WO1999054483A1 - Gene de la dihydrodipicolinate synthase du riz et adn associe - Google Patents

Description

明 細 書

イ ネのジ ヒ ドロ ジピ コ リ ネー ト シン タ ーゼの遺伝子 と該 遺伝子に関連する D NA

技術分野

本発明は、 イ ネのジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼ の遺伝子と 、 該遺伝子に関連する D NAに関する。 詳しく 言えば、 本発明はイネ植物の リ ジンの生合成経路に関与 する ジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼをコ一 ドする新 規な D NAに関する。 また、 本発明は、 ジ ヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼ活性を有する新規なタ ンパク質を コー ドする D NAにも関する。 さ らに本発明は、 それら新規な D NA で形質転換された大腸菌、 あ るいはそれら新規な DNAで形質転換された植物と その種子も包含する。

さ らに、 本発明は、 新規な DNAを組込んだ新規な組換 えベク ターも包含する。

背景技術

イ ネ、 ト ウモ ロ コ シ、 コ ムギな どの穀物種子は、 人や 家畜等に と って重要な栄養源である。 しかし、 これ ら の 種子は、 必須ァ ミ ノ 酸の一つである リ ジン含量が低いこ と から栄養価が多少と も劣っている。 高い リ ジン含量を もち栄養価に優れた穀物種子を産生でき る植物の新品種 を作出する こ と が望まれている。

植物体中の リ ジンの生合成経路である ジア ミ ノ ビメ リ ン酸経路において、ァスパラギン酸- /3 -セ ミ アルデヒ ドと ピル ビン酸と がジ ヒ ドロ ジ ピコ リ ネー ト シンターゼ（以 下、「DHDPSjと略すこ と がある）の作用によって縮合結合 する こ と によ り 、 2, 3-ジヒ ドロ ピコ リ ン酸が生成し、 これ から さ らに 5 段階の酵素反応によ り ジア ミ ノ ピメ リ ン酸 を生成 し、 これを経て リ ジンが生成する こ と が知 られて いる。 （生化学実験講座、 第 11卷、 511頁〜 517頁、 東京 化学同人）。 従って、 DHDPSは、 ァスノ ラ ギン酸- )3 -セ ミ アルデ ヒ ド と ピル ビ ン酸 と を縮合結合する こ と に よ り 2,3-ジ ヒ ドロ ピコ リ ン酸を生成する活性を有する酵素タ ンパク質である こ と が知られてレ、る。

DHDPSをコー ドする遺伝子すなわち DHDPS遺伝子を、 ト ウモロ コ シ、 タノくコ、 ナタネ、 ダイ ズな どの有用植物 体中に導入しその遺伝子の機能を発現させる こ と によ り 、 それら形質転換植物の種子中の リ ジン含量を向上する こ と が報告されている（PCT国際公開 W095/15392号公報、 特表平 7-504821 号、 および Biotechnology, 第 13 卷、 577頁〜 582頁、 1995 )_c

これまで、 DHDPSの遺伝子はコ ムギ、 ト ウモ ロ コ シ、 ダイ ズおよびタ バ コ の植物よ り 取得され、 それ ら遺伝子 の DNAの塩基配列が解明 されている _e 例えば次の技術が 幾つかの文献に報告されている。

(1) コ ムギの DHDPSのア ミ ノ酸配列の解析と DHDPS 遺伝子の単離（特開平 3- 127984号公報）。

(2) ト ウモロ コ シの DHDPS 遺伝子の単離と その DNA の塩基酉己歹 iJの角？析（Molecular & General Genetics、第 228 卷、 287頁〜 293頁、 1991年）。

(3) ト ウモ ロ コ シの DHDPS遺伝子の改変型 DNAを用 いる ト ウモ ロ コ シの形質転換と 、 種子の リ ジン含量の向 上（米国特許 5545545号明細書）。

(4) タバ コ の DHDPS遺伝子の DNAを改変 して、 植物 体中の リ ジン含量を高め得る よ う に DNA でコー ドされ る DHDPS の リ ジンに よ る フ ィ ー ドバ ッ ク阻害感受性を 角？除されてある改変 DNA(The Plant Journal, 第 8卷、 5 号、 733頁〜 743頁、 1995年）。

(5) ダィ ズの DHDPS遺伝子（Plant Molecular Biology, 第 26卷、 989頁〜 993頁、 1994年）。

(6) 細菌例えば大腸菌の DHDPS 遺伝子を用いる形質 転換に よ り 植物の種子の リ ジン含量を向上 させる 方法 (欧州特許出願公開第 0485970A2号公報）。

し力 し、 本発明者 らの知る 限 り では、 イ ネの DHDPS のア ミ ノ酸配列を解析した こ と 、 及びイネの DHDPS 遺 伝子を取得でき たこ と を報告する文献は知 られていない し、 またイ ネの DHDPS 遺伝子を利用する こ と を報告す る文献も知 られていなレ、 _c

本発明の 目 的の一 つは、 イ ネの DHDPS 遺伝子をィ ネ 植物から取得して提供する こ と にある。 本発明の別の 目 的は、イネの DHDPSタ ンパク質の DHDPS活性を有する タ ンパク質を コー ドでき る新規な DNA を提供する こ と である。 本発明の さ らに別の 目 的は、 DHDPS活性を有す る タ ンノ ク質をコー ドでき る新規な D NAによって、 ト ウ モ ロ コ シ、 イネ、 ダイ ズ、 コ ムギ、 ォォムギな どの有用 植物を形質転換する こ と であ り 、 また高い リ ジン含量を もつ種子を産生でき る有用植物の新しい形質転換品種を 提供する こ と である。

本発明のその他の 目 的は、 後記の説明から明 らかにな るであろ う。

発明の開示

上記の諸 目 的を達成するために、 本発明者らは一連の 種々研究を行った。 先づ、 イ ネ植物から DHDP S 遺伝子 を取得するための研究を行った。 こ の研究の結果、 イネ の幼植物体の組織、 例えば緑色の茎葉の破砕物か ら 全 RNAを遺伝子工学技術で知 られる方法によ り 抽出 し、 そ の抽出 された全 RNAカゝら mRNAを常法によ り 単離し、そ の mRNAか 、 市販の cD NA合成キ ッ ト によ り cD NAを 収得する こ と に成功 した 得られた cD NAは、 λ gt l 1 フ ァ一ジベク ターの EcoRI 切断片の末端を仔ゥシ小腸由来 ァノレ力 リ ホ ス フ ァ タ ーゼ で処理 し た フ ァ ー ジベ ク タ ー (STRATAGEN 社製の巿販品）に連結する と 、 複製可能な 組換え ラ ムダ-フ ァ ージを構築でき る こ と が多 く の試行 錯誤の結果によ り 知見された。

その組換えラ ムダ-フ ァージを大腸菌 Y 1088 に感染さ せ、 ィ ンキュベ ー トする と 、 多数のプラーク（溶菌斑）と し て組換え λ フ ァ ージの多数が得られる こ と 、 また得られ た多数のプラーク に含まれる組換え λ フ ァージ群は、 ィ ネ由来の cDNA を含有する各種多様なフ ァージであって イネの cDNA ライ ブラ リ ーと して利用でき る こ と が知見 された。

他方、 日本特開平 3-127984号明細書に記載されたコム ギの DHDPS タ ンパク質のア ミ ノ 酸配列と 、 これから推 認 さ れ る DHDPS 遺伝子の塩基配歹 ij、 な ら びに文献 「Molecular & General GeneticsJ 228卷、 287〜293頁 (1991 年）に記載された ト ゥモ ロ コ シの DHDPS 遺伝子の 塩基配列を参照しなが ら、 PCR法のプライマーと して適 する と考え られた 25個のヌ ク レオチ ドカゝらなる第 1のォ リ ゴヌ ク レオチ ドと 、 24 個のヌ ク レオチ ドからなる第 2 のオ リ ゴヌ ク レオチ ドと を本発明者は、 化学合成によ り 作製した。

前記の第 1 のオ リ ゴヌ ク レオチ ドと 第 2 のオリ ゴヌ ク レオチ ドと前記のイネの cDNAライ ブラ リ ー（すなわち前 記の組換え ； L フ ァージ）と の混合物を用いて PCR 法増幅 反応を行 う と 、 第 1および第 2のオ リ ゴヌ ク レオチ ドは、 PCR法で所要なブライマー（相補的 DNA)と して働く こ と ができ、 前記のィネ cDNA ライ ブラ リ ー中の cDNAがテ ンプレー ト と して利用する こ と ができ 、 イ ネの DHDPS 遺伝子由来の cDNA の一部分を増幅でき る こ と が認め ら れた。 そ して PCR増幅反応液からイ ネ DHDPS遺伝子由 来の cDNAの一部分の増幅生成物を、 プローブ DNA と し て回収する こ と に成功した。

こ の よ う に収得された上記のプローブ DNA をス ク リ 一二ング材料と して用いる フ ァ ージプラーク -ハイ プ リ ダイ ゼーシ ヨ ン法に よ って、 先に得られたイ ネの cDNA ライ ブラ リ ー（すなわち前記の組換え λ フ ァージの 30 万 個のプラーク）から、 多く の試行錯誤の試験の結果と して イ ネの DHDPS 遺伝子を組込まれた組換え え フ ァ ージの プラーク の 4 個を単離する こ と に幸にも成功 した。 それ ら 4 個のプラーク の組換え λ フ ァージを別々 に増幅した 後に、 各々 の L ファージ DNAを常法で単離した。 こ う し て得られた 4種類の DNAを制限酵素 EcoRIで切断して得 られた DNA断片は相互に比較する と 、 同一の塩基配列を 有する ものである こ と が認め られ、 そ してコ ムギおよび ト ウモ ロ コ シの DHDPS遺伝子の DNA配列と の比較から、 イ ネの DHDPS 遺伝子に相当する DNA 配列を含有する DNA断片である と認定された。

上記のよ う に して得られた、 イネの DHDPS 遺伝子に 相当する と認め られる DNA配列を含有する DNA断片を 制限酵素 EcoRIで切断して得られた DNA断片は、 これを 次に、 市販の既知のプラ ス ミ ドベク ター p Bluescript II SK( + )の EcoRI切断部位に DNA リ ゲーシ ヨ ンキ ッ ト によ り 挿入、 連結する こ と ができた。 こ う して得られた組換 えプラス ミ ドベク ターで大腸菌 XLI-Blue MRF'を形質転 換する こ と ができ た。 得られた大腸菌形質転換体をイ ン キュベー ト して多数の菌体を得る こ と ができ た。 得られ た菌体か ら プラ ス ミ ドを採取 し、 得 られたプラ ス ミ ド DNA から、 制限酵素でイネ由来の D NA 配列を含有する D NA断片を切出 した。 切出された D NA断片を、 DNA の 塩基配列の解析に力 ナる こ と によって、 こ の DNA断片に 含有されて且つイ ネの DHD PS 遺伝子に相当する と判定 された D NA配列の塩基配列は、 後記の配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列を有する ものである と確認された。

さ らに、 本発明者らの知る限 り では、 配列表の配列番 号 1 に記載の塩基配列を有する D NAは、 何れの文献にも 記載されていない新規な D NA配列である と認め られた。

配列表の配列番号 1の塩基配列を有する DNAでコ ー ド される タ ンパク質は配列表の配列番号 2 に記載のァ ミ ノ 酸配列を有する タ ンパク質である と認め られ、 また こ の タ ンパク質はイ ネの DHDPS を構成する タ ンパク質であ る と認め られる。

従って、 第 1 の本発明においては、 配列表の配列番号 2 に示すア ミ ノ 酸配列を有するイネのジヒ ドロ ジビ コ リ ネ — ト シンターゼをコー ドする D NAが提供される . _c

第 1 の本発明によ る D NAは、 具体的には、 配列表の配 列番号 1に記載の塩基配列を有する D NAである こ と がで さ る。

第 1の本発明の DNAは、 イネの D HD PSである タ ンパ ク質をコー ドする DNAである。 こ の DNA は、 本発明者 らの研究を行 う に際 しては、 前述のよ う に、 イネの cDNA ライ ブラ リ 一から遺伝子工学の技法で取得されたもので ある。 しかし、 その DNAの塩基配列が本発明で明 らかに されたので、 配列表の配列番号 1 の塩基配列を参照 して ヌ ク レオチ ドから化学合成によって も取得する こ と がで き る。 また、 前記の塩基配列を参照 して合成ヌ ク レオチ ドをプローブと して作製 して用いる力 、 も し く はその合 成オ リ ゴヌ ク レオチ ドをプライマー と して用いる公知の 方法によってイネ染色体の DNAライ ブラ リ ー力ゝら、 ポ リ メ ラ一ゼ 'チェイ ン ' リ ア ク シ ョ ン（PCR)の方法又はハイ ブ リ ダイゼーシ ョ ンによって第 1の本発明の DNAを取得 する こ と もでき る。

以下に、 イネの茎葉から遺伝子工学の技法によって、 第 1 の本発明によ る DNA を取得する方法を概略的に説 明する。

(1) イネ mRNAの調製およびイネの cDNA ライ ブラ リ ー の構築

ィネ (Oriza sativa)の種々 な組織、 例えば茎葉、 根、 力 ノレ スな どの組織、 好ま し く は緑色の茎葉から、 常法に よ り 全 RNA を抽出する： 抽出 された全 RNA から蛋白質な どの夾雑物を除いた後、 さ らにオ リ ゴ dTセルロースの充 填カ ラムに通 して poly(A) + RNAを精製する こ と によって、 イネの mRNAを得る こ と ができ る _c 次に、 mRNAから市販の cD NA を合成キッ ト によ り ィ ネの cD NA を合成する。 合成された cDNA をフ ァージべ ク タ一、 例えば λ gt l 1ベク ター又は λ ΖΑΡΙΙベク ターな どに組み込み、 多数の組換えフ ァージを得る。 それら組 換えフ ァージを宿主と して大腸菌に感染させ、 イ ンキュ ペー トする と 、 プラーク と して多数の組換えフ ァージを 得る こ と ができ る。 これら一連の操作は、 市販の cDNA ク ローニングキ ッ ト を使用 して実施でき る。

このよ う に宿主大腸菌の溶菌のプラーク と して得られ た多数の組換えフ ァージは、 イネ由来の全 cD NA を含有 する多種多様のフ ァージカゝら成る ものである力ゝら、 イ ネ の cDNAライ ブラ リ ーと して利用でき る。

(2) PCR法用のプライマーの構築

コムギの DHDPS遺伝子の既知の塩基配列（例えば、 日 本特開平 3 - 127984号明細書に記載される D NA配列）と 、 ト ウモ ロ コ シの D HDP S遺伝子の既知の塩基配列（例えば、 前出の「Molecular & Ge neral Genetics J 228卷、 287〜

293 頁に記載の D NA 配列）と を相互に比較し且つこれら と の間で共通に保存されている塩基配列がある こ と を本 発明者は見出 した。 このよ う に見出 された共通の塩基配 列を参照 して、 本発明者らは 2 種類のオ リ ゴヌ ク レオチ ド（後記の配列表の配列番号 3および 4のオ リ ゴヌ ク レオ チ ド）を P CR 法用のプライマー（相補的 DNA)と して化学 合成によ り 作製して構築 した。 (3) プロ一ブ DNAの作製

先に多数の組換えフ ァージからなるプラーク と して得 られたイ ネの cDNA ライ ブラ リ ーの中で、 所望のイ ネ DHDPS をコー ドする DNAを選択的に増幅するために、 前記の合成オリ ゴヌ ク レオチ ドょ り なる プライ マ ーを使 用 し、 それで、 PCR 法によ り テンプレー ト と してのイネ cDNA ライ ブラ リ 一力ゝらイネ DHDPS 遺伝子の一部分を コ ー ドする DNAを増幅する。

増幅反応を PCR法によって反復した後に、イネ DHDPS 遺伝子に相当する DNA配列の う ちの一部分である DNA 断片の増幅生成物を、 増幅反応液から、 プローブ DNAと して採取する。

(4) ィネ cDNAライ ブラ リ 一力 らのイネ DHDPS遺伝子の DNAの選択

先にイネの cDNA ライ ブラ リ ーと して得られた組換え フ ァ ー ジの多数のプラ ーク の 中力ゝ ら 、 上記のプロ ーブ DNAをスク リ ーニング材料と して利用する フ ァージプラ ー ク -ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン法に よ り 、 目 的のイ ネ DHDPS遺伝子に全体的に対応する DNA配列を組込まれ た組換えフ ァージよ り なる数個のブラ一ク を選抜する： これによつて、 イネ DHDPS遺伝子の DNAに相当する 目 的の DNA配列を内部に含有する DNA断片が該 DNA断 片を組込んでいる組換えフ ァージの形で採取でき る _c すなわち、 詳し く 言えば、 上記のよ う なプラーク ·ハイ W

11 ブ リ ダイゼーシ ョ ンで選抜されたプラーク の フ ァ ージを 採取 して、 さ らに採取フ ァージからフ ァージ DNAを回収 する。 回収したフ ァ 一ジ DNAをジデォキシ法な どで処理 する こ と によ り 、 ィネ由来の挿入 DNA断片の塩基配列を 5 決定する こ と ができ る。 そのイ ネ由来の挿入 DNA配列の 塩基配列中の タ ンパク 質コー ド領域（オープン リ一ディ ングフ レーム）から規定されるア ミ ノ酸配列を、 既知の ト ゥモ ロ コ シ DHDPSやコ ム ギ DHDPSの タ ンノ ク 質のア ミ ノ 酸配列に对して比較する と 、 相同性を判定する こ と に

10 よ り 、 イ ネの DHDPSの遺伝子に対応する DNA配列を内 部に含有する DNA断片である こ と を特定でき る。

従って、 イネの DHDPSの遺伝子に相当する DNA配歹 ij を内部に含有する と判定された挿入 DNA断片は、 上記の よ う に選抜された採取フ ァージのフ ァージ DNA カゝら制

15 限酵素で切出 して収得でき る。

(5) イ ネの DHDPS遺伝子に相当する cDNAの ク ロ ーニ ン グ

上記のよ う にイネの DHDPS遺伝子に相当する DNA酉己 列を内部に含有する DNA断片 と して、 フ ァージから切出 20 して収得された DNA は、 これをプラ ス ミ ドベク タ ー p Bluescript II SK( + )の EcoRI切断部位に挿入、 連結 して 組換えプラ ス ミ ドベク ターを構築する。 こ の よ う に構築 さ れた組換えプラ ス ミ ドベ ク タ ーで大腸菌 XLl-Blue MRF'を形質転換する。 こ う して得られた大腸菌形質転換 体を培養 して増殖させる と 、 イ ネ DHDPS 遺伝子に相当 する DNA配列を含有する DNA断片を担 う 前記の組換え プラス ミ ドをク ローニングでき る。 従って、 イネ DHDPS 遺伝子に対応する DNA配列を含有する DNA断片がク 口 一二ングでき る。

(6) ク ローニ ングされた DNAのシー ク ェ ンス解析

上記のク ローニングされた組換えプラ ス ミ ドから適当 な制限酵素によ り 遺伝子に該当の DNA 配列を含有する DNA 断片を切 り 出す。 切 り 出された DNA 断片を市販の 塩基配列決定キ ッ トで処理する と 、 イネ DHDPS 遺伝子 に該当する DNA配列を内部に含有する DNAの塩基配列 を決定でき る。 こ の よ う に決定された塩基配列をも ち且 つイネ DHDPSをコー ドする DNA配列の塩基配列は、 後 記の配列表の配列番号 1に記載されてある。

前記に説明 したよ う に収得された第 1の本発明の DNA 配列、 又はその DNA配列を含有する DNA断片をプロ一 ブと して用いる と 、 常法によ ってイ ネ染色体自体から も DHDPS遺伝子の DNAを取得し得る。 しカゝし、 イ ネ染色 体自体から得た DHDPS遺伝子の DNAは、 イ ン ト ロ ンを 含むこ と が予想される。 この よ う なイ ン ト ロ ンで分断さ れている DNA も、 イネ DHDPS をコー ドする DNAであ る限 り 、 第 1の本発明の DNAに含まれる と認め られる。 なお、 後記の実施例 1 で得られて且つ配列表の配列番 号 1 に記載の塩基配列を有するイネ DHDPS 遺伝子に相 当する DNA配列を含有する DNA断片は、 pBluescriptSK

(+)プラ ス ミ ドベク ターに挿入、 連結された。 こ の よ う に 得られた組換えプラ ス ミ ドベク ターの導入によ り 形質転 換 さ れた大腸菌 XLl-Blue MRF'はェ シ エ リ ヒ ア ' コ リ (Escherichia coli)DAP8-l と命名 され、 日 本の茨城県、 つ く ば市の工業技術院生命工学工業技術研究所に 1996 年 10月 14 日 に、 FERM P- 15906の受託番号で寄託され てい る _c さ ら に、 ェ シエ リ ヒ ア ' コ リ DAP8-1 は、 1998 年 3 月 26 日 以降、 ブダペス ト 条約の規約下で FERM BP-6310の受託番号で前記の研究所に寄託されてある。

第 1 の本発明によ る DNA は、 本発明で解明 された該 DNAの塩基配列を指針と して用いる こ と によって、 イネ の DHDPS タ ンパク質を化学合成によ り 多量に収得たる こ と を可能に している 点で有用 であ り 、 そ してイ ネの DHDPS タ ンパク質の酵素学的研究を進める のに貢献で き る ものである。

さ らに、 第 1 の本発明によ る DNA 配列、 またはその DNA配列を含有する適当な DNA 断片は、 それの末端を Eco I リ ンカ一と連結した後に、 市販のプラ ス ミ ドベク タ — pTVll8N (宝酒造株式会社製、 日本）の Eac プロモータ —の下流にある Nco I 切断部位に挿入する こ と によ り 、 組換えベク ターを構築でき る。 このよ う に構築された組 換えべク ターで形質転換された大腸菌は、 培養される と 、 細胞中に DHDPS 活性を有する タ ンパク質を生産する こ W

14 と ができ る と期待される。 従って、 第 1 の本発明によ る D NAを発現でき る よ う に前記の組換えべク ターを導入さ れて形質転換された大腸菌を培養する と 、 イ ネ DHDPS 活性を有する タ ンパク質を製造でき る と期待される。 5 他方、 一般的には、 生理活性を有する タ ンパク質を構 成するア ミ ノ 酸配列中の 1 個も しく は複数個のア ミ ノ酸 が欠失される力 、及び（又は）他のァ ミ ノ酸に置換される力 及び（又は） 1 個も し く は複数個のア ミ ノ 酸が該ア ミ ノ 酸 配列中に付力 Qされたア ミ ノ 酸配列でも、 元のア ミ ノ 酸配

