FR2773170A1 - Enzymes immobilisees sur un support a base d'alumine, leurs procedes de preparation et leurs applications - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet une enzyme immobilisée caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une osidase, notamment la 1-3 glucanase, et/ ou par une lipase immobilisées par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé par de l'alumine liée à un composé bi- oupolyfonctionnel comportant un groupe fonctionnel phosphate par lequel il est lié à l'alumine et un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif étant capable de former la susdite liaison covalente avec l'osidase et/ ou avec la lipase.
Description
ENZYMES IMMOBILISÉES SUR UN SUPPORT À BASE D'ALUMINE,
LEURS PROCÉDÉS DE PRÉPARATION ET LEURS APPLICATIONS
L'invention a pour objet des enzymes immobilisées sur un support à base d'alumine.
LEURS PROCÉDÉS DE PRÉPARATION ET LEURS APPLICATIONS
L'invention a pour objet des enzymes immobilisées sur un support à base d'alumine.
L'intérêt des enzymes immobilisées réside essentiellement dans la possibilité de les récupérer sans difficulté à partir du milieu dans lequel elles ont été mises en oeuvre et dans lequel l'enzyme proprement dite développe ses activités pour lesquelles elle est classiquement utilisée, de les purifier en tant que de besoin et de les remettre à agir dans un autre milieu.
L'invention vise également les procédés de préparation de ces enzymes immobilisées ainsi que leurs applications.
On connaît déjà des enzymes immobilisées sur un support d'alumine.
Ainsi, le document EP-A-86 402014.4 décrit l'immobilisation des protéases sur des alumine-phosphates organiques.
Selon ce document, la protéase est rattachée par une liaison covalente à un complexe solide formé par de l'alumine liée à un composé bi- ou polyfonctionnel comportant un groupe fonctionnel phosphate et un groupe capable de former une liaison covalente avec une protéase.
La préparation, selon le susdit document, de la protéase ainsi immobilisée, consiste à fixer sur de l'alumine, en tant que composé bifonctionnel, un phosphate organique comportant un groupe réactionnel capable de former une liaison covalente avec une protéase, puis à faire réagir le complexe ainsi formé avec la protéase après avoir éventuellement activé le groupe réactif comporté par le groupe, en ayant recours à des activateurs appropriés, de façon à former la liaison covalente recherchée liant la protéase au complexe.
I1 est également connu --voir à cet égard le document "Bioscience .Reports" vol. 8, No.3, 1988, page 266-de former dans un premier temps une phosphoprotéase en faisant réagir le composé bifonctionnel dont il a été question ci-dessus avec la protéase en question de façon à former une liaison covalente entre la protéase et le groupe chimiquement réactif comporté par ledit composé, éventuellement après activation de celui-ci, puis à fixer la phosphoprotéase ainsi constituée sur de l'alumine par réaction de celle-ci avec le groupe réactionnel phosphate comporté par le composé bifonctionnel.
La constitution chimique de la protéase immobilisée obtenue par le premier des deux susdits procédés, n'est pas la même que celle de la protéase immobilisée obtenue par le susdit deuxième procédé.
I1 s'ensuit que les activités des deux types de protéases immobilisées ainsi obtenues ne sont pas identiques.
I1 est enfin connu, par le susdit document, d'utiliser les enzymes ainsi immobilisées dans leurs applications classiques.
L'invention a pour objet, surtout, de répondre au souhait des utilisateurs de disposer d'un éventail aussi large que possible d'enzymes immobilisées sur un support à base d'alumine.
Et les inventeurs ont eu le mérite de trouver que, de façon surprenante et inattendue, il est possible d'immobiliser, sur u support à base d'alumine, les osidases et notamment la ss 1-3 glucanase ainsi que les lipases.
I1 s'ensuit que l'enzyme immobilisée conforme à l'invention est caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une osidase, notamment la 3 1-3 glucanase, et/ou par une lipase immobilisées par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé par de l'alumine liée à un composé bi- ou polyfonctionnel comportant un groupe fonctionnel phosphate par lequel il est lié à l'alumine et un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif étant capable de former la susdite liaison covalente avec l'osidase et/ou avec la lipase.
