WO1999035250A1 - Enzymes immobilisees actives sur un support a base d'alumine, leurs procedes de preparation et leurs applications - Google Patents

Enzymes immobilisees actives sur un support a base d'alumine, leurs procedes de preparation et leurs applications Download PDF

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WO1999035250A1
WO1999035250A1 PCT/FR1998/002902 FR9802902W WO9935250A1 WO 1999035250 A1 WO1999035250 A1 WO 1999035250A1 FR 9802902 W FR9802902 W FR 9802902W WO 9935250 A1 WO9935250 A1 WO 9935250A1
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group
osidase
alumina
compound
reactive chemical
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Application number
PCT/FR1998/002902
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Inventor
Raphaël DUVAL
Jean-Claude Yvin
Original Assignee
Societe Civile Ase & Bio
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier

Definitions

  • the invention relates to immobilized enzymes active on an alumina-based support.
  • immobilized enzymes lies essentially in the possibility of recovering them without difficulty from the medium in which they have been used and in which the enzyme proper develops its activities for which it is conventionally used, to purify them by as needed and put them back to act in another environment.
  • the invention also relates to the processes for preparing these active immobilized enzymes as well as their applications.
  • Enzymes immobilized on an alumina support are already known.
  • the protease is attached by a covalent bond to a solid complex formed by alumina linked to a bi- or polyfunctional compound comprising a phosphate functional group and a group capable of forming a covalent bond with a protease.
  • the preparation, according to the above document, of the protease thus immobilized consists in fixing on alumina, as a bifunctional compound, an organic phosphate comprising a reaction group capable of forming a covalent bond with a protease, then in reacting the complex thus formed with the protease after having optionally activated the reactive group comprised by the group, using appropriate activators, so as to form the desired covalent bond binding the protease to the complex.
  • the chemical constitution of the immobilized protease obtained by the first of the above two processes is not the same as that of the immobilized protease obtained by the above second process.
  • the object of the invention is, above all, to respond to the desire of users to have as wide a range as possible of immobilized enzymes active on a support based on alumina.
  • the inventors had the merit of finding that, surprisingly and unexpectedly, it is possible to immobilize, on an alumina-based support, the osidases and in particular ⁇ 1-3 glucanase as well as the lipases.
  • the active immobilized enzyme according to the invention is characterized in that it consists of an osidase, in particular ⁇ 1-3 glucanase, and / or by a lipase immobilized by fixing using of a covalent bond on an insoluble solid complex formed by alumina linked to a bi- or polyfunctional compound comprising a phosphate functional group by which it is linked to alumina and a reactive chemical group, activated as necessary by the use of an activating agent, this reactive chemical group being capable of forming the above covalent bond with osidase and / or with lipase.
  • a bi- or polyfunctional compound comprising, on the one hand, a phosphate functional group and, d on the other hand, a reactive chemical group capable, after activation as necessary by the use of an activating agent, of forming a covalent bond with an enzyme, and that
  • this bi- or polyfunctional compound is fixed on alumina by its phosphate reaction group forming a complex between the compound and the alumina then, in a second step, the complex thus formed is reacted with osidase and / or lipase so as to create a covalent bond between osidase and / or lipase and the reactive chemical group of the bi- or polyfunctional compound after having activated the latter as necessary,
  • a phospho-osidase and / or a phospholipase is formed by reacting the bi- or polyfunctional compound with 1 Osidase and / or the lipase so as to form a covalent bond between the osidase and / or the lipase and the reactive chemical group, comprising the bi- or polyfunctional compound, after activation as necessary then, in a second step, the phospho-osidase and / or the phospholipase thus formed are fixed on an alumina-based support by reaction of the latter with the phosphate reaction group of the bi- or polyfunctional compound.
  • the alumina can be used in the form of powders or membranes obtained according to conventional methods described in particular in "Chromatographies in liquid or super-critical phases” by Robert Rosset, Marcel Caude and Alain
  • the bi- or polyfunctional compound is chosen from the group of those having the general formula xo ⁇ Q
  • - X represents a hydrogen or alkali metal atom
  • - Y which comprises at least one reactive chemical group chosen from the group comprising the amino, carboxylic acid, alcohol, thiol, aldehyde or ester functions, is either a linear or branched C 1 -C 40 alkyl group which may contain one or more heteroatoms, either an aryl or polyaryl group which may comprise one or more heteroatoms, or an alkylaryl or arylalkyl group in which the alkyl part is C to C 40 and may comprise, like the aryl part, one or more heteroatoms, it being understood that, when the reactive chemical group is different from the thiol and aldehyde functions, it must be activated by reaction of the compound of formula (I) with an activating agent.
  • the activating agent is a chemical compound comprising a function capable of forming a covalent bond with the amino or carboxylic acid functions carried by the enzymes and which is reacted with those of the bi- or polyfunctional compounds which, as chemical group reactive, have an amino, alcohol or carboxylic acid function.
  • the activating agent which can be implemented according to the techniques of Howard H. Weetall published in "Applied Biochemistry and Biotechnology" ( 1993) 41, 157-188, and which should be used when the reactive chemical group comprising said bi- or polyfunctional compound is different from the thiol or aldehyde functions, is chosen from the group comprising the derivatives whose formulas are indicated below after activation of a reactive chemical group comprising said bi- or polyfunctional compound and consisting of an amino, alcohol or carboxylic acid function, the nature of this function being mentioned for each of said derivatives, namely: NH N
  • the fixing of the bi- or polyfunctional compound on the alumina-based support is carried out by reacting an aqueous solution of the bi-compound or polyfunctional optionally activated with an alumina suspension in an aqueous medium.
  • the fixing, on a support constituted by an alumina powder, of a particle size of 40 to 150 ⁇ m, of the above-mentioned activated bifunctional compound is carried out in stirring for 30 minutes a suspension of 10 g of said alumina powder in the solution obtained, as indicated above, of the activated bifunctional compound, the pH of the suspension being maintained at 7.
  • the immobilization of the osidase and / or the lipase by reaction with the reactive chemical group possibly activated, of the bifunctional compound fixed on the alumina-based support is carried out in an aqueous medium at pH 7 and at a temperature between 15 and 40 ° C.
  • the phospho-osidase and the phospholipase are first prepared by reacting the enzyme in aqueous solution on the bifunctional compound of formula (I), also in aqueous solution after activation of this bifunctional compound as necessary.