10 列のタ ンパク質の生理活性が維持される場合がある こ と は当業者において広く 認識されている。 第 1 の本発明の DNAは、 その塩基配列の一部分又は数部分に修飾が加え られた後にも、 DHDPS活性を有する タ ンパク質をコー ド する D NAである こ と が可能である。

15 換言すれば、 第 1の本発明による D NAは、 それの塩基 配列の中の 1個又は複数個の塩基、 例えば 1、 2又は 3〜 10 個の塩基を別の塩基に改変された後にも、 DHD P S 活 性を有する タ ンパク質をコー ドする能力を保有する こ と ができ る。

20 従って、 第 2 の本発明においては、 後記の配列表の配 列番号 2 に示されたア ミ ノ酸配列における 1 個も し く は 複数個のア ミ ノ 酸が欠失する力 、 及び （又は） 他のア ミ ノ 酸と置換される力 、 及び （又は） 他のア ミ ノ 酸を挿入 又は付加されるかして形成されたァ ミ ノ 酸配列を有する タ ンノ ク質であって、 ジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンター ゼ活性を有する タ ンパク 質をコー ドする D NA が提供さ れる。

第 2 の本発明によ る DNAは、第 1 の本発明によ る DNA から改変された D NA であ り 、 この第 2 の本発明の D NA は、 例えば部位特異的変異法によって、 D NAでコー ドさ れる タ ンパク質の特定の部位のァ ミ ノ酸が上記のよ う な 仕方で欠失、 置換若し く は付加されてなるア ミ ノ 酸配列 を もつタ ンノ ク質をコー ドする よ う に、 第 1 の本発明の DNAの塩基配列を改変する こ と によ って得られる。

また、 第 1 の本発明の D NAを含有する D NA断片を包 有する細胞に変異処理を行い、 変異 した細胞から、 例え ば配列表の配列番号 1に記載の塩基配列を有する D NAに 対 してス ト リ ンジェ ン ト な条件下でハイ ブ リ ダィ ズでき るが配列番号 1 の塩基配列と部分的に異なる塩基配列を 有する D NAを選別する こ と によつて も、 第 2の本発明の 改変された D NA を得る こ と ができ る。 こ こ でい う 「ス ト リ ンジェ ン ト な条件」と は、 第 1 の本発明の D NA に対す るいわゆる特異的なハイ プ リ ッ ドが形成され、 非特異的 なハィ ブ リ ッ ドが形成されない条件をい う ： こ の条件は、 これを明確に数値で特定化する こ と は困難であるが、 一 例を示せば、 相同性が高い 2 つの核酸同志、 高い相同性 を有する例えば 98%以上の相同性を有する D NA 同志が ハイ プ リ ダイ ズする こ と を許すが、 それよ り 相同性が低 い核酸同志がハイ ブ リ ダィ ズする こ と を許さ ない条件が 挙げられる。

従って、 第 2の本発明によ る D NAは、 その具体例と し て、 配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列と部分的に異 なる塩基配列を有するが、 配列番号 1 に記載の前記の塩 基配列に対して高い相同性を示す D NAであって、 しかも 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列を有する DNAに対 してス ト リ ンジユ ン ト な条件下でハイ プ リ ダイ ズする こ と ができ 、 かつ、 ジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼ活 性を有する タ ンノ、°ク質を コー ドする DNA である こ と 力 S でき る。

第 2の本発明によ る DNAの具体的な例には、 後記の実 施例 2 に記載された方法で作製されて実施例 2 で改変 D NA- 158N と命名 された D NA配列と 、 後記の実施例 3に 記載された方法で作製されて実施例 3 で改変 DNA- 166A と命名 された D NA配列と がある：

その改変 DNA- 158N と命名 された D NA 配列は、 後記 の配列表の配列番号 5に記載の塩基配列を有する D NAで ある： これは配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列を有 する第 1 の本発明 D NAの中にある 472番目 、 473番目 、 474 番目 の AAC 酉己列（ァスパラ ギンを コー ドする コ ドン） での 473番 目 の塩基 A (ァデニン） 1個を T (チ ミ ン） 1個に置 換して、 塩基配列の 472〜474番目 に配歹 ij ATC (ィ ソ ロイ シンを コー ドする コ ドン）が在る よ う に改変 された D NA に相当する。 こ の改変 DNA-158N配列は、 第 1の本発明 の DNA に対してス ト リ ンジェ ン ト な条件でハイ ブ リ ダ ィ ズでき る。

こ の改変 DNA- 158N配列でコー ドされる タ ンノ ク質は、 配列表の配列番号 6 に記載のア ミ ノ 酸配列を有する もの であ り 、 DHDPS活性を有する。

さ らに、 上記の改変 DNA- 166A配列は、 配列表の配列 番号 7に記載された塩基配列を有する DNAである - これ は、 配列番号 1 に記載の塩基配列を有する第 1 の本発明 DNAの中にある 496番目 、 497番目 、 498番目 の GCA配 列（ァ ラ ニンを コ ー ドする コ ドン）での 497 番 目 の塩基 C (シ ト シン） 1個を T (チミ ン） 1個に置換して、 塩基配列の 496〜 498番目 に配歹 ij GTA (バ リ ンを コー ドする コ ドン）が 在る よ う に改変された DNAに相当する。 こ の改変 DNA- 166A配列は、 第 1 の本発明の DNA に対してス ト リ ンジ ェ ン ト な条件下でハイ ブ リ ダィ ズでき る ₌

こ の改変 DNA- 166A配列でコ ー ドされる タ ンパク質は、 配列表の配列番号 8 に記載のア ミ ノ 酸配列を有する もの であ り 、 DHDPS活性を有する _c

第 2の本発明によ る改変 DNAの更に別の例は、 配列表 の配列番号 1に示す塩基配列における、 473番目 のアデ二 ンをチミ ンに置換し且つ 497 番目 のシ ト シンをチ ミ ンに 置換して形成された塩基配列を有する DNA配列であ り 、 この DNA配列によっては、 配列表の配列番号 2に示すァ ミ ノ 酸配列における 158 番目 のァスパラギンをイ ソ ロイ シンに置換し且つ 166 番目 のァラニンをバ リ ンに置換し て形成されたア ミ ノ酸配列を有する タ ンパク質であって ジヒ ドロ ジビコ リ ネー ト シンターゼ活性を有する タ ンパ ク質がコー ドされる。

一般的には、 DNA配列の一部分の領域にある塩基配列 を 改変 す る 方法 と し て 、 （ Kunkel 法 「 Methods in Enzymology」 154卷 367号） 、 およびオ リ ゴヌ ク レオチ ドー ダイ レク ト デュアルア ンバー法、 さ ら にその他の 方法が知られている。

本発明の本来の 目 的は、 高い リ ジン含量を もつ種子を 産生でき る よ う に形質転換された新品種植物を創成する こ と にあ る こ と か ら 、 リ ジ ン の生合成経路に関与する DHDPS が生合成生成物 と しての リ ジンによ る酵素活性 の フ ィ ー ドバ ッ ク 阻害を受けなく なる よ う に酵素活性を 改質された DHDPS、 な らびにこ の改質 DHDPSをコー ド する DNAが必要と される。 そこで リ ジンによ るフ ィ ー ト ノく ッ ク 阻害についての酵素の感受性を解消 されたよ う に 改質 さ れた新規な DHDPS を コ ー ドでき る新規な改変 DNA を第 1 の本発明の DNA から作製する こ と を 目 的と して、 先づ本発明者らは研究を行った： その結果、 既知 の Kunkel法の改良法と 、オリ ゴヌ ク レオチ ドーダイ レク ト デュアルアンバー法の改良法と を組合せる こ と によ つて、 イネの DHDPS を コー ドする第 1 の本発明の塩基 の配列の一部領域における 1 個又は 2 個又はそれ以上の 塩基を別の塩基に置換する こ と が可能である こ と を本発 明者らは、 知見 した。

更に、 前記の米国特許第 5545545号明細書に記載され る ト ウモ ロ コ シの DHDPS 遺伝子の改変に関する従来技 術および前記の 「 The Plant Journal」 8 卷、 5 号、 733 〜 743 頁に記載される タ ノくコの DHDPS 遺伝子の改変に 関する技術、 な らびに欧州特許出願公開第 0485970A2号 明細書に記載される細菌の DHDPS 遺伝子を用いる植物 の形質転換に関する技術を参照 しなが ら、 本発明者らは、 第 1 の本発明の DNAの配列表、 配列番号 1に記載の塩基 配列の 473番目 の塩基、アデニン（A)をチミ ン（T)に取代え るか又は 497番目 の塩基、シ ト シン（C)をチミ ン（T)に取代 えて得られた改変 DNAが、 リ ジンによ る フ ィ ー ドノくッ ク 阻害を受けない酵素活性を有する よ う に改質された酵素 タ ンハク質であって且つ DHDPS 活性を維持でき る新規 なタ ンパク 質を コー ドでき るはずである と の予想的な着 想を今回、 得た。

こ の着想に基づいて、 本発明者らは、 種々 の研究を行 つたが、 多く の試行錯誤の試験の結果と して、 第 1 の本 発明の新規 DNA の作製に あた り 構築 さ れた、 イ ネ の DHDPS遺伝子に対応する DNA配列を含有する DNA断片 〔すなわち、 λ フ ァージから前記の とお り 切出 した DNA 断片、 すなわち配列表の配列番号 1 の DNA 配列（これは 以下では DHDPS-DNA-1143 と称す）を含有する DNA 断 片〕 をプラ ス ミ ドベク ター p Bluescript II SK(+)の EcoRI 切断部位と Sac I切断部位と の間に DNA リ ゲーショ ンキ ッ ト によ り 揷入、 連結 してなる組換えプラス ミ ドベク タ 一（以下、 p DAP8-1 と称する）が 目 的の新規な改変 DNA の作製のための出発材料と して適する こ と を認めた。

また、 このよ う な 目 的の新規な改変 DNAを、 前記の出 発材料、 組換えプラス ミ ドベク ター p DAP8-1 から PCR 法に準じて作製するために適当に使用でき るプラマー と して、 5種類のプライマ一、 すなわち、 後記の配列表の配 列番号 9 に記載の塩基配列を有するオリ ゴヌ ク レオチ ド よ り なるプラマー No.3 と 、 配列番号 10に記載の塩基配 列を有するオ リ ゴヌ ク レオチ ドょ り なるプライマー No.4 と 、 配列番号 11に記載の塩基配列を有するオ リ ゴヌ ク レ ォチ ドよ り なるプライマー FW- 1 と 、 配列番号 12 に記载 の塩基配列を有するオ リ ゴヌ ク レオチ ドょ り なるプライ マー RV-1 と 、 配列番号 13 に記載の塩基配列を有するォ リ ゴヌ ク レオチ ドよ り なるプライ マ一 BS KPN-1)を化学 合成によ り 本発明者は作製した。

上記のプラス ミ ドベク ター p DAP8-1 と 、 上記の 5種の 合成オ リ ゴヌ ク レオチ ドよ り なるブライ マー と を利用 し て、 後記に詳述される方法を実施する と 、 第 2 の本発明 によ る改変 DNAの具体的な例である配列表、 配列番号 5 に記載の DNA、すなわち前記の改変 DNA-158N配列を含 有する DNA断片、 な らびに配列番号 7 に記載の DNA、 すなわち前記の改変 DNA-166A配列を含有する DNA 断 片を収得する こ と に成功できたのである。

第 1の本発明によ る DNAも、また改変 DNA-158N配列 も、 改変 DNA-166A配列も、 これを組換えベク ターに組 込んで後記の実施例 4又は 5 に記載される植物体への外 来遺伝子の導入方法によ り イネ植物に導入される と 、 そ の形質転換された ト ラ ンス ジェニ ッ ク植物の中で発現す る こ と ができ た。

そ して、 第 1の本発明 DNA、 または第 2の本発明によ る改変 DNA-158N配列あるいは改変 DNA-166A配列で形 質転換されたイネの ト ラ ンス ジエニ ッ ク植物は、 リ ジン 含量を増強されたイ ネ植物細胞あるいはイネ種子を産生 する こ と ができ る こ と が確認された。

次に、 第 2の本発明によ る上記の改変 DNA-158N配列 を含有する DNA断片を作製するのに、 好適に使用でき且 つ後記の実施例 2において例示される手順よ り なる DNA の改変方法を要約的に説明する。

(1) 第 1の本発明の DNAのク ローニング

配列表の配列番号 1に記載される 1143個の塩基からな る第 1 の本発明の DNA、 すなわち前記の DHDPS-DNA- 1143 配列を含有する DNA 断片を、 DNA リ グーシ ヨ ン · キ ッ ト の利用によ り 、 ベク ター p Bluescript II SK(+)の EcoRI 切断部位と の間に挿入、 連結する こ と によ って、 前記の組換えプラス ミ ドベク ター p DAP8-1 を得る。 こ の ベク ター p DAP8-1 を大腸菌 XLI-Blue MRF' に導入し、 これで得られた形質転換大腸菌を増殖する。 増殖された 大腸菌細胞から、 常法で抽出する こ と によ り 組換えブラ ス ミ ドベク ター p DAP8-l を多量に収得する。 こ のべク タ 一は、 DHDPS-DNA-1143配列を含有する DNA断片のコ ピーを多量に含むから、 第 1の本発明 DNAがク ロ ーニン グされた こ と になる。

(2) PCR用のプライマーの構築

DNA合成装置 （Model-391，アプライ ド バイオシステ ムズ社製） を利用 して、 下記の塩基配列を有する 5 種類 のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマ一と して合成する。

(a) プライマー Νο·3(配列表の配列番号 9 に記載され 且つ下記される塩基配列をもつプライマ一） ：

5' -GCCTCTCTTGTTGAGATACTACCTGTGTTGCC-3'

(b) プライマー No.4(配列表の配列番号 10 に記載され 且つ下記される塩基配列をもつプライマー） ：

5' -GCAAATCCCTGCTCTGTTACATGAATAGCC-3'

(c) プライマ一 FW-1(配列表の配列番号 11に記載され 且つ下記される塩基配列を もつブライマー） ：

5' -GTAAAACGACGGCCAGTGAG-3⁷

(d) プライマー RV-1(配列表の配列番号 12に記載され 且つ下記される塩基配列をもつプライ マ一） ：

5' -GGAAACAGCTATGACCATG-3 W

23

(e) プライマ ー BSKPN-1(配列表の配列番号 13に記載 され且つ下記される塩基配列をもつプライマ一） ：

5' -TAGGGCGAATTGTGTGTACCG-3

(3) 所要な DNA断片の PCR法によ る増幅と 回収

5 所要な DNA断片を増幅して得るために、 PCR法の第 1 回段階と して 2 つの反応、 すなわち後記の（A)反応 と （B) 反応と を行 う 。

その（A)反応は、 テンプレー ト と して用いられる前記の 組換えプラス ミ ドベク ター p DAP8-1 と 、 プライマー と し

10 て用いられる前記のプライマ ー FW-1(配列番号 11の合成 オリ ゴヌ ク レオチ ド）と 、プライマ ー Νο·3(配列番号 9の合 成オリ ゴヌ ク レオチ ドであ り 、 5' -末端から 15〜 ： 17番目 の GAT 力 DNA-158N配列の改変部 ATC を誘導でき る） と を、 PCR法用の通常の反応液（Tris-HCl、 MgCl₂、 KC1、

15 4種のデォキシヌ クチォチ ド三リ ン酸（d NTP)、 および La Taq DNAポ リ メ ラーゼを含有）に加え、 次いで増幅反応を 行 う こ と カゝ ら 成 る 。 こ の （A)反応 に よ っ て 、 前記 の DHDPS-DNA-1143 配列の う ちの或る領域における塩基 配列をもつ DNA 断片（DNA断片- A と称す）が増幅反応に

20 よ り 生成される。

また（B)反応は、 前記のブライ マ ー RV-1(配列番号 12の 合成オ リ ゴヌ ク レオチ ド）と 、 プライマ ー BS KPN-1(配歹 IJ 番号 13の合成オリ ゴヌ ク レオチ ドと 、 テンブレー ト と し て用い られる前記のべク タ一 p DAP8-1 と を、 （A)反応で 用いたと 同 じ PCR法用の通常の反応液に加え、 次いで増 幅反応を行 う こ と カゝら成る。 こ の（B)反応によって、 前記 の DHDPS-DNA-1143 配列の う ちの或る領域における塩 基配列を含有し且つ 3' -側に Sac I 切断部位を有する延 伸部を含有する DNA 断片（DNA 断片- B と称す）が増幅反 応によ り 生成される。

PCR法によ る上記の増幅反応は、 市販の PCR反応装置 を用いて実施でき る。

増幅反応の終了後に、 上記の（A)反応の増幅反応液を低 融点ァガロ ー ス電気泳動によ り 分画して、 増幅生成物 と しての 480bp (ベースペア）の DNA断片- Aを含むバン ドを ァガロースゲルから切出す。 また、 上記の（B)反応の増幅 反応液を同様に低融点ァガロー ス電気泳動によ り 分画し、 そ してそのァガロ ー ス ゲル力 ら 1200bp (ベ一ス ペア）の DNA断片- Bを含むバ ン ドを切出す _c

次いで、 それら 2つのゲル切片を DNA精製キ ッ ト 、 例 えば Genclean IIキ ッ ト（フナコ シ社製）によ り 精製する こ と によ り 、 DNA断片- Aの精製品 と 、 DNA断片- B の精製 品 と をそれぞれ回収する。

さ らに、 PCR法の第 2 回段階と して、 配列表の配列番 号 1 に記載の塩基配列の う ちの 473 番 目 のアデニンをチ 了 ミ ンに置換してなる塩基配列をもつ DNA 配列（すなわ ち配列番号 3 の塩基配列を もつ第 2 の本発明の DNA- 158N断片に相当する配歹 を含み且つ該 DNA配列の 5' - 末端に Kpn I切断部位を有する延伸部と 3' -末端に Sac l 切断部位を有する延伸部を含有する 配列長 1200bp の DNA断片を作製する工程を行 う。 このためには、 テンプ レー ト と して用 レ、 られる前記の（A)反応の増幅生成物で ある DNA 断片- A の精製品（配列長 480bp)と 、 （B)反応の 増幅生成物である DNA 断片- B の精製品（配列長 1200bp) と 、 前記のプライマ ー RV-1(配列番号 12 の合成オリ ゴヌ ク レオチ ド）と 、 前記のプライマ ー FW- 1 (配列番号 11の合 成オ リ ゴヌ ク レオチ ド）と を、 PCR法用の通常の増幅反応 液（Tris-HCl、 MgCl₂、 KC1、 4種の d NTP、 および La Taq DNAポリ メ ラーゼを含有）に加え、次いで増幅反応を行 う。 その反応終了後に、 その反応液を低融点ァガロ ー ス電気 泳動に よ り 分画 し、 そのァガロ ー ス ゲルか ら 、 配列長 1200bpの所期の DNA断片（DNA断片- C と称す）を含有す るノく ン ドを切出す。

そのゲル切片を、 DNA精製キ ッ ト、 例えば Genclean II キ ッ ト（フナコ シ社製）によ り 精製して、 DNA断片- Cの精 製品を得る。 こ の DNA断片- Cは、 第 2の本発明によ る改 変 DNA-158N断片に相当する塩基配列を内部に含有し且 つ DNA配列の 5' -末端に Kpn I切断部位を有する延伸部 と 3' -末端に Sac I 切断部位を有する延伸部を含有する 構造をもつものである

(4) 改変 DNA-158N酉 S歹 IJを含有する DNA断片のク ロー二 ング 次に、上記の（3)項で得られた DNA断片- Cを利用 して、 目 的の改変 DNA-158A 配歹 ij (第 2 の本発明によ る改変型 DNAの第 1例）を含有する DNA断片を収得する。

そのためには、先づ、上記の DNA断片- Cの 5' -及び 3' -末端における延伸部を、制限酵素 Kpn I と制限酵素 Sac I で処理する。

これによつて、 DNA断片- C力 ら、 3' -側に Sac I切断 部位を有する延伸部を含有し、 且つ 5' -側が ATGから始 ま る改変 DNA-158A配列を含有する DNA断片を切取る。

このよ う に して、 目 的の改変 DNA-158A配歹 IJに相当す る DNA配列を含有する DNA断片の試料が得られる。 次 に、 プラス ミ ドベク ター p Bluescript II SK(+)を制限酵 素 Kpn I と制限酵素 Sac I で処理する こ と によ り 、 5' - 側の-端に Kpn I切断部位をもち且つ 3' -側の他端に Sac I 切断部位を も つ短縮 さ れたプラ ス ミ ド（以下では、 p Bluescript II SK (+) -Kpn I-Sac I-短縮プラス ミ ド称す）を 守る。

この Kpn I-Sac I-短縮プラ ス ミ ドを前記の DNA-158N 配列を含む DNA断片試料と 混合し、 次いで DNA リ ゲー シ ヨ ン 'キ ッ ト で連結反応にかける と 、 改変 DNA-158N 配 列 を 含 有 す る 組 換 え ブ ラ ス ミ ド （以 下 で は 、 p Bluescript- DNA-158Nプラス ミ ドと称す）を作製でき る _c こ の組換えブ ラ ス ミ ドを大腸菌 XLl-Blue MRF' に導 入 して形質転換し、 こ う して得られた形質転換大腸菌を 液体培地中で培養 して増殖させる。 大量に増殖された大 腸菌細胞は、 前記の組換え プ ラ ス ミ ド、 すな わち p - Bluescript-DNA-158Nプラ ス ミ ドの コ ッ ピィ を含有する。 こ の よ う に して、 改変 DNA-158N配列はク ロ ーニングで き る。 その大腸菌培養細胞から、 常法によ り 改変 DNA- 158N配列を含有するプラ ス ミ ドを抽出 して取る _c

(5) 改変 DNA-158N断片の回収

前項（4)で得られた改変 DNA- 158N 配列を含有する プ ラ ス ミ ドを、 次いで制限酵素 Xba I と制限酵素 Sac Iで処 理する こ と によって消化する。

これによつて Xba I切断部位に隣接する 5' -側端に塩 基配列 ATGを有し且つ 3' -側端に Sac I切断部位を有す る延伸部を有する改変 DNA-158N 配列を含有する DNA 断片を含有する消化反応液を得る こ と ができ る。