Le procédé de préparation de l'osidase et/ou de la lipase immobilisées conforme à l'invention est caractérisé par le fait - que l'on sélectionne un composé bi- ou polyfonctionnel
comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphate
et, d'autre part, un groupe chimique réactif capable,
après activation en tant que de besoin par mise en oeuvre
d'un agent activateur, de former une liaison covalente
avec une enzyme, et - que
soit, dans une première étape, on fixe ce composé bi
ou polyfonctionnel sur de l'alumine par son groupe
réactionnel phosphate formant un complexe entre le
composé et l'alumine puis, dans une deuxième étape, on
fait réagir le complexe ainsi formé avec l'osidase
et/ou la lipase de façon à créer une liaison covalente
entre l'osidase et/ou ia lipase et le groupe chimique
réactif du composé bi- ou polyfonctionnel après avoir
activé ce dernier en tant que de besoin,
soit, dans une première étape, on constitue une
phospho-osidase et/ou une phospholipase en faisant
réagir le composé bi- ou polyfonctionnel avec
l'osidase et/ou la lipase de façon à former une
liaison covalente entre l'osidase et/ou la lipase et
le groupe chimique réactif, comporté par le composé
bi- ou polyfonctionnel, après activation en tant que
de besoin puis, dans une deuxième étape, on fixe la
phospho-osidase et/ou la phospholipase ainsi formées
sur un support à base d'alumine par réaction de celle
ci avec le groupe réactionnel phosphate du composé bi
ou polyfonctionnel.
comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphate
et, d'autre part, un groupe chimique réactif capable,
après activation en tant que de besoin par mise en oeuvre
d'un agent activateur, de former une liaison covalente
avec une enzyme, et - que
soit, dans une première étape, on fixe ce composé bi
ou polyfonctionnel sur de l'alumine par son groupe
réactionnel phosphate formant un complexe entre le
composé et l'alumine puis, dans une deuxième étape, on
fait réagir le complexe ainsi formé avec l'osidase
et/ou la lipase de façon à créer une liaison covalente
entre l'osidase et/ou ia lipase et le groupe chimique
réactif du composé bi- ou polyfonctionnel après avoir
activé ce dernier en tant que de besoin,
soit, dans une première étape, on constitue une
phospho-osidase et/ou une phospholipase en faisant
réagir le composé bi- ou polyfonctionnel avec
l'osidase et/ou la lipase de façon à former une
liaison covalente entre l'osidase et/ou la lipase et
le groupe chimique réactif, comporté par le composé
bi- ou polyfonctionnel, après activation en tant que
de besoin puis, dans une deuxième étape, on fixe la
phospho-osidase et/ou la phospholipase ainsi formées
sur un support à base d'alumine par réaction de celle
ci avec le groupe réactionnel phosphate du composé bi
ou polyfonctionnel.
L'alumine peut être utilisée sous forme de poudres ou de membranes obtenues selon des procédés classiques décrits notamment dans "Chromatographies en phases liquide ou super-critique" par Robert Rosset, Marcel Caude et Alain
Jardy, 1991, Edition Masson.
Jardy, 1991, Edition Masson.
Dans un mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale
dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
avec n variant de 1 à 100 000, et
- Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C40 pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C1 à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs hétéroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
avec n variant de 1 à 100 000, et
- Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C40 pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C1 à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs hétéroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
L'agent activateur est un composé chimique comportant une fonction capable de former une liaison covalente avec les fonctions amine ou acide carboxylique comportées par les enzymes et que l'on fait réagir avec ceux des composés bi- ou polyfonctionnels qui, à titre de groupe chimique réactif, comportent une fonction amine, alcool ou acide carboxylique.
Dans un autre mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, l'agent activateur, qui peut être mis en oeuvre selon les techniques de Howard H. Weetall publiées dans "Applied 3iochemistry and siotechnology" (1993) 41, 157-188, et auquel il convient d'avoir recours quand le groupe chimique réactif comporté par ledit composé bi- ou polyfonctionnel est différent des fonctions thiol ou aldéhyde, est choisi dans le groupe comportant les dérivés dont les formules sont indiquées ci-après après activation d'un groupe chimique réactif comporté par ledit composé biou polyfonctionnel et constitué par une fonction amine, alcool ou acide carboxylique, la nature de cette fonction étant mentionnée pour chacun desdits dérivés, à savoir:
(activation amine + trichloro-trlazine)
(activation amine + glutaraldéhyde)
(activation amine + DSS ou disuccinimidyl-subérate)
(activation amine + trichloro-trlazine)
(activation amine + glutaraldéhyde)
(activation amine + DSS ou disuccinimidyl-subérate)
(activatlon amine + SPDP ou succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate)
