WO1999060025A1 - Anticorps recombines de gene - Google Patents

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WO1999060025A1
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Kenya Shitara
Mikito Ito
Yoko Kawada
Kazuyasu Nakamura
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Definitions

  • the present invention is useful for the diagnosis or treatment of diseases in which the disease state progresses due to abnormal angiogenesis, such as proliferation or metastasis of solid tumors, arthritis in rheumatoid arthritis, retinopathy of diabetes mellitus, retinopathy of prematurity and dryness.
  • abnormal angiogenesis such as proliferation or metastasis of solid tumors, arthritis in rheumatoid arthritis, retinopathy of diabetes mellitus, retinopathy of prematurity and dryness.
  • the present invention relates to a method for diagnosing solid tumors, rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity and xerosemia using antibodies, diagnostic agents and therapeutic agents.
  • Angiogenesis plays an important role in the development and tissue organization of vertebrate individuals, and also plays a role in the luteal formation, transient proliferation of the endometrium and placental formation in the sexual cycle of mature individuals (females). Is also closely involved. In addition, angiogenesis is involved in the pathogenesis or promotion of solid tumor growth or metastasis, diabetic retinopathy and rheumatoid arthritis [J. Biol. Ch, 267, 10931]. (1992)].
  • Angiogenesis is triggered by the secretion of angiogenic factors, which destroys the basement membrane and stroma by the secretion of proteases from endothelial cells of existing blood vessels in the vicinity of the secreted angiogenic factors, followed by migration of the endothelial cells [J. Biol. Chem., 267, 10931 (1992)]
  • the factors that induce lk vascularization include vascular endothelial cells
  • VPF vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VPF / VEGF vascular endothelial growth factor
  • the activity of VEGF has been reported so far on proliferation of vascular endothelial cells [Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, 851 (1989)], migration promotion activity [J. Immunology, 152, 4149 (1994)] ], Meta-oral protease secretion promoting activity [J. Cell.
  • VEGF is a growth factor with extremely high specificity for vascular endothelial cells [Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, 851 (1989)], and has a different molecular weight due to alternative splicing of mRNA 4 type has been reported that the protein is present [J. Biol. Chem., 67 , 26031 (1991)] 0
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • an anti-VEGF monoclonal antibody exhibits a tumor growth inhibitory effect [Nature, 362, 841 (1993)]. Further, it has been reported that an anti-VEGF monoclonal antibody can suppress cancer metastasis in a metastatic cancer model of a human tumor in nude mice [Cancer Research, 56, 921 (1996):]. High concentrations of VEGF are detected in human pleural effusions and ascites in humans, suggesting that it may be a major factor in pleural effusion and ascites retention. [Biochimica et Biophysica Acta, 1221, 211 (1994)].
  • angiogenesis In diabetic retinopathy, abnormal angiogenesis causes retinal detachment and vitreous hemorrhage leading to blindness, but it has been reported that angiogenesis in diabetic retinopathy and VEGF levels in the patient's eye are positively correlated [ New England J. Medicine, 331, 1480 (1994)]. In addition, it has been reported that angiogenesis is suppressed when VEGF activity is suppressed by intraocular administration of an anti-VEGF neutralizing monoclonal antibody in a monkey retinopathy model [Arch
  • Fit-1 ftns-like tyrosine kinase belonging to the receptor tyrosine kinase family [Oncogene, 5, 519 (1990); Science, 255, 989 (1992)] and kinase insert domain-containing receptor (KDR) [W092 / 14748; Proc. Natl. Acad. Science USA, 88, 9026 (1991); Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 1579 (1992) ); W094 / 11499] has been reported.
  • Fit-1 and KDR are membrane proteins with a molecular weight of 180-200 kilodaltons, having an extracellular region consisting of seven immunoglobulin-like sites and an intracellular region consisting of tyrosine kinase sites. It has been reported that VEGF specifically binds to Fit-1 and KDR at Kd values of 20 pM and 75 pM, and that Flt-1 and KDR are specifically expressed in vascular endothelial cells [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7533 (1993); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8915 (1993)].
  • Flt-1 Flt-1 in various diseases has been described in tumor vascular endothelial cells of human glioplastoma tissue [Nature, 359, 845 (1992)] and tumor vascular endothelial cells of human gastrointestinal cancer tissue [Cancer Research, 53, 4727 (1993)], it is reported that the expression of flt-1 mRNA is higher than that of vascular endothelial cells in normal tissues. Furthermore, it has been reported that the expression of flt-1 mRNA is also observed in vascular endothelial cells of the joints of patients with rheumatoid arthritis by in situ hybridization (in situ hybridization) [J.
  • Fit-1 has been reported to bind VEGF and autophosphorylate the intracellular domain [Science, 255, 989 (1992)], but its detailed function is unknown.
  • flt-1 knockout mice in which the flt-1 gene has been disrupted have an abnormal vascular structure due to abnormal vascular endothelial cell morphology in the early formation of blood islands and subsequent angiogenesis, resulting in embryonic 8.5-9.5 day old
  • Fit-1 plays an essential function in vascular endothelial cell tube formation during angiogenesis [Nature, 376, 66 (1995)].
  • antibodies that bind to the VEGF receptor Fit-1 and have neutralizing activity against Flt-1 include solid tumor growth or metastasis, arthritis in rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, and retinopathy of prematurity. It is expected to be useful for diagnosis and treatment of diseases in which the disease state progresses due to abnormal angiogenesis such as desiccation.
  • a monoclonal antibody derived from a non-human animal can be converted to a human chimeric antibody or a human CDR (complementary
  • Human chimeric antibodies are antibodies in which the antibody variable region (hereinafter, referred to as V region) is derived from a non-human animal antibody and the antibody constant region (hereinafter, referred to as C region) is derived from a human antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851 (1984)], when administered to humans, it was reported that antibodies to monoclonal antibodies derived from non-human animals were hardly elicited, and the half-life in blood was increased by 6 times. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220 (1989)].
  • V region antibody variable region
  • C region antibody constant region
  • the human-type CDR-grafted antibody converts human antibody CDRs to antibodies derived from non-human animals. [Nature, 32 ⁇ , 522 (1986)], which has reduced immunogenicity and increased blood half-life by 4 to 5 times compared to mouse antibodies in monkey experiments. Have been reported [J. Immunol., 147, 1352 (1991)].
  • chimeric antibodies and humanized antibodies that specifically bind to the human VEGF receptor Fit-1 have side effects due to the absence of antibodies to monoclonal antibodies derived from non-human animals when administered to humans.
  • Diseases that progress due to abnormal angiogenesis such as proliferation or metastasis of solid tumors, arthritis in rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, and dryness due to a decrease and prolonged blood half-life High therapeutic effects are expected.
  • single-chain antibodies and disulfide-stabilized antibodies that specifically bind to the human VEGF receptor Fit-1 can be used for the growth or metastasis of solid tumors, arthritis in rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, and retinopathy of prematurity. It is expected to have a high diagnostic and therapeutic effect on diseases in which the disease state progresses due to abnormal angiogenesis such as freshness.
  • the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody can detect and suppress angiogenesis sites, and is expected to be useful for diagnosis and treatment of diseases in which the disease progresses due to abnormal angiogenesis as described above.
  • the present invention relates to the following (1) to (68).
  • the recombinant antibody of the present invention is obtained by genetically modifying the monoclonal antibody of the present invention. It has been modified using technology.
  • Recombinant antibodies include humanized antibodies and antibodies produced by genetic recombination, such as antibody fragments such as single chain antibodies and disulfide stabilized antibodies.
  • those that have the characteristics of a monoclonal antibody, have low antigenicity, and have an extended half-life in blood are preferred as therapeutic agents.
  • the humanized antibody in the present invention includes a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody.
  • the antibody fragment of the present invention is an antibody fragment that specifically reacts with the human VEGF receptor Fit-1, Fragment of antigen binding (abbreviated as Fab), Fab, F (ab,) 2 , single-chain antibody ( single chain Fv; hereinafter abbreviated as scFv) and disulfide stabilized Fv (hereinafter abbreviated as dsFv).
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • the human chimeric antibody is composed of an antibody non-human animal heavy chain variable region (hereinafter, the heavy chain is referred to as H chain, the variable region is referred to as HV or VH as V region) and a light chain variable region (hereinafter, light chain is referred to as L
  • H chain an antibody non-human animal heavy chain variable region
  • HV or VH variable region
  • L light chain variable region
  • An antibody consisting of a constant chain hereinafter also referred to as CH as a C region
  • a light chain constant region of a human antibody hereinafter also referred to as CL).
  • the human chimeric antibody of the present invention obtains cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically reacts with human VEGF receptor Flt-1, and obtains human antibody CH and human antibody
  • a human-type chimeric antibody expression vector can be constructed by inserting each into an expression vector for animal cells having a gene encoding CL, and can be expressed and produced by introducing the vector into animal cells.
  • any of the I Takeno globulin (hereinafter abbreviated as ig) by even those belonging to the class les, but, IgG type, more belong to IgG-type IgGl, IgG2, I g
  • the C region of immunoglobulin such as G3 and IgG4 is preferred.
  • the human CDR-grafted antibody means an antibody in which the CDRs of VH and VL of a human antibody have been substituted with the CDR sequences of antibodies of a non-human animal, respectively.
  • the human-type CDR-grafted antibody of the present invention comprises a VH and VL CDR sequence of any human antibody, which is a VH and VL CDR sequence of an antibody of a non-human animal, which specifically reacts with human VEGF receptor Flt_l.
  • CDNAs encoding the respective substituted V regions were constructed, and inserted into animal cell expression vectors having genes encoding human antibody CH and human antibody CL, respectively, to construct human CDR-grafted antibody expression vectors. It can be produced by introducing it into animal cells and expressing it.
  • the structure of the human CDR-grafted antibody C region of the present invention may be any one of the immunoglobulin (lg) classes, such as IgG, IgGl, lgG2, IgG3, IgG4, etc.
  • the C region of the globulin is preferred.
  • the antibody VH CDR1S of the humanized antibody comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 5, 6 and 7, or the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 11, 12 and 13.
  • Human chimera antibody power The human chimera according to (8) above, comprising VH and VL of monoclonal antibodies specifically reacting with the human VEGF receptor Fit-1, and CH and CL of human antibodies. antibody.
  • VH and V amino acid sequence is a monoclonal antibody selected from monoclonal antibody KM1732 (FERM BP-5698) or monoclonal antibody KM1750 (FERM BP-5700)
  • the human chimeric antibody according to the above (11) which has the same amino acid sequence as that of VH and V.
  • the human chimeric antibody according to (11) above, wherein the human chimeric antibody specifically reacting with human VEGF receptor Fit-1 is selected from KM2532 and KM2550.
  • the human VL CDR of the human CDR-grafted antibody which has the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 8, 9 and 10 or the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 14, 15 and 16; G type CDR-grafted antibody.
  • the transformant described in (32) is cultured in a medium, and the human CDR-grafted antibody described in (22) to (29) is produced and accumulated in the culture, and the antibody is isolated from the culture.
  • a method for producing an antibody which comprises collecting the antibody.
  • the antibody according to the above (6) wherein the antibody fragment is any one selected from the group consisting of Fab, Fab ', F (ab') 2 , a single-chain antibody and a disulfide-stabilized Fv.
  • Fab is obtained by degrading the peptide part above two disulfide bonds that bridges two H chains in the hinge region of IgG with the enzyme papain. This fragment is composed of the body and has an antigen-binding activity with a molecular weight of about 50,000.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating an antibody specifically reacting with the human VEGF receptor Fit-1 with papain.
  • Fab encoding can be produced by inserting a DNA encoding the Fab fragment of the antibody into an expression vector for animal cells and introducing the vector into animal cells for expression.
  • Fab is a fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity in which the disulfide bond between the hinges of F (ab,) 2 is cleaved.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating an antibody that specifically reacts with the human VEGP receptor Fit-1 with a reducing agent dithiothreitol.
  • Fabs can be produced by inserting a DNA encoding the Fab or fragment of the antibody into an expression vector for animal cells and introducing the vector into animal cells for expression.
  • F (ab ') 2 is obtained by degrading the lower part of two disulphide bonds in the hinge region of IgG with the enzyme trypsin. Which is a fragment having an antigen-binding activity.
  • the F (ab,) 2 of the present invention can be obtained by trypsinizing an antibody that specifically reacts with the human VEGF receptor Fit-1.
  • DNA encoding the F (ab,) 2 fragment of the antibody is inserted into an expression vector for animal cells, and the vector is expressed by introducing the vector into animal cells to produce F (ab ') 2.
  • a single-chain antibody (hereinafter, also referred to as scFv) is obtained by linking one VH and one VL with an appropriate peptide linker (hereinafter, referred to as P), and is composed of VH—P—VL or VL—P — Indicates VH polypeptide.
  • VH and VL contained in the scFv used in the present invention either the monoclonal antibody of the present invention or the human CDR-grafted antibody can be used.
  • cDNAs encoding VH and VL were obtained from a hybridoma producing an antibody that specifically reacts with human VEGF receptor Fit-1, and a single-chain antibody expression vector was constructed. Thereafter, the cDNA can be introduced into the expression vector and expressed by introducing the expression vector into Escherichia coli, yeast, or animal cells to produce the cDNA.
  • a disulfide-stabilized antibody (hereinafter, also referred to as dsFv) refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL has been substituted with a cysteine residue via a disulfide bond.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue was determined by the method described by Reiter et al. According to [Protein Engineering, 7, 697 (1994)], selection can be made based on prediction of the three-dimensional structure of the antibody.
  • the VH or VL contained in the disulfide stabilized antibody of the present invention either a monoclonal antibody or a human CDR-grafted antibody can be used.
  • the disulfide-stabilized antibody of the present invention obtains cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing an antibody that specifically reacts with human VEGF receptor Fit-1, and inserts the cDNAs into an appropriate expression vector. Alternatively, it can be produced by introducing the expression vector into Escherichia coli, yeast, or animal cells for expression.
  • the amino acid sequence of the CDRs of VH and VL of the main chain antibody has the same amino acid sequence as that of the CDRs of VH and VL of the monoclonal antibody that specifically reacts with human VEGF receptor Fit-1;
  • the amino acid sequence of the CDR of VH or VL of the main chain antibody contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, 6, or 7 as the CDR of VH, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 9, or 10 (37) above.
  • VH and VL CDR amino acid sequence power of a single-chain antibody The amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, 12 and 13 is included as a VH CDR, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 15 and 16 is VL
  • amino acid sequence of VH of the chain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91 or SEQ ID NO: 95
  • amino acid sequence of VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94 or SEQ ID NO: 96
  • the amino acid sequence of VH and VL of the disulfide-stabilized antibody has the same amino acid sequence as the amino acid sequence of VH and VL of the monoclonal antibody that specifically reacts with the human VEGF receptor Fit-1 (44). )).
  • the amino acid sequence of the VH and VL CDRs of the disulfide-stabilized antibody has the same amino acid sequence as the VH and VL CDRs of the monoclonal antibody that specifically reacts with human VEGF receptor Fit-1. And the disulfide-stabilized antibody according to (44).
  • the amino acid sequence of CDRs of VH and VL of a disulfide-stabilized antibody contains the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 5, 6, and 7 as a CDR of VH, and the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 8, 9, and 10 is VL.
  • the amino acid sequence of the CDRs of VH and VL of the disulfide-stabilized antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, 12, and 13 as the CDR of VH, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 15, and 16 to VL
  • the amino acid sequence of VH of the disulfide-stabilized antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91 or SEQ ID NO: 95, and the amino acid sequence of VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, or SEQ ID NO: 96,
  • a peptide comprising an amino acid sequence selected from CDRs of the H chain V region and L chain V region of a recombinant antibody specifically reacting with the human VEGF receptor Fit-1 described in (1) above; .
  • a fusion antibody in which the antibody or peptide described in any of (1) to (55) above is chemically or genetically engineered with a radioisotope, protein, or low-molecular-weight drug; or An antibody or peptide that is a fusion peptide.
  • a fusion antibody or fusion peptide refers to an antibody or peptide obtained by chemically or genetically binding a radioisotope, a protein, a low-molecular-weight drug, or the like to the above-described antibody or peptide.
  • the fusion antibody or fusion peptide of the present invention can be produced by chemically binding an antibody or peptide that specifically reacts with human VEGF receptor Flt-1 with a radioisotope, protein, or low-molecular-weight drug. it can.
  • a cDNA encoding the protein is ligated to a cDNA encoding the antibody or peptide, inserted into an appropriate expression vector, and the expression vector is transformed into E. coli, yeast, or animal. It can be produced by expressing it in cells.
  • Low molecular drugs include alkylating agents such as nitrogen mustard and cyclophosphamide, antimetabolites such as 5-fluorouracil and methotrexate, antibiotics such as mitomycin C and daunorubicin, and plant alkaloids such as vincristine and vinblastine.
  • Ta Anticancer drugs such as hormones such as moxifuyun and dexamethasone [clinical oncology (Japan Clinical Tumor Study Group, 1996, Cancer and Chemotherapy)], or nonsteroidal drugs such as noid oral cortisone and prednisone, aspirin and indomethacin.
  • Immunomodulators such as steroids, gold thiomalate, and penicillamine; immunosuppressants such as cyclophosphamide and azathioprine; anti-inflammatory drugs such as antihistamines such as chlorpheniramine maleate and clemacitin [Inflammation and anti-inflammatory therapy Showa 57 Year Medical and Dental Publishing Co., Ltd.].
  • a human VEGF receptor Flt-1 A method for immunologically quantifying cells that have expressed on the cell surface.
  • An angiogenesis abnormality comprising, as an active ingredient, the antibody or peptide described in any one of (1) to (17), (22) to (29), and (34) to (56). Diagnostic agent for diseases whose disease state progresses due to
  • Solid tumors include breast cancer, prostate cancer, colon cancer, stomach cancer, lung cancer and the like.
  • Angiogenesis comprising, as an active ingredient, the antibody or peptide described in any one of (1) to (17), (22) to (29), and (34) to (56).
  • the following shows the anti-human VEGF receptor Fit-1 humanized antibody and the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody fragment that specifically react with human VEGF receptor Fit-1 or have neutralizing activity against human Fit-1
  • the following describes the method for producing E. coli, and the method for detecting and quantifying the human VEGF receptor Fit-1 using the antibody.
  • Antigens required to produce anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody include cells that express human VEGF receptor Fit-1 on the cell surface or cell membrane fraction thereof, or cells of different lengths. Examples include a soluble human VEGF receptor Fit-1 protein having an outer region, or a fusion protein of the protein with the Fc portion of an antibody.
  • Cells expressing the human VEGF receptor Flt-1 on the cell surface include NIH3T3-Fit-1 cells [Oncogene, 10, 135 (1995)] and the like.
  • DNA encoding the human VEGF receptor Fit-1 was obtained using a genetic engineering technique, and a soluble human VEGF receptor Flt-1 protein having an extracellular region having different amino acid lengths or the protein was obtained. It can also be expressed as a fusion protein of the antibody and the Fc portion of the antibody to serve as an antigen.
  • the host may be any host, such as bacteria, yeast, animal cells, and insect cells, as long as it can express the gene of interest.
  • bacteria include bacteria of the genus Escherichia, such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and those of the genus Bacillus.
  • yeast include Saccharomyces' cerevisiae (Shiapcharyces cerevisiae) and Shizo Saccharomyces bomb (Scj2 zosa_ ⁇ haroipyces pombe).
  • animal cells include Namalva cells, which are human cells, COS cells, which are monkey cells, and CHO cells, which are Chinese hamster cells.
  • insect cells include Sf9, Sf21 (Pharmingen), High Five (Invitrogen) and the like.
  • any vector can be used as long as the DNA can be incorporated and can be expressed in a host cell.
  • the expression vector When a bacterium, for example, Escherichia coli (Escherichia £ 2) is used as a host, the expression vector includes a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, a transcription termination sequence, and in some cases, a promoter control sequence.
  • a promoter for example, commercially available pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen) and the like are exemplified.
  • pGEX Pharmacia
  • pET system Novagen
  • protoplast Any method such as the method (JP-A-63-248394) can be used.
  • yeast When yeast is used as a host, for example, YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) and the like are used as expression vectors.
  • a method for introducing a recombinant vector into yeast includes, for example, the elect-portion method [Methods. Enzymol., 194. 182 (1990)], the Sufero plast method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)] and the lithium acetate method [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)].
  • promoters of the IE (immediate early) gene of cytomegalovirus (CMV), SV40, and metamouth thionein can be used. Promoters and the like. Further, the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • a method for introducing DNA into animal cells includes, for example, the elect-portion method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and the calcium phosphate method (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2-227075), and the Lipofxion method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • an insect cell When an insect cell is used as a host, for example, it is described in Current 'Protocols (Supplement 1-34), Baculovirus' Expression' Vectors, A 'Laboratory' manual (Baculovirus expression vectors, A laboratory manual), etc.
  • the protein can be expressed by the applied force method. That is, the recombinant gene transfer vector and baculovirus described below are co-transfected into insect cells to obtain a recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is infected into the insect cells. Obtain protein-expressing insect cells.
  • PVL1392 As the gene transfer vector, for example, PVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitrogen) and the like are used.
  • baculovirus for example, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects night insects belonging to the moth family, is used.
  • Examples of a method for co-transferring the above-described recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells to prepare a recombinant virus include a calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), a lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • insect cells such as Sf9, Sf21 or High Five described above were produced.
  • a protein can also be produced by infecting the recombinant virus with the recombinant virus [Bio / Technology, 6, 47 (1988)].
  • Molecular 'cloning 2nd edition As a method for expressing a gene, in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression and the like have been developed, and any method can be used. For example, described in Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989) (hereinafter abbreviated as Molecular 'cloning 2nd edition). It can be performed according to the method.
  • the proteins to be fused include ⁇ -galactosidase, protein ⁇ , IgG binding region of protein ⁇ , chloramphenicol 'acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose binding protein, daltathione S-transferase. , Polyhistidine chain (His-tag), S-peptide, DNA-binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green 'fluorescent' protein, and any antibody epitope [Experimental Medicine, 13, 469-474 ( 1995)].
  • the transformant obtained as described above is cultured in a medium, the full-length or partial fragment of the human VEGF receptor Flt-1 is produced or accumulated as it is or as a fusion protein in the culture, and collected from the culture.
  • the full length or partial fragment of human VEGF receptor Fit-1 can be produced as it is or as a fusion protein.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the medium for culturing the transformant obtained by using a microorganism such as Escherichia coli or yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like, which can be used by the microorganism, so that the cultivation of the transformant is efficient.
  • a carbon source such as Escherichia coli or yeast
  • Cultivation is usually performed at 15 to 40 ° C for 16 to 96 hours under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as needed.
  • a medium for culturing transformants obtained using animal cells as a host generally used media are used. RPMI1640 medium, Eagle's MEM medium, or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums is used. Cultures, 5% C0 2 presence usually performed 3-7 days at 35 to 37 ° C, the culture if necessary, kanamycin, may be added to the antibiotic penicillin such as the medium.
  • TNM-FH medium As a culture medium for culturing the transformant obtained using insect cells as a host, commonly used TNM-FH medium [Pharmingen], Sf900IISFM [Life Technologies (Siba e Technologies)] ExCell400, ExCell405 [all manufactured by JRH Biosciences] and the like.
  • the culture is performed at 25 to 30 ° C for 1 to 4 days, and an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture, if necessary.
  • the power of serum contained in the culture medium of animal cells and insect cells In order to facilitate purification of the full-length or partial fragment of human VEGF receptor Flt-1 as it is or as a fusion protein, preferably a serum-free medium Is used.
  • the full-length or partial fragment of the human VEGF receptor Fit-1 is accumulated in host cells either as it is or as a fusion protein, after culturing, the cells are centrifuged, suspended in an aqueous buffer, and then suspended. The cells are disrupted by a sonication method, a French press method, or the like, and the protein is recovered by centrifugation and purification. .
  • the insoluble substance is solubilized with a protein denaturing agent, and then diluted to a solution that does not contain the protein denaturing agent or is diluted so that the concentration of the protein denaturing agent does not change the protein. Or by dialysis to form the three-dimensional structure of the protein.
  • the expressed protein can be recovered in the culture supernatant. Isolation and purification include solvent extraction, fractional precipitation with organic solvents, salting out, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, and reverse chromatography. Separation operations such as phase chromatography, crystallization, and electrophoresis can be performed alone or in combination.
  • the animal used for immunization may be any animal, such as a mouse, a rat, a hamster, or a rabbit, as long as it can produce a hybridoma.
  • an example using a mouse and a rat will be described.
  • a mouse or rat aged 3 to 20 weeks is immunized with the protein obtained in the above 1 (1) as an antigen, and antibody-producing cells are collected from the spleen, lymph nodes, and peripheral blood of the animal. Immunization is performed by subcutaneously, intravenously or intraperitoneally administering the antigen several times with an appropriate adjuvant.
  • Adjuvants include Complete Freund's Adjuvant or aluminum hydroxide gel and B. pertussis vaccine.
  • N1H3T3 cells expressing the soluble human VEGF receptor Fit-1 or human VEGF receptor Flt_l used as an antigen on the cell surface from the venous plexus or tail vein of the immunized animal 3 to 7 days after each administration The reactivity of the mouse or rat whose serum showed a sufficient antibody titer was confirmed by enzyme immunoassay or the like [Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): published by Medical Shoin (1976)]. It is a source of producer cells.
  • Myeloma cells include 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BA and B / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-Ul (P3-Ul), a cell line obtained from mice. Immunol., 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3—X63—Ag8653 (653) [J. Immunol., 12 ⁇ 1548 ( 1979)], P3-X63_Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975);], and any other myeloma cells that can grow in vitro. Culture and passage of these cell lines are performed according to a known method (Antibody's 'Laboratory' manual), and a cell number of 2 ⁇ 10 7 or more is secured by the time of cell fusion.
  • a cell-aggregating medium such as polyethylene glycol-1000 (PEG-1000) is added to fuse the cells, and the cells are suspended in the medium. Cloudy.
  • PEG-1000 polyethylene glycol-1000
  • MEM medium or PBS 1.83 g of disodium phosphate, 0.21 g of monopotassium phosphate, 7.65 g of salt, 1 liter of distilled water, pH 7.2
  • a HAT medium normal medium [glutamine (1.5 mM), 2_mercaptoethanol (5 X 1 (gamma 5 Micromax), gentamicin (10 mu g / ml) and fetal calf serum (FCS) (CSL Ltd., 10%) was added medium] hypoxanthine (10- 4 M), thymidine (1.5 X 10- 5 M) and aminopterin (4 X 10- 7 M) and using a medium ⁇ plus.
  • a part of the culture supernatant is taken, and a sample that reacts with the antigen protein and does not react with the non-antigen protein is selected by enzyme immunoassay. Subsequently, cloning is performed by the limiting dilution method, and those having a stable and high antibody titer determined by enzyme immunoassay are selected as monoclonal antibody-producing hybridoma strains.
  • the antigen protein or cells expressing the antigen protein are coated on a 96-well plate, and the hybridoma culture supernatant or the purified antibody obtained by the above method is reacted as the primary antibody.
  • the plate After the first antibody reaction, the plate is washed and the second antibody is added.
  • the second antibody is an antibody obtained by labeling an antibody capable of recognizing the immunoglobulin of the first antibody with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, a radiation compound, or the like. Specifically, if a mouse is used for preparing the hybridoma, an antibody capable of recognizing mouse immunoglobulin is used as the second antibody.
  • hybridoma strain examples include the hybridoma strains KM1732 (FERM BP-5699), KM 1748 (FERM BP-5699) and KM1750 (FERM BP-5700).
  • an enzyme, a chemiluminescent substance or a radioactive compound after mixing and reacting the above-mentioned first antibody with human VEGF labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance or a radioactive compound, a reaction according to the labeling substance is performed, whereby human VEGF is The activity of inhibiting the binding to human VEGF receptor Fit-1 can be measured.
  • a hybridoma having high human VEGF inhibitory activity can be screened.
  • Pristane-treated (2,6,10,14-tetramethylpentadecan (? 1 ⁇ 1 & 06) 0.51 ⁇ was intraperitoneally administered and bred for 2 weeks), 8-10 week-old mice or nude mice were treated with 1 (4 ).
  • the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody-producing hybridoma cells obtained in 2) above are injected intraperitoneally at 2 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 6 cells / animal. In 10 to 21 days, the hybridoma becomes ascites cancer.
  • IgG or Ig fraction is collected using a column of Fine GSL2000 (manufactured by Seikagaku Corporation) and used as a purified monoclonal antibody.
  • the subclass of the purified monoclonal antibody can be determined using a mouse monoclonal antibody typing kit, a rat monoclonal antibody typing kit, or the like.
  • the protein mass can be calculated by the Lowry method or from the absorbance at 280 nm.
  • the antibody subclass is an isotype within the class, and includes IgGl, IgG2a, lgG2b, and IgG3 in mouse and IgGl, lgG2, IgG3, and IgG4 in human.
  • Mouse IgGl, IgG2a and human IgGl types have complement-dependent cytotoxicity (hereinafter referred to as CDC activity) and antibody-dependent cytotoxicity (hereinafter referred to as ADCC activity), and are useful for therapeutic applications. It is.
  • a humanized antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which genes encoding the C regions CH and CL of the human antibody are incorporated. It was constructed by inserting each of the encoding genes.
  • the C region of a human antibody for example, the C region of any human antibody such as CT / 1 or C ⁇ 4 for a human antibody heavy chain and C ⁇ for a human antibody L chain can be used.
  • the gene encoding the C region of the human antibody chromosomal DNA consisting of exons and introns can be used, and cDNA can also be used.
  • the expression vector for animal cells any vector can be used as long as it can incorporate and express the gene encoding the human antibody C region.
  • pAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)]
  • pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]
  • pSGl ⁇ d2-4 [Cytotechnology, 4, 173 (1990):]
  • the promoter and enhancer used in the expression vector for animal cells include the SV40 early promoter and enhancer [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], the LTR promoter and the enhancer of Moroni murine leukemia virus [Biochem. Biophys. Res. Med., 149, 960 (198 7 )], and immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and Enhanser [Cell, 33, 717 (1983)].
  • the expression vector for the hen M antibody can be either the type in which the antibody H and L chains are present on separate vectors or the type in which the antibody is present on the same vector (tandem type).
  • a vector for expressing a tandem humanized antibody in terms of ease of construction of an expression vector, ease of introduction into animal cells, and balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells. Is more preferable [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)].
  • Non-human animal antibodies for example, cDNAs encoding VH and VL of a mouse anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody are obtained as follows.
  • the synthesized cDNA is inserted into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or plasmid containing VH-encoding cDNA, and VL were obtained by using a C region or V region of a non-human animal antibody, for example, a mouse antibody as a probe. Isolate the recombinant phage or plasmid containing the desired cDNA.
  • the entire nucleotide sequence of VH and VL of the target antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH and VL is deduced from the nucleotide sequence.
  • An antibody expression vector can be constructed.
  • a restriction enzyme recognition sequence for cloning cDNA encoding VH and VL of a non-human animal antibody is provided in advance of the gene encoding the CH and CL of the human antibody in the chimeric antibody expression vector.
  • a human chimeric antibody expression vector can be produced by inserting a cDNA encoding the V region of an antibody of a non-human animal into this closing site via a synthetic DNA described below.
  • Synthetic DNA consists of the nucleotide sequence at the 3 'end of the V region of an antibody of a non-human animal and the nucleotide sequence at the 5' end of the C region of a human antibody. It is manufactured using a DNA synthesizer so as to have
  • VH and VL that form the antigen-binding site of the antibody are composed of four relatively conserved framework regions (hereinafter referred to as FR regions) and three sequence-rich complementary sequences that link them. Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, (1991); Sequences 'ob''proteins' ob. Immunological interest. ]. Each CDR amino acid sequence (CDR sequence) can be identified by comparing it with the amino acid sequence of the known antibody V region (Sequences of protein proteins of interest). (5) Construction of cDNA encoding V region of human CDR-grafted antibody
  • CDNAs encoding VH and VL of the human CDR-grafted antibody can be obtained as follows.
  • the FR amino acid sequence of the V region of the human antibody for grafting the CDR of the V region of the antibody of the target non-human animal is selected for each of VH and VL.
  • the FR amino acid sequence of the V region of the human antibody any FR amino acid sequence of the V region of the human antibody can be used.
  • the amino acid sequence of FR in the V region of a human antibody registered in the Protein Data Bank and the common amino acid sequence of each subgroup of FR in the V region of a human antibody are highly homologous to the amino acid sequence of the V region of the target non-human animal antibody, preferably 65. It is desirable to have homology of at least%.
  • the DNA sequence encoding the amino acid sequence of FR in the V region of the selected human antibody and the DNA sequence encoding the amino acid sequence of the CDR in the V region of the antibody of the target non-human animal are ligated to obtain VH, Design a DNA sequence that encodes the amino acid sequence of each VL.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the amplified fragment is subcloned into an appropriate vector, its base sequence is determined, and a plasmid containing cDNA encoding the amino acid sequence of the V region of each chain of the target human CDR-grafted antibody is obtained.
  • both sense and antisense is synthesized using synthetic DNA consisting of about 100 bases, and annealing and ligation are performed to obtain the amino acid sequence of the V region of each chain of the target human CDR-grafted antibody.
  • synthetic DNA consisting of about 100 bases
  • annealing and ligation are performed to obtain the amino acid sequence of the V region of each chain of the target human CDR-grafted antibody.
  • a cDNA encoding the same can be constructed.
  • a human CDR-grafted antibody has the activity of the original non-human animal by simply grafting only the CDR of the V region of the target non-human animal antibody between the FRs of the V region of the human antibody. It is known that the activity is lower than that of the antibody [BIO / TECHNO OGY, 9, 266 (1991)]. Therefore, of the amino acid sequence of FR in the V region of the human antibody, amino acid residues that are directly involved in binding to the antigen, amino acid residues that interact with amino acid residues of the CDR, or the three-dimensional structure of the antibody.
  • Amino acid residues having a possibility of being involved in maintenance of a structure or the like have been modified into amino acid residues found in an antibody of a non-human animal to increase the activity.
  • a method for producing a human CDR-grafted antibody applicable to any antibody has not yet been established, and at present, various trials and errors are required for each antibody.
  • the modification of the FR amino acid sequence of the V region of the selected human antibody can be achieved by performing the PCR described in the above 2 (5) using various mutagenic primers.
  • an amino acid sequence-modified vector After subcloning the amplified fragment after PCR into an appropriate vector, its base sequence is determined, and a vector containing the cDNA into which the desired mutation has been introduced (hereinafter referred to as an amino acid sequence-modified vector) is obtained.
  • the modification of the amino acid sequence in a narrow region can be performed by a PCR mutagenesis method using a mutagenesis primer consisting of 20 to 35 bases. Specifically, a sense mutation primer and an antisense mutation primer consisting of 20 to 35 bases containing a DNA sequence encoding a modified amino acid residue are synthesized, and a cDNA encoding the amino acid sequence of the V region to be modified is prepared. Perform a two-step PCR using the plasmid containing After subcloning the final amplified fragment into an appropriate vector, its base sequence is determined, and an amino acid sequence-modified vector containing cDNA into which the desired mutation has been introduced is obtained.
  • a human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed.
  • an appropriate restriction enzyme recognition sequence is added to the ends of the synthetic DNAs at the 5 ′ end and the 3 ′ end. By introduction, they can be inserted upstream of the gene encoding the C region of the desired human antibody so that they can be expressed in an appropriate form.
  • the human chimeric antibody expression vector (2) above and the human CDR-grafted antibody expression vector (2) above or a modified vector thereof were used. It is introduced into COS-7 cells (ATCC CRL1651) to perform transient expression of a humanized antibody [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, pp283 (1991)], and to measure its activity.
  • Methods for introducing an expression vector into COS-7 cells include the DEAE-dextran method [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, pp283 (1991)] and the lipofection method [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413. (1987)].
  • the activity of the humanized antibody in the culture supernatant can be measured by the enzyme immunoassay (ELISA) described in 1 (5) above.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • Transformation to stably produce a humanized antibody by introducing the human chimeric antibody expression vector of (2) and the human CDR-grafted antibody expression vector of (2) into appropriate host cells. You can get a strain.
  • Examples of a method for introducing an expression vector into a host cell include a direct-portion method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 257891/1990; Cytotechnology, 3, 133 (1990)).
  • any cell can be used as long as it can express the humanized antibody.
  • mouse SP2 / 0- Agl4 cells ATCC CRL 1581
  • murine P3X63- A g 8.653 cells ATCC CRL 1580
  • dihydrofolate reductase gene hereinafter, referred to as DHFR gene
  • DHFR gene dihydrofolate reductase gene
  • a transformant capable of stably producing a humanized antibody is selected on a RPMI1640 medium containing G418 and FCS according to the method disclosed in JP-A-2-2577891.
  • the humanized antibody By culturing the obtained transformant in a medium, the humanized antibody can be produced and accumulated in the culture solution.
  • the activity of the humanized antibody in the culture solution was determined by the method described in 1 (5) above. Measure more.
  • the transformed strain can increase the amount of humanized antibody produced using a DHFR gene amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • the humanized antibody can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column (Chapter 8 of the Antibody's Laboratory Manual).
  • other purification methods used for ordinary proteins can be used. For example, gel filtration, ion exchange chromatography, ultrafiltration and the like can be combined and purified.
  • the molecular weight of the purified humanized antibody H-chain, L-chain or the entire antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting (Antibody's antibody). Measure in 'Laboratory' Manual, Chapter 12).
  • the reactivity of the purified humanized antibody and the binding activity of the humanized antibody to the VEGF receptor Fit-1 can be measured by the method described in 1 (5) above.
  • An antibody fragment is generated by treating the above-mentioned antibody with an enzyme.
  • the enzyme include papain and trypsin.
  • DNA encoding the Fab, Fab, or F (ab,) 2 fragment of the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody is inserted into an expression vector for animal cells, and the vector is introduced into animal cells. It can be expressed to produce Fab, Fab, or F (ab ') 2 .
  • the resulting antibody fragment can be purified by a combination of gel filtration, ion exchange, affinity chromatography, ultrafiltration and the like.
  • the molecular weights of purified Fab, Fab, and F (ab,) 2 were determined by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) [Nature, 227, 680 (1970)] or by Western blotting (Antibody's Laboratory). , Manual Chapter 12).
  • Non-human animal antibody or human CDR transfer according to 2 (2), 2 (5) and 2 (6) above
  • the expression vector of a single-chain antibody of a non-human animal antibody or a single-chain antibody of a human CDR-grafted antibody can be expressed.
  • the single-chain antibody expression vector used herein any vector can be used as long as it can integrate and express cDNA encoding VH and VL of an antibody from a non-human animal or a human CDR-grafted antibody.
  • any vector can be used as long as it can integrate and express cDNA encoding VH and VL of an antibody from a non-human animal or a human CDR-grafted antibody.
  • AGE 107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • Escherichia coli is used as a host for expressing single-chain antibodies.
  • the single-chain antibody can be secreted extracellularly, transported to the polyplasma region, or retained in the cell.
  • the cDNA encoding the single-chain antibody is ligated to the cDNA encoding VH and the cDNA encoding VL using synthetic DNA encoding a peptide linker having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at both ends. Can be obtained. It is important that the linker peptide be optimized so that its addition does not interfere with the binding of VH and VL to the antigen, for example those shown by Pantoliano et al. [Biochemistry,, 10117 (1991)]. Alternatively, a modified version thereof can be used.
  • a disulfide-stabilized antibody is a nucleotide sequence corresponding to one amino acid residue at an appropriate position in cDNA encoding VH and VL of a non-human animal antibody or cDNA encoding VH and VL of a human CDR-grafted antibody. Is modified to a nucleotide sequence corresponding to a cysteine residue, expressed and purified, and then formed to form a disulfide bond. Can be Amino acid residues can be changed to cysteine residues by the mutagenesis method using PCR described in 2 (5) above.
  • a disulfide-stabilized antibody H chain expression vector and a disulfide-stabilized antibody L chain expression vector can be constructed.
  • any vector can be used as long as it can integrate and express cDNA encoding modified VH and modified VL.
  • pAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)]
  • pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proc. Natl. Acad. Sci.
  • an appropriate host is selected from Escherichia coli, yeast, animal cells, etc. Power that can be selected In that case, it is necessary to select an expression vector appropriate for each host.
  • a disulfide-stabilized antibody can be secreted extracellularly, transported to the periplasmic region, or retained inside the cell.
  • a transformed strain to be produced can be obtained.
  • the expression of antibody fragments, single-chain antibodies, disulfide-stabilized antibody H chains or disulfide-stabilized antibody L chains contained in the culture supernatant, etc. was confirmed by the method described in 1 (5) above. can do.
  • a single-chain antibody, a disulfide-stabilized antibody H chain or a disulfide-stabilized antibody chain can be achieved by a combination of known techniques. For example, If antibody fragments, single-chain antibodies, disulfide-stabilized antibody H chains or disulfide-stabilized antibody L chains are secreted into the medium, they can be concentrated by ultrafiltration, followed by various types of chromatography or gel filtration. It can be achieved by executing. Further, if the cells are transported to the periplasmic region of the host cell, the cells can be subjected to osmotic shock, concentrated by ultrafiltration, and then achieved by performing various types of chromatography or gel filtration. I can do it.
  • Antibody fragments single-chain antibodies, disulfide-stabilized antibody H chains or disulfide-stabilized antibody L chains, which are insoluble and exist as granules (inclusion body), lyse cells and granules in a single cell. It can be achieved by repeating centrifugation and washing for separation, for example, solubilization with guanidine-hydrochloric acid, and then performing various chromatography or gel filtration chromatography.
  • the purified single-chain antibody can be measured by the method described in 1 (5) or the like.
  • the purified disulfide-stabilized antibody The H chain and the disulfide-stabilized antibody chain are mixed together, and a disulfide bond is formed by an operation that leads to an active structure [refolding operation, Molecular Immunology, 32, 249 (1995)].
  • the active disulfide-stabilized antibody can be purified by antigen affinity chromatography or ion exchange chromatography or gel filtration.
  • the activity of the disulfide-stabilized antibody can be measured by the method described in the above 1 (5) or the like.
  • Peptides can also be used as derivatives of antibodies.
  • a fusion antibody or fusion peptide in which an antibody or peptide is chemically bound to a toxin protein is prepared according to the method described in the literature [Anticancer Research, 11_, 2003 (1991); Nature Medicine, 3, 350 (1996)]. Can be made.
  • a fusion antibody or peptide in which an antibody or peptide is bound to a protein such as a toxin, cytodynamic protein or enzyme by genetic engineering is described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 974 (1996); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7826 (1996)].
  • a fusion antibody or fusion peptide in which an antibody or peptide is chemically bound to a low molecular weight anticancer agent can be prepared according to the method described in the literature [Science, 261_, 212 (1993)] and the like.
  • These derivatives can be used for more effective diagnosis with less side effects by accumulating radioisotopes, toxins, proteins such as cytokins or enzymes, and low-molecular-weight drugs around the target tissue according to the specificity of the antibody molecule. It is expected to enable treatment.
  • anti-VEGF receptor Flt-1 antibody, peptide, a fusion antibody thereof or a fusion peptide thereof, or a fusion peptide binds to the human VEGF receptor Fit-1, and acts through the effector activity of antibodies such as ADCC and CDC.
  • ADCC and CDC antibodies
  • the antibody, peptide, fusion antibody or drug containing the fusion peptide of the present invention can be administered alone as a therapeutic agent, but is usually one or more pharmacologically acceptable carriers. And provided as pharmaceutical preparations prepared by any of the methods well-known in the art of pharmacy.
  • intravenous administration can be preferably used.