こ の消化反応液を、 低融点ァガロース電気泳動によ り 分画して、 前記の DNA断片を含むバン ドをァガロースゲ ノレ力ゝら切出す。切出 されたァガロ ースゲル片を TEバ ッ フ ァ一に溶解し、 得られた溶液をフ エ ノ ールで抽出する と 、 フ エ ノ ール抽出液に前記の DNA断片が回収される： 前記 の DNA断片を含むフ エ ノ ール抽出液を、 3M酢酸ナ ト リ ゥ ム水溶液お よびエタ ノ ールを混合 し、 その混合物を - 20°Cで約 6 時間放置し、 さ らに低温で遠心分離する と 、 前記の DNA断片が沈澱する。 これを減圧下に乾燥する と 、 目 的の改変 DNA-158N配列を内部に含有する DNA 断片 が粉末と して得られる。 この改変 DNA-158N配列を含有 する DNA断片の粉末は水に可溶性である。

更に、 第 2の本発明によ る前記の改変 DNA-166A配列 を含有する DNA断片を作製するのに好適に使用でき、 且 つ後記の実施例 3で例示される DNAの改変方法は、 前記 の改変 DNA-158N配列を含有する DNA 断片の作製のた めの先に説明 した方法と 同様な手順によ り 実施でき る。 すなわち、改変 DNA-166A配列を含有する DNA断片を 作製するための好適な作製方法は、 先づ改変 DNA-158N 配列を含有する DNA 断片の作製法の（1)項で説明 した と 同 じ手順に よ り 、 第 1 の本発明 の DNA(す な わ ち 、 DHDPS-DNA-1143)を含有する組換えべク ター p DAP8-1 を、 大腸菌 XLI-Blue MRF に導入し、 大腸菌を増殖す る こ と によ り 成る ク ローニング工程力 ら始ま る。

次 に 、 テ ン プ レー ト と し て 用 レ、 ら れ る ベ ク タ ー p DAP8-1 と 、オリ ゴヌ ク レオチ ドと して合成されたプライ マ一 FW-1 と 、 プライマ一 No.4(配列番号 10の合成オリ ゴ ヌ ク レオチ ドであ り 、 5' -末端から 18〜20 番目 の TAC が改変 DNA-166A配列の改変部 GTAを誘導でき る）と を、 前記の改変 DNA-158N配列含有の DNA断片の製法の（3) 項で説明 された（A)反応で用いた と 同 じ PCR 法用の通常 の反応液に加え、 次いで増幅反応を行 う こ と から成るェ 程が実施 さ れる。 こ の際の増幅反応に よ っ て 、 前記の DHDPS-DNA-1143 配列の う ちの或る領域における塩基 配列をもつ DNA断片（DNA断片- Dと称す）が生成される _c 次に、改変 DNA-158N配列含有の DNA断片の製法の（3) 項で説明 された手順で行われる（B)反応 と 全く 同 じに、 PCR法の（B)反応を行 う こ と から成る工程が実施される。 これによつて、 その（B)反応から、 前記 DNA断片- B を増 幅生成物と して得る。

上記のプライマ ー FW-1 と プライマ ー No.4を用いる（A) 反応によって生成された前記 DNA 断片- D を含む増幅反 応液は、 これを低融点ァガロ ース電気泳動にかけて分画 する。 こ う して、 増幅生成物と しての 480bpの DNA断片 -Dを含むバン ドをァガロースゲルから切出す。 また、 （B) 反応によって生成された DNA 断片- B を含む増幅な反応 液も、 同様に低融点ァガロース電気泳動によ り 分画して、 1200bpの DNA断片- Bを含むバン ドをァガロースゲル力 ら切出す さ らに、 DNA精製キ ッ ト によ り それらゲル切 片を精製する と 、 DNA断片- D精製品 と 、 DNA断片- Bの 精製品 と をそれぞれ回収でき る。

さ らに、 PCR法の第 2回段階と して、 配列表の配列番 号 1 に記載の塩基配列の う ちの 497番目 の塩基シ ト シン をチ ミ ンに置換してなる塩基配列を もつ DNA 酉己列（すな わち配列番号 7の塩基配列をもつ改変 DNA-166A配列に 相当する DNA配歹 ij )を内部に含み且つ該 DNA配列の 5' - 末端に Kpn I切断部位を有する延伸部と 3' -末端に Sac I 切断部位を延伸部と を含有する配列長 1200bpの DNA断 片を作製する工程を行 う 。 このためには、 テ ンプ レー ト と して用い られる前記の DNA 断片 - D の精製品（配列長 480bp)と 、 DNA 断片- B の精製品（配列長 1200bp)と 、 前 記のプライマー RV-1 と 、 プライマー FW-1 と を PCR法用 の増幅反応液に加え、 次いで増幅反応を行 う 。 その反応 終了後に、 その反応液を低融点ァガロ ース電気泳動によ り 分画する。 そのァガロ ース ゲル力ゝ ら、 配列長 1200bp の所期の DNA 断片（DNA断片- E と称す）を含有するバン ドを切出す。

そのゲル切片を DNA精製キ ッ ト によ り 精製して、 DNA 断片- E の精製品を得る。 こ の DNA断片- E は、 第 2 の本 発明によ る改変 DNA- 166A配列に相当する塩基配列を内 部に含有し且つ DNA配列の 5' -末端に Kpn I切断部位を 有する延伸部と 3' -末端に Sac I切断部位を有する延伸 部と を含有する構造をもつものである。

この DNA 断片- E を利用 して、 目 的の改変 DNA-166A 配歹 ij (第 2の本発明によ る改変型 DNAの第 2例）を含有す る DNA断片を収得する。 そのためには、 DNA断片- E を 制限酵素 Kpn I と Sac Iで処理する。 これによ つて、 DNA 断片- E から、 3' -側に Sac I切断部位を有する延伸部を 含有し且つ 5' 側が ATGから始ま る改変 DNA-166A配歹 IJ を含有する DNA断片を切取る。

こ の よ う に して、 改変 DNA-166A配列に相当する DNA 配列を含有する DNA 断片の試料が得られる。 この DNA 試料を、 先に改変 DNA-158N配列含有の DNA 断片の製 法の（4)項に記載と 同 じ要領で DNA リ ゲーシ ヨ ン .キ ッ ト の利用によ り 、 プラス ミ ドベク ター p Bluescript II SK (+) と連結 し、 得られた組換えベク ターで大腸菌 XLl-Blue MRF' を形質転換し、 さ らに増殖する こ と によ り 、 ク ロ 一二ングでき る。

さ ら に、 こ の よ う に ク ロ ー ニ ン グ さ れた改変 DNA- 166A 配列を含有する プラ ス ミ ドを大腸菌の細胞力ゝら回 収する。 次いで該プラス ミ ドを、 改変 DNA- 158N配列含 有の DNA 断片の製法の（5)項に記載と 同 じ手順によ り 処 理する。 このよ う にする と 、 1143bpの DNA断片と して、 目 的の改変 DNA-166A配列を含有する DNA 断片を水溶 性粉末の形で収得する こ と ができ る。

以上の説明 にぉレ、 て は 、 第 2 の本発 明 に よ る 改変 DNA-158N配列を含有する DNA断片 と 、改変 DNA-166A 配列を含有する DNA断片は、 遺伝工学の技法を利用する 方法で作製された。 しかしなが ら、 配列表の配列番号 5 および配列番号 7 に記載の塩基配列を参照 しなが ら、 従 来知 られるポ リ ヌ ク レオチ ド化学合成法によ って も製造 でき る：

なお、 第 1の本発明の DNAの塩基配列の 473番目 のァ デニン又は 497 番 目 のシ ト シンを前記のよ う にチ ミ ンに 置換する場合について、 第 2 の本発明の具体例を説明 し た。 し力 しなが ら、 第 1の本発明の D N Aをテンプレー ト と して用い且つ適当に工夫された塩基配列を有する合成 オ リ ゴヌ ク レオチ ドの数種類を組合せてプライマ一と し て用いるな らば、第 1の本発明の D NAの 473番目 又は 497 番目 の場所と は別の場所における塩基を別の塩基に置換 して形成される塩基配列を有する別例の改変 D NA を作 製する こ と が可能である。

更に、 本発明者らは別段の研究を進めた。 その結果、 植物体に外来遺伝子を導入 して植物体を形質転換され、 得られた ト ラ ンスジエニ ッ ク植物体で外来遺伝子を発現 させるための従来知 られたバイ オテク ノ ロ ジー技法を禾 IJ 用する こ と によって、第 1 の本発明によ る DHDPSをコー ドする新規 D NA も、 第 2 の本発明によ る DHDP Sをコー ドする新規な改変 D NA も、 組換えべク ターによ る組込ん だ後に植物体に導入する こ と ができ 、 しかも植物体内で 発現でき る こ と が知見された。

従って、 第 3 の本発明においては、 イネのジヒ ドロ ジ ピ コ リ ネー ト シ ンターゼを コー ドする第 1 の本発明の

D NA、 も し く はジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼ活性 を有する タ ンパク質をコー ドする第 2の本発明の DNAを 担持する組換えベク ターを導入されて形質転換された植 物細胞を有し、 そ して導入された前記 DNAが発現可能で ある こ と を特徴とする、 形質転換植物が提供される： しかも、 第 1 の本発明または第 2 の本発明によ る DNA の導入によ り 形質転換された植物体が裁培する と種子を 結実でき る植物である場合、 その植物を通常の条件で裁 培して植物の種子を収獲でき る こ と が知見された。

従って、 第 4 の本発明においては、 イ ネのジヒ ドロ ジ ピコ リ ネー ト シ ンタ ーゼを コー ドする第 1 の本発明の D NAを担持する組換えべク ターを植物細胞に導入する こ と によって得られ且つ前記の DNA が発現可能である形 質転換植物を裁培 し、 さ ら にその裁培によ り 結実した植 物から採取された種子である こ と を特徴とする、 形質転 換植物の種子が提供される。

また、 第 5 の本発明による と 、 ジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼ活性を有する タ ンパク質をコー ドする第 2 の本発明によ る DNA を担持する組換えべク ターを植物 細胞に導入する こ と によ って得られ且つ前記の DNA が 発現可能である形質転換植物を裁培 し、 さ らにその裁培 によ り 結実 した植物から採取された種子である こ と を特 徴とする、 形質転換植物の種子が提供される。

さ らにまた、 第 6 の本発明においては、 プラス ミ ドべ ク タ一 p Blue scrip t II SK(+)の制限酵素 EcoR Iによ る切 断部位に、 配列表の配列番号 1の塩基配列を有する D NA 配列を含有する D NA断片を D NAリ ゲーシ ヨ ン 'キ ッ ト に よ り 連結 して形成された組換えブ ラ ス ミ ドを含み、 し力 も ア ン ピシ リ ンの存在下で も安定に増殖でき る こ と を特 徴と する、 形質転換された大腸菌が新規な微生物と して 提供される。 第 6 の本発明によ る形質転換大腸菌は、 日本における 工業技術院生命工学工業技術研究所にブダぺス ト条約の 規約下に受託番号 FERM BP-6310で寄託されてある大腸 菌 DAP8-1である こ と ができ る。

第 1の本発明によ る DNA、 あるいは第 2の本発明によ る DNA を外来遺伝子 と して用いて植物を形質転換する 場合には、 形質転換でき る植物の種類は多種多様であ り 、 また植物の形質転換のために外来遺伝子と しての本発明 DNAを植物に導入する方法は、 その 目 的で行われる従来 公知のバイ ォテク ノ 口 ジ一の種々 な技法である こ と がで き る。

第 1 の本発明の DNAまたは第 2の本発明の DNAを外 来遺伝子と してイネ植物に導入するために好適に実施で き且つ後記の実施例 4 に例示される方法を以下に要約的 に説明する。

(1) 外来遺伝子の導入用の組換えベク ターの作成

従来知 られる 力 リ フ ラ ワー ·モザイ ク ゥイ ノレス の 35S プロモーターと 、 NOS ター ミ ネータ一と 、 ア ン ピシ リ ン 耐性遺伝子 と を含有する既知のプラ ス ミ ドベク タ ー p BI221 (Clontech社製）をバッ フ ァ一中で制限酵素 Xba I および制限酵素 Sac Iで処理する と 、 35Sブ ロ モ一ターの 下流の Xba l切断部位で切断され且つ NOSター ミ ネータ 一の上流の Sac I切断部位で切断された約 3.8kbのサイ ズ のべク タ一 DNA断片を得る。 そのべク ター DNA 断片の水溶液を、 本発明の DNA の 水溶液と混合し、 その混合物を D NA リ ゲーシ ヨ ン ·キ ッ トで処理して連結反応を行 う 。 これによ る と 、 ベク ター DNA 断片の 35 S プロモータ一領域と NOS ター ミ ネータ 一領域と の間に本発明の D NAが揷入、 連結されてある組 換えべク ターを得る。

得られた組換えべク ターを大腸菌 XL l -Blue MRF'に導 入して、 形質転換大腸菌を得る。

得られた形質転換大腸菌を、 抗生物質ア ン ピシ リ ン含 有の培地に接種、 培養する こ と によ り 、 ア ン ピシ リ ン耐 性の大腸菌コ ロ ニーの数個を得る。 これらのコ ロ ニーを 更にアンピシ リ ン含有の培地中でそれぞれ別々 に増殖さ せる。

各コ ロ ニーごと の増殖されたアンピシ リ ン耐性の大腸 菌から、 それぞれにプラス ミ ドを回収する。 回収された プラ ス ミ ドは、 挿入 D NAの向きが相異なる種々 なプラ ス ミ ドを含む。 各コ ロニーごと に回収されたプラス ミ ドを、 制限酵素 Xb a I と S ac I と で消化して切出 された種々 の DNA断片を含む消化反応液をァガロースゲル電気泳動に かけて、 それら D NA断片の大き さ及び塩基配列を解析す る と 、 組換えプラス ミ ドの 35S プロモーターの下流に本 発明の DNAを正常な向きで挿入、 連結されている適当な プラス ミ ド（約 4.9kbのサイ ズ）を選抜でき る。

第 1の本発明の D NAが正常に挿入、 連結されている組 換えプラス ミ ドをベク ター p DAP と称し、 第 2 の本発明 によ る改変 DNA-158N断片が正常に挿入、 連結されてい る組換えプラス ミ ドをベク ター p l58N と称する。 また、 第 2 の本発明によ る改変 DNA-166A断片が正常に揷入、 連結している組換えプラス ミ ドを、 ベク タ一 pl66A と称 する。 これらのベク ターは、 何れも、 本発明の DNA断片 と 35Sプロモーター領域と NOSター ミ ネータ一領域と ァ ン ピシ リ ン耐性遺伝子（Am^r)と を含有する。

(2) イ ネのカルス の調製

イ ネの完熟種子から籾殻を除き 、 得られた外皮付き コ メ 種子をエタ ノ ール溶液で殺菌、 次いで次亜塩素酸ナ ト リ ゥムの希水溶液で殺菌 し、 さ らに滅菌水で洗浄する。

MS 培地にシ ョ 糖、 植物ホルモ ンと しての 2,4-PA、 寒 天を加えてなる組成のカルス形成用培地に、 前の外皮付 き コ メ 種子を置く 。 28°Cで 1 日 当 り 15〜： 18時間にわた り 、 1500〜2500 ノレ ッ ク ス の大陽光を照射しなが ら 40〜50 日 間、 培養する と 、 イ ネのカルス が形成される。 そのカ ル スを種子の胚乳部分から切取 り 、 さ らに篩別によ り 1mm 以下の寸法のカ ルスを得る _c

(3) 遺伝子運搬用の ウイ ス力 の調製

チタ ン酸カ リ ゥ ム製の市販ウイ スカ（微細な針状体）の 多数を、 小型のチューブ状容器内に入れてエタ ノ ールで 殺菌する。 エタ ノ ールを完全に蒸発によ り 除去する： こ のよ う に殺菌 された ウイ スカ を収納 している前記のチュ ーブ状容器に滅菌水を入れて洗浄 し、 該容器から遠心分 離によ り 洗液を除去する。 洗浄された ウイ スカ を収容す るチューブ状容器に R2液体培地を加えて、 ゥイ ス力 の懸 濁液を得る。

(4) イ ネ 'カルス細胞への外来遺伝子の導入用の材料の調 製

前項（1)に記載したよ う に作製された、 本発明 DNA を 正常に挿入、 連結してある組換えベク ター（すなわち、 前 記のベク ター p DAP、 ベク ター p l58N、 またはベク ター p 166A)を TE緩衝液に溶解してべク ター溶液を調製する。

上記のウイ スカ懸濁液を収容するチューブ状容器内に、 前記の 1mm以下の寸法のカルスを装入する。 カルス の細 胞量の PCVlml あた り ゥイ ス力の量が ：！〜 lOOmg である よ う にする。 さ らに容器内の混合物を攪拌 し、 次いで遠 心分離に力 ナる。 上清を捨てる と 、 イ ネのカ ルス細胞と ゥイ ス 力 と の混合物が沈殿と して得られる。

上記のチューブ状容器内で前記のカ ルス細胞と ウイ ス 力 と の混合物よ り なる沈殿へ、 本発明 DNAを含有する組 換えベク ター（すなわちベク ター p DAP、 ベク ター p l58N またはベク ター p 166A)の溶液と 、 除草剤ホス フ ィ ノ ス リ シンに耐性の遺伝子を選択マーカー と して含む既知のブ ラ ス ミ ドベク タ一 p35SC-SSの溶液と を加えて、 さ らに十 分に振 り 混ぜる： このよ う に して、 カノレス細胞と ゥイ ス 力 と 、 本発明 DNAを含有する組換えベク ターと 、 ブラ ス ミ ドベク ター p 35S C - S S と の均質な混合物を得る。 こ の 混合物を遠心分離と振 り 混ぜる操作と に反復的にかける こ と によ り 、 よ り 均質な混合物を得る。

(5)イネのカルスへの外来遺伝子の導入の操作

前項（4)に示されたよ う に調製されたカルス細胞、 ウイ スカ 、 本発明 D NAを含有する組換えベク ター、 およびプ ラス ミ ドベク ター p 35S C - S S よ り なる均質な混合物を超 音波照射によ り 処理する。 用いる超音波は、 10〜60KHz の振動数の も のであ る こ と が でき 、 照射強度は 0.：!〜 lW/cm²である こ と ができ る。 30秒〜 2分間の時間、 超音 波処理を行 う と 、 超音波の物理作用 と ゥイ ス 力 の助けに よ り 、 本発明 DNAを含む組換えベク ターと 、 選抜マーカ 一用のプラ ス ミ ドベク ター と は、 カルス の細胞内に侵入 して導入でき る。

(6) 導入ベク ターで形質転換されたカルス細胞の選抜

上記のよ う に超音波処理された混合物を、 R2液体培地 で洗浄し、 洗浄された混合物を遠心分離にかけて、 ウイ ス力からカ ルス細胞を分離する。 分離されたカルス細胞 は、 上記のプラ ス ミ ドベク タ一を細胞内に導入されて含 有する形質転換細胞である。

プラス ミ ドベク ターを含有するカルス細胞を、 R2培地 にシ ョ 糖、 植物ホルモ ン 2 , 4- PAを添加 してなる植物細胞 培養用の培地に入れて、 1500〜2000ル ッ ク ス の光を 1 日 当 り 15〜20 時間照射しなが ら 27〜29°Cで振と う 培養す る。 これによつて、 カルス細胞は細胞分裂を起こ して増 殖する。

培養を 2〜3 日行った後に、 得られた分裂した植物細胞 の懸濁液を、 N6培地にシ ョ糖、 2 , 4-PA、 ゲルライ ト及び 除草剤ホ ス フ ィ ノ ス リ シ ン を添加 して な る選抜用培地 (半固体状である）の上に均一に広げて加える。 さ らに、

1500〜2000ノレ ッ タ ス の光を 1 日 当 り 15〜20時間照射しな ら 27〜28°Cで 25〜30 日 間培養する。 こ う してホス フ ィ ノ ス リ シン耐性であ り 且つ導入べク ターで形質転換され た植物細胞が得られる。

(7) 形質転換植物細胞の再選抜

上記の よ う に得られたホス フ ィ ノ ス リ シン耐性の形質 転換植物細胞の中から、 本発明 DNAを外来遺伝子と して 十分に有効な量で含有する形質転換植物細胞のみを再選 抜する。

こ のために、 前者の形質転換細胞を、 N6培地にショ 糖 と 、 2 , 4-PA と 、 ゲルライ ト と 、 リ ジンのアナロ グ体であ る AE C (すなわち S - (2 -ア ミ ノ エチル）システィ ン）と を添 加 してなる再選抜用培地上に移植する。

移植された細胞を、 1 日 当 り 15〜 16時間、 1800〜 2000 ノレ ッ ク ス の光で照射しなが ら 27〜 28。Cで 25〜 30 日 間培 養する。

本発明 D NA を外来遺伝子 と して十分に有効な量で含 有する形質転換植物細胞は、 培地中に細胞増殖阻害剤 と して作用する AE Cが存在していても AE C耐性であって、 生育でき る。 AE C添加の上記培地で生育できた AE C耐性 の培養植物細胞を選抜する。

(8) 再選抜された AE C耐性の形質転換植物細胞からの植 物体の再生

上記のよ う に再選抜された AE C耐性の培養植物細胞を、 植物組織培養用の M S 培地にショ糖、 植物ホルモ ンと し てのベンジルアデニ ン、 ナ フ タ レ ン酢酸、 ゲルラ イ ト を 添加 してなる植物体再生用の分化培地に移植する

移植された細胞を、 1800〜 2000ノレ ッ ク ス の光を 1 日 当 り 15〜 16時間照射しなが ら 27〜 28°Cで 25〜 30 日 間培養 する。 このよ う にする と 、 培養された形質転換植物細胞 から、 分化によ り 、 芽と根が再生でき る。

再生した芽と根を含有する幼芽が長さ 10〜 30mm に生 育した後に、 その幼芽を、 MS培地にシ ョ 糖と ゲルライ ト を添加 してなる順化用の培地に移植する。 さ らに、 1 日 当 り 15〜 16 時間、 1800〜 2000 ノレ ッ ク ス の光を照射しなが ら 27〜 28°Cで 18〜 20 日 間育成する。

こ のよ う に して、 形質転換植物が再生でき る - こ う し て得られた植物体は、 温室内で土壌に移植して通常の条 件下で裁培する と 、 順長に生育して 3〜 6ヶ月 の裁培でィ ネ種子を結実でき る

(9) 導入した外来遺伝子の確認

上記のよ う に再生された形質転換イネ植物から緑色の 葉を採取する。 採取された葉を液体窒素で凍結 した後に 破碎する 。 そ の葉破碎物か ら 、 J. S ambrook ら の方法 (Molecular Cloning 、 第 2 版 、 Cold Spring Habor Laboratory Pre ss , 1989年に記載）に準じて D NAを抽出 する。

他方、 後記の配列表の配列番号 14に記載される塩基配 列を有するオリ ゴヌ ク レオチ ドと 、 配列番号 15に記載の 塩基配列を有するオ リ ゴヌ ク レオチ ドを化学合成 して、 プライマー用に用いる。

