WO1999016881A1

WO1999016881A1 - Proteine antigenique et acide nucleique codant pour elle

Info

Publication number: WO1999016881A1
Application number: PCT/JP1998/004326
Authority: WO
Inventors: Kazutoh Takesako; Shigetoshi Mizutani; Masahiro Endo; Junko Ogawa; Takashi Okado; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1997-10-01
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 1999-04-08
Also published as: JPH11103862A; US20050276821A1; KR100567606B1; US7070793B1; EP1026245A4; CN1280620A; EP1026245A1; KR20010030880A

Description

9/16881

明細書抗原タンパク質及び該タンパク質をコードする核酸技術分野

本発明は、真菌による感染症やアレルギー疾患の予防、治療、診断に有用な力ンジダ ·アルビカンス（Candida albicans) 抗原タンパク質及びそれをコードする核酸に関する。さらに本発明は、該核酸を含有してなるベクター、及び該べク夕一によって形質転換されてなる形質転換体に関する。さらに本発明は、かかる形質転換体を培養する本発明の抗原夕ンパク質の生産方法に関する。さらに本発明は、本発明の抗原夕ンパク質又は核酸を含有する医薬組成物及び診断用組成物に関する。背景技術

カンジダ *アルビカンスはヒトの常在菌であるが、健常人は通常本菌の感染に対して抵抗性を示し、全身的感染症を起こすことはほとんどない。しかし、本菌は、健常人でも部分的な感染症を起こす場合があり、女性、特に妊婦においては膣カンジダ症を起こすことがある。一方、白血病等の癌を治療するため制癌剤の投与を受けた場合、臓器移植に伴う免疫抑制剤の投与を受けた場合、 A I D S感染を起こした場合等により免疫的易感染状態になったヒトでは、内臓を始めとする全身的な感染症を起こすことがある。更に本菌は、真菌の中では最も頻度の高いアレルゲンであり、アレルギー疾患の原因でもある。また殆どのヒトは常在菌であるカンジダ ·アルビカンスの免疫感作状態にあり、カンジダ ·アルビカンスの構成成分に対する抗体を有しており、また細胞性免疫を獲得している。

抗原となっているものの多くは、細胞表面のマンナン（mannan) 、グルカン（ glucan) 等の多糖を中心とする細胞壁構成成分であり、特にマンナン及びそのタンパク質との結合物が多い。またカンジダ ·アルビカンス感染患者又はアレルギ一疾患患者の血清中には上記細胞壁構成成分に対する抗体の他、細胞内成分であるエノラ一ゼ（enolase：)、 HSP90 (heat shock protein90)、ホスホグリセレートキナーゼ（phosphoglycerate kinase)、アルコールデヒドロゲナーゼ (alcohol dehydrogenase)に対する抗体等が検出されている。

カンジダ 'アルビカンス以外のカンジダ属真菌、例えばカンジダ' トロピカリス（C . tropical is) 、カンジダ，グラブラー夕（C . glabrata) 等も主として免疫的易感染宿主に感染症を起こす。カンジダ属真菌以外の真菌、例えばァスぺルギルス（Aspergillus ) 属、ぺニシリウム（Penici Il ium ) 属、アルタナリア (Alternaria) 属真菌も環境中に広く存在しヒトを始めとする哺乳類にとって非常に身近な存在である。これらの真菌の細胞増殖形態は酵母状もしくは菌糸状であるが、その細胞構造は基本的には類似しており、表層は全て厚い細胞壁に囲まれている。細胞壁構成成分の化学構造は真菌の種類によりある程度異なるが、マンナン、グルカン、キチン（chi tin) 等の多糖を主成分としている。また細胞壁に取り囲まれた細胞膜、細胞質内のタンパク質を始めとする構成成分も基本的には類似している。これらの真菌も多くのものが免疫的易感染宿主に感染症を起こしたり、アレルギーの原因となっている。

真菌が関与する疾患の病原因子やアレルゲンとして、いくつかの真菌由来の抗原分子が単離同定されている。これら抗原分子の単離同定には一般に真菌に対し感作状態にある哺乳類の血清を利用しており、同定されたこれらの抗原分子としては真菌の表層を取り巻く細胞壁構成成分が最も一般的である。該成分以外にも単離同定されている抗原分子は数多くあり、診断や治療を目的として研究されている。しかし、真菌感作状態において保有されている抗体に反応する抗原が全て感染症やアレルギー疾患において有効に働く抗原とは限らない。

