Fusionsproteingen) sowie gegebenenfalls weiteren regulatorischen Sequenzen bestehen.
Als Wirtsorganismen für das erfindungsgemäße Genkonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontisehen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie gram-positive oder gram-negative Bakterien, Archaebak erien, Pilze, Hefen, tierische oder pflanzliche Zellen wie Drosophila speziell D. melanogaster, Maus, Zebrafisch oder Tabak verwendet. Bevorzugt werden gram-positive oder gramnegative Bakterien, Pilze oder Hefen, besonders bevorzugt die Gattungen Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Aspergillus oder Saccharomyces, ganz besonders bevorzugt E. coli verwendet.
Besonders bevorzugt sind folgende Kombinationen aus Vektor und Wirtsorganismus wie Escherichia coli und seinen Plasmiden und Phagen und den dazugehörenden Promotoren sowie Bacillus und seine Plasmide und Promotoren, Streptomyces und seine Plasmide und Promotoren, Aspergillus und seine Plasmide und Promotoren oder Saccharomyces und seine Plasmide und Promotoren zu verstehen.
^ Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine lassen sich wie oben beschrieben in einem Verfahren herstellen, wobei die erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente, die für die Proteinfragmente mit der oben genannten Sequenz kodieren, mit einem Gen, das für die zu reinigenden Proteine kodiert, und gegebenenfalls weiteren
10 vorteilhaften Sequenzen wie Promotor- und/oder Enhancersequenzen, Schnittstellen für Proteasen etc. fusioniert werden. Dazu wird falls erforderlich eine geeignete Restriktionsenzymschnittstelle zwischen dem Nukleinsäurefragment und dem Gen des zu reinigenden Proteins eingeführt und dieses Konstrukt über geeignete Schnitt-
•^ stellen in einen Vektor inseriert. Derartige Methoden sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise aus den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al . (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley
20 and Sons oder D.M. Glover et al . , DNA Cloning Vol.l, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9) • entnommen werden. Weitere vorteilhafte Vektoren sind die Pichia pastoris Vektoren pPic und pGap. Diese Hefe ist auch ein geeigneter Wirtsorganismus für die Proteinexpression. 5
Die erfindungsgemäßen Proteinfragmente eignen sich zur Herstellung von Fusionsproteinen, die mit Hilfe der Proteinfragmente leicht, kostengünstig und effizient aufgereinigt werden können. Die erfindungsgemäßen Proteinfragmente und Fusionsproteine können 0 so vorteilhafterweise sehr selektiv in guten Ausbeuten, mit hoher Reinheit gereinigt werden. Die erfindungsgemäßen Proteinfragmente und damit die aus ihnen hergestellten Fusionsproteine zeichnen sich vorteilhaft durch eine im Vergleich zur Helicobacter pilori ATPase-439 Sequenz um mindestens 1,5 fach stärkere Bindung an die ^ immobilisierten Metallionen aus.
Zur Herstellung der Fusionsproteine sind prinzipiell- alle Proteine geeignet. Bevorzugt werden Proteine verwendet, die eine biologische Wirkung in Mensch, Tier oder Pflanze zeigen oder die 0 für organische Synthese interessant sind. Hierbei handelt es sich beispielsweise um Proteine wie Enzyme, Hormone, Speicher- oder Bindungs- oder Transportproteine. Beispielhaft seien Proteine wie Hydrolasen wie Lipasen, Esterasen, Amidasen, Nitrilasen, Proteasen, Mediatoren wie Cytokine z.B. Lymphokine wie MIF, MAF, TNF, 5 Interleukine wie Interleukin 1, Interferone wie γ-Interferon, tPA, Hormone wie Proteohormone, Glykohormone, Oligo- oder Polypetid- hormone wie Vassopresεin, Endorphine, Endostatin, Angiostatin, Wachstumsfaktoren Erythropoietin, Transkriptionsfaktoren, Integrine wie GPIIb/IIIa oder Ovßlll, Rezeptoren wie die verschiedenen Glutamatrezeptoren, Angiogenesefaktoren wie Angio- tensin genannt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung von Fusionsproteinen ermöglicht beispielsweise die Reinigung von Proteinen aus natürlichen Quellen wie Pflanzen- oder Tierextrakten, Pflanzen- oder Tierzell-Lysaten, aus Kulturmedien, Fermentationsbrühen oder aus Synthesebrühen um nur einige beispielhaft zu nennen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt folgende Reaktionsschritte:
a) Die Flüssigkeit (en) , die das Fusionsprotein enthalten, werden so mit immobilisierten Metallionen in Kontakt gebracht, daß sich zwischen den Metallionen und dem Fusionsprotein eine Affinitätsbindung ausbilden kann,
b) Entfernen nicht gebundener in der Flüssigkeit enthaltener Substanzen,
c) Eluieren des gebundenen Fusionsproteins, in dem die Affinitätsbindung durch Änderung des Flüssigkeitsmileus aufgehoben wird und
d) Sammlung des gereinigten Fusionsprotein.