再生イネ植物体から上記のよ う に抽出 された DNA を テンプレー ト と して用い且つ上記の 2 種の合成オリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して用いて、 公知の P CR法に よって前記 DNAを増幅する。 得られた増幅反応液を常法 によ り ァガロース電気泳動にカ けて分画 し、 再生イ ネ植 物から抽出 された D NAの種々 の D NA分画の う ちで、 導 入された外来遺伝子の D NA に相当する D NA断片を含む ゲルバン ドを採る。

こ のバ ン ドに含有された D NA 断片の塩基配列を公知 のサザン法によって解析する と 、 本発明 D NAに相当する か否かを確認でき る。

前記においては、 本発明 D NAを外来遺伝子と してイネ 植物に導入 してイネ植物を形質転換する こ と のでき る好 適な形質転換方法を説明 した： しかし、 本発明 D NAは、 外来遺伝子と してイ ネ植物のみな らず、 他の種類の植物 に導入して植物の形質転換を行 う こ と に使用でき る。 従 つて、 本発明 DNAを植物体に外来遺伝子に導入でき る方 法を次に一般的に説明する。

本発明の DNAを導入でき る植物は、 特に限定される種 類のものではな く 、 例えば、 イネ、 ト ウモロ コ シ、 コム ギ、 ォォムギ、 およびその他の単子葉植物、 な らびにタ ノ コ 、 ダイ ズ、 ヮ タ 、 ト マ ト 、 ノヽク サイ 、 キユ ウ リ 、 レ タ スな どの双子葉植物な どが挙げられる。 先づ、 これら の植物から培養細胞を調製 し、 得られた培養細胞に本発 明 DNAを外来遺伝子と して導入するのが都合よい。

本発明の DNA導入に用いられる培養細胞の作製は、 植 物由来のいかなる外殖物であっても よ く 、 例えば、 胚盤、 生長点、 花粉、 葯、 葉身、 茎、 葉柄、 根由来の外殖物を 使用でき る。

上記 した外殖片を、 カ ルス形成用の培地、 例えば MS 培地（Murashige ら、 「Physiologia PlantarumJ、 1962年、 第 15卷、 473頁〜 497頁）、または R2培地（Ojima ら、「Plant and Cell Physiologyj、 1973年、 第 14巻、 1113-1121 頁、 あるレ、は N6培地（Chu ら、 1978年、 「InPro Symp. Plant Tissue Culture , Science Press Peking」、 43貞〜 50頁などの如く 、 必須成分と しての無機塩成分およびビ タ ミ ン類を含む植物組織培養用の培地に、 植物ホルモ ン と して、 列えば、、 2,4-PA(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 0.：!〜 5mg/リ ッ トル、 な らびに、 炭素源と して、 例えば、 シ ョ 糖 10〜60g/リ ッ トノレ 、 ゲルライ ト ；！〜 5 g/リ ッ トノレを 添加 してなる培地に置床 して培養する こ と によ り 得られ る培養細胞を用いて、 これに本発明 D NAを導入するのが 便利である。

本発明 D NAの導入の対象と なる植物細胞は、 例えば、 カルスや懸濁細胞な どの脱分化した培養細胞あるいは不 定胚、 苗条原基な どの培養細胞、 も し く は植物組織例え ば葉、 根、 茎、 胚、 生長点な どの細胞から作られた力ル ス細胞および懸濁細胞であるのが好ま しい。

本発明 DNAの導入用の培養細胞を調製するために、 力 ルス形成用培地に外殖片を置床する場合、 本発明 D NAの 導入用の培養細胞が得られるまでの培養期間は特に限定 される も のではない。 しかし、 形質転換植物を再生する こ と が必要であるから、 当該の培養細胞からの植物体再 生が可能である こ と 、 つま り 、 当該植物細胞が植物体再 生能力を保有している期間内に得られた培養細胞を用い る こ と が重要である。

また、 本発明 DNAの導入用の培養細胞は、 植物体再生 能力を保有している培養細胞であれば、 液体培地中で培 養 された懸濁細胞であっても よレ、 _c

本発明 DNAを植物細胞に導入するためには、 先づ、 本 発明 DNA を発現べク ターに組込んだ組換えべク タ一を 調製する こ と が必要である。 その組換えベク ターは、 植 物体に導入後の本発明 DNA が植物体中で発現する よ う に、 発現プロ モーターの下流に本発明 D NAを配し、 さ ら に本発明 D NA の下流にター ミ ネータ一を配する よ う に 調整された組換えベク ターである こ と を要する。 こ の 目 的に用い られる組換えべク ターは、 植物への導入方法の 種類に応 じて、 通常の植物形質転換に利用 される各種の ベク ターである こ と ができ る。 例えば、 エ レク ト ロ ポ レ ーシ ヨ ン法、 パーティ ク ルガン法、 ウイ ス カ一法な どに よる植物細胞への直接的な DNA導入法を用いる場合は、 pUC 系または p BR322 系などの大腸菌で増殖可能である プラ ス ミ ドベク ターを利用するのがよ く 、 またァグロ ノく クテ リ ゥム法を用いる場合は plan系な どのプラス ミ ドべ ク タ一を利用するのがよい。

組換えべク ター中で本発明 DNA の上流に配されるプ 口 モーターは、 例えば力 リ フ ラ ワーモザイ ク ウイノレス 由 来の C aMV35S「The EMBO Journal」、 第 6卷、 第 3901 頁〜3907頁、 1987年、 または、 特開平 6- 315381号公報 J、 ト ゥモロ コ シのュビキチンプロモーター [特開平 2 - 79983 号公報]、 フ ァゼォ リ ンプロモーター「Plant Cell , 第 1巻、 第 839頁〜 853頁、 1989年]である こ と 力 Sでき る _ε また、 本発明 D NAの下流に配される ター ミ ネータ一は、 例えば 力 リ フ ラ ワーモザイ ク ウイノレ ス由来のター ミ ネ一ター、 あるいはノ パ リ ン合成酵素遺伝子由来のター ミ ネータ一 [The EMBO J .第 6巻、 第 3901頁〜 3907頁、 1987年]で あるのがよい。 しかし、 植物体中で機能するプロモータ 一やター ミ ネータ一であれば、 何れでも よい。

また、 本発明 DNAの導入で形質転換された植物細胞を 効率的に選択するためには、 用いる上記の組換えべク タ 一は、 適当な選抜マーカー遺伝子を含有するプラ ス ミ ド ベク ター と 共に植物細胞に導入される こ と が好ま しい。 こ の 目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、 抗生物質ハ ィ グロマイ シンに耐十生であるハイ グロマイ シ ンフ ォ ス フ ォ ト ラ ンス フ ェ ラ ーゼ遺伝子、 あ る いはカ ナマイ シ ン、 ゲンタ マィ シンに耐性であるネオマイ シンフ ォ ス フ ォ ト ラ ンス フ ェ ラ ーゼ遺伝子、 も し く は除草剤フ ォ ス フ イ ノ ス リ シンに耐性であ る ァセチル ト ラ ンス フ ェ ラーゼ遺伝 子 [The EMBO Journa 第 6巻、 第 2513頁〜 2518頁、 1987年、 または特開平 2-171188号公報]である こ と がで き る。

本発明 DNA を外来遺伝子 と して植物に導入する方法 は、 ァグロパクテ リ ゥム法 [Bio/technology、 第 6卷、 第 915 頁〜 922 頁、 1988 年]、 エ レ ク ト 口 ポ レーシ ヨ ン法 [Plant cell Rep., 第 10卷、 第 106頁〜 110頁、 1991年]、 パーティ クノレガン法 [Theor. Appl. Genet., 第 79巻、 第 337頁〜 341頁、 1990年]、 ウイ ス カ一法である こ と がで き 、 しかし特にこれらに限定されない。

本発明 DNA を外来遺伝子に導入するのに ウイ スカ法 を用いる場合、 好適に使用でき る ウイ ス カは、 具体的に は、 直径が 0.01〜： 10 μ m、 好ま しく は、 0.5〜1 μ mであ り 、 長さが、 1〜： 100 /i m、 好ま しく は 3〜40 n mである。 ウイ ス カ材質は、 チタ ン酸カ リ ウム、 炭酸カルシ ウ ム 、 ホ ウ酸アル ミ ニ ウ ム、 窒化ケィ 素、 酸化亜鉛、 塩基性硫 酸マ グネシウム、 マグネシア、 ホ ウ酸マグネシゥム、 力 —ボングラ フ アイ ト 、 硫酸カルシウム、 サフ ァイ ア、 シ リ コ ンカーバイ ドであるのがよい。 好ま し く はチタ ン酸 カ リ ウム、 炭酸カルシウム、 またはホ ウ酸アルミ ニ ウム 製ゥイ ス力がよい。

こ こ で使用 される ゥイ ス力は、 表面処理を行わな く と も単独で使用でき るが、 ウイ ス カ表面に塩基性官能基を 持つウイ ス カ 、 好ま し く は表面処理剤によ り 表面処理さ れている ウイ スカ を使用する と 、 植物細胞の形質転換率 を高める こ と ができ る。

ウイ ス カ表面への塩基性官能基の付与に用いる化合物 は、 ウイ ス カ表面と共有結合でき る化合物であれば、 特 に限定されない。 好ま し く は、 シラ ンカ ップリ ング剤、 よ り 好ま し く は塩基性官能基を有する シラ ン力 ップ リ ン グ剤である。 シラ ンカ ップリ ング剤 と しては、 3 - (2 -ア ミ ノ エ ト キ シノレア ミ ノ ブ 口 ピル） - ト リ メ ト キ シ シラ ン 、 3 - ア ミ ノ ブ口 ピル - ト リ エ ト キ シシ ラ ンな どの塩基性シ ラ ンカ ップ リ ング剤を使用でき る。 塩基性官能基を有する シラ ンカ ップリ ング剤であれば、 何れも使用でき る .：

ゥイ ス力 と 混合される植物細胞の量は適宜に調整され る。 しカゝし、 ゥイ ス力 と混合される植物細胞の容量は、 特定の値に限定される も のではない。 植物細胞と共に媒 質液体中に混合される ウイ ス 力 の量は植物細胞の容量に 伴い調整されるのがよレ、。植物細胞量の P CV l ml当た り 、 ウイ スカはその量力 S 1〜： 100m g、 好ま しく は、 4〜40m gに なる よ う に添加されるのが好ま しい。

このよ う に して、 媒質液体中に分散させた植物細胞、 ウイ スカおよび本発明 D NA 含有の組換えべク ターの混 合物を作る。 こ の混合物を次に遠心分離処理する。

例えば遠心加速度が 3 , 000〜50，000 X g、 好ま し く は、 10，000〜30，000 X g で、 遠心時間が、 10秒〜 40 分、 好ま しく は、 5〜10分間行 う 。 その後、 得られた沈殿を超音波 処理にかける。 例えば超音波処理は、 周波数が lk〜lMHz、 好ま しく は、 10〜60kHzで、 照射時間が 0.2秒〜20分間、 好ま し く は、 30秒〜 2分間で、 強度は、 0.01〜： 10W/cm²、 好ま し く は、 0. 1〜W/cm²で超音波の照射を行 う のがよい。

超音波処理された混合物から、 遠心分離によって植物 細胞を分け取る。 得られた植物細胞は、 導入された本発 明 D NA 含有の組換えベク ターおよび選抜マーカ一用の ブラ ス ミ ドベク ターを含有する も のであ る ：

こ のよ う に して得られた外来遺伝子を導入された植物 細胞は、 液体培地な どによ り 洗浄する： その後に、 細胞 に導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な 選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床 し培養する。 これによ り 、 形質転換された培養植物細胞を得る こ と が でき る。

次に、 本発明 D NAを含有する組換えべク ターを十分に 有効な量で含有する形質転換細胞を効率良 く 再選抜する ために、 細胞増殖阻害剤である リ ジンアナ口 グを添加 し た培地上で培養する。 リ ジンアナロ グと しては、 例えば S - (2 -ァ ミ ノ ェチル） -システィ ン（AE C)あ る いは 0 - (2-ァ ミ ノ エチル） -セ リ ンを 、 10m g/l〜： 1000m g/l、 好ま し く は 100m g/l〜300mg/lの濃度で再選抜用培地に添加でき る。

前記のよ う に再選抜された本発明 D NA を外来遺伝子 と して組込まれた組換えべク ター と選抜マーカー用のベ ク タ一と を含有する形質転換植物細胞から、 次に、 植物 体を再生する。 植物体の再生は公知の要領で行 う こ と が でき る。 例えば、 前記のよ う に再選抜された形質転換植 物細胞を、 公知の植物体再生用培地に置床 して培養する こ と によ り 植物体の再生を行 う こ と ができ る。

植物体再生用の培地に置床された形質転換細胞は 15〜 30°C、 好ま しく は、 20〜 28°Cの温度で 500〜 2000ノレッ ク ス 、 好ま し く は、 800〜 1000 ノレ ッ ク ス の光を照射しなが ら培養期間 20〜 60 日 間、 好ま しく は 30〜 40 日 間で培養 する。

これによつて、 個々 の植物細胞から本発明 D NAよ り な る外来遺伝子を担 う 組換えベク ターが導入されて形質転 換された植物体が再生でき る。

形質転換細胞から再生された植物体は次に順化用培地 で培養する。 その後、 順化された再生植物体を、 温室内 で通常の裁培条件下で育成する と 、 3〜6力月 の裁培で植 物体は成熟し結実して種子を得る こ と ができ る。

なお、 このよ う に再生され且つ裁培された形質転換植 物体中の導入された外来遺伝子の存在は、 公知の PCR法 とサザン法 (Southern, 「J. Mol. Biol.,」 98巻 503-517頁、 1975年）によって、 植物体中の DNAの塩基配列を解析す る こ と によって確認でき る。

この場合、 形質転換植物体からの DNAの抽出は、 公知 の J. Sambrook ら の方法（「Molecular CloningJ 第 2版、 Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989年）に準じて 実施でき る。

再生された植物体中に存在する本発明 DNA よ り なる 外来遺伝子を PCR法を用いて解析する場合には、 上記の よ う に再生植物体から抽出された DNAを、 テ ンプレー ト と して用い且つ第 1 の本発明によ る DNA、 あるいは第 2 の本発明によ る改変 DNA の塩基配列に従って適当に選 択された塩基配列を もつ合成 したオ リ ゴヌ ク レオチ ドを プライ マー と して用い、 これらを混合 して PCR法用反応 液中に加えて増幅反応を行 う。 こ の増幅反応においては、 DNAの変性、 アニー リ ング、 伸張反応を数十回繰 り 返え すと 、 本発明 DNA配列を含む DNA断片の増幅生成物を 得る こ と ができ る。

増幅生成物を含む反応液を例えばァガロース電気泳動 にかけ る と 、 増幅された各種の D NA断片が分画される。 導入した外来遺伝子である本発明 D NA に相当する DNA 配列を含有する と認め られる D NA 断片を含むバン ドア ガロースゲル片を切出す。 切出されたゲル片内に含有さ れる D NA断片の D NA配列の塩基配列をサザン法で解析 する と 、 その DNA配列が本発明 D NA に対応するか確認 でき る。

第 7 の本発明においては、 力 リ フ ラ ワーモザイ ク ウイ ノレ ス 由来であ り 且つ植物で発現可能なプロ モーター と 、 NO S ター ミ ネータ一と 、 ア ン ピシ リ ン耐性遺伝子と を含 有するプラ ス ミ ドベク ターに、 前記のプロモーターの支 配下に、 配列表の配列番号 1、 または配列番号 5または配 列番号 7 に記載の 1143bp の塩基配列を有する D NA配列 を担 う DNA 断片を組込んでなる組換えべク ターが提供 される。

上記のプ ラ ス ミ ドベ ク タ ー 力 S プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー p BI221であるのが好ま しレヽ。

図面の簡単な説明

第 1 図は、 後記の実施例 4 においてイネの培養細胞を 形質転換するのに用いる外来遺伝子の導入用の組換えべ ク ターであ り 且つ第 2の本発明によ る改変 D NA- 158N配 列を内部に含有するべク ター p 158Nを、べク タ一 p BI 221 から作成する手順を図解的に示す。

第 2図は、 後記の実施例 4においてベク ター p 158N と 共にイネの培養細胞に導入されるべク ターであって、 選 抜マーカ ー と してのホス フ ィ ノ ス リ シン遺伝子 SS を含 有するべク ター p 35SC-SSの構造を図解的に示す。

発明を実施するための最良の形態

以下に、 第 1 の本発明によ る配列長 1143bp の DNA配 列（配列表の配列番号 1 に示す塩基配列を有する DNA 配 列すなわち DHDPS-DNA-1143 配列）を含有する DNA 断 片の製造を例示する実施例 1 を参照 して、 第 1 の本発明 を具体的に説明する。 また、 第 2 の本発明による配列長 1143bp の改変 DNA-158N配歹 ij (配列表の配列番号 5 に示 す塩基配列を有する DNA配列）を含有する DNA断片の製 造を例示する実施例 2、 ならびに第 2の本発明によ る配列 長 1143bp の改変 DNA-166A配列（配列表の配列番号 Ί に 示す塩基配列を有する DNA配歹 ij )を含有する DNA断片の 製造を例示する実施例 3 を参照 して、 第 2 の本発明を具 体的に説明する。

さ らに、 組換えべク ターに組込まれた本発明 DNAを外 来遺伝子 と してイ ネ植物体に導入 してイネ植物を形質転 換する方法を例示する実施例 4 を参照 して、 第 3 の本発 明を具体的に説明する。

但し、 以下の実施例に記載される実験操作の手順は、 特に記述 し な い 限 り 、 「 Molecular Cloning」第 2 版 (J.^ambrook ら、 Cold Spring Habor Laooratory Press, 1989年）に記載されている方法に従った。 実施例 1

(1) ィネ mRNAの調製

イネ （品種 ： 日 本晴） の種子を播種した。 裁培 7 日 目 の幼植物体の茎葉 2gを液体窒素で凍結した。 凍結した茎 葉を乳鉢内で粉砕した。 その粉砕物から公知の AGPC 法 (Acid Guanidinium thiocy anatc phenol-chloroformを使 用）（実験医学、 Vol.9 Νο·15(11月 号） 1991年、 99頁〜 102 頁）に従い、 全 RNA約 2mgを抽出 した。 次に、 得られた 全 RNA ら、 mRNA を、 mRNA精製キ ッ ト（Pharmacia Biotech社製、 mRNA Purification Kit)によ り 単離した。 こ う してイネの mRNAを約 30 μ g得た。

(2) イネの cDNAライ ブラ リ ーの構築

上記（1)で得 られた mRNA カゝ ら 、 cDNA 合成キ ッ ト (Pharmacia Biotech社製、 TimeSaver cDNA Synthesis Kit) によ り cDNAを得た。

この cDNAを、 EcoR I切断末端を仔ゥシ小腸由来アル 力 リ ホス フ ァ タ ーゼ処理 した λ gtll フ ァージべク タ ー [ DNA Cloning Techniques, IRL Press, Oxfond, 49卷 (1985年）参照 ； ambda gtll/EcoR I/C1AP-Treated Vector Kit(STRATAGEN社製）〕 に連結して、 得られた組換えて フ ァ ー ジ を イ ン - ビ ト ロ ノ、。 ッ ケ ー ジ ン グ ' キ ッ ト (Gigapackll Gold Packaging Extract(STRATAGENE社 製））によ り ラムダフ ァージにパッケィ ジングした _c

こ う して得られた組換えフ ァージを大腸菌 Y1088 に感 染させて増殖させた。 大腸菌の溶菌プラーク と して多数 の組換えフ ァージが得られた。 プラーク 中のフ ァージは、 イ ネ由来の全 cDNA を含有する多種多様のフ ァージから 成る ものであ り 、 イ ネの cDNA ライ ブラ リ ー と して利用 した。

(3) PCR法用のプライマーの構築

ィネ DHDPS をコー ドする の cDNA 断片をク 口 一ニ ン グするための DNA プローブを PCR 法用に作製するため に、 まずプライ マーの設計を行った。 そのためには、 既 知のコムギ及び ト ウモ ロ コ シの DHDPS 遺伝子の塩基配 列および DHDPS のア ミ ノ 酸配列を参考に して、 下記の 塩基配列を有する 2 種類のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライ マ ー No.l と プライ マ ー No.2 と して作製した。

プライマ ー No.l(配列表の配列番号 3に示す塩基配列を 有す）：

5' -GTAATAGTTGGAGGAACAACAGGAG-3

プライマ 一 No.2(配列表の配列番号 4に示す塩基配列を 有す）：

5' -GAGCTGAGCCAGAGCAGTGTTGAG-3'

上記のオ リ ゴヌ ク レオチ ドの作製は、 DNA 合成装置 (Model 391、 アプライ ドバイオシステム ズ社製）を用いて オ リ ゴヌ ク レオチ ドを合成 し、 さ らにイ オン交換 HPLC で精製する こ と によ り 行った。

(4)プ口一ブ DNAの作製 次に、 上記の 2 種類の合成オ リ ゴヌ ク レオチ ドの各 ΙΟρ.Μ を第 1 のプライマー及び第 2 のプライマーと して 用い、 上記（2)で得られた組換えファージよ り なる cDNA ライ ブラ リ ーの 1 1をテンプレイ ト と して用レ、、 これら を PCR 法用の増幅反応液（10mM の Tris-HCl(pH8.3)、 1.5mMの MgCl₂、50mMの KCl、0.001%ゼラチン、 pH8.3;4 種のヌ ク レオチ ド dNTP の各 2.5mM の混合物、 および DNAポ リ メ ラーゼ Takara Ex Taq、 2.5単位） 50 μ 1にカロ えて、 増幅反応を行った。 こ こで使用 される増幅反応液 は、 PCRキ ッ ト（PCR Amplification Kit (宝酒造（株）社製） によ り 調製した。

PCR 法に よ る DNA の増幅反応は、 PCR 反応装置 (PERKIN ELMER社製、 DNA、 Thermal Cycler 480)を 用いて、 変性を 94°C、 30秒間、 ァニー リ ングを 55°C、 1 分間、 また伸張（extention)を 72°C、 2分間行 う 3つの反 応操作を 35回繰り 返すこ と によって実施した。

上記のよ う にする と 、 イネ DHDPS 遺伝子に相当する DNA配列の う ちの一部分である DNA 断片の増幅生成物 が生成されるから、 これをプローブ DNAと して採取する。 そ して、 以下の cDNA ライ ブラ リ ーのク ローニングに用 いた。

(5) イネの cDNAライ ブラ リ ーからのイネ DHDPS遺伝子 の DNAの選択

上記（2)で作製したイネの cDNAライ ブラ リ ーである組 換えフ ァ ージから、 上記（3)で作製したプロ一ブ D NA に よ り 、 イネ DHDP S遺伝子に対応する D NA配列を組込ま れた組換えファージをス ク リ ーニングする。

