FR2773172A1 - Enzymes immobilisees sur un support mineral, leurs procedes de preparation et leurs applications - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
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Abstract
La présente invention a pour objet une enzyme immobilisée caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une enzyme quelconque, notamment choisie dans le groupe comprenant les osidases et en particulier la 1-3 glucanase, les protéases et les lipases et immobilisée par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé entre un oxyde minéral de préférence choisi dans le groupe comprenant notamment l'alumine, la zircone, la silice et le dioxyde de titane, et un composé bi- oupolyfonctionnel comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphonate par lequel il est lié à l'oxyde minéral et, d'autre part, un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif formant la liaison covalente avec l'enzyme.
Description
ENZYMES naMOBILISÉES SUR UN SUPPORT MINIB , LUEURS
PROCÉDÉS DE PRÉPARATION HT LEURS APPLICATIONS
L'invention a pour objet des enzymes immobilisées sur un support minéral.
PROCÉDÉS DE PRÉPARATION HT LEURS APPLICATIONS
L'invention a pour objet des enzymes immobilisées sur un support minéral.
L'intérêt des enzymes immobilisées réside essentiellement dans la possibilité de les récupérer sans difficulté à partir du milieu dans lequel elles ont été mises en oeuvre et dans lequel l'enzyme proprement dite développe ses activités pour lesquelles elle est classiquement utilisée, de les purifier en tant que de besoin et de les remettre à agir dans un autre milieu.
L'invention vise également les procédés de préparation de ces enzymes immobilisées ainsi que leurs applications .
On connaît déjà des enzymes immobilisées sur un support d'alumine.
Ainsi, le document EP-A-86 402014.4 décrit l'immobilisation des protéases sur des alumine-phosphates organiques.
Selon ce document, la protéase est rattachée par une liaison covalente à un complexe solide formé par de l'alumine liée à un composé bi- ou polyfonctionnel comportant un groupe fonctionnel phosphate et un groupe capable de former une liaison covalente avec une protéase.
La préparation, selon le susdit document, de la protéase ainsi immobilisée, consiste à fixer sur de l'alumine, en tant que composé bifonctionnel, un phosphate organique comportant un groupe réactionnel capable de former une liaison covalente avec une protéase, puis à faire réagir le complexe ainsi formé avec la protéase après avoir éventuellement activé le groupe réactif comporté par le groupe, en ayant recours à des activateurs appropriés, de façon à former la liaison covalente recherchée liant la protéase au complexe.
I1 est également connu --voir à cet égard le document l'Bioscience Reports" vol. 8, No.3, 1988, page 266-de former dans un premier temps une phosphoprotéase en faisant réagir le composé bifonctionnel dont il a été question ci-dessus avec la protéase en question de façon à former une liaison covalente entre la protéase et le groupe chimiquement réactif comporté par ledit composé, éventuellement après activation de celui-ci, puis à fixer la phosphoprotéase ainsi constituée sur de l'alumine par réaction de celle-ci avec le groupe réactionnel phosphate comporté par le composé bifonctionnel.
La constitution chimique de l'enzyme immobilisée obtenue par le premier des deux susdits procédés, n'est pas la même que celle de l'enzyme immobilisée obtenue par le susdit deuxième procédé.
Il s'ensuit que les activités des deux types de protéases immobilisées ainsi obtenues ne sont pas identiques.
Il est enfin connu, par le susdit document, d'utiliser les enzymes ainsi immobilisées dans leurs applications classiques.
L'invention a pour objet, surtout, de répondre au souhait des utilisateurs de disposer d'un éventail aussi large que possible d'enzymes immobilisées sur un support.
Et les inventeurs ont eu le mérite de trouver que, de façon surprenante et inattendue, il est possible d'immobiliser les enzymes sur un support à base d'oxydes minéraux en utilisant un composé bi- ou polyfonctionnel constitué par un phosphonate organique comportant un groupe chimique réactif capable de former une liaison covalente avec une enzyme.
Il s'ensuit que 1'enzyme immobilisée conforme à l'invention est caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une enzyme quelconque, notamment choisie dans le groupe comprenant les osidases et en particulier la ss 1-3 glucanase, les protéases et les lipases et immobilisée par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé entre un oxyde minéral de préférence choisi dans le groupe comprenant notamment l'alumine, la zircone, la silice et le dioxyde de titane, et un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphonate par lequel il est lié à l'oxyde minéral et, d'autre part, un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif formant la liaison covalente avec l'enzyme.