Vorteilhaft wird das Fusionsprotein in einem geeigneten Wirtsorganismus (siehe oben) vor der Reinigung exprimiert um die Aus- beute an Fusionsprotein zu erhöhen. Der Wirtsorganismus wird in einem geeignetem synthetischen oder komplexen Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und gegebenenfalls anorganische Salze, Vitamine und Spurenelemente enthält, bei geeigneter Temperatur und Belüftung angezogen.
Je nach dem ob das Fusionsprotein aus den Zellen exkretiert wird oder nicht, werden die Zellen zunächst aufgeschlossen und die Zellen oder Zelltrümmer vorteilhafterweise abgetrennt. Für den Zellaufschluß werden dem Fachmann bekannte Methoden verwendet wie Ultraschall, French press, Enzymaufschluß, osmotiseher Schock und andere mehr. Die Abtrennung der Zellen oder Zelltrümmer kann beispielsweise über Zentrifugation oder Filtration erfolgen. Eine Abtrennung der Zellen oder Zelltrümmer ist jedoch nicht zwingend erforderlich. Die die Fusionsproteine enthaltende Flüssigkeit wird anschließend mit den immobilisierten Metallionen in Kontakt gebracht, so daß sich eine Affinitätsbindung zwischen dem Fusionsprotein und den Metallionen ausbilden kann. Die Bindung erfolgt bei pH-Werten größer 7, beispielsweise vorteilhaft bei pH 7,0 bis 9,0 bevorzugt zwischen pH 7,5 bis 8,0. Vorteilhafte Puffer sind einzelne Puffer oder Puffergemische wie beispielsweise 50 bis 1000 mM Puffer wie 50 mM Tris/HCl pH 8,0 + 150 mM NaCl, 100 mM NaAcetat pH 7,7 + 500 mM NaCl, 20 mM NaPhosphat pH 7 , 7 + 500 mM NaCl oder 50 mM Tris/HCl pH8,0 + 150 mM NH4CI . Diese Puffer ermöglichen ein Auftragen der Fusionsproteine auf die immobilisierten Metallionen. Im einfachsten besonders vorteilhaften Fall werden die Fusionsproteine direkt im zum Aufschluß verwendeten Puffer oder im Inkubationsmedium mit den immobilisierten Metallionen in Kontakt gebracht. Vorteilhafterweise werden die Flüssigkeiten und die immobilisierten Metallionen in einer üblichen Chromatographiesäule miteinander in Kontakt gebracht. Dies erleichtert das Entfernen nicht gebundener Substanzen beispielsweise Proteine durch Waschen der Säule mit einem geeigneten Puffer. Geeignete Puffer sind Puffer, die die Bindung der erfindungsgemäßen Proteinfragmente oder der Fusionsproteine an die Metallionen nicht stören und Verunreinigungen entfernen können. Solche Puffer haben vorzugsweise einen pH-Wert größer pH7 , vorteilhaft einen pH-Wert zwischen pH 7,0 bis 9,0, bevorzugt zwischen pH 7 , 5 bis 8,0. Auch batch-Ansätze, bei denen die immobilisierten Metallionen in einem Gefäß vorgelegt werden und die Flüssigkeiten anschließend zugesetzt werden oder umgekehrt, können so gereinigt werden. Für diese batch-Ansätze können die genannten Puffer verwendet werden. Zwischen den einzelnen Waschschritten werden die Ansätze vorteil- hafterweise zentrifugiert oder filtriert.
Für die Immobilisierung der Metallionen eignen sich prinzipiell alle üblichen Trägermaterialen, die sich leicht derivatisieren lassen, keine oder nur geringe unspezifische Adsorption auf- weisen, gute physikalische, mechanische und chemische Stabilität aufweisen und eine hohe äußere und innere Oberfläche aufweisen. Geeignete Materialien sind beispielsweise käuflich erwerbbar von Pharmacia LKB, Schweden (Sepharose™6B oder Superose™) , Pierce, USA (immobilisierte Iminodiessigsäure I oder II, immobilisiertes Tris (carboxymethyl)ethylendiamin) , Sigma, USA (immobilisierte Imminodiessigsäureagarose) , Boehringer Mannheim, Deutschland (Zinkchelatagarose) oder Toyo Soda, Japan (TSKgel Chelate-5PW) . In EP-B-0 253 303 werden weitere geeignete Materialien beschrieben. Weitere geeignete vorteilhafte Materialien sind Materialien wie Ni-beschichtete Mikrotiterplatten (Nickel-chelate coated Flashplate®, Nen life science products) oder Magnetpartikel oder speziell mit Metallionen behandelte und bindende Membranen.
Die verschiedenen Metallionen werden in geeigneten Materialien vorteilhaft über Gruppen wie IDA (= Imminodiessigsäure) , NTA ( = Nitrilotriessigsäure) oder TED (= Tris (carboxymethyl) ethylen- diamin gebunden. Geeignete Metallionen sind Co, Cu, Fe, Ca, Mg, Ni, AI, Cd, Hg oder Zn, bevorzugt werden Fe, Ni oder Cu, besonders bevorzugt Ni oder Cu, ganz besonders bevorzugt Ni . Die Beladung der Materialien mit Metallionen erfolgt vorteilhaft mit 0,1 bis 0,4 M Lösungen der Metallsalze in wäßriger, ungepufferter Lösung .