こ の 目的のためには、 上記（2)で得られたイネ cD NA ラ イ ブラ リ ーである組換えフ ァ ージのプラーク を 1.5 %寒 天培地上に形成させた。 それらプラーク をナイ 口 ン膜（ァ マ シャ ム社製）ハイ ボン ド Nに転写した。 こ う してナイ 口 ン膜に転写されたフ ァージのプラーク に含まれている フ ァージ DNAは、アル力 リ 変性液（1.5M NaC 2.0M NaOH) および中和液（1.0M Tris -HCl pH5、 2.0M NaCl)でそれぞ れ 10分間処理し、 その後に UV照射によ り ナイ 口 ン膜上 に固定した。

次に、 上記（4)で得られたプロ一ブ D NA をジゴキシゲ ニン（DIG)でラベル して得られた標識プローブ DNA を、 フ ァージ D NA を固定したナイ 口 ン膜に対してプラーク · ハイ ブリ ダイゼーシ ョ ンさせた。 プローブ D N Aのラベリ ングは DI G-ELISA D NA Labeling & Detection Kit (ベ一 リ ンガ一'マ ンハイ ム社製）に よ り 行った。

この場合、 フ ァージ DNAの固定されたナイ ロ ン膜をハ ィ ブ リ ダイゼーシ ョ ン溶液（500mM Na-Pi ノく ッ フ ァー、 pH7.2、 7 % SD S、 l mM EDTA)に浸し、 さ らに 65°C、 10 分間、 浸漬処理を行った。 次に前記の DIG ラベルした標 識プローブ D NA( 10ng/ml)を加え、 65°C、 15 時間にわた り ハイ ブリ ダイゼーシ ョ ン反応を行った。 反応終了後、 洗浄液 （40mM Na-Piノく ッ フ ァ ー、 ρΗ7·2、 1 % SDS)で 20 分間ずつ 3 回洗浄した。 その後、 上記の DIG-ELISA Labeling & Detection Kitを用いて、 目的 の組換えフ ァージの検出を行った。 ハイ ブリ ダィ ズし X 線フ イ ノレム上で強く シグナルを発 している 4 個の組換え フ ァ ージプラーク 、 すなわち DHDPS 遺伝子が組み込ま れている と 思われる フ ァージのプラーク を 30万個のフ ァ ージプラーク から、 探知する こ と ができた。 そ して、 前 記の 4個の組換えフ ァージプラーク を単離選抜できた。

これら 4個の組換えフ ァージから、 λ DNA単離キ ッ ト (Lambda DNA Purification Kit(STRATAGENE社製））に よ り 、 それぞれにフ ァージプラーク の 4 個ごと に別々 に λ DNAを単離した。

この際の ； I DNAの単離は次のよ う に して行った。 すな わち、 各々 の フ ァ ージを大量に増殖させた培養液 5mlに、 DNaseI(20mg/ml)50 μ 1、 RNaseA(2mg/ml)200 μ 1をカロ え、 室温で 15分間、 放置した。 得られたフ ァ ージ増殖溶 液を 15000rpm、 4°Cで 10分間遠心分離した。 得られた上 清に 80% DEAE-セノレロー ス 25ml力 Qえ、 室温で 10 分間 イ ンキュベー ト した。 このよ う にイ ンキュベー ト された 混合液を遠心分離し、 得られた上清に 0.5M EDTA 2ml、 Pronase(50mg/ml)770 μ 1をカ卩え、 37°Cで 15分間放置し た。 さ らに、 5% CTAB溶液（1% CTAB(Cetyltrimethyl- ammouium bromide) , 50mM Tris-HCl、 pH8.0、 lOmM EDTA)1.5ml を加えた。 得られた混合物を 65°C、 3 分間 処理した後、 水中で 5 分間放置 した。 こ う して得られた それぞれの反応液に 1/10容の 3M酢酸ナ ト リ ゥム、 2倍 容のエタ ノ ールを加え、 - 20°Cで約 6時間放置し、 その後、 こ の溶液を遠心分離し、 沈澱したフ ァ ージ DNAを乾燥さ せ、 5mlの水に溶解して保存した

上記のよ う に して単離された 4種類のフ ァージ DNAの 各々 5 μ 1を Ηノく ッ フ ァ ー中で制限酵素 EcoR Iの 10ュ ニ ッ トで消化 して、 その消化反応液を分析した。 その結 果これらフ ァージ DNAはいずれも同一の DNA配列であ る こ と が確認された。

従って、 イ ネの DHDPSの遺伝子に相当する DNA配歹 IJ を含有する と判定されたフ ァ ージ中の挿入 DNA断片は、 上記の よ う に選抜された採取フ ァージのフ ァ ージ DNA から制限酵素 EcoR Iで切出 して収得できた。

(6) イ ネの DHDPS遺伝子に相当する DNA配列を含有す る cDNAの ク ロ ーニ ン グ

上記のよ う にイネの DHDPS遺伝子に相当する DNA配 列を含有する と判定された DNA断片と して、 フ ァ ージか ら切出 して収得された DNA断片は、 これをブラ ス ミ ドべ ク タ一 p Bluescript II SK(+)の EcoR I切断部位に DNA リ ゲー シ ョ ン 'キ ッ ト によ り 挿入、 連結して組換えブ ラ ス ミ ドベク タ一を構築 した。 こ の よ う に構築された組換え ブラ ス ミ ドベク ターの導入で大腸菌 XLI-Blue MRF' を 形質転換した。

上記のよ う に、 構築された組換えプラス ミ ドベク ター を大腸菌 XLT-Blue MRF'に導入するために、 上記で得ら れた組換えフ ァージ DNA の 10 μ g を、 H ノく ッ フ ァー中 で、 制限酵素 EcoR I の 10 ュニ ッ トで消化して消化反応 液を得た。また、プラス ミ ドベク ター p Bluescript II SK (+) の 10 μ gを同様に EcoR Iで消化して消化反応液を得た。 それぞれの消化反応液に 1/10容の 3M酢酸ナ ト リ ゥム、 2 倍容のエタ ノ ールを加え、 -20°Cで約 6時間放置し、 その 後にそれぞれの得られた DNA溶液を遠心分離し、 沈殿し た DNA を乾燥させ、 5 μ 1 の水に溶解した。 こ う して得 られたフ ァージ由来の DNA の水溶液と プラ ス ミ ド由来 の DNA水溶液の各々 5 μ 1 を混合し、 得られた混合物を DNA Ligation kit (宝酒造（株）製）で処理して、 それら 2種 の DNA を連結させた。 得られた連結反応液に 10 分の 1 容量の 3M酢酸ナ ト リ ゥム、 2倍容のエタ ノ ールを加え、 -20Vに約 6時間放置した。 得られた混合液を遠心分離し、 沈殿した DNAを乾燥させた。 こ う して得られた連結べク タ一 DNAを 10 μ 1の水に溶解した：

こ う して得られた連結ベク ター DNA の水溶液 10 μ 1 (DNA lOng)と 、 市販の大腸菌 XLl-Blue MRF'コ ンビテン トセノレ （STRATAGENE 社製） 100 μ 1 と を、 1.5ml容チュ ーブに入れ、 氷中で 30分間、 42でで 30秒間、 そ して再 び氷中で 2 分間イ ンキュベー ト した。 その後に、 イ ンキ ュ ベー ト された混合物に対して SOC 液体培地（2% バク ト - ト リ プ ト ン、 0.5% ノく ク ト -酵母抽出物、 lOmM NaCl、 2.5mM KC1、 lOmM MgSO lOmM MgCl₂、 20mM Glucose を含有） 900 μ 1を加えて力ゝら、 37°Cで 1時間大腸菌を振 と う培養する。

得られた大腸菌の培養液の 100 μ 1を、アンビシ リ ンを 50mg/lの濃度、 X-gal(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D- Galactoside)を 20mg/l の 濃 度 、 IPTG(Isopropyl-b-D- thiogalactopyranoside) ¾r 20mg/l の濃度で添力 Dされてあ る LB寒天培地（1% ノく ク ト -ト リ プ ト ン、 0.5% バタ ト -酵 母抽出物、 0.5°/。 NaCl、 0.1% Glucose, pH 7.5、 寒天 1.5% 含有）にプレーティ ングした。 37°Cで 16 時間、 大腸菌を 培養後、 白色に発色してない大腸菌コ ロ ニーから、 白色 に発色 している大腸菌コ ロ ニーを、 前記の連結ベク ター DNAで形質転換された大腸菌と して分離した。

こ の よ う に して分離された白色を発色 している且つァ ン ピシ リ ン耐性である大腸菌コ ロ ニー 10個を、 ア ンピシ リ ン 50mg/lを含む液体培地で増殖させ、 さ らに増殖され た大腸菌から、プラ ス ミ ド精製キ ッ ト（QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社製）によ り ブラ ス ミ ドを分離し且つ 精製 した。 こ の精製によ り 、 上記で得られた耐性コ ロ ニ 一の形質転換大腸菌から 50 μ g(50 μ 1)のブラ ス ミ ドを 得た。

このよ う にク ローニングされて得られた前記のプラ ス ミ ドは、 イネ DHDPS遺伝子に相当する DNA配列を内部 に含有する DNAである 目 的の組換えプラス ミ ドであ り 、 そ して約 4.3kbのサイ ズを有した。

(7) ク ローニングされた DNAのシー ク ェンス解析

上記のク ローニングされた DNA である組換えブラ ス ミ ド（約 4· 3kb のサイ ズ）を市販の塩基配列決定キ ッ ト で 処理する と 、 その DNA断片の全体の塩基配列を決定でき る。そ して、その DNA断片内部に含有されたイネ DHDPS 遺伝子に該当する DNA配列の塩基配列を判定でき る。 こ の よ う に判定された塩基配列をもち且つイネ DHDPS 遺 伝子をコー ドする DNA配列の塩基配列は、 後記の配列表 の配列番号 1に記載されてある。

なお、上記の DNAの塩基配列の決定を行 う に当っては、 塩 基 歹 ij 決 キ ッ ト (Autoread Sequencing Kit (Pharmacia Biotech社製）を用レ、て、 変性処理を行った後 に自動 DNAシーケンサ ALF DNA Sequencer Π(フ ァノレマ シァ社製）で前記 DNA断片-ひ： の塩基配列を決定した： 本発明によって実施例 1 で得られた DNA 断片- Q に含 有され且つイネイネ DHDPS をコー ドする と判定された DNA配列の塩基配列は、 配列表の配列番号 1に記載され た 単一 の オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム 内 に あ る 1140bpの塩基からなる。 また、 第 1の本発明による配列 番号 1に記載される塩基配列をもつ DNAは、 配列番号 2 に記載の 380 個のア ミ ノ 酸残基からなる タ ンパク をコ一 ドしている。 こ の配列番号 2 のア ミ ノ 酸配列を前記のコ ムギの DHDPS のア ミ ノ 酸配歹 IJ (前記の特開平 3-127984 号公報）および ト ゥモ ロ コ シの DHDPS のア ミ ノ 酸配歹 iJ (前記の Molecular & General Genetics, 第 228卷 287頁 〜293 頁、 1991 年）と 比較する と 、 それぞれ 82%および 79%の相同性がある と認め られた。 こ の相同性がある領 域よ り 以外の DNA配列領域では、 コムギおよび ト ゥモ ロ コ シと は明 らかに異な り 且つイ ネに特有である DNA 配 列を、 第 1の本発明 DNAは有する。

実施例 2

本例は、 第 2 の本発明によ り 得られた改変 DNA-158N と命名 された DNA 配列（すなわち、 配列表の配列番号 5 に記載の塩基配列を有する DNA配歹 ij )を含有する DNA断 片の製造を例示する。

(1) PCR 用 のプラ イ マー と しての合成オ リ ゴヌ ク レオチ ドの構築

DNA 合成装置（Model-391,ァプライ ドバイ オシステ ム ズ社製）を利用 して、 配列表の配列番号 9に記載の塩基配 列を有するオリ ゴヌ ク レオチ ドであるプライマ ー No.3と 、 配列番号 11 に記載の塩基配列を有するブライマ ー FW- 1 と 、 配列番号 12 に記載の塩基配列を有するプライ マー RV-1 と 、 配列番号 13 に記載の塩基配列を有するブライ マ ー BSKPN-1 と を化学合成によ り構築した。

さ らに、 配列番号 14に記載の塩基配列を有するプライ /5

62 マーと 、 配列番号 15に記載の塩基配列を有するプライマ 一も合成した。

(2) PCR法用のテ ンプ レー ト の作製

実施例 1 の（6)項において、 イ ネの DHDPS遺伝子に相 当する DNA配列を含有する と判定される DNA断片 と し て組換えフ ァージから切出 して収得された DNA断片は、 プラス ミ ドベク ター p Bluescript II SK( + )の EcoR I切断 部位に DNA リ ゲーシ ヨ ン 'キ ッ ト によ り 連結されて、 組 換えプラス ミ ドを構築した。

上記の組換えプラ ス ミ ドベク タ一 p DAP8-1 に含まれ る DNA断片に対して、 PCR法によ る Xba I、 Sac I制限 酵素切断部位を付与するために、 下記の反応を行った。

p DAP8-1の 5 μ 1 と 、 配列番号 14のプライマーおよび 配列番号 15のプライマーの 1 / Μと を増幅反応液（10mM の Tris-HCl(pH8.3)、 ImM の MgCl₂、 50mM の KC1、 4 種のヌ ク レオチ ド dNTP の各 0.2mM の混合物、 LA Taq DNAポ リ メ ラーゼの 2.5ュニ ッ ト を含有）の 100 μ 1にカロ えて、 増幅反応を行った。 増幅反応は、 変性を 94°C , 1 分、 アニー リ ング 60°C， 30秒、 伸張 72°C , 1 分の 3つの 反応操作を 30回繰 り 返すこ と によ り 実施した。

こ の増幅反応の終了後、 そ の増幅反応液を低融点ァガ ロース電気泳動によ り 分画し、 増幅 DNA生成物と して約 1160bpのノく ン ドをゲルから切出 した。 このゲル切片から GENCLEAN II Kit (フナコ シ社製）によ り 、 DHDPS 遺伝 W

63 子をコー ドする DNA配列の 5' 側に Xba I部位、 3' 側に Sac I部位を持つ、 DNA断片の精製品（Xba I-DNA-Sac I) (DNA断片- XS)を得た。

市販のブラス ミ ドベク ター pUCl9の 10 μ gを Μノく ッ 5 フ ァ ー中で Xbalの 10ュニ ッ ト と Saclの 10ュニ ッ トで 消化した。

前記の DNA断片（Xba I-DNA-Sac I)と こ の切断された 線状のプラ ス ミ ドベク タ一 pUCl9 と を、 前記の DNA リ ゲーシ ョ ン 'キ ッ ト に よ り 連結 して環状の組換えブラ ス0 ミ ドベク ター p DAP8-1-XS (約 3.9kb)を得た。

このプラス ミ ドベク ター p DAP8-1-XSが下記の PCR法 でテンプレー ト と して利用 された。

(3) 所要な DNA断片の PCR法による増幅と 回収

(i) PCR法の第 1回段階

5 所要な DNA断片を PCR法によ る増幅反応によ り 収得 するために、 PCR法の第 1回段階と して下記の（A)反応と (B)反応と を行った。

すなわち、 その（A)反応では、 テ ンプ レー ト と して用い られる前記の組換えプラス ミ ドベク ター p DAP8-1-XSの 50 n 1 と 、 ブライマ一 FW- 1の 1 μ M と 、 配列番号 9のプラ ィマ一 Νο·3 の 1 μ Μ と を、 増幅反応液（10mM の Tris- HCl(pH8.3)、 ImMの MgCl₂、 50mMの KC1, 4種のヌ ク レオチ ド dNTPの各 0.2mMの混合物、 LA Taq DNAボ リ メ ラーゼの 2.5ユニ ッ ト を含有）の 100 μ 1に加えて、 増 5

64 幅反応を行った。 こ の（A)反応で得られた DNA の増副生 成物を、 DNA断片- Aと称する。

また、 （B)反応では、 テ ンプレー ト と して用い られる前 記べク ター p DAP8-1-XS の 5 μ 1 と 、 プライマーと して 用いられる前記のプライマ ー RV- 1 の Ι μ Μ と 、 前記の BSKPN-1の 1 μ Μ と を、 （Α)反応で用いた と 同 じ組成の 増幅反応液に加えて、 増幅反応を行った。 こ の（Β)反応で 得られた DNAの増幅生成物を DNA断片- Β と称する。

なお、前記の増幅反応は、PCR反応装置（Promram Temp Control System PC-700(ア ステ ッ ク社製））内で、 変性を 94°Cで 30秒間、 アニー リ ングを 55°Cで 2 分間、 伸張を 72°Cで 2分間行 う 3つの反応操作を 30回繰り 返すこ と に よ り 実施された。

増幅反応の終了後、 （A)反応の増幅反応液を低融点了ガ ロース電気泳動によ り 分画し、 増幅 DNA生成物と しての 480bp の DNA 断片- A を含むバン ドをァガロースゲル力 ら切出 した。 また、 （B)反応の増幅反応液を低融点ァガロ ース電気泳動にかけて分画し、 増幅 DNA生成物と しての 1200b の DNA断片- Bを含むバン ドをァガロースゲル力、 ら切出 した。

これ ら の ゲル切片力、 ら 、 GENCLEAN II Kit (フナ コ シ 社製）によ り 分離して DNA断片- Aの精製品 と DNA断片- Bの精製品を得た。

(ii) PCR法の第 2回段階 W

65 次に、 PCR法の第 2 回段階と して、 前記のプライマ ー RV-1 の 1 μ 1および FW-1 の 1 μ 1、 な らびに前記の（A) 反応および（B)反応で増幅 した DNA 断片- A の 1 μ 1 と DNA 断片 - Β の 1 μ 1 を、 増幅反応液（10mM の Tris- 5 HCl(pH8.3)、 ImM の MgCl₂、 50mM の KC1, dNTP の各 0.2mMの混合物、 LA Taq DNA ポ リ メ ラーゼの 2.5ュニ ッ ト を含有） 100 μ 1 に加えて、 増幅反応を行った。 こ の 場合の増幅反応は、 変性を 94°C、 30秒、 アニー リ ングを 55°C、 2分、 伸張を 72°C、 2分行 う 3 つの反応操作を 200 回繰 り 返して実施した。

こ の増幅反応の終了後、 その増幅反応液を低融点ァガ ロ ース電気泳動によ り 分画し、 増幅 DNA 生成物と して 1200bpの所期の DNA断片- C を含有するバン ドをゲル力 ら切出 した。 こ のゲル切片から GENCLEAN II Kit (フナ 5 コシ社製）によ り DNA断片- C を分離して且つ DNA断片- C の精製品を得た。

この DNA断片- Cは、配列表の配列番号 5に示された塩 基配列を有する DNA-158N配列（1143bpのサイ ズ）を内部 に含有する約 1350bp のサイ ズの DNA断片であ り 、 し力 0 も DNA-158N配列の 5' -末端の先方に Kpn I切断部位を もち且つ 3' -末端の後方に Sac I切断部位をもつ DNA断 片である。

(4)改変 DNA-158N配列を含有する DNA断片のク ロー ニ ング 上記で得られた DNA 断片- C を利用 して、 目 的の改変 DNA-158N 配列を含有する DNA 断片をク ローニングに よ り 十分な量で収得する操作を次に行 う 。

(i) 先づ、 上記で得られた DNA断片- C の 10 μ gを、 L バ ッ フ ァ ー（宝酒造（株）社製）中で制限酵素 Kpn I の 10 ュニッ ト と Sac I の 10ュニ ッ トで消ィ匕した。 こ の消ィ匕で 得られた DNA断片を DNA断片- j3 と称する。 他方、 ブラ ス ミ ドベク ター p Blue script II SK(+)の 10 μ gを Lノく ッ フ ァー（宝酒造（株）社製）中で、 Kpn Iの 10ュニ ッ ト と Sac I の 10ュニッ トで消化して短縮プラ ス ミ ドを得た。 DNA 断片- i3 を含む消化反応液と 、 短縮プラス ミ ドを含む消化 反応液と にそれぞれに 1/10 容の 3M 酢酸ナ ト リ ウム、 2 倍容のエタ ノ ールを加え、 -20°Cに約 6時間ィ ンキュベー ト した。 その後、 イ ンキュベー ト された溶液を遠心分離 し、 沈殿した DNAを乾燥させ、 5 μ 1 の水に溶解した。 こ う して得られた DNA断片- /3 の水溶液の 5 μ 1 と 、 該 短縮プラス ミ ド DNAの水溶液の 5 1 と を混合し、 次に、 得 ら れた混合物（10 μ 1)に含 ま れ る DNA を 、 DNA Ligation kit (宝酒造（株）社製）によ り 連結反応させた。 そ の連結反応液に 1/10 容の 3M酢酸ナ ト リ ゥム、 2倍容の エタ ノ ールを加え、 -20°Cに約 6時間ィ ンキュベー ト した。 ィ ンキュベー ト された反応溶液を遠心分離 し、 沈殿した DNAを乾燥させ、 5 μ 1 の水に溶解して水溶液に した。

こ の水溶液に含まれる DNAは、前記の DNA断片- |3 と 、 プラス ミ ドベク ター p Bluescript II SK( + )の Kpn-1及び

Sac I 切断で得られた前記の短縮プラ ス ミ ドと を連結 し て 作 ら れ た 2 本鎖 の 組換 え プ ラ ス ミ ド （前記 の p Bluescript-DNA-158Nプラ ス ミ ドであ る）であ り 、 その挿 入 DNA領域内に、 前記の改変 DNA-158N配列を含有し た。

(ii) こ の p Bluescript-DNA-158Nプラ ス ミ ドを大腸 菌 XLl-Blue MRF' に導入する こ と に よ り 大腸菌 XL1- Blue MRF' を形質転換した。 さ らに形質転換された大腸 菌細胞を液体培地中で培養 した。

培養された大腸菌細胞から、 さ らにプラス ミ ドを抽出 した。 こ う して改変 DNA- 158N配列を含有する組換えプ ラ ス ミ ドが ク ロ ーニ ングでき た。

(5) 改変 DNA-158N配列を含有する DNA断片の回収

得られた Bluescrip DNA-158Nプラス ミ ドのプラス ミ ド DNAの 10 μ 1を、 Μバ ッ フ ァ ー（宝酒造（株）社製）中 で Xba Iの 10ュニッ ト と Sac Iの 10ュニ ッ ト で消化した。 その消化反応液を低融点ァガロース電気泳動によ り 分画 した。 DNA-158N配列（1143bpのサイ ズ）を内部に含有す る DNA断片（DNA断片- |3 -2 と称する）をァガロースか ら 切出 した。 こ の DNA断片- ]3 -2 を含有するァガロース切 片に TE ノく ッ フ ァ ー（10mM の Tris-HCl、 ImM の EDTA を含有、 pH8)を等量加え、 68°C、 20分間加温する こ と に よ り ァガロ ースを溶解した。 得られた溶液を飽和フ ヱ ノ ールで 2 回抽出する こ と によ り ァガロースを除いた。 得 られた DNAを含むフエ ノ ール抽出液に対して、それの 10 分の 1容の 3M酢酸ナ ト リ ゥム、 2倍容のエタ ノールをカロ え、 -20°Cに約 6時間放置しイ ンキュベー ト した。 イ ンキ ュペー ト された溶液を、 15000rpm、 4°Cで 10分間遠心分 離した。 得られた DNA沈殿を減圧下で乾燥させ、 得られ た DNA粉末を 10 μ 1の水に溶解させた。 その DNA粉末 は、 目的の改変 DNA-158N配列を含有する DNA断片- -2からなる ものであった。

実施例 3

本例は、 第 2 の本発明によ り 得られた改変 DNA- 166A と命名 された DNA 配列（すなわち、 配列表の配列番号 7 に記載の塩基配列を有する DNA配歹 U )を含有する DNA断 片の製造を例示する。

(1) PCR 用 のプラ イ マー と しての合成オ リ ゴヌ ク レオチ ドの構築

DNA合成装置（Model-391、 アプライ ドバイ オシステム ズ社製）を利用 して、 配列表の配列番号 10 に記載の塩基 配列を有するオ リ ゴヌ ク レオチ ドである プライマー No.4 を化学合成によ り 構築 した。

(2) PCR法用のテンプレー ト

実施例 2の（2)項に記載されたべク タ一 pDAP8-l-XSは、 それの Xba I切断部位と Sac I切断部位と の間に、 配列表 の配列番号 1 に記載の塩基配列を有する DNA配列（すな わち前記の DHPDPS-DNA-1143 配歹 !j )を内部に含有する 約 1200bp の配列長をもつ DNA断片を挿入されて有する ものである。

こ の組換えべク タ一 pDAP8-l-XS が本実施例 2 でも下 記の PCR法でテンプレー ト と して利用 された。

(3) 所要な DNA断片の PCR法による増幅と 回収

(i) PCR法の第 1回段階

所要な DNA断片を PCR法によ る増幅反応によ り 収得 するために、 PCR法の第 1 回段階と して下記の（A)反応と (B)反応と を行った。 .