  • Administration forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, and P-hydroxy. It can be manufactured using preservatives such as benzoic acid esters and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. include excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol, hydroxy It can be produced using a binder such as propylcellulose and gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • An injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • Sprays are prepared using the antibody or peptide itself, or a carrier that does not irritate the oral and respiratory mucosa of the recipient and disperses the compound as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • Formulations such as aerosols and dry powders are possible depending on the properties of the antibody or peptide and the carrier used.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc. Normally, it is 10 / g / kg to 8 mg / kg per day for an adult.
  • the antibody or peptide against human VEGF receptor Flt-1 of the present invention may be used for the growth or metastasis of solid tumors such as breast cancer, prostate cancer, colorectal cancer, stomach cancer and lung cancer, arthritis in rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, premature infants It can be used as a diagnostic or therapeutic agent for diseases in which the disease progresses due to abnormal angiogenesis such as retinopathy and psoriasis.
  • the antibody or peptide of the present invention has a neutralizing activity against human Fit-1, it inhibits the binding of human VEGF to Fit-1. In other words, it inhibits Flt_l autophosphorylation and Inhibits the migration of existing human vascular endothelial cells. Therefore, the pathology is caused by abnormal growth of solid tumors such as breast cancer, prostate cancer, colorectal cancer, stomach cancer, and lung cancer, or metastasis formation, abnormalities of angiogenesis such as arthritis, rheumatoid retinopathy, prematurity retinopathy and psoriasis in rheumatoid arthritis. Can be used as a therapeutic agent for diseases in which the disease progresses.
  • the method for examining the antitumor effect of the antibody or peptide used in the present invention on various tumor cells includes an in vitro experiment, a method for measuring complement-dependent cytotoxicity (CDC activity), and an antibody-dependent cytotoxicity. (ADCC activity) and the like, and in vivo experiments include antitumor experiments using a tumor system in experimental animals such as mice.
  • the present invention provides a method for immunologically detecting and quantifying cells expressing human VEGF receptor Fit-1 or human VEGF receptor Fit-1 on the surface of Itoda wrapping, and a method for detecting soluble human VEGF receptor Fit-1.
  • Method for immunologically detecting and quantifying 1 method for inhibiting the binding of human VEGF to human VEGF receptor Fit-1; method for neutralizing the function of human VEGF receptor Flt-1; migration of endothelial cells
  • Method for inhibiting 1 method for inhibiting the binding of human VEGF to human VEGF receptor Fit-1
  • method for neutralizing the function of human VEGF receptor Flt-1 migration of endothelial cells
  • immunologically detecting and quantifying cells expressing human VEGF receptor Fit-1, cells expressing human VEGF receptor Flt-1 or soluble human VEGF receptor Fit-1 Methods include immunohistochemical staining (ABC, CSA) such as immunofluorescence, immunoenzyme immunoassay (ELISA), radiolabeled immunoassay (RIA), immunohistochemistry, and immunocytochemistry. Etc.), Western plotting method, immunoprecipitation method, enzyme immunoassay described above, sandwich ELISA method [Monoclonal antibody experiment manual (Kodansha Scientific, 1987), seismic chemistry experiment course 5 Immunobiochemistry Research Methods (Tokyo Kagaku Doujin, 1986)].
  • the fluorescent antibody method is an anti-immunoglobulin antibody or binding fragment that is obtained by reacting the antibody or peptide of the present invention with isolated cells or tissues and then labeling with a fluorescent substance such as fluorescin'isothiosinate (F1TC). After the reaction, the fluorescent dye is This is a method of measuring in one step.
  • F1TC fluorescin'isothiosinate
  • the immunoenzymatic antibody method refers to the separation of the antibody or peptide of the present invention into separated cells or lysates thereof, tissues or lysates thereof, cell culture supernatants, serum, pleural effusion, ascites, and eye fluid. Is reacted with an anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment labeled with an enzyme such as peroxidase or biotin, and then the coloring dye is measured with an absorptiometer.
  • the radioactive substance-labeled immunoassay refers to the reaction of the antibody of the present invention with isolated cells or their lysates, tissues or their lysates, cell culture supernatants, serum, pleural effusion, ascites, and eye fluid. Further, after reacting a radiolabeled anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment, measurement is performed with a scintillation counter or the like.
  • Immune cell staining and immunohistochemistry are defined as the steps of reacting an antibody or peptide of the present invention with isolated cells or tissues, and then using a fluorescent substance such as fluorescin'isothiosinate (FITC), peroxidase, or biotin. After reacting an anti-imnoglobulin antibody or a binding fragment labeled with an enzyme such as an enzyme, the reaction is observed using a microscope. In addition, the inhibitory activity of the binding between human VEGF and the human VEGF receptor Fit-1 was measured by a method for measuring the binding between a growth factor and a receptor. ] And the like, a VEGF-VEGF receptor Fit-1 binding inhibition test using the antibody of the present invention can be confirmed.
  • FITC fluorescin'isothiosinate
  • a scintillation counter or the like By reacting the antibody or peptide of the present invention simultaneously with VEGF labeled with a radioactive substance or the like, the activity of inhibiting the binding of VEGF labeled with a radioactive substance or the like to Flt-1 can be measured.
  • the autophosphorylation inhibitory activity of the VEGF receptor Fit-1 is determined by a method such as the growth factor receptor autophosphorylation measurement method [Sequence Chemistry Laboratory Lecture Information transmission and cellular response (Tokyo Kagaku Dojin, 1986)]. It can be confirmed by conducting an autophosphorylation inhibition test of VEGF-VEGF receptor Fit-1 using an antibody or a peptide.
  • VEGF is reacted with cells or tissues expressing Fit-1 and VEGF is bound.
  • autophosphorylation of Fit-1 that is enhanced by the combination is detected by immunoprecipitation and Western blotting.
  • By reacting the antibody or peptide of the present invention simultaneously with VEGF it is possible to measure the activity of inhibiting the autophosphorylation of Flt-l, which is enhanced by the binding of VEGF.
  • the inhibitory activity of human VEGF can be measured by performing VEGF-dependent endothelial cell proliferation, migration, and tube formation tests [New Chemistry Laboratory Lecture 10 Blood vessels (endothelium and smooth muscle) (Tokyo Kagaku Dojin, 1991)] Can be confirmed by
  • the VEGF-dependent growth test of vascular endothelial cells is a method in which vascular endothelial cells are reacted with VEGF, and the number of vascular endothelial cell growth-promoting activities that is enhanced by the binding of VEGF is measured.
  • VEGF vascular endothelial growth-promoting activities that is enhanced by the binding of VEGF.
  • the VEGF-dependent migration test of vascular endothelial cells is a method of reacting vascular endothelial cells with VEGF and observing, using a microscope, the vascular endothelial cell migration promoting activity that is enhanced by the binding of VEGF.
  • By reacting the antibody or the peptide of the present invention simultaneously with VEGF it is possible to measure the activity of inhibiting the migration promoting activity of vascular endothelial cells which is enhanced by VEGF.
  • the VEGF-dependent vascular endothelial cell tube formation test is a method in which vascular endothelial cells are reacted with VEGF, and the tube formation promoting activity of vascular endothelial cells, which is enhanced by the binding of VEGF, is observed using a microscope.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • cells expressing the human VEGF receptor Fit-1 on the cell surface are prepared. After suspending cells as they are, and detaching adherent cells with trypsin EDTA, the cells are suspended in an immune cell staining buffer (PBS containing 1% BSA, 0.02% EDTA, 0.05% sodium azide), etc. 1 X 10 5 is dispensed into each ⁇ 2 X 1 0 6 pieces.
  • an immune cell staining buffer PBS containing 1% BSA, 0.02% EDTA, 0.05% sodium azide
  • Anti-human VEGF receptor obtained in (4) Culture supernatant of Fit-1 monoclonal antibody-producing hybridoma or culture supernatant of anti-human VEGF receptor Flt_l humanized antibody-producing transformant obtained in 2 (9), or 1 (6), 2 (9)
  • immunize the purified antibody obtained in 3 (4) or biotin-labeled antibody by a known method (enzyme antibody method: interdisciplinary project 1985) to a concentration of 0.1 to 50 ⁇ g / ml.
  • Culture supernatant of anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in 1 (4) or culture of anti-human VEGF receptor Fit-1 humanized antibody-producing transformant obtained in 2 (9) When reacting the supernatant or the purified antibody obtained in 1 (6), 2 (9) or 3 (4), wash the cells with a buffer solution for immunocytostaining, and then use fluorescence such as FITC or phycoerythrin. Dispense 50-500 ⁇ l of an immunocell staining buffer containing a dye-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody, anti-rat immunoglobulin antibody, or anti-human immunoglobulin antibody at a concentration of about 0.1 to 50 ⁇ g / ml.
  • reaction under ice-cooling for 30 minutes When the biotin-labeled antibody is reacted, 50-500 ⁇ l of streptavidin labeled with a fluorescent dye such as FITC or phycoerythrin is dispensed at 50-500 ⁇ l each, and the reaction is performed under ice-cooling for 30 minutes under light shielding. . After the reaction, wash well with immunobtaining cell staining buffer and analyze with a cell sorter.
  • a fluorescent dye such as FITC or phycoerythrin
  • NIH3T3-Flt_l human VEGF receptor Flt-1 expressing NIH3T3 cells
  • control cells such as NIH3T3 cells
  • NIH3T3-Neo NIH3T3 cells
  • a reaction according to the labeling substance is performed.
  • Methods for inhibiting the binding between human VEGF and the human VEGF receptor Fit-1 include the following methods.
  • Dispense methanol into a 96-well MultiScreen-IP plate (96-well MultiScreen-IP Plate; manufactured by Millipore) at 100 ⁇ l / well to hydrophilize the PVDF membrane at the bottom of the plate.
  • 50 ⁇ l of recombinant protein such as a fusion protein of human VEGF receptor Fit-1 or human VEGF receptor Flt_l and other proteins diluted with PBS to a concentration of 0.1 to 10 ⁇ g / ml was added to 50 ⁇ l.
  • Methods for diagnosing diseases based on the growth or metastasis of solid tumors such as breast cancer, prostate cancer, colorectal cancer, stomach cancer, and lung cancer, and diseases in which the disease progresses due to abnormal angiogenesis, include humans present in cells or tissues of the subject.
  • the above-described method for immunologically detecting or quantifying the VEGF receptor Flt_l using the antibody or the peptide of the present invention is mentioned.
  • FIG. 1 is a view showing a construction step of plasmid pBS1732H.
  • FIG. 2 is a view showing a construction step of plasmid pBS1732L.
  • FIG. 3 is a view showing a construction process of plasmid PKANTEX1732H.
  • FIG. 4 is a view showing a construction step of plasmid pKANTEX1732.
  • FIG. 5 is a view showing a construction process of plasmid pBS1750H.
  • FIG. 6 is a view showing a construction process of plasmid pBS1750L.
  • FIG. 7 is a view showing a construction step of plasmid pKANTEX1750H.
  • FIG. 8 is a view showing a construction step of plasmid pKANTEX1750.
  • FIG. 9 is a diagram showing an electrophoresis pattern of purified anti-human VEGF receptor Flt_l human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 by SDS-PAGE (using a 4 to 15% gradient gel).
  • Lane 1 is a low molecular marker
  • lane 2 is KM2532 under reducing conditions
  • lane 3 is KM2550 under reducing conditions
  • lane 4 is a high molecular marker
  • lane 5 is KM2532 under non-reducing conditions
  • lane 6 is non-reducing
  • the migration pattern of KM2550 under each condition is shown.
  • FIG. 10 shows the binding activity of purified anti-human VEGF receptor Flt-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 to soluble human VEGF receptor Fit-17N.
  • A shows the results when the concentration of the soluble human VEGF receptor Fit-17N to be adsorbed on the plate was kept constant (1 ⁇ g / ml) and the concentration of the added human chimeric antibody was varied.
  • the vertical axis shows the binding activity to the soluble human VEGF receptor Flt-17N, and the horizontal axis shows the concentration of the human chimeric antibody.
  • ⁇ indicates the activity of KM2532, and ⁇ indicates the activity of KM2550, respectively.
  • B can be adsorbed on the plate FIG.
  • FIG. 9 shows the results obtained by measuring the binding activity of a constant concentration (10 ⁇ g / ml) of a human chimeric antibody by changing the concentration of soluble human VEGF receptor Flt — 17N.
  • the vertical axis shows the binding activity to the soluble human VEGF receptor Flt-17N, and the horizontal axis shows the concentration of the soluble human VEGF receptor Fit-17N adsorbed on the plate.
  • ⁇ indicates the activity of KM2532, and ⁇ indicates the activity of KM2550, respectively.
  • FIG. 11 is a graph showing the activity of purified anti-human VEGF receptor Fit-1 human-type chimeric antibodies KM2532 and KM2550 for inhibiting the binding of human VEGF to human VEGF receptor Fit-1.
  • ⁇ indicates the activity of KM1732
  • ⁇ indicates the activity of KM1750
  • ⁇ indicates the activity of KM2532
  • the image indicates the activity of KM2550.
  • FIG. 12 is a view showing a construction process of plasmid phKM1732HV0.
  • FIG. 13 is a view showing a construction process of plasmid phKM1750HV0.
  • FIG. 14 is a view showing a construction process of plasmid phKM1732LV0.
  • FIG. 15 is a view showing a construction process of plasmid phKM1750LV0 (IV).
  • FIG. 16 is a view showing a construction process of plasmid PKANTEX1732HV0.
  • FIG. 17 is a view showing a construction step of plasmid pKANTEX1732HV0LV0.
  • FIG. 18 is a view showing a plasmid pKANTEX1750HV0LV0 (IV).
  • FIG. 19 is a view showing a construction step of plasmid pVL1393 / Flt 3N.
  • FIG. 20 is a view showing a construction step of plasmid pVLl 393 / Flt 7N.
  • FIG. 21 is a view showing a pattern of purified SDS polyacrylamide electrophoresis (using a 5-20% gradient gel) of Fit- 17N and Fit- 13N. From left, the migration patterns of the molecular weight markers, Flt-1 3N and Flt-17N are shown. Electrophoresis was performed under reducing conditions.
  • FIG. 23 shows the results obtained by examining the binding reactivity of anti-human VEGF receptor Flt-1 monoclonal antibody by enzyme immunoassay.
  • FIG. 24 shows the results of examining the activity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody for inhibiting the binding between VEGF and human VEGF receptor Flt-1.
  • Anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibodies KM1732, KM1748 and 3 shows the results of examining the binding inhibitory activity of human VEGF and human VEGF receptor Fit-1 by M1750.
  • FIG. 26 shows the results of examining the activity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibodies KM1732, KM1748 and M1750 for inhibiting the binding between human VEGF and human VEGF receptor Flt_l-expressing cells.
  • Fig. 27 Reactivity of anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibodies KM1730, KM1731, KM1732, KM1748 and KM1750 with human NIGF3 expressing Fit-1 cells NIH3T3-Fit-1 and control cells NIH3T3-Neo cells The results of analysis using a flow cytometer are shown.
  • FIG. 28 shows the results of examining the reactivity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody KM1737 with the human VEGF receptor Fit-1 by Western blotting.
  • Lane 1 shows NIH3T3-Fit-1 cells
  • lane 2 shows Western blotting of NIH3T3-Neo cells.
  • Fig. 29 shows the results of examining the quantification system of soluble human VEGF receptor Fit-13N and FLT-17N using anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody KM1732 and biotinylated KM1730.
  • Fig. 30 Fit-17N, a soluble human VEGF receptor and its derivative of anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody KM1732, KM1750, and anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2532, K2550
  • the results of examining the binding reactivity of Flt-13N, Flt-12N, Fit-17N.K2 and KDR7N by enzyme immunoassay are shown.
  • Fig. 31 Soluble human VEGF receptor of anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2532, K2550 and its derivatives Fit-17N, Fit-13N, Fit-12N, Fit-17N. The results obtained by examining the concentration-dependent binding reaction of K2 and KDR 7N by enzyme immunoassay are shown.
  • FIG. 32 shows a schematic diagram of various derivatives of a soluble human VEGF receptor.
  • FIG. 33 is a view showing a step of constructing plasmids phKMlO and V0 (I).
  • FIG. 34 is a view showing a step of constructing plasmid pKANTEX1750HV0LV0 (I).
  • FIG. 35 is a view showing a step of constructing plasmid phKM1750HV3.
  • FIG. 36 is a view showing a step of constructing plasmid phKM50LV4.
  • FIG. 37 is a view showing a step of constructing plasmid pKANTEX1750HV3LV0 (I).
  • FIG. 38 is a view showing a step of constructing plasmid pKANTEX1750HV3V0 (IV).
  • FIG. 39 is a view showing a step of constructing plasmid pKANTEX1750HV0LV4.
  • FIG. 40 is a view showing a step of constructing plasmid pKANTEX1750HV3LV4.
  • FIG. 9 is a diagram showing an electrophoresis pattern of a 15% gradient gel.
  • Lanes 1 to 9 show electrophoresis patterns under non-reducing conditions
  • lanes 10 to 19 show electrophoretic patterns under reducing conditions.
  • Lanes 1 and 10 are high molecular weight markers
  • lane 19 is low molecular weight marker
  • lanes 2 and 11 are control antibodies KM8969
  • lanes 3 and 12 are KM2550
  • lanes 4 and 13 are KM8550
  • lanes 5 and 14 are KM8551
  • lanes 6 and 15 are KM8552
  • lanes ⁇ and 16 are KM8553
  • lanes 8 and 17 are
  • FIG. 42 shows the binding activity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2550 and human CDR-grafted antibodies KM8550, M8551, KM8552, KM8553, KM8554, and KM8555 to the soluble human VEGF receptor Flt_l7N. is there.
  • FIG 43 Anti-human VEGF receptor Fit-1 Human chimeric antibody KM2550 and human CDR-grafted antibody Various soluble human VEGF receptor derivatives of KM8550, KM8551, KM8552, KM8553, KM8554, K8555 Fit-1-7N, Fit-1 It is a figure which showed the binding activity with 3N, Fit-12N, Fit-17N.K2, KDR7N.
  • FIG. 44 Anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2550 and human CDR-grafted antibodies KM8550, K8551, KM8552, KM8553, KM8554, M8555 inhibit the binding inhibitory activity of human VEGF and human VEGF receptor Flt-1
  • FIG. 44 Anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2550 and human CDR-grafted antibodies KM8550, K8551, KM8552, KM8553, KM8554, M8555 inhibit the binding inhibitory activity of human VEGF and human VEGF receptor Flt-1
  • FIG. 45 is a view showing the amino acid sequence of the H chain variable region of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody and CDR-grafted antibody.
  • KM1750mouse is the amino acid sequence of the variable region of the H chain of KM1750
  • KM1750HV0 is the amino acid sequence configured by inserting the CDR in the variable region of the H chain of KM1750 into the human framework
  • KM1750HV3 is the amino acid sequence of KM1750HV0.
  • the amino acid sequences obtained by partially substituting the amino acid sequence of the framework with the amino acid of KM1750mouse are shown.
  • FIG. 46 is a view showing an amino acid sequence of an L chain variable region of an anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody and a CDR-grafted antibody.
  • KM1750mouse is the amino acid sequence of the variable region of the light chain of KM1750
  • KM1750LV0 (I) is the amino acid sequence composed of the CDR in the variable region of the light chain of KM1750 inserted into the human framework
  • KM1750LV4 is the amino acid sequence composed of the CDR in the variable region of the light chain of KM1750 inserted into the human framework
  • KM1750LV4 KM1750LV00
  • FIG. 47 is a graph examining the activity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibodies KM1732 and KM1750 to inhibit the migration of VEGF-dependent human vascular endothelial cells HUVEC.
  • Example 1 Using 5 ⁇ g of each of the KM1732 and KM1750 mRNAs obtained in Example 1 (1), cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech), and EcoR I at both ends according to the instruction manual attached to the kit. CDNAs each having a -Notl adapter were synthesized. Approximately 6 ⁇ g of each prepared cDNA is dissolved in sterile 10/1 water and fractionated by agarose gel electrophoresis to correspond to the heavy chain of IgG type antibody (hereinafter referred to as H chain). The 1.5 kb cDNA fragment and the approximately 1 kb cDNA fragment corresponding to the light chain (hereinafter referred to as L chain) About 0.1 ⁇ g was recovered.
  • H chain heavy chain of IgG type antibody
  • 0.1 ⁇ g of the cDNA fragment of about 1.5 kb and 0.1 ⁇ g of the cDNA fragment of about l.Okb were combined with the Lambda ZAPII Vector (Lambda ⁇ Vector cut with EcoRI and treated with Calf Intestine Alkaline Phosphatase : Stratagene (1 ⁇ g) is dissolved in 11.5 ⁇ l of T4 ligase buffer (Takara Shuzo), and 175 units of ⁇ 4 DNA ligase (Takara Shuzo) is added. For an additional 2 hours at room temperature.
  • Each phage prepared in 1 (2) of Example 1 was immobilized on a nitrocellulose filter according to a conventional method (Molecular. Cloning, 2nd edition).
  • C region the constant region of mouse immunoglobulin (hereinafter referred to as C region) according to the instruction manual attached to L direct nucleic acid labeling and detection systems (Amersham).
  • H chain is a mouse C lcDNA fragment [Cell, 18.559 (1979)]
  • L chain is a mouse C ⁇ cDNA fragment [Cell, 22, 197 (1980)] as a probe
  • a phage clone was obtained.
  • the phage clone was cloned into a plasmid according to the instruction manual attached to Lambda ZAPII Vector (Stratagene).
  • pBluescriptSK (-) was converted to the recombinant flop finally containing cDNA encoding the L chain of KM 17 32 recombinant plasmid KM 1732HA2 containing cDNA encoding the H chain of and KM 1732 plasmid KM1732L2- 1, KM1750 Recombinant plasmids KM1750H2-1 and KM1750L3-1 containing cDNA encoding the L chain of KM 1750 were obtained, respectively.
  • E. coli XL1-Blue with recombinant plasmid KM 1732L2-1 E. coli XL1-Blue with MRF7KM1732L2-U recombinant plasmid 1750H2-1
  • E. coli XL1-Blue having RF7K 1750H2-1 and recombinant plasmid KM1750L3-1
  • the E. coli strain having MRF7KM1750L3-1 has FERM BP-6354, FERM BP-6352, FERM BP-6353, and FERM BP-6355, respectively.
  • FERM BP-6354 FERM BP-6354
  • FERM BP-6352 FERM BP-6352
  • FERM BP-6353 FERM BP-6355
  • V region The nucleotide sequence of the variable region (hereinafter referred to as V region) of the cDNA encoding the H chain and L chain of each anti-human VEGF receptor Fit-1 mouse monoclonal antibody obtained in 1 (3) of Example 1 was determined. Using 0.1 / g of the obtained plasmid, BigDye Terminator Cycle
  • VH V region of the H chain
  • VL V region of the L chain
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of KM1732 VH
  • SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of KM1732
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of KM1750
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of VL of KM1750
  • SEQ ID NO: 86 shows the VH of KM1732
  • SEQ ID NO: 88 shows the amino acid sequence of KM1750 VH
  • SEQ ID NO: 89 shows the amino acid sequence of KM1750 VL.
  • Anti-human VEGF receptor Flt_l mouse having neutralizing activity against human VEGF receptor Fit-1
  • Mouse anti-human VEGF receptor Fit-1 chimeric antibodies KM2532 and KM2550 derived from monoclonal antibodies KM1732 and KM1750 as follows: It was manufactured.
  • the expression vector pKANTEX1732 was constructed as follows.
  • the the reflected reaction solution was precipitated with ethanol, 50 mM Tris - HCl ( ⁇ ⁇ 7 ⁇ 5), lOOmM sodium chloride, LOMM magnesium chloride, ImM DTT, 100 ⁇ g / ml BSA and 0.01% Triton X-100 consists of buffer 10 mu In addition to 1, 10 units of a restriction enzyme NotK (Takara Shuzo) were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis.
  • plasmid KM1732HA2 is buffered with 20 mM Tris-acetic acid (pH 7.9), ⁇ magnesium acetate, 50 mM potassium acetate, ImM DTT and 100 ⁇ g / ml bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • 10 units of a restriction enzyme NlalV manufactured by Ngrand Biolabs was further added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • the reaction solution was precipitated with ethanol, and added to 10 ⁇ l of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, ImM DTT, 100 ⁇ g / ml BSA and 0.01% Triton X_100. Further, 10 units of restriction enzyme Notl (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C for 1 hour. The reaction mixture was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 ⁇ g of a 0.41 kb NlalV-Notl fragment was recovered.
  • a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, ImM DTT, 100 ⁇ g / ml BSA and 0.01% Triton X_100. Further, 10 units of restriction enzyme Notl (Takara Shu
  • a synthetic DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 or 18 was synthesized (Saddy 1. 0.3 ⁇ g of each synthetic DNA was added to 15 ⁇ l of sterilized water, and heated at 65 ° C. for 5 minutes. After leaving the reaction solution at room temperature for 30 minutes, 2 ⁇ l of 10-fold buffer [500 mM Tris-hydrochloric acid (pH7.6), 100 mM magnesium chloride, 50 m DTT] and 2 ⁇ l of 10 mM ATP were added, and further 10 units were added. ⁇ 4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to phosphorylate the 5 ′ end.
  • 0.1 ⁇ g of Apa-Notl fragment derived from plasmid pBluescript SK (-) obtained above, 0.1 ⁇ g of NlalV-Notl fragment derived from plasmid KM 1732HA2, and 0.05 ⁇ g of phosphorylated synthetic DNA were sterilized in a total volume of 10 ⁇ l.
  • ligation was performed using DNA ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) according to the instruction manual.
  • the recombinant plasmid DNA solution thus obtained was used to transform Escherichia coli DH5 ⁇ strain (manufactured by Toyobo) to obtain the plasmid pBS1732H shown in FIG.
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 2 ⁇ g of an EcoRI-Spll fragment of about 2.95 kb was recovered.
  • 5 ⁇ g of plasmid KM 1732-2 was added to 10 ⁇ l of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM magnesium chloride, and ImM DTT, and an additional 10 units of restriction enzyme MboII (Toyo (Manufactured by Spinning Co., Ltd.) and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • the reaction ethanolate was Nord precipitate, 50 mM Tris - HCl (P H7.5), lOOmM sodium chloride, 10 mM chloride magnetic Shiumu, in addition to the LMM DTT force becomes buffer 10 mu 1, further 10 units of a restriction enzyme EcoRI (Takara (Manufactured by Shuzo) and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 ⁇ g of a boII-EcoRI fragment of about 0.38 kb was recovered.
  • 0.1 ⁇ g of the EcoRI-SplI fragment derived from the plasmid phKM1259LV0 obtained above, 0.1 ⁇ g of the EcoRI fragment of the plasmid KM1732L2-1 and 0.05 ⁇ g of phosphorylated synthetic DNA were added to a total volume of 10 ⁇ l of sterilized water. Ligation was performed using DNA ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) according to the instruction manual. Escherichia coli DH5 ⁇ strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant plasmid DNA solution obtained in this manner, and plasmid pBS1732L shown in FIG. 2 was obtained.
  • 3 / g of the humanized antibody expression vector No. 93 was added to 10 ⁇ l of a buffer solution containing lOmM Tris-HCl ( ⁇ 7.5), 10 mM magnesium chloride and ImM DTT, and 10 units of the restriction enzyme Apal ( (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • the reaction solution was precipitated with ethanol, and a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, ImM DTT, 100 ⁇ g / ml BSA and 0.01% Triton X-100 was used.
  • the reaction mixture was precipitated with ethanol and dissolved in 10 n 1 of a buffer consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, ImM DTT, 100 ⁇ g / ral BSA and 0.01% Triton X-100.
  • 10 units of a restriction enzyme NotK (Takara Shuzo) was further added and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.46 kb Apa Notl fragment was recovered in an amount of about 0.5 ⁇ g.
  • the antibody expression vector pKANTEX1750 was constructed as follows.
  • the reaction solution was precipitated with ethanol, and the solution was diluted to 10 ⁇ l of a buffer solution containing 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, ImM DTT, 100 ⁇ g / ml BSA and 0.01% Triton X-100.
  • 10 units of Notl manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis. After fractionation, about 0.5 ⁇ g of an approximately 0.41 kb Av26I-Notl fragment was recovered.
  • ligation was performed using DNA ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) according to the instruction manual.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant plasmid DNA solution obtained in this manner to obtain a plasmid PBS1750H shown in FIG.
  • plasmid KM1750L3-1 was added to 10 ⁇ l of a buffer consisting of 100 mM Tris-HCl (pH 8.8), 440 mM sodium chloride, 12 mM magnesium chloride, 14 mM 2-mercaptoethanol, and 200 ⁇ g / ml BSA.
  • 10 units of a restriction enzyme Maell (Boehringer 1. Mannheim) was further added and reacted at 50 ° C. for 1 hour.
  • the reaction mixture was precipitated with ethanol, added to 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 10 ⁇ l of ImM DTT buffer, and 10 units of restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo). And reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • the reaction mixture was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 ⁇ g of a Maell-EcoRI fragment of about 0.38 kb was recovered.
  • the reaction market shares ethanol precipitation, 50 mM Tris - HCl ( ⁇ ⁇ 7 ⁇ 5), lOOmM sodium chloride, 10 mM chloride mug Neshiumu, lmM DTT, 100 ⁇ g / ml BSA and 0.01% Triton X - 100 force becomes buffer 10
  • 10 units of Notl manufactured by Takara Shuzo
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 ⁇ g of an Apal-Notl fragment of about 0.46 kb was recovered.
  • PKANTEX 1732 and pKANTEX 1750 were introduced by electroporation [Cytotechnology, ⁇ 133 (1990)] according to the method of Miyachi et al.
  • dienecin (hereinafter referred to as G418, manufactured by Gibco) was added to a concentration of 0.5 mg / ml, and the cells were further cultured for 1 to 2 weeks. G418 resistant transformant colonies appeared and the culture supernatant was recovered from the confluent gel.
  • the activity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody in the supernatant was determined as follows. It was measured by immunoassay.
  • the soluble human VEGF receptor Fit-17N was prepared according to the method of Tanaka et al. [Japanese Journal of Cancer Research, 88 ⁇ 867 (1997)]. Dispense 1 ⁇ g / ml soluble human VEGF receptor Fit-17N diluted with PBS into a 96-well EIA plate (manufactured by Glyner) at 50 ⁇ 1 / well, and add 4 ⁇ C It was left to adsorb. After washing with PBS, 100 ⁇ l / well of PBS containing 1% BSA (hereinafter referred to as 1% BSA-PBS) was added and reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups.
  • 1% BSA-PBS PBS containing 1% BSA
  • MTX nM methotrexate
  • transformants showing activity further increase the MTX concentration to 100 nM and 200 nM by the same culturing method as above, and use RPMI1640-FCS (10) medium containing 0.5 mg / ml G418 and 200 nM MTX.
  • a transformant capable of growing and highly producing an anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody was obtained.
  • the resulting transformant was cloned twice by the limiting dilution method to obtain a final transformed anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody-producing transformant cell line.
  • a transformed cell line obtained by introducing the expression vector # 32 that is, a transformed cell line that produces an anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody derived from the anti-human VEGF receptor Fit-1 mouse monoclonal antibody KM1732
  • An example thereof is KM2532, and the anti-human VEGF receptor Flt-II human chimeric antibody produced by it is named KM2532.
  • a transformed cell line obtained by introducing the expression vector pKANTEX1750 that is, a transformant that produces an anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody derived from the anti-human VEGF receptor Fit-1 mouse monoclonal antibody KM1750
  • KM2550 the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody produced by it is named KM2550.
  • the productivity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody of each of the obtained transformed cell clones was about 5 ⁇ g / 10 6 cells / 24 hours.
  • the cells were suspended at a concentration of 1 to 2 ⁇ 10 5 cells / ml, and 200 ml of the suspension was dispensed into 175 cm 2 flasks (manufactured by Grainer Co., Ltd.) in total of 5 cells.
  • the cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 5 to 7 days. When the cells became confluent, about 1.0 L of each culture supernatant was collected.
  • the purified anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 were analyzed by SDS-PAGE. SDS-PAGE followed a known method [Anticancer Research, 12, 1121 (1992)]. The gel used was a 5-20% gradient gel (manufactured by Atoichi Co., Ltd.).
  • the molecular weight of the gel was low molecular weight protein molecular weight marker “Daiichi” II, and high molecular weight protein molecular weight marker “Daiichi” 111 ( Under a reducing and non-reducing condition, 2.5 ⁇ g of protein per lane of anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 were used under reducing and non-reducing conditions, respectively. Electrophoresed and stained with Coomassie Brilliant Blue. The results are shown in FIG.
  • the human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 showed an IgG band at a molecular weight of about 150 kDa, and under reducing conditions, an H-chain band power of about 50 kDa and an L-chain of about 25 kDa. A band was observed.
  • the IgG type antibody breaks the intermolecular disulfide bond and breaks down into two heavy and light chains, respectively.
  • the molecular weight is composed of two heavy and short chains, respectively. Consistent with its existence as a 150 kilodalton molecule, a human chimera Antibodies KM2532 and KM2550 were shown to be antibody molecules with the correct structure.
  • the binding activity of the purified anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 to the human VEGF receptor Fit-1 was confirmed according to the following procedure.
  • Soluble human Fit- 17N was prepared according to the method of Tanaka et al. [Japanese Journal of Cancer Research, 88, 867 (1997)].
  • the amount of soluble human Fit-17N to be adsorbed to a 96-well EIA plate was fixed using enzyme immunoassay, and the binding activity was examined by changing the concentration of the added human chimeric antibody.
  • 1% BSA-PBS was discarded, and 0.152 to 333 ng / ml of purified anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 were dispensed at 50 1 / well and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with 0.05% tween-PBS, a peroxidase-labeled anti-human IgG antibody (manufactured by American Corex) diluted 3000 times with 1% BSA_PBS was added at 50 1 / well, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • ABTS substrate solution [2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazol-6-sulfonic acid) ammonium] at 50 ⁇ l / well to develop color, and measure absorbance at OD415nm. The measurement was carried out using E max (Molekiura I, manufactured by Devices).
  • the results are shown in FIG.
  • the binding activities of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 were almost the same.
  • the binding activity of the human chimeric antibody was examined by changing the amount of soluble human Fit-17N adsorbed on a 96-well EIA plate using enzyme immunoassay. Dispense 0.04 to 10 ⁇ g / ml soluble human VEGF receptor Fit-17N diluted in PBS at 50 ⁇ l / well into a 96-well BIA plate (Glyna) at 4 ° C. ⁇ ⁇ Leave and let it adsorb. With PBS After washing, 1% BSA-PBS was reacted with 100 ⁇ l / Derka syrup at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups.
  • 1% BSA_PBS was discarded and 10 ⁇ g / ml of purified anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 were dispensed at 50 // 1 / well and reacted at room temperature for 1 hour. .
  • a peroxidase-labeled anti-human IgG antibody manufactured by American Corex
  • 1% BSA-PBS was added at 50 ⁇ l / well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • the ABTS substrate solution [2.2-azinobis (3-ethylpentazothiazol-6-sulfonic acid) ammonium] was added at 50 ⁇ l / well to develop the color. Absorbance was measured using E max (Molequiura I 'Devices).
  • the result is shown in FIG. 10 (B).
  • the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 showed binding activity depending on the concentration of the soluble human VEGF receptor Fit- 17 adsorbed on the plate.
  • the binding activities of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 were almost the same.
  • the activity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody to inhibit the binding between human VEGF and human VEGF receptor Fit-1 was examined as follows. Methanol was dispensed into a 96-well 'Multiscreen-IP plate (Millipore) at 100 n1 / well to hydrophilize the PVDF membrane at the bottom of the plate. After washing with water, soluble human VEGF receptor Fit-17N diluted to a concentration of 0.2 ⁇ g / ml with PBS was dispensed at 50 ⁇ l / well, and allowed to stand at 4 ° C for adsorption. .
  • 1% BSA-PBS was added in an amount of 50 ⁇ l / well, and reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups.
  • anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 have the same binding inhibitory activity of human VEGF and human VEGF receptor Fit-1 as anti-human VEGF receptor Fit-1 mouse monoclonal antibodies KM1732 and KM1750. It was shown that the human chimeric antibody retained the activity of the mouse monoclonal antibody.
  • Soluble human VEGF receptor KDR 7N and soluble human VEGF receptor chimeric protein Fit-17N.K2 were prepared as follows.
  • a soluble human VEGF receptor KDR fragment (hereinafter referred to as a soluble human VEGF receptor KDR 7N) corresponding to 19 amino acids constituting the signal peptide of human VEGF receptor KDR and the 738th amino acid from the N-terminal amino acid of the mature form, and a linker
  • a vector for expressing the derived 2-amino acid residue was prepared by the following procedure.
  • the soluble human VEGF receptor KDR 7N is composed of seven immunoglobulin-like sites from the N-terminal side of the extracellular region of the soluble human VEGF receptor KDR.
  • pUC-KDR CDNA clone encoding full-length cDNA of human VEGF receptor KDR B CMG S-Neo-KDR [Cell Growth & Differentiation 7, 213 (1996)] is cut with EcoRI to encode extracellular and membrane-bound regions of DR
  • a pUC-KDR was prepared by incorporating the approximately 2.8 kb fragment into the EcoRI site of pUC18.
  • pUC-KDR was digested with Xhol, treated with Klenow, and inserted with Xbal linker (SEQ ID NO: 57) to prepare pUC-KDR-Xb.
  • pBS-KDR-Xb-S After inserting the Xbal-BamHI (2.3 kbp) fragment of pUC-KDR-Xb into the Xbal / BamHI site of pBluescriptll KS (+), a Sphl-BamHI (5.2 kbp) fragment was prepared, and a synthetic linker containing a SnaBI site ( SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59) were used to prepare pBS-KDR-Xb-S.
  • pBS-KDR-Xb-S was cut with SnaBI / BamHI, and a synthetic linker (SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 61) containing a stop codon and a Notl site was incorporated to prepare pBS-KDR (Xb) -SN. .
  • an oligonucleotide consisting of 56 bases SEQ ID NO: 62
  • a site-directed mutagenesis kit MutanK (Takara Shuzo) were used according to the manual attached to Takara Shuzo site-directed mutagenesis kit MutanK.
  • perform site-directed mutagenesis, Fit- 1 extracellular region second I Takeno immunoglobulin-like site and the region coding is deletion mutant Fit- 1 plasmid carrying a gene of (P M 13- fh, - D2N ) was prepared.
  • a DNA fragment encoding the site was recovered.
  • the DNA fragment Cleavage with Narl / Kpnl yielded a 340 bp Narl / Kpnl fragment.
  • the DNA fragment and the Smal / Narl (0.5 kb) fragment of pM13-flt'-D2N were inserted into the Smal / pnl site of pBluescriptll to prepare pBSfit-1'-KDR2N.
  • each of the obtained recombinant viruses was propagated by the following procedure.
  • the virus titer of the obtained recombinant virus solution was calculated by the method described in the Bakuguchi Gold Starter Kit 'Manual (manufactured by Pharmingen).
  • a medium containing [agagar plaque 'Agarplaque Agarose', manufactured by Pharmingen] (Sterile lml of 5% agarplaque plus' agagarose aqueous solution and 4ml of TMN-FH Insect Medium) are mixed and kept at 42 ° C.
  • vinyl tape was wrapped around a Petri dish to prevent drying, the dish was placed in a sealable plastic container, and cultured at 27 ° C for 6 days.
  • each of the recombinant virus solutions contained about 1 ⁇ 10 7 plaque forming units (hereinafter, referred to as PFU) / ml of virus.
  • PFU plaque forming units
  • the collected purified fraction was concentrated using Centriprep 10 (manufactured by Amicon), and 4.8 ml of a solution of soluble human VEGF receptor KDR 7N (protein concentration: 815 ⁇ g / ml, purity: 70-80%) Obtained.
  • the soluble human VEGF receptor chimeric protein Fit- 17N.2 was purified as follows.
  • the column was filled with about 20 ml of heparin mono-Sepharose CL-6B Ge / re [Phanoremasia 'Pharmacia Biotech AB] and 0.5 ml / 100 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer. The column was washed at a flow rate of 1 minute. After washing, 900 ml of the culture solution containing the soluble human VEGF receptor chimeric protein Fit-17N.K2 prepared as described above was passed through a heparin-sepharose CL-6B column at a flow rate of 0.5 ml / min.
  • the protein contained in each fraction was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and 50 to 70 ml of the fraction containing the soluble human VEGF receptor chimeric protein Fit- 17N.K2 was collected, and centrifuged. It was concentrated using Librep 10 (manufactured by Amicon). After concentration, 5.8 ml of each of the soluble human VEGF receptor chimeric protein Fit- 17N.K2 was obtained as a solution (protein concentration: 588 ⁇ g / ml, purity: 65 to 75%).
  • Soluble human VEGF receptor Fit-17N (corresponding to the 750th position from the N-terminal amino acid including the signal sequence), soluble human VEGF receptor Flt-13N (corresponding to the 338th position from the N-terminal amino acid including the signal sequence), Soluble human VEGF receptor Fit-12N (corresponding to the 223rd amino acid from the N-terminal amino acid including the signal sequence) was prepared according to the method of Tanaka et al. [Japanese Journal of Cancer Research, 88, 867 (1997)].
  • Soluble human receptor KDR 7N (including the signal sequence, equivalent to position 738 from the N-terminal amino acid), soluble human VEGF receptor chimeric protein Fit- 17N.2 (amino acids 100-204 of human Fit- 17N) was converted to amino acids 95 to 199 of human KDR via a linker) according to (6-5).
  • FIG. 32 shows a schematic diagram of various derivatives of the soluble human VEGF receptor used in the experiment.
  • the reactivity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 mouse monoclonal antibody M1732, KM1750 and the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2532, KM2550 were compared using an enzyme immunoassay. Transfer 4 ⁇ g / ml of Flt-17N, Flt-1 3N, Flt-1 2N, Flt-1 7N.K2, and KDR 7N diluted with PBS to a 96-well E1A plate (Glyna). Each was dispensed at 50 ⁇ l / ⁇ , and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption.
  • 1% BSA-PBS was allowed to react at 100 ⁇ l / perker nutrient at room temperature for 1 hour to block remaining active groups. Discard 1% BSA-PBS, 0.1 g / ml purified anti-human VEGF receptor Fit-1 mouse monoclonal antibody ⁇ 32 or KM1750, or purified anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2532 or KM2550 was dispensed at 50 / z1 / well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • ABTS substrate solution [2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid) ) Ammonia] was added at 50 ⁇ l / well to develop color, and the absorbance at OD 4 15 mn was measured using E max (Molecular 'Devices).
  • KM2550 (Fit-17N, Fit-13N, Fit-12N) did not bind to Fit-17N.K2 or KDR7N. Therefore, anti-human VEGF receptor Fit-1 mouse monoclonal
  • the epitopes recognized by the antibodies KM1732 and KM1750 and the anti-human VBGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2532 and K2550 must be contained in the region from the N-terminal amino acid 100 to 204 of the human Fit-1 It has been shown.
  • 1% BSA-PBS was added at 100 ⁇ l / well, and reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups.
  • 1% BSA-PBS was discarded, and 0.0152 to 100 ng / ml of purified anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2532 or KM2550 was dispensed at 50 ⁇ l / mL and allowed to react at room temperature for 1 hour. .
  • 1% BSA-PBS was added in an amount of 100 ⁇ l / ml, and reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups.