  • the bifunctional compound is thiamine pyrophosphate
  • the reactive chemical group which it contains is an amine function which should consequently be activated; to do this, and as before, we can use glutaraldehyde.
  • the reaction solution is subjected to dialysis to remove the excess reagents.
  • the phosphoglucanase "TPPc" is thus obtained.
  • the phosphoglucanase obtained above is immobilized on the alumina-based support by reacting, with stirring, for 4 hours at 37 ° C, an aqueous suspension of alumina with a particle size of 40 to 150 ⁇ m with the dialysate of the phosphoenzyme obtained above.
  • the progression of the absorption is followed by determination at regular intervals of the residual enzymatic activity of samples of the filtrate of the above mixture.
  • reaction medium After complete disappearance of the enzymatic activity (2 to 4 hours in general), the reaction medium is filtered and washed abundantly with water.
  • the immobilized phosphoenzyme thus obtained is stored as it is, that is to say wet, in the refrigerator at + 4 ° C until use. Its enzymatic activity is determined by hydrolysis of its specific substrate.
  • the active immobilized enzymes in accordance with the invention are used for the treatment of the media in respect of which they develop the activities for which they are conventionally used.
  • the above treatments use a setting medium aqueous or hydroorganic work or containing only organic solvents; this medium can be a liquefied gas used in the critical, sub-critical, or super-critical state; the temperature of the medium can vary from -20 ° C to + 200 ° C and the pressure exerted on the medium can vary from 0.1 to 300 bars in absolute value.
  • reaction medium is stirred at 20-25 ° C until a total solution is obtained. To this reaction medium is added, with slow stirring
  • the suspension thus formed is stirred for 15 minutes and its pH is adjusted to 4.5 with a sufficient quantity of sodium acetate.
  • the insoluble material is separated by filtration on a No. 2 frit and then washed thoroughly with three times 0.5 l of demineralized water.
  • the insoluble matter is collected and loaded again into a 4-liter glass reactor containing a solution 1 M of glutaraldehyde previously prepared by dissolving, in 1231 ml of demineralized water, 270 ml of 5.6 M glutaraldehyde sold by the company FLUKA under the reference 49629. Stirring is maintained at 30 rpm, at a temperature included between 20 and 25 ° C, for 2 hours; filtered through a No. 2 frit and then washed with three times 0.5 1 of demineralized water.
  • the wet insoluble material is recovered and loaded into a 4-liter reactor containing a solution, in 1.5 liters of 2.1 M sodium acetate, pH 4.55, of 3 g of ⁇ 1-3 glucanase sold under the GLUCANEX brand by NOVO Company
  • the temperature is maintained between 20 and 25 ° C and stirred for 2 hours at a speed of 30 rpm.
  • the wet precipitate consisting of ⁇ 1-3 glucanase immobilized on alumina is recovered and stored at a temperature of 4 to 6 ° C until use.
  • the activated bifunctional compound is thus obtained. Then added to the solution of activated bifunctional compound a solution previously prepared by dissolving, in 10 liters of demineralized water, 20 g of ⁇ 1-3 glucanase marketed under the brand GLUCANEX by the company NOVO INDUSTRIES.
  • the pH is adjusted to 4.5 with the sufficient amount of sodium hydroxide 0.1 N.
  • the mixture is stirred for 3 hours at a temperature of between 20 and 30 ° C., it is cooled to 20 ° C. and then added, all at once. , 2.5 g sodium cyanoborohydride.
  • the mixture is stirred for 3 hours at a temperature between 20 and 30 ° C., then the reaction medium is subjected to dialysis.
  • the dialysate is recovered and charged to a 20-liter glass reactor with stirring set at 30 rpm.
  • a quantity of 1 kg of alumina sold under the brand SPHERALITE 509 D by the company PROCATALYSE is added to the reaction mass thus constituted.
  • the mixture is stirred for 24 hours at a temperature between 20 and 25 ° C.
  • the wet precipitate consisting of the desired immobilized active enzyme, is kept at the temperature of 4 ° C. (in the refrigerator) until it is used.
  • immobilized ⁇ 1-3 glucanase obtained in Example 1 for example to "digest" a substrate consisting of ⁇ 1-3 glucan, can be carried out in a fixed bed or in a fluidized bed.
  • the two embodiments in question are described below.
  • the substrate solution is circulated through a fixed bed of ⁇ 1-3 glucanase immobilized on alumina as obtained in Example 1.
  • This immobilized enzyme is packed, for example by compression pneumatic in a low pressure column; we can use the AMICON brand Vantage A type.
  • the substrate solution circulates in a closed circuit.
  • a compromise is determined between the adjustment of the flow rate, the residence time of the solution in contact with the immobilized enzyme (which must be sufficiently long to allow the carrying out of the enzymatic hydrolysis) and the passage time. of an entire volume of solution through the circuit (time which must be relatively short, in order to achieve a maximum of passages in a given time).
  • the total duration of stay in contact with the immobilized enzyme depends only on the volume of the latter and on the total duration of the operation.
  • a test is carried out on 10 liters of a solution of ⁇ 1-3 glucan at 10 g / 1, previously clarified by filtration at 1.6 ⁇ m.
  • the device used shown in FIG. 1, comprises the following elements:
  • thermostated tank 1 with a capacity of for example 50 liters, equipped with a stirring system 2 and containing the substrate solution,
  • a peristaltic pump 3 for example of the Watson-Marlow type
  • the pressure gauge located upstream of the column makes it possible to measure the pressure drop caused by the immobilized enzyme bed, knowing that the pressure at the column outlet is negligible given the low flow rates of the order of 10 1 / h supplied by the peristaltic pump. It can be seen that at zero flow, the pressure gauge indicates a low pressure (less than
  • the mass of immobilized enzyme active in the embodiment shown is 3 grams of ⁇ 1-3 glucanase immobilized on 500 g of alumina; it is packed to a height of 14.5 cm, which, taking into account the dimensions of the column (height equal to 47.5 cm and diameter equal to 6.2 cm), corresponds to a volume of active immobilized enzyme of 0.9 liter.
  • the substrate solution is thermostatically controlled at 40 ° C within the tank 1.
  • the heat losses being relatively low, the entire circuit quickly reaches this temperature, then maintained by the circulation of the liquid.
  • the thermostat is set at 56 ° C to obtain 40 ° C in the tank, the optimal temperature for enzymatic hydrolysis. Once the temperature has stabilized, the peristaltic pump is started. The temperature does not vary much since the heat losses in the column and the circuit are minimal.
