WO1999035251A1 - Enzymes immobilisees actives sur un support mineral, leurs procedes de preparation et leurs applications - Google Patents
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- WO1999035251A1 WO1999035251A1 PCT/FR1998/002903 FR9802903W WO9935251A1 WO 1999035251 A1 WO1999035251 A1 WO 1999035251A1 FR 9802903 W FR9802903 W FR 9802903W WO 9935251 A1 WO9935251 A1 WO 9935251A1
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
Definitions
- the invention relates to immobilized enzymes active on a mineral support.
- immobilized enzymes lies essentially in the possibility of recovering them without difficulty from the medium in which they have been used and in which the enzyme proper develops its activities for which it is conventionally used, to purify them by as needed and put them back to act in another environment.
- the invention also relates to the processes for preparing these active immobilized enzymes as well as their applications.
- Enzymes immobilized on an alumina support are already known.
- the protease is attached by a covalent bond to a solid complex formed by alumina linked to a bi- or polyfunctional compound comprising a phosphate functional group and a group capable of forming a covalent bond with a protease.
- the preparation, according to the above document, of the protease thus immobilized consists in fixing on alumina, as a bifunctional compound, an organic phosphate comprising a reaction group capable of forming a covalent bond with a protease, then in reacting the complex thus formed with the protease after having optionally activated the reactive group comprised by the group, by using appropriate activators, so as to form the desired covalent bond binding the protease at the complex.
- the chemical constitution of the immobilized enzyme obtained by the first of the above two processes is not the same as that of the immobilized enzyme obtained by the above second process.
- the object of the invention is, above all, to respond to the desire of users to have as wide a range as possible of immobilized enzymes active on a support.
- the inventors had the merit of finding that, surprisingly and unexpectedly, it is possible to immobilize the enzymes on a support based on mineral oxides using a bi- or polyfunctional compound constituted by an organic phosphonate comprising a group reactive chemical capable of forming a covalent bond with an enzyme.
- the active immobilized enzyme according to the invention is characterized in that it is consisting of any enzyme, in particular chosen from the group comprising osidases and in particular ⁇ 1-3 glucanase, proteases and lipases and immobilized by fixation using a covalent bond on an insoluble solid complex formed between a mineral oxide preferably chosen from the group comprising in particular alumina, zirconia, silica and titanium dioxide, and a bi- or polyfunctional compound comprising, on the one hand, a phosphonate functional group by which it is linked to the mineral oxide and, on the other hand, a reactive chemical group, activated as necessary by the use of an activating agent, this reactive chemical group forming the covalent bond with the enzyme.
- any enzyme preferably in the group comprising osidases and in particular ⁇ 1-3 glucanase, proteases and lipases, • a bi- or polyfunctional compound comprising, on the one hand, a phosphonate functional group and, on the other hand, a reactive chemical group capable, after activation as necessary by the use of an activating agent, of forming a covalent bond with the abovementioned enzyme and
- an inorganic oxide as a support preferably chosen from the group comprising alumina, zirconia, silica and titanium dioxide, and that • either, in a first step, the bi- or polyfunctional compound is fixed on the support by its phosphonate reaction group by forming a complex between the compound and the support then, in a second step, the complex thus formed is reacted with the enzyme so as to create a covalent bond between the enzyme and the reactive chemical group comprising the bi- or polyfunctional compound after activating the latter as necessary,
- a phosphono-enzyme is formed by reacting the bi- or polyfunctional compound with the enzyme so as to form a covalent bond between the enzyme and the reactive chemical group, possibly after its activation, comprising with the bi- or polyfunctional compound then, in a second step, the phosphono-enzyme thus formed is fixed on the support by reaction of the latter with the phosphonate reaction group of the bi- or polyfunctional compound.
- the mineral oxide can be used in the form of powders or membranes obtained according to conventional methods described in particular in “Chromatographies in liquid and supercritical phases” by Robert Rosset, Marcel
- the bi- or polyfunctional compound is chosen from the group of those having the general formula
- - X represents a hydrogen or alkali metal atom
- n varying from 1 to 100,000
- Y which comprises at least one reactive chemical group chosen from the group comprising the amino, carboxylic acid, alcohol, thiol, aldehyde or ester functions, is either a linear or branched or branched C 1 -C 40 alkyl group which may contain a or more heteroatoms, either an aryl or polyaryl group which may comprise one or more heteroatoms, or an alkylaryl or arylalkyl group in which the alkyl part is C 1 to C 40 and may include, like the aryl part, one or more heteroatoms, it being understood that when the reactive chemical group is different from the thiol and aldehyde functions, it must be activated by reaction of the compound of formula (I) with an activating agent.
- the activating agent is a chemical compound which has a function capable of forming a covalent bond with the amino or carboxylic acid functions carried by the enzymes and which is reacted with those of the bi- or polyfunctional compounds which, as a group reactive chemical, have an amino, alcohol or carboxylic acid function.
- the activating agent which can be implemented according to the techniques of Howard H. Weetall published in "Applied Biochemistry and Biotechnology" (1993) 41 , 157-188, and which should be used when the reactive chemical group comprised by said bi- or polyfunctional compound is different from thiol or aldehyde functions, is chosen from the group comprising derivatives the formulas of which are given below after activation of a reactive chemical group comprising said bi- or polyfunctional compound and consisting of an amino function of carbosylic acid or alcohol, the nature of this function being mentioned for each of said derivatives, namely:
- the fixing of the bi- or polyfunctional compound on a support based on titanium dioxide is carried out by reacting an aqueous solution of the bi- or polyfunctional compound with a suspension of titanium dioxide in an aqueous medium.
- the immobilization of the enzyme by reaction with the activated organic grouping of the bifunctional compound fixed on the support based on mineral oxide is carried out in medium aqueous and at a temperature of 20-25 ° C.
- the phosphono-enzyme is firstly prepared by reacting the enzyme in aqueous solution on the bifunctional compound of formula (I), also in aqueous solution.
- bifunctional compound is the result of the reaction of 2-aminoethylphosphonic acid and glutaraldehyde and the enzyme is ⁇ 1-3 glucanase, it is possible to proceed as indicated below.
- the solution thus obtained is subjected to dialysis in order to remove the excess reagents.