Nach dem Waschen wird das Fusionsprotein mit einem geeigneten Puffer eluiert. Dieser Puffer hebt die Affinitätsbindung zwischen dem Fusionsprotein und den immobilisierten Metallionen auf. Die Fusionsproteine können über einen pH-Gradienten (niedrige pH- Werte < pH 7,0 wirken eluierend) , kompetitive Liganden wie Imidazol, organische Lösungsmittel wie Aceton oder Ethanol, chelatisierende Agentien wie EDTA oder NTA und/oder Detergentien wie Tween 80 eluiert werden. Bevorzugt wird eine Elution über kompetitive Liganden wie Imidazol und/oder Detergentien. Imidazol wird in einem Bereich von 0,05 bis 0,7 M, bevorzugt von 0,1 bis 0,5 M zur Elution verwendet. Die kompetitiven Liganden und/oder Detergentien werden vorteilhaft in einem Puffer eingesetzt, aber auch die Verwendung in Wasser ist möglich. Vorteilhafte Puffer sind Puffer, die den Puffern entsprechen, die für das Auftragen auf die immobilisierten Metallionen verwendet wurden. Dies hat den Vorteil, daß keine unerwünschten Wechselwirkungen zwischen dem Säulenmaterial, den gebundenen Proteinen und dem Puffer auftreten. Vorteilhafte Puffer haben vorzugsweise einen pH-Wert größer pH7, vorteilhaft einen pH-Wert zwischen pH 7 , 0 bis 9,0, bevorzugt zwischen pH 7,5 bis 8,0. Bevorzugt werden diese Puffer über einen steigenden Gradienten aufgebracht. Im Falle, daß mit einem pH-Gradient eluiert wird, können Puffer mit einem pH-Wert kleiner pH 7,0 und/oder Säuren verwendet werden. Das eluierte Fusionsprotein wird gesammelt und kann' sofort verwendet werden, oder aber falls erforderlich und gewünscht weiter behandelt werden. Geeignete Auftrags- und Elutionspuffer sind beispiels- weise dem Lehrbuch Protein Purification (Eds. J.C. Janson, L.
Ryden, VCH Publisher Inc., 1989, Seite 227 bis 251) zu entnehmen.
Das erfindungsgemäße Proteinfragment kann mit den oben beschriebenen Methoden wie Bromcyan- oder Proteasespaltung entfernt werden. Hierbei können Reste des Proteinfragments im Molekül enthalten bleiben oder aber total aus dem zu reinigenden Protein abgespalten werden. Vorteilhaft wird das Proteinfragment rückstandslos aus dem Protein entfernt.
Vorteilhaft geeignete Proteinfragemente für die Herstellung von Fusionsproteinen lassen sich durch folgendes erfindungsgemäße Verfahren screenen. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinfragmenten, die in der Lage sind mit immobilisierten Metallionen eine reversible Affinitätsbindung einzugehen, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
a) Herstellung einer Nukleinsäurebibliothek ausgehend von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die für ein Proteinfragment der Sequenz
His-X1-His-X2-X3-X4-Cys-X5-X6-Cys,
kodiert, wobei die Histidin- und Cysteinreste der Sequenz in der Nukleinsäurebibliothek konserviert werden,
b) Fusion der Nukleinsäuren der Bibliothek an ein Reportergen, das die Detektion des durch die erhaltene Nukleinsäure kodierten Fusionsproteins über seine Bindung an die immobilisierten Metallionen ermöglicht und
c) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die eine gegenüber der in der natürlichen Helicobacter pilori ATPase-439 Sequenz um mindestens 1,5 fach stärkere reversible Bindung an die immobilisierten Metallionen aufweisen.
Die Nukleinsäurebibliothek ausgehend von der oben genannten Sequenz läßt sich über dem Fachmann bekannte Methoden zur Mutagenese erstellen. Hierzu kann die Sequenz beispielsweise einer "site directed mutagenesis" unterzogen werden wie sie in D.M. Glover et al . , DNA Cloning Vol.l, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), Kapitel 6, Seite 193 ff beschrieben wird.
Von Spee et al . (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777 - 778) wird eine PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese beschrieben.
Die Verwendung einer "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution wird von Stemmer (Proc. Natl . Acad. Sei. USA, Vol. 91, 1994: 10747 - 10751) beschrieben. Von Moore et al . (Nature Biotechnology Vol. 14, 19-96: 458 - 467) wird die Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode beschrieben.
5 Die Verwendung einer "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution wird von Stemmer (Proc. Natl . Acad. Sei. USA, Vol. 91, 1994: 10747 - 10751) beschrieben. Auch die Kombination der beiden Methoden kann verwendet werden.