  • the power of the peristaltic pump is adjusted so as to obtain a pressure of 1.5 bar at the inlet of the column. Beyond such a pressure, the active immobilized enzyme undergoes constraints which, in the more or less long term, could affect its efficiency and its stability.
  • the flow rate associated with such a pressure is 13.2 l / h. Under these conditions, the passage time "t-passage” is 45 minutes. At each passage through the column, the residence time “t-residence" in contact with the enzyme is 4 minutes.
  • the circulation of the substrate solution is carried out for 5 hours 30 minutes.
  • the reaction kinetics obey phenomena of interfacial transport. These are a limiting factor in the enzymatic hydrolysis reaction.
  • the "fixed bed” process which in itself is satisfactory, has a drawback which is due to the heterogeneity existing between the particle bed and the solution passing through it, which has the effect of placing the hydrolysis reaction under diffusion control.
  • the fluidization of the bed of particles of active immobilized enzyme, by an upward flow of liquid, will have the effect of providing an almost homogeneous medium and of optimizing the interfacial exchanges, by an increase in the contact surfaces of immobilized enzyme-solution.
  • the fluidization of the particle bed can be carried out by an upward flow of fluid, in this case the substrate solution.
  • Each of these particles is then surrounded by fluid which protects it from any friction with the other particles, as well as with the walls of the column.
  • the fluidized layer a heterogeneous mixture of solid particles and fluid, behaves macroscopically like a "homogeneous" liquid.
  • thermostatically controlled tank 1 with a capacity of 50 liters, fitted with a stirring system 2 and containing the substrate solution,
  • a peristaltic pump 3 for example of the Watson-Marlow type
  • a mass 5 of active immobilized enzyme adsorbed on alumina filling a low pressure column 13, for example of the VA 90500 type, - a pipe 14 through which the substrate solution is conveyed to the lower end of the column 13 in which it enters 15 to put in a fluidized bed the mass of active immobilized enzyme 5,
  • the pressure gauge located at the inlet of the column, at the bottom of the latter, makes it possible to measure the pressure drop suffered by the liquid through the column, knowing that the pressure leaving the latter is negligible given the low flow rates provided by the peristaltic pump.
  • the liquid is thermostatically controlled within the tank 1. Again, the losses remain low and the entire circuit quickly reaches the set temperature.
  • the thermostat is set at 56 ° C to obtain 40 ° C in the tank, the optimal temperature for enzymatic hydrolysis.
  • the migration, under the influence of the substrate, of the immobilized enzyme, to the top of the column 13 must be carried out gradually in order to avoid turbulence. These would have the effect of dispersing the particles in the column and would promote their migration out of it.
  • the peristaltic pump is set to full power, which allows the active immobilized enzyme to be fluidized over a height of 40 cm. It then occupies a volume "V gel" of 2.5 1.
  • the flow rate associated with such a volume is 28 l / h.
  • fluidization makes it possible to multiply by 2.5 the contact time between the immobilized active enzyme and the ⁇ 1-3 glucan solution.
  • each cycle lasts an average of 4 to 6 hours.
  • the activity of the immobilized enzyme persists under these experimental conditions for at least 8 cycles.

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Abstract

La présente invention a pour objet une enzyme immobilisée active caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une osidase, notamment la β 1-3 glucanase, et/ou par une lipase immobilisées par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé par de l'alumine liée à un composé bi- ou polyfonctionnel comportant un groupe fonctionnel phosphate par lequel il est lié à l'alumine et un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif étant capable de former la susdite liaison covalente avec l'osidase et/ou avec la lipase.

Description

ENZYMES IMMOBILISÉES ACTIVES SUR UN SUPPORT À BASE D'ALUMINE, LEURS PROCÉDÉS DE PRÉPARATION ET LEURS
APPLICATIONS
L'invention a pour objet des enzymes immobilisées actives sur un support à base d'alumine.
L'intérêt des enzymes immobilisées réside essentiellement dans la possibilité de les récupérer sans difficulté à partir du milieu dans lequel elles ont été mises en oeuvre et dans lequel l'enzyme proprement dite développe ses activités pour lesquelles elle est classiquement utilisée, de les purifier en tant que de besoin et de les remettre à agir dans un autre milieu.
L'invention vise également les procédés de préparation de ces enzymes immobilisées actives ainsi que leurs applications .
On connaît déjà des enzymes immobilisées sur un support d'alumine.
Ainsi, le document EP-A-86 402014.4 décrit l'im o- bilisation des protéases sur des alumine-phosphates organiques .
Selon ce document, la protéase est rattachée par une liaison covalente à un complexe solide formé par de l'alumine liée à un composé bi- ou polyfonctionnel comportant un groupe fonctionnel phosphate et un groupe capable de former une liaison covalente avec une protéase.
La préparation, selon le susdit document, de la protéase ainsi immobilisée, consiste à fixer sur de l'alumine, en tant que composé bifonctionnel, un phosphate organique comportant un groupe réactionnel capable de former une liaison covalente avec une protéase, puis à faire réagir le complexe ainsi formé avec la protéase après avoir éventuellement activé le groupe réactif comporté par le groupe, en ayant recours à des activateurs appropriés, de façon à former la liaison covalente recherchée liant la protéase au complexe.
Il est également connu --voir à cet égard le document "Bioscience Reports " vol. 8, No.3, 1988, page 266-- de former dans un premier temps une phosphoprotease en faisant réagir le composé bifonctionnel dont il a été question ci-dessus avec la protéase en question de façon à former une liaison covalente entre la protéase et le groupe chimiquement réactif comporté par ledit composé, éventuellement après activation de celui-ci, puis à fixer la phosphoprotease ainsi constituée sur de l'alumine par réaction de celle-ci avec le groupe réactionnel phosphate comporté par le composé bifonctionnel.
La constitution chimique de la protéase immobilisée obtenue par le premier des deux susdits procédés, n'est pas la même que celle de la protéase immobilisée obtenue par le susdit deuxième procédé.
Il s'ensuit que les activités des deux types de protéases immobilisées ainsi obtenues ne sont pas identiques . II est enfin connu, par le susdit document, d'utiliser les enzymes ainsi immobilisées dans leurs applications classiques.
L'invention a pour objet, surtout, de répondre au souhait des utilisateurs de disposer d'un éventail aussi large que possible d'enzymes immobilisées actives sur un support à base d'alumine.