  • 1% BSA-PBS was discarded, and 5 ⁇ g / ml of a purified anti-human VEGF receptor Flt-1 human chimeric antibody KM2532 or KM2550 was dispensed with 5 Q ⁇ l / well, respectively, and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • a peroxidase-labeled anti-human IgG antibody (manufactured by American Corex) diluted 3000-fold with 1% BSA-PBS was added at 50 ⁇ l / well, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the ABTS substrate solution [2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid) ammonium] was added at 50 ⁇ l / well to develop color, and the absorbance at OD415mn was measured at E max ( (Molecular Devices, Inc.).
  • Anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2532, M2550 shows binding activity depending on the concentration of soluble human VEGF receptor Fit-17N, Flt-1 3N, Flt-1 2N adsorbed on the plate, It did not react with Flt-17N.K2 or KDR7N.
  • the binding activities of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibodies KM2532 and KM2550 were almost the same.
  • Anti-human VEGF receptor Fit-1 mouse with neutralizing activity against human VEGF receptor Fit-1 Mouse monoclonal antibody KM1732, M1750 and anti-human VEGF receptor Fit-1 Human chimeric antibodies KM2532, KM2550 With anti-human VEGF receptor Fit-1 human CDR Implanted antibodies were produced as follows.
  • VH of various known human antibodies Were classified into subgroups I to III (HSG I to III) based on the homology of their amino acid sequences, and a common sequence was identified for each subgroup. Therefore, based on these consensus sequences, the amino acid sequence of VH of the anti-human VEGF receptor Flt-1 human CDR-grafted antibody was designed.
  • the final concentration of each synthesized DNA was 0.1 // M 200 ⁇ M dNTP (Takara Shuzo), 0.5 ⁇ M 13primer RV (Takara Shuzo), 0.5 ⁇ M 13primer M4 (Takara Shuzo) and 2.5 units of TaKaRa Ex Taq DNA polymerase —Takara Shuzo
  • the reaction solution was treated using Q1A quick PCR Purification Kit (manufactured by Qiagen) according to the attached instructions, purified and eluted with 20 ⁇ l of sterile water. Next, the obtained eluate was added to 30 ⁇ l of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and ImM DTT, and 20 units of the restriction enzyme Apal (Takara Shuzo) was further added. The reaction was performed at 37 ° C for 1 hour.
  • the reaction solution was precipitated with ethanol, and 10 mM buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, ImM DTT, 100 ⁇ g / ml BSA and 0.01% Triton X-100 was used.
  • 10 units of restriction enzyme N'otI (Takara Shuzo) was further added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.44 kb of Apa Notl fragment of about 0.44 kb was recovered.
  • the ligation was performed using DNA ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) according to the instruction manual.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain manufactured by Toyobo Co., Ltd. was transformed using the recombinant plasmid DNA solution thus obtained.
  • Each plasmid was prepared from 10 transformed Escherichia coli, and the nucleotide sequence was determined according to the method described in Section 1 (4) of Example 1. As a result, the result was shown in FIG. 12 containing cDNA encoding the amino acid sequence of interest.
  • the plasmid phKM1732HV0 was obtained.
  • the nucleotide sequence of VH (hereinafter referred to as 1732HV0) of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human CDR-grafted antibody contained in ph M1732HV0 is shown in SEQ ID NO: 31 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 90.
  • Anti-human VEGF receptor contained in P hKM1750HV0 Fit- 1 human CDR-grafted antibody VH showed the nucleotide sequence SEQ ID NO: 38 and amino acid sequences (hereinafter, referred to as 1750HV0) in SEQ ID NO: 91.
  • Hikbat et al. Classified the VL of various known human antibodies into subgunes 1 to iV (HSGl to [V]) based on the homology of their amino acid sequences, and identified a common sequence for each subgunle. Therefore, the amino acid sequence of VL of the anti-human VEGF receptor Flt-1 human CDR-grafted antibody was designed based on those consensus sequences. First, in order to select a consensus sequence as a basis, the amino acid sequence of the FR of the consensus sequence of the VL of the human antibody of each subgroup and the FR sequence of the VL of the anti-human VEGF receptor Flt-1 mouse monoclonal antibody KM1732 and KM1750 were selected. The homology with the amino acid sequence was examined (Table 2).
  • the reaction solution was treated using QIA quick PCR Purification Kit (manufactured by Qiagen) according to the attached instructions, purified with 20 ⁇ l of sterilized water, and eluted. Next, the obtained eluate was added to 50m Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), lOOmM sodium chloride, 10mM magnesium chloride, ImM DTT and 30 ⁇ l of 100 ⁇ g / ml BSA buffer, and 10 units of The restriction enzyme EcoRI (manufactured by Takara Shuzo) and the restriction enzyme SplK (manufactured by Takara Shuzo) were added and reacted at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 ⁇ g of an EcoRI-Spll fragment of about 0.39 kb was recovered.
  • QIA quick PCR Purification Kit manufactured by Qiagen
  • Each plasmid was prepared from 10 transformed Escherichia coli, and the nucleotide sequence was determined according to the method described in Example 1, paragraph 1 (4). As a result, the result was shown in FIG. 14 containing cDNA encoding the desired amino acid sequence.
  • the plasmid phKM1732LV0 was obtained.
  • the nucleotide sequence of VL (hereinafter referred to as 1732LV0) of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human CDR-grafted antibody contained in phKM1732LV0 is shown in SEQ ID NO: 45, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 92.
  • VL of the anti-human VEGF receptor Flt-1 human CDR-grafted antibody contained in phKM1750LVO (IV) [hereinafter referred to as 1750 and V0 (IV)] SEQ ID NO: 52 and the amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 93.
  • 1750 and V0 (IV) The nucleotide sequence of VL of the anti-human VEGF receptor Flt-1 human CDR-grafted antibody contained in phKM1750LVO (IV) [hereinafter referred to as 1750 and V0 (IV)] SEQ ID NO: 52 and the amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 93.
  • VL of anti-human VEGF receptor Fit- 1 human CDR-grafted antibody contained in c PhKM1750 teeth V0 (1) to obtain plasmid phKM1750LV0 (I) is that containing cDNA encoding the amino acid sequence of interest shown in FIG. 33 [hereinafter , 1750LV00)] is shown in SEQ ID NO: 71, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 94.
  • Notl a product of Takara Shuzo Co., Ltd.
  • 10 units of Notl (a product of Takara Shuzo Co., Ltd.) was further added and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour.
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 ⁇ g of an Apal-Notl fragment of about 0.44 kb was recovered.
  • the tandem cassette vector for humanized antibody expression obtained in Example 1 2 (1), 0.1 g of the Apat Notl fragment derived from pKANTEX93 and 0.1 g of the Apt Notl fragment derived from the plasmid phKM 1732HV0 obtained above were used in a total amount of 10 g. ⁇ l of sterile water, add DNA ligation Kit Ver.2 (Takara (Manufactured by Shuzo) according to the instructions for use.
  • Escherichia coli DH5: strain manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the positions of tyrosine at position 27, alanine at position 40, arginine at position 67, threonine at position 69, isoleucine at position 70, glutamic acid at position 82, glutamic acid at position 82, and palin at position 93 are the amino acid sequences of SEQ ID NO: 45 in VL. Positions 39, leucine 45, leucine 46, aspartic acid 69, and phenylalanine 70 play important roles in binding to human VEGF receptor Fit-1 Was thought.
  • VL aspartic acid at position 17 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 71, arginine at position 18, The positions of proline at position 59, serine at position 59, aspartic acid at position 69, and fujylalanine at position 70 were thought to play important roles in binding to the human VEGF receptor Fit-1.
  • Anti-human VEGF receptor Anti-human derived from Fit-1 mouse monoclonal antibody KM1750 The H chain of the VEGF receptor Fit-1 human-type CDR-grafted antibody has three residues among the five amino acid residues shown above, which are thought to play an important role in binding to the human VEGF receptor Flt-1.
  • the positions of the groups (glutamic acid at position 82, serine at position 84, tyrosine at position 95) are considered particularly important, so the corresponding residues found at 1750 (glutamine at position 82, arginine at position 84, position 95)
  • CDNA encoding the amino acid sequence substituted with phenylalanine was constructed as follows using the PCR method.
  • plasmid phKM1750HV0 After treating the plasmid phKM1750HV0 with the restriction enzymes Apal and Mrol, an Apal-Mrol fragment of about 3.04 kb was recovered, the PCR amplified fragment obtained above was ligated, and Escherichia coli DH5 ⁇ was obtained using the obtained recombinant plasmid DNA solution. (Toyobo Co., Ltd.). Each plasmid was prepared from 10 transformed Escherichia coli cells, and the nucleotide sequence was determined according to the method described in Example 1, paragraph 1 (4). As a result, the plasmid containing the cDNA encoding the desired amino acid sequence was obtained. The plasmid phKM1750HV3 shown in (1) was obtained.
  • the nucleotide sequence of VH (hereinafter, referred to as 1750HV3) of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human CDR-grafted antibody contained in ph M1750HV3 is shown in SEQ ID NO: 78, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 95.
  • the light chain of the antibody plays an important role in binding to the human VEGF receptor Flt-1, and 4 residues out of the 6 amino acid residues shown above,
  • the positions of aspartic acid at position 17, arginine at position 18, aspartic acid at position 69, and phenylalanine at position 70) are considered to be particularly important in KM175OLV00), so the corresponding residues found in KM1750 (17
  • a cDNA encoding the amino acid sequence substituted with glutamic acid at position 18, glutamic acid at position 18, phenylalanine at position 69, and tyrosine at position 70 was constructed using PCR as follows.
  • FIG. 46 shows the amino acid sequences of KM1750 mouse L chain, KM1750LV0 (I), KM1750LV (IV), and KM1750LV4.
  • coli DH5 ct / pHKM1750LV4 with recombinant plasmid PHKM1750LV4 are FERM BP-6719, FERM BP-6720, FERM BP-6716, FER, respectively.
  • BP-6717, FERM BP-6718 have been deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on May 12, 2001.
  • G418 manufactured by Gibco
  • G418-resistant transformant colonies appeared, culture supernatants were collected from confluent wells, and the activity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 human CDR-transferred antibody in the supernatants was measured. The measurement was carried out by the enzyme immunoassay described in section 1 (2) (3).
  • Expression vectors pKANTEX 1750HV0LV0 (I), pKANTEX 1750HV0LV0 (IV), pKANTEX 1750HV3LV0 (I), pKANTEX 1750HV3LV0 (IV), pKANTEX-1750HV0LV4, pKANTEX 1750HV3LV4 , KM8550, KM8551, KM8552, and KM8553 are examples of transformants that produce anti-human VEGF receptor Fit-1 human CDR-grafted antibody derived from KM1750, an anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody.
  • the culture supernatant containing the anti-human VEGF receptor Flt-1 human CDR-grafted antibody-producing strains KM8550, KM8551, KM8552, KM8553, M8554, KM8555 prepared as described above was 2.3 L, 2.5, and 1.9, respectively.
  • 2.4, 1.1 L and 2 L were passed through a Prosep A column at a flow rate of 70 ml / hour.
  • washing is carried out stepwise with 4 ml each of 50 mM citrate buffer at pH 6, pH 5, and pH, followed by 50 mM quench.
  • the human CDR-grafted antibody was eluted by passing 7 ml of an acid buffer (pH 3.0) through the column.
  • anti-human VEGF receptor Fit-1 human CDR-grafted antibodies KM8550, KM8551, M8552, M8553, KM8554, and K8555 were obtained at l.lmg ⁇ 1.8 mg, 1.6 mg, 1.6 mg, 2.2 mg, 1.3 mg, and 1.6 mg, respectively.
  • the purified anti-human VEGF receptor Fit-1 human CDR-grafted antibody ⁇ 8550, ⁇ 8 ⁇ 1, ⁇ 8552, ⁇ 8553, ⁇ 8554, and ⁇ 8555 were analyzed by the SDS-PAGE method described in Example 1, section 2 (3).
  • Anti-human VEGF receptor 2 g of the protein amount per lane under reducing and non-reducing conditions Fit- 1 human CDR-grafted antibody KM8550, 855 U KM8552, ⁇ 8553, ⁇ 8554, ⁇ 8 ⁇ ⁇ 2 wherein Example 1 (4)
  • the anti-human VEGF receptor Flt-l human chimeric antibody KM2550 and the control human-type CDR-grafted antibody react with gandarioside GM2 and do not react with human VEGF receptor Fit-1 as shown in KM8969 ( JP-A-10-257893) were respectively electrophoresed and stained with Coomassie brilliant blue. The results are shown in FIG. Human CDR-grafted antibody KM8550, KM8551, M8552 N
  • M8553, ⁇ 8554, ⁇ 8 ⁇ 5 have a molecular weight of about 150 kDa under non-reducing conditions. Under the reducing conditions, a band of the H chain was observed at about 50 kDa, and a band of the L chain was observed at about 25 kDa. This result indicates that the IgG-type antibody breaks the intermolecular disulfide bond under reducing conditions and breaks down into two heavy and light chains, respectively, and under non-reducing conditions, two heavy and light chains respectively.
  • the human CDR-grafted antibodies KM8550, KM8551, KM8552, KM8553, KM8554, and M8555 were shown to be antibody molecules with the correct structure.
  • Anti-human VEGF receptor Fit-1 human CDR-grafted antibody KM8550, ⁇ , ⁇ 8552, ⁇ 8553, ⁇ 8554, ⁇ 85 ⁇ and anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2550 is a human VEGF receptor dependent on antibody concentration Fit- 17N.
  • the binding activity of M2550 was almost equivalent. Accordingly, it was revealed that the six human CDR-grafted antibodies of the present invention retain the binding activity of the human chimeric antibody KM2550.
  • Figure 43 shows the results.
  • Anti-human VEGF receptor Flt-1 human CDR-grafted antibody KM8550, ⁇ 8 ⁇ 1 ⁇ ⁇ 8552, ⁇ 8553, ⁇ 8554, ⁇ 8555 and anti-human VEGF receptor Fit- 1 human chimeric antibody KM2550 showed all comparable reaction specificity, Flt It reacted with 17N, Flt-1 3N, and Flt-1 2N, but did not react with Fit-17N.K2 or KDR7 at all.
  • the anti-GM2 human CDR-grafted antibody KM8969 Japanese Patent Laid-Open No. 10-257893
  • the six human CDR-grafted antibodies of the present invention retain the binding specificity of the human chimeric antibody KM2550.
  • the activity of KM2550 to inhibit the binding between human VEGF and human VEGF receptor Fit-1 was examined according to the method described in Example 1, paragraph 2 (5).
  • the antibody concentration to be added was 0.0048 to 15 g / ml (5-fold dilution series).
  • the results are shown in FIG.
  • KM8555 and anti-human VEGF receptor Fit-1 human chimeric antibody KM2550 inhibited binding of human VEGF to human VEGF receptor Fit-1 in an antibody concentration-dependent manner. Accordingly, it was revealed that the six human CDR-grafted antibodies established in the present invention retain the VEGF-Fk-1 binding inhibitory activity of the human chimeric antibody KM2550.
  • a soluble human VEGF receptor Fit-1 fragment (hereinafter referred to as soluble human VEGF receptor Fit-13N) corresponding to positions 1 to 338 (including the signal sequence) from the N-terminal amino acid of human VEGF receptor Fit-1
  • C- soluble human VEGF receptor F-13, for which a vector for expression was prepared by the following procedure, is composed of three immunoglobulin-like sites from the N-terminal side of the extracellular region of the soluble human VEGF receptor Fit-1. Is equivalent to
  • a soluble human VEGF receptor Fk-1 fragment corresponding to positions 1 to 750 (including the signal sequence) from the N-terminal amino acid of human VEGF receptor Fit-1 (hereinafter referred to as soluble human VEGF receptor Fit-17N)
  • a vector for expression was prepared by the following procedure.
  • the soluble human VEGF receptor Fit- 17 corresponds to seven immunoglobulin-like sites in the extracellular region of the soluble human VEGF receptor Fit-1.
  • DNA 10 ng, and 10 mM deoxynucleotide triphosphate 2.5 units Taq polymerase was added to 100 ⁇ l of a 10 mM MgCl 2 , 0.001% (W / V) gelatin solution containing (deoxynucleotide triphosphates).
  • the reaction was pre-treated at 95 ° C for 5 minutes, followed by 30 polymerase 'chain' reactions (PCR) at 95 ° C for 90 seconds, 50 ° C for 90 seconds, and finally 72 ° C for 90 seconds.
  • the DNA fragment was recovered repeatedly. This DNA fragment was digested with Hindm (at position 1893 bp in # 3-7 clone) and Notl, and a 610 bp Hindlll-Notl DNA fragment, that is, a 1894-2499 bp fragment and a complete codon in A DNA fragment containing the Notl recognition sequence was recovered. Next, the flt # 3-7 clone was digested with both EcoRl and Hindlll restriction enzymes, and an 1893 bp EcoRI-Hindlll fragment was recovered from the 5 'end.
  • Production of protein by insect cells requires the production of a recombinant virus incorporating the gene of interest
  • the process of incorporating the cDNA encoding the protein of interest, called transfer vector 1 into a special plasmid
  • the virus and the transfer vector are cotransfected into insect cells, and the recombinant virus is obtained by homologous recombination.
  • the above process was performed according to the manual according to the manual using the Bakulogo logo starter kit (product number PM-21001K) manufactured by Farmingen.
  • the recombinant virus obtained for use in protein expression was propagated by the following procedure. 2 ⁇ 10 7 Sf9 cells were suspended in 10 ml of Sf00-Il medium, placed in a 175 cm 2 flask (manufactured by Grainer Co., Ltd.) and allowed to stand at room temperature for 1 hour to allow the cells to adhere to the flask. After standing, the supernatant was removed, and 1 ml of a fresh culture supernatant containing the TMN-FH Insect Medium and the above recombinant virus was added, followed by culturing at 27 ° C for 3 days. After the culture, the supernatant was centrifuged at 1,500 X g for 10 minutes to remove cells, and a recombinant virus solution used for protein expression was obtained.
  • the virus titer of the obtained recombinant virus solution was determined using the Baculo Logo First Starter. —Calculated by the method described in the kit manual (Pharmingen).
  • each of the recombinant virus solutions contained about 1 ⁇ 10 7 PFLI / ml of the virus.
  • Soluble human VEGF receptors Fit-17N and Fit-13N were obtained as follows. 4 ⁇ 10? High Five cells were suspended in 30 ml of EX-CELL TM 400 medium (manufactured by JRH Bioscience) in a 175 cm 2 flask (manufactured by Grainer), allowed to stand at room temperature for 1 hour, and allowed to adhere to the flask. Add 1 ml of a solution containing the recombinant virus derived from the transfer vectors pVL1393 / Flt 7N and pVL1393 / Flt 3N obtained in (3) at a concentration of about 1-3 ⁇ 10 8 PFU / ml, and infect for 2 hours at room temperature. I let it.
  • the culture supernatant was removed and a fresh 30 ml of EX-CELL TM 400 medium was added, followed by culturing at 27 ° C for 3 to 4 days. After completion of the culture, the culture supernatant was collected and centrifuged at 1,500 X g for 10 minutes to obtain a supernatant.
  • the column was filled with approximately 60 ml of heparin-sepharose CL-6B gel (Pharmacia Biotech AB) and 0.5 ml of 20 ml of 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5) buffer. The column was washed at a flow rate of / min. After washing, 1000 ml of the culture solution containing the soluble human VEGF receptor Fit-17 and Flt-13 prepared as described above was passed through a heparin-sepharose CL-6B column at a flow rate of 0.5 ml / min.
  • the column was filled with approximately 20 ml of heparin-sepharose CL-6B gel (Pharmacia Biotech AB) and 0.5 ml / min using 200 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer. Wash at flow rate. After washing, 500 ml of the culture solution of High Five cells prepared as described above was passed through a heparin-sepharose CL-6B column at a flow rate of 0.5 ml / min.
  • Methanol was dispensed into a 96-well Immobilon TM -P Filtration Plate (96-well Immobilon TM -P Filtration Plate; manufactured by Millipore) at 100 ⁇ l / well to hydrophilize the PVDF membrane at the bottom of the plate.
  • PBS-diluted 2 ⁇ g / ml soluble human Fit-17N was dispensed at 50 ⁇ l / well, and allowed to stand at 4 ° C. for adsorption. After washing, 100 ⁇ l / well of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups.
  • BSA bovine serum albumin
  • Human VEGF was obtained as follows. 4 ⁇ 10 7 High Five cells were suspended in 30 ml of EX-CELL TM 400 medium (manufactured by JRH Bioscience) in a 175 cm 2 flask (manufactured by Grina), allowed to stand at room temperature for 1 hour, and allowed to adhere to the flask. 1 ml of a solution containing human VEGF recombinant baculovirus solution obtained by the method described in the literature [Cell Growth & Differentiation, 7, 213 (1996)] at a concentration of about 1 to 3 ⁇ 10 8 PFU / ml, was added at room temperature. Time infected.
  • the culture supernatant was removed and a fresh 30 ml of EX-CELL TM 400 medium was added, followed by culturing at 27 ° C for 3 to 4 days. After completion of the culture, the culture supernatant was recovered and centrifuged at 1,500 X g for 10 minutes to obtain a supernatant.
  • the column was filled with about 40 ml of heparin-Sepharose C-6B gel (Pharmacia Biotech AB) and 400 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5). Washing was performed at a flow rate of 0.5 ml / min using a buffer solution. After washing, human prepared as above
  • the protein contained in each fraction was analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and 120 ml of a fraction containing human VEGF (0.5-1 M NaCl fraction) was collected. After concentration with Centriprep-10 (manufactured by Amicon), 4 ml (protein concentration: 1.2 mg / ml) of human VEGF was obtained as a solution.
  • NIH3 Ding 3-Flt- 1 cells IX 10 7 pieces of N 5 Shureimesu BALB (manufactured by Nippon SLC Co., Ltd.) in 3 animals, were administered a total of six times. Blood was collected from the fundus venous plexus or the tail vein, and its serum antibody titer was examined by the enzyme immunoassay shown below. The spleen was extracted 3 days after the last immunization from a mouse or rat showing a sufficient antibody titer. The BALB / c 5-week-old female to which NIH3T3-F-1 cells had been administered had no immunity, and the antibody titer to soluble Fit- 17N did not increase.
  • Spleen is shredded in MEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with forceps, and centrifuged
  • the 8-azaguanine-resistant mouse myeloma cell line P3-shi'1 was cultured in a normal medium to secure 2 ⁇ 10 7 or more cells at the time of cell fusion and used as a parent strain for cell fusion.
  • mice spleen cells or rat spleen cells obtained in 2 and the myeloma cells obtained in 4 were mixed at a ratio of 10: 1, centrifuged (1, 200 rpm, 5 minutes), and the supernatant was discarded. After loosening the precipitated cell group, 37 with stirring.
  • 5 clones and 6 clones of anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibodies were obtained, and these were respectively identified as KM1737, K1739, M1740, KM1742, KM1743 and KM1743.
  • KM1731, KM1732 Named KM1731, KM1732.
  • three clones of KM1732, KM1748, and KM1750 were found to exhibit the inhibitory effect of human VEGF on Fit-1 binding shown in 8 below.
  • the three clones of M1730, KM1731 and KM1732 reacted extremely strongly with human VEGF receptor Fk-1 expressing cells in the immunocytostaining method shown in 10 below.
  • the antibody class of the monoclonal antibody was determined by an enzyme immunoassay using a subcluster typing kit (Zymet MZymed). The results are shown in Table 4 below. Table 4
  • Pristane-treated 8-week-old nude female mice (Balb / c) were injected intraperitoneally with 5-20 ⁇ 10 6 cells of the hybridoma strain obtained in 5 above. After 10 to 21 days, the hybridoma became ascites carcinoma. From accumulated mouse ascites, ascites collected (1 ⁇ 8ml / animal), centrifugal away (3,00 (p m, 5 min) and the force prills acid precipitation after removal of the solids (anti body Ichizu The product was purified according to the manufacturer's manual.
  • the specificity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody obtained in 5 was confirmed using the enzyme immunoassay described in 3.
  • Hybridomas were prepared from mice and rats immunized with Flt-17N, Among the monoclonal antibodies (KM1733, M1735, 1736, KM1737, KM1739, KM1740, M1742, KM1743, KM1745, M1746, KM1747) selected using Flt-1 7N, only KM1740 has Fit- 17 and Fit- 13 From the N-terminal amino acid of Flt-1 (including the signal sequence), it was revealed that the peptide recognized the 1-338th epitope. The remaining 10 clones react with Flt-17 but do not react with Fit-13N, and thus recognize the 339-750th epitope from the N-terminal amino acid of Flt-1 (including the signal sequence).
  • hybridomas were prepared from mice immunized with Fit-17N, and six monoclonal antibodies selected using Flt-13N (KM1748, KM1749, KM1750, KM1730, KM1731, K1732) All reacted with Flt-1 7N and Fit-13N, indicating that they recognized the epitopes 1-338 from the N-terminal amino acid of Flt-1 (including the signal sequence). became.
  • the binding inhibitory activity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody obtained in step 5 between human VEGF and human VEGF receptor Fit-1 was confirmed according to the following procedure.
  • Methanol was dispensed into a 96-well MultiScreen IP plate (96-well MultiScreen-IP Plate; manufactured by Millipore) at 100 ⁇ l / well to hydrophilize the PVDF membrane at the bottom of the plate.
  • a soluble human VEGF receptor Flt — 17N diluted to a concentration of 1.6 / zg / ml with PBS was dispensed at 50 ⁇ l / well, and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption.
  • PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) was added at 50 / il / well, and reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups.
  • BSA bovine serum albumin
  • a purified monoclonal antibody (0.01 to 7 ⁇ 29 ⁇ g / ml) diluted with the culture supernatant of hybridoma or 1% BSA-PBS solution containing 0.5 M NaCl is dispensed at 50 ⁇ l / well. Then, 3 ⁇ g / ml of 12- labeled human VEGF (manufactured by Amersham) was added at 50 ⁇ l / ml, and reacted at room temperature for 1.5 hours.
  • FIG. 24 shows the results of examining the activity of the culture supernatant of the hybridoma.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma is screened using the same protein as the antigen used for the immunogen. This time, a total of 11 monoclonal antibodies selected with Flt_l7N used as the immunogen did not show any binding inhibitory activity, and the six monoclonal antibodies selected with Fit-13N (KM1748, KM1749, KM1750, KM1730, KM1731, M1732), KM1748, KM1750 and KM1732 showed binding inhibitory activity.
  • the use of Flt_l3N for screening of hybridomas resulted in the acquisition of a monoclonal antibody having binding inhibitory activity, which was an unexpected effect.
  • FIG. 25 shows the results of examining the binding inhibitory activity using the purified anti-Fit-1 monoclonal antibodies KM1732, KM1748, and KM1750.
  • KM1732, KM1748, and KM1750 inhibited the binding of human VEGF to human VEGF receptor Fit-1 in a concentration-dependent manner.
  • the concentrations (IC50) of KM1732, KM1748, and KM1750 showing 50% inhibition of binding between human VEGF and human VEGF receptor Flt-1 were 1.1 ⁇ g / ml and 1.3 ⁇ g / mU 2.0 ⁇ g / ml.
  • mouse IgGl class anti-sialyl Lewis A monoclonal antibody KM231 [Anticancer
  • a 96-well multiscreen-HV plate (96-well ultiScreen-HV Plate; manufactured by Millipore) was added with 100 ⁇ l / well of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA), and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • BSA bovine serum albumin
  • NIH3T3-Fit-1 cells suspended in 1% BSA-PBS containing 0.05% NaN 3 after blocking the active groups were added at 5 ⁇ 10 4 cells / well.
  • the purified monoclonal antibody (0.01-7.29 mu g / ml) was dispensed in 50 mu 1 / Ueru, further, 3 ng / ml of 125 1-labeled human VEGF (manufactured by Amersham) 50 ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ was added and reacted on ice for 2 hours.
  • After washing with PBS dry the wells at 50 ° C and use MicroScint-0 (Packard The Ltd.) 30 mu 1 / Ueru addition, using a Top Count (manufactured by Packard) to measure the radioactivity of 125 1-labeled human VEGF bound to each Ueru.
  • FIG. 26 shows the results of examining the binding inhibitory activity using the purified anti-Fit-1 monoclonal antibodies KM1732, KM1748, and KM1750.
  • M1732, KM1748 and KM1750 inhibited the binding of human VEGF to NIH3T3-Fit-1 cells in a concentration-dependent manner.
  • the concentrations (ICS0) of KM1732, M1748, and KM1750 that show 50% inhibition of binding between human VEGF and NIH3T3-Flt-1 cells were ⁇ . ⁇ ⁇ g / mU 0.037 ⁇ g / ml and 0.041 ⁇ g / ml .
  • the mouse IgGl class anti-sialyl Lewis A monoclonal antibody KM231 used as a control did not show any inhibitory activity.
  • the specificity of the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody obtained in step 5 was confirmed by using the immunocell staining according to the following procedure.
  • NIH3T3-Fit-1 Human VEGF receptor Fit-1 expressing NIH3T3 cells
  • control N1H3T3 cells NIH3T3-Neo [Oncogene, 10, 135 (1995)] 5 x 10 6 cells in a round bottom 96 ⁇ L plate
  • the suspension was dispensed in 100 ⁇ l of a buffer for staining immunological cells (PBS containing 1% BSA, 0.02% EDTA and 0.05% sodium azide) and dispensed.
  • PBS containing 1% BSA, 0.02% EDTA and 0.05% sodium azide
  • an immunocell staining buffer containing FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody or FITC-labeled anti-rat immunoglobulin antibody (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a concentration of 1 ⁇ g / ml is used. ⁇ 1 was added and the reaction was carried out at 4 for 30 minutes. After the reaction, the same washing operation as described above was performed three times, and then analyzed using a flow cytometer (manufactured by Coulter).
  • the results are shown in FIG.
  • the anti-human VEGF receptor Flt_l monoclonal antibodies KM1730, KM1731, and KM1732 did not react with control cells but specifically and remarkably reacted with Flt- ⁇ expressing cells (A).
  • purified human anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody ⁇ 1748 (10 ⁇ g / ml) and hybridoma culture supernatant KM1748 do not react with control cells but are specific to Fit-1 expressing cells.
  • the monoclonal antibodies KM1730, M1731, 1732, KM 1748 and KM1750 are It has been found that it specifically recognizes human VEGF receptor Fit-1.
  • KM1735, M1736, KM1742, KM1743 and KM1745 reacted with cells expressing human VEGF receptor Fit-1, but were extremely weaker than KM1730, M1731, KM1732, KM1748 and KM1750.
  • Cell membrane components were prepared from NIH3T3-Fit-1 cells and control NIH3T3 cells (N1H3T3-Neo) according to the method described in the literature [Cancer Research, 46, 4438 (1986)], and electrophoresed by SDS-PAGE.
  • the SDS-PAGE was performed according to the method described in the literature [Anticancer Research, 12 ⁇ 1121 (1992)].
  • the gel used was a 5-20% gradient gel (manufactured by Atto Co., Ltd.). 15 ⁇ g of the cell membrane component was electrophoresed as the protein mass per cell.
  • the electrophoresed protein was transferred to a PVDF membrane according to the method described in the literature [Anticancer Research, 12, 1121 (1 "2).
  • the PVDF membrane was reacted with PBS containing 1% BSA at room temperature for 30 minutes.
  • a blocking operation was performed, and the culture supernatant of the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody KM1737 was reacted at 4 ° C. for 1 ° C.
  • the plate was washed with PBS containing 0.05% Tween and peroxidase-labeled goat antibody.
  • the mouse lgG [5,000-fold dilution: Chemicon] was reacted for 2 hours at room temperature, washed with PBS containing 0.05% Tween, and washed with ECL TM Western Blotting Deg. detectionreagents (manufactured by Amersham) was used to detect the band bound to the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody KM1737.
  • Figure 28 shows the results. It was revealed that the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody KM1737 can specifically detect the human VEGF receptor Fit-1 having a molecular weight of 180 kilodaltons expressed in NIH3T3-Fit-1 cells.
  • BSA bovine serum albumin
  • the cell migration test was performed according to the method of Sato et al. [J. Cell Biology, 107, 1199 (1988)]. HUVECs cultured to confluence in a 3.5 cm dish were wounded with a razor blade and washed with PBS. Add 1.5 ml of M-199 medium containing 5% FCS, add VEGF (final concentration lOng / ml) and anti-VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody KM1750 or KM1732 obtained in 5 (final concentration 0, 1, 10 ⁇ l). g / ml) and cultured for 24 hours. After the culture, the number of cells migrated from the damaged position was measured.
  • FIG. 47 shows the results of comparing the activity of the anti-VEGF receptor Flt_l monoclonal antibodies KM1750 and KM1732 to inhibit the migration of vascular endothelial cells.
  • a recombinant antibody that specifically binds to a human VEGF receptor Flt-1 which is considered to be specifically expressed on neonatal human vascular endothelial cells. Further, the present invention provides a recombinant antibody having a neutralizing activity against human VEGF receptor Fit-1.
  • the recombinant antibody of the present invention is useful for diagnosis, treatment, etc. of angiogenesis-related diseases such as cancer and diabetic retinopathy, and particularly, its effect in humans is lower in immunogenicity than mouse monoclonal antibody. Is expected to last for a long time. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 28 Description of artificial sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 31 Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 32—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 33—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 34—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 35—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 36—Artificial Sequence Description: Synthetic DNA SEQ ID No. 37—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 38—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 39—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 40—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA Sequence No. 41 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No.
  • SEQ ID NO: 65 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 70 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 86 Description of artificial sequence: variable region of humanized antibody heavy chain
  • SEQ ID NO: 87 Description of artificial sequence: variable region of humanized antibody light chain
  • SEQ ID NO: 88 Description of artificial sequence: variable region of humanized antibody heavy chain
  • SEQ ID NO: 89 Description of artificial sequence: variable region of humanized antibody light chain
  • SEQ ID NO: 90 Description of artificial sequence: variable region of humanized antibody heavy chain
  • SEQ ID NO: 92 Description of artificial sequence: variable region of humanized antibody light chain
  • SEQ ID NO: 93 Description of artificial sequence: variable region of humanized antibody light chain
  • SEQ ID NO: 94 Description of artificial sequence: variable region of humanized antibody light chain
  • SEQ ID NO: 95 Description of artificial sequence: variable region of humanized antibody heavy chain
  • SEQ ID NO: 96 Description of artificial sequence: variable region of humanized antibody light chain

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Description

明 細 書
遺伝子組換え抗体
技術分野
本発明は、固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、慢性関節リウマチにおける関節炎、糖 尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾鮮など血管新生の異常により病態が進行する 疾患の診断あるいは治療に有用であるヒト VEGF受容体 Flt-1に特異的に結合する 遺伝子組換え抗体、該抗体を生産する細胞株および該抗体を用いてヒト VEGF受容 体 Fit- 1 を免疫学的に検出する方法、並びに該抗体を用いた固形腫瘍、慢性関節リ ユウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾鮮などの診断方法、診断薬および 治療薬に関する。
背景技術
血管新生は、脊椎動物の個体の発生および組織の構築に重要な役割を果たすととも に、成熟個体 (雌)の性周期における黄体形成、子宮内膜の一過性の増殖および胎盤 形成などにも密接に関与している。さらに、病的状態としては、固形腫瘍の増殖もしく は転移形成、糖尿病性網膜症および慢性関節リュウマチの病態形成あるいは促進に 血管新生が深く関与している [J. Biol. Ch , 267, 10931 (1992)]。血管新生は、血管 新生因子の分泌が引き金となり、分泌された血管新生因子の近傍にある既存の血管の 内皮細胞からのプロテアーゼ分泌による基底膜、間質の破壊、続いて起こる血管内皮 細胞の遊走、増殖により、管腔が形成され、血管が新生される過程よりなる [J. Biol. Chem., 267, 10931 (1992)] lk管新生を誘導する因子としては、 vascular
permeability factor (以！ "、 VPFと略記するノ、 vascular endothelial growth factor (以 下、 VEGFと略記する）があり（以下、 VPF/VEGFと記す）、これらは発生過程におけ る血管新生および病的な状態における血管新生において最も重要な因子として知ら れている [Advances in Cancer Research, 67, 281 (1995)] VPF, VEGFはホモダイ マーよりなる分子量約 4 万の蛋白質であり、 1983年に血管透過性促進因子 (Vascular permeability factor: VPF) として [Science, 219, 983 (1983)] 1989年に血管内皮細 胞増殖因子 (Vascular endothelial growth factor: VEGF) として [Biochem. Biophys. Res. Comm., 161 , 851 (1989)]報告されたが、 cDNAクローニングの結果、両者は同一 の物質であることが明らかとなった [Science, 246, 1306 (1989); Science, 246, 1309 (1989)] (以下、 VPF/ VEGFは VEGFと記す）。 VEGFの活性としてはこれまでに、血 管内皮細胞に対する、増殖促進活性 [Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, 851 (1989)]、遊走促進活性 [J. Immunology, 152, 4149 (1994)]、メタ口プロテアーゼ分泌 促進活性 [J. Cell. Physiol., 153, 557 (1992)]、ゥロキナ一ゼ、 tPA分泌促進活性 [Biochem. Biophys. Res. Comm., 181 , 902 (1991)]などが知られており、 in vivo にお いて血管新生促進活性 [Circulation, 92, suppl 11, 365 (1995)]、血管透過性促進活 性 [Science, 219, 983 (1983)]などがこれまでに知られている。 VEGFは血管内皮細胞 に極めて特異性の高い増殖因子であり [Biochem. Biophys. Res. Comm., 161 , 851 (1989)]、また mRN Aのオルタナティブ'スプライシング (Alternative splicing)により分子 量の異なる 4種類の蛋白質が存在することが報告されている [J. Biol. Chem.， 67, 26031 (1991)] 0
血管新生を伴う疾患の中で、固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、糖尿病性網膜症、 慢性関節リュウマチの病態形成に VEGFが深く関与していることが報告されている。固 形腫瘍については、これまでに腎癌 [Cancer Research, 54, 4233 (1994)]、乳癌
[Human Pathology, 26, 86 (1995)]、脳腫瘍 [J. Clinical Investigation, 91， 153 (1993)]、消化器癌 [Cancer Research, 53, 4727 (1993)]、卵巣癌 [Cancer Research, 54, 276 (1994)]などの多くのヒト腫瘍組織における VEGFの産生が報告されている。ま た、乳癌患者の腫瘍における VEGF発現量と患者の生存率との相関性を検討した結 果、 VEGF高発 重瘍は、 VEGF低発現腫瘍に比べて腫瘍血管新生が盛んであり、 かつ VEGF高発現腫瘍の乳癌患者は、 VEGF低発現腫瘍の乳癌患者に比べて生存 率が低いことも明らかとなっている [Japanese J. Cancer Research, 8^ 1045 (1994)]。 また、ヌードマウスにヒト腫瘍を皮下移植したゼノグラフトモデル実験系において、抗 VEGFモノクローナル抗体は腫瘍増殖抑制効果を示すことが報告されている [Nature, 362, 841 (1993)]。さらに、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍の転移癌モデルにおいて、抗 VEGFモノクローナル抗体は癌転移を抑制できることが報告されている [Cancer Research, 56, 921 (1996) ：]。また、ヒトの癌性胸水、腹水中に高濃度の VEGFが検出 されることから、胸水、腹水貯留の主要な因子である可能性も示されている [Biochimica et Biophysica Acta, 1221 , 211 (1994)]。
糖尿病網膜症においては、血管新生の異常により網膜剥離や硝子体出血をおこして 失明にいたるが、糖尿病性網膜症における血管新生と患者眼球内の VEGFレベルが 正相関することが報告されている [New England J. Medicine, 331 , 1480 (1994)]。また、 サルの網膜症モデルにおいて抗 VEGF中和モノクローナル抗体の眼内投与により VEGF活性を抑制すると血管新生が抑制されることが報告されている [Arch
Opthalmol., 114, 66 (1996)]。
慢性関節リュウマチの関節炎の病態の進展（骨、軟骨の破壊）には血管新生を伴うが、 慢性関節リュウマチ患者の関節液中には VEGFが高濃度で含まれていること、関節中 のマクロファージが VEGFを産生することが報告されてレ、る [Journal of Immunology, 152, 4149 (1994); J. Experimental Medicine, 180， 341 (1994)] 0
VEGF受容体としてはこれまでに受容体型チロシンキナーゼファミリーに属する ftns - like tyrosine kinase (以下、 Fit - 1 と略記する） [Oncogene, 5, 519 (1990); Science, 255， 989 (1992)]および kinase insert domain-containing receptor (以下、 KDR と略 記する） [W092/14748 ; Proc. Natl. Acad. Science USA, 88， 9026 (1991) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 1579 (1992) ; W094/11499]が報告されている。 Fit- 1お よび KDRは、 7個のィムノグロブリン様部位よりなる細胞外領域とチロシンキナーゼ部 位よりなる細胞内領域とを有する、分子量 180〜200キロダルトンの膜蛋白質である。 VEGFと、 Fit- 1 および KDR とは、 Kd値が 20 pMおよび 75 pMで特異的に結合し、 また Flt-1および KDRは血管内皮細胞に特異的に発現していると報告されている [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90， 7533 (1993); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90， 8915 (1993)]。 Flt-1 の様々な疾患における発現については、ヒトグリオプラストーマ組織の 腫瘍血管内皮細胞 [Nature, 359, 845 (1992)]、ヒト消化器癌組織の腫瘍血管内皮細 胞 [Cancer Research, 53, 4727 (1993)]で、正常組織の血管内皮細胞に比べ flt - 1 mRNAの発現が上昇していることが報告されている。さらに、慢性関節リュウマチ患者 の関節の血管内皮細胞においてもイン'サイチュ'ノヽィブリダィゼ一シヨン（in situ hybridization)により flt - 1 mRNAの発現が認められることが報告されている [J.