- the phosphono- ⁇ 1,3-glucanase "APA-Glut" obtained above is carried out on a dioxide-based support. of titanium by reacting, with stirring, for 24 hours at 25 ° C, a suspension of titanium dioxide with a particle size of 40 to 200 ⁇ m with the dialysate of the phosphono-enzyme.
- the progression of the absorption is followed by determination at regular intervals of the residual enzymatic activity of samples of the filtrate of the above mixture. After complete disappearance of the enzymatic activity (2 to 4 hours in general), the reaction medium is filtered and washed abundantly with water.
- the immobilized phosphono-enzyme thus obtained is kept as it is, that is to say moist in the refrigerator at + 4 ° C. until use. Its enzymatic activity is determined by hydrolysis of its specific substrate.
- the active immobilized enzymes in accordance with the invention are used for the treatment of media in respect of which they develop the activities for which they are conventionally used.
- aqueous or hydroorganic implementation medium or containing only organic solvents this medium can be a liquefied gas used in the critical, sub-critical, or super-critical state; the temperature of the medium can vary from -20 ° C to + 200 ° C and the pressure exerted on the medium can vary from 0.1 to 300 bars in absolute value.
- reaction medium is stirred at a temperature of 20-25 ° C until a total solution is obtained.
- 500 g of titanium dioxide with a particle size of 40 to 200 ⁇ m are then added with slow stirring (30 rpm).
- the mixture is stirred for 12 hours at a temperature of 20-25 ° C. at 30 rpm, checking the pH every hour and readjusting, if necessary, to the required value which is 4.5.
- the binding kinetics of 2-aminoethylphosphonic acid are monitored by means of the ninhydrin staining test.
- the insoluble material is filtered through a No. 2 frit and then washed thoroughly with three times 0.5 liters of demineralized water.
- the wet insoluble material is recovered and loaded into a 4-liter reactor containing a solution prepared by dissolving 3 g of ⁇ 1-3 glucanase sold under the brand
- the mixture is stirred at 20-25 ° C for 24 hours at a speed of 30 rpm.
- the pH is adjusted to 4.5 with the necessary quantity of 0.1 N sodium hydroxide solution.
- the mixture is stirred for 3 hours at a temperature of 20 to
- the mixture is stirred for 3 hours at a temperature of 20 to 30 ° C., then the reaction medium is subjected to dialysis.
- the dialysate is recovered and charged to a 20-liter glass reactor with stirring set at 30 rpm.
- the mixture is stirred for 24 hours at a temperature of 20 to 25 ° C. and filtered on a No. 2 frit or on a buchner.
- the retentate is washed with three times 3 liters of demineralized water.
- the moist retentate constituting the desired immobilized active enzyme is kept at a temperature of approximately + 4 ° C. until it is used.
- the substrate solution is circulated through a fixed bed of ⁇ 1-3 glucanase immobilized on titanium dioxide as obtained in Example 1.
- This immobilized enzyme is packed, for example by pneumatic compression in a low pressure column; you can use the AMICON brand Vantage A type.
- the substrate solution circulates in a closed circuit.
- a compromise is determined between the adjustment of the flow rate, the residence time of the solution in contact with the active immobilized enzyme (which must be sufficiently long to allow the carrying out of the enzymatic hydrolysis) and the time of passage of an entire volume of solution through the circuit (time which must be relatively short, in order to achieve a maximum of passages in a given time).
- the total duration of stay in contact with the active immobilized enzyme depends only on the volume of the latter and on the total duration of the operation.
- a test is carried out on 10 liters of a solution of ⁇ 1-3 glucan at 10 g / 1, previously clarified by filtration at 1.6 ⁇ m.
- the device used shown in FIG. 1, comprises the following elements:
- thermostated tank 1 with a capacity of, for example, 50 liters, equipped with a stirring system 2 and containing the substrate solution,
- a peristaltic pump 3 for example of the Watson-Marlow type
- the pressure gauge located upstream of the column allows to measure the pressure drop caused by the bed of active immobilized enzyme, knowing that the pressure at the column outlet is negligible given the low flow rates of the order of 10 1 / h provided by the peristaltic pump. It can be seen that at zero flow, the pressure gauge indicates a low pressure (less than 0.5 bar) probably due to a local increase in pressure between the pump and the inlet of the column due to the design of the circuit.
- the mass of immobilized enzyme active in the embodiment shown is 3 grams of ⁇ 1-3 glucanase immobilized on 500 g of titanium dioxide; it is packed to a height of 14.5 cm, which, taking into account the dimensions of the column (height equal to 47.5 cm and diameter equal to 6.2 cm), corresponds to a volume of active immobilized enzyme of 0.9 liter.
- the substrate solution is thermostatically controlled at 40 ° C within the tank 1.
- the heat losses being relatively low, the entire circuit quickly reaches this temperature, then maintained by the circulation of the liquid.
- the thermostat is set at 56 ° C to obtain 40 ° C in the tank, the optimal temperature for enzymatic hydrolysis. Once the temperature has stabilized, the peristaltic pump is started. The temperature varies little later, because the heat losses in the column and the circuit are minimal.
- the power of the peristaltic pump is adjusted so as to obtain a pressure of 1.5 bar at the inlet of the column. Beyond such a pressure, the active immobilized enzyme undergoes constraints which, in the more or less long term, could affect its efficiency and its stability.
- the flow rate associated with such a pressure is 13.2 l / h.
- the passage time "t-passage” is 45 minutes.
- the residence time “t-residence” in contact with the enzyme is 4 minutes.
- the circulation of the substrate solution is carried out during
- reaction kinetics obey phenomena of interfacial transport. These are a limiting factor in the enzymatic hydrolysis reaction.
- the "fixed bed” process which in itself is satisfactory, has a drawback which is due to the heterogeneity existing between the particle bed and the solution passing through it, which has the effect of placing the hydrolysis reaction under diffusion control.
- the fluidization of the bed of particles of active immobilized enzyme, by an upward flow of liquid, will have the effect of providing an almost homogeneous medium and of optimizing the interfacial exchanges, by an increase in the surfaces of immobilized enzyme-solution contact.
- the fluidization of the particle bed can be carried out by an upward flow of fluid, in this case the substrate solution. It occurs when the speed of the fluid is sufficient to suspend the particles of the mass of active immobilized enzyme.
- Each of these particles is then surrounded by fluid which protects it from any friction with the other particles, as well as with the walls of the column.
- the fluidized layer a heterogeneous mixture of solid particles and fluid, behaves macroscopically like a "homogeneous" liquid.