Et les inventeurs ont eu le mérite de trouver que, de façon surprenante et inattendue, il est possible d'immobiliser, sur un support à base d'alumine, les osidases et notamment la β 1-3 glucanase ainsi que les lipases.
Il s'ensuit que l'enzyme immobilisée active conforme à l'invention est caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une osidase, notamment la β 1-3 glucanase, et/ou par une lipase immobilisées par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé par de l'alumine liée à un composé bi- ou polyfonctionnel comportant un groupe fonctionnel phosphate par lequel il est lié à l'alumine et un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif étant capable de former la susdite liaison covalente avec l' osidase et/ou avec la lipase.
Le procédé de préparation de l' osidase et/ou de la lipase immobilisées conforme à l'invention est caractérisé par le fait que l'on sélectionne un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphate et, d'autre part, un groupe chimique réactif capable, après activation en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, de former une liaison covalente avec une enzyme, et que
• soit, dans une première étape, on fixe ce composé bi- ou polyfonctionnel sur de l'alumine par son groupe réactionnel phosphate formant un complexe entre le composé et l'alumine puis, dans une deuxième étape, on fait réagir le complexe ainsi formé avec l' osidase et/ou la lipase de façon à créer une liaison covalente entre l' osidase et/ou la lipase et le groupe chimique réactif du composé bi- ou polyfonctionnel après avoir activé ce dernier en tant que de besoin,
• soit, dans une première étape, on constitue une phospho-osidase et/ou une phospholipase en faisant réagir le composé bi- ou polyfonctionnel avec 1 Osidase et/ou la lipase de façon à former une liaison covalente entre l' osidase et/ou la lipase et le groupe chimique réactif, comporté par le composé bi- ou polyfonctionnel, après activation en tant que de besoin puis, dans une deuxième étape, on fixe la phospho-osidase et/ou la phospholipase ainsi formées sur un support à base d'alumine par réaction de celle- ci avec le groupe réactionnel phosphate du composé bi- ou polyfonctionnel.
L'alumine peut être utilisée sous forme de poudres ou de membranes obtenues selon des procédés classiques décrits notamment dans "Chromatographies en phases liquide ou super-cri tique " par Robert Rosset, Marcel Caude et Alain
Jardy, 1991, Edition Masson.
Dans un mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale xo ^ Q
(D
MO
dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes
O phosphates de formules ox
— P
O X
O O
Figure imgf000006_0001
o o o
I! ':
-p — -o— p — -o— P— ox
O X - O X - n O X
avec n variant de 1 à 100 000 , et - Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions aminé, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C^ à C40 pouvant comporter un ou plusieurs heteroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs heteroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs heteroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
L'agent activateur est un composé chimique comportant une fonction capable de former une liaison covalente avec les fonctions aminé ou acide carboxylique comportées par les enzymes et que l'on fait réagir avec ceux des composés bi- ou polyfonctionnels qui, à titre de groupe chimique réactif, comportent une fonction aminé, alcool ou acide carboxylique.
Dans un autre mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, l'agent activateur, qui peut être mis en oeuvre selon les techniques de Howard H. Weetall publiées dans "Applied Biochemistry and Biotechnology" (1993) 41, 157-188, et auquel il convient d'avoir recours quand le groupe chimique réactif comporté par ledit composé bi- ou polyfonctionnel est différent des fonctions thiol ou aldéhyde, est choisi dans le groupe comportant les dérivés dont les formules sont indiquées ci-après après activation d'un groupe chimique réactif comporté par ledit composé bi- ou polyfonctionnel et constitué par une fonction aminé, alcool ou acide carboxylique, la nature de cette fonction étant mentionnée pour chacun desdits dérivés, à savoir: NH N
N
Cl
(activation aminé + trichloro-triazine)
— N=CH — (CH2)3 — C-H
(activation aminé + glutaraldéhyde)
— NH-C — (CH2)6 — C-O-N '
O
(activation aminé + DSS ou disuccinimidyi-subérate)
O — H-C— CH2— CH2 — S— S — ^ /
N
(activation aminé + SPDP ou succlnimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate)
O
O V ^
Figure imgf000008_0001
A O
(activation aminé + SMCC ou succinimidyl-4-(N-malélmldométhyl)cyclohexane-î-carboxylate)
— N = N + Cl"
(activation aminé + nitrite de sodium) O NH — C~ O NO
(activation amlne + 4-nltrophényl-chloroformiate)
H — CH2 — CH— CH2 — O— (CH2)4 — 0-CH2 CH~ :H.
OH «
(activation amlne + bisoxyrane)
O NH CH2 CH3 — C— C=N — (CHjJj— N(CH3)2 , HCI
(activation acide + EDC)
O
O \ C-O-N
(activation acide + N-hydroxy-succinimide)
Figure imgf000009_0001
(activation alcool + carbonyl-diimidazole)
O
Figure imgf000009_0002
(activation alcool + benzoquinone) OH n
\
0-CH2— CH— CH2— O — (CH2)4-0 — CH2-CH — CH,
(activation alcool + bisoxyrane) O — 0 -CH 2 — CH 2 — S — CH = CH 2
(activation alcool + dlvinylsu lfone)
Figure imgf000010_0001
(activation alcool + 3-nltrophényl-chloroformlate)
A titre d'exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on indique que l' activation par mise en oeuvre des techniques décrites par Howard H. eetall dans
"Applied Biochemistry and Biotechnology" (1993) 41, 157-188, d'un composé bifonctionnel de formule (I) dans lequel le groupe chimique réactif activé est une fonction amine, est obtenue par réaction de cette fonction amine, comportée en l'occurrence par le 2-aminoéthyl-dihydrogéno- phosphate de formule
HO —O-CH,—CH. NH,
HO
avec le glutaraldéhyle de formule
O O H—C—(CH2)3—C—H
le composé bifonctionnel activé ainsi obtenu ayant donc une fonction 5-iminopentanal et répondant à la formule
HO° ? p—0-CH2—CH2—N=CH—(CH2)3—C—H HO
Du point de vue pratique, on fait réagir 30 ml d'une solution aqueuse à 0,05 M du 2-aminoéthyl-dihydrogénophosphate avec 30 ml d'une solution aqueuse 0,05 M de glutaraldéhyde. Après 30 minutes d'agitation du mélange à une température de 20 à 25°C, la réaction est complète et la solution du composé bifonctionnel activé ainsi obtenu peut être conservée à une température de 5 à 10°C pendant 300 jours avant son utilisation ultérieure.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, la fixation du composé bi- ou polyfonctionnel sur le support à base d'alumine est réalisée en faisant réagir une solution aqueuse du composé bi- ou polyfonctionnel éventuellement activé avec une suspension d'alumine dans un milieu aqueux.