Le procédé de préparation de l'enzyme immobilisée conforme à l'invention est caractérisé par le fait - que l'on sélectionne
une enzyme quelconque, de préférence dans le groupe
comprenant les osidases et notamment la ss 1-3
glucanase, les protéases et les lipases,
un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une
part, un groupe fonctionnel phosphonate et, d'autre
part, un groupe chimique réactif capable, après
activation en tant que de besoin par mise en oeuvre
d'un agent activateur, de former une liaison covalente
avec la susdite enzyme et
un oxyde minéral en tant que support, de préférence
choisi dans le groupe comprenant l'alumine, la
zircone, la silice et le dioxyde de titane, et - que
soit, dans une première étape, on fixe le composé bi
ou polyfonctionnel sur le support par son groupe
réactionnel phosphonate en formant un complexe entre
le composé et le support puis, dans une deuxième
étape, on fait réagir le complexe ainsi formé avec
l'enzyme de façon à créer une liaison covalente entre
l'enzyme et le groupe chimique réactif comporté par le
composé bi- ou polyfonctionnel après avoir activé ce
dernier en tant que de besoin,
soit, dans une première étape, on constitue une
phosphono-enzyme en faisant réagir le composé bi- ou
polyfonctionnel avec l'enzyme de façon à former une
liaison covalente entre l'enzyme et le groupe chimique
réactif, éventuellement après son activation, comporté
par le composé bi- ou polyfonctionnel puis, dans une
deuxième étape, on fixe la phosphono-enzyme ainsi
formée sur le support par réaction de celui-ci avec le
groupe réactionnel phosphonate du composé bi- ou
polyfonctionnel.
une enzyme quelconque, de préférence dans le groupe
comprenant les osidases et notamment la ss 1-3
glucanase, les protéases et les lipases,
un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une
part, un groupe fonctionnel phosphonate et, d'autre
part, un groupe chimique réactif capable, après
activation en tant que de besoin par mise en oeuvre
d'un agent activateur, de former une liaison covalente
avec la susdite enzyme et
un oxyde minéral en tant que support, de préférence
choisi dans le groupe comprenant l'alumine, la
zircone, la silice et le dioxyde de titane, et - que
soit, dans une première étape, on fixe le composé bi
ou polyfonctionnel sur le support par son groupe
réactionnel phosphonate en formant un complexe entre
le composé et le support puis, dans une deuxième
étape, on fait réagir le complexe ainsi formé avec
l'enzyme de façon à créer une liaison covalente entre
l'enzyme et le groupe chimique réactif comporté par le
composé bi- ou polyfonctionnel après avoir activé ce
dernier en tant que de besoin,
soit, dans une première étape, on constitue une
phosphono-enzyme en faisant réagir le composé bi- ou
polyfonctionnel avec l'enzyme de façon à former une
liaison covalente entre l'enzyme et le groupe chimique
réactif, éventuellement après son activation, comporté
par le composé bi- ou polyfonctionnel puis, dans une
deuxième étape, on fixe la phosphono-enzyme ainsi
formée sur le support par réaction de celui-ci avec le
groupe réactionnel phosphonate du composé bi- ou
polyfonctionnel.
L'oxyde minéral peut être utilisé sous forme de poudres ou de membranes obtenues selon des procédés classiques décrits notamment dans "Chromatographies en phases liquide et super-critique' par Robert Rosset, Marcel
Caude et Alain Jardy, 1991, Edition Masson.
Caude et Alain Jardy, 1991, Edition Masson.
Dans un mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées et de leurs procédés de préparation, le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale
dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
avec n variant de 1 à 100 000, et
- Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié ou ramifié en
C1 à C40 pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C1 à C40 et peut comporter comme la partie aryle un ou plusieurs hétéroatomes, étant entendu que lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
L'agent activateur est un composé chimique qui comporte une fonction capable de former une liaison covalente avec les fonctions amine ou acide carboxylique comportées par les enzymes et que l'on fait réagir avec ceux des composés bi- ou polyfonctionnels qui, à titre de groupe chimique réactif, comportent une fonction amine, alcool ou acide carboxylique.