- thermostatically controlled tank 1 with a capacity of 50 liters, fitted with a stirring system 2 and containing the substrate solution,
- a peristaltic pump 3 for example of the Watson-Marlow type
- a mass 5 of active immobilized enzyme adsorbed on titanium dioxide filling a low pressure column 13, for example of the VA 90500 type, - a line 14 through which the substrate solution is conveyed to the lower end of the column 13 into which it enters at 15 in order to put in a fluidized bed the mass of active immobilized enzyme 5,
- the pressure gauge located at the entrance of the column, at the bottom of it, allows to measure the loss of load undergone by the liquid through the column, knowing that the pressure leaving the latter is negligible given the low flow rates supplied by the peristaltic pump.
- the liquid is thermostatically controlled within the tank 1. Again, the losses remain low and the entire circuit quickly reaches the set temperature.
- the thermostat is set at 56 ° C to obtain 40 ° C in the tank, the optimal temperature for enzymatic hydrolysis.
- the peristaltic pump is started; the temperature does not vary much since the heat losses in the column and the circuit are minimal.
- the migration, under the influence of the substrate, of the active immobilized enzyme, to the top of the column 13 must be carried out gradually in order to avoid turbulence. These would have the effect of dispersing the particles in the column and would promote their migration out of it.
- the peristaltic pump is set to full power, which allows the active immobilized enzyme to be fluidized over a height of 40 cm. It then occupies a volume "V gel" of 2.5 1.
- the flow rate associated with such a volume is 28 l / h.
- fluidization makes it possible to multiply by 2.5 the contact time between the enzyme immobilized active and ⁇ 1-3 glucan solution.
- each cycle lasts an average of 4 to 6 hours.
- the activity of the active immobilized enzyme persists under these experimental conditions for at least 8 cycles.
- oligo- ⁇ 1,3-glucans 85 g are thus distributed mainly between DP 2 and DP 10.
Abstract
La présente invention a pour objet une enzyme immobilisée active caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une enzyme quelconque, notamment choisie dans le groupe comprenant les osidases et en particulier la β 1-3 glucanase, les protéases et les lipases et immobilisée par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé entre un oxyde minéral de préférence choisi dans le groupe comprenant notamment l'alumine, la zircone, la silice et le dioxyde de titane, et un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphonate par lequel il est lié à l'oxyde minéral et, d'autre part, un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif formant la liaison covalente avec l'enzyme.
Description
ENZYMES IMMOBILISÉES ACTIVES SUR UN SUPPORT MINERAL, LEURS PROCÉDÉS DE PRÉPARATION ET LEURS APPLICATIONS
L'invention a pour objet des enzymes immobilisées actives sur un support minéral .
L'intérêt des enzymes immobilisées réside essentiellement dans la possibilité de les récupérer sans difficulté à partir du milieu dans lequel elles ont été mises en oeuvre et dans lequel l'enzyme proprement dite développe ses activités pour lesquelles elle est classiquement utilisée, de les purifier en tant que de besoin et de les remettre à agir dans un autre milieu.
L'invention vise également les procédés de préparation de ces enzymes immobilisées actives ainsi que leurs applications.
On connaît déjà des enzymes immobilisées sur un support d' alumine .
Ainsi, le document EP-A-86 402014.4 décrit l'immo- bilisation des protéases sur des alumine-phosphates organiques .
Selon ce document, la protease est rattachée par une liaison covalente à un complexe solide formé par de l'alumine liée à un composé bi- ou polyfonctionnel comportant un groupe fonctionnel phosphate et un groupe capable de former une liaison covalente avec une protease.
La préparation, selon le susdit document, de la protease ainsi immobilisée, consiste à fixer sur de l'alumine, en tant que composé bifonctionnel, un phosphate organique comportant un groupe reactionnel capable de former une liaison covalente avec une protease, puis à faire réagir le complexe ainsi formé avec la protease après avoir éventuellement activé le groupe réactif comporté par le groupe, en ayant recours à des activateurs appropriés, de façon à former la liaison covalente recherchée liant la
protease au complexe.
Il est également connu --voir à cet égard le document "Bioscience Reports " vol. 8, No.3, 1988, page 266-- de former dans un premier temps une phosphoprotéase en faisant réagir le composé bifonctionnel dont il a été question ci-dessus avec la protease en question de façon à former une liaison covalente entre la protease et le groupe chimiquement réactif comporté par ledit composé, éventuellement après activation de celui-ci, puis à fixer la phosphoprotéase ainsi constituée sur de l'alumine par réaction de celle-ci avec le groupe reactionnel phosphate comporté par le composé bifonctionnel.
La constitution chimique de l'enzyme immobilisée obtenue par le premier des deux susdits procédés, n'est pas la même que celle de l'enzyme immobilisée obtenue par le susdit deuxième procédé.
Il s'ensuit que les activités des deux types de protéases immobilisées ainsi obtenues ne sont pas identiques . II est enfin connu, par le susdit document, d'utiliser les enzymes ainsi immobilisées dans leurs applications classiques.
L'invention a pour objet, surtout, de répondre au souhait des utilisateurs de disposer d'un éventail aussi large que possible d'enzymes immobilisées actives sur un support .
Et les inventeurs ont eu le mérite de trouver que, de façon surprenante et inattendue, il est possible d'immobiliser les enzymes sur un support à base d'oxydes minéraux en utilisant un composé bi- ou polyfonctionnel constitué par un phosphonate organique comportant un groupe chimique réactif capable de former une liaison covalente avec une enzyme .
Il s'ensuit que l'enzyme immobilisée active conforme à l'invention est caractérisée par le fait qu'elle est
constituée par une enzyme quelconque, notamment choisie dans le groupe comprenant les osidases et en particulier la β 1-3 glucanase, les protéases et les lipases et immobilisée par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé entre un oxyde minéral de préférence choisi dans le groupe comprenant notamment l'alumine, la zircone, la silice et le dioxyde de titane, et un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphonate par lequel il est lié à l'oxyde minéral et, d'autre part, un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif formant la liaison covalente avec l'enzyme.