10 Die Verwendung von Mutationsstämmen mit Defekten im DNA- Reparatursystem wird von Bornscheuer et al . (Strategies, 11, 1998: 16 - 17) beschrieben. Von Rellos et al . wird eine PCR- Methode unter Verwendung von nichtäquimolaren Nucleotidmengen (Protein Expression and Purification, 5, 1994: 270 - 277)
.je beschrieben.
Vorteilhaft läßt sich die Nukleinsäurebibliothek über eine PCR- Technik mit Hilfe zweier komplementärer, degenerierter Oligo- nukleotide (= sog. wobble-primer) , wie in den Beispielen beschrieben, erzeugen. Wichtig ist, daß die in der Sequenz ent¬
20 haltenen Histidin- und Cysteinreste konserviert werden.
Zum Screening auf Proteinfragmente mit einer verbesserten Metallbindungsaffinität wird das erfindungsgemäße Nukleinsäurefragment., das für das Proteinfragment kodiert, an ein Reportergen fusio¬
25 niert. Vorteilhafte Reportergene ermöglichen eine leichte Detek- tion der Bindung an die immobilisierten Metallionen über beispielsweise eine Bindung von mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörpern, die gegen das Reportergen gerichtet sind, oder über selbst fluoreszierende Proteine wie das vorteilhafte
30 bevorzugte egf-Protein von E. coli (= green fluorescent protein, siehe Prasher et al . , Gene 111 (2), 1992: 229 - 233) oder das bevorzugte Biolumineszenzprotein von Aequoria victoria oder über Licht generierende Proteine wie das Luzeferin/Luzeferase-System. Besonders bevorzugt wird ein gfp-Proteinmutante (= egfp =
3^ enhanced green fluorescence protein) mit einer 35fach höheren Fluoreszenzaktivität, die durch zwei Punktmutationen an Position 64 Austausch von Phe gegen Leu und Position 65 Austausch von Ser gegen Thr verursacht wird, verwendet. Diese Proteinmutante hat den Vorteil gegenüber dem Wildtypprotein, daß es löslich ist und
40 keine sog. "Inclusion Bodies" bildet. Die Verwendung des egfp- Proteins ermöglicht die Lokalisierung und Quantifizierung der Proteinkonzentration in jeder Phase der Reinigung der Proteine ohne Eingriff in die Reinigung und ohne Verwendung von weiterer Kofaktoren oder Substrate (Poppenborg et al., J. Biotechnol.,
45 58 (2), 1997, 77 - 88). Außerdem zeichnet sich das egfp-Protein durch eine hohe Stabilität gegenüber einem weiten pH-Bereich (pH 5,5 bis 12), Bleichung durch Photooxidation, oxidierende und schwach reduzierende Agentien wie 2% Mercaptoethanol aus. Das Protein zeigt eine Abnahme der Fluoreszenz oberhalb 37 °C. Ebenfalls geeignet als Reportergen sind das gfp-uv- (blue fluorescence) und das eyfp-(yellow fluorescence) Protein.
Die Auswahl der geeigneten Sequenzen erfolgt im Vergleich zur Bindungsaffinität an die immobilisierten Metallionen der folgenden natürlichen Helicobacter pilori ATPase-439 Sequenz His-Ile-His-Asn-Leu-Asp-Cys-Pro-Asp-Cys. Die erfindungsgemäßen Proteinfragmentsequenzen weisen eine um mindestens 1,5 fach stärkere reversible Bindung an die immobilisierten Metallionen auf, bevorzugt eine mindestens zweifach, besonders bevorzugt mindestens dreifach stärkere reversible Bindung auf. Vorteilhafte Sequenzen ermöglichen eine Proteinausbeute nach der Reinigung von mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt von mindestens 40%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 50%.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Screening der Nukleinsäurebibliothek eignet sich vorteilhaft für eine Automatisierung. Mit diesem Verfahren läßt sich einfach ein große Zahl von Nuklein- säurefragmenten bzw. Proteinfragmenten auf ihre Metallionenbin- dungsaffinität in einem sogenannten "High-Throughput-Screening" testen.
Mit den erfindungsgemäßen Proteinfragmenten lassen sich Proteine leicht detektieren. Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Detektion von Proteinen werden aus einer Proteinmischung einzelne Proteine, die ein Proteinfragment mit den erfindungsgemäßen oben genannten Proteinfragmenten enthalten, über Antikörper nachgewiesen, die gegen das Proteinfragment gerichtet sind. Der Nachweis dieser Fusionsproteine erfolgt vorteilhaft über mono- oder polyklonale Antikörper, die gegen das Proteinfragment (= Tag) gerichtet sind. Das Proteingemisch kann vorteilhaft vor dem Nachweis chromatographisch oder elektrophoretisch aufgetrennt werden und anschließend auf eine geeignete Membran (z.B. PVDF oder Nitrocellulose) mit üblichen Methoden (siehe Sambrook et al.) überführt (= geblottet) werden. Anschließend wird diese Membran mit dem gegen das Tag gerichteten Antikörper inkubiert. Vorteilhaft wird die Membran mehrmals gewaschen und danach die gebundenen Antikörper über eine spezifische Reaktion mit einem beispielsweise Enzymkonjugierten (z.B. alkalische Phosphatase, Peroxidase etc.) zweiten Antikörper der gegen die konstante Region des ersten gerichtet ist in einem sog. Western- oder Immuno-Blot nachgewiesen. Entsprechende Antikörper sind im Handel erhältlich. Im Falle der Verwendung von Magnetpartikel kann auf das Waschen verzichtet werden, die mit Antikörpern beschichteten Magnetpartikel können über das Fischen mit Magneten gereinigt werden. Die erfindungsgemäßen Proteinfragmente haben gegenüber den üblichen His-Tags bei der Proteindetektion den Vorteil, daß sie eine stärkere antigene Wirkung besitzen und so leichter zur Herstellung von Antikörpern gegen das Tag geeignet sind.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht .
Beispiele:
Für die Bindungstest an Metallchelatsäulen (= immobilisierte Metallionen) wurde die sog. "Chelating Sepharose Fast-Flow" von Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden verwendet. Ampicillin, Imidazol, EDTA und alle weiteren Reagentien wurden von Fluka (Buchs, Schweiz) bezogen. Das verwendete DNA Gel-Extraktions-Kit, das Midi Plasmid-Kit und das Prepspin Plasmid Kit stammten von Qiagen (Hilden, Deutschland), die Restriktionsenzyme, die DNA- modifizier nden Enzyme, die T4-DNA-Ligase und die Taq-Polymerase stammten von MBI Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland). Der Taq Dye Cycle Sequeneing Kit wurde von Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland) bezogen.
Für die Klonierungsversuche wurde der E. coli Stamm DH5α (F~ endAl hsdR17 [rk-, mk+] supE44 thil λgyrA96 relAl Δ (argF laczya) U169) verwendet. Die Plasmide, die das Gen für das egf-Protein enthielten, wurden von Clonetech USA bezogen. Die E. coli Stämme wurden bei 37 °C in Luria-Bertani Medium (= LB) mit 100 μg/ml Ampicillin zur Selektion der Klone auf Transformation mit dem egfp-Vektor angezogen. Der Lysepuffer enthielt 50 mM NaPhosphat- puffer pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mg/ml Lysozym und 1 mM PMSF (= Phenylmethansulfonylflourid = spez. Trypsin- und Chymotrypsin- Inhibitor) .
Die DNA-Methoden wie Ligationen, Restriktionen, PCR oder Transformationen etc. wurden wie bei Sambrook, J. et al . (1989) Mole- cular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press oder F.M. Ausubel et al . (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons beschrieben durchgeführt. Für die Sequenzierung wurde die Fluoreszenzmarkierte Dideoxy-DNA- Sequenzierungsmethode verwendet. Die DNA-Sequenzierung wurde mit dem Taq Dye Deoxy™ Cycle Sequeneing Kit (Applied Biosystems) und dem 373A DNA Sequeneing System (Applied Biosystems) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Beispiel 1: Herstellung zufällig mutagenisierter N-terminaler
Metallbindungsstellen, die an das egfp-Gen gebundenen wurden, und des his6-egfp
Für die PCR-Reaktion wurde das Plasmid egfp und die zwei folgenden komplementäre Oligonukleotide
5 ' -GCAATACCATGGGGCATNNNCATNNNNNNNNNTGTNNNNNNTGTGTGAGGAAGGGCGAG-3 '
5 ' -CAGTTGGAATTCTAGAG-3 '
verwendet. Im Falle des his6-egfp wurden die folgenden zwei komplementären Primer
5 ' -GCAATACCATGGGGCATCATCATCATCATCATGTGAGGAAGGGCGAG-3 '
5 ' -CAGTTGGAATTCTAGAG-3 '
verwendet.
Die für die PCR-Reaktionen verwendeten Bedingungen waren wie folgt:
Ansatz: 8 μl dNTP Mix (200 μ ol) 10 μl 10 x ThermoPolPuffer (New England Biolabs)
1 μl (100 pmol) Primer1
1 μl (100 pmol) Primer2
1 μl (100 ng) egfp Plasmid
79, 5 μl Wasser
1 μl Deep Vent Polymerase (New England Biolabs)
PCR-Programm 95 °C 7min 95 °C 1min 56 °C 1min 30x 72 °C 3min 72 °C 7min
Die PCR-Produkte wurden jeweils mit Ncol und Notl verdaut und in den egfp-Vektor, der mit den gleichen Enzymen verdaut worden war, um Mutationen im Vektor auszuschließen legiert (siehe Figur 1) . Die PCR-Vektorligationen wurden zur Transformation von E. coli verwendet. Die Transformanden wurden auf LB-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin plattiert und bei 37 °C inkubiert. Beispiel 2: Kultivierungsbedingungen und Herstellung der Zell- Lysate
Transformierte Kolonien, die Fluoreszenz und einige die keine Fluoreszenz zeigten, wurden ausgewählt und in 50 ml LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, angezogen. Für das High- Throughput-Screening wurden Kolonien ausgewählt, die Fluoreszenz zeigten, und in sterilen Mikrotiterplatten, die 250 μl LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin enthielten, inkubiert. Nach Inkubation wurden die Kulturen zentrifugiert. Die Pellets wurden in 2 ml Lysepuffer resuspendiert, 20 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend mit Ultraschall aufgeschlossen (zweimal, 5 Minuten mit einem Branson Sonifier 250). Nach Zentrifugation (15 min, 4 C, 20000 x g) wurden die verschiedenen egfp-Mutanten im Überstand erhalten. Alle ausgewählten Klone wurden sequenziert (siehe Tabelle I und II). Klone, die keine Fluoreszenz zeigten, enthielten Stopcodons in der Sequenz, so daß keine funktionellen Proteine exprimiert wurden (siehe Tabelle I, A8, A13 , M16a, Z4, ZU und Z13). In allen Versuchen wurde zur Quantifizierung der gebundenen Proteine eine Fluoreszenzmessung durchgeführt, die in einem weiten Bereich mit der gfp-Konzentration korrelierte (siehe Figur 2) .