Dans un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées et de leurs procédés de préparation, l'agent activateur, qui peut être mis en oeuvre selon les techniques de Howard H. Weetall publiées dans "Applied Biochemistry and Biotechnology (1993) 41, 157-188, et auquel il convient d'avoir recours quand le groupe chimique réactif comporté par ledit composé bi- ou polyfonctionnel est différent des fonctions thiol ou aldéhyde, est choisi dans le groupe comportant les dérivés dont les formules sont indiquées ci-après après activation d'un groupe chimique réactif comporté par ledit composé biou polyfonctionnel et constitué par une fonction amine acide carbosylique ou alcool, la nature de cette fonction étant mentionnée pour chacun desdits dérivés, à savoir:
(activation amine + trichloro-trlazine)
(activation amine + glutaraldéhyde)
(activation amine + DSS ou disuccinimidyl-suberate)
(activation amine + trichloro-trlazine)
(activation amine + glutaraldéhyde)
(activation amine + DSS ou disuccinimidyl-suberate)
(activation amine + SPDP ou succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate)
(activation amine + SMCC ou su ccin Im Idyl-4-(N -m alélm Id o m eth yl)cyclo h exan e- 1 -carb oxylate)
-N=N + Cl (activation amine + nitrite de sodlum)
(activation amine + 4-nitrophényl-chloroformiate)
-N=N + Cl (activation amine + nitrite de sodlum)
(activation amine + 4-nitrophényl-chloroformiate)
(activation amine + bisoxyrane)
O NH-CH2-CH3 -C-C=N-(CH2)3-N(CH3)2, HCI
(activation acide + EDC)
(activation acide + N-hydroxy-succinimide)
(activation alcool + carbonyl-diimidazole)
(activation alcool + benzoqulnone)
(activation alcool + bisoxyrane)
o
0-CH2-CH2 SH-CH2 (activation alcool + divinylsuifone)
(activation alcool zF + 3-nltrophényi-ch lorofonri late)
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées et de leurs procédés de préparation, l'activation d'un composé bifonctionnel de formule (I) constitué par l'acide phosphonopropionique est réalisée comme suit:
On dissout 10 mg d'acide phosphopropionique dans 100 ml d'eau déminéralisée; on ajoute 5 mg d'éthyl-3- < 3 diméthylaminopropyl)-carbodiimide et le milieu est agité pendant 5 heures à une température de 20-250C, puis conservé au frais vers +50C.
O NH-CH2-CH3 -C-C=N-(CH2)3-N(CH3)2, HCI
(activation acide + EDC)
(activation acide + N-hydroxy-succinimide)
(activation alcool + carbonyl-diimidazole)
(activation alcool + benzoqulnone)
(activation alcool + bisoxyrane)
o
0-CH2-CH2 SH-CH2 (activation alcool + divinylsuifone)
(activation alcool zF + 3-nltrophényi-ch lorofonri late)
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées et de leurs procédés de préparation, l'activation d'un composé bifonctionnel de formule (I) constitué par l'acide phosphonopropionique est réalisée comme suit:
On dissout 10 mg d'acide phosphopropionique dans 100 ml d'eau déminéralisée; on ajoute 5 mg d'éthyl-3- < 3 diméthylaminopropyl)-carbodiimide et le milieu est agité pendant 5 heures à une température de 20-250C, puis conservé au frais vers +50C.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées et de leurs procédés de préparation, la fixation du composé bi- ou polyfonctionnel sur un support à base de dioxyde de titane est réalisée en faisant réagir une solution aqueuse du composé bi- ou polyfonctionnel avec une suspension du dioxyde de titane dans un milieu aqueux.
A titre d'exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on décrit ci-après la fixation sur de la poudre de dioxyde de titane d'une granulométrie de 40 à 200 um d'un composé bifonctionnel de formule (I).
On peut procéder comme suit.
A une solution de 60 mg d'acide 2-aminoéthyl phosphonique dans 100 ml d'eau à 200C, on ajoute 3 g de dioxyde de titane.
Le mélange est maintenu sous légère agitation pendant 24 heures à pH 7.
Au bout de cette durée, la fixation de l'acide 2-aminoéthylphosphonique est totale, ce qui est vérifié par le test à la ninhydrine sur une partie aliquote de filtrat obtenu par filtration de la suspension, le rétentat étant lavé avec trois fois 100 ml d'eau.
Le rétentat lavé est mis en suspens ion dans 50 ml d'eau.
On ajoute ensuite 5 ml d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde 1 M.
L'agitation est maintenue pendant 4 heures à une température de 20-250C. Le rétentat est encore lavé par trois fois 50 ml d'eau et conservé humide vers +50C jusqu'à utilisation (Ti-APA-Glut).
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées et de leurs procédés de préparation, l'immobilisation de l'enzyme par réaction avec le groupement organique activé du composé bifonctionnel fixé sur le support à base d'oxyde minéral est effectuée en milieu aqueux et à une température de 20-250C.