A titre d'exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on indique que la fixation, sur un support constitué par une poudre d'alumine, d'une granulométrie de 40 à 150 μm, du susdit composé bifonctionnel activé est réalisée en agitant pendant 30 minutes une suspension de 10 g de ladite poudre d'alumine dans la solution obtenue, comme indiqué plus haut, du composé bifonctionnel activé, le pH de la suspension étant maintenu à 7.
A l'issue de cette période d'agitation, la totalité du composé bifonctionnel activé est fixée sur le support d'alumine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, l'immobilisation de l' osidase et/ou de la lipase par réaction avec le groupe chimique réactif éventuellement activé, du composé bifonctionnel fixé sur le support à base d'alumine est effectuée en milieu aqueux à pH 7 et à une température comprise entre 15 et 40°C.
A titre d'exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on indique que, lorsqu'il s'agit de faire réagir une osidase, par exemple la β 1-3 glucanase avec le complexe constitué par l'alumine sur laquelle a été fixé le composé bifonctionnel activé dont la préparation vient d'être décrite —à savoir le 2-aminoéthyl-dihydrogéno-phosphate, activé par le glutaraldehyde et fixé sur l'alumine, ledit composé bifonctionnel activé comportant par conséquent, à titre de groupe chimique réactif, une fonction 5-imino-pentanal-- on procède comme indiqué ci-après.
5 g du susdit complexe sont mis en suspension dans 10 ml d'une solution aqueuse contenant 50 mg de β 1-3 glucanase. Le pH du milieu est ajusté au pH maximum d'activité de l'enzyme, à savoir 3,8 à 4,2 et doit être réajusté si nécessaire. La suspension est agitée pendant 24 heures; elle est ensuite filtrée et lavée à l'eau jusqu'à pH neutre du filtrat. L'enzyme immobilisée active ainsi obtenue est conservée telle quelle (humide) au réfrigérateur à +4°C jusqu'à utilisation. Son activité enzymatique est déterminée par hydrolyse de son substrat spécifique.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, on prépare tout d'abord la phospho- osidase et la phospholipase en faisant réagir l'enzyme en solution aqueuse sur le composé bifonctionnel de formule (I), également en solution aqueuse après activation de ce composé bifonctionnel en tant que de besoin.
Lorsque le composé bifonctionnel est le pyrophosphate de thiamine, le groupe chimique réactif qu'il comporte est une fonction amine qu'il convient par conséquent d'activer; pour ce faire, et comme précédemment, on peut avoir recours au glutaraldehyde.
C'est le résultat de la réaction du pyrophosphate de thiamine avec le glutaraldehyde qui constitue le composé bifonctionnel activé que l'on fait réagir avec l'enzyme, par exemple la β 1-3 glucanase.
On peut procéder comme indiqué ci-après. 460,8 mg (10~3 moles) de pyrophosphate de thiamine sont mis en solution dans 500 ml d'eau et mélangés à 400 ml d'une solution aqueuse de glutaraldehyde à 25% (soit 100 mg à 100% ou 10~3 moles) et le mélange est agité pendant 3 heures à 20-25°C. On ajoute ensuite 2 g d'enzyme de β 1-3 glucanase en solution dans 1000 ml d'eau. Le pH est ajusté à 6,5 par addition de soude 0,1 N. On ajoute ensuite 250 mg de cyanoborohydrure de sodium à titre d'agent réducteur des fonctions imines. Le pH est ajusté à 7 à l'aide d'HCl 0,1 N. Après 3 heures d'agitation, la solution reactionnelle est soumise à une dialyse pour éliminer les réactifs en excès. On obtient ainsi la phosphoglucanase "TPPc". Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, on réalise l'immobilisation de la phosphoglucanase obtenue ci-dessus sur le support à base d'alumine en faisant réagir, sous agitation, pendant 4 heures à 37°C, une suspension aqueuse d'alumine d'une granulométrie de 40 à 150 μm avec le dialysat de la phosphoenzyme obtenu ci- dessus .
La progression de l'absorption est suivie par détermination à intervalles réguliers de l'activité enzymatique résiduelle d'échantillons du filtrat du susdit mélange.
Après disparition totale de l'activité enzymatique (2 à 4 heures en général) , le milieu réactionnel est filtré et lavé abondamment à 1 ' eau.
La phosphoenzyme immobilisée ainsi obtenue est conservée telle quelle, c'est-à-dire humide, au réfrigérateur à +4°C jusqu'à son utilisation. Son activité enzymatique est déterminée par hydrolyse de son substrat spécifique.
Les enzymes immobilisées actives conformes à l'invention sont utilisées pour le traitement des milieux à l'égard desquels elles développent les activités pour lesquelles elles sont utilisées classiquement.
Parmi ces traitements, on peut citer les transformations chimiques, les purifications ou la séparation de molécules organiques, organo- inérales ou minérales . Les susdits traitements utilisent un milieu de mise en oeuvre aqueux ou hydroorganique ou contenant uniquement des solvants organiques; ce milieu peut être un gaz liquéfié utilisé à l'état critique, sub-critique, ou super-critique; la température du milieu peut varier de -20°C à +200°C et la pression exercée sur le milieu peut varier de 0,1 à 300 bars en valeur absolue.
EXEMPLE 1
Préparation de la β 1-3 glucanase immobilisée sur alumine. La préparation de cette β 1-3 glucanase peut être réalisée selon les deux variantes décrites ci-après. Première variante
Dans un réacteur en verre de 4 litres muni d'une agitation mécanique, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on introduit 3 litres d'eau déminéralisée et 10,7 g du composé bifonctionnel constitué par le 2-aminoéthyl-dihydro- génophosphate .
Le milieu réactionnel est agité à 20-25°C jusqu'à l'obtention d'une solution totale. On ajoute à ce milieu réactionnel, sous agitation lente
(30 t/min) , une quantité de 500 g d'alumine commercialisée sous la marque SPHERALITE 509 D par la Société PROCATALYSE.
On agite pendant 15 minutes la suspension ainsi formée et on ajuste son pH à 4,5 avec une quantité suffisante d'acétate de sodium.
Pendant 12 heures et à une température de 20-25°C on maintient une agitation à 30 t/min; on vérifie le pH toutes les heures et on le réajuste à 4,5 si nécessaire.