Beispiel 3 : Low-Throughput-Screening mit Ni-NTA-Säulen von Quiagen
600 μl der lysierten Zellen wurden auf eine Ni-NTA-Säule aufgebracht, zweimal mit 600 μl einer Waschlösung (50 mM NaPhosphat- puffer, pH 8,0, 250 mM NaCl) gewaschen und anschließend mit einer 0,7 M Imidazollösung eluiert.
Beispiel 4: High-Throughput-Screening mit Membranfilterplatten
Für das High-Throughput-Screening wurden Me branfilter-Mikro- titerplatten (MultiScreen 5 μm; Fa. Millipore, Molsheim, Deutschland) verwendet. In jedes "Well" der Membranfilterplatten wurden je dreimal 250 μl einer gerührten Chelatsepharosesuspension gegeben. Nach jeder Zugabe wurde die Sepharose abzentrifugiert (2 min, 23 °C, 350 rpm) . Alle weiteren Schritte wurden in einem Beckmann Biomek 2000 Roboter durchgeführt. Die Minisäulen in den Wells wurden zweimal mit 250 μl Wasser gewaschen. Anschließend wurde die Sepharose mit mit 250 μl einer Metallsalzlösung beladen und dreimal mit 200 μl Puffer (50 mM NaPhosphat, pH 8,0, 250 mM NaCl) äquilibriert . Für die verschiedenen Ansätze (Beladung mit Metallionen) wurden je 0,3 M NiCl2-, 0,3 M CuS04- oder 0,3 M ZnC12-Lösungen verwendet. Es wurden wäßrige, ungepufferte Metallsalzlösungen verwendet. 200 μl der Zell-Lysatüberstände wurden auf jede dieser Minisäulen gegeben. Die Säulen wurden anschlie- ßend zweimal mit 250 μl Aquilibrierungspuffer gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden mit zweimal 100 μl 0,5 M Imidazol in Aquilibrierungspuffer eluiert. Die Chelatsepharose in den Filtern kann mit 250μl 50 mM EDTA, 1 M NaCl in Wasser regeneriert werden 5 und für weitere Screeningversuche verwendet werden.
Beispiel 5: IMAC-Versuche
Für den Versuch wurde ein üblicher Chromatographieaufbau aus 10 einer Glassäule, zwei peristaltischen Pumpen zum Aufbringen der Lösungen, einem UV-Detektor (LKBUV-MII), einem Drucker (LKB RIC 102) und einem Fraktionssammler (LKB FRAC-200) gewählt. Alle Geräte stammten von der Firma Pharmacia. Die Säule wurde mit chelatisierender Sepharose Fast-Flow Gel (Pharmacia) gefüllt, mit 15 7 Bettvolumen deinosiertem Wasser gewaschen und mit 7 Bettvolumen 0,3 M NiCl2-Lösung mit den Metallionen beladen. Anschließend wurde die Säule mit 7 Bettvolumen IMAC-Puffer (50 mM NaPhosphat, pH 8,0, 250 mM NaCl) gewaschen und ä uilibriert . 1 ml Proben der Zell-Lysate wurden auf die Säule mit einer Flußrate von _0 1,5 ml/min aufgebracht und mit 10 Bettvolumen IMAC-Puffer gewaschen. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgt über einen ansteigenden Gradienten mit 0,5% einer 0,5 M Imidazollösung pro ml Elutionslösung und schließlich 5 Bettvolumen einer 0,5 M Imidazol/Wasserlösung. Die Proteinfraktionen wurden über UV-
Detektion ermittelt und gesammelt. Nach Abschluß wurde die Säule 25 mit 50 mM EDTA/1 M NaCl-Lösung gewaschen und regeneriert. Dieser
Waschschritt löst das Metall, gebundene Zellreste und Proteine von der Säule. Die eluierten Fraktionen wurden sowohl optisch als auch spektroskopisch untersucht. Einige der untersuchten
Klone zeigten keine Affinität zur Matrix (siehe Tab.I, M15, M16)
30 während andere eine gute Bindung aufwiesen (siehe Tab.I, M13 ,
Z5 und Z7) . Die Klone M13 und Z5 eluierten in einer scharfen
Bande von der Säule, während der Klon Z7 auf der Säule schmierte.