A titre d'exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on indique que, lorsqu'il s'agit de faire réagir une protéase, par exemple la a-chymotrypsine avec le complexe constitué par le dioxyde de titane sur lequel a été fixé le composé bifonctionnel de formule (I) décrit ci-dessus, on procède comme indiqué ci-après.
3,06 grammes du complexe activé Ti-APA-Glut sont mis en suspension dans 10 ml d'eau, puis mélangés à une solution aqueuse de 60 mg d'a-chymotrypsine. Le pH du milieu est ajusté au pH d'activité maximum de l'enzyme, à savoir 7, et doit être réajusté en cours d'expérience si nécessaire; cet ajustement peut être réalisé à l'aide de HC1 0,1 N.
Par filtration de la suspension sur fritté n04, on récupère 3,66 g du complexe a-chymotrypsine "Ti-APA-Glut".
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées et de leurs procédés de préparation, on prépare tout d'abord la phosphono-enzyme en faisant réagir l'enzyme en solution aqueuse sur le composé bifonctionnel de formule (I), également en solution aqueuse.
Lorsque le composé bifonctionnel est le résultat de la réaction de l'acide 2-aminoéthylphosphonique et du glutaraldéhyde et que l'enzyme est la ss 1-3 glucanase, on peut procéder comme indiqué ci-après.
125 mg (10-3 moles) d'acide 2-aminoéthylphosphonique sont mis en solution dans 500 ml d'eau. 400 ml d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 25% sont additionnés (10-3 moles).
On agite pendant 4 minutes à une température de 20-250C. On ajoute le composé bifonctionnel ainsi activé à une solution de 2 g de ss 1,3-glucanase (commercialisée sous la marque GLUCANEX par la Société NOVO INDUSTRIES) dans 100 ml d'eau. On ajuste le pH à 4,5 à l'aide de soude 0,1 N, puis on agite pendant 24 heures à la température de 20-250C.
La solution ainsi obtenue est soumise à une dialyse pour éliminer les réactifs en excès.
On obtient ainsi la phosphono-ss 1,3-glucanase "APA Glut".
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées et de leurs procédés de préparation, on réalise l'immobilisation de la phosphono-ss 1,3glucanase "APA-Glut" obtenue ci-dessus sur un support à base de dioxyde de titane en faisant réagir sous agitation, pendant 24 heures à 250C, une suspension de dioxyde de titane d'une granulométrie de 40 à 200 um avec le dialysat de la phosphonoenzyme.
La progression de l'absorption est suivie par détermination à intervalles réguliers de l'activité enzymatique résiduelle d'échantillons du filtrat du susdit mélange.
Après disparition totale de l'activité enzymatique (2 à 4 heures en général), le milieu réactionnel est filtré et lavé abondamment à l'eau.
La phosphono-enzyme immobilisée ainsi obtenue est conservée telle quelle, c'est-à-dire humide au réfrigérateur à +40C jusqu'à utilisation. Son activité enzymatique est déterminée par hydrolyse de son substrat spécifique.
Les enzymes immobilisées conformes à l'invention sont utilisées pour le traitement des milieux à l'égard desquels elles développent les activités pour lesquelles elles sont utilisées classiquement.
Parmi ces traitements, on peut citer les transformations chimiques, les purifications ou la séparation de molécules organiques, organo-minérales ou minérales.
Les susdits traitements utilisent un milieu de mise en oeuvre aqueux ou hydroorganique ou contenant uniquement des solvants organiques; ce milieu peut être un gaz liquéfié utilisé à l'état critique, sub-critique, ou super-critique; la température du milieu peut varier de -200C à +2000C et la pression exercée sur le milieu peut varier de 0,1 à 300 bars en valeur absolue.
=3MPLE 1 Préparation de la ss 1-3 glucanase imnobilisee sur dioxyde de titane.
On a mis en oeuvre successivement les deux variantes du procédé conforme à l'invention.
Première variante
Dans un réacteur en verre de 4 litres muni d'une agitation mécanique, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on charge:
- 3 litres d'eau déminéralisée et
- 20 g d'acide 2-aminoéthyl-phosphonique.
Dans un réacteur en verre de 4 litres muni d'une agitation mécanique, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on charge:
- 3 litres d'eau déminéralisée et
- 20 g d'acide 2-aminoéthyl-phosphonique.
Le milieu réactionnel est agité à une température de 20-250C jusqu'à obtention d'une solution totale.