Le procédé de préparation de l'enzyme immobilisée active conforme à l'invention est caractérisé par le fait que l'on sélectionne
• une enzyme quelconque, de préférence dans le groupe comprenant les osidases et notamment la β 1-3 glucanase, les protéases et les lipases, • un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphonate et, d'autre part, un groupe chimique réactif capable, après activation en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, de former une liaison covalente avec la susdite enzyme et
• un oxyde minéral en tant que support, de préférence choisi dans le groupe comprenant l'alumine, la zircone, la silice et le dioxyde de titane, et que • soit, dans une première étape, on fixe le composé bi- ou polyfonctionnel sur le support par son groupe reactionnel phosphonate en formant un complexe entre le composé et le support puis, dans une deuxième étape, on fait réagir le complexe ainsi formé avec l'enzyme de façon à créer une liaison covalente entre
l'enzyme et le groupe chimique réactif comporté par le composé bi- ou polyfonctionnel après avoir activé ce dernier en tant que de besoin,
• soit, dans une première étape, on constitue une phosphono-enzyme en faisant réagir le composé bi- ou polyfonctionnel avec l'enzyme de façon à former une liaison covalente entre l'enzyme et le groupe chimique réactif, éventuellement après son activation, comporté par le composé bi- ou polyfonctionnel puis, dans une deuxième étape, on fixe la phosphono-enzyme ainsi formée sur le support par réaction de celui-ci avec le groupe reactionnel phosphonate du composé bi- ou polyfonctionnel .
L'oxyde minéral peut être utilisé sous forme de poudres ou de membranes obtenues selon des procédés classiques décrits notamment dans "Chromatographies en phases liquide et super-cri tique " par Robert Rosset, Marcel
Caude et Alain Jardy, 1991, Edition Masson.
Dans un mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées actives et de leurs procédés de préparation, le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
O ii /O X ox o o
H n ,ox
— p— o — P ; I O X
O X
avec n variant de 1 à 100 000, et
- Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions aminé, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié ou ramifié en cl à C40 pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes , soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en Cl à C40 et peut comporter comme la partie aryle un ou plusieurs hétéroatomes, étant entendu que lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur. L'agent activateur est un composé chimique qui comporte une fonction capable de former une liaison covalente avec les fonctions aminé ou acide carboxylique comportées par les enzymes et que 1 ' on fait réagir avec ceux des composés bi- ou polyfonctionnels qui, à titre de groupe chimique réactif, comportent une fonction aminé, alcool ou acide carboxylique.
Dans un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées actives et de leurs procédés de préparation, l'agent activateur, qui peut être mis en oeuvre selon les techniques de Howard H. Weetall publiées dans "Applied Biochemistry and Biotechnology" (1993) 41, 157-188, et auquel il convient d'avoir recours quand le groupe chimique réactif comporté par ledit composé bi- ou polyfonctionnel est différent des fonctions thiol ou aldéhyde, est choisi dans le groupe comportant les dérivés
dont les formules sont indiquées ci-après après activation d'un groupe chimique réactif comporté par ledit composé bi- ou polyfonctionnel et constitué par une fonction aminé acide carbosylique ou alcool, la nature de cette fonction étant mentionnée pour chacun desdits dérivés, à savoir:
N
^
NH N
N
Cl (activation aminé + trichloro-triazine)
— N=CH — (CH2)3— C— H (activation aminé + glutaraidéhyde)
(activation aminé + DSS ou disuccinlmidyl-subérate)
(activation aminé + SPDP ou succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate)
N
(activation aminé + SMCC ou succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-l -carboxylate)
N=N + Cl
(activation amine + nitrite de sodium)
(activation amine + 4-nltrophényl-chloroformiate)
H — CH2 — CH — CH2 — O — (CH2)4 — 0-CH2 CH CH2
OH O
(activation amine + bisoxyrane)
O NH CH, CH, Il I 3 C — C=N — (C 2)_~ N(CH3)2 , HCI
(activation acide + EDC)
(activation acide + N-hydroxy-succinimide)
(activation alcool + carbonyl-diimidazole)
(activation alcool + benzoquinone)
O— CH2" CH — CH2 — O— (CH2)4 — O CH2— CH CH2
(activation alcool + bisoxyrane)
O II ^0 -CH2— CH2— S — CH = CH2
(activation alcool + divinylsulfone)
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées actives et de leurs procédés de préparation, l' activation d'un composé bifonctionnel de formule (I) constitué par l'acide phosphonopropionique est réalisée comme suit:
On dissout 10 mg d'acide phosphopropionique dans
100 ml d'eau déminéralisée; on ajoute 5 mg d' éthyl-3- (3- diméthylaminopropyl) -carbodiimide et le milieu est agité pendant 5 heures à une température de 20-25°C, puis conservé au frais vers +5°C.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées actives et de leurs procédés de préparation, la fixation du composé bi- ou polyfonctionnel sur un support à base de dioxyde de titane est réalisée en faisant réagir une solution aqueuse du composé bi- ou polyfonctionnel avec une suspension du dioxyde de titane dans un milieu aqueux.
A titre d'exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on décrit ci-après la fixation sur de la poudre de dioxyde de titane d'une granulometrie de 40 à 200 μm d'un composé bifonctionnel de formule (I) .
On peut procéder comme suit. A une solution de 60 mg d'acide 2-aminoéthyl-
phosphonique dans 100 ml d'eau à 20°C, on ajoute 3 g de dioxyde de titane.
Le mélange est maintenu sous légère agitation pendant 24 heures à pH 7. Au bout de cette durée, la fixation de l'acide 2-amino- éthylphosphonique est totale, ce qui est vérifié par le test à la ninhydrine sur une partie aliquote de filtrat obtenu par filtration de la suspension, le rétentat étant lavé avec trois fois 100 ml d'eau. Le rétentat lavé est mis en suspension dans 50 ml d' eau.
On ajoute ensuite 5 ml d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde 1 M.
L'agitation est maintenue pendant 4 heures à une température de 20-25°C. Le rétentat est encore lavé par trois fois 50 ml d'eau et conservé humide vers +5°C jusqu'à utilisation (Ti-APA-Glut) .
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées actives et de leurs procédés de préparation, l'immobilisation de l'enzyme par réaction avec le groupement organique activé du composé bifonctionnel fixé sur le support à base d'oxyde minéral est effectuée en milieu aqueux et à une température de 20-25°C.