Beispiel 6: Vergleichsversuch mit egfp-Wildtyp und his-tag 5
Der Klon Ml3 wurde in einem Vergleichsversuch mit dem egfp-Wild- typprotein und den üblichen his-tags verglichen. Das- egfp-Wild- typprotein bindet nicht an die Metallchelatsäulen. Nach dem Waschen der Säule war keine Fluoreszenz mehr auf der Säule ° detektierbar. Der Klon M13 bindet in einer scharfen Bande auf der Säule während die his-tag-Proteine über die gesamte Säule binden. Dies ist auf einer geringere Affinität zurückzuführen, die letztlich zu einer geringeren Kapazität der Säule führt. Die Proteinausbeute liegt im Falle von M13 mit 56% höher als 5 mit den his-tags mit 48%. Tabelle I: Bindungsversuche an Ni-Metallchelatsäulen
Figure imgf000022_0001
Die Klone A6 , AlO, M13 , Z5 und Z7 binden gut an die Metallchelat- säule, während die Klone M14, Ml5 und M16 keine Bindung zeigten.
Tabelle II: Weitere sequenzierte im High-Throughput-Screening durch Fluoreszenz aufgefallene Klone
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
Beispiel 7: Metallbindungsaffinität
Viele der Klone zeigten eine bevorzugte Bindung an Ni + oder Cu2+. im Falle von M13 konnte keine Bindung an Zn2+ beobachtet werden. Bei Verwendung von Ni-Chelatsäulen zeigt der Klon M13 eine deutlich bessere Reinigung der Proteine im Vergleich zu den his-tags. Diese führten umgekehrt bei Verwendung von Cu-Chelatsäulen zu einem reineren Produkt im Vergleich zu M13, wobei jedoch, da die Bindung an das Säulenmaterial in beiden Fällen sehr stark ist, durch die drastischen Elutionsbedingungen Cu-Ionen ausgewaschen wurden. Dies führt zu Produktverunreinigungen.
Beispiel 8: Vergleichsversuch zwischen Sequenz der ATPase-439 und erfindungsgemäßen Proteinfragmenten
Der Vergleichsklon der ATPase-439 wurde analog Beispiel 1 und 6 durchgeführt. Als Primer wurde folgender Primer
5'-GCAATACCATGGGGCATATTCATAATCTTGATTGTCCTGATTGT-3 ' verwendet. Die anderen Primer und die PCR-Bedingungen waren wie unter Beispiel 1 beschrieben.
Der Versuch wurde mit dem Quiagen Ni-NTA Spin Kit unter nativen Bedingungen durchgeführt, unter diesen Bedingungen wurde wie be- schrieben lysiert; die bereits fertig beladenen Säulen wurden mit 600 μl 50 mM Na-Phosphatpuffer, pH 8,0, 300 mM NaCl äquilibriert und 2 min bei 2000 rpm (= 420 x g) zentrifugier . Anschließend wurden 600 μl des Lysats aufgebracht und wie 2 min zentrifugiert. Mit je 600 μl 50 mM Na-Phosphatpuffer, pH 8,0, 300 mM NaCl wurde zweimal gewaschen. Danach wurde mit 600 μl 50 mM Na-Phosphatpuf- fer, pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 M Imidazol wurde zweimal eluiert. Die Ausbeute an reinem Protein war mit dem Klon M13 l,5fach höher als der Metallbindungstelle des Vergleichsklons der ATPase-439. Klon M13 bindet damit besser und läßt sich auch besser eluieren.

Claims

Patentansprüche
1. Peptidfragment mit der allgemeinen Sequenz
His-X1-His-X2-X3-X-Cys-X5-X6-Cys,
wobei die Variablen X1 bis X6 in der Sequenz die folgende Bedeutung haben:
χi = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Ala, Val, Phe, Ser, Met, Trp, Tyr, Asn, Asp oder Lys und die Variablen X2 bis X6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His oder
X2 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Val, Ile, Phe, Pro, Trp, Tyr, Gin, Glu oder Arg und die Variablen X1, X3 bis X6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His oder
X3 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ile, Thr, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His und die Variablen X1, X2, X4 bis X6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His oder
X4 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Val, Phe, Pro, Cys, Met, Trp, Asn, Glu, Arg oder His und die Variablen X1 bis X3, X5 ' X6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His oder
X5 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ser, Cys, Met, Trp, Asn, Glu, Lys oder Arg und die Variablen X1 bis X4, X6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His oder
Zeichn. χ6 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Phe, Pro, Ser, Cys, Trp, Tyr oder Gin und die Variablen X1 bis X5 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His und
wobei mindestens eine der Variablen X1 bis X6 in der Sequenz unabhängig voneinander Gin oder Asn bedeutet
2. Peptidfragment nach Anspruch 1, in der die Variablen X1 bis X6 die gemäß Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, wobei mindestens eine der Variablen X1 bis X6 in der Sequenz unabhängig voneinander Lys oder Arg bedeutet.