On ajoute alors sous agitation lente (30 t/min) 500 g de dioxyde de titane d'une granulométrie de 40 à 200 um.
On agite pendant 12 heures à une température de 20-250C à 30 t/min en vérifiant le pH toutes les heures et en réajustant, si nécessaire, à la valeur requise qui est de 4,5.
La cinétique de fixation de 1'acide 2-aminoéthylphosphonique est suivie au moyen du test de coloration à la ninhydrine.
Après 12 heures d'agitation, l'insoluble est filtré sur fritté n02 puis lavé abondamment avec trois fois 0,5 litres d'eau déminéralisée.
L'insoluble humide est récupéré et chargé à nouveau dans un réacteur en verre de 4 litres contenant une solution 1 M de glutaraldéhyde préalablement préparée par mélange de 270 ml de glutaraldéhyde 5,6 M (commercialisé par la Société FLUKA sous la référence 49629) avec 1231 ml d'eau déminéralisée.
On agite à 30 t/min et à une température de 20-250C pendant 24 heures.
On filtre sur fritté n02 puis on lave avec trois fois 0,5 litre d'eau déminéralisée.
L'insoluble humide est récupéré et chargé dans un réacteur de 4 litres contenant une solution préparée en dissolvant 3 g de ss 1-3 glucanase commercialisée sous la marque
GLUCANEX par la Société NOVO INDUSTRIES dans 1,5 litres d'acétate de sodium 2,1 M de pH 4,55.
GLUCANEX par la Société NOVO INDUSTRIES dans 1,5 litres d'acétate de sodium 2,1 M de pH 4,55.
On agite à une température de 20-250C pendant 24 heures à une vitesse de 30 t/min.
On filtre sur fritté n02 et on lave le résidu de filtration trois fois avec 0,5 litre d'eau déminéralisée.
On récupère le rétentat humide constitué par 1' enzyme immobilisée recherchée et on le conserve à une température de +4 à +60C jusqu'à utilisation.
Deuxième variante
Dans un réacteur en verre de 20 litres, muni d'une agitation, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on charge 21,85 g d'acide 2-aminoéthyl-phosphonique et 5 litres d'eau déminéralisée.
Dans un réacteur en verre de 20 litres, muni d'une agitation, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on charge 21,85 g d'acide 2-aminoéthyl-phosphonique et 5 litres d'eau déminéralisée.
On agite jusqu'à dissolution.
On ajoute par l'ampoule de coulée, en veillant à ce que la température ne dépasse pas 300C, 4 litres de glutaraldéhyde en solution aqueuse à 25%.
On agite la solution ainsi obtenue pendant 3 heures à une température de 20 à 300C.
On ajoute ensuite une solution préalablement préparée et contenant 20 g de ss 1-3 glucanase commercialisée sous la marque GLUCANEX par la Société NOVO INDUSTRIES dans 10 litres d'eau déminéralisée.
On ajuste le pH à 4,5 avec la quantité nécessaire de soude 0,1 N.
On agite pendant 3 heures à une température de 20 à 300C, puis on refroidit à 200C.
On ajoute ensuite en une seule fois 22,5 g de cyanoborohydrure de sodium.
On agite pendant 3 heures à une température de 20 à 300C, puis on soumet le milieu réactionnel à une dialyse.
On récupère le dialysat et on le charge dans un réacteur en verre de 20 litres muni d'une agitation réglée à 30 t/min.
On ajoute dans la masse réactionnelle 1 kg de dioxyde de titane d'une granulométrie de 40 à 200 um.
On agite pendant 24 heures à une température de 20 à 250C et on filtre sur fritté nO 2 ou sur buchner.
On lave le rétentat avec trois fois 3 litres d'eau déminéralisée.
On conserve le rétentat humide constituant l'enzyme immobilisée recherchée, à une température d'environ +40C jusqu'à son utilisation.
*
* *
La mise en oeuvre de la ss 1-3 glucanase immobilisée obtenue à l'exemple 1, par exemple pour "digérer" un substrat constitué par du ss 1-3 glucane, peut être réalisée en lit fixe ou en lit fluidisé.
* *
La mise en oeuvre de la ss 1-3 glucanase immobilisée obtenue à l'exemple 1, par exemple pour "digérer" un substrat constitué par du ss 1-3 glucane, peut être réalisée en lit fixe ou en lit fluidisé.
Ci-après, on décrit les deux modes de réalisation en question.