本発明の目的はカンジダ ·アルビカンスを始めとする真菌による疾患の治療及び診断に有用な新規な抗原タンパク質を提供することにある。さらに本発明の目的は該抗原夕ンパク質をコードする核酸を提供することにある。さらに本発明の目的は、該核酸を含有してなるベクター、及び該ベクターによって形質転換されてなる形質転換体を提供することにある。さらに本発明の目的は、かかる形質転換体を培養する本発明の抗原タンパク質の生産方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、本発明の抗原タンパク質又は核酸を含有する医薬組成物及び診断用組成物を提供することにある。発明の開示

本発明者らは、マウス、ラット等のカンジダ'アルビカンス感染に感受性の哺乳類に対してカンジダ ·アルビ力ンス感染抵抗性を付与する方法について検討してきた。その結果、これらの哺乳類に対して、抗原としてカンジダ 'アルビカンス細胞を用い、不完全フロイントアジュバン卜のアジュバントと混ぜて免疫することにより強レ、感染抵抗性を獲得させることができることを明らかにした。そして、この感染抵抗性に C D 4陽性 T細胞が重要な働きを果たしていることを明らかにした。更に上記感染抵抗性を獲得した免疫感作状態にある哺乳類より得られた抗血清は、例えば市販の抗カンジダ血清である因子血清 N o . 1 (ャトロン製 ) に比べ、意外にも真菌細胞表層に存在する細胞壁由来成分には低い抗体価を示し、細胞壁を除去した真菌のプロトプラスト細胞由来の成分により高い抗体価を示した。

本発明者らは上記感染抵抗性を示す免疫感作状態にある哺乳類の血清中には真菌感染症に有効に働く抗体をより多く含有すると考え該血清に含有される抗体に着目し、該抗血清により認識される抗原タンパク質を探索した。即ち、カンジダ •アルビカンスの c D NAを基に、発現ライブラリーを作製し、ィムノスクリ一ニングにより探索した。その結果、大腸菌の組み換えタンパク質として 8種類の抗原タンパク質を見い出し、その D N Aを単離し、塩基配列を決定すると共に、塩基配列よりアミノ酸配列を決定し、本発明を完成させた。即ち、本発明の要旨は、

〔 1〕カンジダ ·アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識されることを特徴とする、抗原タンパク質、

〔2〕前記〔 1〕記載の抗原タンパク質と免疫学的に同等な抗原タンパク質、

〔 3〕カンジダ ·アルビ力ンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質をコードする核酸、

〔4〕前記〔3〕記載の核酸を含有してなるベクター、

〔5〕前記〔4〕記載のベクターによって形質転換されてなる形質転換体、

〔 6〕前記〔5〕記載の形質転換体を、前記〔3〕記載の核酸にコードされる抗原タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、カンジダ ·ァルビ力ンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質の生産方法、

〔7〕前記〔 1〕若しくは〔2〕記載の抗原タンパク質、又は前記〔6〕記載の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有することを特徴とする医薬組成物、

〔8〕前記〔 1〕若しくは〔2〕いずれか記載の抗原タンパク質、又は前記〔 6〕記載の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有することを特徴とする診断用組成物、

〔 9〕前記〔 3〕記載の核酸を含有することを特徵とする医薬組成物、

〔 1 0〕前記〔3〕記載の核酸を含有することを特徴とする診断用組成物、〔 1 1〕前記〔 1〕または〔2〕いずれか記載の抗原タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片、並びに

〔 1 2〕前記〔3〕記載の核酸に特異的に結合する核酸、

に関するものである。 1

図面の簡単な説明

第 1図は、 C. アルビカンスのリシル tRNAシンテターゼホモログ遺伝子と TPI ホモログ遺伝子由来の組み換えタンパク質を、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

1. 本発明の抗原タンパク質

本発明の抗原タンパク質は、カンジダ ·アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識されるタンパク質である。

本明細書において「カンジダ'アルビカンス感染抵抗性哺乳類」とは、カンジダ ·アルビカンス由来の抗原を免疫して感染抵抗性を獲得させた哺乳類であり、免疫前の致死量のカンジダ 'アルビカンス細胞（静脈内感染後 10日以内に死ぬ細胞数）を投与されても死ななくなつた状態の哺乳類である。

かかる哺乳類は、例えば次のようにして得ることができる。

カンジダ ·アルビカンス感染感受性の動物、例えば、 C57BL/6、 BAL B/c、 DB AZ2等のマウス、及び S P r ague— Dawl ey、 Wi s t a r等のラット等に対して、抗原としてカンジダ'アルビカンス生細胞、アジュバントとして細胞性免疫を強く誘導するために不完全フロイントアジュバント（ I FA) を用いた混合物を、皮下又は腹腔内に 1〜 2週間隔で少なくとも 2回投与し免疫する。このようにして免疫されて感染抵抗性を獲得した動物をカンジダ •アルビ力ンス感染抵抗性哺乳類とする。