すなわち、 その（A)反応では、 テンプレー ト と して用い られる前記の組換えプラス ミ ドベク タ一 pDAP8-l-XS の 5 μ 1 と 、 プライマ ー FW- 1の 1 μ Μ と 、 配列番号 10のプ ライマー No.4の Ι μ Μ と を、 増幅反応液（10mM の Tris- HCl(pH 8.3), lmMの MgCl₂、 50mM の KC1、 4種のヌ ク レオチ ド dNTPの各 0.2mMの混合物、 LA Taq DNAポ リ メ ラ一ゼの 2.5ュニ ッ ト を含有）の 10 μ 1に加えて、 増幅 反応を行った。 こ の（Α)反応で得られた DNA の増幅生成 物を、 DNA断片- D と称する。

また、 （Β)反応では、 実施例 2 の（3)項に記載と 同 じ く 、 テ ンプレー ト と して用い られる前記ベク タ ー pDAP8-l- XSの 5 μ 1 と 、 プライマー と して前記のブライマー RV-1 の 1 μ Μ と 、 前記の BSKPN-1の 1 μ Μ と を、 （Α)反応で 用いた と 同 じ組成の増幅反応液に加えて、 増幅反応を行 つた。 この（B)反応で得られた DNA の増幅生成物を、 実 施例 2の（3)項と 同 じく 、 DNA断片- B と称する。

なお、 前記の増幅反応は、 実施例 2 の（3)項に記載され た と 同 じく 、 CR反応装置（Program Temp Control System PC-700(アステ ッ ク社製）内で、 変性を 94^CCで 30 秒間、 ァニー リ ングを 55°Cで 2分間、 伸張を 72°Cで 2分間行 う 3つの反応操作を 30回繰り 返すこ と によ り 実施された。

増幅反応の終了後、 （A)反応の増幅反応液を低融点ァガ ロース電気泳動によ り 分画し、 増幅 DNA生成物と しての 480bp の DNA 断片- D を含むバ ン ドをァガロ ースゲル力 ら切出 した。 また、 （B)反応の増幅反応液を低融点ァガロ ー ス電気泳動にカ けて分画し、 増幅 DNA生成物と しての 1200b の DNA断片- Bを含むバン ドをァガロースゲル力 ら切出 した。

これらのゲル切片力 ら 、 GENCLEAN II Kit (フナコ シ 社製）によ り 分離して DNA断片- D の精製品 と DNA断片- Bの精製品を得た。

(11) PCR法の第 2回段階

次に、 PCR法の第 2 回段階と して、 前記のブライマー PV-1の 1 μ 1およびプライ マ 一 FW-1 の 1 μ 1、 な らびに 前記の（Α)反応および（Β)反応で増幅 した DNA断片- Dの 1 μ 1 と DNA 断片- Β の 1 n 1 を、 増幅反応液 （10mM の Tris-HCl(pH 8.3), ImMの MgCl₂、 50mMの KC1、 dNTP の各 0.2mMの混合物、 LA Taq DNAポ リ メ ラ一ゼの 2.5 ユニ ッ ト を含有） 100 μ 1 に加えて、 増幅反応を行った _c この場合の増幅反応は、 変性を 94°C、 30秒、 ァニーラ ン グを 55°C、 2分、 伸張を 72°C、 2分行 う 3つの反応操作 を 20回繰り 返して実施した。

こ の増幅反応の終了後、 その増幅反応液を低融点ァガ ロース電気泳動によ り 分画 し、 増幅 DNA 生成物と して 1200bpの所期の DNA断片- Eを含有するバン ドをゲル力 ら切出 した。 こ のゲル切片から GENCLEAN II Kit (フナ コ シ社製）によ り DNA断片- E を分離して且つ DNA断片- Eの精製品を得た。

この DNA断片- Eは、配列表の配列番号 7に示された塩 基配列を有する DNA-166A酉己歹 IJ (1143bpのサイ ズ）を内部 に含有する約 1350bpのサイ ズの DNA断片であ り 、 し力 も DNA-166A配列の 5' -末端の先方に Kpn 1切断部位を もち且つ 3' -末端の後方に Sac I切断部位をもつ DNA断 片である。

(4) 改変 DNA-166A配歹 IJを含有する DNA断片のク ロー二 ング

上記で得られた DNA 断片- E を利用 して、 目 的の改変 DNA-166A配列を含有する DNA断片をク ローニングによ り 十分な量で収得する操作を次に行 う 。

(1) 先づ、 上記で得られた DNA断片- Eの 10 μ gを L バッ フ ァー（宝酒造（株）製）中で制限酵素 Kpnlの 10ュニ ッ ト と Sacl の 10 ユニ ッ トで消化した。 こ の消化で得られ た DNA断片を DNA断片- y と称する。 他方、 プラス ミ ド ベク タ一 pBluescriptIISK(+)の 10 μ gを Lノく ッ フ ァ ー（宝 酒造（株）製）中で、 Kpnl の 10ュニ ッ ト と Sacl の 10ュニ ッ トで消化して短縮プラス ミ ドを得た。 DNA断片- γ を含 む消化反応液と 、 短縮プラ ス ミ ドを含む消化反応液と に それぞれに 1/10 容の 3Μ酢酸ナ ト リ ゥム、 2 倍容のエタ ノ ールを加え、 -20°Cに約 6時間イ ンキュベー ト した。 そ の後、 イ ンキュベー ト された溶液を遠心分離 し、 沈殿 し た DNAを乾燥させ、 5 μ 1 の水に溶解した。

こ う して得られた DNA断片- γ の水溶液の 5 1 と 、 該 短縮プラス ミ ド DNAの水溶液の 5 μ 1 と を混合し、 次に、 得 ら れた 混合物（10 μ 1)に含 ま れ る DNA を 、 DNA Ligation kit (宝酒造（株）製）によ り 連結反応させた。 その 連結反応液に 1/10容の 3M酢酸ナ ト リ ゥム、 2倍容のェ タ ノ ールを加え、 -20°Cに約 6時間ィ ンキュベ一 ト した。 イ ン キ ュ ベー ト された反応液を遠心分離 し、 沈殿 した DNAを乾燥させ、 5 μ 1の水に溶解して水溶液に した。

この水溶液に含まれる DNAは、前記の DNA断片- γ と 、 プラス ミ ドベク ター p Bluescript II SK( + )の Kpn-1及び Sac I 切断で得られた前記の短縮ブラ ス ミ ド と を連結 し て作られた組換えプラ ス ミ ド（p Bluescript-DNA-166Aブ ラ ス ミ ドと称する）であ り 、 その揷入 DNA 領域内に、 前 記の DNA-166A配列を含有 した _c

(ii) こ の p Bluescrip1:-DNA-166Aブ ラ ス ミ ドを大腸 菌 XLl-Blue MRF'に導入する こ と に よ り 大腸菌 XL1- Blue MRF'を形質転換した。 さ らに形質転換大腸菌細胞 を液体培地中で培養 した。

培養された大腸菌細胞から、 さ ら にプラス ミ ドを抽出 した。 こ う して改変 DNA- 166A配列を含有するブラ ス ミ ドがク ロ ーニ ングできた。

(5) 改変 DNA-166A配列を含有する DNA断片の回収

得 られた p Bluescript-DNA-166Aプラ ス ミ ドのプラ ス ミ ド DNAの 10 / 1を、 Mバ ッ フ ァ ー（宝酒造（株）製）中で Xba Iの 10ュニ ッ ト と Sac Iの 10ュニ ッ トで消ィ匕した。 その消化反応液を低融点ァガロース電気泳動によ り 分画 した。 DNA-166A配列（1143bpのサイ ズ）を内部に含有す る DNA断片-" y -2 を含有するァガロースから切出 した。 この DNA断片- _Ί -2を含有するァガロ ースゲル切片に ΤΕ ノ ッ フ ァ ー（10mMの Tris-HCl、 ImMの EDTAを含有、 pH 8)を等量加え、 68°C、 20 分間加温する こ と によ り ァ ガロ ースを溶解した。得られた溶液を飽和フ ェ ノ ールで 2 回抽出する こ と に よ り ァ ガ ロ ー ス を除いた。 得 られた DNAを含むフエ ノ ール抽出液に対して、 それの 10分の 1 容の 3M 酢酸ナ ト リ ウム、 2 倍容のエタ ノ ールを加え、 - 20°Cで約 6 時間放置イ ンキ ュベー ト した。 イ ンキュベー ト された溶液を、 15000rpm、 4°Cで 10分遠心分離した。 得られた DNA 沈殿を減圧下で乾燥させ得られた粉末と 10 ]1 1の水に溶解させた。 こ の DNA粉末は、 目 的の改変 DNA-166A配列を含有する約 1200bpのサイ ズの DNA断 片 - γ -2力 ら成る ものであった。

なお、 実施例 2 の（5)で得られた前記の DNA断片- ]3 -2 を、 実施例 1 の（7)項に記載された と 同様に して、 塩基配 列決定キ ッ ト を用いる 自動 DNA シーケンサ、 ALF DNA Sequener IIに力、けた。 DNA断片- ]3 -2は酉己歹 lj表の酉己歹 IJ番 号 5 に記載の塩基配列をもつ改変 DNA- 158N配列を内咅 |5 に含有する DNA断片である と確認できた。

また、 実施例 3の（5)で得られた DNA断片- γ -2 も、 上 記と 同様に、 塩基配列決定の試験にかけた。 DNA 断片 - γ -2 は、 配列表の配列番号 7 に記載の塩基配列をもつ改 変 DNA-166A 配列を内部に含有する DNA 断片である と 確認できた。

実施例 4

本例は、 第 1の本発明によ る DNA配列または第 2の本 発明によ る改変 DNA配列を、 外来遺伝子と してイネ植物 に導入する こ と からなるイネ植物の形質転換法を例示す る。

(1) 外来遺伝子の導入用の組換えベク ターの作成

(i) カ リ フ ラ ヮ一モザイ ク ゥイ ノレス の 35S プロモー ターと 、 NOS ター ミ ネータ一と 、 アンピシ リ ン耐性遺伝 子 と を含有する 5.7kb のサイ ズのプラ ス ミ ドベク タ ー pBI221(Clontech社製）の DNA(10 μ g)を、 Mノく ッ フ ァー (宝酒造（株）製）中で制限酵素 Xba Iおよび Sac Iの 10ュニ W

75 ッ トで消化した。 その消化反応液から DNAを沈殿させ、 遠心分離してから乾燥させた。 35S プロ モーターおよび NOS ター ミ ネータ一を保有する約 3.8kb のサイ ズのべク ター断片を得た。

5 (ii) 得られたベク ター断片を 5 μ 1の水に溶解した。

そのべク ター断片の水溶液の 5 μ 1を、 実施例 2で得られ 且つ第 1 の本発明によ る配列番号 1 に記載の DHDPS- DNA-1143 配歹 1J (1143bp のサイ ズ）を内部に含有する約 1143bp のサイ ズの DNAであ る DNA断片- XS の水溶液の

10 5 μ 1 と混合した。

得られた混合物を DNA リ ゲーシ ョ ン ·キ ッ ト（宝酒造 (株）製）で処理して、 DNAの連結反応を行った。 こ う して プラ ス ミ ドベク ター ρΒΙ221 の Xba I-Sac I-切断べク タ ー 断片に対して、 前記の DNA断片- XSを連結してなる環状

15 の組換えベク ターを作成した。 こ の組換えベク ターをべ ク タ一 pDAP と称する。 ベク ター pDAPは、 35Sプロモー タ一領域と NOS ター ミ ネータ一領域と の間に、 DNA 断 片 -XS 領域が揷入、 連結されて あ り 、 且つア ン ピシ リ ン 耐性遺伝子（Am を含有する構造を有し、 4.9kb のサイ ズ

20 を有した。

(iii) 実施例 2 で得られた DNA断片- XS の代り に、 実 施例 2 で得られた DNA断片- )3 -2(すなわち、 第 2 の本発 明 に よ る 配列番号 5 に 記載の 改変 DNA-158N 配歹 IJ (1143bp のサイ ズ）を内部に含有する約 1143bp のサイ ズ の DNAである）を用いて、 前記と 同様な連結反応によ り 、 プラス ミ ドベク タ一 pBI221の Xba I-Sac I-切断-ベク タ一 断片に対して連結 した。 こ う して作成された環状の組換 えベク ターはベク ター pl58N と称する。 ベク ター pl58N は、 35S プロ モーター領域と 、 NOS ター ミ ネータ一領域 と の間に、 DNA 断片- )3 -2 の領域が挿入、 連結された構 造を有し、 4.9kb のサイ ズを有した。

(iv) さ らに、 実施例 1 で得られた DNA断片- XS の代 り に、 実施例 3で得られた DNA断片- γ -2(すなわち、 第 2 の本発明によ る配列番号 7 に記载の改変 DNA- 166A配列 (1143bp のサイ ズ）を内部に含有する約 1143bp のサイ ズ の DNAである）を用いて、 前記と 同様な連結反応によ り 、 プラ ス ミ ドベク タ一 pBI221の Xba I -Sac I-切断-ベク ター 断片に対して連結した。 こ う して作成された環状の組換 えベク ターはベク ター pl66A と称する。 ベク ター pl66A は、 35S プロ モーター領域と NOSター ミ ネータ一領域と の間に、 DNA 断片- γ -2 の領域が挿入、 連結されてある 構造を有し、 また 4.9kb のサイ ズを有した。

(2) 組換えベク ターのク ローニング

上記で得られた組換えベク ター pDAP あるいは組換え ベク タ一 pl58N あるいは組換えべク タ一 p 166 Aの水溶液 10 μ 1(DNAの量： 10mg)と 、 大腸菌 XL 1 -Blue MRF'コ ン ピテン トセル 100 μ 1 と を 1.5ml容チューブに入れ、氷中 で 30分間、 42°Cで 30秒間、 そ して再び氷中で 2分間ィ ンキュペー ト した。 その後に、 イ ンキュベー ト された混 合物を実施例 1 の（6)項で記載された と 同様に処理し且つ 大腸菌を振と う培養 した。

得られた大腸菌の培養液を、 実施例 1 の（6)項に記載さ れた と 同様に、 ア ン ピシ リ ン及びその他の添加物を添加 された LB寒天培地にプレーティ ングした。 37°C、 16 時 間にわたって大腸菌を培養 した。

用 いた組換えべク タ ー p DAP ま たは組換えべク タ ー 158N または組換えべク ター 166A の導入によ り 形質転換 され且つア ン ピシ リ ン耐性である大腸菌コ ロ ニー 10個を 得た。 これら大腸菌コ ロニー 10個を、 それぞれにアンピ シ リ ン 50m g/lを含む液体培地で増殖させた。

(3) 組換えベク ターの回収

10個のコ ロ ニーカゝら夫々 に増殖した大腸菌細胞力ゝら、 プラ ス ミ ド精製キ ッ ト （QIA filter Plasmid Midi Kit、 QIAGE N 社製）によ り 組換えプラ ス ミ ドを分離し且つ精 製した。

得られたそれぞれの組換えプラ ス ミ ドを、制限酵素 Xb a I と Sac I と で消化し、 得られた D NA断片をァガロース ゲル電気泳動によ り 解析した。

その解析の結果を参照 して、 得られた組換えブラ ス ミ ドの中で 35 S プロ モーターの下流に正常に第 1 の本発明 によ る DHDPS -DNA- 1 143 配列が連結されてある組換え プラス ミ ドを、ベク タ一 p DAP と して選択して、採取 した。 また、 同様に して、 組換えプラス ミ ドの中で 35S プロ モーターの下流に正常に第 2 の本発明によ る改変 DNA-

158N配列が連結されてある組換えプラ ス ミ ドを、 ベタ タ 一 P158Nと して選択 して、 採取した。

さ らに、 同様に して、 組換えプラス ミ ドの中で 35S プ 口 モー タ ー の下流に正常に第 ₂ の本発明 に よ る 改変

DNA-166N 配列が連結されてある組換えプラ ス ミ ドを、 ベク タ一 p 166Aと して選択して、 採取した。

こ の よ う に得られた組換えべク ター pl58N の導入によ り 形質転換された大腸菌 XLl-Blue MRF'はェ シエ リ ヒ ァ ·コ リ （Escherichia coli) XLl-Blue MRF7pl58Nと命名 され、 日本の茨城県、 つく ば市の工業技術院生命工学ェ 業技術研究所に 1998年 4月 13 日 以降、 ブダペス ト条約 の規約下で FERM BP-6323の受託番号で前記の研究所に 寄託されてある。

このよ う に得られた組換えべク ター pl66A の導入によ り 形質転換された大腸菌 XLl-Blue MRF'はェ シエ リ ヒ ァ ·コ リ （Escherichia coli) XLl-Blue MRF7pl66Aと命名 され、 日 本の茨城県、 つく ば市の工業技術院生命工学ェ 業技術研究所に 1998年 4月 13 日 以降、 ブダぺス ト条約 の規約下で FERM BP-6324の受託番号で前記の研究所に 寄託されてある：.，

(4) イ ネのカルス の調製

イネ（品種： 日 本晴）の完熟種子から籾榖を脱榖した。 得 W

79 られた外皮付きの種子を 70%ェタ ノ ール溶液に 60秒間、 ついで有効塩素約 1%の次亜塩素酸ナ ト リ ゥム溶液に 6分 間浸漬して種子を殺菌処理した。 さ らに種子を滅菌水で 洗浄した。

5 MS培地の無機成分組成にシ ョ糖 30g/l、 植物ホルモ ン と して 2,4-PA 2mg/l、 寒天 8g/lを添加してなる培地に、 上記で殺菌 したイネ種子を置床 した。 28°Cで 45 日 間、 2000 ノレ ッ ク ス の光を 1 日 当た り 16 時間照明 しなが らィ ンキ ュペー ト した。 カルス が形成された。 それらカノレス 10 を胚乳部分力 ら切 り 出 し、 孔 lmmのステ ン レス メ ッ シュ の篩を用いて、 lmm 以下のカルス を PCV(Packed Cell Volume; 圧縮細胞量）と して 3mlの量で得た。

(5) ゥイ ス 力 の調製

チ タ ン酸力 リ ゥ ム製 ゥ イ ス 力 （チ タ ン工業（株）製、 15 LS20)5g を 1.5ml 容のチューブに入れ、 エタ ノ ールを 0.5ml加えて、 ー晚放置した。 エタ ノ ールを完全に蒸発さ せて、 殺菌された ウイ スカ を得た。 こ の ウイ ス力の入つ たチューブに滅菌水 lml を入れ、 よ く 攪拌した。 ゥイ ス 力 と滅菌水を遠心分離し、 上清の水を捨てた。 このよ う 20 に して ウイ スカ を洗浄 した。 こ の ウイ ス カ洗浄操作を 3 回行った。 その後、 同チューブ内に R2液体培地の 0.5ml を加えて ウイ ス カ懸濁液を得た。

(6) イネ 'カルス細胞への外来遺伝子の導入用の材料の調 前項（3)に記載す る よ う に調製 し た組換えべク タ ー pDAP、 またはベク ター pl58N、 またはベク ター p 166Aを lmg/mlの濃度で TE緩衝液（Tris-HCl 10mM, EDTA ImM, pH 8)に溶解してベタ ター溶液を得た。

上記で得 られた ウイ ス カ懸濁液の入っ たチューブに lmm以下のカルスを 250 μ 1入れて、 攪拌した。 得られ た混合物を lOOOrpm/分で 10秒間遠心分離し、 カルス と ウイ スカ を沈殿させた。 上清を捨てた。 カルス と ゥイ ス 力 と の混合物が得られた。

カルス と ゥイ ス力 と の混合物を入れたチューブに、 組 換えベク ター（すなわち、 ベク ター DAP または pl58N ま たは pl66A)の 10 μ 1(DNAの 10 μ g含有）と 、 選抜マ ー カー用 と して除草剤ホ ス フ ィ ノ ス リ シン耐性遺伝子を含 むプラ ス ミ ドベク ター p35SC-SS (特開平 8-154513 号公 報） 10 μ 1(10 の DNAを含有）と を加えた。十分振 り 混 ぜた均質な混合物を得た。