Lorsqu'on a recours au lit fixe, on fait circuler la solution de substrat à travers un lit fixe de ss 1-3 glucanase immobilisée sur dioxyde de titane telle qu'obtenue à 1' exemple 1.
Cette enzyme immobilisée est tassée, par exemple par compression pneumatique dans une colonne basse pression; on peut utiliser celle de type Vantage A de marque AMICON.
La solution de substrat circule en circuit fermé.
Pour une efficacité optimale, on détermine un compramis entre le réglage du débit, le temps de séjour de la solution au contact de l'enzyme immobilisée (qui doit être suffisamment important pour permettre la réalisation de l'hydrolyse enzymatique) et le temps de passage d'un volume entier de solution à travers le circuit (temps qui doit être relativement court, afin de réaliser un maximum de passages en un temps donné).
La durée totale de séjour au contact de l'enzyme immobilisée ne dépend que du volume de cette dernière et de la durée totale de l'opération.
Un essai est réalisé sur 10 litres d'une solution de ss 1-3 glucane à 10 g/l, préalablement clarifiée par filtration à 1,6 um.
Le dispositif utilisé, montré à la figure 1, comprend les éléments suivants:
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de par exemple 50 litres, munie d'un système d'agitation 2 et contenant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3, par exemple du type
Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme ss 1-3 glucanase fixée sur dioxyde de titane, tassée entre deux plateaux 7 et 8 dans une colonne 6 basse pression,
- une canalisation 9 par laquelle la solution de substrat est acheminée vers la colonne 6 à l'intérieur de laquelle elle est amenée par un tube 10 traversant le plateau 7 jusqu'à la surface de la masse 5,
- une canalisation 11 par laquelle la solution de substrat ayant traversé le lit d'enzyme immobilisée est extraite de la colonne 6 à travers le plateau 8 grâce à un trou 12 et recyclée vers la cuve 1.
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de par exemple 50 litres, munie d'un système d'agitation 2 et contenant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3, par exemple du type
Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme ss 1-3 glucanase fixée sur dioxyde de titane, tassée entre deux plateaux 7 et 8 dans une colonne 6 basse pression,
- une canalisation 9 par laquelle la solution de substrat est acheminée vers la colonne 6 à l'intérieur de laquelle elle est amenée par un tube 10 traversant le plateau 7 jusqu'à la surface de la masse 5,
- une canalisation 11 par laquelle la solution de substrat ayant traversé le lit d'enzyme immobilisée est extraite de la colonne 6 à travers le plateau 8 grâce à un trou 12 et recyclée vers la cuve 1.
Le manomètre situé en amont de la colonne permet de mesurer la perte de charge provoquée par le lit d'enzyme immobilisée, sachant que la pression en sortie de colonne est négligeable étant donné les faibles débits de l'ordre de 10 l/h fournis par la pompe péristaltique. On constate qu'à débit nul, le manomètre indique une faible pression (inférieure à 0,5 bar) probablement due à un accroissement local de celle-ci entre la pompe et l'entrée de la colonne du fait de la conception du circuit.
La masse d'enzyme immobilisée dans le mode de réalisation montré est de 3 grammes de ss 1-3 glucanase immobilisée sur 500 g de dioxyde de titane; elle est tassée sur une hauteur de 14,5 cm, ce qui, compte tenu des dimensions de la colonne (hauteur égale à 47,5 cm et diamètre égal à 6,2 cm), correspond à un volume d'enzyme immobilisée de 0,9 litre.
La solution de substrat est thermostatée à 400C au sein de la cuve 1. Les pertes de chaleur étant relativement faibles, l'ensemble du circuit atteint rapidement cette température, ensuite entretenue par la circulation du liquide.
Une quantité de 10 litres de substrat à 1% de ss 1-3 glucane, préalablement clarifié par filtration à 1,6 um, est introduite dans la cuve thermostatée. Le thermostat est réglé à 560C afin d'obtenir 400C dans la cuve, température optimale de l'hydrolyse enzymatique. Une fois la température stabilisée, la pompe péristaltique est mise en route. La température varie peu ensuite, car les pertes de chaleur dans la colonne et le circuit sont minimes.
La puissance de la pompe péristaltique est réglée de façon à obtenir une pression de 1,5 bar à l'entrée de la colonne. Au-delà d'une telle pression, l'enzyme immobilisée subit des contraintes qui, à plus ou moins long terme, pourraient affecter son efficacité et sa stabilité. Le débit associé à une telle pression est de 13,2 l/h.
Dans ces conditions, le temps de passage "t-passage" est de 45 minutes. A chaque passage dans la colonne, le temps de séjour 'séjour" au contact de l'enzyme est de 4 minutes.