La cinétique de fixation du 2-aminoéthyl-dihydrogéno- phosphate est suivie par un test de coloration à la ninhydrine.
A la fin des 12 heures d'agitation, l'insoluble est séparé par filtration sur fritte n°2 puis lavé abondamment avec trois fois 0,5 1 d'eau déminéralisée.
L'insoluble humide est récupéré et chargé à nouveau dans un réacteur en verre de 4 litres contenant une solution 1 M de glutaraldehyde préalablement préparée par dissolution, dans 1231 ml d'eau déminéralisée, de 270 ml de glutaraldehyde 5,6 M commercialisé par la Société FLUKA sous la référence 49629. On maintient une agitation à 30 t/min, à une température comprise entre 20 et 25°C, pendant 2 heures; on filtre sur fritte n°2 puis on lave avec trois fois 0,5 1 d'eau déminéralisée .
L'insoluble humide est récupéré et chargé dans un réacteur de 4 litres contenant une solution, dans 1,5 litres d'acétate de sodium 2,1 M de pH 4,55, de 3 g de β 1-3 glucanase commercialisée sous la marque GLUCANEX par la Société NOVO
INDUSTRIES .
On maintient la température entre 20 et 25°C et on agite pendant 2 heures à une vitesse de 30 t/min.
On filtre sur fritte n°2 , puis on lave avec trois ois 0,5 1 d'eau déminéralisée.
On récupère le précipité humide constitué par la β 1-3 glucanase immobilisée sur alumine et on le conserve à une température de 4 à 6°C jusqu'à son utilisation. Deuxième variante
Dans un réacteur en verre de 20 litres, muni d'une agitation, d'un thermomètre et d'une -ampoule de coulée, on charge 4,61 g de pyrophosphate de thiamine et 5 litres d'eau déminera1isée .
On agite jusqu'à dissolution.
On ajoute par l'ampoule de coulée et sans dépasser une température de 30°C, un volume de 4 litres d'une solution aqueuse de glutaraldehyde à 25%. On agite pendant 3 heures à une température comprise entre 20 et 30°C la solution ainsi obtenue.
On obtient ainsi le composé bifonctionnel activé. On ajoute ensuite dans la solution de composé bifonctionnel activé une solution préalablement préparée par dissolution, dans 10 litres d'eau déminéralisée, de 20 g de β 1-3 glucanase commercialisée sous la marque GLUCANEX par la Société NOVO INDUSTRIES.
On ajuste le pH à 4,5 avec la quantité suffisante de soude 0, 1 N. On agite pendant 3 heures à une température comprise entre 20 et 30°C, on refroidit à 20°C et on ajoute ensuite, en une seule fois, 2,5 g de cyanoborohydrure de sodium.
On agite pendant 3 heures à une température comprise entre 20 et 30°C, puis on soumet le milieu réactionnel à une dialyse .
On récupère le dialysat et on le charge dans un réacteur en verre de 20 litres muni d'une agitation réglée à 30 t/min.
On ajoute à la masse reactionnelle ainsi constituée une quantité de 1 kg d'alumine commercialisée sous la marque SPHERALITE 509 D par la Société PROCATALYSE.
On agite pendant 24 heures à une température comprise entre 20 et 25°C.
On filtre sur fritte n°2 ou au buchner et on lave le précipité à l'aide de trois fois 3 litres d'eau déminéralisée.
On conserve le précipité humide, constitué par l'enzyme immobilisée active recherchée, à la température de 4°C (au réfrigérateur) jusqu'à son utilisation.
* * *
La mise en oeuvre de la β 1-3 glucanase immobilisée obtenue à l'exemple 1, par exemple pour "digérer" un substrat constitué par du β 1-3 glucane, peut être réalisée en lit fixe ou en lit fluidisé. Ci-après, on décrit les deux modes de réalisation en question.
Lorsqu'on a recours au lit fixe, on fait circuler la solution de substrat à travers un lit fixe de β 1-3 glucanase immobilisée sur alumine telle qu'obtenue à l'exemple 1. Cette enzyme immobilisée est tassée, par exemple par compression pneumatique dans une colonne basse pression; on peut utiliser celle de type Vantage A de marque AMICON.
La solution de substrat circule en circuit fermé.
Pour une efficacité optimale, on détermine un compromis entre le réglage du débit, le temps de séjour de la solution au contact de l'enzyme immobilisée (qui doit être suffisamment important pour permettre la réalisation de l'hydrolyse enzymatique) et le temps de passage d'un volume entier de solution à travers le circuit (temps qui doit être relativement court, afin de réaliser un maximum de passages en un temps donné) .
La durée totale de séjour au contact de l'enzyme immobilisée ne dépend que du volume de cette dernière et de la durée totale de l'opération.
Un essai est réalisé sur 10 litres d'une solution de β 1-3 glucane à 10 g/1, préalablement clarifiée par filtration à 1, 6 um.
Le dispositif utilisé, montré à la figure 1, comprend les éléments suivants :
- une cuve ther ostatée 1 d'une capacité de par exemple 50 litres, munie d'un système d'agitation 2 et contenant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3 , par exemple du type Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4, - une masse 5 d'enzyme β 1-3 glucanase fixée sur alumine, tassée entre deux plateaux 7 et 8 dans une colonne 6 basse pression,
- une canalisation 9 par laquelle la solution de substrat est acheminée vers la colonne 6 à l'intérieur de laquelle elle est amenée par un tube 10 traversant le plateau 7 jusqu'à la surface de la masse 5,
- une canalisation 11 par laquelle la solution de substrat ayant traversé le lit d'enzyme immobilisée active est extraite de la colonne 6 à travers le plateau 8 grâce à un trou 12 et recyclée vers la cuve 1. Le manomètre situé en amont de la colonne permet de mesurer la perte de charge provoquée par le lit d'enzyme immobilisée, sachant que la pression en sortie de colonne est négligeable étant donné les faibles débits de l'ordre de 10 1/h fournis par la pompe péristaltique. On constate qu'à débit nul, le manomètre indique une faible pression (inférieure à
0,5 bar) probablement due à un accroissement local de celle-ci entre la pompe et l'entrée de la colonne du fait de la conception du circuit. La masse d'enzyme immobilisée active dans le mode de réalisation montré est de 3 grammes de β 1-3 glucanase immobilisée sur 500 g d'alumine; elle est tassée sur une hauteur de 14,5 cm, ce qui, compte tenu des dimensions de la colonne (hauteur égale à 47,5 cm et diamètre égal à 6,2 cm), correspond à un volume d'enzyme immobilisée active de 0,9 litre.