Experimental Medicine, 180, 341 (1994)] 0これらの結果は、腫瘍血管新生において VEGF-VEGFレセプタ一 Fit- 1 系が重要な役割を果たしていることを強く示唆するも のである。 Fit- 1 は VEGFが結合すること、細胞内ドメインが自己リン酸化されることが 報告されているが [Science, 255, 989 (1992)]、詳しい機能については不明である。し かし、 flt-1遺伝子を破壊した flt- 1ノックアウトマウスは発生初期の血島形成や、それ に続く血管新生において、血管内皮細胞の形態異常により血管構築が異常となり胎生 8.5 〜9.5日齢で死亡することから、 Fit- 1は血管新生における血管内皮細胞の管腔 形成に必須の機能を果たしていると推定されている [Nature, 376, 66 (1995)]。
以上のことから、 VEGF受容体 Fit- 1 に結合し、 Flt-1に対する中和活性を有する抗 体は固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、慢性関節リュウマチにおける関節炎、糖尿病 性網膜症、未熟児網膜症および乾鮮など異常な血管新生により病態が進行する疾患 の診断、治療に有用であることが期待される。
一般にヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体をヒトに投与すると、異物として認識 されることによりヒト体内にヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体がで きる。その結果、投与されたヒト以外の動物抗体と反応し、副作用を引き起こしたり [ Clin. Oncol., 2, 881 (1984) ; Blood, 65, 1349 (1985) ; J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1242 (1985) ]、抗体がはやくクリアランスされ たり [J. Nucl. Med., 26, 1011 (1985) ; Blood, 65, 1349 (1985) ; J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988) ]、抗体の治療効果を滅じてしまうことが知られている [J. Immunol., 135, 1530 (1985) ; Cancer Res., 46, 6489 (1986)]。
これらの問題点を解決するため、遺伝子組换ぇ技術を利用してヒト以外の動物由来 のモノクローナル抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型 CDR(complementary
determining region;以下、 CDRと略記する場合もある）移植抗体（再形成ヒト抗体）の ようなヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体は、抗体可変領域（以下、 V領域と称す）がヒト以外の動物抗体由来で抗体定常領域（以下、 C領域と称す）がヒト 抗体由来である抗体であり [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 , 6851 (1984) ]、ヒトに投 与した場合、ヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体はほとんど惹起さ れず、血中半減期が 6倍のびることが報告されている [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220 (1989)]。ヒト型 CDR移植抗体はヒト抗体の CDRをヒト以外の動物由来の抗 体の CDR と置換した抗体であり [Nature, 32^, 522 (1986) ] ,サルを用いた実験でマ ウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が 4〜5倍伸びることが報告されてい る [J. Immunol., 147, 1352 (1991)]。
従って、ヒト VEGF受容体 Fit - 1 に対して特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体 は、ヒト体内に投与したときにヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体 が生じないことによる、副作用の減少、および血中半減期の延長により、固形腫瘍の増 殖もしくは転移形成、慢性関節リュウマチにおける関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児 網膜症および乾鮮など異常な血管新生により病態が進行する疾患等に対する高い治 療効果が期待される。
さらに、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、一本鎖抗体 [Science, 242, 423 (1988)]あるいはジスルフイド安定化抗体 [Molecular Immunology, 32, 249 (1995)]といった、より小さな抗体分子の作製が行われている。一本鎖抗体やジスルフ イド安定化抗体はモノクローナル抗体あるいはヒト化抗体に比べ、その分子量が小さい ことから組織移行性、血中からのクリアランスに優れ、イメージング等への応用、さらに はトキシンとの複合体の作製も行われ、治療効果も期待されている [Cancer Research, 55, 318(1995)]。従って、ヒト VEGF受容体 Fit- 1 特異的に結合する一本鎖抗体およ びジスルフイド安定化抗体は、固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、慢性関節リュウマチ における関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾鮮など異常な血管新生に より病態が進行する疾患等に対する高い診断、治療効果が期待される。
発明の開示
固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、慢性関節リュウマチにおける関節炎、糖尿病性 網膜症、未熟児網膜症あるいは乾鮮など異常な血管新生により病態が進行する疾患 を診断、治療するための有用な方法が求められている。抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗 体は、血管新生部位を検出および抑制することができ、上記のような異常な血管新生 により病態が進行するする疾患の診断および治療に役立つと期待される。
本発明は、以下の（1)〜（68)に関する。
(1 )ヒト VEGF受容体 Flt-1に特異的に反応する遺伝子組換え抗体。
本発明の遺伝子組換え抗体は、上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え 技術を用いて改変したものである。遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体、ならびに 一本鎖抗体およびジスルフイド安定化抗体などの抗体断片など、遺伝子組換えにより 製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクロ一ナル抗体の特徴 を有し、抗原性が低ぐ血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。
(2)ヒト VBGF受容体 Fit- 1のシグナル配列を含む N末端アミノ酸から 750番目に存 在するェピトープを認識する上記（1)記載の遺伝子組換え抗体。
(3)ヒト VEGF受容体 Fit - 1のシグナル配列を含む N末端アミノ酸から 338番目に存 在するェピトープを認識する上記（1)記載の遺伝子組換え抗体。
(4)ヒト VEGF受容体 Fit- 1のシグナル配列を含む N末端アミノ酸から数えて 100〜 204番目に存在するェピト一プを認識する上記（1)記載の遺伝子組換え抗体。
(5)ヒト VEGFのヒト VEGF受容体 Fit- 1への結合を阻害し、力っヒト Fit- 1に対する 中和活性を有する上記（1)記載の遺伝子組換え抗体。
(6)遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体、抗体断片から選ばれる上記（1)記載の抗体。 本発明におけるヒト化抗体は、ヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR移植抗体を包含す る。
本発明の抗体断片は、ヒト VEGF受容体 Fit - 1に特異的に反応する抗体断片である Fragment of antigen binding (Fab と略記する）、 Fab，、 F(ab，)2、一本鎖抗体 (single chain Fv; 以下、 scFvと略記する） およびジスルフイド安定化抗体 (disulfide stabilized Fv; 以下、 dsFvと略記する)を包含する。以下、ヒト VEGF受容体 Fit- 1に特異的に反 応する抗体または抗体断片を抗ヒト VEGF受容体 Flt-1抗体と略記する。
(7)ヒト化抗体が、ヒト抗体 IgG 型に属する上記（6)記載の抗体。
(8)ヒトイ匕抗体がヒト型キメラ抗体またはヒト型 CDR移植抗体である、上記（6)記載の抗 体。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域 (以下、重鎖は H鎖として、 可変領域は V領域として HVまたは VHとも称す）および軽鎖可変領域（以下、軽鎖 は L鎖として LVまたは Vしとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域は C 領域として CHとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、 CLとも称す）とからな る抗体を意味する。 本発明のヒト型キメラ抗体は、ヒト VEGF受容体 Flt-1に特異的に反応するモノクロ一 ナル抗体を生産するハイプリドーマより、 VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 ヒト抗体 CHおよびヒト抗体 CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクター にそれぞれ揷入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入すること により発現させ製造することができる。
本発明のヒト型キメラ抗体の構造としては、いずれのィムノグロブリン (以下、 ig と略記 する)クラスに属するものでもよレ、が、 IgG 型、さらには IgG 型に属する IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG 4等のィムノグロブリンの C領域が好ましい。
ヒト型 CDR移植抗体は、ヒト抗体の VHおよび VLの CDRをヒト以外の動物の抗体 の CDR配列でそれぞれ置換した抗体を意味する。
本発明のヒト型 CDR移植抗体は、ヒト VEGF受容体 Flt_lに特異的に反応する、ヒト 以外の動物の抗体の VHおよぴ VLの CDR配列で任意のヒト抗体の VHおよび VL の CDR配列をそれぞれ置換した V 領域をコードする cDNAを構築し、ヒト抗体の CH およびヒト抗体の CL をコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞ れ挿入してヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し、発現させ ることにより製造することができる。
本発明のヒト型 CDR移植抗体 C領域の構造としては、いずれのィムノグロブリン (lg) クラスに属するものでもよい力 IgG 型、さらに IgG 型に属する IgG l、 lgG2, IgG3、 IgG4等のィムノグロブリンの C領域が好ましい。
(9)ヒト化抗体の抗体 VHの CDR 1S 配列番号 5、 6および 7記載のアミノ酸配列また は配列番号 11、 12および 13記載のアミノ酸配列を含む上記（8)記載のヒト化抗体。
(10)ヒト化抗体の VLの CDR i 配列番号 8、 9および 10記載のアミノ酸配列または 配列番号 14、 15および 16記載のアミノ酸配列を含む上記（8)記載のヒト化抗体。
(11)ヒト型キメラ抗体力 ヒト VEGF受容体 Fit - 1 に特異的に反応するモノクローナル 抗体の VHおよび VLと、ヒト抗体の CHおよび CLと力、らなる、上記（8)記載のヒト型 キメラ抗体。
(12) VHおよび Vしのアミノ酸配列が、モノクローナル抗体 KM1732(FERM BP- 5698) またはモノクローナル抗体 KM1750(FERM BP- 5700)から選ばれるモノクローナル抗体 の VH および Vしのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、上記（11)記載のヒト型 キメラ抗体。
(13) VHのアミノ酸配列が配列番号 86または 88 に記載されたアミノ酸配列である、 上記（11 )記載のヒト型キメラ抗体。
(14) Vしのアミノ酸配列が配列番号 87または 89に記載されたアミノ酸配列である、上 記（11)記載のヒト型キメラ抗体。
(15) VH のアミノ酸配列が配列番号 86 記載のアミノ酸配列を含み、 VLのアミノ酸配 列が配列番号 87のアミノ酸配列を含む上記（11)記載のヒト型キメラ抗体。
(16) VH のアミノ酸配列が配列番号 88 記載のアミノ酸配列を含み、 VLのアミノ酸配 列が配列番号 89のアミノ酸配列を含む上記（11)記載のヒト型キメラ抗体。
(17)ヒト VEGF受容体 Fit- 1に特異的に反応するヒト型キメラ抗体が、 KM2532および KM2550から選ばれる上記（1 1)記載のヒト型キメラ抗体。
(18)上記（11)〜（17)のいずれか 1つに記載のヒト VEGF受容体 Flt-Ι に特異的に 反応するヒト型キメラ抗体をコードする DNA。
(19)上記（18)記載の DNA とタンデムカセットベクター pKANTEX93 とを含有する組 換えベクター。
(20)上記（19)記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
(21)上記（20)記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記（11 )〜（17)記 載のヒト型キメラ抗体を生成蓄積させ、該培養物から該抗体を採取することを特徴とす る抗体の製造方法。
(22)ヒト型 CDR移植抗体がヒト VEGF受容体 Fit - 1 に特異的に反応するモノクロ一 ナル抗体の H鎖および L鎖の V領域 CDRと、ヒト抗体の H鎖および L鎖の C領域 および V領域フレームワーク領域とからなる抗体である上記（8)記載のヒト型 CDR移 植 体。
(23)ヒト型 CDR移植抗体の VHの CDR 、配列番号 5、 6および 7または配列番号 11、 12および 13である、上記（22)記載のヒト型 CDR移植抗体。
(24)ヒト型 CDR移植抗体の VLの CDR 、配列番号 8、 9および 10記載のアミノ酸 配列または配列番号 14、 15および 16記載のアミノ酸配列である、上記（22)記載のヒ ト型 CDR移植抗体。
(25)ヒト型 CDR移植抗体が、配列番号 5、 6および 7記載のアミノ酸配列を VHの CDRとして含み、かつ配列番号 8、 9および 10記載のアミノ酸配列を VLの CDRとし て含む、上記 (22)記載のヒト型 CDR移植抗体。
(26)ヒト型 CDR移植抗体が、配列番号 11、 12および 13記載のアミノ酸配列を VH の CDRとして含み、かつ配列番号 14、 15 および 16 記載のアミノ酸配列を Vしの CDRとして含む、上記（22)記載のヒト型 CDR移植抗体。
(27) VHのアミノ酸配列が配列番号 90記載のアミノ酸配列を含み、 VLのアミノ酸配 列が配列番号 92記載のアミノ酸配列を含む、上記（22)記載のヒト型 CDR移植抗体。
(28) VHのアミノ酸配列が配列番号 91または配列番号 95のアミノ酸配列を含み、 VL のアミノ酸配列が配列番号 93、配列番号 94または配列番号 96のアミノ酸配列を含む、 上記 (22)記載のヒト型 CDR移植抗体。
(29)ヒト VEGF受容体 Fit- 1に特異的に反応するヒト型 CDR移植抗体が、 K 8550, K 8551, KM8552, KM8553, KM8554 および K 8555 から選ばれる上記（22)記載 のヒト型 CDR移植抗体。
(30)上記（22)〜（29)のいずれか 1つに記載のヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に 反応するヒト型 CDR移植抗体をコードする DNA。
(31)上記（30)記載の DNAとタンデムカセットベクター pKANTEX93 とを含有する組 換えベクター。
(32)上記（31)記載の組換えべクタ一を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
(33)上記（32)記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記（22)〜（29)記 載のヒト型 CDR移植抗体を生成蓄積させ、該培養物から該抗体を採取することを特徴 とする抗体の製造方法。
(34)抗体断片が、 Fab, Fab'、 F(ab')2、一本鎖抗体およびジスルフイド安定化 Fv から なる群より選ばれるいずれか 1つである、上記（6)記載の抗体。
Fabは、 IgGのヒンジ領域で 2本の H鎖を架橋している 2つのジスルフイド結合の上部 のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られた、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全 体で構成された、分子量約 5万の抗原結合活性を有するフラグメントである。 本発明の Fabは、ヒト VEGF受容体 Fit- 1に特異的に反応する抗体をパパイン処理 して得ることができる。または、該抗体の Fab断片をコードする DNAを動物細胞用発 現ベクターに挿入し、該ベクターを動物細胞へ導入することにより発現させ、 Fab を製 造することができる。
Fab，は、上記 F(ab，)2のヒンジ間のジスルフイド結合を切断した分子量約 5万の抗原 結合活性を有するフラグメントである。
本発明の Fab，は、ヒト VEGP受容体 Fit- 1 に特異的に反応する抗体を還元剤ジチ オスレィトール処理して得ることができる。または、該抗体の Fab，断片をコードする DNAを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを動物細胞へ導入することによ り発現させ、 Fab，を製造することができる。
F(ab')2は、 IgGのヒンジ領域の 2個のジスルフイド結合の下部を酵素トリプシンで分解 して得られた、 2つの Fab領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約 10万の 抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明の F(ab，)2は、ヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応する抗体をトリプシン 処理して得ることができる。または、該抗体の F(ab，)2断片をコードする DNAを動物細 胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを動物細胞へ導入することにより発現させ、 F(ab')2を製造することができる。
一本鎖抗体（以下、 scFvとも称す）は、一本の VHと一本の VLとを適当なペプチドリ ンカー（以下、 Pと称す）を用いて連結した、 VH— P— VLないしは VL— P— VHポリぺ プチドを示す。本発明で使用される scFvに含まれる VHおよび VLは、本発明のモノ クローナル抗体あるいはヒト型 CDR移植抗体のいずれをも用いることができる。
本発明の一本鎖抗体は、ヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応する抗体を生産 するハイプリドーマより VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、一本鎖抗体発現 ベクタ一を構築した後、該 cDNAを該発現ベクターに揷入し、大腸菌、酵母、あるいは 動物細胞へ該発現ベクターを導入することにより発現させ製造することができる。
ジスルフイド安定化抗体（以下、 dsFvとも称す）は、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミ ノ酸残基をシスティン残基に置換したポリペプチドをジスルフイド結合を介して結合させ たものをいう。システィン残基に置換するアミノ酸残基は Reiter らにより示された方法 [Protein Engineering, 7, 697 (1994)]に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選 択することができる。本発明のジスルフイド安定化抗体に含まれる VHあるいは VLは モノクローナル抗体あるいはヒト型 CDR 移植抗体のいずれをも用いることができる。 本発明のジスルフイド安定化抗体は、ヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応する 抗体を生産するハイプリドーマより VH および VL をコードする cDNA を取得し、該 cDNA を適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動 物細胞へ導入し発現させることにより製造することができる。
(35)—本鎖抗体が、抗体の VHおよび VLを含む、上記（34)記載の一本鎖抗体。
(36)—本鎖抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列が、ヒト VEGF受容体 Flt_lに特異 的に反応するモノクローナル抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列 を有する、上記（35)記載の一本鎖抗体。
(37)—本鎖抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列が、ヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応するモノクローナル抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列と同 じアミノ酸配列を有する、上記（35)記載の一本鎖抗体。
(38)—本鎖抗体の VH および VLのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号 86 および 87であるモノクローナル抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有 する、上記（36)記載の一本鎖抗体。
(39)—本鎖抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列力 S、配列番号 88および 89であるモ ノクローナル抗体の VH および VLのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、上記 (36)記載の一本鎖抗体。
(40)—本鎖抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列が、配列番号 5、 6および 7 記載のアミノ酸配列を VHの CDRとして含み、かつ配列番号 8、 9および 10記載のァ ミノ酸配列を VLの CDRとして含む、上記（37)記載の一本鎖抗体。
(41)一本鎖抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列力 配列番号 11、 12および 13記載のアミノ酸配列を VHの CDRとして含み、かつ配列番号 14、 15および 16記 载のアミノ酸配列を VLの CDRとして含む、上記（37)記載の一本鎖抗体。
(42)—本鎖抗体の VHのアミノ酸配列が配列番号 90記載のアミノ酸配列を含み、 VL のアミノ酸配列が配列番号 92 記載のアミノ酸配列を含む、上記（37)記載の一本鎖抗 体。
(43)—本鎖抗体の VHのアミノ酸配列が配列番号 91または配列番号 95のアミノ酸 配列を含み、 VLのアミノ酸配列が配列番号 93、配列番号 94または配列番号 96のァ ミノ酸配列を含む、上記（37)記載の一本鎖抗体。
(44)ジスルフイド安定化抗体が、抗体の VHおよび Vしを含む、上記（34)記載のジス ルフイド安定化抗体。
(45)ジスルフイド安定化抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列が、それぞれヒト VEGF 受容体 Fit- 1 に特異的に反応するモノクローナル抗体の VHおよび VLのアミノ酸配 列と同じアミノ酸配列を有する、上記 (44)記載のジスルフイド安定化抗体。
(46)ジスルフイド安定化抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列が、それぞれヒ ト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応するモノクローナル抗体の VHおよび VLの CDR のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、上記（44)記載のジスルフイド安定化 抗体。
(47)ジスルフイド安定化抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号 86および 87である、上記（45)記載のジスルフイド安定化抗体。
(48)ジスルフイド安定化抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号 88および 89である、上記（45)記載のジスルフイド安定化抗体。
(49)ジスルフイド安定化抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列が、配列番号 5、 6および 7記載のアミノ酸配列を VHの CDRとして含み、かつ配列番号 8、 9および 10記載のアミノ酸配列を VLの CDRとして含む、上記（46)記載のジスルフイド安定化 抗体。
(50)ジスルフイド安定化抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列が、配列番号 11、 12および 13記載のアミノ酸配列を VHの CDRとして含み、かつ配列番号 14、 15 および 16記載のアミノ酸配列を VLの CDRとして含む、上記（46)記載のジスルフイド 安定化抗体。
(51)ジスルフイド安定化抗体の VHのアミノ酸配列が配列番号 90記載のアミノ酸配列 を含み、 VLのアミノ酸配列が配列番号 92記載のアミノ酸配列を含む、上記（46)記載 のジスルフイド安定化抗体。 (52)ジスルフイド安定化抗体の VHのアミノ酸配列が配列番号 91または配列番号 95 のアミノ酸配列を含み、 VLのアミノ酸配列が配列番号 93、配列番号 94または配列番 号 96のアミノ酸配列を含む、上記（46)記載のジスルフイド安定化抗体。
(53)上記（1)に記載されたヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応する遺伝子組換 え抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域の CDRから選ばれるアミノ酸配列を含むぺ プチド。
(54) H鎖 V領域および L鎖 V領域の CDR 、配列番号 5、 6、 7、 8、 9および 10記 載のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも 1アミノ酸配列を含む、上記（53)記載のぺプ チド。
(55) H鎖 V領域および L鎖 V領域の CDR 、配列番号 11、 12、 13、 14、 15および 16記載のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも 1アミノ酸配列を含む、上記（53)記載の ペプチド。
(56)上記（1)〜（55)のレ、ずれかに記載された抗体またはペプチドが、放射性同位元 素、蛋白質または低分子の薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合させた融合抗体 または融合ペプチドである抗体またはペプチド。
融合抗体または融合ペプチドは、上述の抗体またはペプチドに放射性同位元素、蛋 白質、低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体またはぺ プチドをいう。
本発明の融合抗体または融合ペプチドは、ヒト VEGF受容体 Flt-1に特異的に反応 する抗体またはペプチドを放射性同位元素、蛋白質あるいは低分子の薬剤などと化学 的に結合させることにより製造すること力できる。
また、蛋白質との融合抗体または融合ペプチドについては、抗体またはペプチドをコ ードする cDNAに蛋白質をコードする cDNAを連結させ、適当な発現ベクターに挿入 し、該発現ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞に発現させることにより製造す ること力 Sでさる。
低分子の薬剤は、ナイトロジェン 'マスタード、サイクロフォスフアミドなどのアルキル化 剤、 5—フルォロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、マイトマイシン C，ダウノ ルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチンのような植物アルカロイド、タ モキシフユン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤 [臨床腫瘍学（日本臨床腫 瘍研究会編 1996年 癌と化学療法社）]、またはノヽイド口コーチゾン、プレドニゾンな どのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チォマレート、ぺ ニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスフアミド、ァザチォプリンなどの免疫抑制剤、 マレイン酸クロルフエ二ラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤 [炎症 と抗炎症療法 昭和 57年 医歯薬出版株式会社]などがあげられる。
(57)上記（1)〜（17)、 （22)〜（29)、 (34)〜（56)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Fit- 1を免疫学的に検出する方法。
(58)上記（1)〜（17)、 （22)〜（29)、 （34)〜（56)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Fit- 1を免疫学的に定量する方法。
(59)上記（1)〜（17)、 (22)〜（29)、 (34)〜（56)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを用いて、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1を免疫学的に検出する方法。
(60)上記（1)〜（17)、 (22)〜（29)、 (34)〜（56)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを用いて、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1を免疫学的に定量する方法。
(61)上記（1)〜（： 17)、 (22)〜（29)、 （34)〜（56)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Fit- 1を細胞表面に発現した細胞を免疫 学的に検出する方法。
(62)上記（1 )〜（17)、 （22)〜（29)、 （34)〜（56)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Flt-1を細胞表面に発現した細胞を免疫 学的に定量する方法。
(63)上記（1)〜（17)、 (22)〜（29)、 (34)〜（56)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを用いて、ヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit- 1との結合を阻害する方 法。
(64)上記（1)〜（17)、 （22)〜（29)、 (34)〜（56)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Fit- 1機能を中和する方法。
(65)上記（1)〜（17)、 (22)〜（29)、 (34)〜（5S)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを用いて、血管内皮細胞の遊走を阻害する方法。
(66)上記（1 )〜（17)、 (22)〜（29)、 （34)〜（56)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを用いる、血管新生の異常により病態が進行する疾患の診断方法。
(67)上記（1)〜（17)、 (22)〜（29)、（34)〜（56)のいずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを有効成分として含有する、血管新生の異常により病態が進行する疾 患の診断薬。
血管新生の異常により病態が進行する疾患とは、固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、 慢性関節リウマチにおける関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾癬などを いう。固形腫瘍としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、胃癌、肺癌などがあげられる。
(68)上記（1)〜（： 17)、 (22)〜 (29)、 (34)〜 (56)の 、ずれか 1つに記載された抗体 またはペプチドを有効成分として含有する、血管新生の異常により病態が進行する疾 患の治療薬。
以下に、ヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応する、またはヒト Fit - 1に対する中 和活性を有する抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト化抗体および抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 抗体断片の製造法、ならびに該抗体によるヒト VEGF受容体 Fit- 1の検出および定量 法について説明する。
1.抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体の製造法
(1)抗原の調製
抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原として は、ヒト VEGF受容体 Fit - 1 を細胞表面に発現した細胞あるいはその細胞膜画分、ま たは、長さの異なる細胞外領域を有する可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1蛋白質あるい は該蛋白質と抗体の Fc部分との融合蛋白質などをあげることができる。
ヒト VEGF受容体 Flt-1を細胞表面に発現する細胞としては、 NIH3T3- Fit- 1細胞 [Oncogene, 10, 135 (1995)]等をあげることができる。
また、遺伝子工学的手法を用いて、ヒト VEGF受容体 Fit- 1をコードする DNAを取 得し、アミノ酸の長さの異なる細胞外領域を有する可溶性ヒト VEGF受容体 Flt-1 蛋 白質あるいは該蛋白質と抗体の Fc部分との融合蛋白質として発現させて抗原とするこ ともでさる。
ヒト VEGF受容体 Fit- 1 をコードする全長あるいはその部分断片 cDNA[Oncogene， 5, 519 (1990); 第 1 8回日本分子生物学会年会議 ·講演要旨集、演題番号 2P - 227(1995年 12月） ]を適当なプロモーター下流に揷入した組み換えベクターを造成 し、それを宿主細胞に導入することにより得られたヒト VEGF受容体 Fit - 1発現細胞を、 適当な培地中で培養することにより細胞内または培養上清中にヒト VEGF受容体 Flt- 1の全長または部分断片をそのまま、または融合蛋白質として生産することができる。 宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞など、 目的とする遺伝子を発現でき るものであれば、いずれでもよレ、。細菌としては、ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli)、 バチルス 'ズブチリス（Bacillus subtilis)等のェシヱリヒア属、バチルス属等の細菌が例 示される。酵母としては、サッカロミセス'セレビシェ（Sa££har ^yces cerevisiae)、シゾ サッカロミセス.ボンべ（Scj2 zosa_^haroipyces pombe)等が例示される。動物細胞として は、ヒトの細胞であるナマルバ細胞、サルの細胞である COS細胞、チャイニーズ.ハム スターの細胞である CHO細胞等が例示される。昆虫細胞としては、 Sf9、 Sf21 (ファー ミンジェン社製）、 High Five (インビトロジェン社製）等が例示される。
本発明の DNAを導入するベクターとしては、該 DNAを組み込むことができ、宿主細 胞で発現できるものであればいかなるベクターでも用いることができる。
細菌、例えばエシュリヒア 'コリ（Escherichia £2 )を宿主として用いる場合の発現べク ターとしては、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の DNA、転写終結配列、場 合によってはプロモーターの制御配列より構成されているのが好ましいが、例えば、市 販の pGEX (フアルマシア社製）、 pET システム（ノバジェン社製）などが例示される。 細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌に DNAを導入する方法であれ ば、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)] ,プロトプラスト法（特開昭 63-248394)等、いずれの方法も用いられる。 酵母を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、 例えば、 YE p l 3 (ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)等が用いられる。 酵母への組換えべクタ一の導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であれ ば、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods. Enzymol., 194. 182 (1990)]、スフエロ プラスト法 [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978) ]、酢酸リチウム法 [ J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]等、いずれの方法も用いられる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pAGE107 [特 開平 3—22979 ； Cytotechnology, 33, 133 (1990)] , pAGE 103 [J. Biochem. 101 , 1307 (1987) ] 等が用いられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいかなるものを用いて もよいが、例えば、サイトメガロウィルス（CM V)の IE(immediate early) 遺伝子のプロモ 一ター、 SV40 あるいはメタ口チォネインのプロモーター等があげられる。また、ヒト CM Vの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターとともに用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方 法であれば、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、リン 酸カルシウム法（特開平 2-227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等、いずれの方法も用いられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント'プロトコールズ（サプルメント 1〜34)、バキュロウィルス'イクスプレツシヨン'ベクターズ、ァ'ラボラトリー 'マニュアル (Baculovirus expression vectors, A laboratory manual)等に己載 れた力法によって、 タンパク質を発現することができる。すなわち、以下に述べる組換え遺伝子導入べクタ 一およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイ ルスを得たのち、さらに組換えウィルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質発現昆虫細 胞を取得する。
遺伝子導入べクタ一としては、例えば、 P VL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともにィ ンビトロジェン社製）等が用いられる。
バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグ ラファ 'カリフオル-力'ヌクレア一 ·ポリへドロシス'ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) なとが用レヽられる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと 上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平 2- 227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84， 7413 (1987)]等が用い られる。
また、ファーミンジェン社製バキュ口ゴールドスターターキットなどを用いて組み換えバ キュロウィルスを作製したのち、前述した Sf9、 Sf21あるいは High Five等の昆虫細胞 に該組み換えウィルスを感染させることにより蛋白質を生産させることもできる [Bio/Technology, 6, 47(1988)]。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産、融合蛋白質発現等が開 発されており、いずれの方法も用いることができる。例えば、モレキュラー 'クロ一ニング 第 2版、コールドスプリングノヽーバーラボ'プレス（Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Lab. Press) New York(1989) (以下、モレキュラー 'クローニング 第 2版 と略記する）に記載されてレ、る方法に準じて行うことができる。
融合させる蛋白質としては、 β 一ガラクトシダーゼ、プロテイン Α、プロテイン Αの IgG 結合領域、クロラムフエニコール'ァセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Arg)、ポリ（Glu)、 プロテイン G、マルトース結合蛋白質、ダルタチオン S—トランスフェラーゼ、ポリヒスチ ジン鎖（His-tag)、 Sペプチド、 DNA結合蛋白質ドメイン、 Tac抗原、チォレドキシン、 グリーン 'フルォレツセント'プロテイン、および任意の抗体のェピトープなどがあげられ る [実験医学， 13, 469-474(1995)]。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にヒト VEGF受容体 Flt-1 の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、ヒト VEGF受容体 Fit- 1の全長あるいは部分断片を そのままあるいは融合蛋白質として製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方 法に従って行われる。
大腸菌あるいは酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と しては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培 養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のレ、ずれを用いてもょレ、（モレ キュラー ·クローニング 第 2版)。培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養など の好気的条件下、 15〜40°Cで 16〜96時間行う。培養期間中、 pHは 3. 0〜9. 0に 保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。培養中は必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等 の抗生物質を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI1640培地、 Eagleの MEM培地またはこれら培地に牛胎児血清等を 添加した培地等が用いられる。培養は、通常 5%C02存在下、 35〜37°Cで 3〜7日間 行い、培養中は必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加し てもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM- FH培地 [ファーミンジェン（Pharmingen)社製]、 Sf900IISFM [ライフテク ノロジーズ（しば e Technologies)社製]、 ExCell400 、 ExCell405 [いずれも JRH バイ ォサイエンシーズ (JRH Biosciences)社製]等が用いられる。培養は、 25〜30°Cで 1 〜4 日間行い、培養中は必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加し てもよい。
動物細胞および昆虫細胞の培地中に血清が含有されている力 ヒト VEGF受容体 Flt-1 の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として精製することを 容易にするため、好ましくは血清無添加の培地を用いる。
ヒト VEGF受容体 Fit- 1 の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質と して宿主細胞内に蓄積された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離し、水系緩衝 液にけん濁後、超音波法、フレンチプレス法などにより細胞を破砕し、その遠心分離上 清に該蛋白質を回収する。 .
さらに、細胞内に不溶体を形成した場合には、不溶体をタンパク質変性剤で可溶化 後、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変 性しない程度に希薄な溶液に希釈、或いは透析し、タンパク質の立体構造を形成させ ること力でさる。
ヒト VEGF受容体 Flt-1 の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質と して細胞外に分泌された場合には、培養上清中に発現蛋白質を回収することができる。 単離精製については、溶媒抽出、有機溶媒による分別沈殿、塩析、透析、遠心分離、 限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィ一、疎水性クロマトグ ラフィ一、ァフィ二ティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、結晶化、電気泳動 などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行うことができる。
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製 免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどハイプリドーマを 作製することが可能であれば、いかなるものでもよいが、本発明においてはマウスおよ びラットを用いる例を説明する。
3〜20週令のマウスまたはラットに、上記 1 (1)で得られた蛋白質を抗原として免疫し、 その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、 静脈內または腹腔内に、適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。 アジュバンドとしては、フロインドの完全アジュバント (Complete Freund's Adjuvant)また は、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどがあげられる。各投与後 3 〜7日 目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、抗原として用いた可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 あるいはヒト VEGF受容体 Flt_l を細胞表面に発現している N1H3T3細胞に対しての反応性について、酵素免疫測定法などで確認し [酵素免疫測 定法（ELISA 法）：医学書院刊（1976年）]、その血清が十分な抗体価を示したマウス またはラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原物質の最終投与後 3 〜7 [3目に、 免疫したマウスより公知の方法 [アンティボディズ 'ァ ·ラボラトリ一 ·マニュアル、コール ド'スプリングノヽーノく一 'ラホラトリー（Antibodies— A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)、以下、アンチボディズ 'ァ ·ラボラトリ一'マニュアルと記す] に準じて脾臓を摘出し、脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。
(3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である、 8-ァザグァニン耐性マウ ス（BAし B/c由来）骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8-Ul(P3-Ul) [Euro. J. Immunol., 6, 511 (1976)]、 SP2/0-Agl4(SP-2) [Nature, 276, 269 (1978) ]、 P3—X63— Ag8653(653) [J. Immunol., 12^ 1548 (1979)]、 P3- X63_Ag8(X63) [Nature, 256， 495 (1975) ；]など、 イン'ビトロ（in vitro)で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これら の細胞株の培養および継代については公知の方法（アンチボディズ 'ァ 'ラボラトリー' マニュアル）に従い、細胞融合時までに 2 X 107個以上の細胞数を確保する。
(4)細胞融合
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングライコ —ルー 1000(PEG- 1000)などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸 濁させる。細胞の洗浄には MEM培地または PBS (リン酸ニナトリウム 1.83g 、リン酸一 カリウム 0.21g、食塩 7.65g 、蒸留水 1 リットル、 pH7.2)などを用いる。また、融合細胞 を懸濁させる培地としては、 目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、 HAT 培 地 {正常培地 [RPMI-IMO培地にグルタミン (1.5mM) 、 2_メルカプトエタノール（5 X 1(Γ 5Μ)、ジェンタマイシン (10 μ g/ml)および牛胎児血清 (FCS) (CSL社製、 10%)を加えた 培地]にヒポキサンチン（10—4M)、チミジン（1.5 X 10— 5M)およびアミノプテリン（4 X 10— 7M)を加えた培地 }を用いる。
培養後、培養上清の一部をとり、酵素免疫測定法により、抗原蛋白質に反応し、非抗 原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを 行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル 抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
(5)マウスあるいはラット抗ヒト VEGF受容体 Flt_l モノクローナル抗体の選択 マウスまたはラット抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマの選択は、アンチボディズ 'ァ'ラボラトリー 'マニュアルに述べられている方法な どに従い、以下に述べる測定法により行う。これらの方法により、後述する抗ヒト VEGF 受容体 Flt-1 ヒト化抗体、該抗体断片を産生する形質転換株の培養上清中に含まれ る抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 抗体あるいはすべての精製抗ヒト VEGF受容体 Fk - 1 抗体の結合活性を測定することができる。
酵素免疫測定法
抗原蛋白質あるいは抗原蛋白質を発現した細胞などを 96ゥエルプレートにコートし、 ハイプリドーマ培養上清もしくは上述の方法で得られる精製抗体を第一抗体として反 応させる。
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、第一抗体のィムノグロブリンを認識できる抗体を、ビォチン、酵素、化 学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイプリドー マ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスィムノグロブリンを 認識できる抗体を用いる。
反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応する モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
当該ハイブリド一マ株の具体例としては、ハイプリドーマ株 KM1732 (FERM BP- 5698) , KM 1748 (FERM BP- 5699)および KM1750 (FERM BP- 5700)があげられる。 また、上述の第一抗体と、ビォチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等 で標識したヒト VEGFとを混合して反応させた後、標識物質に応じた反応を行うことに より、ヒト VEGFのヒト VEGF受容体 Fit- 1 への結合阻害活性を測定することができる。 該方法を用いることにより、ヒト VEGF阻害活性の高いハイブリドーマのスクリーニング を行うことができる。
(6)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2，6,10，14-テトラメチルぺンタデカン(？1^1&06)0.51^ を腹腔内投与し、 2 週間飼育する〕した 8 〜 10週令のマウスまたはヌードマウスに、 1(4)で得られた抗ヒ ト VEGF受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞 2 X 107〜5 X 106 細胞/ 匹を腹腔内に注射する。 10〜21 日間でハイプリドーマは腹水癌化する。該マウ スまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、 40〜50%飽和硫酸アンモ-ゥムに よる塩析、力プリル酸沈殿法、 DEAE- セファロースカラム、プロテイン A- カラムあるい はセル口ファイン GSL2000 (生化学工業社製）のカラムなどを用いて、 IgG あるいは Ig 画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピング キットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋 白質量は、ローリー法あるいは 280nm での吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、 IgGl、 IgG2a、 lgG2b、 IgG 3,ヒトでは、 IgGl、 lgG2、 IgG3、 IgG4があげられる。
マウス IgGl、 IgG2a およぴヒト IgGl タイプは、補体依存性細胞傷害活性（以下、 CDC活性）および抗体依存性細胞傷害活性（以下、 ADCC活性）を有し、治療への応 用上、有用である。
2.組換え抗体の作製方法（I)一抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト化抗体の作製方法
(1)ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト以外の動物の抗体からヒト化抗体を作製するために必要なヒト化抗体発現用べク ターを構築する。ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体の C領域である CHおよび CLをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用 発現べクタ一にヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子をそれぞれ挿入すること により構築されたものである。