La circulation de la solution de substrat est effectuée durant 5 heures 30 minutes.
Les cinétiques réactionnelles obéissent à des phénomènes de transports interfaciaux. Ceux-ci sont un facteur limitant dans la réaction d'hydrolyse enzymatique.
Le procédé "lit fixe" qui en lui-même est satisfaisant, présente un inconvénient qui est dû à l'hétérogénéité existant entre le lit de particules et la solution qui le traverse, ce qui a pour effet de placer la réaction d'hydrolyse sous contrôle diffusionnel.
De plus, progressivement, il se crée dans ce lit des canaux préférentiels de circulation du liquide.
Dès lors, certaines régions du lit ne sont plus irriguées et les molécules qui traversent les canaux préférentiels ne sont plus mises au contact du lit et donc de 1' enzyme.
Cet inconvénient n'est toutefois pas de nature à rendre inutilisable le procédé en lit fixe.
On peut néanmoins remédier à cet inconvénient en ayant recours à un système à lit fluidisé.
La fluidisation du lit de particules d'enzyme immobilisée, par un flux ascendant de liquide, aura pour effet de fournir un milieu quasiment homogène et d'optimaliser les échanges interfaciaux, par un accroissement des surfaces de contact enzyme immobilisée-solution.
La fluidisation du lit de particules peut être réalisée par un courant ascendant de fluide, en l'occurrence la solution de substrat.
Elle se produit lorsque la vitesse du fluide est suffisante pour mettre en suspension les particules de la masse d'enzyme immobilisée.
Chacune de ces particules est alors entourée de fluide qui la préserve de tout frottement avec les autres particules, ainsi qu'avec les parois de la colonne.
La couche fluidisée, mélange hétérogène de particules solides et de fluide, se comporte macroscopiquement comme un liquide "homogène .
On peut avoir recours au dispositif montré à la figure 2 et qui comprend les éléments suivants:
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de 50 litres, munie d'un système d'agitation 2 et contenant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3, par exemple du type
Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme immobilisée adsorbée sur dioxyde de titane, remplissant une colonne basse pression 13, par exemple de type VA 90500,
- une canalisation 14 par laquelle la solution de substrat est acheminée à l'extrémité inférieure de la colonne 13 dans laquelle elle pénètre en 15 pour mettre en lit fluidisé la masse d'enzyme immobilisée 5,
- une canalisation 15 par laquelle la solution de substrat est extraite en 17 à l'extrémité supérieure de la colonne après avoir traversé le lit fluidisé comprenant la masse d'enzyme immobilisée 5, à la partie supérieure de la colonne 13 pour être recyclée vers la cuve 1.
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de 50 litres, munie d'un système d'agitation 2 et contenant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3, par exemple du type
Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme immobilisée adsorbée sur dioxyde de titane, remplissant une colonne basse pression 13, par exemple de type VA 90500,
- une canalisation 14 par laquelle la solution de substrat est acheminée à l'extrémité inférieure de la colonne 13 dans laquelle elle pénètre en 15 pour mettre en lit fluidisé la masse d'enzyme immobilisée 5,
- une canalisation 15 par laquelle la solution de substrat est extraite en 17 à l'extrémité supérieure de la colonne après avoir traversé le lit fluidisé comprenant la masse d'enzyme immobilisée 5, à la partie supérieure de la colonne 13 pour être recyclée vers la cuve 1.
Le manomètre situé à l'entrée de la colonne, à la partie inférieure de celle-ci, permet de mesurer la perte de charge subite par le liquide à travers la colonne, sachant que la pression en sortie de celle-ci est négligeable étant donné les faibles débits fournis par la pompe péristaltique.
Le liquide est thermostaté au sein de la cuve 1. Là encore, les pertes restent faibles et l'ensemble du circuit atteint rapidement la température fixée.
EY]MPLE 2
Digestion de ss 1-3 glucane à l'aide d'un lit fluidisé à base de ss 1-3 glucanase immobilisée selon l'exemple 1.
Digestion de ss 1-3 glucane à l'aide d'un lit fluidisé à base de ss 1-3 glucanase immobilisée selon l'exemple 1.
10 litres de substrat à 1% de ss 1-3 glucane, préalablement clarifiés par filtration à 2,7 urn, sont introduits dans la cuve thermos tatée 1 dont la capacité est de 50 litres, sa hauteur étant de 47 cm et son diamètre de 39,5 cm.