次に この均質な混合物の入ったチューブを 18000 X g で 5 分間遠心分離した。 遠心分離された混合物を再度振 り 混ぜた。 この遠心分離の操作と再度振 り 混ぜる操作を 3 回反復 した。

(7) イ ネのカルスへの外来遺伝子の導入の操作

上記のよ う に して得られた、 カノレス細胞と 、 ウイ ス カ と 、 本発明 DNA配列を含有する組換えベク ターと 、 選択 用プラ ス ミ ドベク タ一 p35SC-SS と よ り なる均質な混合 物を収容 しているチューブを、 超音波発生機の浴槽にチ ユ ーブが十分浸かる よ う に設置した。 周波数 40kHzの超 音波を強度 0.25W/cm²で 1分間照射した。 照射後、 30分 間、 4°Cで超音波処理された混合物をィ ンキュベー ト した。

こ の よ う に超音波処理した混合物を R2 液体培地で洗 浄し、 組換えベク ターを導入 した 目 的の形質転換カルス 細胞を得た。

(8) 導入べク ターで形質転換されたカルス細胞の選抜

上記で組換えベク ターを導入された形質転換細胞を有 するカルスを、 3.5cm のシャー レに入れた。 さ らに R2培 地の無機成分組成にショ糖 30g/l、 2 , 4-PA 2m g/lを添加 し て得た液体培地を 3ml 加えた。 その後に、 28 °Cで 2000 ノレ ッ ク スの光を 1 日 当た り 16時間照射しなが ら ロータ リ 一シェ ーカ ー (50rpm)上でカルス細胞を培養 し、 分裂細胞 を得た。

培養 3 日 目 に、 得られた分裂細胞の懸濁液 3mlを、 N6 培地の無機成分組成に、 シ ョ 糖 30 g/l、 2 , 4-PA 2mg/ ゲ ノレラ イ ト 3 g/l、 ホス フ ィ ノ ス リ シン 30m g/1を添加 してな る培地上に均一に広げた。 培地上の細胞を、 28°Cで 2000 ノレ ッ ク ス の光を 1 日 当た り 16 時間照射 しな力； ら 30 日 間 培養 した： ホ ス フ ィ ノ ス リ シ ン耐性の形質転換カル ス細 胞を得た：

(9) ベク タ一 p l 58Nまたは p l 66Aによ る形質転換カルス 細胞の再選抜 上記によ り 得たホス フ ィ ノ ス リ シン耐性である形質転 換カルス培養細胞の う ち、 第 2 の本発明によ る DNAを外 来遺伝子と して十分に導入されて形質転換された所期の 培養細胞のみを再選抜する。 そのためには、 形質転換力 ルス細胞 400個（直径 2mm)を、 N6培地の無機成分組成に ショ 糖の 30g/l と 、 2,4-PAの 2mg/l と 、 ゲノレライ トの 3g/l と 、細胞増殖阻害剤と して働く S-(2-ア ミ ノ エチル）システ ィ ン（以下、 AEC と レ、 う）（リ ジンのアナロ グ体）の 200mg/l と を添加 してなる培地上に移植した。 28 C、 2000ノレッ ク スの光を 1日 当た り 16時間照射しなが らカノレス細胞を 30 日 間培養 した。 前記の AEC添加培地で生育できたべク タ 一 pl58Nまたは pl66A含有の形質転換力ルス細胞をこの よ う に して再選抜した。

(10) 形質転換カルス細胞からの植物体の再生

上記によ り 得たホス フ ィ ノ ス リ シン耐性および AEC耐 性である形質転換カルス培養細胞（直径 5mm)の 98〜： 100 個を、 MS培地の無機成分組成にシ ョ 糖の 30g/l、 ベンジ ノレアデニンの 2mg/l、 ナフタ レン酢酸の lmg/l、 ゲルライ トの 3g/lを添加 してなる培地上に移植した。 28°Cで 2000 ノレ ッ ク ス の光を 1 日 当た り 16時間照射 しなが ら 30 日 間 培養 した。 形質転換カルス細胞から芽と根が再生できた： 再生 した芽と根を幼芽（長さ 10〜 30mm に生育した芽）を、 シ ョ 糖の 30g/l、 ゲルライ トの 3g/lを含む MS培地を入れ た試験管（直径 45mm、 長さ 25cm)に移植した。 移植され た幼芽を 20日 間培養 して形質転換したイネ植物を得た。 上記の方法に よ り 、 第 1 の本発明 に よ る DHDPS-

DNA-1143 配列を外来遺伝子と して含有する形質転換力 ノレ ス細胞の 98個から、 80個体のイ ネ植物が再生できた。 また、 第 2の本発明によ る改変 DNA-158N配列を外来遺 伝子と して含有する AEC 耐性の形質転換カ ルス細胞の

100個から、 76個体のイネ植物が再生できた。

さ らに、 第 2の本発明によ る改変 DNA-166A配列を外 来遺伝子と して含有する AEC耐性の形質転換カルス細胞 の 100個から、 79個体のィ ネ植物が再生できた。

(11) 形質転換イネ植物の再生体の遺伝子解析

上記 の よ う に 再生 さ れ た イ ネ 植物 体 に 存在 す る

DHDPSをコー ドする DNAの解析を PCR法で次の手順に よ り 行った。

(i) 前項（10)で得た再生イネ植物から葉を採取した。 その葉 50mg を 1.5ml 容のマイ ク 口 チューブに入れ、 10mM EDTAを含む 20mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5)300 μ 1を添加 し、これを磨碎した。磨砕物に 20%SDSを 20ml 加えて、 65°Cで 10分間加温した。 得られた混合物に 5M 酢酸カ リ ウムを 100 μ 1力 Qえ、 氷中に 20分間置いた後、 1 , 7000xg の遠心加速度で 20 分間遠心分離した。 得られ た上清にイ ソプロノヽ。ノ ーノレ 200 μ 1を力卩ぇ、 転倒攪拌し、 これを再び 1.7000Xgの遠心加速度で 20分間遠心分離し た。 得られた DNAの沈殿を減圧下で乾燥した。 100 μ 1 の TE緩衝液にその DNAを溶解した。

(ii) PCR 用のプライマーと して、 配列表の配列番号 14に示す塩基配列を有する前記オリ ゴヌ ク レオチ ドと 、 配列番号 15に示す塩基配列を有する前記オリ ゴヌ ク レオ チ ドと を用いた。

次に、 これら 2種類のオ リ ゴヌ ク レオチ ドの各 1 μ Μ をプライ マー と して用い且つ上記再生イ ネ植物体由来の DNAの 5 μ 1 をテンプレイ ト と して用い、 これらを増幅 用反応液（10mM Tris-HCl(pH8.3)、 l.OmM MgCh, 50mM KC1、 0.01%ゼラ チン、 pH 8.3、 dNTPの各 0.2mMの混合 物および Taq DNA ポ リ メ タ ラーゼ 2.5 ュニ ッ ト を含有） 100 1 1に加えた。 そ して増幅反応を行った。 用いた増幅 反応液は、 PCRキ ッ ト（PCR Amplification Kit (宝酒造（株） 製）で調製した。

増幅反応は、 PCR 反応装置（Program Temp Control System PC-700(ァズテ ッ ク社製））内で、 変性 94°C、 1分、 アニー リ ング 60°C、 30秒、 伸張（extention)72°C、 1分の

3つの反応操作を 30回繰り 返すこ と によって実施した。

(iii) 得られた PCR反応液を、常法によ り ァガロース 電気泳動にかけて分析 した と こ ろ、 再生イ ネ植物から抽 出 した DNAから増幅された各種の DNAのバン ドが確認 された。

さ らに、 それらの各種の DNA配列を、 塩基配列決定キ ッ トによ り 解析したと こ ろ、本発明の DHDPS-DNA-1143 配列、 改変 DNA-158N配列または改変 DNA-166A配列に 相当する DNA 断片が再生イ ネ植物から上記のよ う に抽 出 された各種の DNA 断片の中に存在する こ と が確認で きた。

上記のよ う に PCR法によ る遺伝子解析を行 う こ と によ り 、 導入した外来遺伝子が確認できた再生イネ植物体は、 各々 を培養土を入れたポッ ト に移植 して栽培した。 これ らの再生イ ネ植物体は正常に生育 したので自殖種子を得 る こ とができた。

(12) 形質転換イネ植物の再生体中の リ ジン含量の測定 前項（11)で得 られた、 第 1 の本発明ににる DHDPS- DNA-1143 配列を含有する組換えべク タ一 pDAP を導入 された植物細胞を有する再生された形質転換イネ植物体 と 、 第 2の本発明によ る DNA-158N配列を含有する組換 えべク タ一 pDNA-158N を導入された植物細胞を有する 再生された形質転換イネ植物体と 、 第 2 の本発明による DNA-166A 配列を含有する組換えべク タ一 pDNA-166 を 導入された植物細胞を有する再生する形質転換イネ植物 体と から、 夫々 に緑色の葉を採取した。

このよ う にそれぞれに採取された葉を lgづっ取 り 、 そ れらの葉の lgを、 1.5ml容の第 1のチューブに入れ、 さ らに 50%ァセ トニ ト リ ノレ lmlを添加 し、 磨砕した。 磨碎 混合物を新た ら しい 1.5ml容の第 2 のチューブに移し替 え、 17000Xgの遠心加速度で 20分間遠心分離した。 得ら W 5

86 れた上清を、 再び新た ら しい第 3 のチューブに移し入れ、 その第 3のチューブ内に 50%ァセ トニ ト リ ノレ 1 mlを加え、 十分に転倒攪拌し、 再び遠心分離した。 得られた上清を 第 1 のチューブに加え、 こ の操作を 3 回繰り 返した。 こ 5 のよ う に して、 葉力 ら リ ジンを抽出 したァセ ト ニ ト リ ノレ 抽出液を得た。

このァセ トニ ト リ ル抽出液を減圧下で乾固 させた後、 蒸 留 水 1ml を 力 Π え て 水溶液 を 得た 。 そ の 水溶液 を 17000Xgの遠心加速度で 20分間遠心分離によ り 、 上清の

10 0.5mlを得た。その上清の う ち 100 μ 1に 5mM DNFB (2 , 4- ジニ ト ロ - 1 -フルォロベンゼン） 100 μ 1 を混合した。 得ら れた混合物をー晚反応させた。こ の反応液に 200 μ 1のァ セ ト ニ ト リ ルを添加 し、 攪拌した後、 17000xg の遠心力 I] 速度で 20分間遠心分離した。 上清液と して、 リ ジンの抽

15 出液を得た。これを、高速液体ク ロマ ト グラ フィ 一（HPLC) 装置（東ソ一（株）製、 8020 .型）にかけて遊離リ ジン含量を 測定 した。 こ の HPLC に用 いたカ ラ ムは、 CAP CELL PAK- C 18 (資生堂（株）製）であ り 、 展開溶媒はァセ トニ ト リ ル-水をァセ ト ニ ト リ ノレの 60%〜 72 %濃度勾配で用い、 流

20 量は 0.8ml/分と して、 350nmの光の吸光度を測定して、 リ ジン含量を評定した。

対照のイネ植物と して、 通常のイネ（品種： 日本晴）の植 物体を用いた。 得られた測定結果を次の表 1 に示す。 _¾ 1

測疋 されんこィ 不榧物 1本 、t Twirit 1)^x1 、、： ゝ 旦 ンノ 3 里 女汁昭ィ ネ槠物

ベク タ一 pDAP導入のイネ植物 360

ベタ ター pl58N導入のィネ植物- 1 688

ベク タ一 pl58N導入のィネ植物- 2 652

ベク タ一 pl66A導入のィネ植物- 1 673

表 1 に示された結果から明 らかなよ う に、 本発明によ る新規 DNA 配列を外来遺伝子と して用い且つ植物細胞 中で発現でき るプロ モーターを有する組換えべク ターを 利用する と 、 本発明によ る新規 DNA配列を導入する こ と によ り 、 イネ植物体中に生成される遊離リ ジン含量が増 加でき る こ と が確認された。

産業上の利用可能性

以上の説明から明 らかなよ う に本発明によ り 、 イ ネの ジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼを コー ドでき る新規 な DNA配列が提供される。 当該 DNA配列を外来遺伝子 と してイ ネ植物体に導入する こ と によ り 、 イ ネ植物体中 の必須ア ミ ノ 酸、 リ ジンの含量を高める こ と ができ た。 本発明によ る DNA配列は、 従来知 られるバイ オテク ノ 口 ジ一の技法によ って、 イネ及びその他の有用植物、 例え ば ト ウモロ コ シ、 ダイ ズ、 コ ムギ、 ォォムギの植物体に も外来遺伝子と して導入でき る。 従って、 本発明で提供 された DNA配列は、 高い リ ジン含量を有する種子を産生 でき る新品種の植物を育種するのに有用である。 【配列表】

配列番号： 1

配列の長さ ： 1143

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

酉己列の種類： CD A to mRNA

起源

生物名 ：イネ

組織の種類：茎葉

配列の特徴

特徴を表す記号： CDS

存在位置： 1 . . 114 0

特徴を決定した方法： E

配列

( 5 ' -末端)

ATG GCG TCG CTG CTG ATC GCC AGC ACG GGG GGC TGC CCA. CCG CCT CGC 48 Met Ala Ser Leu Leu lie Ala Ser Thr Gly Gly Cys Pro Pro Pro Arg

1 5 10 15

GTG GAA GGA. CGC CGC CGC CCT GGG ACC CGC TCC GGC TTG GCG CGA. CCT 96 Val Glu Gly Arg Arg Arg Pro Gly Thr Arg Ser Gly Leu Ala Arg Pro

20 25 30

TGG CCC GCC GCC GTG GCT GCA CCG GCG CCG CTG CTC AGG ΑΤΓ AGC AGA 144 Trp Pro Ala Ala Val Ma Ala Pro Ala Pro Leu Leu Arg lie Ser Arg

35 40 45

GGA. AAG TTT GCA TTG CAG GCC ATC ACC CTT GAT GAT TAT CTT CCA ATG 192 Gly Lys Phe Ala Leu Gin Ala He Thr Leu Asp Asp Tyr Leu Pro Met

50 55 60

CGA ACT ACT GAA GTG AAA ΑΆΤ CGG ACA TCA A A GCT GAT ATC ACT AGT 240 Arg Ser Thr Glu Val Lys Asn Arg Thr Ser Thr Ala Asp lie Thr Ser

65 70 75 80

CTC AGA. GTA ATT ACA. GCG GTC AAA ACC CCA TAT CTG CCT GAT GGA. AGA. 288 Leu Arg Val lie Thr Ala Val Lys Thr Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Arg TT GAT CTC GAA. GCA. TAT GAT TCA. CTG ATA ΑΆΤ ATG CAG ATA GAT GGT 336 Phe Asp Leu Glu Ala Tyr Asp Ser Leu lie Asn Met Gin He Asp Gly

100 105 110

GGT GCT GAA. GCT GTA ATA CTT GGA GGA ACA. ACA. GGA. GAG GGC CAC CTT 384 Gly Ala Glu Gly Val lie Val Gly Gly Thr Thr Gly Glu Gly His Leu

115 120 125

ATG AGC TGG GAT GAA CAC ATC ATG CTT ATT GGA CAT ACT GTT AAC TGC 432 Met Ser Trp Asp Glu His lie Met Leu lie Gly His Thr Val Asn Cys

130 135 140

TTT GGT GCT AAA CTT AAA GTG GTA GGC AAC ACA GGT ACT AAC TCA ACA 480 Phe Gly Ala Lys Val Lys Val Val Gly Asn Thr Gly Ser Asn Ser Thr 145 150 155 160

AGA GAG GCT ATT CAT GCA ACA GAG CAG GGA TTT GCT GTA GGT ATG CAT 528 Arg Glu Ala lie His Ala Thr Glu Gin Gly Phe a Val Gly Met His

165 170 175

GCG GCT CTC CAT ATC ΑΆΤ CCT TAC TAT GGG AAG ACC TCT ATC GAA GGG 576 Ala Ala Leu His lie Asn Pro Tyr Tyr Gly Lys Thr Ser lie Glu Gly

180 185 190

1TG ATA TCT CAT ΤΊΤ GAG GCT GTC CTC CCA. ATG GGT CCA ACC ATT ATT 624 Leu lie Ser His Phe Glu Ala Val Leu Pro Met Gly Pro Thr He lie

195 200 205

TAC AAT GTT CCA. TCT AGG ACT GGC CAG GAT ATT CCT CCT GCA GTT ATT 672 Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Gin Asp lie Pro Pro Ala Val lie

210 215 220

GAG GCT GTT TCA. AGT TTC ACA AAC TTG GCA GGT GTG AAA GAA TGT CTT 720 Glu Ala Val Ser Ser Phe Thr Asn Leu a Gly Val Lys Glu Cys Val 225 230 235 240

GGA CAT GAG AGG GTT AAG TGC TAC ACT GAC AAA GGT ATA ACC ATA TGG 768 Gly His Glu Arg Val Lys Cys Tyr Thr Asp Lys Gly lie Thr He Trp

245 250 255 ACT GG ΑΆΤ GAT GAT GAA TGC CAT GAT TCT AGG TGG AAA TAT GGT GCC 816 Ser Gly Asn Asp Asp Glu Cys His Asp Ser Arg Trp Lys Tyr Gly Ala

260 265 270

ACT GGA. GTT ATT TCT G G GCT AGC AAC CTT ATT CCT GGT CTC ATG CAC 864 Thr Gly Val lie Ser Val Ala Ser Asn Leu lie Pro Gly Leu Met His

275 280 285

GAT CTC ATG TAT GAA GGG GAG ΑΆΤ AAG ACG CTA AAT GAG AAG CTC TTT 912 Asp Leu Met Tyr Glu Gly Glu Asn Lys Thr Leu Asn Glu Lys Leu Phe

290 295 300

CCC CTG ATG AAA. TGG TTG ΊΤΤ TGC CAG CCA. AAT CCA ΑΊΤ GCT CTC？ AC 960 Pro Leu Met Lys Trp Leu Phe Cys Gin Pro Asn Pro lie Ala Leu Asn 305 310 315 320

ACT GCC CTG GCT CAG CTT GGA CTG CTA AGG CCT GTT TTC AGA. TTA CCA. 1008 Thr Ala Leu Ala Gin Leu Gly Val Val Arg Pro Val Phe Arg Leu Pro

325 330 335

TAT CTA CCT CTT CCT CTT GAA AAG AGG CTA GAG TTT GTC CGA. ATC CTT 1056 Tyr Val Pro Leu Pro Leu Glu Lys Arg Val Glu Phe Val Arg lie Val

340 345 350

GAA TCT ΑΊΤ GGA CGG GAA AAC ΊΤΓ GTG GGT GAG AAC GAG GCA CGG CTT 1104 Glu Ser lie Gly Arg Glu Asn Phe Val Gly Glu Asn Glu Ala Arg Val

355 360 365

( 3 ' -末端)

CTT GAC GAC GAT GAT TTT GTG TTG GTC ACT AGG TAC TAA 1143 Leu Asp Asp Asp Asp Phe Val Leu Val Ser Arg Tyr

370 375 380

配列番号： 2

配列の長さ ： 380

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： タンパク質

配列

(N-末端）

Met Ala Ser Leu Leu lie Ala Ser Thr Gly Gly Cys Pro Pro Pro Arg 1 5 10 15

Val Glu Gly Arg Arg Arg Pro Gly Thr Arg Ser Gly Leu Ala Arg Pro

20 25 30

Trp Pro Ala a Val Ala Ala Pro Ala Pro Leu Leu Arg lie Ser Arg

35 40 45

Gly Lys Phe Ala Leu Gin Ala lie Thr Leu Asp Asp Tyr Leu Pro Met 50 55 60

Arg Ser Thr Glu Val Lys Asn Arg Thr Ser Thr Ala Asp lie Thr Ser 65 70 75 80

Leu Arg Val lie Thr Ala Val Lys Thr Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Arg

85 90 95

Phe Asp Leu Glu Ala Tyr Asp Ser Leu lie Asn Met Gin lie Asp Gly

100 105 110

Gly Ala Glu Gly Val lie Val Gly Gly Thr Thr Gly Glu Gly His Leu

115 120 125

Met Ser Trp Asp Glu His lie Met Leu lie Gly His Thr Val Asn Cys 130 135 140

Phe Gly Ma Lys Val Lys Val Val Gly Asn Thr Gly Ser Asn Ser Thr 145 150 155 160

Arg Glu a lie His Ala Thr Glu Gin Gly Phe Ala Val Gly Met His

165 170 175 Ala a Leu His lie Asn Pro Tyr Tyr Gly Lys Thr Ser lie Glu Gly 180 185 190

Leu lie Ser His Phe Glu Ma Val Leu Pro Met Gly Pro Thr lie lie

195 200 205

Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Gin Asp lie Pro Pro Ala Val lie 210 215 220

Glu Ala Val Ser Ser Phe Thr Asn Leu Ala Gly Val Lys Glu Cys Val 225 230 235 240

Gly His Glu Arg Val Lys Cys Tyr Thr Asp Lys Gly lie Thr lie Trp

245 250 255

Ser Gly Asn Asp Asp Glu Cys His Asp Ser Arg Trp Lys Tyr Gly Ma

260 265 270

Thr Gly Val lie Ser Val a Ser Asn Leu lie Pro Gly Leu Met His

275 280 285

Asp Leu Met Tyr Glu Gly Glu Asn Lys Thr Leu Asn Glu Lys Leu Phe 290 295 300

Pro Leu Met Lys Trp Leu Phe Cys Gin Pro Asn Pro lie Ala Leu Asn 305 310 315 320

Thr Ala Leu Ala Gin Leu Gly Val Val Arg Pro Val Phe Arg Leu Pro

325 330 335

Tyr Val Pro Leu Pro Leu Glu Lys Arg Val Glu Phe Val Arg lie Val

340 345 350

Glu Ser lie Gly Arg Glu Asn Phe Val Gly Glu Asn Glu Ala Arg Val

355 360 365

( C -末端)

Leu Asp Asp Asp Asp Phe Val Leu Val Ser Arg Tyr

370 375 380 配列番号： 3

配列の長さ ： 25

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA

アンチセンス： No

配列

GTAATAGTTG GAGGAACAAC AGGAG 25 配列番号： 4

酉己列の長さ ： 24

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA

アンチセンス： YES

配列

GAGCTGAGCC AGAGCAGTGT GAG 24

配列番号： 5

配列の長さ ： 1143

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：合成 DNA

配列の特徴

特徴を表す記号： CDS

存在位置： 1 . . 1140

特徴を決定した方法： E

配列

ATG GCG TCG CTG CTG ATC GCC AGC ACG GGG GGC TGC CCA. CCG CCT CGC 48 Met Ala Ser Leu Leu lie Ala Ser Thr Gly Gly Cys Pro Pro Pro Arg