本明細書において「カンジダ*アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清」とは、カンジダ .アルビカンス感染抵抗性哺乳類から得られる抗血清である。かかる抗血清としては、例えば、カンジダ，アルビカンス感染抵抗性哺乳類において、最終免疫後 1〜2週後に採血したものを用いることができる。このような抗血清は、好ましくは哺乳類としてマウス、更に好ましくは 5週令以上の C 5 7 B L/ 6 , B A L BZ c又は D B AZ 2を用い、これに例えば 1 x 1 0 ⁵ 〜 1 X I 0 ⁸ 個の生きた細胞を I F Aと混ぜ、得られた混合物を用いて約 1週間隔で 2回以上免疫し、その後 1週〜 1 ヶ月経過以降に得られる抗血清である。本発明において使用される抗血清は、真菌細胞の細胞膜成分及び細胞内分子に対して高い抗体価を示すものである。これに対し、一般的に使用される抗カンジダ抗血清は、感染抵抗性哺乳類由来のものではなく、表層の細胞壁の構成成分、例えばマンナンやマンナンタンパク質に対して高い抗体価を有しており、本発明における抗血清とは異なる。

なお本発明において使用できるカンジダ ·アルビカンス細胞としては特に限定されるものではなく、例えば、カンジダ 'アルビカンス T I MM 1 7 6 8株、力ンジダ ·アルビカンス AT C C 1 0 2 3 1株等が挙げられる。

本明細書において、「抗血清により認識される」とは、抗血清中に含まれる抗体成分と結合することを意味し、通常、この結合を測定するために使用されるィムノブロッティングゃ E L I S A、免疫沈降法等の免疫学的手法によりその抗原を検出及び Z又は定量できる。抗原と抗体の結合は、通常、 4 °C〜室温で適当な溶液中やゲル内又は抗原固定化プレート上で実施する。

これらの抗原タンパク質は、哺乳類において、カンジダ ·アルビカンスに代表されるカンジダ菌による感染や他の真菌感染に対する感染防御免疫を誘導するためのワクチン用の抗原として、また感染の有無や進行状態を診断するための抗原として有用である。また、カンジダ，アルビカンスに代表される真菌を原因とするアレルギー疾患の予防、治療や診断のための抗原として有用である。また、力ンジダ ·アルビカンスはヒトの常在菌であるため、殆どのヒ卜の免疫細胞（リンパ球、マクロファージ等）がカンジダ ·アルビカンス由来の抗原タンパク質に対して各種サイトカイン遊離、免疫細胞の活性化等の免疫反応を起こす。

即ち、本発明の抗原タンパク質はインターフェロン 7、インターロイキン 4等の有効な免疫調節物質を遊離させたり、活性化させるための抗原として有用である。また本発明の抗原タンパク質は生体内診断の目的で、個体に対し、例えば、吸入誘発試験、皮膚テスト、鼻や眼の粘膜試験における抗原性成分として使用することが出来る。更に実験室診断、例えば、抗原抗体反応である凝集反応、沈降反応、中和反応、標識抗体法を用いた診断法、ヒスタミン遊離試験、リンパ球幼若化試験、白血球遊走阻止試験等における抗原性成分にも使用することができる o

本発明の抗原夕ンパク質としては、カンジダ ·アルビ力ンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識されるタンパク質又はボリべプチドであれば特に限定されない。かかるタンパク質又はボリペプチドは、例えば、カンジダ.アルビカンス c D NAのライブラリー発現物に対する、カンジダ ·アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清を用いたィムノスクリ一ニングにより得ることができる。なお本明細書における「タンパク質」とは生物体の主要構成成分を意味し、ポリベプチド鎖からなるものを示す。また本明細書におけるポリべプチドとは複数のァミノ酸がぺプチド結合によって結合したものを意味し、構成ァミノ酸の数は特に限定されない。また本明細書におけるポリペプチドは、アミノ酸のみから構成される単純ポリぺプチド又はァミノ酸以外の構成成分を含む複合ポリぺプチドのいずれであってもよい。更に本明細書で「融合タンパク質」なる語を使用するが、これは 2つ以上のタンパク質の一部又は全部が結合したタンパク質又はボリペプチドを意味する。

本発明の抗原タンパク質の具体例としては、例えば、以下のポリペプチドが挙げられる。

(A— 1 ) 配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリぺプチド、

(A— 2 ) 配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、 1 個以上、例えば 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたァミノ酸配列を有するポリぺプチド、 (A— 3 ) 配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のいずれかを有する核酸にコ一ドされるポリぺプチド、

(A— 4 ) 配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のいずれかにおいて、 1 個以上、例えば 1若しくは複数個の塩基が欠失、置換、揷入又は付加された塩基配列を有する核酸にコードされるポリペプチド。