A titre d'exemple non limitatif mais illustrant un mode de réalisation avantageux, on indique que, lorsqu'il s'agit de faire réagir une protease, par exemple la α-chymotrypsine avec le complexe constitué par le dioxyde de titane sur lequel a été fixé le composé bifonctionnel de formule (I) décrit ci-dessus, on procède comme indiqué ci-après . 3,06 grammes du complexe activé Ti-APA-Glut sont mis en suspension dans 10 ml d'eau, puis mélangés à une solution aqueuse de 60 mg d' α-chymotrypsine. Le pH du milieu est ajusté au pH d'activité maximum de l'enzyme, à savoir 7, et doit être réajusté en cours d'expérience si nécessaire; cet ajustement peut être réalisé à l'aide de HCl 0,1 N.
Par filtration de la suspension sur fritte n°4, on récupère 3,66 g du complexe α-chymotrypsine "Ti-APA-Glut".
Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées actives et de leurs procédés de préparation, on prépare tout d'abord la phosphono-enzyme en faisant réagir l'enzyme en solution aqueuse sur le composé bifonctionnel de formule (I), également en solution aqueuse.
Lorsque le composé bifonctionnel est le résultat de la réaction de l'acide 2-aminoéthylphosphonique et du glutaraldéhyde et que l'enzyme est la β 1-3 glucanase, on peut procéder comme indiqué ci-après.
125 mg (10~3 moles) d'acide 2-aminoéthylphosphonique sont mis en solution dans 500 ml d'eau. 400 ml d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 25% sont additionnés (10 moles) . On agite pendant 4 minutes à une température de 20-25°C. On ajoute le composé bifonctionnel ainsi activé à une solution de 2 g de β 1, 3-glucanase (commercialisée sous la marque GLUCANEX par la Société ΝOVO INDUSTRIES) dans 100 ml d'eau. On ajuste le pH à 4,5 à l'aide de soude 0,1 N, puis on agite pendant 24 heures à la température de 20-25°C.
La solution ainsi obtenue est soumise à une dialyse pour éliminer les réactifs en excès.
On obtient ainsi la phosphono-β 1, 3-glucanase "APA- Glut". Selon un autre mode de réalisation avantageux des susdites enzymes immobilisées actives et de leurs procédés de préparation, on réalise l'immobilisation de la phosphono-β 1,3- glucanase "APA-Glut" obtenue ci-dessus sur un support à base de dioxyde de titane en faisant réagir sous agitation, pendant 24 heures à 25°C, une suspension de dioxyde de titane d'une granulometrie de 40 à 200 μm avec le dialysat de la phosphono- enzyme .
La progression de l'absorption est suivie par détermination à intervalles réguliers de l'activité enzymatique résiduelle d'échantillons du filtrat du susdit mélange.
Après disparition totale de l'activité enzymatique (2 à 4 heures en général) , le milieu reactionnel est filtré et lavé abondamment à l'eau.
La phosphono-enzyme immobilisée ainsi obtenue est conservée telle quelle, c'est-à-dire humide au réfrigérateur à +4°C jusqu'à utilisation. Son activité enzymatique est déterminée par hydrolyse de son substrat spécifique.
Les enzymes immobilisées actives conformes à l'invention sont utilisées pour le traitement des milieux à 1 ' égard desquels elles développent les activités pour lesquelles elles sont utilisées classiquement.
Parmi ces traitements, on peut citer les transformations chimiques, les purifications ou la séparation de molécules organiques, organo-minérales ou minérales. Les susdits traitements utilisent un milieu de mise en oeuvre aqueux ou hydroorganique ou contenant uniquement des solvants organiques; ce milieu peut être un gaz liquéfié utilisé à l'état critique, sub-critique, ou super-critique; la température du milieu peut varier de -20°C à +200°C et la pression exercée sur le milieu peut varier de 0,1 à 300 bars en valeur absolue .
EXEMPLE 1
Préparation de la β 1-3 glucanase immobilisée sur dioxyde de titane.
On a mis en oeuvre successivement les deux variantes du procédé conforme à l'invention. Première variante
Dans un réacteur en verre de 4 litres muni d'une agitation mécanique, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on charge:
- 3 litres d'eau déminéralisée et
- 20 g d'acide 2-aminoéthyl-phosphonique.
Le milieu reactionnel est agité à une température de 20-25°C jusqu'à obtention d'une solution totale.
On ajoute alors sous agitation lente (30 t/min) 500 g de dioxyde de titane d'une granulometrie de 40 à 200 μm.
On agite pendant 12 heures à une température de 20-25°C à 30 t/min en vérifiant le pH toutes les heures et en réajustant, si nécessaire, à la valeur requise qui est de 4,5.
La cinétique de fixation de l'acide 2-aminoéthyl- phosphonique est suivie au moyen du test de coloration à la ninhydrine .
Après 12 heures d'agitation, l'insoluble est filtré sur fritte n°2 puis lavé abondamment avec trois fois 0,5 litres d'eau déminéralisée.
L'insoluble humide est récupéré et chargé à nouveau dans un réacteur en verre de 4 litres contenant une solution
1 M de glutaraldéhyde préalablement préparée par mélange de 270 ml de glutaraldéhyde 5,6 M (commercialisé par la Société FLUKA sous la référence 49629) avec 1231 ml d'eau déminéralisée.
On agite à 30 t/min et à une température de 20-25°C pendant 24 heures.
On filtre sur fritte n°2 puis on lave avec trois fois 0,5 litre d'eau déminéralisée.
L'insoluble humide est récupéré et chargé dans un réacteur de 4 litres contenant une solution préparée en dissolvant 3 g de β 1-3 glucanase commercialisée sous la marque
GLUCANEX par la Société NOVO INDUSTRIES dans 1,5 litres d'acétate de sodium 2,1 M de pH 4,55.
On agite à une température de 20-25°C pendant 24 heures à une vitesse de 30 t/min.
On filtre sur fritte n°2 et on lave le résidu de filtration trois fois avec 0,5 litre d'eau déminéralisée. On récupère le rétentat humide constitué par l'enzyme immobilisée active recherchée et on le conserve à une température de +4 à +6°C jusqu'à utilisation. Deuxième variante
Dans un réacteur en verre de 20 litres, muni d'une agitation, d'un thermomètre et d'une ampoule de coulée, on
charge 21,85 g d'acide 2-aminoéthyl-phosphonique et 5 litres d'eau déminéralisée.
On agite jusqu'à dissolution.
On ajoute par l'ampoule de coulée, en veillant à ce que la température ne dépasse pas 30°C, 4 litres de glutaraldéhyde en solution aqueuse à 25%.