ヒト抗体の C領域としては、例えば、ヒト抗体 H鎖では C T/ 1や C γ 4、ヒト抗体 L 鎖では C κ等の任意のヒト抗体の C領域を用いること力 Sできる。ヒト抗体の C領域をコ ードする遺伝子としてはェキソンとイントロンより成る染色体 DNA を用いることができ、 また、 cDNAを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体 C領域 をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることがで さる。
例えば、 pAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990) ]、pAGE103 [J. Biochem., 101 , 1307 (1987)]、 pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]、 pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]、 pSG l β d2-4 [ Cytotechnology, 4, 173 (1990) ：]等があげられる。 動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40 の初期 プロモーターとェンハンサー [J. Biochem. , 101 , 1307 (1987)]、モロニ一マウス白血病 ウィルスの LTR プロモ一ターとェンハンサー [Biochem. Biophys . Res . Comun., 149, 960 (1987)]、および免疫グロブリン H鎖のプロモーター [Cell, 41 , 479 (1985)]とェン ハンサー [Cell, 33, 717 (1983)]等があげられる。
ヒ Mヒ抗体発現用ベクターは、抗体 H鎖、 L鎖が別々のベクター上に存在するタイプ あるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることがで きるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築のしゃすさ、動物細胞への導入のし易さ、動物 細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタンデム型のヒ ト化抗体発現用ベクターの方が好ましい [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)]。 (2)ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗ヒト VEGF 受容体 Fit- 1 モノクローナル抗 体の VHおよび VLをコードする cDNAは以下のようにして取得する。
抗ヒト VEGF 受容体 Fit - 1 モノクロ一ナル抗体を産生する細胞、例えば、マウスヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体産生ハイプリドーマ等より mRNAを抽出し、 cDNAを合成す る。合成した cDNAを、ファージあるいはプラスミドなどのベクターに挿入し、 cDNAライ ブラリーを作製する。該ライブラリ一より、ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体の C領域部分あるいは V領域部分をプローブとして用い、 VHをコードする cDNAを有 する組換えファージあるいは組換えプラスミド、および VLをコ ドする cDNAを有する 組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるい は組換えプラスミド上の目的とする抗体の VHおよび VLの全塩基配列を決定し、塩基 配列より VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定する。
(3)ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
前記 2 (1 )で構築したヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコード する遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを 挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、キメラ抗体発 現用ベクターのヒト抗体の CH および CLをコードする遺伝子の上流にあらかじめヒト 以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAをクローニングするための制 限酵素の認識配列を設けておき、このクローユングサイトにヒト以外の動物の抗体の V 領域をコードする cDNAを下記に述べる合成 DNAを介して挿入することにより、ヒト型 キメラ抗体発現ベクターを製造することができる。合成 DNAは、ヒト以外の動物の抗体 の V領域の 3'末端側の塩基配列とヒト抗体の C領域の 5'末端側の塩基配列とからな るものであり、両端に適当な制限酵素部位を有するように DNA合成機を用いて製造す る。
(4)ヒト以外の動物の抗体の CDR 配列の同定
抗体の抗原結合部位を形成する VH及び VLは、配列の比較的保存された 4個のフ レームワーク領域（以下、 FR領域と称す）とそれらを連結する配列の変化に富んだ 3個 の相補性決定領域（CDR)から成っている [シーケンシズ'ォブ ·プロテインズ 'ォブ ·ィム ノロシカレ 'インタレスト (Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services，（1991) ;以下、シ一ケンシズ' ォブ' プロテインズ' ォブ. ィムノロジカル · インタレストと記す。 ]。そして各 CDR アミノ酸配列（CDR 配列）は、 既知の抗体の V 領域のアミノ酸配列（シーケンシズ'ォブ'プロテインズ.ォブ' ィムノ ロジカル'インタレスト）と比較することにより同定することができる。 (5)ヒト型 CDR移植抗体の V領域をコードする cDNAの構築
ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは以下のようにして取得 すること力 Sできる。
まず、 目的のヒト以外の動物の抗体の V領域の CDR を移植するためのヒト抗体の V 領域の FRのアミノ酸配列を VH、 VLそれぞれについて選択する。ヒト抗体の V領域 の FRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来の V領域の FRのアミノ酸配列であればい かなるものでも用いることができる。
例えば、 Protein Data Bank に登録されているヒト抗体の V領域の FRのアミノ酸配 列、ヒト抗体の V 領域の FRの各サブグループの共通アミノ酸配列（シ一ケンシズ. ォ ブ. プロテインズ. ォブ. ィムノロジカル. インタレスト）があげられる力 S、充分な活性を 有するヒト型 CDR 移植抗体を創製するためには、 目的のヒト以外の動物の抗体の V 領域のアミノ酸配列と高い相同性、好ましくは 65%以上の相同性を有することが望まし レ、。次に、選択したヒト抗体の V領域の FRのアミノ酸配列をコードする DNA配列と目 的のヒト以外の動物の抗体の V領域の CDRのアミノ酸配列をコードする DNA配列を 連結させて、 VH、VLそれぞれのアミノ酸配列をコードする DNA 配列を設計する。 CDR移植抗体可変領域遺伝子を構築するために設計した DNA 配列を得るためには、 全 DNA配列をカバーするように各鎖について数本の合成 DNAを設計し、それらを用 いてポリメラーゼ 'チェイン'リアクション（Polymerase Chain Reaction ;以下、 PCR と記 す）を行う。 PCR での反応効率および合成可能な DNA の長さから各鎖について、好 ましくは、 6本の合成 DNAを設計する。反応後、増幅断片を適当なベクターにサブクロ 一ユングし、その塩基配列を決定し、 目的のヒト型 CDR移植抗体の各鎖の V領域の アミノ酸配列をコードする cDNAを含むプラスミドを取得する。また、約 100塩基よりな る合成 DNAを用いてセンス、アンチセンスともに全配列を合成し、それらをァニーリン グ、連結することで、 目的のヒト型 CDR移植抗体の各鎖の V領域のアミノ酸配列をコ ードする cDNAを構築することもできる。
(6)ヒト型 CDR移植抗体の V領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型 CDR移植抗体は目的のヒト以外の動物の抗体の V領域の CDRのみをヒト抗 体の V領域の FR間に、単純に移植しただけでは、その活性はもとのヒト以外の動物の 抗体の活性に比べて低下してしまうことが知られている [BIO/TECHNOし OGY， 9, 266 (1991) ]。そこでヒト抗体の V領域の FRのアミノ酸配列のうち、直接抗原との結合に 関与しているアミノ酸残基、 CDR のアミノ酸残基と相互作用をしているアミノ酸残基、あ るいは抗体の立体構造の維持に関与している等の可能性を有するアミノ酸残基をもと のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、活性を上昇させることが 行われている。そして、それらのアミノ酸残基を効率よく同定するため、 X線結晶解析 あるいはコンピューターモデリング等を用いた抗体の立体構造の構築および解析を行 つている。しかし、いかなる抗体にも適応可能なヒト型 CDR移植抗体の製造法は未だ 確立されておらず、現状では個々の抗体によって種々の試行錯誤が必要である。 選択したヒト抗体の V領域の FRのアミノ酸配列の改変は各種の変異導入プライマー を用いて前記 2 (5)に記載の PCRを行うことにより達成できる。 PCR 後の増幅断片を 適当なベクターにサブクロー-ング後、その塩基配列を決定し、 目的の変異が導入さ れた cDNAを含むベクタ一（以下、アミノ酸配列改変ベクターと称す）を取得する。 また、狭い領域のアミノ酸配列の改変であれば、 20〜35塩基からなる変異導入プラ イマ一を用いた PCR変異導入法により行うことができる。具体的には、改変後のアミノ 酸残基をコードする DNA配列を含む 20〜35塩基からなるセンス変異プライマー及び アンチセンス変異プライマ一を合成し、改変すべき V領域のアミノ酸配列をコードする cDNAを含むプラスミドを铸型として 2段階の PCRを行う。最終増幅断片を適当なべク ターにサブクロ一ユング後、その塩基配列を決定し、 目的の変異が導入された cDNA を含むアミノ酸配列改変ベクターを取得する。
(7) ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターの構築
前記 2 (1)のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CH及び CLをコードする遺伝子 の上流に、前記 2 (5)および 2 (6)で取得したヒト型 CDR移植抗体の VH及び VLをコ ードする cDNAを挿入し、ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。 例えば、ヒト型 CDR移植抗体の VH及び VLのアミノ酸配列をコードする cDNAを構 築するための PCRの際に 5'末端および 3'末端の合成 DNAの末端に適当な制限酵 素の認識配列を導入することで、所望のヒト抗体の C 領域をコードする遺伝子の上流 にそれらが適切な形で発現するように挿入することができる。 (8)ヒト化抗体の一過性（トランジェント)発現および活性評価
多種類のヒト化抗体の活性を効率的に評価するために、前記 2 (3)のヒト型キメラ抗体 発現ベクター、および前記 2 (7) のヒト型 CDR移植抗体発現ベクターあるいはそれら の改変ベクターを COS-7細胞（ATCC CRL1651)に導入してヒト化抗体の一過性発現 [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, pp283 (1991)]を行い、その活性を測定 すること力 Sでさる。
COS- 7細胞への発現ベクターの導入法としては、 DEAE-デキストラン法 [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, pp283 (1991)]、リポフエクシヨン法 [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987) ]等があげられる。
ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の活性は前記 1 (5)に記載の酵素免疫 測定法（ELISA法）等により測定することができる。
(9)ヒト化抗体の安定 (ステーブル)発現および活性評価
前記 2 (3)のヒト型キメラ抗体発現べクタ一および前記 2 (7)のヒト型 CDR移植抗体発 現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に生産する形質転 換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、ヱレクト口ポレーシヨン法 [特開平 2- 257891; Cytotechnology, 3, 133 (1990) ]等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることが できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウス SP2/0- Agl4 細胞（ATCC CRL1581 )、 マウス P3X63— Ag8.653 細胞（ ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、 DHFR 遺伝子と称す）が欠損した CHO 細胞 [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77. 4216 ( 1980 ) ] 、 ラット YB2/3Hし P2.G l l .16Ag.20細胞（ATCC CRL1662、以下、 YB2/0 細胞と称す）等があ げられる。
ベクタ一の導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平 2 - 257891 に開示されている方法に従レ、、 G418 および FCS を含む RPMI1640 培地により選択 する。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中にヒト化抗体を生産蓄 積させること力できる。培養液中のヒト化抗体の活性は前記 1 (5)に記載の方法などに より測定する。また、形質転換株は、特開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。 ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテイン A カラムを用いて精製すること ができる（アンチボディズ 'ァ'ラボラトリ一'マニュアル 第 8章）。また、その他に、通常 の蛋白質で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交 換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組合せて行レ、、精製することができる。精製し たヒト化抗体の H鎖、 L鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動（SDS- PAGE) [Nature, 227, 680 (1970) ]やウェスタンブロッテイング法（アン チボディズ 'ァ'ラボラトリー 'マニュアル 第 12章）等で測定する。
精製したヒト化抗体の反応性、また、ヒト化抗体の VEGF受容体 Fit- 1に対する結合 活性の測定は前記 1 (5)に記載の方法などにより測定することができる。
3.組換え抗体の作製方法 (II)
(1)抗体断片 Fab、 Fab，および F(ab，)2の作製方法
上述した抗体を酵素で処理することにより、抗体断片を生成させる。酵素としては、パ パイン、トリプシンなどをあげることができる。
または、該抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体の Fab、 Fab，あるいは F(ab，)2断片をコード する DNA を動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを動物細胞へ導入するこ とにより発現させ、 Fab、 Fab，あるいは F(ab')2を製造することができる。
生成される抗体断片は、ゲル濾過、イオン交換、ァフィ二ティ一クロマトグラフィーおよ び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製した Fab、 Fab，および F(ab，)2の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS- PAGE) [Nature, 227, 680 (1970) ]やウェスタンブロッテイング法（アンチボディズ.ァ 'ラボラトリー，マニュアル 第 12章）等で測定する。
精製した Fab、 Fab，および F(ab，)2の反応性、また、 Fab、 Fab，および F(ab，)2の VEGF受容体 Flt-1 に対する結合活性の測定は前記 1 (5)に記載の方法などにより測 定することがでさる。
(2)抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1—本鎖抗体の作製方法
前記 2 (2)、 2 (5)および 2 (6)に記載のヒト以外の動物の抗体あるいはヒト型 CDR移 植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを一本鎖抗体発現用ベクターに挿入する ことによりヒト以外の動物の抗体の一本鎖抗体あるいはヒト型 CDR移植抗体の一本鎖 抗体の発現べクタ一を構築することができる。ここで用いる一本鎖抗体発現用ベクター としてはヒト以外の動物の抗体あるいはヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコード する cDNAを組込み発現できるものであれば、いかなるものでも用いることができる。 例えば、 AGE 107 [ Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、 pAGE 103 [J. Biochem" 101 , 1307 (1987) ]、 pHSG274 [ Gene , 27, 223 (1984) ]、 pKCR [ Proc. Natl. Acad. Sci. U SA. , 78, 1527 (1981)]、 pSG l β d2-4 [ Cytotechnology, 4, 173 (1990)]等があげら れる。一本鎖抗体を発現させるための宿主としては、大腸菌、酵母、動物細胞等の中 力ら適切なものを選択することができる力 その場合の発現用ベクターとしては、それ ぞれの宿主に適切なものを選択する必要がある。また、適切なシグナルペプチドをコー ドする cDNA を発現用ベクターに挿入することで一本鎖抗体を細胞外に分泌させ、ぺ リプラズマ領域に輸送させ、あるいは細胞内に留まらせることができる。
選択された発現用ベクターに、 VH— P— VLあるいは VL— P— VH (Pはペプチドリン 力一）からなる一本鎖抗体をコードする cDNAを適切なプロモ一ター、および必要に応 じてシグナルペプチドの下流に挿入することにより、 目的の一本鎖抗体をコードする cDNAが挿入された一本鎖抗体発現ベクターを構築することができる。
一本鎖抗体をコ一ドする cDNAは、 VHをコードする cDNAと VLをコードする cDNA とを、両端に適当な制限酵素の認識配列を有するペプチドリンカ一をコードする合成 DNA を用いて連結することにより得ることができる。リンカ一ペプチドは、その付加が VHおよび VLの抗原への結合に対して妨害しないように最適化することが重要で、例 えば Pantolianoらにより示されたもの [ Biochemistry， , 101 17 (1991) ]あるいはそれ を改変したものを用いることができる。
(3 )抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ジスルフイド安定化抗体の作製方法
ジスルフイド安定化抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VH および VL をコードする cDNAあるいはヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAのそれぞれ の適切な位置の 1アミノ酸残基に相当する塩基配列をシスティン残基に相当する塩基 配列に改変し、発現および精製したのち、ジスルフイド結合を形成させることで作製す ることができる。アミノ酸残基のシスティン残基への改変は前記 2 (5)の PCR を用いた 変異導入法により行うことができる。
得られた改変 VHおよび改変 VLをコードする cDNAを適切な発現用ベクターに揷 入することによりジスルフイド安定化抗体 H 鎖発現ベクターおよびジスルフイド安定化 抗体 L鎖発現ベクターを構築することができる。ここで用いるジスルフイド安定化抗体 発現用ベクターとしては改変 VHおよび改変 VLをコードする cDNAを組込み発現で きるものであれば、 いかなるものでも用いることができる。 例えば、 pAGE107 [ Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、 pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)]、 pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]、 pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981) ]、pSG l β d2-4 [Cytotechnology, 4, 173 (1990) ]等があげられる。ジスルフ イド安定化抗体を形成させるためにジスルフイド安定化抗体 L鎖発現ベクターおよび ジスルフイド安定化抗体 H鎖発現ベクターを発現させるための宿主としては、大腸菌、 酵母、動物細胞等の中から適切なものを選択することができる力 その場合の発現用 ベクターとしては、それぞれの宿主に適切なものを選択する必要がある。
また、適切なシグナルペプチドをコードする cDNAを発現用ベクターに揷入することで ジスルフイド安定化抗体を細胞外に分泌させ、ペリプラズマ領域に輸送させ、あるいは 細胞内に留まらせることができる。
(4)各種抗体の発現および活性評価
前記 3 (1)〜（3)で構築された抗体断片発現ベクター、一本鎖抗体発現ベクター、ジ スルフイド安定化抗体 H 鎖発現ベクターあるいはジスルフイド安定化抗体 L鎖発現 ベクターをエレクト口ポレーシヨン法 [特開平 2-257891; Cytotechnology, 3, 133 (1990)]等の方法により宿主細胞へ導入することにより、 目的の抗体断片、一本鎖抗体、 ジスルフイド安定化抗体 H鎖あるいはジスルフイド安定化抗体 L鎖を生産する形質転 換株を取得することができる。発現ベクターの導入後、培養上清等に含まれる抗体断 片、一本鎖抗体、ジスルフイド安定化抗体 H鎖あるいはジスルフイド安定化抗体 L鎖 の発現は前記 1 (5)に記載の方法等により確認することができる。
一本鎖抗体、ジスルフイド安定化抗体 H鎖あるいはジスルフイド安定化抗体し鎖の 回収おょぴ精製は公知の技術を組み合わせることにより達成することができる。例えば、 抗体断片、一本鎖抗体、ジスルフイド安定化抗体 H 鎖あるいはジスルフイド安定化抗 体 L鎖が培地中に分泌されるならば、限外濾過により濃縮することができ、次いで各種 クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を実行することにより達成することができる。また、 宿主細胞のペリプラズマ領域へと輸送されるならば、その細胞に浸透圧ショックを与え、 限外濾過により濃縮することができ、次いで各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を 実行することにより達成すること力できる。不溶性であり、かつ顆粒（インクル一ジョン' ボディー）として存在している抗体断片、一本鎖抗体、ジスルフイド安定化抗体 H 鎖あ るいはジスルフイド安定化抗体 L 鎖は、細胞の溶解、顆粒を単離するための遠心分離 と洗浄の繰り返し、例えばグァニジン-塩酸による可溶化後、各種クロマトグラフィーある いはゲル濾過クロマトグラフィーを実行することにより達成することができる。
精製された一本鎖抗体は、前記 1 (5)に記載の方法等により測定することができる。 精製されたジスルフイド安定化抗体 H鎖とジスルフイド安定化抗体し鎖は、各々を混 合したのち、活性を有する構造へと導く操作 [refolding 操作， Molecular Immunology, 32, 249 (1995)]によりジスルフイド結合を形成させた後、抗原ァフィ二ティークロマトグラ フィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーまたはゲルろ過により活性を有するジスルフ イド安定化抗体を精製することができる。ジスルフイド安定化抗体の活性は前記 1 (5)に 記載の方法等により測定することができる。
4.融合抗体および融合ペプチドの作製方法
本発明で使用される抗体またはペプチドに、放射性同位元素、毒素、サイト力インま たは酵素等の蛋白質、低分子の薬剤などを、化学的あるいは遺伝子工学的に結合さ せた融合抗体または融合ペプチドも抗体の誘導体として使用することができる。
抗体またはペプチドと毒素蛋白質とを化学的に結合させた融合抗体または融合ぺプ チドは、文献 [Anticancer Research, 11_, 2003 (1991); Nature Medicine, 3， 350 (1996)]記載の方法等に従って作製することができる。
抗体またはペプチドと、毒素、サイト力インまたは酵素等の蛋白質とを遺伝子工学的 に結合させた融合抗体または融合ペプチドは、文献 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 974 (1996); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7826 (1996)]記載の方法等に従って作 製することができる。 抗体またはペプチドと低分子抗癌剤を化学的に結合させた融合抗体または融合ぺ プチドは、文献 [Science, 261_, 212 (1993)]記載の方法等に従って作製することができ る。
抗体またはペプチドと放射性同位元素を化学的に結合させた融合抗体または融合 へ 7テトは、文献 [Antibody Immunocoryugates and Radiopharmaceuticals, 3. 60 (1990); Anticancer Research, 11 , 2003 (1991)]記載の方法等に従って作製することが できる。
これらの誘導体は、抗体分子の特異性に従って放射性同位元素、毒素、サイト力イン または酵素等の蛋白質、低分子の薬剤などを標的組織周辺に集積させることで、より 効果的で副作用の少ない診断あるいは治療を可能にすることが期待されている。
5.抗体の使用方法（I)
上述した抗 VEGF受容体 Flt-1抗体、ペプチド、それらと他分子との融合抗体、または 融合ペプチドは、ヒト VEGF受容体 Fit- 1と結合し、 ADCC、 CDC等の抗体のエフヱクタ 一活性を介して VEGF受容体 Fit- 1を細胞表面に発現している細胞を破壊するため、 乳癌、前立腺癌、大腸癌、胃癌、肺癌などの固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、慢性 関節リウマチにおける関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾癬などの血 管新生の異常により病態が進行する疾患の治療等に有用である。
本発明の抗体、ペプチド、融合抗体または融合ペプチドを含有する医薬は、治療薬 として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるい はそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方 法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、ま たは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげるこ とができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。 投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注 射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒 剤等があげられる。 乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖 類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、ォリーブ 油、大豆油等の油類、 P—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレ 一バ—、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦 形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等 の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造 できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて 調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体またはペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔および気道 粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担 体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体またはペプチドおよ び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、 これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもでき る。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重 等により異なる力 通常成人 1日当たり 10 / g/kg〜8mg/kgである。
本発明のヒト VEGF受容体 Flt-1に対する抗体またはペプチドは、乳癌、前立腺癌、大 腸癌、胃癌、肺癌など固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、慢性関節リウマチにおける 関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾癬などの血管新生の異常により病 態が進行する疾患の診断薬あるいは治療薬に用いることができる。
さらに、本発明の抗体またはペプチドはヒト Fit - 1に対して中和活性を有するため、ヒト VEGFの Fit- 1への結合を阻害する。すなわち、 Flt_l自己リン酸化を阻害し、 VEGF依 存的ヒト血管内皮細胞の遊走を阻害する。したがって、乳癌、前立腺癌、大腸癌、胃癌、 肺癌などの固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、慢性関節リウマチにおける関節炎、糖 尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾癬などの血管新生の異常により病態が進行す る疾患の治療薬として用いることができる。
また、本発明で使用される抗体またはペプチドの各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果 を検討する方法は、インビトロ実験としては、補体依存性細胞障害活性 (CDC活性)測 定法、抗体依存性細胞障害活性 (ADCC活性)測定法等があげられ、インビボ実験と しては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
CD C活性、 ADCC活性、抗腫瘍実験は、文献 [Cancer Immunology
Immunotherapy, 36, 373 (1993)， Cancer Research, 54, 1511 (1994)]記載の方法等に 従って行うことができる。
6.抗体の使用方法（II)
また、本発明 ίま、ヒト VEGF受容体 Fit— 1また ίまヒト VEGF受容体 Fit— 1を糸田包表面 に発現した細胞を免疫学的に検出および定量する方法、可溶性ヒト VEGF 受容体 Fit- 1を免疫学的に検出および定量する方法、ヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit- 1と の結合を阻害する方法およびヒト VEGF受容体 Flt-1 機能を中和する方法、血管内 皮細胞の遊走を阻害する方法に関する。
本発明の抗体またはペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Fit- 1、ヒト VEGF受容体 Flt-1を細胞表面に発現した細胞または可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1を免疫学的に 検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ELISA)、放射性物 質標識免疫抗体法 (RIA)、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染 色法 (ABC法、 CSA法等）、ウェスタンプロッティング法、免疫沈降法、上記に記した酵 素免疫測定法、サンドイッチ ELISA 法 [単クローン抗体実験マニュアル (講談社サイエ ンティフィック、 1987年）、続生化学実験講座 5 免疫生化学研究法（東京化学同人、 1986年）]などがあげられる。
蛍光抗体法とは、分離した細胞あるいは組織などに、本発明の抗体またはペプチドを 反応させ、さらにフルォレシン'イソチオシァネート（F1TC)などの蛍光物質でラベルし た抗ィムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメ 一ターで測定する方法である。
免疫酵素抗体法（ELISA)とは、分離した、細胞あるいはその破砕液、組織あるいはそ の破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明の抗体またはぺプ チドを反応させ、さらにペルォキシダーゼ、ビォチンなどの酵素標識などを施した抗ィ ムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定 する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法（RIA)とは、分離した、細胞あるいはその破砕液、組織 あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明の抗体 を反応させ、さらに放射線標識を施した抗ィムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反 応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
免疫細胞染色法、免疫組織染色法とは、分離した、細胞あるいは組織などに、本発 明の抗体またはペプチドを反応させ、さらにフルォレシン'イソチオシァネート（FITC) などの蛍光物質、ペルォキシダーゼ、ビォチンなどの酵素標識を施した抗ィムノグロブ リン抗体あるいは結合断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。 また、ヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit- 1との結合の阻害活性は、増殖因子と受容 体の結合測定法 [新生化学実験講座 7 増殖分化因子とその受容体 (東京化学同人、 1991年）]等の方法に準じて、本発明の抗体を用いた VEGF-VEGF受容体 Fit- 1結 合阻害試験を行うことにより確認することができる。
すなわち、 Fit- 1を発現している細胞あるいは組織に放射性物質等を標識した
VEGFを反応させ、 Flt-1発現細胞あるいは組織に結合した VEGFをシンチレーシヨン カウンターなどで測定する方法である。放射性物質等を標識した VEGFと同時に本発 明の抗体またはペプチドを反応させることで、放射性物質等を標識した VEGFが Flt- 1に結合するのを阻害する活性を測定することが可能である。
VEGF受容体 Fit- 1の自己リン酸化阻害活性は、増殖因子受容体の自己リン酸化測 定法 [続生化学実験講座 情報伝達と細胞応答 (東京化学同人、 1986年) ]等の方法 に準じて、抗体またはペプチドを用いた、 VEGF- VEGF受容体 Fit- 1の自己リン酸化 阻害試験を行うことにより確認することができる。
すなわち、 Fit- 1を発現している細胞あるいは組織に VEGFを反応させ、 VEGFが結 合することで亢進する Fit- 1の自己リン酸化を免疫沈降法およびウェスタンプロット法 などで検出する方法である。 VEGFと同時に本発明の抗体またはペプチドを反応させ ることで、 VEGFが結合することにより亢進される Flt-lの自己リン酸化を阻害する活性 を測定することが可能である。
ヒト VEGFの阻害活性は、 VEGF依存的な血管内皮細胞の増殖、遊走、およびチュ ーブ形成試験 [新生化学実験講座 10 血管（内皮と平滑筋）（東京化学同人、 1991 年）]を行うことにより確認することができる。
VEGF依存的な血管內皮細胞の増殖試験とは、血管内皮細胞に VEGFを反応させ、 VEGFが結合することで亢進する血管内皮細胞の増殖促進活性を細胞数を測定する 方法である。 VEGFと同時に本発明の抗体またはペプチドを反応させることで、 VEGF により亢進する血管内皮細胞の増殖促進活性を阻害する活性を測定することが可能 である。
VEGF依存的な血管内皮細胞の遊走試験とは、血管内皮細胞に VEGFを反応させ、 VEGFが結合することで亢進する血管内皮細胞の遊走促進活性を顕微鏡を用いて観 察する方法である。 VEGFと同時に本発明の抗体またはペプチドを反応させることで、 VEGFにより亢進する血管内皮細胞の遊走促進活性を阻害する活性を測定することが 可能である。
VEGF依存的な血管内皮細胞のチューブ形成試験とは、血管内皮細胞に VEGFを 反応させ、 VEGFが結合することで亢進する血管内皮細胞のチューブ形成促進活性を 顕微鏡を用いて観察する方法である。 VEGFと同時に本発明の抗体またはペプチドを 反応させることで、 VEGFにより亢進する血管内皮細胞のチューブ形成促進活性を阻 害する活性を測定することが可能である。
以下、それらの一例について説明する。
(1)抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 抗体を用いた免疫細胞染色
まず、ヒト VEGF受容体 Fit - 1 を細胞表面に発現した細胞を調製する。浮遊細胞に ついてはそのまま、付着細胞についてはトリプシン EDTAにて細胞をはがした後、免疫 細胞染色用緩衝液（1%BSA 、0.02%EDTA 、 0.05%アジ化ナトリウムを含む PBS )など に懸濁し、 1 X 10 5〜2 X 1 06個ずつに分注する。 1 (4)で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマの培養上清あるいは 2(9)で得られた抗ヒ ト VEGF受容体 Flt_lヒト化抗体産生形質転換株の培養上清、または 1(6)、 2(9)ある いは 3 (4)で得られた精製抗体、または公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊 1985 年）でビォチン標識した該抗体を 0.1〜50 μ g/mlの濃度になるように免疫細胞染色 用緩衝液あるいは 10%動物血清を含む免疫細胞染色用緩衝液を用いて希釈したも のを 20〜500 μ Iずつ分注し、水冷下で 30分間反応させる。 1(4)で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは 2(9) で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト化抗体産生形質転換株の培養上清、または 1(6)、 2(9)あるいは 3 (4)で得られた精製抗体を反応させた場合、免疫細胞染色用緩 衝液で細胞を洗浄後、 FITCあるいはフィコエリスリンなどの蛍光色素で標識した抗マウ スィムノグロブリン抗体、抗ラットイムノグロブリン抗体あるいは抗ヒトイムノグロブリン抗体 を 0.1〜50 μ g/ml程度の濃度で含む免疫細胞染色用緩衝液を 50〜500 μ 1ずつ分 注し、氷冷下で 30分間遮光して反応させる。また、ピオチン標識した該抗体を反応さ せた場合、 FITCあるいはフィコエリスリンなどの蛍光色素で標識したストレプトアビジン を 50〜500 μ 1ずつ分注し、氷冷下で 30分間遮光して反応させる。反応後は、よく免 疫細胞染色用緩衝液で洗浄し、セルソーターにより解析する。
(2)ウェスタンブロット法によるヒト VEGF受容体 Fit- 1の検出
ヒト VEGF受容体 Fit- 1 を発現している細胞、例えばヒト VEGF受容体 Flt-1 発現 N IH3T3 細胞（NIH3T3-Flt_lと称す）、およびコントロール細胞、例えば NIH3T3細 胞（NIH3T3-Neoと称す） [Oncogene, 10, 135 (1995)]等より、細胞膜成分を調製し、 還元条件下でレーンあたりの蛋白質量として 0.1〜30 μ gの膜成分を SDS - PAGE法 により泳動する。泳動された蛋白質を PVDF膜にトランスファーし 1 %BSAを含む PBSに室温で 30分間反応させブロッキング操作を行う。 1 (4)で得られた抗ヒト VEGF 受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは 2(9)で得ら れた抗ヒト VEGF受容体 Flt-1 ヒト化抗体産生形質転換株の培養上清、または 1 (6)、 2(9)ある!/、は 3 (4)で得られた精製抗体を反応させ、 0.05% Tween を含む PBS で洗浄 し、ペルォキシダーゼ標識した抗マウス IgG、抗ラット IgGまたは抗ヒト IgGを室温で 2 時間反応させる。 0.05% Tween を含む PBS で洗浄し、 ECL Western blotting detection reagents (Amersham社製） 等を用いて、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が 結合したバンドを検出する。
(3)抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 抗体による可溶性 VEGF受容体 Fk-1定量
1(6)、 2(9)あるいは 3 (4)で得られた精製抗体を一次抗体として適当なプレートにコー トし、 1(1) で得られたヒト VEGF受容体 Fit- 1 またはヒト VEGF受容体 Fit- 1 と他の 蛋白質との融合蛋白質などの組換え蛋白質 0.056〜10，000ng/ml 、もしくはヒト血清 などの検体を反応させる。プレートをよく洗浄した後、さらに第二抗体としてビォチン、 酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した 1(6)、 2(9)あるいは 3 (4)で 得られた精製抗体のうち一次抗体として使用した抗体とは異なるェピトープを認識する モノクローナル抗体またはヒト化抗体を反応させた後、標識物質に応じた反応を行なう。 精製可溶性 VEGF受容体 Flt-1 に対する反応性をもとに検量線を描き、検体中の可 溶性 VEGF受容体 Fit- 1 濃度を算出する。
ヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit- 1との結合を阻害する方法にっレ、ては、以下の方 法があげられる。
(4)抗体を用いた VEGF— VEGF受容体 Flt-Ι結合阻害試験
96ゥエル'マルチスクリーン · IPプレート（96- well MultiScreen-IP Plate ;ミリポア社 製）にメタノールを 100 μ 1/ゥエルで分注し、プレート底部の PVDF膜を親水化する。 水で洗浄後、 PBS で 0.1〜10 μ g/mlの濃度に希釈したヒト VEGF受容体 Fit- 1また はヒト VEGF受容体 Flt_lと他の蛋白質との融合蛋白質などの組換え蛋白質を、 50 μ 1/ゥエルで分注し、 4 °Cでー晚放置して吸着させる。洗浄後、 1 %牛血清アルブミン (BSA) を含む PBSを 100 μ \/ ゥヱル加え、室温で 1時間反応させて残っている活性 基をブロックする。 PBSで洗浄後、前記 1 (4)で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 モ ノクローナル抗体産生ハイプリドーマの培養上清あるいは前記 2 (9)で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト化抗体産生形質転換株の培養上清、または前記 1 (6)、 2(9)あ るいは 3 (4)で得られた精製抗体を 50 μ 1/ゥエルで分注し、さらに、 0.1〜10ng/ml の 1251標識 VEGF (アマシャム社製）を 50 ゥエル加え、室温で 1.5 時間反応させる。 0.05%tween - PBSで洗浄後、 50°Cでゥエルを乾燥させ、シンチレーターを 20から 100 μ 1/ゥエル加え、各ゥエルに結合した 1251標識 VEGFの放射活性をトップカウント (パ ッカード社製)等を用いて測定する。
7.乳癌、前立腺癌、大腸癌、胃癌、肺癌などの固形腫瘍の増殖もしくは転移形成に基 づく疾患、異常な血管新生により病態が進行する疾患の診断方法
乳癌、前立腺癌、大腸癌、胃癌、肺癌などの固形腫瘍の増殖もしくは転移形成に基 づく疾患、異常な血管新生により病態が進行する疾患の診断方法としては、被験者の 細胞あるいは組織に存在するヒト VEGF受容体 Flt_lを、本発明の抗体またはぺプチ ドを用いて、上述した免疫学的に検出または定量する方法があげられる。
図面の簡単な説明
第 1図 プラスミド pBS1732Hの造成工程を示した図である。
第 2図 プラスミド pBS1732Lの造成工程を示した図である。
第 3図 プラスミド PKANTEX1732Hの造成工程を示した図である。
第 4図 プラスミド pKANTEX1732の造成工程を示した図である。
第 5図 プラスミド pBS1750Hの造成工程を示した図である。
第 6図 プラスミド pBS1750Lの造成工程を示した図である。
第 7図 プラスミド pKANTEX1750Hの造成工程を示した図である。
第 8図 プラスミド pKANTEX1750の造成工程を示した図である。
第 9図 精製した抗ヒト VEGF受容体 Flt_lヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550の SDS- PAGE (4〜 15%グラジェントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した 図である。レーン 1が低分子マーカー、レーン 2が還元条件下での KM2532、レーン 3が還元条件下での KM2550、レーン 4が高分子マーカー、レーン 5が非還元条件下 での KM2532、レーン 6が非還元条件下での KM2550の泳動パターンをそれぞれ示 す。
第 10図 精製した抗ヒト VEGF受容体 Flt-lヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550の可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nとの結合活性を示した図である。 (A)は プレートに吸着させる可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7Nの濃度を一定（1 β g/ml)に し、添加するヒト型キメラ抗体濃度を変化させた場合の結果である。縦軸は可溶性ヒト VEGF受容体 Flt-1 7Nとの結合活性、横軸はヒト型キメラ抗体濃度をそれぞれ示す。 △が KM2532、〇が KM2550の活性をそれぞれ示す。（B)はプレートに吸着させる可 溶性ヒト VEGF受容体 Flt_l 7Nの濃度を変化させ、一定濃度（10 μ g/ml)のヒト型キ メラ抗体の結合活性を測定した結果である。縦軸は可溶性ヒト VEGF受容体 Flt-1 7N との結合活性、横軸はプレートに吸着させた可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nの濃度 をそれぞれ示す。△が KM2532、〇が KM2550の活性をそれぞれ示す。
第 11図 精製した抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550によるヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit- 1の結合阻害活性を示した図である。 〇が KM1732、口が KM1750、鲁が KM2532、画が KM2550の活性をそれぞれ示す。 第 12図 プラスミド phKM1732HV0の造成工程を示した図である。
第 13図 プラスミド phKM1750HV0の造成工程を示した図である。
第 14図 プラスミド phKM1732LV0の造成工程を示した図である。
第 15図 プラスミド phKM1750LV0(IV)の造成工程を示した図である。
第 16図 プラスミド PKANTEX1732HV0の造成工程を示した図である。
第 17図 プラスミド pKANTEX1732HV0LV0の造成工程を示した図である。
第 18図 プラスミド pKANTEX1750HV0LV0(IV)を示した図である。
第 19図 プラスミド pVL1393/Flt 3Nの造成工程を示した図である。
第 20図 プラスミド pVLl393/Flt 7Nの造成工程を示した図である。
第 21図 精製した Fit- 1 7Nおよび Fit- 1 3Nの SDSポリアクリルアミド電気泳動（5 〜20%グラジェントゲルを使用）のパターンを示した図である。左より、分子量マ一カー、 Flt-1 3N、 Flt-1 7Nの泳動パターンをそれぞれ示す。還元条件下で電気泳動を行つ た。
第 22図 プレートコートした可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7Nへの 1251-ヒト VEGF の結合に及ぼす可溶性ヒト VEGF受容体 Flt_l 7Nおよび Fit- 1 3Nの阻害効果を解 析した結果を示す。
第 23図 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1 モノクローナル抗体の結合反応性を酵素免疫 測定法にて検討した結果を示す。
第 24図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体による VEGFとヒト VEGF 受容体 Flt-1 の結合阻害活性を検討した結果を示す。
第 25図 抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 モノクローナル抗体 KM1732、 KM 1748および M1750によるヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit- 1の結合阻害活性を検討した結果を 示す。
第 26図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体 KM1732、 KM1748および M1750によるヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Flt_l 発現細胞の結合阻害活性を検討 した結果を示す。
第 27図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体 KM1730、 KM1731、 KM1732、 KM 1748および KM1750のヒト VEGF受容体 Fit- 1 発現細胞 NIH3T3- Fit - 1およびコントロール細胞 NIH3T3- Neo細胞との反応性をフローサイトメーターに て解析した結果を示す。
第 28図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体 KM1737のヒト VEGF受容 体 Fit - 1 との反応性をウェスタンブロッテイングにより検討した結果を示す。レーン 1 は、 NIH3T3- Fit- 1細胞、レーン 2 は、 NIH3T3- Neo細胞のウェスタンブロッテイング のノ、 "ターンを示す。
第 29図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体 KM1732およびビォチン化 KM1730を用いて可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 3Nおよび FLT- 1 7Nの定量系を検 討した結果を示す。
第 30図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1732、 KM1750,および抗 ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532、 K 2550の、可溶性ヒト VEGF受容 体およびその誘導体である Fit- 1 7N、Flt- 1 3N、Flt- 1 2N、 Fit- 1 7N.K2および KDR 7Nの結合反応性を酵素免疫測定法で検討した結果を示す。
第 31図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532、 K 2550の可溶性ヒト VEGF受容体およびその誘導体である Fit - 1 7N、 Fit- 1 3N、 Fit- 1 2N、 Fit - 1 7N.K2 および KDR 7N の濃度依存性結合反応について酵素免疫測定法で検討した結果を 示す。
第 32図 可溶性ヒト VEGF受容体の各種誘導体の模式図を示す。
第 33図 プラスミド phKMl Oし V0 (I)の造成工程を示した図である。
第 34図 プラスミド pKANTEX1750HV0LV0 (I)の造成工程を示した図である。
第 35図 プラスミド phKM1750HV3の造成工程を示した図である。 第 36図 プラスミド phKM 50LV4の造成工程を示した図である。
第 37図 プラスミド pKANTEX1750HV3LV0 (I)の造成工程を示した図である。
第 38図 プラスミド pKANTEX1750HV3し V0 (IV)の造成工程を示した図である。
第 39図 プラスミド pKANTEX1750HV0LV4の造成工程を示した図である。
第 40図 プラスミド pKANTEX1750HV3LV4の造成工程を示した図である。
第 41図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2550およびヒト型 CDR移植 抗体 KM8550, M8551V KM8552, KM8553, K 8554, KM8555 の SDS-PAGE (4~
15%グラジェントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。レーン 1〜9 は 非還元条件下での電気泳動パターン、レーン 10〜19 までは還元条件下での電気泳 動パターンを示す。レーン 1および 10は高分子分子量マーカ一、レーン 19 は低分子 分子量マーカー、レーン 2および 1 1はコント口一ル抗体である KM8969、レ一ン 3およ び 12は KM2550、レーン 4および 13は KM8550、レーン 5および 14は KM8551、レー ン 6および 15 は KM8552、レーン Ί および 16 は KM8553,レーン 8および 17 は
K 8554,レーン 9および 18は KM8555を示す。
第 42図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2550およびヒト型 CDR移植 抗体 KM8550、 M8551, KM8552, KM8553、 KM8554、 KM8555 の可溶性ヒト VEGF 受容体 Flt_l 7Nとの結合活性を示した図である。
第 43図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2550およびヒト型 CDR移植 抗体 KM8550、 KM8551、 KM8552, KM8553、 KM8554, K 8555 の可溶性ヒト VEGF 受容体各種誘導体 Fit - 1 7N、 Fit- 1 3N、 Fit - 1 2N、 Fit- 1 7N.K2、 KDR 7Nとの結合活 性を示した図である。
第 44図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2550およびヒト型 CDR移植 抗体 KM8550、 K 8551 , KM8552, KM8553、 KM8554、 M8555によるヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Flt-1の結合阻害活性を示した図である。
第 45図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体および CDR移植抗体の H鎖可 変領域のアミノ酸配列を示した図である。図中、 KM1750mouseとは、 KM1750の H鎖 可変領域アミノ酸配列、 KM1750HV0とは、 KM1750の H鎖可変領域内の CDRをヒト フレームワークに挿入して構成されるアミノ酸配列、 KM1750HV3とは、 KM1750HV0の フレームワークのアミノ酸配列を一部 KM1750mouseのアミノ酸に置換したアミノ酸配列 を、それぞれ示す。
第 46図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体および CDR移植抗体の L鎖可変 領域のアミノ酸配列を示した図である。図中、 KM1750mouseとは、 KM1750の L鎖可 変領域アミノ酸配列、 KM1750LV0(I)とは、 KM1750の L鎖可変領域内の CDRをヒトフ レームワークに挿入して構成されるアミノ酸配列、 KM1750LV4とは、 KM1750LV00)の フレームワークのアミノ酸配列を一部 KM1750mouseのアミノ酸に置換したアミノ酸配列 を、それぞれ示す。