Le thermostat est réglé à 560C afin d'obtenir 400C dans la cuve, température optimale de l'hydrolyse enzymatique.
La colonne 13 contient 3 grammes d'enzyme immobilisée sur 500 g de dioxyde de titane préparée conformément à l'exemple 1.
Une fois la température stabilisée, la pompe péristaltique est mise en route; la température varie peu ensuite car les pertes de chaleur dans la colonne et le circuit sont minimes.
La migration, sous l'influence du substrat, de l'enzyme immobilisée, vers le haut de la colonne 13 doit être réalisée de façon progressive afin d'éviter les turbulences. Celles-ci auraient pour effet de disperser les particules dans la colonne et favoriseraient leur migration hors de celle-ci.
La pompe péristaltique est
En outre, elle optimise la cinétique de catalyse hétérogène par la formation d'une gaine de solution autour de chaque particule.
Pour obtenir la digestion du ss 1-3 glucane, chaque cycle dure en moyenne de 4 à 6 heures. L'activité de l'enzyme immobilisée persiste dans ces conditions expérimentales pendant au moins 8 cycles.
On obtient ainsi 85 g d'oligo- 1,3-glucanes répar-tis majoritairement entre DP 2 et DP 10.
Claims (6)
1. Enzyme immobilisée caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une enzyme quelconque, notamment choisie dans le groupe comprenant les osidases et en particulier la ss 1-3 glucanase, les protéases et les lipases et immobilisée par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé entre un oxyde minéral de préférence choisi dans le groupe comprenant notamment l'alumine, la zircone, la silice et le dioxyde de titane, et un composé biou polyfonctionnel comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphonate par lequel il est lié à l'oxyde minéral et, d'autre part, un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif formant la liaison covalente avec 1' enzyme.
2. Procédé de préparation d'une enzyme immobilisée, caractérisé par le fait - que l'on sélectionne
une enzyme quelconque, de préférence dans le groupe
comprenant les osidases et notamment la ss 1-3 glucanase,
les protéases et les lipases,
un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une part,
un groupe fonctionnel phosphonate et, d'autre part, un
groupe chimique réactif capable, après activation en tant
que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur,
de former une liaison covalente avec la susdite enzyme et
o un oxyde minéral en tant que support, de préférence
choisi dans le groupe comprenant l'alumine, la zircone,
la silice et le dioxyde de titane, et - que
soit, dans une première étape, on fixe le composé bi- ou
polyfonctionnel sur le support par son groupe réactionnel
phosphonate en formant un complexe entre le composé et le
support puis, dans une deuxième étape, on fait réagir le
complexe ainsi formé avec l'enzyme de façon à créer une
liaison covalente entre l'enzyme et le groupe chimique
réactif comporté par le composé bi- ou polyfonctionnel
après avoir activé ce dernier en tant que de besoin,
soit, dans une première étape, on constitue une
phosphono-enzyme en faisant réagir le composé bi- ou
polyfonctionnel avec l'enzyme de façon à former une
liaison covalente entre l'enzyme et le groupe chimique
réactif, éventuellement après son activation, comporté
par le composé bi- ou polyfonctionnel puis, dans une
deuxième étape, on fixe la phosphono-enzyme ainsi formée
sur le support par réaction de celui-ci avec le groupe
réactionnel phosphonate du composé bi- ou
polyfonctionnel.
3. Enzyme immobilisée selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale
dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
avec n variant de 1 à 100 000, et
- Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié ou ramifié en C1 à C40 pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C1 à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs hétéroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
4. Enzyme immobilisée selon l'une des revendi-cations 1 et 3, caractérisée par le fait que l'agent activateur est un composé chimique qui comporte une fonction capable de former une liaison covalente avec les fonctions amine ou acide carboxylique comportées par les enzymes, cet agent activateur étant mis à réagir avec ceux des composés bi- ou polyfonctionnels qui, à titre de groupe chimique réactif, comportent une fonction amine, alcool ou acide carboxylique.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale
dans laquelle
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
- Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié ou ramifié en C1 à C40 pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe aikylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C1 à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs hétéroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
avec n variant de 1 à 100 000, et
6. Application de l'enzyme immobilisée selon l'une des revendications 1, 3 et 4 ou obtenue selon l'une des revendications 2 et 5, au traitement des milieux à l'égard desquels ladite enzyme développe les activités pour lesquelles elle est utilisée classiquement, notamment les transformations chimiques, les purifications ou la séparation de molécules organiques, organo-minérales ou minérales.
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