3. Peptidfragment nach Anspruch 1 oder 2, in der die Variablen X1 bis X6 in der Sequenz unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben:
X1 - eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Ala, Val, Phe, Ser, Met, Trp, Tyr, Asn, Asp oder Lys;
X2 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Val, Ile, Phe, Pro, Trp, Tyr, Gin, Glu oder Arg;
X3 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ile, Thr, Met, Trp, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg oder His;
X4 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Val, Phe, Pro,
Cys, Met, Trp, Asn, Glu, Arg oder His;
X5 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ser, Cys,
Met, Trp, Asn, Glu, Lys oder Arg;
X6 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Phe, Pro, Ser, Cys, Trp, Tyr oder Gin.
4. Peptidfragment nach den Ansprüchen 1 bis 3, in der die
Variablen X1 bis X6 in der Sequenz unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben:
X1 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Phe, Ser, Asn, Asp oder Lys;
X2 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Val, Ile, Phe, Pro, Gin, Glu oder Arg; X3 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ile, Thr, Met, Trp, Tyr, Asn, Asp, Glu, Arg oder His;
X4 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Val, Phe, Cys, Met, Trp, Asn, Arg oder His;
X5 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ser, Cys, Met, Asn, Glu, Lys oder Arg;
X6 = eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Phe, Ser, Cys, oder Tyr.
5. Peptidfragment nach den Ansprüchen 1 bis 4, in der die Variablen X1 bis X6 in der Sequenz unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben:
χl = Asn;
X2 = Gin, Glu oder Arg;
X3 = Gly, Thr oder Tyr;
X4 = Asn oder Arg;
X5 = Gly oder Lys;
X6 = Cys.
6. Peptidfragmente mit den Sequenzen
His-Gln-His-Glu-Gly-Arg-Cys-Lys-Glu-Cys
His-Asn-His-Arg-Tyr-Gly-Cys-Gly-Cys-Cys
His-Arg-His-Gly-Thr-Asn-Cys-Leu-Lys-Cys
His-Ile-His-Gln-Ser-Asn-Cys-Gln-Val-Cys.
7. Fusionsprotein enthaltend ein Proteinfragment gemäß den Ansprüchen 1 bis 6.
8. Nukleinsäurefragment kodierend für ein Proteinfragment gemäß den Ansprüchen 1 bis 6.
9. Nukleinsäuren enthaltend ein Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 8.
10. Nukleinsäuren kodierend für ein Fusionsprotein gemäß Anspruch 7.
11. Vektor enthaltend ein Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 8 oder 10.
12. Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 8 mit einem Gen, das für ein Protein kodiert, fusioniert.
13. Verfahren zur Reinigung von Fusionsproteinen gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) Flüssigkeiten, die das Fusionsprotein enthalten, so mit immobilisierten Metallionen in Kontakt bringt, daß sich zwischen den Metallionen und dem Fusionsprotein eine Affinitätsbindung ausbilden kann,
b) Entfernen nicht gebundener in der Flüssigkeit enthaltener Substanzen,
c) Eluieren des gebundenen Fusionsproteins, in dem die Affinitätsbindung durch Änderung des Flüssigkeits mileus aufgehoben wird und
d) Sammlung des gereinigten Fusionsprotein.
14. Verwendung eines Proteinfragments gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder eines Nukleinsäurefragments gemäß Anspruch 8 zur
Reinigung von Proteinen .
15. Verfahren zur Herstellung von Proteinfragmenten, die in der Lage sind mit immobilisierten Metallionen eine reversible Affinitätsbindung einzugehen, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
a) Herstellung einer Nukleinsäurebibliothek ausgehend von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die für ein Proteinfragment der Sequenz
His-X1-His-X2-X3-X4-Cys-X5-X6-Cys,
kodiert, wobei die Histidin- und Cysteinreste der Sequenz in der Nukleinsäurebibliothek konserviert werden, b) Fusion der Nukleinsäuren der Bibliothek an ein Reportergen, das die Detektion des durch die erhaltene Nuklein- säure kodierten Fusionsproteins über seine Bindung an die immobilisierten Metallionen ermöglicht und
c) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die eine gegenüber der in der natürlichen Helicobacter pilori ATPase-439 Sequenz um mindestens 1,5 fach stärkere reversible Bindung an die immobilisierten Metallionen aufweisen.
10
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, das als Reportergen das egf-Protein von Aequoria victoria verwendet wird.
15 17. Verfahren zur Detektion von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer Proteinmischung einzelne Proteine, die ein Proteinfragment gemäß Anspruch 1 enthalten, über Antikörper nachweist, die gegen das Proteinfragment gerichtet sind.
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Verwendung eines Proteinfragments gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder eines Nukleinsäurefragments gemäß Anspruch 8 zur Reinigung von Proteinen.
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