第 47図 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 モノクローナル抗体 KM1732および KM1750の VEGF依存性ヒト血管内皮細胞 HUVECへの遊走阻害活性を検討したグラフである。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1
1.抗ヒト VEGF受容体 Flt_l マウスモノクローナル抗体をコードする cDNAの単離お よび解析
(1)抗ヒト VEGF受容体 Flt_l マウスモノクローナル抗体生産ハイプリドーマからの mRNAの取得
インビトロジェン社製の mRNA抽出キットである Fast Trackを用い、キットに添付の使 用説明書に従って、参考例 1で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナ ル抗体 KM1732および KM1750生産ハイブリドーマ（それぞれ FERM BP- 5698、 FERM BP-5700) の各 1 X 108細胞より、それぞれ mRNAを取得した。
(2)抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 マウスモノクローナル抗体生産ハイプリドーマの重鎖 および軽鎖 cDNAライブラリ一の作製
実施例 1の 1 (1)で取得した KM1732および KM1750の mRNAの各 5 μ g力、ら、 cDNA Synthesis Kit (フアルマシア バイオテク社製）を用い、キットに添付の使用説明 書に従って、両端に EcoR I-Notl アダプターを有する cDNAをそれぞれ合成した。作 製したそれぞれの cDNAの約 6 μ gを 10 // 1の滅菌水に溶解後、ァガロースゲル電 気泳動にて分画し、 IgG型抗体の重鎖（以下、 H鎖と表記する）に対応する約 1.5kbの cDNA断片と軽鎖（以下、 L鎖と表記する）に対応する約 l.Okbの cDNA断片をそれぞ れ約 0.1 μ g回収した。次に、それぞれの約 1 .5kbの cDNA断片 0.1 μ gおよび約 l .Okbの cDNA断片 0.1 μ gと、 Lambda ZAPII Vector (Lambda ΖΑΡΠ Vectorを EcoR Iで切断後、 Calf Intestine Alkaline Phosphataseで処理したもの：ストラタジーン 社製）の 1 μ gを T4 ligase緩衝液（宝酒造社製） 1 1 .5 μ 1 に溶解し、 Τ4 DNA ligase (宝酒造社製） 175単位を加えて、 12°Cにて 24時間インキュベートし、さらに室温にて 2時間インキュベートした。それぞれの反応液のうち 4 μ 1を常法（モレキュラー 'クロー ニング 第 2版）に従い、 Gigapack Gold Packaging Kit (ストラタジーン社製）を使用し てラムダファージにパッケージングし、これらを常法（モレキュラー 'クローニング 第 2 版）に従って、 Gigapack Gold Packaging Kit (ストラタジーン社製）に付属の大腸菌株 XLl-Blue [Biotechniques, 5, 376 (1987) ]に感染させて、 K 1732および K 1750の H鎖 cDNAライブラリーおよび L鎖 cDNAライブラリーとしてそれぞれ約 4 X 103個の ファージクローンを取得した。
(3)抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体生産ハイプリドーマの H鎖 および L鎖をコードする cDNAのクローニング
実施例 1の 1 (2)で作製したそれぞれのファージを常法（モレキュラー.クローエング 第 2版）に従い、ニトロセルロースフィルタ一上に固定した。各ニトロセルロースフィルタ 一を用 ヽて Eし L direct nucleic acid labeling and detection systems (アマシャム社 製）に添付の使用説明書に従い、マウス免疫グロブリンの定常領域（以下、 C領域と表 記する）をコードする cDNA [H鎖はマウス C lcDNA の断片 [ Cell, 18. 559 (1979)]、 L鎖はマウス C κ cDNAの断片 [Cell, 22, 197 (1980)]をプローブとしてそ れと強く結合したファージクローンを取得した。次に、 Lambda ZAPII Vector (ストラタ ジーン社製）に添付の使用説明書に従い、ファージクローンをプラスミド
pBluescriptSK (-)に変換し、最終的に KM 1732の H鎖をコードする cDNAを含む組換 えプラスミド KM 1732HA2および KM 1732の L鎖をコードする cDNAを含む組換えプ ラスミド KM1732L2- 1、 KM1750の H鎖をコードする cDNA含む組換えプラスミド KM1750H2-1および KM 1750の L鎖をコードする cDNAを含む組換えプラスミド KM 1750L3-1を取得した。組換えプラスミド KM 1732HA2を有する大腸菌 XL1- Blue MRFVKM 1732HA2 、組換えプラスミド KM 1732L2-1を有する大腸菌 XL1- Blue MRF7KM1732L2-U組換えプラスミド 1750H2- 1を有する大腸菌 XL1- Blue
RF7K 1750H2-1および組換えプラスミド KM1750L3- 1を有する大腸菌 XL1- Blue MRF7KM1750L3-1を有する大腸菌株は、それぞれ FERM BP- 6354、 FERM BP - 6352、 FERM BP- 6353、 FERM BP - 6355として、平成 10年 5月 14日付けで工業技術 院生命工学工業技術研究所（ 3本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に寄託されて レ、る。
(4)抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 マウスモノクローナル抗体の H 鎖およびし 鎖をコ一 ドする cDNAの可変領域の塩基配列の決定
実施例 1の 1 (3)で得られた各抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 マウスモノクローナル抗体 の H 鎖および L鎖をコードする cDNAの可変領域（以下、 V領域と表記する）の塩基 配列を、得られたプラスミドの 0.1 / g を用いて BigDye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit (アプライド バイオシステムズ社製）に添付の説明書 に従って反応後、 ABI PRISM™377 (アプライド バイオシステムズ社製)により電気泳動 し、決定した。決定したそれぞれの cDNAの塩基配列より、 KM1732および KM1750 の H鎖の V領域（以下、 VHと表記する）および L鎖の V領域（以下、 VLと表記する） のアミノ酸配列を決定した。配列番号 1に KM1732の VH、配列番号 2に KM1732の VL、配列番号 3に KM1750の VH、配列番号 4に KM1750の VLのそれぞれの塩基配 列を、配列番号 86に KM1732の VH、配列番号 87に KM1732の Vし、配列番号 88 に KM1750の VH、配列番号 89に KM1750の VLのそれぞれのアミノ酸配列を示す。
(5)抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体の H鎖および L鎖の CDR 配列の同定
実施例 1の 1 (4)で決定した各抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 の VHおよび VLのアミノ酸配列より、それぞれの VHおよび VLの CDR配列を既知 の抗体の V領域のアミノ酸配列（シーケンシズ' ォブ' プロテインズ' ォブ.ィムノロジ カル'インタレスト）と比較することによって同定した。配列番号 5、 6および 7に KM1732 の VHの CDR1、 CDR2および CDR3、配列番号 8、 9および 10に KM1732の VLの CDR1、 CDR2および CDR3、配列番号 11、 12および 13に KM1750の VHの CDR1、 CDR2および CDR3 、配列番号 14、 15および 16に KM1750の VLの CDR1、 CDR2 および CDR3のそれぞれのアミノ酸配列を示す。
2.抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型キメラ抗体の製造
ヒト VEGF受容体 Fit- 1に対する中和活性を有する抗ヒト VEGF受容体 Flt_lマウス モノクロ一ナル抗体 KM1732および KM1750に由来する、抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550を以下のようにして製造した。
(1)抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型キメラ抗体の発現ベクター pKANTEX 1732の構 築
WO97/10354に記載のヒトイヒ抗体発現用タンデムカセットベクター pKANTEX93およ び実施例 1の 1項で得られたプラスミド KM 1732HA2および KM1732L2 - 1を用いて抗 ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体の発現べクタ一 pKANTEX1732を以下のよう にして構築した。
プラスミド pBluescript SK (-) (ストラタジーン社製）の 3 μ gを 10mMトリス-塩酸 (pH7.5)、 10mM塩化マグネシウムおよび ImM DTTからなる緩衝液 10 μ 1に加え、 更に 10単位の制限酵素 ApaK宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反 応液をエタノール沈殿し、 50mMトリス -塩酸（ΡΗ7 ·5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 lOmM 塩化マグネシウム、 ImM DTT 、 100 μ g/ml BSAおよび 0.01% トライトン X-100から なる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 NotK宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、約
2.95kbの Apa卜 Notl断片を約 2 μ g回収した。次に、プラスミド KM1732HA2の 5 μ gを 20mMトリス-酢酸（pH7.9)、 ΙΟτηΜ酢酸マグネシウム、 50Mm 酢酸カリウム、 ImM DTTおよび 100 μ g/ml 牛血清アルブミン（以下、 BSA と表記する）からなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 NlalV (ニュ ングランドバイオラブズ社製） を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、 50mMトリス-塩酸 (pH7.5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 10mM塩化マグネシウム、 ImM DTT、 100 μ g/ml BSAおよび 0.01% トライトン X_100からなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制 限酵素 Notl (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をァガロース ゲル電気泳動にて分画し、約 0.41kbの NlalV- Notl断片を約 0.5 μ g回収した。次に、 配列番号 17、 18に記載の塩基配列を有する合成 DNAを合成し（サヮディ一.テクノロ ジ一社製）、各合成 DNAの 0.3 μ gずつを 15 μ 1の滅菌水に加え、 65°Cで 5分間 加熱した。該反応液を室温にて 30分間放置した後、 10倍緩衝液 [500mMトリス-塩酸 (pH7.6)、 lOOmM塩化マグネシウム、 50m DTT]2 μ 1と 10mM ATP 2 μ 1 を加え、 更に 10単位の Τ4 polynucleotide kinase (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 30分間反応 させ、 5'末端をリン酸化した。
上記で得られたプラスミド pBluescript SK (-)由来の Apaト Notl断片 0.1 μ g とプラ スミド KM 1732HA2由来の NlalV- Notl断片 0.1 μ gとリン酸化合成 DNA0.05 μ gを 全量 10 μ 1の滅菌水に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて使用説 明書に従い、連結した。このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大 腸菌 DH5 α株 (東洋紡績社製）を形質転換し、図 1に示したプラスミド pBS1732Hを得 た。
次に、 WO97/10354に記載のプラスミド phKM1259LV0の 3 gを 50mMトリス-塩 酸（pH7.5)、 lOOmM塩ィヒナトリウム、 10mM塩化マグネシウム、 lmM DTTおよび 100 μ g/ml BSAからなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 EcoRI (宝酒造 社製）および制限酵素 SplK宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応 液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、約 2.95kbの EcoRI- Spll断片を約 2 μ g 回収した。次に、プラスミド KM 1732し 2- 1の 5 μ gを 10mMトリス-塩酸（pH7.5)、 lOOmM塩化マグネシウム、 ImM DTTからなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の 制限酵素 MboII (東洋紡績社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をエタ ノール沈殿し、 50mMトリス-塩酸 (PH7.5)、 lOOmM塩化ナトリウム、 10mM塩化マグネ シゥム、 lmM DTT力 なる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 EcoRI (宝 酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をァガロースゲル電気泳動 にて分画し、約 0.38kbの boII-EcoRI断片を約 0.5 μ g回収した。次に、配列番号 1 9、 20に記載の塩基配列を有する合成 DNAを合成し（サヮディ一 ·テクノロジ一社製）、 各合成 DNAの 0.3 // gずつを 15 μ 1の滅菌水に加え、 65°Cで 5分間加熱した。該 反応液を室温にて 30分間放置した後、 10倍緩衝液 [500mMトリス-塩酸 (pH7.6)、 lOOm 塩化マグネシウム、 50mM DTT]2 μ 1と lOmM ATP 2 μ 1を加え、 -更に 10単 位の Τ4 polynucleotide kinase (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 30分間反応させ、 5'末 端をリン酸化した。
上記で得られたプラスミド phKM1259LV0由来の EcoRI-SplI断片 0.1 μ g 、プラスミ ド KM1732L2- 1由来の Mbol卜 EcoRI断片 0.1 μ gおよびリン酸化合成 DNA0.05 μ g を全量 10 μ 1の滅菌水に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて使用 説明書に従い、連結した。このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて 大腸菌 DH5 α株（東洋紡績社製）を形質転換し、図 2に示したプラスミド pBS1732Lを 得た。
次に、ヒト化抗体発現用ベクター ΡΚΑΝΤΕΧ93の 3 / gを lOmMトリス-塩酸 (ρΗ7·5)、 10mM塩化マグネシウムおよび ImM DTTからなる緩衝液 10 μ 1 に加え、更に 10単 位の制限酵素 Apal (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をェ タノール沈殿し、 50mMトリス-塩酸 (pH7.5)、 lOOmM塩化ナトリウム、 10mM塩化マグ ネシゥム、 ImM DTT 、 100 μ g/ml BSA および 0.01% トライトン X- 100 からなる緩衝 液 10 // 1に加え、更に 10単位の制限酵素 Notl (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時 間反応させた。該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、約 12.75kbの Apal - Notl 断片を約 1 μ g回収した。次に、上記で得られたプラスミド pBS1732Hの 5 μ g を lOmMトリス-塩酸（pH7.5 )、 10mM塩化マグネシウムおよび ImM DTTからなる緩 衝液 10 μ 1 に加え、更に 10単位の制限酵素 Apal (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1 時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、 50mMトリス-塩酸（pH7.5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 10mM塩化マグネシウム、 ImM DTT 、 100 μ g/ral BSA および 0.01% トライトン X- 100からなる緩衝液 10 n 1 に加え、更に 10単位の制限酵素 NotK宝酒 造社製)を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をァガロースゲル電気泳動にて 分画し、約 0.46kbの Apa卜 Notl断片を約 0.5 μ g回収した。
上記で得られたヒト化抗体発現用ベクター PKANTEX93由来の Apaト Notl断片 0.1 μ gとプラスミド PBS1732H由来の Apaト Notl断片 0.1 μ gを全量 10 μ 1 の滅菌水 に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて使用説明書に従い、連結した。 このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 α株（東洋紡 績社製)を形質転換し、図 3に示したプラスミド ρΚΑΝΤΕΧ1732Ηを得た。
次に、上記で得られたプラスミド ρΚΑΝΤΕΧ1732Ηの 3 μ gを 50mMトリス-塩酸 (pH7.5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 lOmM塩化マグネシウム、 ImM DTTおよび 100 μ g/ml BSAからなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 EcoRl (宝酒造社 製）および制限酵素 Spll (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液 をァガロースゲル電気泳動にて分画し、約 13.20kbの BcoRI- Spll断片を約 1 // g回 収した。次に、上記で得られたプラスミド pBS1732Lの 5 ju gを 50mMトリス-塩酸
(pH7.5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 10mM塩化マグネシウム、 ImM DTTおよび 100 μ g/ml BSA からなる緩衝液 10 n 1に加え、更に 10単位の制限酵素 EcoRl (宝酒造社 製）および制限酵素 Spll (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1 時間反応させた。該反応液 をァガロースゲル電気泳動にて分画し、約 0.39kbの EcoRl- Spll断片を約 0.5 μ g回 収した。
上記で得られたプラスミド PKANTEX1732H由来の EcoRl- Spll断片 0.1 μ g、プラス ミド PBS1732L由来の EcoR SplI断片 0.1 μ gを全量 10 μ 1の滅菌水に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて使用説明書に従い、連結した。このようにし て得られた組換えプラスミド DNA 溶液を用いて大腸菌 DH5 ひ株 (東洋紡績社製）を 形質転換し、図 4に示したプラスミド pKANTEX1732を得た。
(2)抗ヒト VEGF受容体 Fk- 1 ヒト型キメラ抗体の発現べクタ一 pKANTEX1750 の構 築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用タンデムカセットベクター pKANTEX93 およ ぴ実施例 1の 1項で得られたプラスミド KM1750H2-1および KM1750L3 - 1を用いて抗 ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体の発現ベクター pKANTEX1750 を以下のよう にして構築した。
プラスミド KM1750H2- 1の 5 gを 33mMトリス-酢酸（ΡΗ7·9)、 10mM酢酸マグネシ ゥム、 66mM酢酸カリウムおよび 100 μ g/ml BSAからなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 Alw26I (ニューイングランドバイオラブズ社製）を加えて 37。Cで 1 時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、 50mMトリス -塩酸 (pH7.5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 10mM塩化マグネシウム、 ImM DTT、 100 μ g/ml BSAおよび 0.01% トライトン X- 100からなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 Notl (宝酒 造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をァガロースゲル電気泳動にて 分画し、約 0.41kbの A v26I- Notl 断片を約 0.5 μ g回収した。次に、配列番号 21、 22に記載の塩基配列を有する合成 DNAを合成し（サヮディー.テクノロジ一社製）、各 合成 DNAの 0.3 μ gずつを 15 μ 1の滅菌水にカ卩え、 65°Cで 5分間加熱した。該反 応液を室温にて 30分間放置した後、 10倍緩衝液 [500mMトリス-塩酸 (pH7.6)、 lOOm 塩化マグネシウム、 50mM DTT]2 μ 1と 10mM ATP 2 μ 1を加え、更に 10単 位の Τ4 polynucleotide kinase (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 30分間反応させ、 5'末 端をリン酸化した。
実施例 1の 2 (1)で得られたプラスミド pBluescript SK (-)由来の Ap -Notl断片 0.1 μ gとプラスミド KM1750H2- 1由来の Alw26I - Notl断片 0.1 gとリン酸化合成 DNA0.05 μ gを全量 10 μ 1の滅菌水に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製） を用いて使用説明書に従い、連結した。このようにして得られた組換えプラスミド DNA 溶液を用いて大腸菌 DH5 α株 (東洋紡績社製）を形質転換し、図 5に示したプラスミド PBS1750Hを得た。
次に、プラスミド KM1750L3-1の 5 g を 100mM トリス-塩酸（pH8.8)、 440mM塩 化ナトリウム、 12mM塩化マグネシウム、 14mM 2-メルカプトエタノールおよび 200 μ g/ml BSAからなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 Maell (ベーリンガ 一.マンハイム社製）を加えて 50°Cで 1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、 50mMトリス -塩酸（pH7.5)、 lOOm 塩化ナトリウム、 10mM塩化マグネシウム、 ImM DTT力 なる緩衝液 10 μ 1 に加え、更に 10単位の制限酵素 EcoRI (宝酒造社製）を 加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0.38kbの Maell-EcoRI断片を約 0.5 μ g回収した。次に、配列番号 23、 24に記 載の塩基配列を有する合成 DNAを合成し（サヮディー.テクノロジ一社製）、各合成 DNAの 0.3 μ gずつを 15 μ 1の滅菌水に加え、 65°Cで 5分間加熱した。該反応液を 室温にて 30分間放置した後、 10倍緩衝液 [500mMトリス-塩酸 (pH7.6)、 lOOmM 塩 化マグネシウム、 50mM DTT]2 μ 1 と lOmM ATP 2 μ 1 を加え、更に 10単位の Τ4 polynucleotide kinase (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 30分間反応させ、 5'末端をリン 酸化した。
実施例 1の 2 (1)で得られたプラスミド phKM1259LV0由来の EcoRI- Spll断片 0.1 μ g、プラスミド KM1750し 3- 1由来の Maell- EcoRI断片 0.1 μ gおよびリン酸化合成 DNA 0.05 μ gを全量 10 μ 1の滅菌水に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製） を用いて使用説明書に従い、連結した。このようにして得られた組換えプラスミド DNA 溶液を用いて大腸菌 DH5 ひ株（東洋紡績社製）を形質転換し、図 6に示したプラスミド PBS1750Lを得た。
次に、上記で得られたプラスミド pBS1750Hの 5 / gを 10mMトリス-塩酸 (ρΗ7·5)、 lOmM塩化マグネシウムおよび Im DTTからなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単 位の制限酵素 Apa 宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をェ タノール沈殿し、 50mMトリス-塩酸（ΡΗ7·5)、 lOOmM塩化ナトリウム、 10mM塩化マグ ネシゥム、 lmM DTT、 100 μ g/ml BSAおよび 0.01% トライトン X - 100力 なる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 Notl (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間 反応させた。該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、約 0.46kbの Apal- Notl 断片を約 0.5 μ g 回収した。
実施例 1の 2 (1)で得られたヒト化抗体発現用タンデムカセットベクター pKANTEX93 由来の Apal-Notl断片 0.1 μ gとプラスミド pBS1750H由来の Apal- Notl断片 0.1 μ gを全量 10 μ 1の滅菌水に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて使用 説明書に従い、連結した。このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて 大腸菌 DH5 α株 (東洋紡績社製）を形質転換し、図 7に示したプラスミド
PKANTEX1750Hを得た。
次に、上記で得られたプラスミド ρΚΑΝΤΕΧ1750Ηの 3 μ gを 50mMトリス-塩酸 (pH7.5)、 lOOmM塩化ナトリウム、 10mM塩化マグネシウム、 ImM DTTおよび 100 μ g/ml BSAからなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 EcoRI (宝酒造社 製）および制限酵素 Spll (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液 をァガ口一スゲル電気泳動にて分画し、約 13.20kbの EcoRI- Spll断片を約 1 μ g回 収した。次に、上記で得られたプラスミド pBS1750Lの 5 /z gを 50mMトリス-塩酸 (pH7.5)、 lOOm 塩化ナトリウム、 lOmM塩化マグネシウム、 ImM DTTおよび 100 μ g/ml BSAからなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 EcoRI (宝酒造社 製）および制限酵素 Spll (宝酒造社製)を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液 をァガロースゲル電気泳動にて分画し、約 0.39kbの EcoRI- Spll断片を約 0.5 μ g回 収した。
上記で得られたプラスミド PKANTEX1750H由来の EcoRI- Spll断片 0.1 g 、プラ スミド PBS1750L由来の EcoR SplI断片 0.1 μ gを全量 10 μ 1の滅菌水に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて使用説明書に従い、連結した。このよう にして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a株（東洋紡績社 製）を形質転換し、図 8に示したプラスミド pKANTEX1750を得た。
(3) pKANTEX 1732および pKANTEX1750を用いた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト 型キメラ抗体のラットミエロ一マ YB2/0細胞（ATCC CRL1581 )での発現
YB2/0細胞への抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体発現ベクター
PKANTEX 1732および pKANTEX 1750の導入は宮地らの方法に従い、エレクトロポレ ーシヨン法 [Cytotechnology, ^ 133 (1990)]にて行った。
実施例 1の 2項（1)、（2)で得られた pKANTEX 1732および pKANTEX 1750の 5 μ gを 4 X 106個の YB2/0細胞へ導入後、 40mlの RPMI1640- FCS ( 10)培地 [牛胎児血 清 (FCS) を 10%含む RPMI1640培地（日水製薬社製）]に懸濁し、 96ウェルマイクロタ イタ一プレート（スミロン社製）に 200 μ 1/ゥエルずつ分注した。 5%C02インキュベータ 一内で 37°C、 24時間培養後、ジエネティシン（以下、 G418と表記する、ギブコ社製）を 0.5mg/mlになるように添加してさらに 1〜2週間培養した。 G418耐性を有する形質転 換株のコロニーが出現し、コンフルェントになったゥェルより培養上清を回収し、上清中 の抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト型キメラ抗体の活性を以下に示す酵素免疫測定法に より測定した。
酵素免疫測定法
可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nは、 Tanakaらの方法 [Japanese Journal of Cancer Research, 88^ 867 (1997)]に従い調製した。 96ゥエルの EIA用プレ一ト（グラ イナ一社製）に、 PBSで希釈した 1 μ g/mlの可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nを 50 β 1/ゥェルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。 PBSで洗浄後、 1 % BSAを含 む PBS (以下、 1%BSA - PBSと表記する）を 100 μ 1/ゥュル加え、室温で 1時間反応さ せて残っている活性基をブロックした。 1%BSA- PBSを捨て、形質転換株の培養上清を 50 μ 1/ゥエルで分注し、室温で 1時間反応させた。 0.05% tween20を含む PBS (以 下、 0.05%tween- PBSと表記する）で洗浄後、 1%BSA- PBSにて 3000倍に希釈したぺ ルォキシダーゼ標識抗ヒト IgG 抗体（アメリカン コーレックス社製）を 50 μ 1/ゥエルで 加えて室温で 1 時間反応させ、 0.05% tween-PBS で洗浄後、 ABTS基質液 [2.2-アジ ノビス（3-ェチルベンゾチアゾール -6-スルホン酸）アンモニゥム]を 50 μ 1/ゥエルでカロ えて発色させ、 OD415nmの吸光度を E max (モレキユラ一.デバイシ一ズ社製）を用い て測定した。
培養上清中に抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト型キメラ抗体の活性が認められた形質 転換株について、生産性を上げる目的で、 0.5mg/ml G418および 50nMメソトレキセ ート（以下、 MTX .と表記する、シグマ社製）を含む RPMI1640- FCS (IO)培地に懸濁し、 5%C02インキュベーター内で 37°C、 1〜2週間培養し、 50nM MTX耐性を有する形質 転換株を誘導した。形質転換株がゥエルにコンフルェントになった時点で培養上清中 の抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体の活性を上記の酵素免疫測定法により測 定した。活性の認められた形質転換株については、上記と同様の培養方法により、さら に MTX 濃度を 100nM、 200nMと上げて行き、 0.5mg/ml G418 および 200nM MTX を含む RPMI1640-FCS (10)培地で増殖可能でかつ、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株については 2回の 限界希釈法によるクローニングを経て、最終的な抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ 抗体を生産する形質転換細胞株とした。発現ベクター ΡΚΑΝΤΕΧΠ32を導入して得ら れた形質転換細胞株、すなわち、抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1マウスモノクローナル抗体 KM1732由来の抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株の 例としては KM2532があげられ、それが生産する抗ヒト VEGF受容体 Flt-Ιヒト型キメ ラ抗体を KM2532と命名した。また、発現ベクター pKANTEX1750を導入して得られた 形質転換細胞株、すなわち抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1750由来の抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株の 例としては KM2550があげられ、それが生産する抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型キメ ラ抗体を KM2550と命名した。得られた各形質転換細胞クローンの抗ヒト VEGF受容 体 Fit - 1ヒト型キメラ抗体の生産性は約 5 μ g/106細胞 /24時間であった。 (4)抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型キメラ抗体の培養上清からの精製
実施例 1の 2 (3)で得られた抗ヒト¥50 受容体1¾-1ヒト型キメラ抗体生産株 - KM2532および KM2550を 0.5mg/ml G418および 200nM MTX含む G1T培地（日本 製薬社製）に 1〜2 X 105細胞/ ml となるように懸濁し、 175cm2フラスコ（グライナ一社 製）に 200mlずつ計 5本に分注した。 5%C02インキュベータ一内で 37°C、 5〜7日間 培養し、コンフルェントになった時点で各培養上清約 1.0Lを回収した。カラムに約 1ml のプロセップ A (バイオプロセッシング社製）を充填し、 10mlの 1Mグリシン- 0.15M NaCl (PH8.6)を用いて 1ml/分の流速でカラムを洗浄した。洗浄後、上記のように調製 した抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550を含む培養 上清をそれぞれ 1700ml、 1800mlを 70ml/時の流速でプロセップ Aカラムに通塔した。 さらに 10mlの 1Mグリシン- 0.15M NaCl (pH8.6)を用いて 1ml/分の流速で洗浄した後、 pH6、 pH5および pH4の 50mMクェン酸緩衝液各 4mlで段階的に洗浄し、 50mMクェ ン酸緩衝液 (PH3.0)を 7ml通塔してヒト型キメラ抗体を溶出した。その結果、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550がそれぞれ 0.4mg 、 0.3mg得られた。
精製した抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550は、 SDS- PAGE法で解析した。 SDS- PAGEは公知の方法 [Anticancer Research, 12, 1121 (1992) ]に従った。ゲルには 5〜20%グラジェントゲル（アト一社製）を、分子量マ 一力一としては低分子量タンパク質分子量マーカ一「第一」 II、高分子量タンパク質分 子量マーカー「第一」111 (第一化学薬品社製)を用い、還元および非還元条件下でレ ーンあたりのタンパク質量として 2·5 μ gの抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532およぴ KM2550をそれぞれ泳動し、クーマシーブリリアントブルーにて染色し た。その結果を図 9に示した。ヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550は、非還元条 件下では分子量約 150キロダルトンに IgGのバンドが認められ、還元条件下では約 50キロダルトンに H鎖のバンド力 約 25キロダルトンに L鎖のバンドが認められた。 IgG型の抗体は、還元条件下では分子間ジスルフイド結合が切断され、それぞれ 2本 の H鎖および L鎖に分解し、非還元条件下ではそれぞれ 2本の H鎖およびし鎖より 構成される分子量 150キロダルトンの分子として存在することことと一致し、ヒト型キメラ 抗体 KM2532および KM2550は正しい構造の抗体分子であることが示された。
(5)抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型キメラ抗体のヒト VEGF受容体 Fit- 1に対する結 合活性
精製抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550のヒト VEGF受容体 Fit- 1に対する結合活性を以下の手順に従い、確認した。
可溶性ヒト Fit- 1 7Nは Tanakaらの方法 [Japanese Journal of Cancer Research, 88, 867 (1997)]に従い調製した。
まず、酵素免疫測定法を用いて 96ゥエルの EIA用プレートに吸着させる可溶性ヒト Fit - 1 7N量を固定し、添加するヒト型キメラ抗体の濃度を変化させて結合活性を検討 した。 96ゥエルの EIA用プレート（グライナ一社製）に、 PBSで希釈した 1 μ g/mlの可 溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nを 50 / 1/ゥエルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着 させた。 PBSで洗浄後、 1%BSA- PBSを 100 μ 1/ゥエル加え、室温で 1 時間反応させ て残っている活性基をブロックした。 1%BSA- PBSを捨て、 0.152〜333ng/mlの精製抗 ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550を 50 1/ゥエルで 分注し、室温で 1時間反応させた。 0.05%tween-PBSで洗浄後、 1%BSA_PBSにて 3000倍に希釈したペルォキシダーゼ標識抗ヒト IgG 抗体（アメリカン コーレックス社 製）を 50 1/ゥェルで加えて室温で 1 時間反応させ、 0.05% tween- PBSで洗浄後、 ABTS基質液 [2.2-アジノビス（3-ェチルベンゾチアゾ一ル -6-スルホン酸）アンモ-ゥ ム]を 50 μ 1/ゥエルで加えて発色させ、 OD415nmの吸光度を E max (モレキユラ一. デバイシーズ社製)を用レ、て測定した。
その結果を図 10 (A)に示す。抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型キメラ抗体 KM2532、 KM2550は抗体濃度依存的にヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nに結合した。また、抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト型キメラ抗体 KM2532、 KM2550の結合活性はほぼ同等であ つた。
次に、酵素免疫測定法を用いて 96ゥエルの EIA用プレートに吸着させる可溶性ヒト Fit- 1 7N量を変化させてヒト型キメラ抗体の結合活性を検討した。 96ゥエルの BIA用 プレート（グライナ一社製）に、 PBSで希釈した 0.04〜10 μ g/mlの可溶性ヒト VEGF 受容体 Fit- 1 7Nを 50 μ 1/ゥエルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。 PBSで 洗浄後、 1%BSA-PBSを 100 μ 1/ゥェルカ卩ぇ、室温で 1時間反応させて残っている活 性基をブロックした。 1%BSA_PBSを捨て、 10 μ g/mlの精製抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト型キメラ抗体 KM2532およぴ KM2550を 50 // 1/ゥエルで分注し、室温で 1時間反 応させた。 0.05%tween-PBSで洗浄後、 1%BSA- PBSにて 3000倍に希釈したペルォ キシダーゼ標識抗ヒト IgG 抗体（アメリカン コーレックス社製）を 50 μ 1/ゥエルで加え て室温で 1時間反応させ、 0.05% tween-PBSで洗浄後、 ABTS基質液 [2.2-アジノビス (3 -ェチルペンゾチアゾ一ル -6-スルホン酸）アンモニゥム]を 50 μ 1/ゥエルで加えて 発色させ、 OD415nmの吸光度を E max (モレキユラ一'デバイシーズ社製）を用いて測 定した。
その結果を図 10 (B)に示す。抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532、 KM2550はプレートに吸着させた可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7 の濃度に依存し た結合活性を示した。また、抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型キメラ抗体 KM2532、 KM2550の結合活性はほぼ同等であった。
、 乙、抗ヒト VEGF受容体 Fit— 1ヒト型キメラ抗体によるヒト VEGFとヒト VEGF受容 体 Fit- 1 の結合阻害活性を以下のようにして検討した。 96ゥエル 'マルチスクリーン- IPプレート（ミリポア社製）にメタノールを 100 n 1/ゥエルで分注し、プレート底部の PVDF膜を親水化した。水で洗浄後、 PBSで 0.2 μ g/mlの濃度に希釈した可溶性ヒ ト VEGF受容体 Fit- 1 7Nを 50 μ 1/ゥェルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。 PBSで洗浄後、 1%BSA - PBSを 50 μ 1/ゥエル加え、室温で 1時間反応させて残ってい る活性基をブロックした。 PBSで洗浄後、 1%BSA- PBS溶液で希釈し 0.004〜2 μ g/ml の精製抗ヒト VEGF受容体 Flt_lヒト型キメラ抗体 KM2532、 M2550および精製抗ヒ ト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1732、 KM 1750を 50 1/ゥエル で分注し、さらに、 3ng/mlの 1251標識ヒト VEGF (アマシャム社製）を 50 μ 1/ゥエルで 加え室温で 1.5時間反応させた。 0.05%tween- PBSで洗浄後、 50°Cにてゥエルを乾燥 させ、マイクロシンチ- 0 (パッカード社製）を 30 μ 1/ゥエルで加え、トップカウント（パッ カード社製)を用いて、各ゥエルに結合した 1251標識ヒト VEGFの放射活性を測定した。 その結果を図 11に示す。図 11に示したように抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト型キメラ抗 体 KM2532および KM2550は抗体濃度依存的にヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit- 1 の結合を阻害した。また、抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550は、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1732および KM1750と同等のヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit - 1の結合阻害活性を示し、ヒト型 キメラ抗体はマウスモノクローナル抗体の活性を保持していることが示された。
( 6 ) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体の認識するェピトープの解析 (6-1)可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7N、可溶性ヒト VEGF受容体キメラタンパク質 Flt-1 7N. 2の調製
可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7N、可溶性ヒト VEGF受容体キメラタンパク質 Fit- 1 7N.K2を以下のようにして調製した。
(6-2)可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7N発現ベクターの構築
ヒト VEGF受容体 KDRのシグナルペプチドを構成する 19アミノ酸及び成熟体 の N末端アミノ酸から 738番目に相当する可溶性ヒト VEGF受容体 KDR断片 (以下、可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7Nと称す）及ぴリンカ一由来の 2ァミノ 酸残基を発現するためのベクターを以下の手順で作製した。
可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7Nは、可溶性ヒト VEGF受容体 KDRの細胞 外領域の N末端側から 7個のィムノグロブリン様部位より構成される。
ヒト VEGF受容体 KDRの完全長 cDNAをコードする cDNAクローン B CMG S - neo-KDR [ Cell Growth & Differentiation 7 , 213 (1996)]を EcoRIで切断し、 DRの細胞外領域及び膜結合領域をコードする約 2.8 kbの断片を pUC 18の EcoRI部位に組み込むことによって、 pUC- KDRを作製した。 pUC- KDRを Xhol で切断し、 Klenow処理後、 Xbalリンカ一（配列番号 57)を挿入することによって pUC-KDR-Xbを作製した。 pUC- KDR- Xbの Xbal-BamHI (2.3 kbp)断片を pBluescriptll KS(+)の Xbal/BamHI部位に挿入した後、 Sphl-BamHI (5.2kbp) 断片を調製し、 SnaBI部位を含む合成リンカ一（配列番号 58及ぴ配列番号 59 ) を揷人し、 pB S— KDR— Xb—Sを作製した。
pBS-KDR-Xb-Sを SnaBI/BamHIで切断し、終止コドンと Notl部位とを含む 合成リンカ一（配列番号 60及び配列番号 6 1 )を組み込み、 pBS-KDR(Xb)-S-N を作製した。 pBS - KDR-Xb- S- Nの Xba卜 Notl (2.3kb)断片をバキゴロウィルス 組み換え pVL1393プラスミドのポリヘドリン（Polyhedrin)遺伝子の転写開始点の 下流 5'側 Xbal及び 3'側 Notl部位に組み込み、可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7N発現べクタ一 pVL- KDR - 7Nを作製した。
(6-3)可溶性ヒト VEGF受容体キメラタンパク質 Fit- 1 7N .K2発現ベクターの 可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1のシグナル配列を含む N末端から 750番目に 相当する可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7Nのうち、 N末端から 2番目のィムノグ ロブリン様部位に相当する、 100番目のアミノ酸から 204番目のアミノ酸を、それ ぞれ 2 アミノ酸からなるリンカ一(Gly- Ala,Gly- Thr)を介して、可溶性ヒト VEGF 受容体 KDRの 2番目のィムノグロブリン様部位に相当する、 95番目のアミノ酸か ら 199番目のアミノ酸に置換したキメラタンパク質 Fit- 1.K2を発現させるための ベクターを以下の手順で作製した。
ヒト fit一 lcDNA [Oncogene, 5 , 519 (1990)]の EcoRI/Hindlll ( 1 .9 kb)断片を ベクター M 13mp l の EcoRI/Hindlll に揷入し、 pM 13— fit を作製した。 pM 13— fit を大腸菌 XLlBlue に感染させ、宝酒造製の部位特異的変異導入用キット MutanK 添付のマニュアルに従って、培養上清より ssDNA を調製した。本 ssDNA を铸型として、 56 塩基から成るオリゴヌクレオチド（配列番号 62 )及び部 位特異的変異導入用キット MutanK (宝酒造製）を用い、宝酒造製の部位特異的 変異導入用キット MutanK 添付のマニュアルに従って部位特異的変異を行い、 Fit- 1 の細胞外領域の 2 番目のィムノグロブリン様部位をコードする領域を欠失 させた変異 Fit- 1 遺伝子を運ぶプラスミド（PM 13- fh，- D2N)を作製した。次に、 BCMG Sneo- DR [Cell Growth and Diff. , 7 , 213, (1996)] DNA l Ongを铸型 として用い、配列番号 63及び配列番号 64に示した塩基配列を有するプライマ一 各 10 pmol、 TaqDNAポリメラーゼバッファー、及び、 10mMデォキシヌクレオチ ド三リン酸を含む溶液 100 mlに 2.5 unitsの TaqDNAポリメラーゼを添加し、 PCR反応を行った。反応は、 95°Cで 90秒間、 50°Cで 90秒間、 72°Cで 90秒間 の反応を 30回繰り返し、増幅した、 DRの細胞外領域の N末端側から 2番目 のィムノグロブリン様部位をコードする DNA 断片を回収した。該 DNA 断片を Narl/Kpnl で切断し、 340bp の Narl/Kpnl 断片を得た。該 DNA 断片及び、 pM 13-flt'-D2Nの Smal/Narl (0.5 kb)断片を、 pBluescriptllの Smal/ pnl部 位に挿入し、 pB S- fit- 1 '- KDR2N を作製した。 pB S- fit- 1，- KDR2N の BamH/KpnI(0.8kb)断片、 pM 13 - fit，- D2N の Kpnl/Munl (80 b )断片、及び、 pVし - fit - 1の MunI/NotI ( 1 .5 kb)断片を、 pVL 1393の BamHII/Notl部位に揷 入し、 FU-1. 2遺伝子を運ぶプラスミド PVL- fkfを作製した。
(6 - 4)昆虫細胞による可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7Nおよび可溶性ヒト VEGF受 容体キメラタンパク質 Fit- 1 7N.K2発現を行うための組み換えウィルスの作製 昆虫細胞による蛋白質の生産には目的遺伝子を組み込んだ組み換えウィルス の作製が必要であるが、その作製にはトランスファ一^ ^クタ一と呼ばれる目的蛋白 質をコードする cDNAを特殊なプラスミドに組み込む過程と野生型ウィルスとトラ ンスファーべクタ一を昆虫細胞にコトランスフエクシヨンし、相同組み換えにより組 み換えウィルスを取得する過程を経る。以上の過程をファーミンジユン社製バキュ ロゴ一ルドスターターキット（製品番号 PM- 21001K)を用いてそのマニュアルに 従い以下の手順で行った。
TMN - FHインセクトメディウム（ファーミンジェン社製）にて培養した昆虫細胞 Sf9 (ファーミンジェン社製）に線状バキュロウィルス D NA [バキュロゴールド.バ キュロウィルス DNA(BaculoGold baculovirus DNA) ,ファーミンジェン社製]およ び作製したトランスファーベクター DNAをリポフエクチン法にて導入すること [蛋白 質核酸酵素、^ ^ 270 1 (1992)]により、組み換えバキュロウィルスを以下のように して作製した。
(6 - 2)で作製した発現ベクターの 1 μ gと線状バキュロウィルス DNAの 20ngと を 12 // 1の蒸留水に溶解し、さらにリポフエクチン 6 μ 1 と蒸留水 6 μ 1 とを混 和したものを加え室温で 15分間放置した。一方 Sf9 細胞 1 X 10 6個を 2mlの Sf900- II培地 [ギブコ（Gibco)社製]に懸濁し、直径 35mmの細胞培養用プラス チックシャ一レに入れた。ここに上記のプラスミド DNA、線状バキュロウィルス DNAおよぴリポフエクチン混和溶液全量を加え 27°Cで 3 日間培養後、組み換え ウィルスを含む培養上清 1ml を採取した。シャーレには新たに Sf900- II培地 lmlを加え、さらに 27°Cで 3日間培養し組み換えウィルスを含む培養上清をさら に 1 .5ml得た。さらに、（6- 3)で作製した発現ベクターを用い同様の操作を行つ た。
次に蛋白質発現に用いるため、得られた組み換えウィルスを各々、以下の手順 で増殖させた。
Sf9細胞 2 X 10 7個を 10mlの Sf900- II培地に懸濁し、 175cm 2フラスコ（グライ ナ一社製）に入れて室温で 1時間放置して細胞をフラスコに付着させた。放置後 上清を除き新たに 15mlの TMN- FHインセクトメディウムと上記の組み換えウィル スを含む培養上清のうち lmlを加え 27°Cで 3 日間培養した。培養後上清を 1 ,500 X gで 10分間遠心分離して細胞を除き、蛋白質発現に使用する組み換え ウィルス溶液を得た。
得られた組み換えウィルス溶液についてウィルスの力価をバキュ口ゴールドスタ 一ターキット'マニュアル（ファーミンジェン社製）に記載の方法で算定した。
Sf9 細胞 6 X 10 6個を 4mlの Sf900- II培地に懸濁し、直径 60mmの細胞培養 用プラスチックシャーレに入れ、室温で 1 時間放置して細胞をシャーレに付着さ せた。次に上清を除き新たに Sf900- II培地 400 μ 1 と Sf900- II培地で 1000倍 に希釈した上記組み換えウィルス溶液を加え室温で 1時間放置した後、培地を 除き 5mlの 1%低融点ァガロース [ァガ一プラーク 'ァガロース (Agarplaque Agarose),ファーミンジェン社製]を含む培地（滅菌した lmlの 5%ァガープラーク プラス'ァガロース水溶液と 4ml の TMN- FHインセクトメディウムを混和し、 42°C に保温したもの）を該シャーレに流し込んだ。室温で 15分間放置した後、乾燥を 防ぐためビニルテープをシャーレに卷き、密閉可能なプラスチック製容器に該シ ヤーレを入れ、 27°Cで 6 日間培養した。該シャーレに 0.01% ニュートラルレッドを 含む PBS lmlを加えさらに 1 日間培養した後、出現したプラークの数を数えた。 以上の操作より該組み換えウィルス溶液はいずれも約 1 X 10 7プラークフォーミン グユニット（以下、 PFU と称す）/ mlのウィルスを含んでいることがわかった。 (6- 5)昆虫細胞における可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7N、可溶性ヒト VEGF受容 体キメラタンパク質 Fit- 1 7N.K2の発現および精製 可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7Nおよび可溶性ヒト VEGF受容体キメラタンパク質 Fit- 1 7N.K2は以下のようにして得た。 High Five細胞 4 X 10 7個を 175cm 2フラ スコ（グライナ一社製）中の EX- CEし L TM 400培地（JRH Bioscience社製） 30ml に懸濁し、室温で 1時間放置し、フラスコに付着させた。（6- 3)および (6- 4)で得ら れたトランスファーベクター由来の組み換えウィルスを約 1〜3 X 10 8 PFU /mlの 濃度で含む溶液を l tnl加え、室温で 2時間感染させた。培養上清を除き新たに 30mlの EX- CELL TM 400培地 30mlを加え 27°Cにて 3〜4 日間培養した。培養 終了後、培養上清を回収し l，500 X gで 10分間遠心分離を行い上清を得た。 可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7Nについては、以下のようにして精製した。