また、本発明においては、前記抗原タンパク質と免疫学的に同等なタンパク質も包含する。

ここで、配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドはそれぞれ、カンジダ'アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清を用いてのィムノスクリーニングにより得られる、カンジダ ·アルビカンス T I MM 1 7 6 8株の c D NAライブラリー由来のものである。また、ィムノスクリーニングにおいては大腸菌を宿主とする発現ライブラリーを用いた場合、ポリべプチドは単純ポリペプチドとして発現されている。従って、抗カンジダ血清中に多く含まれる糖鎖に対する抗体の影響を除き、ポリぺプチド部分に対する抗体により抗原タンパク質をスクリーニングしたことになる。

配列表の配列番号： 1に示されるァミノ酸配列からなるポリべプチドは 2 4 8 ァミノ酸よりなり、サッカロミセス ·セレピシェのトリオースホスフエ一トイソメラーゼ (triosephosphate isomerase ； T. Alber and G. Kawasaki, Journal of Molecular and Appl ied Genetics, Vol. 1, 419-434 (1982) ) とホモロジーを有する。カンジダ ·アルビカンス培養菌体から単離されたタンパク質の N末端アミノ酸配列解析結果によると、 N末のメチォニンは脱離していることから、抗原タンパク質として利用しやすい部分は少なくとも配列表の配列番号： 1の 2〜 2 4 8番目の領域の中に存在すると思われる。更に、ホモロジ一解析の結果も合わせ考えると、配列表の配列番号： 1に示されるポリペプチドはカンジダ ·アルビカンスのトリオースホスフェートイソメラーゼの全長構造であると判断される配列表の配列番号： 2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは 1 32 アミノ酸よりなり、サッカロミセス ·セレピシェのリシル t RNAシン夕一ゼ（ 5 90アミノ酸よりなる； M. irande and J. P. Walker, Journal of Biologic al Chemistry, Vol, 263, 18443-18451 (1988)) の N末端付近の領域（アミノ酸番号： 1 0〜 1 3 7) とホモロジ一を有する。

配列表の配列番号： 3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは 54 8 アミノ酸よりなり、このポリペプチドの 2 6 0〜54 6番目の部分がサッカロミセス ·セレピシェの第 3染色体の YCR 0 3 0 C (8 70アミノ酸よりなるタンパク質をコードする； M. R. Red et al., Yeast, Vol. 7, 533-538 (1991) ) の配列番号： 3の 5 2 3〜8 6 8番目の領域とホモロジ一を有する。

配列表の配列番号： 4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは 1 75 アミノ酸よりなり、サッカロミセス 'セレピシェの EGD 2 ( 1 74アミノ酸よりなる； . Johnston et al., Science, Vol. 265, 2077-2082 (1994) ) とホモロジーを有する。

配列表の配列番号： 5に示されるァミノ酸配列からなるポリべプチドは 8 8ァミノ酸よりなり、サッカロミセス 'セレピシェの ATP シンターゼデルタ鎖（2 44アミノ酸よりなる； J. Velours et al. , European Journal of Biochemistr y, Vol. 170, 637-642 (1988) ) の C末付近の領域（アミノ酸番号： 1 5 8〜2 42) とホモロジ一を有する。

配列表の配列番号： 6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは 264 アミノ酸よりなり、サッカロミセス .セレピシェの BMH 2 (272アミノ酸よりなる； G. P. H. von Heusden et al. , European Journal of Biochemistry, V ol. 229, 45-53 (1995) ) とホモ口ジーを有する。

配列表の配列番号： 7に示されるァミノ酸配列からなるポリべプチドは 224 アミノ酸よりなり、サッカロミセス ·セレピシェのリポソ一厶 YL 8タンパク質 ( 24 3アミノ酸よりなる； K. izuta et al., Nucleic Acids Res.， Vol. 20, 1011-1016 (1992) ) とホモロジ一を有する。

配列表の配列番号： 8に示されるアミノ酸配列からなるボリペプチドは 1 1 5 アミノ酸よりなり、配列番号： 8の 4 6番目〜 C末部分がサッカロミセス ·セレピシェの Y N L 0 8 3 w ( 4 9 4アミノ酸よりなる； A. Soler - Mira et al. , Ye ast, Vol. 12, 485-491 (1996)) の 2 8 4〜3 5 3番目の部分とホモロジ一を有する。

配列表の配列番号： 9に示されるァミノ酸配列からなるボリべプチドは公知の H S P 7 0 S S Bタイプのポリペプチドであり、ゥサギ抗カンジダ血清により認識される抗原タンパク質として発見されたものである。全長は 6 1 3アミノ酸であり、配列番号： 9の 2 8 0番目〜 C末端（3 3 3アミノ酸）よりなるポリべプチドが抗原タンパク質として得られている [V. Maneu et al. . Yeast, Vol . 13, 677-681. ( 1997) ] 。