On agite la solution ainsi obtenue pendant 3 heures à une température de 20 à 30°C.
On ajoute ensuite une solution préalablement préparée et contenant 20 g de β 1-3 glucanase commercialisée sous la marque GLUCANEX par la Société NOVO INDUSTRIES dans 10 litres d' eau déminéralisée .
On ajuste le pH à 4,5 avec la quantité nécessaire de soude 0,1 N. On agite pendant 3 heures à une température de 20 à
30°C, puis on refroidit à 20°C.
On ajoute ensuite en une seule fois 22,5 g de cyanoborohydrure de sodium.
On agite pendant 3 heures à une température de 20 à 30°C, puis on soumet le milieu reactionnel à une dialyse.
On récupère le dialysat et on le charge dans un réacteur en verre de 20 litres muni d'une agitation réglée à 30 t/min.
On ajoute dans la masse réactionnelle 1 kg de dioxyde de titane d'une granulometrie de 40 à 200 μm.
On agite pendant 24 heures à une température de 20 à 25°C et on filtre sur fritte n° 2 ou sur buchner.
On lave le rétentat avec trois fois 3 litres d'eau déminéralisée. On conserve le rétentat humide constituant 1 ' enzyme immobilisée active recherchée, à une température d'environ +4°C jusqu'à son utilisation.
* La mise en oeuvre de la β 1-3 glucanase immobilisée obtenue à l'exemple 1, par exemple pour "digérer" un substrat
constitué par du β 1-3 glucane, peut être réalisée en lit fixe ou en lit fluidisé.
Ci-après, on décrit les deux modes de réalisation en question. Lorsqu'on a recours au lit fixe, on fait circuler la solution de substrat à travers un lit fixe de β 1-3 glucanase immobilisée sur dioxyde de titane telle qu'obtenue à l'exemple 1.
Cette enzyme immobilisée est tassée, par exemple par compression pneumatique dans une colonne basse pression; on peut utiliser celle de type Vantage A de marque AMICON.
La solution de substrat circule en circuit fermé. Pour une efficacité optimale, on détermine un compromis entre le réglage du débit, le temps de séjour de la solution au contact de l'enzyme immobilisée active (qui doit être suffisamment important pour permettre la réalisation de l'hydrolyse enzymatique) et le temps de passage d'un volume entier de solution à travers le circuit (temps qui doit être relativement court, afin de réaliser un maximum de passages en un temps donné) . La durée totale de séjour au contact de l'enzyme immobilisée active ne dépend que du volume de cette dernière et de la durée totale de l'opération.
Un essai est réalisé sur 10 litres d'une solution de β 1-3 glucane à 10 g/1, préalablement clarifiée par filtration à 1, 6 μm.
Le dispositif utilisé, montré à la figure 1, comprend les éléments suivants :
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de par exemple 50 litres, munie d'un système d'agitation 2 et contenant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3 , par exemple du type Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme β 1-3 glucanase fixée sur dioxyde de titane, tassée entre deux plateaux 7 et 8 dans une
colonne 6 basse pression,
- une canalisation 9 par laquelle la solution de substrat est acheminée vers la colonne 6 à l'intérieur de laquelle elle est amenée par un tube 10 traversant le plateau 7 jusqu'à la surface de la masse 5,
- une canalisation 11 par laquelle la solution de substrat ayant traversé le lit d'enzyme immobilisée active est extraite de la colonne 6 à travers le plateau 8 grâce à un trou 12 et recyclée vers la cuve 1. Le manomètre situé en amont de la colonne permet de mesurer la perte de charge provoquée par le lit d'enzyme immobilisée active, sachant que la pression en sortie de colonne est négligeable étant donné les faibles débits de l'ordre de 10 1/h fournis par la pompe péristaltique. On constate qu'à débit nul, le manomètre indique une faible pression (inférieure à 0,5 bar) probablement due à un accroissement local de celle-ci entre la pompe et l'entrée de la colonne du fait de la conception du circuit.
La masse d'enzyme immobilisée active dans le mode de réalisation montré est de 3 grammes de β 1-3 glucanase immobilisée sur 500 g de dioxyde de titane; elle est tassée sur une hauteur de 14,5 cm, ce qui, compte tenu des dimensions de la colonne (hauteur égale à 47 , 5 cm et diamètre égal à 6 , 2 cm) , correspond à un volume d'enzyme immobilisée active de 0,9 litre.
La solution de substrat est thermostatée à 40°C au sein de la cuve 1. Les pertes de chaleur étant relativement faibles, l'ensemble du circuit atteint rapidement cette température, ensuite entretenue par la circulation du liquide. Une quantité de 10 litres de substrat à 1% de β 1-3 glucane, préalablement clarifié par filtration à 1,6 μm, est introduite dans la cuve thermostatée. Le thermostat est réglé à 56°C afin d'obtenir 40°C dans la cuve, température optimale de l'hydrolyse enzymatique. Une fois la température stabilisée, la pompe péristaltique est mise en route. La température varie
peu ensuite, car les pertes de chaleur dans la colonne et le circuit sont minimes.
La puissance de la pompe péristaltique est réglée de façon à obtenir une pression de 1,5 bar à l'entrée de la colonne. Au-delà d'une telle pression, l'enzyme immobilisée active subit des contraintes qui, à plus ou moins long terme, pourraient affecter son efficacité et sa stabilité. Le débit associé à une telle pression est de 13,2 1/h.
Dans ces conditions, le temps de passage "t-passage" est de 45 minutes. A chaque passage dans la colonne, le temps de séjour "t-séjour" au contact de l'enzyme est de 4 minutes.
La circulation de la solution de substrat est effectuée durant
5 heures 30 minutes .
Les cinétiques réactionnelles obéissent à des phénomènes de transports interfaciaux. Ceux-ci sont un facteur limitant dans la réaction d'hydrolyse enzymatique.
Le procédé "lit fixe" qui en lui-même est satisfaisant, présente un inconvénient qui est dû à l'hétérogénéité existant entre le lit de particules et la solution qui le traverse, ce qui a pour effet de placer la réaction d'hydrolyse sous contrôle diffusionnel .
De plus, progressivement, il se crée dans ce lit des canaux préférentiels de circulation du liquide.
Dès lors, certaines régions du lit ne sont plus irriguées et les molécules qui traversent les canaux préférentiels ne sont plus mises au contact du lit et donc de 1 ' enzyme .