50mlの DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech社製）を充填したカラム カ液の人ロイ則に、 40mlの Heparin Sepharose Cし一 6B (Pharmacia Biotech社 製)を充填したカラムが出口側になるように直列に接続し、 300mlの 20mMリン酸 ナトリウム緩衝液 (PH8)で洗浄した。洗浄後、可溶性ヒト VEGF受容体 KDRを含 む培養液 400〜800mlを 50〜 100ml/時の流速で通塔した。更に、 300mlの 20mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH8)で洗浄した後、 Heparin Sepharose CL- 6B カラムのみに 400mlの 0〜1 M NaCl/20mMリン酸ナトリウム緩衝液にて連続濃度 勾配をかけ、吸着蛋白質の溶出を行った。溶出液は 7mlずつ分画し、各分画に 含まれる蛋白質を SDS-PAGEにて解析し、可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7N を含む分画を 60〜80ml回収した。回収した精製画分はセントリプレップ 10 (アミ コン社製）を用いて濃縮し、可溶性ヒト VEGF受容体 KDR 7Nを溶液として 4.8ml (蛋白質濃度は 815 μ g/ml、純度は 70〜80%)得た。
可溶性ヒト VEGF受容体キメラタンパク質 Fit- 1 7N . 2については、以下のよう に精製した。
カラムに約 20mlのへパリン一セファロース CL- 6B ゲ /レ [ファノレマシア 'バイオテック (Pharmacia Biotech) AB社製]を充填し、 100ml の 20mMトリスー塩酸 (pH7.5) 緩衝 液を用いて 0.5ml/分の流速でカラムを洗浄した。洗浄後、上記のように調製した可溶 性ヒト VEGF受容体キメラタンパク質 Fit- 1 7N .K2を含む培養液 900mlを 0.5ml/ 分の流速でへパリン一セファロース CL- 6B カラムに通塔した。さらに 100mlの 20mM トリス—塩酸 (pH7.5)を用いて 0.5ml/分の流速で洗浄した後、濃度勾配が 0 M〜1.5M の NaCl含有 20mMトリスー塩酸 (pH7.5)からなる緩衝液を 200 ml通塔し、へパリン— セファロースに吸着した蛋白質の溶出を行うと共に 8mlずつ溶出液を分画した。各分 画に含まれる蛋白を SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS- PAGE)にて解析し、可 溶性ヒト VEGF受容体キメラタンパク質 Fit- 1 7N .K2を含む分画を 50〜70ml回収 し、セントリブレップ 10 (アミコン社製)を用いて濃縮した。濃縮後、可溶性ヒト VEGF 受容体キメラタンパク質 Fit- 1 7N .K2を溶液としてそれぞれ 5.8ml (蛋白濃度は 588 μ g/ml、純度 65~7 5%)得た。
(6-6)抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト型キメラ抗体の認識するェピト一プの解析 精製抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト型キメラ抗体 KM2532および KM2550の認識す るェピトープを以下の手順に従い解析した。
可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7N (シグナル配列を含む N末端アミノ酸から 750番 目に相当）、可溶性ヒト VEGF受容体 Flt-1 3N (シグナル配列を含む N末端アミノ酸か ら 338番目に相当）、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 2N (シグナル配列を含む N末端 アミノ酸から 223番目に相当）は Tanakaらの方法 [Japanese Journal of Cancer Research, 88, 867 (1997)]に従い調製した。可溶性ヒト受容体 KDR 7N (シグナル配列 を含まなレ、N末端アミノ酸から 738番目に相当）、可溶性ヒト VEGF受容体キメラタンパ ク質 Fit- 1 7N. 2 (ヒト Fit- 1 7Nのアミノ酸 100〜204番目をリンカ一を介してヒト KDR のアミノ酸 95〜199番目に変換したもの）は（6-5)に従い調製した。実験に用いた可 溶性ヒト VEGF受容体各種誘導体の模式図は図 32に示した。
まず、酵素免疫測定法を用いて抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 M1732, KM1750および抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532、 KM2550の反応性を比較した。 96ゥエルの E1A用プレート（グライナ一社製）に、 PBS で希釈した 4 μ g/mlの Flt-1 7N、 Flt-1 3N、 Flt-1 2N、 Flt-1 7N.K2、 KDR 7Nをそれ ぞれ 50 μ 1/ゥエルで分注し、 4 °Cで一晩放置して吸着させた。 PBSで洗浄後、 1%BSA- PBSを 100 μ ΐ/ゥェルカ卩ぇ、室温で 1時間反応させて残っている活性基をブ ロックした。 1%BSA- PBSを捨て、 0.1 g/mlの精製抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウス モノクローナル抗体 ΚΜΠ32または KM1750、あるいは、精製抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532または KM2550を 50 /z 1/ゥエルで分注し、室温で 1 時間反応させた。 0,05%tween - PBSで洗浄後、 1%BSA- PBS にて 400倍に希釈したぺ ルォキシダーゼ標識抗マウス IgG抗体 (ダコ社製）あるいは 3000倍に希釈したペルォ キシダーゼ標識抗ヒト IgG抗体（アメリカン コ一レックス社製）を 50 μ 1/ゥエルで加え て室温で 1時間反応させ、 0.05% tween-PBSで洗浄後、 ABTS基質液 [2.2-アジノビス (3-ェチルベンゾチアゾール -6- スルホン酸）アンモニゥム]を 50 μ 1/ゥエルで加えて 発色させ、 OD415mnの吸光度を E max (モレキュラー 'デバイシーズ社製）を用いて 測定した。
その結果を第 30図に示す。抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 ΚΜ1732 KM 1750およぴ抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型キメラ抗体 KM2532、
KM2550 (ま Fit— 1 7N、 Fit— 1 3N、 Fit— 1 2N こ結合し、 Fit— 1 7N.K2, KDR 7Nに ίま結合 しなかった。従って、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1732、 KM1750および抗ヒト VBGF受容体 Fit- 1 ヒト型キメラ抗体 KM2532、 K 2550の認識 するェピト一プは、ヒト Fit- 1の N末端アミノ酸から 100〜204番目までの領域に含まれ ることが示された。
次に、酵素免疫測定法を用いて 96ゥエルの EIA用プレートに吸着させる Fit- 1 7N、 Flt-1 3N、 Fit- 1 2N、 Fit- 1 7N.K2、 KDR 7N量を一定にし、添加するヒト型キメラ抗体 の濃度を変化させて結合活性を検討した。 96ゥヱルの EIA用プレート（グライナ一社 製）に、 PBS で希釈した 4 μ g/mlの Flt-1 7N、 Flt-1 3N、 Flt-1 2N、 Flt-1 7N.K2、 KDR 7Nをそれぞれ 50 μ 1/ゥエルで分注し、 4 °Cでー晚放置して吸着させた。 PBS で洗浄後、 1%BSA- PBSを 100 μ /ゥエル加え、室温で 1時間反応させて残っている 活性基をブロックした。 1%BSA- PBSを捨て、 0.0152〜100 ng/mlの精製抗ヒト VEGF 受容体 Fit- 1 ヒト型キメラ抗体 KM2532または KM2550を 50 μ 1/ゥヱルで分注し、室 温で 1 時間反応させた。 0.05%tween-PBSで洗浄後、 1%BSA-PBSで 3000倍に希釈 したペルォキシダーゼ標識抗ヒト IgG 抗体 (アメリカン コーレックス社製）を 50 μ 1/ゥ エルで加えて室温で 1時間反応させ、 0.05% tween-PBSで洗浄後、 ABTS基質液
[2.2-アジノビス（3-ェチルベンゾチアゾ一ル -6-スルホン酸）アンモニゥム]を 50 μ 1/ ゥエルで加えて発色させ、 OD415nmの吸光度を E max (モレキュラー.デバイシーズ社 製)を用いて測定した。
その結果を第 31図（上図）に示す。抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2532, M2550は抗体濃度依存的に Flt-1 7N、 Flt-1 3N、 Fit- 1 2Nに結合し、 Flt-1 7N. 2, KDR 7Nに fま結合しな力つた。また、抗ヒト VEGF受容体 Flt-1 ヒト型キ メラ抗体 KM2532、 KM2550の結合活性はほぼ同等であった。
次に、酵素免疫測定法を用いて 96ゥヱルの EIA 用プレートに吸着させる Fit- 1 7N、 Flt-1 3N、 Flt-1 2N、 Flt-1 7N.K2, KDR 7 量を変化させてヒト型キメラ抗体の結合活 性を検討した。 96ゥエルの EIA用プレート（グライナ一社製）に、 PBSで希釈した 0.041 - 10 μ g/mlの可溶性ヒト VEGF受容体 Flt- 1 7N、 Flt-1 3N、 Flt-1 2N、 Flt-1 7N.K2、 KDR 7 をそれぞれ 50 μ 1/ゥェルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。 PBSで洗浄後、 1%BSA-PBSを 100 μ 1/ゥ：ル加え、室温で 1時間反応させて残って いる活性基をブロックした。 1%BSA- PBSを捨て、 5 μ g/mlの精製抗ヒト VEGF受容体 Flt-1 ヒト型キメラ抗体 KM2532または KM2550をそれぞれ 5Q μ 1/ゥュルで分注し、 室温で 1 時間反応させた。 0.05%tween- PBS で洗浄後、 1%BSA- PBS にて 3000倍 に希釈したペルォキシダーゼ標識抗ヒト IgG 抗体（アメリカン コーレックス社製）を 50 μ 1/ゥエルで加えて室温で 1時間反応させ、 0.05% tween-PBSで洗浄後、 ABTS基質 液 [2.2-アジノビス（3-ェチルベンゾチアゾール -6-スルホン酸）アンモニゥム]を 50 μ 1/ゥエルで加えて発色させ、 OD415mnの吸光度を E max (モレキュラー.デバイシ一 ズ社製)を用いて測定した。
その結果を第 31図（下図）に示す。抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト型キメラ抗体 KM2532, M2550はプレートに吸着させた可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7N、 Flt-1 3N、 Flt-1 2Nの濃度に依存した結合活性を示し、 Flt-1 7N.K2、 KDR 7Nには反応し なかった。また、抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型キメラ抗体 KM2532、 KM2550の結合 活性はほぼ同等であった。
3.抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型 CDR移植抗体の製造
ヒト VEGF受容体 Fit - 1に対する中和活性を有する抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1マウス モノクローナル抗体 KM 1732、 M1750および抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗 体 KM2532、 KM2550と同等の活性を有する抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型 CDR移 植抗体を以下のようにして製造した。
( 1 )既知のヒト抗体の VHの共通配列を基礎とする抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型 CDR移植抗体の VHをコードする cDNAの構築
力バットらは [シーケンシズ'ォブ'プロテインズ'ォブ'ィムノロジカル'インタレスト (sequences or Proteins of Immunological Interest), Ub Dept. Health and Human Services, 1991 、以下同様]、既知の様々なヒト抗体の VHをそのアミノ酸配列の相同 性からサブグループ I 〜III (HSG I 〜III)に分類し、各サブグループ毎に共通配列を 同定した。そこで、それら共通配列を基礎として抗ヒト VEGF受容体 Flt-1ヒト型 CDR 移植抗体の VHのアミノ酸配列を設計することとした。まず、基礎とする共通配列を選 択するために、各サブグループのヒト抗体の VHの共通配列のフレームワーク領域（以 下、 FRと表記する）のアミノ酸酉己歹 ljと抗ヒト VEGF受容体 Fit— 1 マウスモノクロ一ナゾレ 抗体 KM1732および KM1750の VHの FRのアミノ酸配列との間の相同性を調べた (第 1表)。
Figure imgf000067_0001
その結果、 K 1732, KM1750ともにサブダル一プ 1 と最も相同性が高いことが確認 され、サブグループ 1の共通配列を基礎として抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体の VHのアミノ酸配列を設計し、そのアミノ酸配列をコードする cDNAをポリメ ラーゼチェーンリアクション法（以下、 PCR法と表記する）を用いて以下のようにして構 築した。
まず、抗ヒト VEGF受容体 Flt- 1マウスモノクローナル抗体 KM1732の VHに由来す る抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体の VHをコードする cDNAの構築に ついて以下に説明する。配列番号 25から 30の塩基配列を有する 6本の合成 DNA を 合成した（サヮディー ·テクノロジ一社製）。合成した各 DNAを最終濃度が 0.1 // Mと なるように 200 μ M dNTP (宝酒造社製）、 0.5 μ M 13primer RV (宝酒造社製）、 0.5 μ M 13primer M4 (宝酒造社製）および 2.5単位の TaKaRa Ex Taq DNA ポリメラ —ゼ（宝酒造社製）を含む 1倍濃度の Ex Taq緩衝液（宝酒造社製） 50 μ 1 に加え、 50 μ 1の鉱油で覆い、 DNAサ一マルサイクラ一 PJ480 (パ一キン エルマ一社製）にセ ットし、 94。Cにて 2分間、 55。Cにて 2分間、 72°Cにて 2分間のサイクルを 30サイクル 行なった。該反応液を Q1A quick PCR Purification Kit (キアジェン社製）を用いて添 付の説明書に従い処理し、 20 μ 1の滅菌水で精製、溶出した。次に、得られた溶出液 を 10mMトリス-塩酸（pH7.5)、 10mM塩化マグネシウムおよび ImM DTTからなる緩衝 液 30 μ 1に加え、更に 20単位の制限酵素 Apal (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時 間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、 50mMトリス-塩酸（pH7.5)、 lOOmM 塩 化ナトリウム、 10mM塩化マグネシウム、 ImM DTT 、 100 μ g/ml BSAおよび 0.01% ト ライトン X- 100 からなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 N'otI (宝酒造 社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分 画し、約 0.44kbの Apa卜 Notl 断片を約 0.5 μ g回収した。
実施例 1の 2 (1 )で得られたプラスミド pBluescript SK (-)由来の Apaト Notl断片 0.1 μ gと上記で得られた PCR 増幅断片の Apa卜 Notl断片 0· 1 μ g を全量 10 μ 1の滅 菌水に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて使用説明書に従い、連結 した。このようにして得られた組換えプラスミド DNA 溶液を用いて大腸菌 DH5 α株 (東洋紡績社製）を形質転換した。 10個の形質転換大腸菌より各プラスミドを調製し、 実施例 1の 1項（4)に記載の方法に従って、塩基配列を決定した結果、 目的のアミノ酸 配列をコードする cDNAを含む図 12に示したプラスミド phKM1732HV0を得た。
ph M1732HV0に含まれる抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型 CDR 移植抗体の VH (以 下、 1732HV0と表記する）の塩基配列を配列番号 31およびアミノ酸配列を配列番号 90に示した。
抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1750の VHに由来する抗ヒ ト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体の VHをコードする cDNAの構築につい ては、配列番号 32から 37の塩基配列を有する 6本の合成 DNA (サヮディ一'テクノロ ジ一社製）を用いて上記と同様の反応を行い、図 13に示した目的のアミノ酸配列をコ ードする cDNAを含むプラスミド phKM 1750HV0を得た。 PhKM1750HV0に含まれる 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体の VH (以下、 1750HV0と表記する）の 塩基配列を配列番号 38およびアミノ酸配列を配列番号 91に示した。
(2)既知のヒト抗体の VLの共通配列を基礎とする抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型 CDR 移植抗体の VLをコードする cDNAの構築
力バットらは既知の様々なヒト抗体の VLをそのアミノ酸配列の相同性からサブグノレ一 プ 1 〜iV (HSG l 〜【V)に分類し、各サブグノレ一プ毎に共通配列を同定した。そこで、 それら共通配列を基礎として抗ヒト VEGF受容体 Flt-1ヒト型 CDR移植抗体の VLの アミノ酸配列を設計することとした。まず、基礎とする共通配列を選択するために、各サ ブグループのヒト抗体の VLの共通配列の FRのアミノ酸配列と抗ヒト VEGF受容体 Flt-1マウスモノクローナル抗体 KM1732および KM1750の VLの FRのアミノ酸配列 との間の相同性を調べた（第 2表）。
Figure imgf000069_0001
その結果、 M1732はサブグループ 1と最も高い相同性を示すこと、 KM1750はサブ グループ 1および IVとほぼ同等の高い相同性を示すことが確認され、それぞれサブグ ループ 1 およびサブグループ IVの共通配列を基礎として抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型 CDR移植抗体の VLのアミノ酸配列を設計し、そのアミノ酸配列をコードする cDNAを PCR法を用いて以下のようにして構築した。
まず、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1732の Vしに由来す る抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型 CDR移植抗体の VLをコードする cDNAの構築に ついて以下に説明する。配列番号 39から 44の塩基配列を有する 6本の合成 DNAを 合成した (サヮディー'テクノロジ一社製）。合成した各 DNAを最終濃度が 0.1 μ Mと なるように 200 μ dNTP (宝酒造社製）、 0.5 μ M M 13primer RV (宝酒造社製）、 0.5 μ M M13primer M4 (宝酒造社製）および 2.5単位の TaKaRa Ex Taq DNA ポリメラ ーゼ（宝酒造社製）を含む 1倍濃度の Ex Taq緩衝液（宝酒造社製） 50 μ ！に加え、 50 μ 1の鉱油で覆レ、、 DNAサ一マルサイクラ一 PJ480 (パーキン エルマ一社製）にセット し、 94。Cにて 2分間、 55°Cにて 2分間、 72。Cにて 2分間のサイクルを 30サイクル行な つた。該反応液を QIA quick PCR Purification Kit (キアジェン社製）を用いて添付の 説明書に従い処理し、 20 μ 1 の滅菌水で精製し、溶出した。次に、得られた溶出液を 50m トリス-塩酸（pH7.5)、 lOOmM 塩ィヒナトリウム、 10mM塩化マグネシウム、 ImM DTTおよび 100 μ g/ml BSA 力 なる緩衝液 30 μ 1 に加え、更に 10単位の制限酵 素 EcoRI (宝酒造社製）および制限酵素 SplK宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反 応させた。該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、約 0.39kbの EcoRI- Spll 断片を約 0.5 μ g回収した。
実施例 1の 2 (1 )で得られたプラスミド phKM1259LV0由来の EcoR!- Spll断片 0.1 μ gと上記で得られた PCR増幅断片の EcoRI - Spll断片 0ュ μ gを全量 10 μ 1の滅菌 水に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて使用説明書に従い、連結し た。このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 ct株（東 洋紡績社製）を形質転換した。 10個の形質転換大腸菌より各プラスミドを調製し、実施 例 1の 1項（4)に記載の方法に従って、塩基配列を決定した結果、 目的のアミノ酸配列 をコードする cDNAを含む図 14に示したプラスミド phKM1732LV0を得た。
phKM1732LV0に含まれる抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体の VL (以 下、 1732LV0と表記する）の塩基配列を配列番号 45およびアミノ酸配列を配列番号 92に示した。
抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1750の VLに由来する抗ヒ ト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体の VLをコードする cDNAの構築にっレヽ ては、ヒトサブグループ I Vの共通配列を基礎として利用する場合には配列番号 46か ら 51の塩基配列を有する 6本の合成 DNA (サヮディー'テクノロジ一社製）を用いて上 記と同様の反応を行レ、、図 15に示した目的のアミノ酸配列をコードする cDNAを含む プラスミド phKM1750LV0(lV)を得た。 phKM1750LVO(IV)に含まれる抗ヒト VEGF受容 体 Flt-1ヒト型 CDR 移植抗体の VL [以下、 1750し V0(IV)と表記する]の塩基配列を配 列番号 52、およびアミノ酸配列を配列番号 93に示した。ヒトサブグループ Iの共通配列 を基礎として利用する場合には配列番号 65から 70の塩基配列を有する 6本の合成 DNA (サヮディ一.テクノロジ一社製）を用いて上記と同様の反応を行い、図 33に示し た目的のアミノ酸配列をコードする cDNAを含むプラスミド phKM1750LV0(I)を得た c phKM1750し V0(1)に含まれる抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体の VL [以下、 1750LV00)と表記する]の塩基配列を配列番号 71およびアミノ酸配列を配列 番号 94に示した。
(3)既知のヒト抗体の V 領域の共通配列を基礎とした抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト 型 CDR移植抗体の発現ベクターの構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用タンデムカセットベクタ一 pKANTEX93およ び実施例 1の 3 (1 )、 （2)で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型 CDR移植抗体の V領域をコードする cDNAを含むプラスミド phKM 1732HV0、 phKM1732LV0、 ph 1750HV0, phKM1750LV0(l)および phKM1750LV0(IV)を用いて抗ヒト VEGF受 容体 Flt_lヒト型 CDR移植抗体の発現べクタ一を以下のようにして構築した。
まず、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクロ一ナル抗体 KM1732に由来する抗ヒ ト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体の発現ベクターの構築について以下に説 明する。
プラスミド phKM1732HV0の 5 μ gを lOmMトリス-塩酸（pH7.5)、 lOmM塩化マグネ シゥムおよび ImM DTT力 なる緩衝液 10 μ 1 に加え、更に 10単位の制限酵素 ApaK宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、 50mMトリス-塩酸（pH7.5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 lOmM塩化マグネシウム、 ImM DTT、 100 μ g/ml BSAおよび 0.01% トライトン X- 100からなる緩衝液 10 μ 1に加え、 更に 10単位の制限酵素 Notl (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反 応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、約 0.44kbの Apal- Notl断片を約 0.5 μ g回収した。
実施例 1の 2 ( 1 )で得られたヒト化抗体発現用タンデムカセットベクタ一 pKANTEX93 由来の Apa卜 Notl断片 0.1 gと上記で得られたプラスミド phKM 1732HV0由来の Apa卜 Notl断片 0.1 g を全量 10 μ 1の滅菌水に加え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝 酒造社製）を用いて使用説明書に従レ、、連結した。このようにして得られた組換えブラ スミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 ο:株（東洋紡績社製）を形質転換し、図 16に示 したプラスミド PKANTEX1732HV0を得た。
次に、得られたプラスミド pKANTEX1732HV0の 3 gを 50mMトリス-塩酸（pH7.5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 10mM塩化マグネシウム、 lmM DTTおよび 100 μ g/ml BSA からなる緩衝液 10 n 1に加え、更に 10単位の制限酵素 EcoRI (宝酒造社製）および 制限酵素 Spll (宝酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をァガロー スゲル電気泳動にて分画し、約 13.20kbの EcoRI- Spll断片を約 1 μ g回収した。次 に、プラスミド phKM1732LV0の 5 μ gを 50mMトリス-塩酸（pH7.5)、 lOOmM 塩化ナ トリウム、 10mM塩化マグネシウム、 ImM DTTおよび 100 μ g/ml BSA力らなる緩衝液 10 μ 1に加え、更に 10単位の制限酵素 EcoRI (宝酒造社製）および制限酵素 Spll (宝 酒造社製）を加えて 37°Cで 1時間反応させた。該反応液をァガロースゲル電気泳動 にて分画し、約 0.39kbの EcoR卜 Spll断片を約 0.5 μ g回収した。
上記で得られたプラスミド PKANTEX1732HV0由来の EcoR卜 Spll断片 0.1 μ g とプ ラスミド phKM1732LV0由来の EcoRI- Spll断片 0.1 μ gを全量 10 μ 1の滅菌水に加 え、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて使用説明書に従レ、、連結した。この ようにして得られた組換えプラスミド DNA 溶液を用いて大腸菌 DH5 α株（東洋紡績 社製）を形質転換し、図 17に示した抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体の 発現べクタ一 PKANTEX1732HV0LV0を得た。
抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1750に由来する抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型 CDR移植抗体の発現べクタ一の構築についても、上記と同 様の反応を行い、図 18および図 34に示した抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移 植抗体の発現べクタ一 pKANTEX 1750HV0LV0(IV)および pKANTEX1750HV0LV0(I) を得た。
4.抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体の V領域の FRのアミノ酸配列の 解析と FRのアミノ酸を改変した改変型ヒト型 CDR移植抗体の発現べクタ一の作製 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1732および KM1750の V 領域のコンピューター三次元構造モデルおよび実施例 1の 3項で製造した各抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体の V 領域のコンピュータ一三次元構造モ デルを構築、比較検討することにより、各抗ヒト VEGF受容体 Flt_lヒト型 CDR移植抗 体の V領域の FRのアミノ酸配列と各抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル 抗体の V領域の FRのアミノ酸配列の間で異なっているアミノ酸残基のうち、各抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体の V領域の FRのアミノ酸配列においてヒト VEGF受容体 Fit- 1との結合に重要と考えられるアミノ酸残基の位置を同定することを 検討した。その結果、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1732に 由来する抗ヒト VEGF受容体 Flt-1ヒト型 CDR 移植抗体については、 VHにおいて配 列番号 31に記載のアミノ酸配列の 24位のァラニン、 27位のチロシン、 40位のァラニ ン、 67位のアルギニン、 69位のスレオニン、 70位のイソロイシン、 82位のグルタミン酸、 93位のパリンの位置が、 VLにおいて配列番号 45に記載のアミノ酸配列の 39位のプ 口リン、 45位のロイシン、 46位のロイシン、 69位のァスパラギン酸、 70位のフエニルァ ラニンの位置がヒト VEGF受容体 Fit- 1との結合において重要な役割を果たしている ことが考えられた。
また、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 マウスモノクロ一ナル抗体 KM1750に由来する抗ヒ ト VEGF受容体 F】t- 1ヒト型 CDR 移植抗体については、 VHにおいて配列番号 38に 記載のアミノ酸配列の 3位のグルタミン、 67位のアルギニン、 82位のグルタミン酸、 84 位のセリン、 95位のチロシンの位置力 VLにおいて配列番号 71に記載のアミノ酸配 列の 17位のァスパラギン酸、 18位のアルギニン、 39位のプロリン、 59位のセリン、 69 位のァスパラギン酸、 70位のフユ二ルァラニンの位置がヒト VEGF受容体 Fit - 1との結 合において重要な役割を果たしていることが考えられた。これらの事実は、上記で述べ た抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体の各アミノ酸残基の位置について、 例えば、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体の相当する位置に見い 出されるアミノ酸残基への改変を行うことにより、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体のヒト VEGF受容体 Fk-1に対する結合活性を改変できることを示している。
(1) FRのアミノ酸を改変した改変型ヒト型 CDR移植抗体の VHをコードする cDNA の構築
抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1750に由来する抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体の H鎖については、ヒト VEGF受容体 Flt-1 との結合において重要な役割を果たしていると考える上記に示した 5つのアミノ酸残基 の中で 3残基（82位のグルタミン酸、 84位のセリン、 95位のチロシン）の位置が特に重 要であると考えられるので、 1750に見出される対応残基（82位のグルタミン、 84位 のアルギニン、 95位のフエ二ルァラニン）へ置換したアミノ酸配列をコードする cDNA を PCR法を用いて以下のようにして構築した。
配列番号 72から 77の塩基配列を有する 6本の合成 DNA (サヮディ一'テクノロジー 社製）を用いて PCR法により約 0.39kb Mrc^-ApaI断片を回収した。
プラスミド phKM1750HV0を制限酵素 Apalおよび Mrolで処理後、約 3.04 kbの Apal-Mrol断片を回収し、上記で得られた PCR増幅断片を連結し、得られた組換え プラスミド DNA 溶液を用いて大腸菌 DH5 α株（東洋紡績社製）を形質転換した。 10 個の形質転換大腸菌より各プラスミドを調製し、実施例 1の 1項（4)に記載の方法に従 つて、塩基配列を決定した結果、 目的のアミノ酸配列をコードする cDNAを含む図 3 5 に示したプラスミド phKM1750HV3を得た。
ph M1750HV3に含まれる抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体の VH (以下、 1750HV3と表記する）の塩基配列を配列番号 78およびアミノ酸配列を配列番 号 95に示した。
(2) FRのアミノ酸を改変した改変型ヒト型 CDR移植抗体の VLをコードする cDNAの 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1マウスモノクローナル抗体 KM1750に由来する抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR 移植抗体の L鎖については、ヒト VEGF受容体 Flt-1 との結合にぉレ、て重要な役割を果たして!/、ると考えられる上記に示した 6つのアミノ酸 残基の中で 4残基（17位のァスパラギン酸、 18位のアルギニン、 69位のァスパラギン 酸、 70位のフエ二ルァラニン）の位置が KM175OLV00)においては特に重要であると考 えれるので、 KM1750に見出される対応残基（17位のグルタミン酸、 18位のグルタミン 酸、 69位のフエ二ルァラニン、 70位のチロシン）へ置換したアミノ酸配列をコードする cDNAを PCR法を用いてを以下のようにして構築した。
配列番号 79から 84の塩基配列を有する 6本の合成 DNA (サヮディー 'テクノロジ一 社製）を用いて上記と同様の反応を行い、図 36に示した目的のアミノ酸配列をコード する cDNAを含むプラスミド phKM1750LV4を得た。 phKM1750LV4に含まれる抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体の VL (以下、 1750LV4と表記する）の塩基 配列を配列番号 85およびアミノ酸配列を配列番号 96に示した。
(3) FRのアミノ酸を改変した改変型ヒト型 CDR移植抗体の発現ベクターの構築 実施例 1の 4 (3)で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体の V領 域をコ一ドする cDNAを含むプラスミド phKM1750HV3、 phKM1750LV4、および、実 施例 1の 3 (1 )、 （2)で得られたプラスミド phKM1750HV0、 phKM1750LV0(I)、 phKM 1750LV0(IV)を用いて、 FRのアミノ酸を改変した改変型抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体の発現ベクターについては、実施例 1の 3 (3)に示した方 法と同様の反応を行い、図 37、図 38、図 39および図 40に示した改変型抗ヒト VEGF 受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体の発現べクタ一 pKANTEX175OHV3LV0(I)、 pKANTEX 175OHV3LV0(IV) , pKANTEX1750HV0LV4, pKANTEX1750HV3LV4を 得た。
M1750マウス H鎖、 KM1750HV0, K 1750HV3のアミノ酸配列を図 45に示した。 KM 1750マウス L鎖、 KM1750LV0(I)、 KM1750LV(IV)、 KM1750LV4のアミノ酸配列を 図 46に示した。
組換えプラスミド PHKM1750HV0 を有する大腸菌 DH5 a /PHKM1750HV0、組換 えプラスミド PHKM1750HV3 を有する大腸菌 DH5 a /pHKM1750HV3、組換えプラ スミド pHKM1750LV0(l) を有する大腸菌 XLl- Blue/pHKM1750LV0(I)、組換えプラ スミド PHKM1750し VO(IV) を有する大腸菌 XLl- Bhie/pHKM1750LV0(lV；)、組換えプ ラスミド PHKM1750LV4 を有する大腸菌 DH5 ct /pHKM1750LV4は、それぞれ FERM BP - 6719、 FERM BP - 6720、 FERM BP - 6716、 FER BP- 6717,、 FERM BP - 6718として、平成 1 1年 5月 12 日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所（日 本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に寄託されている。
5.抗ヒト VEGF受容体 Fk-1ヒト型 CDR移植抗体の製造と活性評価
(l ) pKANTEX1750HV0LV0(I)、 pKANTEX 1750HV0LV0 (IV),
p ANTEX1750HV3LV0(I), pKANTEX 1750HV3LV0(IV)N pKANTEX 1750HV0LV4お よび pKANTEX1750HV3LV4を用いた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗 体のラットミエロ一マ YB2/0細胞（ATCC CRL1581)での発現
YB2/0細胞への抗ヒト VEGF受容体 Flt_l ヒト型 CDR移植抗体発現べクタ一 pKANTEX 1750HV0LV0C)、 p ANTEX 1750HV0LV0(IV)、 pKANTEX 1750HV3LV0(I)、 pKANTEX1750HV3LV0(IV)、 pKANTEX 1750HV0LV4および
pKANTEX1750HV3LV4の導入は実施例 1の 1 (1 )に従い、エレクトロボレ一シヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]にて行った。
実施例 1の 4項（3)で得られた pKANTEX 1750HV0LV0(I)、
pKANTEX 1750HV0LV0(IV)、 pKANTEX 1750HV3LV0(I)、
pKANTEX 175OHV3LVO0V), pKANTEX 1750HV0LV4および
pKANTEX 1750HV3LV4のそれぞれ 5 μ gを 4 X 106個の YB2/0 細胞へ導入後、 40mlの RPMI1640- FCS (IO)培地 [牛胎児血清 (FCS) を 10%含む RPMI1640培地（日 水製薬社製）]に懸濁し、 96ゥヱルマイクロタイタ一プレート (スミロン社製）に 200 μ 1/ ゥエルずつ分注した。 5%CO 2インキュベータ一内で 37°C、 24時間培養後、 G418 (ギブ コ社製）を 0.5mg/mlになるように添加してさらに 1〜2週間培養した。 G418耐性を有 する形質転換株のコロニーが出現し、コンフルェントになったゥエルより培養上清を回 収し、上清中の抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型 CDR移抗体の活性を実施例 1の 2項 (3)に示した酵素免疫測定法により測定した。
培養上清中に抗ヒト VEGF受容体 Fh-1 ヒト型 CDR移植抗体の活性が認められた 形質転換株については 2回の限界希釈法によるクローニングを経て、抗ヒト VEGF受 容体 Fit - 1ヒト型 CDR移植抗体を生産する形質転換細胞株とした。発現べクタ一 pKANTEX 1750HV0LV0(I)、 pKANTEX 1750HV0LV0(IV)、 pKANTEX 1750HV3LV0 (I), pKANTEX 1750HV3LV0(IV)、 pKANTEX-1750HV0LV4, pKANTEX 1750HV3LV4をそ れぞれ導入して得られた形質転換株、すなわち、抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1モノクロ一 ナル抗体 KM 1750由来の抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体を生産する 形質転換株の例としてはとしてはそれぞれ KM8550、 KM8551、 KM8552、 KM8553、 M8554, Μ85δδがあげられ、それが生産する抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型 CDR 移植抗体をそれぞれ KM8550、 M8551 , KM8552、 KM8553、 M8554, Μδδδδと命 名した。得られた各形質転換細胞クローンの抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移 植抗体の生産性は約 0.1〜1 β g/mlであった。
(2)抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒト型 CDR移植抗体の培養上清からの精製 実施例 1の 5 (1 )で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体生産株 KM8550、 KM8551 , KM8552、 KM8553, KM8554、 K 8555を 0.5mg/ml G418を含む GIT培地（日本製薬社製）に 1〜2 X 105細胞/ ml となるように懸濁し、 175cm2フラスコ (グライナ一社製）に 200mlずつ計 5本に分注した。 5%C〇2インキュベーター内で 37°C、 5〜7 日間培養し、コンフルェントになった時点で各培養上清約 1.1〜2.5Lを回 収した。カラムに約 1mlのプロセップ A (バイオプロセッシング社製）を充填し、 10mlの 1Mグリシン- 0.15M NaCl (pH8.6)を用いて 1ml/分の流速でカラムを洗浄した。洗浄後、 上記のように調製した抗ヒト VEGF受容体 Flt-lヒト型 CDR移植抗体生産株 KM8550、 KM8551、 KM8552、 KM8553、 M8554, KM8555を含む培養上清それぞれ 2.3L、 2.5し、 1.9し、 2.4し、 1.1L、 2Lを 70ml/時の流速でプロセップ A カラムに通塔した。さら に 10mlの 1Mグリシン- 0.15M NaCl (pH8.6)を用いて 1ml/分の流速で洗浄した後、 pH6、 pH5、 pH の 50mMクェン酸緩衝液各 4mlで段階的に洗浄し、 50mMクェン酸 緩衝液（pH3.0)を 7ml通塔してヒト型 CDR移植抗体を溶出した。その結果、抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1ヒト型 CDR移植抗体 KM8550、 KM8551、 M8552, M8553, KM8554、 K 8555がそれぞれ l .lmgヽ 1.8mg、 1.6mg、 2.2mg、 1.3mg、 1.6mg得られた。 精製した抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型 CDR移植抗体 ΚΜ8550、 ΚΜ8δδ1 , ΚΜ8552、 ΚΜ8553, ΚΜ8554、 ΚΜ8555は、実施例 1の 2項（3)に示した SDS - PAGE 法で解析した。還元および非還元条件下でレーンあたりのタンパク質量として 2 gの 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型 CDR移植抗体 KM8550、 855 U KM8552、 ΚΜ8553、 ΚΜ8554、 Μ8δδδΝ実施例 1の 2項（4)で示した抗ヒト VEGF受容体 Flt-l ヒト型キメラ抗体 KM2550およびコントロールヒト型 CDR移植抗体としてヒト IgG lタイ プで、ガンダリオシド GM2に反応し、ヒト VEGF受容体 Fit- 1には反応しない KM8969 (特開平 10- 257893)をそれぞれ泳動し、クーマシ一ブリリアントブル一にて染色した。 その結果を図 41に示した。ヒト型 CDR移植抗体 KM8550、 KM8551、 M8552N
M8553, ΚΜ8554、 ΚΜ8δδ5は、非還元条件下では分子量約 150キロダルトンに IgG のバンドが認められ、還元条件下では約 50キロダルトンに H鎖のバンドが、約 25キロ ダルトンに L 鎖のバンドが認められた。この結果は、 IgG 型の抗体は、還元条件下で は分子間ジスルフイド結合が切断され、それぞれ 2本の H鎖および L鎖に分解し、非 還元条件下ではそれぞれ 2本の H鎖および L鎖より構成される分子量 150 キロダル トンの分子として存在することと一致し、ヒト型 CDR移植抗体 KM8550、 KM8551 , KM8552, KM8553、 KM8554、 M8555は正しい構造の抗体分子であることが示された。
(3)抗ヒト VEGF受容体 Fit— 1ヒト型 CDR移植キメラ抗体のヒト VEGF受容体 Fit— 1 に対する結合活性
精製抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体 KM8550、 K 8551 , KM8552, M8553, KM8554、 K 8555および抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体
KM2550のヒト VEGF受容体 Fit- 1に対する結合活性を実施例 1の 2項（5)の手順に 従い、確認した。
プレートにコートする Fit - 1 7Nは 2 Z g/mlに固定し、精製抗体濃度を 1.23〜
900ng/mlまで変化させた（3倍希釈系列）。
その結果を図 42に示す。抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型 CDR移植抗体 KM8550、 ΚΜδδδΙ , ΚΜ8552、 Κ 8553, ΚΜ8554、 ΚΜ85δδおよび抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1 ヒ ト型キメラ抗体 KM2550は抗体濃度依存的にヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nに結合した。 また、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型 CDR移植抗体 KM8550、 M855 M8552, KM8553、 KM8554、 M8555および抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体
M2550の結合活性はほぼ同等であった。従って、本発明の 6種のヒト型 CDR移植 抗体はヒト型キメラ抗体 KM2550の有する結合活性を保持していることが明らかとなつ た。
次に、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト型 CDR移植抗体 KM8550、 M8551 , KM8552、 KM8553、 KM8554、 M8555および抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体
M2550の結合特異性を検討するために、 δ種類の可溶性ヒト VEGF受容体誘導体タ ンパク質 Fit- 1 7N、 Fit - 1 3N、 Fit - 1 2N (W098/22616)、 F it - 1 7N.K2 [実施例 1の 2(6-5)]、 KDR 7N [実施例 1の 2(6-5)]に対する反応性を酵素免疫測定法を用いて検 討した。 96ゥエルの E1A 用プレートに吸着させる可溶性ヒト VEGF受容体誘導体蛋白 質の濃度は 10 μ g/ml (3倍希釈系列）に、抗体濃度は 5 g/mlに固定した。
その結果を図 43に示す。抗ヒト VEGF受容体 Flt-1ヒト型 CDR移植抗体 KM8550、 Μ8δδ1 Λ ΚΜ8552、 ΚΜ8553、 ΚΜ8554、 ΚΜ8555および抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト 型キメラ抗体 KM2550は全て同等の反応特異性を示し、 Flt-1 7N、 Flt-1 3N、 Flt-1 2Nに反応し、 Fit- 1 7N.K2, KDR 7 には全く反応しなかった。陰性コントロール抗体 である抗 GM2ヒト型 CDR移植抗体 KM8969 (特開平 10-257893)はレ、ずれの可溶性 ヒト VEGF受容体誘導体蛋白質にも反応しなかった。従って、本発明の 6種のヒト型 CDR移植抗体はヒト型キメラ抗体 KM2550の有する結合特異性を保持してレ、ることが 明らかとなった。
次に、抗ヒト VEGF受容体 Flt-1 ヒト型 CDR移植抗体 KM8550、 KM8551、 M8552, KM8553、 KM8554、 M8555および抗ヒト VEGF受容体 Flt_lヒト型キメラ抗体
KM2550によるヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit - 1の結合阻害活性を実施例 1の 2項 (5)に記載した方法に従い検討した。添加する抗体濃度は 0.0048〜15 g/ml (5倍 希釈系列）とした。その結果を図 44に示す。図 44に示したように抗ヒト VEGF受容体 Flt-1ヒト型 CDR移植抗体 M8550, M8551, KM8552、 KM8553、 KM8554、
KM8555および抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1ヒト型キメラ抗体 KM2550は抗体濃度依存 的にヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit- 1の結合を阻害した。また、従って、本発明で 確立した 6種のヒト型 CDR移植抗体はヒト型キメラ抗体 KM2550の有する VEGF-Fk- 1結合阻害活性を保持していることが明らかとなった。
参考例 1
1.抗原の調製
(1)可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 3N発現べクタ一の構築
ヒト VEGF受容体 Fit - 1の N末端アミノ酸から 1〜338番目（シグナル配列を含む）に 相当する可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 断片（以下、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 3Nと称す）を発現するためのベクタ一を以下の手順で作製した c可溶性ヒト VEGF受 容体 F - 1 3 は、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1の細胞外領域の N末端側から 3個 のィムノグロブリン様部位に相当する。
ヒト VEGF受容体 Fit- 1の完全長 cDNAをコ一ドする cDNAクローン flt#3- 7 [Oncogene, 5, 519， (1990)]を EcoRlと Taqlの両制限酵素により部分切断し、 5'末端 から 1263bpの EcoR卜 Taql DNA断片を回収し、バキュロウィルス遺伝子組み換えべク タ一 PVL1393プラスミド（インビトロジェン社製）のポリヘドリン（Polyhedrin)遺伝子の転 写開始点の下流 5 '側 EcoRIおよび 3'側 Notl部位に、人為的に終始コドンを導入し た Taqト Notlアダプター（配列番号 53および配列番号 54に示した塩基配列を有する 合成 DNA)を用いて組み込み、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 3N発現ベクター pVL1393/Flt 3Nを作製した（図 19)。
(2)可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7 発現べクタ一の構築
ヒト VEGF受容体 Fit- 1の N末端アミノ酸から 1〜750番目（シグナル配列を含む）に 相当する可溶性ヒト VEGF受容体 Fk-1 断片（以下、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7Nと称す）を発現するためのベクタ一を以下の手順で作製した。可溶性ヒト VEGF受 容体 Fit- 1 7 は、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1の細胞外領域の 7個のィムノグロブ リン様部位に相当する。
配列番号 55および配列番号 56に示した塩基配列を有するプライマー 10 pmol、 flt#3-7クロ一ン [Oncogene, δ, 519,(1990)] DNA 10 ng、および、 10 mM デォキシヌク レオチド三リン酸（deoxynucleotide triphosphates)を含む 10 mM MgCl2、 0.001% (W/V)ゼラチン溶液 100 μ 1に 2.5 units Taqポリメラーゼを加えた。反応は 95°Cで 5 分間の前処理した後に、 95°Cで 90 秒間、 50°Cで 90秒間、最後に 72°Cで 90秒間の ポリメラ一ゼ'チェイン 'リアクション（PCR)を 30回繰り返し、 DNA断片を回収した。この DNA断片を Hindm ( #3- 7クロ一ンで 1893bpの位置）と Notlにより切断し、 610 bp の Hindlll- Notl DNA断片、すなわち flt#3- 7クローンで 1894- 2499bp断片と終始コド ンおよび Notl認識配列を含む DNA断片を回収した。次に、 flt#3 - 7クローンを EcoRl と Hindlllの両制限酵素により切断し、 5 '末端から 1893 bpの EcoRI- Hindlll断片を回 収した。続いて、 610 b の Hindlll- Notl DNA断片、および、 1893 bpの EcoRI - Hindlll断片をバキュロウィルス遺伝子組み換えべクタ一pVLl 393プラスミドのポリへド リン（Polyhedrin)遺伝子の転写開始点の下流 5 '側 EcoRlおよび 3 '側 Notl部位に組 み込み、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7N発現ベクター pVL1393/Flt 7Nを作製した (図 20)。
(3)昆虫細胞による可溶性ヒト VEGF受容体 Flt-1発現を行うための組み換えウィルス の作製
昆虫細胞による蛋白質の生産には目的遺伝子を組み込んだ組み換えウィルスの作 製が必要である力 その作製にはトランスファ一ベクタ一と呼ばれる目的蛋白質をコ一 ドする cDNAを特殊なプラスミドに組み込む過程と野生型ウィルスとトランスファ一べク ターを昆虫細胞にコトランスフエクシヨンし、相同組み換えにより組み換えウィルスを取 得する過程を経る。以上の過程についてファーミンジェン社製バキュロゴ一ルドスタ一 タ一キット（製品番号 PM-21001K)を用いてそのマニュアルに従い以下の手順で行つ た。
TMN-FHインセクトメディウム（ファーミンジェン社製）にて培養した昆虫細胞 Sf9 (フ ァ一ミンジェン社製）に線状バキュロウィルス DNA レ キュロゴールド'バキュロウィルス DNA(BaculoGold baculovirus DNA) 、ファーミンジェン社製]および作製したトランスフ ァ—ベクタ— DNA をリポフエクチン法にて導入すること [蛋白質核酸酵素、 ^1，
2701(1992)]により行い組み換えバキュロウィルスを以下のように作製した。
(2)で作製した pVL1393/Flt7Nあるいは（1)で作製した pVL1393/Flt3Nの 1 μ g と線状バキュロウィルス DNA の 20ngとを 12 μ 1の蒸留水に溶解し、さらにリポフエク チン 6 1 と蒸留水 6 μ 1 とを混和したものを加え室温で 15分間放置した。一方 Sf9 細胞 1 X 106個を 2mlの Sf900- II培地 [ギブコ (Gibco) 社製]に懸濁し、直径 35mmの細胞培養用プラスチックシャーレに入れた。ここに上記のプラスミド DNA 、線 状バキュロウィルス DNA およびリポフエクチン混和溶液全量を加え 27°Cで 3 日間培 養後、組み換えウィルスを含む培養上清 1mlを採取した。シャーレには新たに Sf900- II培地 1mlを加え、さらに 27°Cで 3日間培養し組み換えウィルスを含む培養上清をさ らに 1.5ml得た。