一方、本発明においては、配列表の配列番号： 9に示されるアミノ酸配列に係る c D N Aにおいて、発現物のィムノスクリ一二ングの結果が陽性の c D N Aは 4種類得られており、これらは配列表の配列番号： 9に示されるアミノ酸配列中、 3 2 0番目〜 C末端（2 9 4アミノ酸）、 4 5 2番目〜 C末端（ 1 6 2ァミノ酸）、 4 9 6番目〜 C末端（ 1 1 8アミノ酸）、 5 1 3番目〜 C末端（ 1 0 1ァミノ酸）をコードするものである。従って、 C末側の少なくとも 1 0 0アミノ酸の長さのボリべプチドが抗原性の発現に重要であると考えられる。このことから、前記 4種のタンパク質を含め C末端側の少なくとも 1 0 0アミノ酸を含む約 1 0 0〜2 9 4アミノ酸を有するポリペプチドは本発明の抗原タンパク質に包含される。即ち本発明の配列表の配列番号： 9にされるアミノ酸配列において、 N 末から 3 1 9〜5 1 2アミノ酸の長さのアミノ酸が除かれたポリペプチドも本発明における抗原タンパク質に包含される。

本発明においては、カンジダ *アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、配列表の配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのそれぞれにおいて、 1個以上、例えば 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも本発明の抗原タンパク質に包含される。ここで複数個とは、数個乃至それ以上の個数を言う。例えば、配列番号： 1及び配列番号： 2に示される抗原タンパク質は N末端には T 7夕グを含むぺプチドが付加された融合夕ンパク質として得られており、このような抗原性に無関係のぺプチドが付加されたタンパク質又はポリぺプチドも本発明の抗原タンパク質に包含されるが、 T 7夕グ部分が欠失したものも本発明の抗原タンパク質に包含される。また、前記のように配列番号： 9に示されるアミノ酸配列において、 N末端側から約 3 1 9〜5 1 2アミノ酸を欠失させたポリべプチドも欠失させた例として挙げられるが、これも本発明における抗原タンパク質に包含される。

また、本発明においては、カンジダ ·アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、配列表の配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列の一部からなるポリべプチドも本発明の抗原タンパク質に包含される。さらに、カンジダ ·アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、その一部からなるァミノ酸配列において 1個以上、例えば 1若しくは複数個のァミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも本発明の抗原タンパク質に包含される。また、さらに前述のようなこれらの本発明の抗原夕ンパク質に抗原性に無関係のぺプチドが付加された夕ンパク質又はボリペプチドも本発明の抗原タンパク質に包含される。

配列表の配列番号： 1〜 9に示されるァミノ酸配列の一部からなるポリぺプチドは、例えば、配列表の配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列からなる抗原タンパク質を原料として、リシルエンドペプチドダーゼ、トリプシン等のプロテァ一ゼを用いた酵素消化による切断後、又は臭化シアン等による化学的処理による切断後、目的の抗原性を有するぺプチド断片を夕ンパク質の精製における既知の方法により単離精製すること等により得ることができる。更に、上記の方法等により得られたポリべプチドの化学構造に関する情報を基に、ぺプチド合成技術を利用しての化学合成による製造も可能である。また該ボリぺプチドのァミノ酸配列をコ一ドする核酸を用いて遺伝子工学的に製造することも可能である。

ァミノ酸配列において 1個以上、例えば 1若しくは複数個のァミノ酸の欠失、置換、揷入又は付加を行う手法としては、モレキュラークローニング：ァラボラトリーマニュアル第 2版（ 1 9 8 9年、コールドスプリングハーバーラボラトリ一発行、 T. マニアテイスら編集）等に記載されている、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。

配列表の配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列はそれぞれ、配列番号： 1 〜 9に示されるァミノ酸配列からなるポリべプチドをコ一ドする核酸の配列の例である。従って、本発明においては、カンジダ *アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識されるタンパク質又はポリぺプチドであつて、配列表の配列番号： 1 0〜 1 8に示される塩基配列のそれぞれからなる核酸にコードされるポリべプチドを本発明の抗原タンパク質に包含する。