(activation amine + SMCC ou succinimidyl-4-(N-malélmidométhyl)cyclohexane-1 -carboxylate)
N=N + Ci
(activation amine + nitrite de sodlum)
(activation amine + 4-nitrophényl-chloroformiate)
N=N + Ci
(activation amine + nitrite de sodlum)
(activation amine + 4-nitrophényl-chloroformiate)
(activation amine + bisoxyrane)
O NH-CH2-CH3 -C-C-N-(CH2)3-N(CH3)2, HCI
(activation acide + EDC)
(activation acide + N -hydroxy-succinlmide)
(activatlon alcool + carbonyl-dllmidazole)
(activation alcool + benzoqulnone)
(activation alcool + bisoxyrane)
(actlvatlon alcool + dlvlnylsulfone)
(activatlon alcool flF 3 3-nltrophényl-ch loroformiate)
A titre d' exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on indique que l'activation par mise en oeuvre des techniques décrites par Howard H. Weetall dans "Applied Biochemistry and Biotechnology" (1993) 41, 157-188, d'un composé bifonctionnel de formule (I) dans lequel le groupe chimique réactif activé est une fonction amine, est obtenue par réaction de cette fonction amine, comportée en l'occurrence par le 2-aminoéthyl-dihydrogéno- phosphate de formule
avec le glutaraldéhyle de formule
le composé bifonctionnel activé ainsi obtenu ayant donc une fonction 5-iminopentanal et répondant à la formule
O NH-CH2-CH3 -C-C-N-(CH2)3-N(CH3)2, HCI
(activation acide + EDC)
(activation acide + N -hydroxy-succinlmide)
(activatlon alcool + carbonyl-dllmidazole)
(activation alcool + benzoqulnone)
(activation alcool + bisoxyrane)
(actlvatlon alcool + dlvlnylsulfone)
(activatlon alcool flF 3 3-nltrophényl-ch loroformiate)
A titre d' exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on indique que l'activation par mise en oeuvre des techniques décrites par Howard H. Weetall dans "Applied Biochemistry and Biotechnology" (1993) 41, 157-188, d'un composé bifonctionnel de formule (I) dans lequel le groupe chimique réactif activé est une fonction amine, est obtenue par réaction de cette fonction amine, comportée en l'occurrence par le 2-aminoéthyl-dihydrogéno- phosphate de formule
avec le glutaraldéhyle de formule
le composé bifonctionnel activé ainsi obtenu ayant donc une fonction 5-iminopentanal et répondant à la formule
Du point de vue pratique, on fait réagir 30 ml d'une solution aqueuse à 0,05 M du 2-aminoéthyl-dihydrogénophosphate avec 30 ml d'une solution aqueuse 0,05 M de glutaraldéhyde.
Après 30 minutes d'agitation du mélange à une température de 20 à 250C, la réaction est complète et la solution du composé bifonctionnel activé ainsi obtenu peut être conservée à une température de 5 à 100C pendant 300 jours avant son utilisation ultérieure.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, la fixation du composé bi- ou polyfonctionnel sur le support à base d'alumine est réalisée en faisant réagir une solution aqueuse du composé bi- ou polyfonctionnel éventuellement activé avec une suspension d'alumine dans un milieu aqueux.
A titre d'exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on indique que la fixation, sur un support constitué par une poudre d'alumine, d'une granulométrie de 40 à 150 ,um, du susdit composé bifonctionnel activé est réalisée en agitant pendant 30 minutes une suspension de 10 g de ladite poudre d'alumine dans la solution obtenue, comme indiqué plus haut, du composé bifonctionnel activé, le pH de la suspension étant maintenu à 7.
A l'issue de cette période d'agitation, la totalité du composé bifonctionnel activé est fixée sur le support d'alumine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, l'immobilisation de l'osidase et/ou de la lipase par réaction avec le groupe chimique réactif éventuellement activé, du composé bifonctionnel fixé sur le support à base d'alumine est effectuée en milieu aqueux à pH 7 et à une température comprise entre 15 et 4000.
A titre d'exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on indique que, lorsqu'il s'agit de faire réagir une osidase, par exemple la ss 1-3 glucanase avec le complexe constitué par l'alumine sur laquelle a été fixé le composé bifonctionnel activé dont la préparation vient d'être décrite --à savoir le 2-aminoéthyl-dihydrogéno-phosphate, activé par le glutaraldéhyde et fixé sur l'alumine, ledit composé bifonctionnel activé comportant par conséquent, à titre de groupe chimique réactif, une fonction 5-imino-pentanal-- on procède comme indiqué ci-après.
5 g du susdit complexe sont mis en suspension dans 10 ml d'une solution aqueuse contenant 50 mg de ss 1-3 glucanase. Le pH du milieu est ajusté au pH maximum d'activité de l'enzyme, à savoir 3,8 à 4,2 et doit être réajusté si nécessaire. La suspension est agitée pendant 24 heures; elle est ensuite filtrée et lavée à l'eau jusqu'à pH neutre du filtrat. L'enzyme immobilisée ainsi obtenue est conservée telle quelle (humide) au réfrigérateur à +40C jusqu'à utilisation. Son activité enzymatique est déterminée par hydrolyse de son substrat spécifique.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases immobilisées et de leurs procédés de préparation, on prépare tout d'abord la phosphoosidase et la phospholipase en faisant réagir l'enzyme en solution aqueuse sur le composé bifonctionnel de formule (I), également en solution aqueuse après activation de ce composé bifonctionnel en tant que de besoin.