次に蛋白発現に用いるために得られた組み換えウィルスを以下の手順で増殖させた。 Sf9 細胞 2 X 107個を 10mlの Sf 00-Il培地に懸濁し、 175cm2フラスコ（グライナ一社 製）に入れて室温で 1 時間放置して細胞をフラスコに付着させた。放置後上清を除き 新たに mlの TMN-FHインセクトメディウムと上記の組み換えウィルスを含む培養上 清のうち 1mlを加え 27°Cで 3 日間培養した。培養後上清を 1 ,500 X gで 10分間遠心 分離して細胞を除き、蛋白質発現に使用する組み換えウィルス溶液を得た。
得られた組み換えウィルス溶液についてウィルスの力価をバキュロゴ一ルドスタータ —キット.マニュアル（ファーミンジェン社製）に記載の方法で算定した。
S 9 細胞 6 X 106個を 4ml の Sf900- II培地に懸濁し、直径 60mmの細胞培養用プラ スチックシャーレに入れ、室温で 1 時間放置して細胞をシャーレに付着させた。次に 上清を除き新たに SraOO- 11培地 400 μ 1 と Sf900- 11培地で 10，000倍に希釈した上 記組み換えウィルス溶液を加え室温で 1 時間放置した後、培地を除き 5mlの 1%低融 点ァガロース [ァガ一プラーク.ァガロース (Agarplaque Agarose),ファーミンジェン社 製]を含む培地 [滅菌した lml の 5%ァガ一プラークプラス'ァガ口一ス水溶液と 4ml の T N-FHインセクトメディウムを混和し、 42°Cに保温したもの]を該シャーレに流し込ん だ。室温で 15分間放置した後、乾燥を防ぐためビニルテープをシャーレにまき、密閉 可能なプラスチック製容器に該シャーレを入れ、 27°Cで 6日間培養した。該シャーレに 0.01% ニュートラルレッドを含む PBSlmlを加えさらに 1 日培養した後、出現したプラ 一クの数を数えた。以上の操作より該組み換えウィルス溶液はいずれも約 1 X 107PFLI /ml のウィルスを含んでいることがわかった。
(4)昆虫細胞における可溶性ヒト VEGF受容体 Flt_l 7Nおよび Fit- 1 3Nの発現、精 製
可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nおよび Fit- 1 3N は以下のようにして得た。 High Five細胞 4 X 10?個を 175cm2フラスコ（グライナ一社製）に EX- CELL™400培地（JRH Bioscience社製） 30mlに懸濁し、室温で 1時間放置し、フラスコに付着させた。（3)で 得られたトランスファーベクター pVL1393/Flt 7N および pVL1393/Flt 3N 由来の組 み換えウィルスを約 1〜3 X 108PFU /ml の濃度で含む溶液を lml加え、室温で 2時 間感染させた。培養上清を除き新たに 30mlの EX- CELL™400培地 30mlを加え 27°Cにて 3〜4日間培養した。培養終了後、培養上清を回収し 1，500 X gで 10分間 遠心分離を行い上清を得た。
カラムに約 60mlのへパリン一セファロ一ス CL- 6Bゲル [フアルマシア 'バイオテック (Pharmacia Biotech) AB社製]を充填し、 600mlの 20mMトリス一塩酸 (pH7.5)緩衝液 を用いて 0.5ml/分の流速でカラムを洗浄した。洗浄後、上記のように調整した可溶性ヒ ト VEGF受容体 Fit- 1 7 および Flt-1 3 を含む培養液 1000mlを 0.5ml/分の流速 でへパリン一セファロース CL- 6Bカラムに通塔した。さらに 600mlの 20mMトリス一塩 酸 (PH7.5)を用いて 0.5ml/分の流速で洗浄した後、濃度勾配が 0 M〜1.1Mの NaCl 含有 20mMトリス一塩酸 (pH7.5)からなる緩衝液を 600 ml通塔し、へパリン一セファロ ースに吸着した蛋白質の溶出を行うと共に 8mlずつ溶出液を分画した。各分画に含ま れる蛋白質を SD Sポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SD S- PAGE)にて解析し、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7 および Fit- 1 3 を含む分画を 60〜80ml回収し、セントリプレ ップ 10 (アミコン社製）を用いて濃縮した。濃縮後、可溶性のヒト Fit- 1 7 および Fit - 1 3Nを溶液としてそれぞれ 5ml および 13 ml (蛋白質濃度は 331 μ g/mlおよび 204 μ g/ml)得た。
(5)可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7Nおよび Fit- 1 3N の純度の確認
精製可溶性ヒト VEGF受容体 Fk - 17Nおよび Fit- 1 3Nの純度を SDS- PAGEを用 いて確認した。 SD S- PAGEは文献記載の方法 [Anticancer Research , 12, 1 121 (1992)]に従った。ゲルには 5〜20%グラジェントゲル（アト一社製）を用レ、、還元条件 下でレ一ンあたりの蛋白質量として 2 μ gの Fh- 1 7Nおよび Fit- 1 3N をそれぞれ泳 動し、クーマシ一ブリリアントブル一にて染色した。図 2 1に結果を示した。 Fit- 17Nおよ び Fit- 1 3 の純度は 95%以上であった。
(6)可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nおよび Flt_l 3Nの対照抗原蛋白質の精製 可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nおよび Fit - 1 3Nの対照抗原蛋白質（ネガティブ コント口一ル蛋白質）は以下のようにして得た。 High Five細胞 4 X 107個を 175cm2フラ スコ（グライナ一社製）に EX- CELL™400培地（JRH Bioscience社製） 30mlに懸濁し、 室温で 1時間放置し、フラスコに付着させ、 27°Cにて 3〜4日間培養した。培養終了後、 培養上清を回収し l，500 X g で 10分間遠心分離を行い上清を得た。
カラムにへパリン一セファロース CL- 6Bゲル [フアルマシア 'バイオテック (Pharmacia Biotech) AB社製]約 20mlを充填し、 200mlの 20mMトリス—塩酸 (pH7.5)緩衝液を用 いて 0.5ml/分の流速で洗浄した。洗浄後、上記のように調製した High Five細胞の培 養液 500ml を 0.5ml/分の流速でへパリン一セファロ一ス CL- 6Bカラムに通塔した。さ らに 200mlの 0.2M NaClを含む 20mMトリス—塩酸 (pH7.5)を用いて 0.5ml/分の流速 で洗浄した後、 1 M NaClを含む 20mMトリス-塩酸 (pH7.5)からなる緩衝液を 200 ml 通塔し、へパリン一セファロ一スに吸着した蛋白質を溶出した。 1M NaCl溶出画分をセ ントリプレップ 10 (アミコン社製)を用いて濃縮し対照抗原蛋白質を溶液として Ί ml( 蛋 白質濃度として 867 μ g/ml) 得た。 (7)可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7Nおよび Fit- 1 3N のヒト VEGF結合活性の確認 可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7 および Fit- 1 3Nのヒト VEGF結合活性を以下の 手順により確認した。
96ゥエル 'ィムオビロン™— Pフィルトレ一シヨン 'プレート（96- well Immobilon™-P Filtration Plate ；ミリポア社製）にメタノールを 100 μ 1/ゥエルで分注し、プレート底部 の PVDF膜を親水化した。水で洗浄後、 PBS希釈 2 μ g/ml可溶性ヒト Fit- 1 7Nを 50 μ 1/ゥュルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。洗浄後、 1 %牛血清アルブ ミン (BSA) を含む PBSを 100 μ ΐ/ ゥエル加え、室温 1時間反応させて残っている活 性基をブロックした。 PBSで洗浄後、（4)で取得した精製可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nおよび Fit - 1 3Nを 50 1/ゥエルで分注し（最終濃度！〜 1000 ng/ml)、さらに、 1251標識ヒト VEGF (最終濃度 3ng/ml :アマシャム社製）を 50 ゥエル加え、室温 で 1.5時間反応させた。 0.05%tween-PBS で洗浄後、 50°Cにてゥエルを乾燥させ、マ イク口シンチ- 0 (パッカ一ド社製）を 20 1/ゥエル加え、トップカウント（パッカ一ド社 製）を用いて、各ゥエルに結合した 1251標識ヒト VEGFの放射活性を測定した。
結果を図 22に示す。可溶性ヒト VEGF受容体 Flt-1 7Nおよび Fit- 1 3Nは濃度依 存的に 1251標識ヒト VEGFの可溶性ヒト Fit - 1 7 への結合を阻害することが示された。 可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nおよび Flt-1 3 は同程度のヒト VEGF結合活性を 示したことから、ヒト VEGFは Fit- 1 3N部分（シグナル配列を含む N末端アミノ酸から 1 から 338 番目）に結合することが明らかとなつた。
(8)昆虫細胞におけるヒト VEGFの発現
ヒト VEGFは以下のようにして得た。 High Five細胞 4 X 107個を 175cm2フラスコ（グラ イナ一社製）に EX- CELL™400培地 (JRH Bioscience社製） 30mlに懸濁し、室温で 1 時間放置し、フラスコに付着させた。文献 [Cell Growth & Differentiation, 7, 213 (1996)]記載の方法により得られたヒト VEGF組み換えバキュロウィルス溶液を約 1〜3 X 108PFU/mlの濃度で含む溶液を 1ml加え、室温で 2時間感染させた。培養上清を 除き新たに 30mlの EX-CELL™400培地 30mlを加え 27°Cにて 3〜4日間培養した。 培養終了後、培養上清を回収し 1 ,500 X gで 10分間遠心分離を行い上清を得た。 カラムに約 40mlのへパリンーセファロース Cし- 6Bゲル [フアルマシア 'バイオテック (Pharmacia Biotech) AB社製]を充填し、 400mlの 20mMトリス—塩酸 (pH7.5) 力 な る緩衝液を用いて 0.5ml/分の流速で洗浄した。洗浄後、上記のように調製したヒト
VEGFを含む培養液 1500mlを 0.5ml/分の流速でへパリン—セファロ一ス CL- 6Bカラ ムに通塔した。さらに 400mlの 20mMトリス一塩酸 (ρΗ7·5)を用いて 0.5ml/分の流速で 洗浄した後、 0.2 、 0.5 および 1Mの NaCl含有 20mMトリス—塩酸 (ρΗ7·5)からなる 緩衝液各 120 mlを順次通塔し、へパリ 一セファロ一スに吸着した蛋白質を段階的に 溶出を行うと共に 8mlずつ溶出液を分画した。各分画に含まれる蛋白質を SDSポリア クリルアミドゲル電気泳動にて解析し、ヒト VEGFを含む分画（0.5〜1 MNaCl画分）を 120ml回収した。セントリプレップ- 10 (アミコン社製）で濃縮後、ヒト VEGFを溶液として 4ml (蛋白質濃度 1.2 mg/ml)得た。
2.動物の免疫と抗体産生細胞の調製
1 (4)より得られた各種抗原 50 μ gをそれぞれアルミニウムゲル 2mg および百日咳 ワクチン（千葉県血清研究所製） 1 X 109細胞とともに 5 週令雌 BALB/c (日本 SLC社 製）、 B6C3F1マウス（日本チャールズリバ一社製）あるいは雌 SDラット（日本 SLC社 製）に投与し、 2 週間後より 10〜50 μ gの蛋白質を 1 週間に 1 回、計 4 回投与した。 また、 NIH3丁 3-Flt- 1細胞 I X 107個を 5 週令雌 BALBん（日本 SLC社製） 3匹に投与 し、計 6回投与した。眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、その血清抗体価を以下に 示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスあるいはラットから最終免 疫 3日後に脾臓を摘出した。なお、 NIH3T3- F - 1細胞を投与した 5週令雌 BALB/c では免疫が力からず、可溶性 Fit- 1 7Nに対する抗体価は上昇しなかった。
脾臓を MEM 培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離
(l，200rpm、 δ 分間）した後、上清を捨て、トリスー塩化アンモニゥム緩衝液 (ρΗ7.65) で 1 〜2 分間処理し赤血球を除去し、 MEM 培地で 3回洗浄し、細胞融合に用いた。
3.酵素免疫測定法
1 (4)で得られた可溶性ヒト Flt-1 7Nおよび Flt-1 3 を免疫したマウスあるいはラット に由来する抗血清およびハイプリドーマの培養上清の測定に関しては、抗原として、 1 (4)の昆虫細胞培養上清より得られた可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nおよび Fit- 1 3Nを用いた。 96ゥエルの EIA用プレート（グライナ一社製）に、 PBS 希釈 1 〜10 μ g/ml可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7N、 Flt-1 3 および対照抗原として 1 (6)で得ら れた High Five細胞培養上清のへパリンカラム吸着画分を、それぞれ 50 μ 1/ゥェル で分注し、 4 °Cでー晚放置して吸着させた。洗浄後、 1 %牛血清アルブミン (BSA) を 含む PBS を 100 μ \/ ゥエル加え、室温 1時間反応させて残っている活性基をブロッ クした。 1%BSA-PBS を捨て、被免疫マウスあるいは被免疫ラット抗血清およびハイプリ ド一マの培養上清を 50 μ 1/ゥエルで分注し 2 時間反応させた。 0.05%tween-PBSで 洗浄後、ペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗マウスィムノグロブリンあるいはペルォキシダ ーゼ標識ゥサギ抗ラットイムノグロブリン（ともに DAKO社製）を 50 μ 1/ゥエルで加えて 室温、 1 時間反応させ、 0.05% tween-PBSで洗浄後 ABTS基質液 [2.2-アジノビス（3- ェチルベンゾチアゾール -6-スルホン酸）アンモニゥム]を用いて発色させ OD415nm の吸光度 E max [モレキュラー 'デバイシ一ズ（Molecular Devices)社製]を測定した。
4.マウス骨髄腫細胞の調製
8 -ァザグァニン耐性マウス骨髄腫細胞株 P3-し' 1 を正常培地で培養し、細胞融合時 に 2 X 107以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
5.ハイブリド一マの作製
2で得られたマウス脾細胞またはラット脾細胞と 4で得られた骨髄腫細胞とを 10:1に なるよう混合し、遠心分離（l，200rpm、 5 分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群を よくほぐした後、攪拌しながら、 37。Cで、ポリエチレングライコ一ルー 1000(PEG-1000)2g、 MEM 培地 2mlおよび DMSO 0.7mlの混液 0.2〜lml/108マウス脾細胞を加え、 1〜2 分間毎に MEM培地 l〜2mlを数回加えた後、 MEM培地を加えて全量が 50mlになる ようにした。遠心分離（900rpm、 5分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、 メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞を HAT培地 100ml中に懸濁した。 この懸濁液を 96ゥエル培養用プレートに 100 μ 1/ゥエルずつ分注し、 5%C〇2インキ ュベータ一中、 37°cで 10〜14日間培養した。この培養上清を実施例 1の 2(3)に記載 した酵素免疫測定法で調べ、 1 (4)で得られた可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nある いは Fit- 1 3Nに特異的に反応し、かつ 1 (6)で得られた対照抗原に反応しないゥェル を選び、さらに HT培地と正常培地に換え、 2 回クローニングを繰り返して、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株を確立した。以下 にその結果を示す。 第 3 表
M物 免疫原 スクリ一ニング原 スクリーニング 611 したハイブリ ドーマ ί
したウェル^
Baib/cマウス 3 NIH3T3- Fit— 1 Fit 7N
SDラッ卜 1 Fit 7N Fit 7N 1008 3 (K 1733, 1735, 1736)
Balb/cマウス 1 Fit 7N Fit 7N 672 5 (KM1 737, 1739, 1740,
1742, 1 743)
SDラッ卜 1 Fit 7N Fit 7N 1 176 3 (K 1 745, 1 746, 1747)
B3C3F1マウス 1 Fit 7N Fit 3N 672 3 (KM1 74S, 1749, 1750)
Balb/cマウス 1 Fit 7N Fit 3N 420 3 (ΚΜ1 730, 1731 , 1732)
1 (4)で得られた可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1 7Nを免疫した Balb/cマウス 1匹、 あるいは SDラット 2匹から得られたハイプリドーマを可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7Nを用いてそれぞれ約 672ゥエルおよび約 2184ゥエルずつスクリーニングした結果、 それぞれ 5クローンおよび 6クローンの抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体 を得、これらをそれぞれ KM1737、 K 1739, M1740, KM1742, KM 1743および
M1733, M1735, KM1736、 KM 1745, KM1746, KM1747と命名した。これらのクロ一 ンの中で、 8〖こ示したヒト VEGFの Fit- 1結合阻害作用を示すものはなかった。さらに、 KM1735, M1736, M1742, KM1743および KM1745は後記 10で示す免疫細胞染 色法にぉレ、てヒト VEGF受容体 Fit- 1発現細胞と反応したが、 M1730, K 1731およ び KM1732に比較して極めて弱いものであった。
一方、 1 (4)で得られた可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 7Nを免疫した B3C3F1マウス 1匹、および、 Balb/cマウス 1匹から得られたノヽイブリドーマを 1 (4)で得られた可溶性 ヒト VEGF受容体 Fit- 1 3 を用いてそれぞれ約 672ゥエルおよび 420ウェルスクリー ニングした結果、それぞれから 3クローンずつ抗ヒト VEGF受容体 Flt-1モノクロ一ナ ル抗体を得、これらをそれぞれ KM1748、 M1749, KM 1750および KM1730、
KM1731、 KM1732と命名した。これらクローンの中で後記 8で示したヒト VEGFの Fit- 1結合阻害作用を示すものとして KM1732、 KM 1748および KM1750の 3クローンが 認められた。さらに、 M1730, KM1731および KM1732の 3クローンは後記 10で示 す免疫細胞染色法においてヒト VEGF受容体 Fk-1発現細胞に極めて強く反応した。 モノクローナル抗体の抗体クラスはサブクラスタイピングキット [ザィメッ MZymed )社 製]を用いた酵素免疫測定法を行った。その結果を以下の第 4表に示す。 第 4 表
モノクローナル伉体 抗体サブクラス
KM 1733 マウス lgG2a
KM 1735 ラッ卜 IgGI
KM 1736 ラッ卜 lgG2a
KM 1737 マウス IgGI
KM! 739 マウス IgGI
KM 1740 マウス IgGI
KM 1742 マウス IgGI
KM 1743 マウス igG1
KM 1745 ラッ卜 lgG2a
KM 1746 ラッ卜 IgGI
KM 1747 ラッ卜 IgGI
KM 1748 マウス lgG2b
KM 1749 マウス IgGI
KM 1750 マウス lgG2b
KM 1730 マウス IgGI
KM1731 マウス lgG2a
KM 1732 マウス IgGI
本発明で確立したモノクローナル抗体はすべて Gクラスであった。
6.モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した 8 週令ヌード雌マウス（Balb/c)に 5で得られたハイブリドーマ株 を 5 〜20X 106細胞 匹それぞれ腹腔内に注射した。 10〜21 日後に、ハイプリドーマ は腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（1 〜8ml/ 匹）し、遠心分 離 (3，00( pm、 5分間）して固形分を除去した後力プリル酸沈殿法（アンチボディ一ズ' ァ 'ラボラトリ一.マニュアル）により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
7.モノクローナル抗体の特異性の確認
5で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクロ一ナル抗体の特異性を 3に記載した 酵素免疫測定法を用いて確認した。
結果を図 23に示す。 Flt-17Nを免疫したマウス、ラットよりハイブリドーマを作製し、 Flt-1 7Nを用いて選択したモノクローナル抗体 (KM1733、 M1735, 1736, KM1737、 KM1739、 KM1740、 M1742, KM1743、 KM1745, M1746, KM1747)の中 で、 KM1740だけは Fit- 1 7 および Fit- 1 3 に反応したことから、 Flt-1の N末端アミ ノ酸（シグナル配列を含む）から 1〜338 番目に存在するェピトープを認識していること が明らかとなった。残りの 10クローンは、 Flt-1 7 には反応するが Fit- 1 3Nには反応 しないことから、 Flt-1の N末端アミノ酸（シグナル配列を含む）から 339〜750番目に 存在するェピトープを認識していることが明らかとなった。一方、 Fit - 1 7Nを免疫したマ ウスよりハイプリドーマを作製し、 Flt-1 3Nを用いて選択した 6種のモノクロ一ナル抗 体 (KM1748、 KM 1749, KM1750, KM1730、 KM1731, K 1732) はすべて、 Flt-1 7N および Fit - 1 3Nに反応したことから、 Flt-1の N末端アミノ酸（シグナル配列を含む）か ら 1〜338番目に存在するェピトープを認識していることが明らかとなった。
8.抗 Flt-1 モノクローナノレ抗体によるヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Flt-1の結合阻 害活性の確認
5 で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit— 1 モノクローナノレ抗体のヒト VEGFとヒ卜 VEGF受容体 Fit- 1 の結合阻害活性を以下の手順に従レ、確認した。
96ゥエル.マルチスクリ一ン一 IPプレート（96- well MultiScreen - IP Plate;ミリポア社 製）にメタノールを 100 μ 1/ゥエルで分注し、プレート底部の PVDF膜を親水化した。 水で洗浄後、 PBSで 1.6 /z g/mlの濃度に希釈した可溶性ヒト VEGF受容体 Flt_l 7N を 50 μ 1/ゥエルで分注し、 4 °Cで一晩放置して吸着させた。洗浄後、 1%牛血清アル ブミン (BSA) 含有 PBSを 50 /il/ ゥェル加え、室温 1 時間反応させて残っている活 性基をブロックした。 PBS で洗浄後、ハイブリド一マの培養上清あるいは 0.5M NaCl を含む 1%BSA-PBS溶液で希釈した精製モノクローナル抗体（0.01〜7·29 μ g/ml)を 50 μ 1/ゥエルで分注し、さらに、 3ng/mlの 12 標識ヒト VEGF (アマシャム社製）を 50 μ\/ ゥヱル加え室温で 1.5 時間反応させた。 0.05%tween-PBSで洗浄後、 50°Cにてゥ エルを乾燥させ、マイクロシンチ -〇（パッカ一ド社製）を 30 μ 1/ゥエル加え、トップカウ ント（パッカ一ド社製）を用いて、各ゥエルに結合した1251標識ヒト VEGFの放射活性を 測定した。
ノ、イブリドーマの培養上清の活性を検討した結果を図 24 に示す。確立した 17種の モノクローナル抗体の中で、 3 種のモノクローナル抗体 KM1748、 KM1750、 M1732 力 それぞれ阻害率 62.6。/0、 66.3%、 83.1 %でヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit- 1の 結合を阻害した。
通常、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニング方法としては、免疫原 に用いた抗原と同一蛋白質で行う。今回、免疫原として用いた Flt_l 7Nで選択された 計 11種のモノクローナル抗体は全く結合阻害活性を示さず、 Fit - 1 3Nで選択された 6 種のモノクローナル抗体（KM1748、 KM1749, KM1750、 KM1730、 KM1731、 M 1732) のうち、 KM1748、 KM1750および KM1732については結合阻害活性を示していた。ノヽ イブリドーマのスクリーニングに Flt_l 3Nを用いたことにより、結合阻害活性を有するモ ノクローナル抗体が取得できたことは、予想外の効果であった。そして、 Flt_l 3Nが結 合阻害活性を有するモノクローナル抗体の確立に非常に重要であることが示された。 精製した抗 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1732、 KM1748、 KM 1750を用いて結合阻 害活性を検討した結果を図 25に示す。 KM1732、 KM1748、 KM1750は濃度依存的に ヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit— 1の結合を阻害した。ヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Flt-1の結合の 50%阻害を示す KM1732、 KM1748、 KM1750の濃度（IC50)は 1.1 μ g/ml、 1.3 μ g/mU 2.0 μ g/mlであった。一方、コントロールとして使用したマウス IgGlクラスである抗シァリルルイス Aモノクロ一ナル抗体 KM231 [Anticancer
Research, ^O, 1579 (1990) ]は全く阻害活性を示さな力 >った。
9.抗 Flt-1モノクロ一ナノレ抗体によるヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Flt-1発現細胞の 結合阻害活性の確認
抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1732、 KM 1748および KM1750に よるヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fit - 1の結合阻害活性を以下の手順に従い確認し た。
96ゥエル'マルチスクリーン一HVプレート（96— well ultiScreen-HV Plate ;ミリポア 社製）に 1 %牛血清アルブミン (BSA) を含む PBS を 100 μ \/ ゥエル加え、室温 1 時間反応させてゥエル中の活性基をブロックし、 0.05%NaN3を含む 1%BSA- PBSに懸 濁した NIH3T3- Fit - 1細胞を 5 X 104個/ゥエル加えた。 1%BSA- PBSで洗浄後、精製 モノクローナル抗体（0.01〜7.29 μ g/ml)を 50 μ 1/ゥエルで分注し、さらに、 3ng/ml の1251標識ヒト VEGF (アマシャム社製）を 50 μ \/ ゥヱル加え、氷上で 2 時間反応さ せた。 PBS で洗浄後、 50°Cにてゥエルを乾燥させ、マイクロシンチ- 0 (パッカード社 製）を 30 μ 1/ゥエル加え、トップカウント（パッカード社製）を用いて、各ゥエルに結合し た 1251標識ヒト VEGFの放射活性を測定した。
精製した抗 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1732、 KM1748, KM1750を用いて結合阻 害活性を検討した結果を図 26に示す。 M1732, KM1748、 KM1750は濃度依存的に ヒト VEGFと NIH3T3— Fit— 1細胞への結合を阻害した。ヒト VEGFと NIH3T3— Flt—l細 胞の結合の 50%阻害を示す KM1732、 M1748, KM1750の濃度（ICS0)は Ο.ΟδΟ μ g/mU 0.037 μ g/ml、 0.041 μ g/mlであった。一方、コントロールとして使用したマウス IgG lクラスである抗シァリルルイス Aモノクローナル抗体 KM231は全く阻害活性を示 さなかった。
10.モノクローナル抗体のヒト VEGF受容体 Flt-1発現細胞との反応性の確認
5で得られた抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体の特異性を免疫細胞染 色を用いて以下の手順に従い確認した。
ヒト VEGF受容体 Fit- 1発現 NIH3T3細胞 (NIH3T3 - Fit- 1)、コントロール N1H3T3細 胞 (NIH3T3 - Neo) [Oncogene, 10, 135 (1995)] 5 X 106個を丸底 96ゥエルプレートに免 疫細胞染色用緩衝液（1%BSA 、 0.02%EDTA 、 0.05%アジ化ナトリウムを含む PBS) 100 μ 1 に懸濁して分注した。 4°C、 350 X gで 1分間遠心分離後、上清を除き、ハイ プリドーマ培養上清あるいは精製抗体（10 μ g/ml) 50 μ 1を加えて 4 °Cで 30分間反 応させた。反応後、 200 /i lの免疫細胞染色用緩衝液を各ゥエルに加え 4 °C、 350 X g で 1 分間遠心分離後、上清を除き細胞の洗浄を行った。この洗浄操作をさらに 2 回 行った後、 FITC標識抗マウスィムノグロブリン抗体あるいは FITC標識抗ラットイムノグ ロブリン抗体（和光純薬社製）を 1 μ g/mlの濃度で含む免疫細胞染色用緩衝液 50 μ 1 を加えて 4 で 30分間反応させた。反応後、上記と同様の洗浄操作を 3回行つ た後フローサイトメ一ター（コールター社製）を用いて解析を行った。
結果を図 27に示す。抗ヒト VEGF受容体 Flt_lモノクローナル抗体 KM1730、 KM1731および KM1732はコントロール細胞には反応せず Flt-Ι発現細胞に特異的 に顕著に反応した (A)。また、精製抗体である抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクロ一ナ ル抗体 ΚΜ1748 (10 μ g/ml)およびハイプリドーマ培養上清 KM1748もコントロール細 胞には反応せず Fit- 1 発現細胞に特異的に顕著に反応した (B)。この結果、モノクロ —ナル抗体 KM1730、 M1731 , 1732, KM 1748および KM1750は細胞表面上の ヒト VEGF受容体 Fit- 1を特異的に認識することが明らカ^なつた。一方、 KM1735、 M1736, KM1742, KM1743および KM1745はヒト VEGF受容体 Fit- 1発現細胞と反 応したが、 KM1730、 M1731 , KM1732, KM1748および KM1750に比較して極めて 弱いものであった。
1 1.モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法によるヒト VEGF受容体 Fit- 1の 検出
NIH3T3- Fit- 1細胞、コントロール NIH3T3細胞 (N1H3T3- Neo)より、文献記載の方法 [Cancer Research, 46, 4438 (1986) ]に従い細胞膜成分を調製し、 SDS-PAGE法に より泳動した。 SDS- PAGEは文献記載の方法 [Anticancer Research, 12^ 1121 (1992)]に従レ、、ゲルには 5〜20%グラジェントゲル（アト一社製）を用レ、、還元条件下 でレーンあたりの蛋白質量として 15 μ gの細胞膜成分を泳動した。泳動された蛋白質 を文献記載の方法 [Anticancer Research, 12, 1121(1"2)]に従い、 PVDF膜にトラン スファーした。続いて、 PVDF膜を 1 %BSAを含む PBSに室温で 30分間反応させブロ ッキング操作を行い、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1737の培養 上清を 4°Cにて 1晚反応させた。 0.05% Tweenを含む PBSで洗浄し、ペルォキシダー ゼ標識したャギ抗マウス lgG [5，000倍希釈:ケミコン (Chemicon)社製]を室温で 2時 間反応させた。 0.05% Tweenを含む PBSで洗浄し、 ECL™ウェスタンブロッテイングデ ィテクシヨンリア一ジェンッ (ECL™ Western blotting detectionreagents； アマシャム 社製)を用いて、抗ヒト VEGF受容体 Fit - 1モノクローナル抗体 KM1737が結合したバ ンドを検出した。
図 28に結果を示す。抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1737は、 NIH3T3- Fit- 1細胞に発現している分子量 180キロダルトンのヒト VEGF受容体 Fit - 1 を特異的に検出できることが明らかとなった。
12.モノクローナル抗体を用いた可溶性ヒト VEGF受容体 Flt-1の検出
96ゥエルの EIA用プレート（グライナ一社製）に、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクロ ーナル抗体 KM1732を PBSで 10 μ g/mlの濃度に希釈し、 50 μ 1/ゥェルずつ分注 し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。洗浄後、 1%牛血清アルブミン (BSA) を含む PBSを 100 μ \/ゥェル加え、室温 1 時間反応させて残っている活性基をブロックした。
1%BSA- PBSを捨て、 1%BSA-PBSで 1000〜0.0056ng/mlの濃度に希釈した 1(4)で得 られた精製可溶性ヒト VEGF受容体 Flt_l 7Nおよび Fit- 1 3Nを 4 °Cでー晚反応さ せた。 0.05%tween-PBS で洗浄後、公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊 1985年） でピオチン標識した抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1730を 1 % BSA-PBS で 0.1 μ g/mlの濃度に希釈して 50 μ 1/ゥエルずつ加えて室温にて 2 時 間反応させた。 0.05%tween- PBS で洗浄後、 1%BSA- PBS にて 4,000 倍に希釈した アビジン標識ペルォキシダ一ゼ（ベクタ一社製）を 50 μ 1/ゥエルで加えて室温にて 1 時間反応させた。 0.05%tween-PBS で洗浄後 ABTS基質液 [2.2-アジノビス（3-ェチ ルベンゾチアゾ一ル- 6- スルホン酸）アンモニゥム]を用いて発色させ OD415nm の吸 光度を E max (モレキュラーデバイシーズ社製）を用いて測定した。
結果を図 29に示す。この結果、抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1732およびビォチン標識抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1730 を用いることにより可溶性ヒト VEGF受容体 Fit - 1 3Nは 0.46 ng/mlより、 Fit- 1 7Nは 1.37 ng/mlより測定することができることが明らかとなった。
13.抗 VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体を用いた VEGF依存性細胞遊走抑制 試験
in vitroにおける血管新生活性の指標である VEGF依存的なヒト血管内皮細胞の遊 走活性に及ぼす抗 VEGF受容体 Fit - 1モノクローナル抗体の効果を検討した。
細胞遊走試験は Satoらの方法 [J. Cell Biology, 107, 1199 (1988)]に従い行った。 3.5cmのディッシュでコンフルェントになるまで培養した HUVECを力ミソリ刃で傷をつ けた後 PBSで洗浄した。 5%FCSを含む M- 199培地を 1.5ml加え、さらに VEGF (終 濃度 lOng/ml)および 5で得られた抗 VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1750 または KM1732 (終濃度 0、 1、 10 μ g/ml)を添加し、 24時間培養した。培養後、傷付 けた位置より遊走した細胞数を測定した。
その結果、 HUVECは VEGF添加により細胞遊走能が上昇したが、抗 VEGF受容体 Fit - 1モノクロ一ナル抗体 KM1750または KM1732 (終濃度 1 β g/ml)により完全に遊 走が阻害された。従って、 Fit- 1は血管内皮細胞の遊走に関わる主な受容体であるこ とが示された。
図 47は抗 VEGF受容体 Flt_lモノクローナル抗体 KM1750および KM1732の血管 内皮細胞の遊走阻害活性を比較した結果を示した。モノクローナル抗体濃度 0.1〜1 μ g/mlにおいて 2つのモノクローナル抗体は濃度依存的に血管内皮細胞の遊走阻 害活性を示した。
以上から、抗 VEGF受容体 Flt-1モノクロ一ナル抗体により、 VEGFにより誘導され る血管内皮細胞の遊走が完全に阻害されることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明により、新生ヒト血管内皮細胞上に特異的に発現されていると考えられるヒト VEGF受容体 Flt-1 に特異的に結合する遺伝子組換え抗体が提供される。また、本発 明により、ヒト VEGF受容体 Fit- 1に対する中和活性を有する遺伝子組換え抗体が提 供される。本発明の遺伝子組換え抗体は癌、糖尿病性網膜症等の血管新生を伴う疾 患の診断、治療等に有用であり、特にヒトにおいてはマウスモノクローナル抗体よりも免 疫原性が低ぐその効果が長期にわたり持続することが期待される。 配列表フリーテキスト
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配列番号 86—人工配列の説明 ：ヒト化抗体重鎖可変領域 配列番号 87—人工配列の説明：ヒト化抗体軽鎖可変領域 配列番号 88—人工配列の説明：ヒト化抗体重鎖可変領域 配列番号 89—人工配列の説明：ヒト化抗体軽鎖可変領域 配列番号 90—人工配列の説明：ヒト化抗体重鎖可変領域 配列番号 91一人工配列の説明：ヒト化抗体重鎖可変領域 配列番号 92—人工配列の説明：ヒト化抗体軽鎖可変領域 配列番号 93—人工配列の説明：ヒト化抗体軽鎖可変領域 配列番号 94一人工配列の説明：ヒト化抗体軽鎖可変領域 配列番号 95—人工配列の説明：ヒト化抗体重鎖可変領域 配列番号 96—人工配列の説明：ヒト化抗体軽鎖可変領域

Claims

請求の範囲
1. ヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応する遺伝子組換え抗体。
2. ヒト VEGF受容体 Fit - 1のシグナル配列を含む N末端アミノ酸から 750番目に存 在するェピトープを認識する請求の範囲 1記載の遺伝子組換え抗体。
3. ヒト VEGF受容体 Fit- 1のシグナル配列を含む N末端アミノ酸から 338番目に存 在するェピト一プを認識する請求の範囲 1記載の遺伝子組換え抗体。
4. ヒト VEGF受容体 Flt-1のシグナル配列を含む N末端アミノ酸から数えて 100〜 204番目に存在するェピトープを認識する請求の範囲 1記載の遺伝子組換え抗体。
5. ヒト VEGFのヒト VEGF受容体 Flt-1への結合を阻害し、力っヒト Fit— 1に対する 中和活性を有する請求の範囲 1記載の遺伝子組換え抗体。
6. 遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体、抗体断片から選ばれる請求の範囲 1記載の抗 体。
7. ヒト化抗体が、ヒト抗体 IgG 型に属する請求の範囲 6記載の抗体。
8. ヒト化抗体がヒト型キメラ抗体またはヒト型 CDR移植抗体である、請求の範囲 6記載 の抗体。
9. ヒト化抗体の抗体重鎖（H 鎖）可変領域 (V 領域)の相補性決定領域（CDR)が、配 列番号 5、 6および 7記載のアミノ酸配列または配列番号 11、 12および 13記載のアミ ノ酸配列を含む請求の範囲 8記載のヒト化抗体。
10. ヒト化抗体の抗体軽鎖（L鎖) V領域の相補性決定領域が、配列番号 8、 9および 10記載のアミノ酸配列または配列番号 14、 15および 16記載のアミノ酸配列を含む請 求の範囲 8記載のヒト化抗体。
11. ヒト型キメラ抗体力 ヒト VEGF受容体 Fit - 1 に特異的に反応するモノクローナル 抗体の抗体重鎖 (H鎖）可変領域 (V領域)および抗体軽鎖 (L鎖) V領域と、ヒト抗体の H鎖定常領域 (C領域)および L鎖 C領域とからなる、請求の範囲 8記載のヒト型キメラ 抗体。
12. H 鎖 V 領域および L 鎖 V 領域のアミノ酸配列が、モノクローナル抗体 KM1732(FERM BP - 5698)またはモノクローナル抗体 KM1750(FERM BP- 5700)から選 ばれるモノクローナル抗体の H鎖 V領域およびし鎖 V領域のアミノ酸配列と同じアミ ノ酸配列を有する、請求の範囲 1 1記載のヒト型キメラ抗体。
13. H鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 86または 88に記載されたアミノ酸配列で ある、請求の範囲 1 1記載のヒト型キメラ抗体。
14. L鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 87または 89に記載されたアミノ酸配列で ある、請求の範囲 1 1記載のヒト型キメラ抗体。
15. H鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 86記載のアミノ酸配列を含み、 L鎖 V領 域のアミノ酸配列が配列番号 87のアミノ酸配列を含む請求の範囲 1 1記載のヒト型キメ ラ抗体。
16. H鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 88記載のアミノ酸配列を含み、 L鎖 V領 域のアミノ酸配列が配列番号 89のアミノ酸配列を含む請求の範囲 1 1記載のヒト型キメ ラ f几^。
17. ヒト VEGF受容体 Fit- 1に特異的に反応するヒト型キメラ抗体力 KM2532および KM2550から選ばれる請求の範囲 1 1記載のヒト型キメラ抗体。
18. 請求の範囲 1 1〜： 17のいずれ力 項に記載のヒト VEGF受容体 Fit- 1に特異的に 反応するヒト型キメラ抗体をコードする DNA。
19. 請求の範囲 18記載の DNAとタンデムカセットベクタ一 pKANTEX93とを含有する 組換えベクター。
20. 請求の範囲 19記載の組換えべクタ一を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
21. 請求の範囲 20記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求の範囲 1 1〜 17記載のヒト型キメラ抗体を生成蓄積させ、該培養物から該抗体を採取することを特 徴とする抗体の製造方法。
22. ヒト型 CDR移植抗体がヒト VEGF受容体 Fit- 1に特異的に反応するモノクローナ ル抗体の H鎖および L鎖の V領域相補性決定領域と、ヒト抗体の H鎖およびし鎖の C領域および V領域フレームワーク領域とからなる抗体である請求の範囲 8記載のヒト 型 CDR移植抗体。
23. ヒト型 CDR移植抗体の H鎖の V領域相補性決定領域が、配列番号 5、 6および 7または配列番号 1 1、 12および 13である、請求の範囲 22記載のヒト型 CDR移植抗 体。
24. ヒト型 CDR移植抗体の L鎖の V領域相補性決定領域が、配列番号 8、 9および 10記載のアミノ酸配列または配列番号 14、 15および 16記載のアミノ酸配列である、 請求の範囲 22記載のヒト型 CDR移植抗体。
25. ヒト型 CDR移植抗体が、配列番号 5、 6および 7記載のアミノ酸配列を抗体可変 領域重鎖の相補性決定領域として含み、かつ配列番号 8、 9および 10記載のアミノ酸 配列を抗体可変領域軽鎖の相補性決定領域として含む、請求の範囲 22記載のヒト型 CDR移植抗体。
26. ヒト型 CDR移植抗体が、配列番号 11、 12および 13記載のアミノ酸配列を抗体 可変領域重鎖の相補性決定領域として含み、かつ配列番号 14、 15および 16記載の アミノ酸配列を抗体可変領域軽鎖の相補性決定領域として含む、請求の範囲 22記載 のヒト型 CDR移植抗体。
27. H鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 90記載のアミノ酸配列を含み、し鎖 V領 域のアミノ酸配列が配列番号 92記載のアミノ酸配列を含む、請求の範囲 22記載のヒト 型 CDR移植抗体。
28. H鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 91または配列番号 95のアミノ酸配列を 含み、 L鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 93、配列番号 94または配列番号 96の アミノ酸配列を含む、請求の範囲 22記載のヒト型 CDR移植抗体。
29. ヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応するヒト型 CDR移植抗体が、 KM8550, KM8551、 K 8552, K 8553, K 8554および KM8555から選ばれる請求の範囲 22記 載のヒト型 CDR移植抗体。
30. 請求の範囲 22〜29のいずれ力 1項に記載のヒト VEGF受容体 Fit- 1に特異的に 反応するヒト型 CDR移植抗体をコードする DNA。
31. 請求の範囲 30記載の DNAとタンデムカセットベクタ一 pKANTEX93とを含有する 組換えベクター。
32. 請求の範囲 31記載の組換えべクタ一を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
33. 請求の範囲 32記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求の範囲 22〜 29記載のヒト型 CDR 移植抗体を生成蓄積させ、該培養物から該抗体を採取すること を特徴とする抗体の製造方法。
34. 抗体断片が、 Fab, Fab'、 F(ab，)2、一本鎖抗体およびジスルフイド安定化 Fv 力 なる群より選ばれるいずれか 1つである、請求の範囲 6記載の抗体。
35. 一本鎖抗体が、抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域を含む、請求の範囲 34 記載の一本鎖抗体。
36. 一本鎖抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域のアミノ酸配列力 ヒト VEGF受容 体 Fit - 1に特異的に反応するモノクローナル抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域の アミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、請求の範囲 35記載の一本鎖抗体。
37. 一本鎖抗体の H鎖 V領域および丄鎖 V領域の相補性決定領域のアミノ酸配列 ifi、ヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応するモノクローナル抗体の H鎖 V領域 およびし鎖 V領域の相補性決定領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、請 求の範囲 35記載の一本鎖抗体。
38. 一本鎖抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域のアミノ酸配列が、配列番号 86お よび 87である、請求の範囲 36記載の一本鎖抗体。
39. 一本鎖抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域のアミノ酸配列が、配列番号 88お よび 89である、請求の範囲 36記載の一本鎖抗体。
40. 一本鎖抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域の相補性決定領域のアミノ酸配列 、配列番号 5、 6および 7記載のアミノ酸配列を抗体可変領域重鎖の相補性決定領 域として含み、かつ配列番号 8、 9および 10記載のアミノ酸配列を抗体可変領域軽鎖 の相補性決定領域として含む、請求の範囲 37記載の一本鎖抗体。
41. 一本鎖抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域の相補性決定領域のアミノ酸配列 力 配列番号 11、 12および 13記載のアミノ酸配列を抗体可変領域重鎖の相補性決 定領域として含み、かつ配列番号 14、 15および 16記載のアミノ酸配列を抗体可変領 域軽鎖の相補性決定領域として含む、請求の範囲 37記載の一本鎖抗体。
42. 一本鎖抗体の H鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 90記載のアミノ酸配列を含 み、 L鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 92 記載のアミノ酸配列を含む、請求の範 囲 37記載の一本鎖抗体。
43. 一本鎖抗体の H鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 91または配列番号 95のァ ミノ酸配列を含み、 L鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 93、配列番号 94または配 列番号 96のアミノ酸配列を含む、請求の範囲 37記載の一本鎖抗体。
44. ジスルフイド安定化抗体が、抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域を含む、請求 の範囲 34記載のジスルフイド安定化抗体。
45. ジスルフイド安定化抗体の H鎖 V領域およびし鎖 V領域のアミノ酸配列が、そ れぞれヒト VEGF受容体 Fit - 1 に特異的に反応するモノクローナル抗体の H鎖 V領 域および L鎖 V領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、請求の範囲 44記載 のジスルフイド安定化抗体。
46. ジスルフイド安定化抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域の相補性決定領域の アミノ酸配列が、それぞれヒト VEGF受容体 Flt-1に特異的に反応するモノクローナル 抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域の相補性決定領域のアミノ酸配列と同じアミノ 酸配列を有する、請求の範囲 44記載のジスルフイド安定化抗体。
47. ジスルフイド安定化抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域のアミノ酸配列が、そ れぞれ配列番号 86および 87である、請求の範囲 45記載のジスルフイド安定化抗体。
48. ジスルフイド安定化抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域のアミノ酸配列が、そ れぞれ配列番号 88および 89である、請求の範囲 45記載のジスルフイド安定化抗体。
49. ジスルフイド安定化抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域の相補性決定領域の アミノ酸配列が、配列番号 5、 6および 7記載のアミノ酸配列を抗体可変領域重鎖の相 補性決定領域として含み、かつ配列番号 8、 9および 10記載のアミノ酸配列を抗体可 変領域軽鎖の相補性決定領域として含む、請求の範囲 46 記載のジスルフイド安定化 抗体。
50. ジスルフイド安定化抗体の H鎖 V領域およびし鎖 V領域の相補性決定領域の アミノ酸配列が、配列番号 11、 12および 13記載のアミノ酸配列を抗体可変領域重鎖 の相補性決定領域として含み、かつ配列番号 14、 15および ie記載のアミノ酸配列を 抗体可変領域軽鎖の相補性決定領域として含む、請求の範囲 46 記載のジスルフイド 安定化抗体。
51. ジスルフイド安定化抗体の H鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 90記載のアミ ノ酸配列を含み、 L鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 92記載のアミノ酸配列を含 む、請求の範囲 46記載のジスルフイド安定化抗体。
52. ジスルフイド安定化抗体の H鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 91または配列 番号 95のアミノ酸配列を含み、 L鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 93、配列番号 94または配列番号 96のアミノ酸配列を含む、請求の範囲 46記載のジスルフイド安定 化抗体。
53. 請求の範囲 1に記載されたヒト VEGF受容体 Fit- 1 に特異的に反応する遺伝子 組換え抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域の CDR力 選ばれるアミノ酸配列を含 むペプチド。
54. H鎖 V領域およびし鎖 V領域の CDR力 配列番号 5、 6、 7、 8、 9および 10記 載のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも 1アミノ酸配列を含む、請求の範囲 53記載の ペプチド。
55. H鎖 V領域および L鎖 V領域の CDR力 配列番号 11、 12、 13、 14、 15および 16 記載のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも 1アミノ酸配列を含む、請求の範囲 53記 載のペプチド。
56. 請求の範囲 1〜55のいずれ力 4項に記載された抗体またはペプチドが、放射性 同位元素、蛋白質または低分子の薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合させた融 合抗体または融合ペプチドである抗体またはペプチド。
57. 請求の範囲 1〜： 17、 22〜29、 34—56のいずれ力 1項に記載された抗体または ペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Fit- 1を免疫学的に検出する方法。
58. 請求の範囲 1〜17、 22〜29、 34-56のいずれか 1項に記載された抗体または ペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Fit- 1を免疫学的に定量する方法。
59. 請求の範囲：!〜 17、 22〜29、 34〜56のいずれ力 1項に記載された抗体または ペプチドを用いて、可溶性ヒト VEGF受容体 Fit- 1を免疫学的に検出する方法。
60. 請求の範囲 1〜： 17、 22〜29、 34〜56のいずれか 1項に記載された抗体または ペプチドを用いて、可溶性ヒト VEGF受容体 Fk-1を免疫学的に定量する方法。
61. 請求の範囲 1〜： 17、 22〜29、 34-56のいずれか 1項に記載された抗体または ペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Fh-1を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に 検出する方法。
62. 請求の範囲 1〜： 17、 22〜29、 34〜56のいずれ力 1項に記載された抗体または ペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Fit- 1を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に 定量する方法。
63. 請求の範囲 1〜17、 22-29, 34〜56のいずれ力 1項に記載された抗体または ペプチドを用いて、ヒト VEGFとヒト VEGF受容体 Fk-1 との結合を阻害する方法。
64. 請求の範囲 1〜： 17、 22〜29、 34-56のいずれ力 1項に記載された抗体または ペプチドを用いて、ヒト VEGF受容体 Fit- 1機能を中和する方法。
65. 請求の範囲 1〜： 17、 22〜29、 34-56のいずれ力 4項に記載された抗体または ペプチドを用いて、血管内皮細胞の遊走を阻害する方法。
66. 請求の範囲 1〜： 17、 22-29, 34〜56のいずれ力 1項に記載された抗体または ペプチドを用いる、血管新生の異常により病態が進行する疾患の診断方法。
67. 請求の範囲 1〜1 7、 22-29, 34〜56のいずれ力 1項に記載された抗体または ペプチドを有効成分として含有する、血管新生の異常により病態が進行する疾患の診 断薬。
68. 請求の範囲:!〜 17、 22-29, 34-56のいずれ力 1項に記載された抗体または ペプチドを有効成分として含有する、血管新生の異常により病態が進行する疾患の治
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