該核酸は発現ライブラリーのィムノスクリーニングにより得られる抗原タンパク質を発現する c D N Aであるが、該 c D N Aは遺伝子全長若しくは部分塩基配列よりなる。例えば、配列表の配列番号： 1 0および配列番号： 1 5に示される塩基配列は抗原タンパク質遺伝子の全長であり、配列表の配列番号： 1 1、配列番号： 1 2、配列番号： 1 3、配列番号： 1 4、配列番号： 1 6、配列番号： 1 7および配列番号： 1 8に示される塩基配列は抗原タンパク質遺伝子の部分配列である。例えば、配列番号： 1 8記載の核酸にコードされる H S P 7 0 S S B夕イブ由来の抗原タンパク質は、上記の最も小さい抗原タンパク質、例えば、配列表の配列番号： 9に示されるアミノ酸配列の 5 1 3番目〜 C末の 1 0 1アミノ酸からなるポリペプチドの場合、配列番号： 1 0の 5 8 0〜8 8 2番目の塩基配列にコードされている。従って、抗原性の高い部分をコードする組み換え D N Aは配列表の配列番号： 1 0の 5 8 0〜8 8 2番目の塩基配列を含有するように設計することが好ましい。

また本発明においては、カンジダ *アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、配列表の配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のそれぞれにおいて、 1個以上、例えば 1若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸にコードされるポリぺプチドも本発明の抗原タンパク質に包含する。ここで複数個とは、数個乃至それ以上の個数を言う o

このように、塩基配列において 1個以上、例えば 1若しくは複数個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加を行うためには、公知の種々の遺伝子工学的手法、例えば、ギャップド ·デュプレックス法 [Wi lfried, K. et al.， Nucleic Acids Rese arch, Vol. 12, 9441-9456(1984) ] 、デレージヨン法 [Celeste, Y. P. et al. , ethods in Enzymology, Vol. 154, 367-382(1987)] 、ゥラシル D NA法 [Thomas , A. K. et al. , Gene, Vol. 34. 315-323 (1987) ] やカセット変異法 [James, A. W.， et al. , Gene. Vol. 34, 315-323(1985) ] 等を利用すれば良い。

また、カンジダ'アルビカンスの変異株、近縁種（例えばカンジダ' トロピカリス等のカンジダ属真菌）、サッカロミセス .セレピシェ以外の他の真菌由来の夕ンパク質であって、本発明の抗原夕ンパク質と免疫学的に同等の性質を有するタンパク質又はポリべプチドも本発明の抗原タンパク質に包含される。本明細書における「免疫学的に同等の性質を有するタンパク質」とはアミノ酸配列或いは糖鎖などの修飾は異なるが、配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかを有する本発明の抗原夕ンパク質により免疫された哺乳類由来の抗血清に含有される抗体で認識されるタンパク質又はポリペプチドを意味する。

なお、抗原としての安定性の強化及び Z又は所望の反応性の強化、即ち治療に用いる場合、個体防御免疫能の誘導強化や、アレルギー反応の減弱化又は酵素活性の消失を目的として、また診断に用いる場合、抗原と抗体との特異的結合の強化を目的として、本発明の抗原タンパク質を改変して誘導体としてもよい。改変法としては、例えば、ピリジルェチル化、還元、アルキル化、ァシル化、適当な単体への化学的カップリング、温和なホルマリン処理、又は塩酸グァニジン処理が挙げられる。誘導体の作製法としては、例えば、ポリエチレングリコール（P E G) 法 [Wie et al.， Int. Arch. Al lergy Appl. Immunol. , Vol. 64, 84 -99 , (1981)] を用いて P E Gと結合させてもよい。

2. 本発明の核酸

本発明の核酸は、カンジダ ·アルビ力ンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原夕ンパク質をコードする核酸である。

かかる核酸は、例えば本発明の抗原タンパク質と同様に、カンジダ 'アルビ力ンスの c D NA発現ライブラリーを作製し、カンジダ 'アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清によるィムノスクリ一ニングを行うことにより得ることができる。また、カンジダ ·アルビカンスのゲノムライブラリー又は c D NAライブラリ一を作製し、本発明の抗原夕ンパク質のァミノ酸配列の一部をコードすると推定されるオリゴヌクレオチドをプローブとする該ライブラリーのスクリーニングによって得ることもできる。

本発明の核酸は、哺乳類において、カンジダ 'アルビカンスを始めとするカンジダ菌による感染や他の真菌感染に対する感染防御免疫を誘導するためのワクチン用の抗原遺伝子として、また、カンジダ，アルビカンスを始めとする真菌を原因とするアレルギー疾患の予防、治療や診断のための抗原遺伝子として有用である。

本発明の核酸の具体例としては、例えば、以下のような核酸が挙げられる。

( B— 1 ) 配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリぺプチドをコ一ドする核酸、

( B— 2 ) 配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、 1 個以上、例えば 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたァミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする核酸、

( B— 3 ) 配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のいずれかを有する核酸

( B— 4 ) 配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のいずれかにおいて、 1 個以上、例えば 1若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸、