Lorsque le composé bifonctionnel est le pyrophosphate de thiamine, le groupe chimique réactif qu'il comporte est une fonction amine qu'il convient par conséquent d'activer; pour ce faire, et comme précédemment, on peut avoir recours au glutaraldéhyde.
C'est le résultat de la réaction du pyrophosphate de thiamine avec le glutaraldéhyde qui constitue le composé bifonctionnel activé que l'on fait réagir avec l'enzyme, par exemple la ss 1-3 glucanase.
On peut procéder comme indiqué ci-après.
460,8 mg (10-3 moles) de pyrophosphate de thiamine sont mis en solution dans 500 ml d'eau et mélangés à 400 ml d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 25% (soit 100 mg à 100% ou 10-3 moles) et le mélange est agité pendant 3 heures à 20-250C. On ajoute ensuite 2 g d'enzyme de ss 1-3 glucanase en solution dans 1z 0 mi d'eau. Le pH est ajusté à 6,5 par addition de soude ,1 N. On ajoute ensuite 250 mg de cyanoborohydrure de sodium à titre d'agent réducteur des fonctions imines. Le pH est ajuste à 7 à l'aide d'HCl 0,1
N. Après 3 heures d'agitation, la solution réactionnelle est soumise à une dialyse pour éliminer les réactifs en excès.
N. Après 3 heures d'agitation, la solution réactionnelle est soumise à une dialyse pour éliminer les réactifs en excès.
On obtient ainsi la phosphogicanase "TPPc".
Selon un autre mode de réaLisation avantageux des susdites osidases et/ou lipases i-.obilisées et de leurs procédés de préparation, on réalise l'immobilisation de la phosphoglucanase obtenue ci-dessus sur le support à base d'alumine en faisant réagir, sous agitation, pendant 4 heures à 370C, une suspension aqueuse d'alumine d'une granulométrie de 40 à 150 um avec le dialysat de la phosphoenzyme obtenu cidessus.
La progression de l'absorption est suivie par détermination à intervalles réguliers de l'activité enzymatique résiduelle d'échantillons du filtrat du susdit mélange.
Après disparition totale de l'activité enzymatique (2 à 4 heures en général), le milieu réactionnel est filtré et lavé abondamment à l'eau.
La phosphoenzyme immobilisae ainsi obtenue est conservée telle quelle, c'est-à-dire humide, au réfrigérateur à +40C jusqu'à son utilisation. Son activité enzymatique est déterminée par hydrolyse de son substrat spécifique.
Les enzymes immobilisées conformes à l'invention sont utilisées pour le traitement des milieux à l'égard desquels elles développent les activités porr lesquelles elles sont utilisées classiquement.
Parmi ces traitements, on peut citer les transformations chimiques, les purificatiors ou la séparation de molécules organiques, organo-minérales ou minérales.
Les susdits traitements utilisent un milieu de mise en oeuvre aqueux ou hydroorganique ou contenant uniquement des solvants organiques; ce milieu peut être un gaz liquéfié utilisé à l'état critique, sub-critique, ou super-critique; la température du milieu peut varier de -200C à +2000C et la pression exercée sur le milieu peut varier de 0,1 à 300 bars en valeur absolue.
EXLE 1
Préparation de la ss 1-3 glucanase mobilisée sur alumine.
Préparation de la ss 1-3 glucanase mobilisée sur alumine.
La préparation de cette 3 1-3 glucanase peut être réalisée selon les deux variantes décrites ci-après.
Première variante
Dans un réacteur en verre de 4 litres muni d'une agitation mécanique, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on introduit 3 litres d'eau déminéralisée et 10,7 g du composé bifonctionnel constitué par le 2-aminoéthyl-dihydrogénophosphate.
Dans un réacteur en verre de 4 litres muni d'une agitation mécanique, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on introduit 3 litres d'eau déminéralisée et 10,7 g du composé bifonctionnel constitué par le 2-aminoéthyl-dihydrogénophosphate.
Le milieu réactionnel est agité à 20-250C jusqu'à l'obtention d'une solution totale.
On ajoute à ce milieu réactionnel, sous agitation lente (30 t/min), une quantité de 500 g d'alumine commercialisée sous la marque SPHERALITE 509 D par la Société PROCATALYSE.