Cet inconvénient n'est toutefois pas de nature à rendre inutilisable le procédé en lit fixe. On peut néanmoins remédier à cet inconvénient en ayant recours à un système à lit fluidisé.
La fluidisation du lit de particules d'enzyme immobilisée active, par un flux ascendant de liquide, aura pour effet de fournir un milieu quasiment homogène et d'optimaliser les échanges interfaciaux, par un accroissement des surfaces de
contact enzyme immobilisée-solution.
La fluidisation du lit de particules peut être réalisée par un courant ascendant de fluide, en l'occurrence la solution de substrat. Elle se produit lorsque la vitesse du fluide est suffisante pour mettre en suspension les particules de la masse d'enzyme immobilisée active.
Chacune de ces particules est alors entourée de fluide qui la préserve de tout frottement avec les autres particules, ainsi qu'avec les parois de la colonne.
La couche fluidisée, mélange hétérogène de particules solides et de fluide, se comporte macroscopiquement comme un liquide "homogène" .
On peut avoir recours au dispositif montré à la figure 2 et qui comprend les éléments suivants:
- une cuve thermostatée 1 d'une capacité de 50 litres, munie d'un système d'agitation 2 et contenant la solution de substrat,
- une pompe péristaltique 3 , par exemple du type Watson-Marlow,
- un manomètre à membrane 4,
- une masse 5 d'enzyme immobilisée active adsorbée sur dioxyde de titane, remplissant une colonne basse pression 13, par exemple de type VA 90500, - une canalisation 14 par laquelle la solution de substrat est acheminée à l'extrémité inférieure de la colonne 13 dans laquelle elle pénètre en 15 pour mettre en lit fluidisé la masse d'enzyme immobilisée active 5,
- une canalisation 15 par laquelle la solution de substrat est extraite en 17 à l'extrémité supérieure de la colonne après avoir traversé le lit fluidisé comprenant la masse d'enzyme immobilisée active 5, à la partie supérieure de la colonne 13 pour être recyclée vers la cuve 1.
Le manomètre situé à l'entrée de la colonne, à la partie inférieure de celle-ci, permet de mesurer la perte de
charge subite par le liquide à travers la colonne, sachant que la pression en sortie de celle-ci est négligeable étant donné les faibles débits fournis par la pompe péristaltique.
Le liquide est thermostaté au sein de la cuve 1. Là encore, les pertes restent faibles et l'ensemble du circuit atteint rapidement la température fixée.
EXEMPLE 2
Digestion de β 1-3 glucane à l'aide d'un lit fluidisé à base de β 1-3 glucanase immobilisée selon l'exemple 1.
10 litres de substrat à 1% de β 1-3 glucane, préalablement clarifiés par filtration à 2,7 μm, sont introduits dans la cuve thermostatée 1 dont la capacité est de 50 litres, sa hauteur étant de 47 cm et son diamètre de 39,5 cm.
Le thermostat est réglé à 56°C afin d'obtenir 40°C dans la cuve, température optimale de l'hydrolyse enzymatique.
La colonne 13 contient 3 grammes d'enzyme immobilisée active sur 500 g de dioxyde de titane préparée conformément à 1 ' exemple 1.
Une fois la température stabilisée, la pompe péristaltique est mise en route; la température varie peu ensuite car les pertes de chaleur dans la colonne et le circuit sont minimes . La migration, sous l'influence du substrat, de l'enzyme immobilisée active, vers le haut de la colonne 13 doit être réalisée de façon progressive afin d'éviter les turbulences. Celles-ci auraient pour effet de disperser les particules dans la colonne et favoriseraient leur migration hors de celle-ci . La pompe péristaltique est réglée à pleine puissance, ce qui permet de fluidiser l'enzyme immobilisée active sur une hauteur de 40 cm. Il occupe alors un volume "V gel" de 2,5 1. Le débit associé à un tel volume est de 28 1/h. Comparativement au procédé "lit fixe", la fluidisation permet de multiplier par 2,5 le temps de contact entre l'enzyme
immobilisée active et la solution de β 1-3 glucane.
En outre, elle optimise la cinétique de catalyse hétérogène par la formation d'une gaine de solution autour de chaque particule. Pour obtenir la digestion du β 1-3 glucane, chaque cycle dure en moyenne de 4 à 6 heures. L'activité de l'enzyme immobilisée active persiste dans ces conditions expérimentales pendant au moins 8 cycles.
On obtient ainsi 85 g d'oligo-β 1,3-glucanes répartis majoritairement entre DP 2 et DP 10.
Claims
1. Enzyme immobilisée active caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une enzyme quelconque, notamment choisie dans le groupe comprenant les osidases et en particulier la β 1-3 glucanase, les protéases et les lipases et immobilisée par fixation à l'aide d'une liaison covalente sur un complexe solide insoluble formé entre un oxyde minéral de préférence choisi dans le groupe comprenant notamment l'alumine, la zircone, la silice et le dioxyde de titane, et un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphonate par lequel il est lié à l'oxyde minéral et, d'autre part, un groupe chimique réactif, activé en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, ce groupe chimique réactif formant la liaison covalente avec l'enzyme.
2. Procédé de préparation d'une enzyme immobilisée active, caractérisé par le fait que l'on sélectionne
• une enzyme quelconque, de préférence dans le groupe comprenant les osidases et notamment la β 1-3 glucanase, les protéases et les lipases, un composé bi- ou polyfonctionnel comportant, d'une part, un groupe fonctionnel phosphonate et, d'autre part, un groupe chimique réactif capable, après activation en tant que de besoin par mise en oeuvre d'un agent activateur, de former une liaison covalente avec la susdite enzyme et
• un oxyde minéral en tant que support, de préférence choisi dans le groupe comprenant l'alumine, la zircone, la silice et le dioxyde de titane, et - que
• soit, dans une première étape, on fixe le composé bi- ou polyfonctionnel sur le support par son groupe reactionnel phosphonate en formant un complexe entre le composé et le support puis, dans une deuxième étape, on fait réagir le complexe ainsi formé avec l'enzyme de façon à créer une
liaison covalente entre l'enzyme et le groupe chimique réactif comporté par le composé bi- ou polyfonctionnel après avoir activé ce dernier en tant que de besoin, soit, dans une première étape, on constitue une phosphono-enzyme en faisant réagir le composé bi- ou polyfonctionnel avec 1 ' enzyme de façon à former une liaison covalente entre l'enzyme et le groupe chimique réactif, éventuellement après son activation, comporté par le composé bi- ou polyfonctionnel puis, dans une deuxième étape, on fixe la phosphono-enzyme ainsi formée sur le support par réaction de celui-ci avec le groupe reactionnel phosphonate du composé bi- ou polyfonctionnel .