La solution de substrat est thermostatée à 40°C au sein de la cuve 1. Les pertes de chaleur étant relativement faibles, l'ensemble du circuit atteint rapidement cette température, ensuite entretenue par la circulation du liquide.
Une quantité de 10 litres de substrat à 1% de β 1-3 glucane, préalablement clarifié par filtration à 1,6 um, est introduite dans la cuve thermostatée. Le thermostat est réglé à 56°C afin d'obtenir 40°C dans la cuve, température optimale de l'hydrolyse enzymatique. Une fois la température stabilisée, la pompe péristaltique est mise en route. La température varie peu ensuite, car les pertes de chaleur dans la colonne et le circuit sont minimes.
La puissance de la pompe péristaltique est réglée de façon à obtenir une pression de 1,5 bar à 1 ' entrée de la colonne. Au-delà d'une telle pression, l'enzyme immobilisée active subit des contraintes qui, à plus ou moins long terme, pourraient affecter son efficacité et sa stabilité. Le débit associé à une telle pression est de 13,2 1/h. Dans ces conditions, le temps de passage "t-passage" est de 45 minutes. A chaque passage dans la colonne, le temps de séjour "t-séjour" au contact de l'enzyme est de 4 minutes. La circulation de la solution de substrat est effectuée durant 5 heures 30 minutes . Les cinétiques réactionnelles obéissent à des phénomènes de transports interfaciaux. Ceux-ci sont un facteur limitant dans la réaction d'hydrolyse enzymatique.
Le procédé "lit fixe" qui en lui-même est satisfaisant, présente un inconvénient qui est dû à l'hétérogénéité existant entre le lit de particules et la solution qui le traverse, ce qui a pour effet de placer la réaction d'hydrolyse sous contrôle diffusionnel.
De plus, progressivement, il se crée dans ce lit des canaux préférentiels de circulation du liquide. Dès lors, certaines régions du lit ne sont plus irriguées et les molécules qui traversent les canaux préférentiels ne sont plus mises au contact du lit et donc de 1 ' enzyme.
Cet inconvénient n'est toutefois pas de nature à rendre inutilisable le procédé en lit fixe.
On peut néanmoins remédier à cet inconvénient en ayant recours à un système à lit fluidisé.
La fluidisation du lit de particules d'enzyme immobilisée active, par un flux ascendant de liquide, aura pour effet de fournir un milieu quasiment homogène et d'optimiser les échanges interfaciaux, par un accroissement des surfaces de contact enzyme immobilisée-solution.
La fluidisation du lit de particules peut être réalisée par un courant ascendant de fluide, en l'occurrence la solution de substrat.
Elle se produit lorsque la vitesse du fluide est suffisante pour mettre en suspension les particules de la masse d'enzyme immobilisée.
Chacune de ces particules est alors entourée de fluide qui la préserve de tout frottement avec les autres particules, ainsi qu'avec les parois de la colonne. La couche fluidisée, mélange hétérogène de particules solides et de fluide, se comporte macroscopiquement comme un liquide "homogène" .
On peut avoir recours au dispositif montré à la figure 2 et qui comprend les éléments suivants:
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de 50 litres, munie d'un système d'agitation 2 et contenant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3 , par exemple du type Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme immobilisée active adsorbée sur alumine, remplissant une colonne basse pression 13, par exemple de type VA 90500, - une canalisation 14 par laquelle la solution de substrat est acheminée à l'extrémité inférieure de la colonne 13 dans laquelle elle pénètre en 15 pour mettre en lit fluidisé la masse d'enzyme immobilisée active 5,
- une canalisation 15 par laquelle la solution de substrat est extraite en 17 à l'extrémité supérieure de la colonne après avoir traversé le lit fluidisé comprenant la masse d'enzyme immobilisée active 5, à la partie supérieure de la colonne 13 pour être recyclée vers la cuve 1.
Le manomètre situé à l'entrée de la colonne, à la partie inférieure de celle-ci, permet de mesurer la perte de charge subite par le liquide à travers la colonne, sachant que la pression en sortie de celle-ci est négligeable étant donné les faibles débits fournis par la pompe péristaltique.
Le liquide est thermostaté au sein de la cuve 1. Là encore, les pertes restent faibles et l'ensemble du circuit atteint rapidement la température fixée.
EXEMPLE 2
Digestion de β 1-3 glucane à l'aide d'un lit fluidisé à base de β 1-3 glucanase immobilisée selon l'exemple 1. 10 litres de substrat à 1% de β 1-3 glucane, préalablement clarifiés par filtration à 2,7 um, sont introduits dans la cuve thermostatée 1 dont la capacité est de 50 litres, sa hauteur étant de 47 cm et son diamètre de 39,5 cm.
Le thermostat est réglé à 56°C afin d'obtenir 40°C dans la cuve, température optimale de l'hydrolyse enzymatique.
La colonne 13 contient 3 grammes d'enzyme immobilisée sur 500 g d'alumine préparée conformément à l'exemple 1. Une fois la température stabilisée, la pompe péristaltique est mise en route; la température varie peu ensuite car les pertes de chaleur dans la colonne et le circuit sont minimes.
La migration, sous l'influence du substrat, de l'enzyme immobilisée, vers le haut de la colonne 13 doit être réalisée de façon progressive afin d'éviter les turbulences. Celles-ci auraient pour effet de disperser les particules dans la colonne et favoriseraient leur migration hors de celle-ci.
La pompe péristaltique est réglée à pleine puissance, ce qui permet de fluidiser l'enzyme immobilisée active sur une hauteur de 40 cm. Il occupe alors un volume "V gel" de 2,5 1.
Le débit associé à un tel volume est de 28 1/h.
Comparativement au procédé "lit fixe", la fluidisation permet de multiplier par 2, 5 le temps de contact entre 1 'enzyme immobilisée active et la solution de β 1-3 glucane.
En outre, elle optimise la cinétique de catalyse hétérogène par la formation d'une gaine de solution autour de chaque particule.
Pour obtenir la digestion du β 1-3 glucane, chaque cycle dure en moyenne de 4 à 6 heures. L'activité de l'enzyme immobilisée persiste dans ces conditions expérimentales pendant au moins 8 cycles.
On obtient ainsi 85 g d'oligo-β-1, 3-glucanes de DP 2 à DP 6.