On agite pendant 15 minutes la suspension ainsi formée et on ajuste son pH à 4,5 avec une quantité suffisante d'acétate de sodium.
Pendant 12 heures et à une température de 20-250C on maintient une agitation à 30 t/min; on vérifie le pH toutes les heures et on le réajuste à 4,5 si nécessaire.
La cinétique de fixation du 2-aminoéthyl-dihydrogénophosphate est suivie par un test de coloration à la ninhydrine.
A la fin des 12 heures d'agitation, l'insoluble est séparé par filtration sur fritté n02 puis lavé abondamment avec trois fois 0,5 1 d'eau déminéralisée.
L'insoluble humide est récupéré et chargé à nouveau dans un réacteur en verre de 4 litres contenant une solution 1 M de glutaraldéhyde préalablement préparée par dissolution, dans 1231 ml d'eau déminéralisée, de 270 ml de glutaraldéhyde 5,6 M commercialisé par la Société FLUKA sous la référence 49629.
On maintient une agitation à 30 t/min, à une température comprise entre 20 et 250C, pendant 2 heures; on filtre sur fritté n02 puis on lave avec trois fois 0,5 1 d'eau déminéralisée.
L'insoluble humide est récupéré et chargé dans un réacteur de 4 litres contenant une solution, dans 1,5 litres d'acétate de sodium 2,1 M de pH 4,55, de 3 g de ss 1-3 glucanase commercialisée sous la marque GLUCANEX par la Société NOVO
INDUSTRIES.
INDUSTRIES.
On maintient la température entre 20 et 250C et on agite pendant 2 heures à une vitesse de 30 t/min.
On filtre sur fritté n02, puis on lave avec trois fois 0,5 1 d'eau déminéralisée.
On récupère le précipité humide constitué par la 3 1-3 glucanase immobilisée sur alumine et on le conserve à une température de 4 à 60C jusqu'à son utilisation.
Deuxième variante
Dans un réacteur en verre de 20 litres, muni d'une agitation, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on charge 4,61 g de pyrophosphate de thiamine et 5 litres d'eau déminéralisée.
Dans un réacteur en verre de 20 litres, muni d'une agitation, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on charge 4,61 g de pyrophosphate de thiamine et 5 litres d'eau déminéralisée.
On agite jusqu'à dissolution.
On ajoute par l'ampoule de coulée et sans dépasser une température de 300C, un volume de 4 litres d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 25%.
On agite pendant 3 heures à une température comprise entre 20 et 300C la solution ainsi obtenue.
On obtient ainsi le composé bifonctionnel activé.
On ajoute ensuite dans la solution de composé bifonctionnel activé une solution préalablement préparée par dissolution, dans 10 litres d'eau déminéralisée, de 20 g de 1-3 glucanase commercialisée sous la marque GLUCANEX par la
Société NOVO INDUSTRIES.
Société NOVO INDUSTRIES.
On ajuste le pH à 4,5 avec la quantité suffisante de soude 0,1 N.
On agite pendant 3 heures à une température comprise entre 20 et 300C, on refroidit à 200C et on ajoute ensuite, en une seule fois, 2,5 g de cyanoborohydrure de sodium.
On agite pendant 3 heures à une température comprise entre 20 et 300C, puis on soumet le milieu réactionnel à une dialyse.
On récupère le dialysat et on le charge dans un réacteur en verre de 20 litres muni d'une agitation réglée à 30 t/min.
On ajoute à la masse réactionnelle ainsi constituée une quantité de 1 kg d'alumine commercialisée sous la marque
SPHERALITE 509 D par la Société PROCATALYSE.
SPHERALITE 509 D par la Société PROCATALYSE.
On agite pendant 24 heures à une température comprise entre 20 et 250C.
On filtre sur fritté n02 ou au buchner et on lave le précipité à l'aide de trois fois 3 litres d'eau déminéralisée.
On conserve le précipité humide, constitué par l'enzyme immobilisée recherchée, à la température de 40C (au réfrigérateur) jusqu'à son utilisation.
*
La mise en oeuvre de la 3 1-3 glucanase immobilisée obtenue à l'exemple 1, par exemple pour "digérer" un substrat constitué par du R 1-3 glucane, peut être réalisée en lit fixe ou en lit fluidisé.
La mise en oeuvre de la 3 1-3 glucanase immobilisée obtenue à l'exemple 1, par exemple pour "digérer" un substrat constitué par du R 1-3 glucane, peut être réalisée en lit fixe ou en lit fluidisé.
Ci-après, on décrit les deux modes de réalisation en question.
Lorsqu'on a recours au lit fixe, on fait circuler la solution de substrat à travers un lit fixe de ss 1-3 glucanase immobilisée sur alumine telle qu'obtenue à l'exemple 1.