( B - 5 ) ( B— 1 ) 〜（B - 4 ) いずれか記載の核酸または該核酸に相補的な核酸に、ストリンジエントな条件下でハイプリダイズする核酸。

ここで、核酸としては D NA又は R N Aのいずれでも良い。

配列表の配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列はそれぞれ、配列番号： 1 〜9に示されるァミノ酸配列からなるポリべプチドをコ一ドする核酸の配列の例である。

なお遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（3つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに 1〜 6種類ずつが存在することが知られている。したがって、あるアミノ酸配列をコードする核酸には、そのアミノ酸配列にもよるが、多数の種類が存在し得る。核酸は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。核酸上に起こった変異がそこにコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、かかる変異を有する核酸は、変異前の核酸と同じアミノ酸配列をコードする異なる核酸といえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコ一ドする核酸が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じァミノ酸配列をコードする多種類の核酸ができていく可能性は否定できない。さらに同じァミノ酸配列をコードする多種類の核酸を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。

例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコ一ドする本来の D N A上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものである場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているァミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主での使用頻度の高いものに人為的に変換することにより、目的夕ンパク質の高発現を図ることが行われている（たとえば特公平 7— 1 0 2 1 4 6号公報等）。このように特定のァミノ酸配列をコードする多種類の核酸は人為的に作成可能なことは言うまでもなく、自然界においても作成され得るものである。

このことから、本明細書における（B— 1 ) に示される、配列番号： 1〜9に示されるァミノ酸配列のそれぞれからなるポリべプチドをコ一ドする核酸は、（ B— 3 ) に示される配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のそれぞれからなる核酸に限定されるものではない。

従って、本発明においては、その発現物がカンジダ，アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、配列表の配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のそれぞれにおいて、 1個以上、例えば 1若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸も本発明の核酸に包含される。ここで複数個とは、数個乃至それ以上の個数をいう。

例えば、配列表の配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列を有するそれぞれの抗原夕ンパク質の抗原性を保持したまま、前記タンパク質の一部を適当に脱離させたタンパク質、及び N末端または C末端に、例えば T 7ファージ由来のタンパク質、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、グルタチオン一S—トランスフェラ一ゼ、 S—ガラクトシダ一ゼ等の他のポリべプチドが付加された抗原タンパク質の融合タンパク質をコードする、配列表の配列番号： 1 0〜1 8に示される核酸の誘導体である核酸も本発明の核酸に含まれる。

さらに、（B— 1 ) 〜（B— 4 ) のいずれかに示される核酸または該核酸に相補的な核酸に、ストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする核酸であって、カンジダ 'アルビ力ンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原夕ンパク質をコードする核酸（即ち、（B— 5 ) の核酸）も本発明の核酸に包含される。かかる核酸は次のようにして検出することができる。

即ち、対象となる核酸を固定したメンブレンを 0. 5重量％SDS、 0. 1重量％ゥシ血清アルブミン（BS A) 、 0. 1重量％ポリビニルピロリドン、 0. 1重量％フイコール 4 0 0、 0. 0 1重量％変性サケ精子 DNAを含む 6 XSS C ( l xSSCは 0. 1 5M Na C K 0. 0 1 5M クェン酸ナトリウム、 pH7. 0を示す）中で、 5 0°Cにて 1 2〜20時間、プローブとともにインキュべ一卜する。インキュベーション終了後、 0. 5重量％SDSを含む 2 XSS C中、 37。Cでの洗浄から始めて、 33(：濃度は0. 1 XSSCまでの範囲で、また、温度は 5 0°Cまでの範囲で変化させ、固定された核酸由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プロ一ブの検出を行う。このような条件で対象の核酸が検出された場合、該核酸を「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸」とする。ここで用いるプロ —ブとしては、（B— 1) 〜（B— 4) に示される核酸または該核酸に相補的な核酸の一部である。

このような核酸には、例えば、カンジダ 'アルビカンスの変異株や近縁菌（例えばカンジダ ' トロピカリス等のカンジダ属真菌）の有する、（B— 1) 〜（B — 4) に示される核酸または該核酸に相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイプリダイズ可能な核酸であって、免疫学的に同等な抗原性を有するタンパク質をコードする核酸等が挙げられる。

また、本発明の核酸は、配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリペプチドをコードする核酸、あるいは配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、 1個以上、例えば 1若しくは複数個のァミノ酸が欠失、置換、揷入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸において、その変異型、対立遺伝子、相同遺伝子、コドンの縮重が伴う核酸も、その発現物がカンジダ 'アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、本発明の核酸に包含される。さらに、本発明の核酸としては、カンジダ ·アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質をコードする核酸、例えば、（B— 1)〜（B— 5) に示される核酸に特異的に結合する核酸も挙げられる。ここでの、本発明の核酸は公知の蛍光物質や放射性物質によりラベルされていてもよい。該核酸は、ハイプリダイゼーションによるカンジダ ·アルビカンス抗原タンパク質遺伝子の検出に用いるプローブや DNAポリメラ一ゼを用いる DNA増幅方法におけるプライマーとして利用可能である。