Claims

REVENDICATIONS
1. Enzyme immobilisée active caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une osidase, notamment la β 1-3 glucanase, et/ou par une lipase immobilisées par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé par de l'alumine liée à un composé bi- ou polyfonctionnel comportant un groupe fonctionnel phosphate par lequel il est lié à l'alumine et un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif étant capable de former la susdite liaison covalente avec l' osidase et/ou avec la lipase.
2. Procédé de préparation d' osidase et/ou de lipase immobilisées, caractérisé par le fait que l'on sélectionne un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphate et, d'autre part, un groupe chimique réactif capable, après activation en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, de former une liaison covalente avec une enzyme et - que
• soit, dans une première étape, on fixe ce composé bi- ou polyfonctionnel sur de 1 ' alumine par son groupe réactionnel phosphate formant un complexe entre le composé et l'alumine puis, dans une deuxième étape, on fait réagir le complexe ainsi formé avec l' osidase et/ou la lipase de façon à créer une liaison covalente entre 1 Osidase et/ou la lipase et le groupe chimique réactif du composé bi- ou polyfonctionnel après avoir activé ce dernier en tant que de besoin, • soit, dans une première étape, on constitue une phospho- osidase et/ou une phospholipase en faisant réagir le composé bi- ou polyfonctionnel avec l' osidase et/ou la lipase de façon à former une liaison covalente entre l' osidase et/ou la lipase et le groupe chimique réactif, comporté par le composé bi- ou polyfonctionnel, après activation en tant que de besoin puis, dans une deuxième étape, on fixe la phospho-osidase et/ou la phospholipase ainsi formées sur un support à base d'alumine par réaction de celle-ci avec le groupe réactionnel phosphate du composé bi- ou polyfonctionnel.
3. Enzyme immobilisée active selon la revendication
1, caractérisée par le fait que le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale XO Λ
\ yy~>
/p (D MO O-Y dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
Figure imgf000023_0001
O O
/OX
—P-o-p^ ox ox
Figure imgf000023_0002
OX - OX -n OX
avec n variant de 1 à 100 000, et - Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié en ^ C40 pouvant comporter un ou plusieurs heteroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs heteroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C1 à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs heteroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
4. Enzyme immobilisée active selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisée par le fait que l'agent activateur est un composé chimique comportant mie fonction capable de former une liaison covalente avec les fonctions amine ou acide carboxylique comportées par les enzymes, cet agent activateur étant mis à réagir avec ceux des composés bi- ou polyfonctionnels qui, à titre de groupe chimique réactif, comportent une fonction amine, alcool ou acide carboxylique.
5. Procédé selon la revendication 2 , caractérisé par le fait que le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale
XO Q
\ yj Λ (I)
MO O-Y dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin, - M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
O
- ;o x
OX
Figure imgf000024_0001
o o o
II
—p o—p o—p—ox
OX - OX -n OX avec n variant de 1 à 100 000, et
- Y qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C- à C40 pouvant comporter un ou plusieurs heteroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs heteroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C]_ à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs heteroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
6. Application de l'enzyme immobilisée active selon l'une des revendications 1, 3 et 4 ou obtenue selon l'une des revendications 2 et 5, au traitement des milieux à l'égard desquels ladite enzyme développe les activités pour lesquelles elle est utilisée classiquement, notamment les transformations chimiques, les purifications ou la séparation de molécules organiques , organo-minérales ou minérales .
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0218506A1 (fr) * 1985-09-17 1987-04-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Procédé d'insolubilisation d'enzymes par fixation sur des complexes alumine-phosphates organiques et enzymes insolubilisées obtenues par ce procédé, nouveaux supports d'enzymes et leur procédé de préparation et application desdits enzymes insolubilisées
JPS62248487A (ja) * 1986-04-22 1987-10-29 Dentaru Kagaku Kk グルカナーゼを固定化したアパタイトおよびその製造法
EP0273756A2 (fr) * 1986-12-29 1988-07-06 Aluminum Company Of America Matériau actif utilisé comme adsorbant comprenant des particules d'un oxyde-hydroxyde de métal ayant réagi avec un ou plusieurs matériaux contenant du phosphore
GB2221466A (en) * 1988-03-09 1990-02-07 Aluminum Co Of America Biologically reactive particles with biological, therapeutic and chromatographic applications
EP0443734A1 (fr) * 1990-02-20 1991-08-28 Minnesota Mining And Manufacturing Company Fibres enrobées d'oxyde de zirconium
DE4309248A1 (de) * 1993-03-23 1994-09-29 Bernd Lorenz Modifikation von Metalloxiden mit Polyphosphaten oder ähnlichen Verbindungen und ihre Anwendung
JPH09313179A (ja) * 1996-05-28 1997-12-09 Toyo Denka Kogyo Kk 酵素固定化用担体及び固定化リパーゼ

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0218506A1 (fr) * 1985-09-17 1987-04-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Procédé d'insolubilisation d'enzymes par fixation sur des complexes alumine-phosphates organiques et enzymes insolubilisées obtenues par ce procédé, nouveaux supports d'enzymes et leur procédé de préparation et application desdits enzymes insolubilisées
JPS62248487A (ja) * 1986-04-22 1987-10-29 Dentaru Kagaku Kk グルカナーゼを固定化したアパタイトおよびその製造法
EP0273756A2 (fr) * 1986-12-29 1988-07-06 Aluminum Company Of America Matériau actif utilisé comme adsorbant comprenant des particules d'un oxyde-hydroxyde de métal ayant réagi avec un ou plusieurs matériaux contenant du phosphore
GB2221466A (en) * 1988-03-09 1990-02-07 Aluminum Co Of America Biologically reactive particles with biological, therapeutic and chromatographic applications
EP0443734A1 (fr) * 1990-02-20 1991-08-28 Minnesota Mining And Manufacturing Company Fibres enrobées d'oxyde de zirconium
DE4309248A1 (de) * 1993-03-23 1994-09-29 Bernd Lorenz Modifikation von Metalloxiden mit Polyphosphaten oder ähnlichen Verbindungen und ihre Anwendung
JPH09313179A (ja) * 1996-05-28 1997-12-09 Toyo Denka Kogyo Kk 酵素固定化用担体及び固定化リパーゼ

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 012, no. 128 (C - 489) 20 April 1988 (1988-04-20) *
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 098, no. 004 31 March 1998 (1998-03-31) *

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