Cette enzyme immobilisée est tassée, par exemple par compression pneumatique dans une colonne basse pression; on peut utiliser celle de type Vantage ; de marque AMICON.
La solution de substrat circule en circuit fermé.
Pour une efficacité optimale on détermine un compromis entre le réglage du débit, le temps de séjour de la solution au contact de l'enzyme immobilisée (qui doit être suffisamment important pour permettre la réalisation de l'hydrolyse enzymatique) et le temps de passage d'un volume entier de solution à travers le circuit (temps qui doit être relativement court, afin de réaliser un .maximum de passages en un temps donné).
La durée totale de séjour au contact de l'enzyme immobilisée ne dépend que du volume de cette dernière et de la durée totale de l'opération.
Un essai est réalisé sur 10 litres d'une solution de ss 1-3 glucane à 10 g/l, préalablement clarifiée par filtration à 1,6 um
Le dispositif utilisé, montré à la figure 1, comprend les éléments suivants:
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de par exemple 50 litres, munie d'un système d'agItatIon 2 et contenant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3, par exemple du type
Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme 1-3 glucanase fixée sur alumine, tassée entre deux plateaux 7 et 8 dans une colonne 6 basse pression,
- une canalisation 9 par :acr;elle la solution de substrat est acheminée vers la colonne 6 à l'intérieur de laquelle elle est amenée par un tube 1C traversant le plateau 7 jusqu'à la surface de la masse 5,
- une canalisation 11 par laquelle la solution de substrat ayant traversé le lit d'enzyme immobilisée est extraite de la colonne 6 à travers le plateau 8 grâce à un trou 12 et recyclée vers la cuve 1.
Le dispositif utilisé, montré à la figure 1, comprend les éléments suivants:
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de par exemple 50 litres, munie d'un système d'agItatIon 2 et contenant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3, par exemple du type
Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme 1-3 glucanase fixée sur alumine, tassée entre deux plateaux 7 et 8 dans une colonne 6 basse pression,
- une canalisation 9 par :acr;elle la solution de substrat est acheminée vers la colonne 6 à l'intérieur de laquelle elle est amenée par un tube 1C traversant le plateau 7 jusqu'à la surface de la masse 5,
- une canalisation 11 par laquelle la solution de substrat ayant traversé le lit d'enzyme immobilisée est extraite de la colonne 6 à travers le plateau 8 grâce à un trou 12 et recyclée vers la cuve 1.
Le manomètre situé en amont de la colonne permet de mesurer la perte de charge provoquée par le lit d'enzyme immobilisée, sachant que la pression en sortie de colonne est négligeable étant donné les faibles débits de l'ordre de 10 l/h fournis par la pompe péristaltique. On constate qu'à débit nul, le manomètre indique une faible pression (inférieure à 0,5 bar) probablement due à un accroissement local de celle-ci entre la pompe et l'entrée de la colonne du fait de la conception du circuit.
La masse d'enzyme immobilisée dans le mode de réalisation montré est de 3 grammes de ss 1-3 glucanase immobilisée sur 500 g d'alumine; elle est tassée sur une hauteur de 14,5 cm, ce qui, compte tenu des dimensions de la colonne (hauteur égale à 47,5 cm et diamètre égal à 6,2 cm), correspond à un volume d'enzyme immobilisée de 0,9 litre.
La solution de substrat est thermostatée à 400C au sein de la cuve 1. Les pertes de chaleur étant relativement faibles, l'ensemble du circuit atteint rapidement cette température, ensuite entretenue par la circulation du liquide.
Une quantité de 10 litres de substrat à 1% de ss 1-3 glucane, préalablement clarifié par filtration à 1,6 ,um, est introduite dans la cuve thermostatée. Le thermostat est réglé à 560C afin d'obtenir 400C dans la cuve, température optimale de l'hydrolyse enzymatique. Une fois la température stabilisée, la pompe péristaltique est mise en route. La température varie peu ensuite, car les pertes de chaleur dans la colonne et le circuit sont minimes.
La puissance de la pompe péristaltique est réglée de façon à obtenir une pression de 1,5 bar à l'entrée de la colonne. Au-delà d'une telle pression, l'enzyme immobilisée subit des contraintes qui, à plus ou moins long terme, pourraient affecter son efficacité et sa stabilité. Le débit associé à une telle pression est de 13,2 l/h.
Dans ces conditions, le temps de passage "t-passage" est de 45 minutes. A chaque passage dans la colonne, le temps de séjour "t-séjour" au contact de l'enzyme est de 4 minutes.
La circulation de la solution de substrat est effectuée durant 5 heures 30 minutes.