1 5 10 15

GTG GAA. GGA CGC CGC CGC CCT GGG ACC CGC TCC GGC TTG GCG CGA. CCT 96 Val Glu Gly Arg Arg Arg Pro Gly Thr Arg Ser Gly Leu a Arg Pro

20 25 30

TGG CCC GCC GCC GTG GCT GCA CCG GCG CCG CTG CTC AGG ATT AGC AGA. 144 Trp Pro Ala a Val Ala Ala Pro Ala Pro Leu Leu Arg lie Ser Arg

35 40 45

GGA. AAG ΊΤΓ GCA. TTG CAG GCC ATC ACC CTT GAT GAT TAT CTT CCA. ATG 192 Gly Lys Phe Ala Leu Gin Ala lie Thr Leu Asp Asp Tyr Leu Pro Met

50 55 60

CGA ACT ACT GAA CTG AAA AAT CGG ACA TCA ACA GCT GAT ATC ACT ACT 240 Arg Ser Thr Glu Val Lys Asn Arg Thr Ser Thr Ma Asp He Thr Ser 65 70 75 80

CTC AGA. GTA ATT ACA GCG GTC AAA ACC CCA TAT CTG CCT GAT GGA AGA. 288 Leu Arg Val lie Thr Ala Val Lys Thr Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Arg

85 90 95

TTT GAT CTC GAA GCA. TAT G¾T TCA CTG ATA AAT ATG CAG ATA GAT GGT 336 Phe Asp Leu Glu Ala Tyr Asp Ser Leu lie Asn Met Gin lie Asp Gly

100 105 110 GGT GCT GAA GG GTA ATA GTT GGA GGA. ACA ACA GGA GAG GGC CAC CTT 384 Gly Ala Glu Gly Val lie Val Gly Gly Thr Thr Gly Glu Gly His Leu

115 120 125

ATG AGC TGG GAT GAA. CAC ATC ATG CTT ATT GGA CAT ACT GTT AAC TGC 432 Met Ser Trp Asp Glu His lie Met Leu lie Gly His Thr Val Asn Cys

130 135 140

ΊΤΓ GGT GCT AAA. GIT AAA GTG GTA GGC AAC ACA GGT AGT ATC TCA ACA 480 Phe Gly Ala Lys Val Lys Val Val Gly Asn Thr Gly Ser lie Ser Thr 145 150 155 158 160

AGA GAG GCT ATT CAT GCA ACA GAG CAG GGA ΤΓΓ GCT GTA GGT ATG CAT 528 Arg Glu Ala lie His Ala Thr Glu Gin Gly Phe Ala Val Gly Met His

165 170 175

GCG GCT CTC CAT ATC AAT CCT TAC TAT GGG AAG ACC TCT ATC GAA GGG 576 a Ala Leu His lie Asn Pro Tyr Tyr Gly Lys Thr Ser lie Glu Gly

180 185 190

TTG ATA TCT CAT TTT GAG GCT GTC CTC CCA. ATG GGT CCA ACC ATT ATT 624 Leu He Ser His Phe Glu a Val Leu Pro Met Gly Pro Thr lie lie

195 200 205

TAC ΑΆΤ GTT CCA. TCT AGG ACT GGC CAG GAT ATT CCT CCT GCA GTT ATT 672 Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Gin Asp lie Pro Pro Ala Val lie

210 215 220

GAG GCT GTT TCA ACT TTC ACA AAC TTG GCA GGT GTG AAA GAA. TGT GTT 720 Glu Ala Val Ser Ser Phe Thr Asn Leu Ala Gly Val Lys Glu Cys Val 225 230 235 240

GGA CAT GAG AGG GTT AAG TGC TAC ACT GAC AAA GGT ATA ACC ATA TGG 768 Gly His Glu Arg Val Lys Cys Tyr Thr Asp Lys Gly He Thr lie Trp

245 250 255

AGT GGT AAT GAT GAT GAA TGC CAT GAT TCT AGG TGG AAA TAT GGT GCC 816 Ser Gly Asn Asp Asp Glu Cys His Asp Ser Arg Trp Lys Tyr Gly Ala

260 265 270

08ε 9L£ 0L£

^Aj, β ¾ jas Τ^Λ ηθΊ T^A s d ds¾ dsv ds ΠΘΊ ε ττ wx ονι SDV ISVつ IS SIX DJB UJ, I¾S IAS OV O¾D U

99ε 09ε ςςε

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982 082 GLZ

STH ari Λχο ο¾ ΘΤΙ ΠΘΤ; us^： ras Βχν χΗΛ： ras ΘΤΙ Τ^Λ Λχο J¾

98 DVD SLV DID ISD J D 11V 1IO OW DSV IDD 3JS JOI 11V U3 ¾DD IDV

96 f8LlO/86<ir/13d €8frf S/66 ΟΛ\ 配列番号： 6

配列の長さ ： 380

配列の型： アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： タンパク質

配列

Met Ala Ser Leu Leu lie Ala Ser Thr Gly Gly Cys Pro Pro Pro Arg 1 5 10 15

Val Glu Gly Arg Arg Arg Pro Gly Thr Arg Ser Gly Leu Ala Arg Pro

20 25 30

Trp Pro Ala Ala Val Ala Ala Pro Ala Pro Leu Leu Arg lie Ser Arg

35 40 45

Gly Lys Phe Ala Leu Gin Ala lie Thr Leu Asp Asp Tyr Leu Pro Met 50 55 60

Arg Ser Thr Glu Val Lys Asn Arg Thr Ser Thr Ala Asp lie Thr Ser 65 70 75 80

Leu Arg Val lie Thr Ma Val Lys Thr Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Arg

85 90 95

Phe Asp Leu Glu Ala Tyr Asp Ser Leu lie Asn Met Gin lie Asp Gly

100 105 110

Gly Ala Glu Gly Val lie Val Gly Gly Thr Thr Gly Glu Gly His Leu

115 120 125

Met Ser Trp Asp Glu His lie Met Leu lie Gly His Thr Val Asn Cys 130 135 140

Phe Gly Ala Lys Val Lys Val Val Gly Asn Thr Gly Ser He Ser Thr 145 150 155 158 160

Arg Glu a lie His Ala Thr Glu Gin Gly Phe Ala Val Gly Met His

165 170 175

Ala Ala Leu His He Asn Pro Tyr Tyr Gly Lys Thr Ser He Glu Gly

180 185 190 Leu lie Ser His Phe Glu Ala Val Leu Pro Met Gly Pro Thr lie lie 195 200 205

Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Gin Asp lie Pro Pro Ala Val lie 210 215 220

Glu Ala Val Ser Ser Phe Thr Asn Leu Ala Gly Val Lys Glu Cys Val 225 230 235 240

Gly His Glu Arg Val Lys Cys Tyr Thr Asp Lys Gly lie Thr lie Trp

245 250 255

Ser Gly Asn Asp Asp Glu Cys His Asp Ser Arg Trp Lys Tyr Gly a

260 265 270

Thr Gly Val lie Ser Val Ala Ser Asn Leu lie Pro Gly Leu Met His

275 280 285

Asp Leu Met Tyr Glu Gly Glu Asn Lys Thr Leu Asn Glu Lys Leu Phe 290 295 300

Pro Leu Met Lys Trp Leu Phe Cys Gin Pro Asn Pro lie Ala Leu Asn 305 310 315 320

Thr Ala Leu a Gin Leu Gly Val Val Arg Pro Val Phe Arg Leu Pro

325 330 335

Tyr Val Pro Leu Pro Leu Glu Lys Arg Val Glu Phe Val Arg lie Val

340 345 350

Glu Ser lie Gly Arg Glu Asn Phe Val Gly Glu Asn Glu Ala Arg Val

355 360 365

Leu Asp Asp Asp Asp Phe Val Leu Val Ser Arg Tyr

370 375 380 配列番号：フ

配列の長さ ： 1143

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：合成 DNA

起源

生物名 ：イネ

組織の種類：茎葉

配列の特徴

特徴を表す記号： CDS

存在位置： 1 . . 1140

特徴を決定した方法： E

配列

ATG GCG TCG CTG CTG ATC GCC AGC ACG GGG GGC TGC CCA CCG CCT CGC 48 Met Ala Ser Leu Leu lie Ala Ser Thr Gly Gly Cys Pro Pro Pro Arg

1 5 10 15

CTG GAA GGA CGC CGC CGC CCT GGG ACC CGC TCC GGC TTG GCG CGA CCT 96 Val Glu Gly Arg Arg Arg Pro Gly Thr Arg Ser Gly Leu Ala Arg Pro

20 25 30

TGG CCC GCC GCC CTG GCT GCA CCG GCG CCG CTG CTC AGG ATT AGC AGA 144 Trp Pro Ala Ala Val Ala Ala Pro Ma Pro Leu Leu Arg lie Ser Arg

35 40 45

GGA. AAG TTT GCA TTG AG GCC ATC ACC CTT GAT GAT TAT CTT CCA ATG 192 Gly Lys Phe Ala Leu Gin Ala lie Thr Leu Asp Asp Tyr Leu Pro Met

50 55 60

CGA. AGT ACT GAA. GTG AAA ΑΆΤ CGG ACA TCA ACA GCT GAT ATC ACT ACT 240 Arg Ser Thr Glu Val Lys Asn Arg Thr Ser Thr Ma Asp He Thr Ser 65 70 75 80

CTC AGA GTA ATT ACA GCG CTC AAA ACC CCA. ΤΆΤ CTG CCT GAT GGA. AGA. 288 Leu Arg Val lie Thr Ala Val Lys Thr Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Arg

85 90 95 W 9/5

100

TTT GAT CTC GAA GCA TAT GAT TCA. C G ATA ΑΆΤ ATG CAG ATA GAT GGT 336 Phe Asp Leu Glu a Tyr Asp Ser Leu He Asn Met Gin lie Asp Gly

100 105 110

GGT GCT GAA GGT CTA ATA CTT GGA GGA ACA ACA GGA. GAG GGC CAC CTT 384 Gly Ala Glu Gly Val lie Val Gly Gly Thr Thr Gly Glu Gly His Leu

115 120 125

ATG AGC TGG GAT GAA CAC ATC ATG CTT ΑΊ GGA. CAT ACT GTT AAC TGC 432 Met Ser Trp Asp Glu His lie Met Leu He Gly His Thr Val Asn Cys

130 135 140

TTT GCT GCT AAA GTT AAA CTG GTA GGC AAC ACA GGT ACT AAC TCA ACA. 480 Phe Gly Ala Lys Val Lys Val Val Gly Asn Thr Gly Ser Asn Ser Thr 145 150 155 160

AGA GAG GCT ATT CAT GTA ACA GAG CAG GGA. TTT GCT GTA GGT ATG CAT 528 Arg Glu Ala lie His Val Thr Glu Gin Gly Phe a Val Gly Met His

165 166 170 175

GCG GCT CTC CAT ATC ΑΆΤ CC TAC TAT GGG AAG ACC TGT ATC GAA GGG 576 Ala a Leu His lie Asn Pro Tyr Tyr Gly Lys Thr Ser lie Glu Gly

180 185 190

TTG ATA TCT CAT ΊΤΤ GAG GCT CTC CTC CCA ATG GGT CCA ACC ATT AIT 624 Leu He Ser His Phe Glu Ala Val Leu Pro Met Gly Pro Thr lie lie

195 200 205

TAC AAT GTT CCA TCT AGG ACT GGC CAG GAT ATT CCT CCT GCA GTT AIT 672 Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Gin Asp lie Pro Pro Ma Val lie

210 215 220

GAG GCT GTT TCA AGT TTC ACA？ AC TTG GCA GGT GTG AAA GAA TGT GTT 720 Glu a Val Ser Ser Phe Thr Asn Leu Ala Gly Val Lys Glu Cys Val 225 230 235 240

GGA CAT GAG AGG GTT AAG TGC TAC ACT GAC AAA GGT ATA ACC ATA TGG フ 68 Gly His Glu Arg Val Lys Cys Tyr Thr Asp Lys Gly lie Thr lie Trp

245 250 255 /5

101

ACT GGT ΑΆΤ GAT GAT GAA TGC CAT GAT TCT AGG TGG AAA TAT GGT GCC 816 Ser Gly Asn Asp Asp Glu Cys His Asp Ser Arg Trp Lys Tyr Gly Ma

260 265 270

ACT GGA GTT ATT TCT GTG GCT AGC AAC CTT ATT CCT GGT CTC A G CAC 864 Thr Gly Val lie Ser Val a Ser Asn Leu lie Pro Gly Leu Met His

275 280 285

GAT CTC ATG TAT GAA GGG GAG ΑΆΤ AAG ACG CTA ΑΆΤ GAG AAG CTC TTT 912 Asp Leu Met Tyr Glu Gly Glu Asn Lys Thr Leu Asn Glu Lys Leu Phe

290 295 300

CCC CTG ATG AAA TGG TG Ί Γ TGC CAG CCA AAT CCA. ΑΊΤ GCT CTC AAC 960 Pro Leu Met Lys Trp Leu Phe Cys Gin Pro Asn Pro lie Ala Leu Asn 305 310 315 320

ACT GCC CTG GCT CAG CTT GGA. CTG CTA AGG CCT GTT TTC AGA. TTA CCA 1008 Thr a Leu Ala Gin Leu Gly Val Val Arg Pro Val Phe Arg Leu Pro

325 330 335

TAT GTA CCT CTT CCT CTT GAA AAG AGG GTA GAG ΤΊΤ CTC CGA. ATC GTT 1056 Tyr Val Pro Leu Pro Leu Glu Lys Arg Val Glu Phe Val Arg lie Val

340 345 350

GAA TCT AT GGA. CGG GAA AAC TTT GTG GGT GAG AAC GAG GCA CGG GTT 1104 Glu Ser lie Gly Arg Glu Asn Phe Val Gly Glu Asn Glu Ala Arg Val

355 360 365

CTT GAC GAC GAT GAT ΤΤΓ GTG TTG CTC ACT AGG TAC ΤΑΆ 1143 Leu Asp Asp Asp Asp Phe Val Leu Val Ser Arg Tyr

370 375 380

配列番号： 8

配列の長さ ： 380

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： タンパク質

配列

Met Ala Ser Leu Leu He Ala Ser Thr Gly Gly Cys Pro Pro Pro Arg 1 5 10 15

Val Glu Gly Arg Arg Arg Pro Gly Thr Arg Ser Gly Leu Ala Arg Pro

20 25 30

Trp Pro Ala Ala Val Ma a Pro Ala Pro Leu Leu Arg lie Ser Arg

35 40 45

Gly Lys Phe Ala Leu Gin Ala lie Thr Leu Asp Asp Tyr Leu Pro Met 50 55 60

Arg Ser Thr Glu Val Lys Asn Arg Thr Ser Thr Ala Asp lie Thr Ser 65 70 75 80

Leu Arg Val lie Thr Ala Val Lys Thr Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Arg

85 90 95

Phe Asp Leu Glu Ala Tyr Asp Ser Leu lie Asn Met Gin lie Asp Gly

100 105 110

Gly Ala Glu Gly Val lie Val Gly Gly Thr Thr Gly Glu Gly His Leu

115 120 125

Met Ser Trp Asp Glu His lie Met Leu lie Gly His Thr Val Asn Cys 130 135 140

Phe Gly Ala Lys Val Lys Val Val Gly Asn Thr Gly Ser Asn Ser Thr 145 150 155 160

Arg Glu Ala lie His Ala Thr Glu Gin Gly Phe Ala Val Gly Met His

165 170 175 a Ala Leu His lie Asn Pro Tyr Tyr Gly Lys Thr Ser lie Glu Gly

180 185 190 Leu lie Ser His Phe Glu Ala Val Leu Pro Met Gly Pro Thr lie lie 195 200 205

Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Gin Asp lie Pro Pro Ala Val lie 210 215 220

Glu Ala Val Ser Ser Phe Thr Asn Leu Ala Gly Val Lys Glu Cys Val 225 230 235 240

Gly His Glu Arg Val Lys Cys Tyr Thr Asp Lys Gly He Thr lie Trp

245 250 255

Ser Gly Asn Asp Asp Glu Cys His Asp Ser Arg Trp Lys Tyr Gly Ala

260 265 270

Thr Gly Val lie Ser Val Ala Ser Asn Leu lie Pro Gly Leu Met His

275 280 285

Asp Leu Met Tyr Glu Gly Glu Asn Lys Thr Leu Asn Glu Lys Leu Phe 290 295 300

Pro Leu Met Lys Trp Leu Phe Cys Gin Pro Asn Pro lie Ala Leu Asn 305 310 315 320

Thr Ala Leu Ala Gin Leu Gly Val Val Arg Pro Val Phe Arg Leu Pro

325 330 335

Tyr Val Pro Leu Pro Leu Glu Lys Arg Val Glu Phe Val Arg lie Val

340 345 350

Glu Ser lie Gly Arg Glu Asn Phe Val Gly Glu Asn Glu Ala Arg Val

355 360 365

Leu Asp Asp Asp Asp Phe Val Leu Val Ser Arg Tyr

370 375 380 配列番号： 9

配列の長さ ： 32

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA

アンチセンス ： YES

配列

5' -GCCTCTCTTGTTGAGATACTACCTGTGTTGCC- 3'

配列番号： 10

配列の長さ ： 30

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA

アンチセンス ： YES

配列

5' -GCAAATCCCTGCTCTGTTACATGAATAGCC- 3'

配列番号： 11

配列の長さ ： 20

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA アンチセンス ： No

配列

5' -GTAAAACGACGGCCAGTGAG- 3'

配列番号： 12

配列の長さ ： 19

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA アンチセンス ： YES

配列

5' -GGAAACAGCTATGACCATG-3'

配列番号： 13

配列の長さ ： 21

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA アンチセンス ： No

配列

5' -TAGGGCGAATTGTGTGTACCG-3'

配列番号： 14

配列の長さ ： 30

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA

アンチセンス ： No

配列

5' -GCTCTAGACAAGATGGCGTCGCTGCTGATC-3'

配列番号： 15

配列の長さ ： 28

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA

アンチセンス ： YES

配列

5' -GCGAGCTCGTTAGTACCTACTGACCAAC-3⁷

Claims

ロ冃 求 の

1. 配列表の配列番号 2 に示すア ミ ノ 酸配列を有 するイネのジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼをコ一 ド する DNA。

2. 配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列を有す る DNAである請求の範囲 1 に記載の D NA。

3. 配列表の配列番号 2 に示されたア ミ ノ 酸配列 における 1 個も しく は複数個のア ミ ノ酸が欠失するカ 及び（又は）他のア ミ ノ 酸と置換される力 、 及び（又は）他の ァ ミ ノ 酸を挿入又は付加 されるかして形成されたァ ミ ノ 酸配列を有する タ ンパク質であって、 ジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シ ンターゼ活性を有する タ ンパク質を コー ドする D NA。

4. 配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列と部分 的に異なる塩基配列を有するが、 配列番号 1 に記載の前 記の塩基配列に対して高い相同性を示す D NAであって、 しかも配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列を有する D NAに対してス ト リ ンジェ ン トな条件下でハイ ブリ ダイ ズする こ と ができ 、 かつ、 ジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シン ターゼ活性を有する タ ンパク質をユー ドする DNA であ る請求の範囲 3に記載の DNA。

5. 配列表の配列番号 6 に記載のア ミ ノ 酸配列を 有し且つジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼ活性を有す る タ ンパク質をコー ドする DNAである請求の範囲 3に記 載の DNA。

6. 配列表の配列番号 5 に記載の塩基配列を有す る D NAであ り 、 DNA- 158N配列と命名 される DNAであ る請求の範囲 3に記載の DNA。

7. 配列表の配列番号 8 に記載のア ミ ノ 酸配列を 有し且つジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼ活性を有す る タ ンパク質を コー ドする DNAである請求の範囲 3に記 載の D NA。

8. 配列表の配列番号 7 に記載された塩基配列を 有する D NA であ り 、 D NA- 166A配列 と命名 される D NA である請求の範囲 3に記載の DNA。

9. イ ネのジ ヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼを コー ドする請求の範囲 1 に記載の D NA、 も しく はジヒ ド ロ ジピコ リ ネー ト シンターゼ活性を有する タ ンパク質を コ ー ドする請求の範囲 3に記載の DNAを担持する組換え ベク ターを導入されて形質転換された植物細胞を有し、 そ して導入された前記 D NA が発現可能である こ と を特 徴とする、 形質転換植物。

10. イ ネのジ ヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼを コ ー ドする請求の範囲 1に記載の D NAを担持する組換え べク ターを植物細胞に導入する こ と によ って得られ且つ 前記の DNAが発現可能である形質転換植物を栽培し、 さ らにその栽培によ り 結実した植物から採取された種子で ある こ と を特徴とする、 形質転換植物の種子。

11. ジヒ ドロ ジピコ リ ネー ト シンターゼ活性を有 する タ ンパク質をコー ドする請求の範囲 3に記載の DNA を担持する組換えべク ターを植物細胞に導入する こ と に よ って得られ且つ前記の D NA が発現可能である形質転 換植物を栽培し、 さ ら にその栽培によ り 結実 した植物か ら採取された種子である こ と を特徴とする、 形質転換植 物の種子。

12. プラス ミ ドベク ター p Blue script II SK(+)の制 限酵素 EcoR Iによ る切断部位に、 配列表の配列番号 1 に 記載の塩基配列を有する D NA配列を含有する D NA断片 を DNA リ ゲーシ ヨ ン ·キ ッ トによ り 連結して形成された 組換えプラ ス ミ ドを含み、 しかもア ン ピシ リ ンの存在下 でも安定に増殖でき る こ と を特徴とする、 形質転換され た大月易菌。

13. 形質転換大腸菌は、 日本における工業技術院生 命工学工業技術研究所にブダぺス ト条約の規約下に受託 番号 FERM BP - 6310で寄託されてある大腸菌 DAP8- 1で ある請求の範囲 12に記載の大腸菌。

14. カ リ フ ラ ワーモザイ ク ウイ ノレ ス 由来であ り 且 つ植物で発現可能なプロモーターと 、 NO S ターミ ネータ 一 と 、 ア ン ピシ リ ン耐性遺伝子と を含有する プラ ス ミ ド ベク ターに、 前記のプロモーターの支配下に、 配列表の 配列番号 1、 または配列番号 5または配列番号 7に記載の 1143bpの塩基配列を有する D NA酉己歹 ijを担 う D NA断片を 組込んでなる組換えべク ター。

15. プラ ス ミ ドベク タ ー力 Sプラ ス ミ ドベク タ ー PBI221である請求の範囲 14に記載の組換えベク ター。