3. Enzyme immobilisée active selon la revendication
1 , caractérisée par le fait que le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l ' un des groupes phosphates de formules
. O X
P O
OX
O X
- Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié ou ramifié en C± à C40 pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C^ à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs hétéroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
4. Enzyme immobilisée active selon l'une des revendi- cations 1 et 3, caractérisée par le fait que l'agent activateur est un composé chimique qui comporte une fonction capable de former une liaison covalente avec les fonctions amine ou acide carboxylique comportées par les enzymes, cet agent activateur étant mis à réagir avec ceux des composés bi- ou polyfonctionnels qui, à titre de groupe chimique réactif, comportent une fonction amine, alcool ou acide carboxylique.
5. Procédé selon la revendication 2 , caractérisé par le fait que le composé bi- ou polyfonctionnel est choisi dans le groupe de ceux présentant la formule générale
- X représente un atome d'hydrogène ou de métal alcalin,
- M représente X ou l'un des groupes phosphates de formules
-p— o — P C ι ox
OX
avec n variant de 1 à 100 000, et - Y, qui comporte au moins un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant les fonctions amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou ester, est soit un groupe alkyle linéaire ou ramifié ou ramifié en C^ à C40 pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe aryle ou polyaryle pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, soit un groupe alkylaryle ou arylalkyle dans lequel la partie alkyle est en C]_ à C40 et peut comporter, comme la partie aryle, un ou plusieurs hétéroatomes, étant entendu que, lorsque le groupe chimique réactif est différent des fonctions thiol et aldéhyde, il doit être activé par réaction du composé de formule (I) avec un agent activateur.
6. Application de l'enzyme immobilisée active selon l'une des revendications 1, 3 et 4 ou obtenue selon l'une des revendications 2 et 5, au traitement des milieux à l'égard desquels ladite enzyme développe les activités pour lesquelles elle est utilisée classiquement, notamment les transformations chimiques, les purifications ou la séparation de molécules organiques , organo-minérales ou minérales .
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106106854A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-11-16 | 南京工业大学 | 一种人乳替代脂的制备方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0218506A1 (fr) * | 1985-09-17 | 1987-04-15 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Procédé d'insolubilisation d'enzymes par fixation sur des complexes alumine-phosphates organiques et enzymes insolubilisées obtenues par ce procédé, nouveaux supports d'enzymes et leur procédé de préparation et application desdits enzymes insolubilisées |
| EP0273756A2 (fr) * | 1986-12-29 | 1988-07-06 | Aluminum Company Of America | Matériau actif utilisé comme adsorbant comprenant des particules d'un oxyde-hydroxyde de métal ayant réagi avec un ou plusieurs matériaux contenant du phosphore |
| GB2221466A (en) * | 1988-03-09 | 1990-02-07 | Aluminum Co Of America | Biologically reactive particles with biological, therapeutic and chromatographic applications |
| EP0443734A1 (fr) * | 1990-02-20 | 1991-08-28 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Fibres enrobées d'oxyde de zirconium |
| DE4309248A1 (de) * | 1993-03-23 | 1994-09-29 | Bernd Lorenz | Modifikation von Metalloxiden mit Polyphosphaten oder ähnlichen Verbindungen und ihre Anwendung |
| WO1997020216A1 (fr) * | 1995-11-27 | 1997-06-05 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Oxydes inorganiques modifies par voie organique au moyen d'oxydes inorganiques modifies par du silane |
| WO1997024421A2 (fr) * | 1995-12-29 | 1997-07-10 | The Procter & Gamble Company | Compositions detergentes comprenant des enzymes immobilisees |
-
1997
- 1997-12-31 FR FR9716800A patent/FR2773172B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-29 AU AU19721/99A patent/AU1972199A/en not_active Abandoned
- 1998-12-29 WO PCT/FR1998/002903 patent/WO1999035251A1/fr active Application Filing
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0218506A1 (fr) * | 1985-09-17 | 1987-04-15 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Procédé d'insolubilisation d'enzymes par fixation sur des complexes alumine-phosphates organiques et enzymes insolubilisées obtenues par ce procédé, nouveaux supports d'enzymes et leur procédé de préparation et application desdits enzymes insolubilisées |
| EP0273756A2 (fr) * | 1986-12-29 | 1988-07-06 | Aluminum Company Of America | Matériau actif utilisé comme adsorbant comprenant des particules d'un oxyde-hydroxyde de métal ayant réagi avec un ou plusieurs matériaux contenant du phosphore |
| GB2221466A (en) * | 1988-03-09 | 1990-02-07 | Aluminum Co Of America | Biologically reactive particles with biological, therapeutic and chromatographic applications |
| EP0443734A1 (fr) * | 1990-02-20 | 1991-08-28 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Fibres enrobées d'oxyde de zirconium |
| DE4309248A1 (de) * | 1993-03-23 | 1994-09-29 | Bernd Lorenz | Modifikation von Metalloxiden mit Polyphosphaten oder ähnlichen Verbindungen und ihre Anwendung |
| WO1997020216A1 (fr) * | 1995-11-27 | 1997-06-05 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Oxydes inorganiques modifies par voie organique au moyen d'oxydes inorganiques modifies par du silane |
| WO1997024421A2 (fr) * | 1995-12-29 | 1997-07-10 | The Procter & Gamble Company | Compositions detergentes comprenant des enzymes immobilisees |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106106854A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-11-16 | 南京工业大学 | 一种人乳替代脂的制备方法 |
| CN106106854B (zh) * | 2016-07-19 | 2019-10-29 | 南京工业大学 | 一种人乳替代脂的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2773172B1 (fr) | 2000-10-13 |
| AU1972199A (en) | 1999-07-26 |
| FR2773172A1 (fr) | 1999-07-02 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| AK | Designated states |
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| AL | Designated countries for regional patents |
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| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application | ||
| DFPE | Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101) | ||
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase | ||
| NENP | Non-entry into the national phase |
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