Les cinétiques réactionnelles obéissent à des phénomènes de transports interfaciaux. Ceux-ci sont un facteur limitant dans la réaction d'hydrolyse enzymatique.
Le procédé "lit fixe" qui en lui-même est satisfaisant, présente un inconvénient qui est dû à l'hétérogénéité existant entre le lit de particules et la solution qui le traverse, ce qui a pour effet de placer la réaction d'hydrolyse sous contrôle diffusionnel.
De plus, progressivement, il se crée dans ce lit des canaux préférentiels de circulation du liquide.
Dès lors, certaines régions du lit ne sont plus irriguées et les molécules qui traversent les canaux préférentiels ne sont plus mises au contact du lit et donc de l'enzyme.
Cet inconvénient n'est toutefois pas de nature à rendre inutilisable le procédé en lit fixe.
On peut néanmoins remédier à cet inconvénient en ayant recours à un système à lit fluidisé.
La fluidisation du lit de particules d'enzyme immobilisée, par un flux ascendant de liquide, aura pour effet de fournir un milieu quasiment homogène et d'optimiser les échanges interfaciaux, par un accroissement des surfaces de contact enzyme immobilisée-solution.
La fluidisation du lit de particules peut être réalisée par un courant ascendant de fluide, en l'occurrence la solution de substrat.
Elle se produit lorsque la vitesse du fluide est suffisante pour mettre en suspension les particules de la masse d'enzyme immobilisée.
Chacune de ces particules est alors entourée de fluide qui la préserve de tout frottement avec les autres particules, ainsi qu'avec les parois de la colonne.
La couche fluidisée, mélange hétérogène de particules solides et de fluide, se comporte macroscopiquement comme un liquide "homogène".
On peut avoir recours au dispositif montré à la figure 2 et qui comprend les éléments suivants:
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de 50 litres, munie d'un système d'agitation 2 et conter.ant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3, par exemple du type
Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme immobilisée adsorbée sur alumine, remplissant une colonne basse pression 13, par exemple de type VA 90500,
- une canalisation 14 par laquelle la solution de substrat est acheminée à l'extrémité inférieure de la colonne 13 dans laquelle elle pénètre en 15 pour mettre en lit fluidisé la masse d'enzyme immobilisée 5,
- une canalisation 15 par laquelle la solution de substrat est extraite en 17 à l'extrémité supérieure de la colonne après avoir traversé le lit fluidisé comprenant la masse d'enzyme immobilisée 5, à la partie supérieure de la colonne 13 pour être recyclée vers la cuve 1.
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de 50 litres, munie d'un système d'agitation 2 et conter.ant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3, par exemple du type
Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme immobilisée adsorbée sur alumine, remplissant une colonne basse pression 13, par exemple de type VA 90500,
- une canalisation 14 par laquelle la solution de substrat est acheminée à l'extrémité inférieure de la colonne 13 dans laquelle elle pénètre en 15 pour mettre en lit fluidisé la masse d'enzyme immobilisée 5,
- une canalisation 15 par laquelle la solution de substrat est extraite en 17 à l'extrémité supérieure de la colonne après avoir traversé le lit fluidisé comprenant la masse d'enzyme immobilisée 5, à la partie supérieure de la colonne 13 pour être recyclée vers la cuve 1.
Le manomètre situé à l'entrée de la colonne, à la partie inférieure de celle-ci, permet de mesurer la perte de charge subite par le liquide à travers la colonne, sachant que la pression en sortie de celle-ci est négligeable étant donné les faibles débits fournis par la pompe péristaltique.
Le liquide est thermostaté au sein de la cuve 1. Là encore, les pertes restent faibles et l'ensemble du circuit atteint rapidement la température fixée.
EXEMPLE 2
D préalablement clarifiés par filtration à 2,7 vm, sont introduits dans la cuve thermosta ée 1 dont la capacité est de 50 litres, sa hauteur étant de 4 cm et son diamètre de 39,5 cm.
D préalablement clarifiés par filtration à 2,7 vm, sont introduits dans la cuve thermosta ée 1 dont la capacité est de 50 litres, sa hauteur étant de 4 cm et son diamètre de 39,5 cm.
Le thermostat est réglé à 560C afin d'obtenir 400C dans la cuve, température optimale de ~'h-,-drolyse enzymatique.
La colonne 13 contient 3 grammes d'enzyme immobilisée sur 500 g d'alumine préparée conformément à l'exemple 1.
Une fois la température stabilisée, la pompe péristaltique est mise en route; la température varie peu ensuite car les pertes de chaleur ars la colonne et le circuit sont minimes.
La migration, sous l'influence du substrat, de l'enzyme immobilisée, vers le haut de la colonne 13 doit être réalisée de façon progressive afin d'éviter es turbulences. Celles-ci auraient pour effet de disperser les particules dans la colonne et favoriseraient leur migration ors de celle-ci.
La pompe péristaltique est réglée à pleine puissance, ce qui permet de fluidiser l'enzyme immobilisée sur une hauteur de 40 cm. Il occupe alors un volve "V gel" de 2,5 1.
Le débit associé à un tel volume est de 28 l/h.
Comparativement au procédé "lit fixe", la fluidisation permet de multiplieur par 2,5 le temps de contact entre l'enzyme immobilisée et la solution de ss 1-3 glucane.
En outre, elle optimise a cinétique de catalyse hétérogène par la formation d'une gaine de solution autour de chaque particule.
Pour obtenir la digestion du ss 1-3 glucane, chaque cycle dure en moyenne de 4 à 6 heures. L'activité de l'enzyme immobilisée persiste dans ces conditions expérimentales pendant au moins 8 cycles.
On obtient ainsi 85 g d'oligo-0-1,3-glucanes de DP 2 à
DP 6.
DP 6.
Claims (6)
1. Enzyme immobilisée caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une osidase, notamment la 3 1-3 glucanase, et/ou par une lipase immobilisées par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé par de l'alumine liée à un composé bi- ou polyfonctionnel comportant un groupe fonctionnel phosphate par lequel il est lié à l'alumine et un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif étant capable de former la susdite liaison covalente avec l'osidase et/ou avec la lipase.
2. Procédé de préparation d'osidase et/ou de lipase immobilisées, caractérisé par le fait - que l'on sélectionne un composé bi- ou polyfonctionnel
comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphate et,
d'autre part, un groupe chimique réactif capable, après
activation en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un
agent activateur, de former une liaison covalente avec une
enzyme et - que
soit, dans une première étape, on fixe ce composé bi- ou
polyfonctionnel sur de l'alumine par son groupe
réactionnel phosphate formant un complexe entre le
composé et l'alumine puis, dans une deuxième étape, on
fait réagir le complexe ainsi formé avec 1'osidase et/ou
la lipase de façon à créer une liaison covalente entre
l'osidase et/ou la lipase et le groupe chimique réactif
du composé bi- ou polyfonctionnel après avoir activé ce
dernier en tant que de besoin,
e soit, dans une première étape, on constitue une phospho
osidase et/ou une phospholipase en faisant réagir le
composé bi- ou polyfonctionnel avec l'osidase et/ou la
lipase de façon à former une liaison covalente entre
l'osidase et/ou la lipase et le groupe chimique réactif,
comporté par le composé bi- ou polyfonctionnel, après
activation en tant que de besoin puis, dans une deuxième
étape, on fixe la phospho-osidase et/ou la phospholipase
ainsi formées sur un support à base d'alumine par
réaction de celle-ci avec le groupe réactionnel phosphate
du composé bi- ou polyfonctionnel.
3. Enzyme immobilisée selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale
dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
avec n variant de 1à 100 000, et
- Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C40 pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylaîkyle dans lequel la partie alkyle est en C1 à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs hétéroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
4. Enzyme immobilisée selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisée par le fait que l'agent activateur est un composé chimique comportant une fonction capable de former une liaison covalente avec les fonctions amine ou acide carboxylique comportées par les enzymes, cet agent activateur étant mis à réagir avec ceux des composés bi- ou polyfonctionnels qui, à titre de groupe chimique réactif, comportent une fonction amine, alcool ou acide carboxylique.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale
dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
- Y qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C40 pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C1 à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs hétéroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
avec n variant de 1 à 100 000, et
6. Application de l'enzyme immobilisée selon l'une des revendications 1, 3 et 4 ou obtenue selon l'une des revendications 2 et 5, au traitement des milieux à l'égard desquels ladite enzyme développe les activités pour lesquelles elle est utilisée classiquement, notamment les transformations chimiques, les purifications ou la séparation de molécules organiques, organo-minérales ou minérales.
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| FR9716798A FR2773170B1 (fr) | 1997-12-31 | 1997-12-31 | Enzymes immobilisees sur un support a base d'alumine, leurs procedes de preparation et leurs applications |
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1998
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- 1998-12-29 AU AU19720/99A patent/AU1972099A/en not_active Abandoned
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| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 012, no. 128 (C - 489) 20 April 1988 (1988-04-20) * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 098, no. 004 31 March 1998 (1998-03-31) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1972099A (en) | 1999-07-26 |
| WO1999035250A1 (fr) | 1999-07-15 |
| FR2773170B1 (fr) | 2000-10-13 |
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