3. 本発明のベクター、形質転換体

本発明のベクターは、本発明の核酸を含有してなるベクターである。このようなベクターは、本発明の核酸を、大腸菌等の宿主に安定に保持させることができる。かかるベクターの構築に用いられるベクターとしては、例えば pUC 1 1 8 、 pWH5、 pTV 1 1 8、 pSCREEN- 1 b等が挙げられるが、本発明の核酸が挿入でき、発現可能なベクターであれば特に限定されない。また、適当な発現ベクターにつなぎ、発現用組み換え DNAとすることもできる。配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列を有する核酸は、 pSCREEN— 1 bにつなぎ、発現用組み換え DNAとして大腸菌に導入し、本発明に使用された。核酸をべクタ一に挿入する方法は特に限定されるものではなく、 T 4 DNAリガーゼを用いる方法等の公知の方法を用いることができる。

本発明の形質転換体は、本発明のべクターによつて形質転換されてなるものである。このような形質転換体は、本発明のベクターを宿主に導入することにより得られる。宿主としては、大腸菌、バチルス属等の細菌、サッカロミセス 'セレピシェ等の酵母、ァスペルギルス属、ピキア ·パストリス等の真菌の他、昆虫細胞、 COS— 7、 Ve r 0細胞等の動物細胞を用いることができる。ベクタ一を宿主に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、 CaC l ₂ 法、 D EAEデキストラン法、エレクトロポーレーシヨン法等の公知の方法が挙げられる。かかる形質転換体は、例えば用いたベクタ一の選択マーカーを指標とすることにより選択することができ、また、例えば該形質転換体より抽出した核酸と本発明の核酸を特異的に検出可能なプローブを用いたハイプリダイゼ一シヨンにより、所望の核酸が導入されていることを確認することができる。

このような形質転換体は本発明の核酸を調製する際に、及び本発明の抗原夕ンパク質を調製する際に利用することができる。

4. 本発明の抗原タンパク質の生産方法

本発明の、カンジダ 'アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質の生産方法は、本発明の形質転換体を、本発明の核酸にコードされる抗原タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする。培養条件としては特に限定されるものではなく、例えばベクターとしてラムダファージベクタ— _{A S}CREEN— 1と Phage Make r™ Sy s t e m Phage Pack Ex t r a c t 〔共にノヴァジェン（N o v a g e n)社製〕を用いて得られる形質転換体の場合、選択圧としてのアンピシリンを含む LB培地で培養し、適当な時期に I PTG (イソプロピル一チォー — D— ガラクトシド）による発現誘導をかければよい。他のベクタ一及び宿主を用いて得られた形質転換体においても、適当な選択圧をかけた培地中でタンパク質の発現に適した条件で培養すればよい。このように培養して目的のタンパク質を発現させる。

発現されたタンパク質又はポリべプチドは、当該分野で知られる公知のタンパク質の精製方法により回収、精製することができる。また、得られたタンパク質又はポリペプチドの抗原性の有無は、例えば、ィムノブロッテイング法、 EL I S A又は免疫沈降法などの免疫学的手法により確認することができる。

また本発明の抗原夕ンパク質は、遺伝子工学的手法を用いて得られる本発明の形質転換体から生産してもよく、カンジダ ·アルビカンス培養物から公知のタンノヽ'ク質精製方法によって得てもよい。

5 . 本発明の医薬組成物及び診断用組成物

本発明の医薬組成物及び診断用組成物は、 1 ) 本発明の抗原タンパク質、又は本発明の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有するもの、及び 2 ) 本発明の核酸を含有するものである。

1 ) 本発明の抗原タンパク質、又は本発明の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有する医薬組成物及び診断用組成物

本発明の医薬組成物及び診断用組成物には、哺乳類において、カンジダ 'アルビカンスを始めとするカンジダ菌による感染や他の真菌感染に対する感染防御免疫を誘導するためのワクチン、また感染の有無や進行状態を判断するための診断用組成物が包含される。更に、カンジダ'アルビカンスを始めとする真菌を原因とするアレルギー疾患の予防、治療や診断に用いられる組成物が包含される。また、カンジダ 'アルビカンスはヒトの常在菌であるため、殆どのヒトの免疫細胞 (リンパ球、マクロファージ等）がカンジダ ·アルビカンス由来の抗原タンパク質に対して各種サイトカイン遊離、免疫細胞の活性化等の免疫反応を起こす。即ち、本発明の医薬組成物及び診断用組成物にはインタ一フロン 7、インタ一口ィキン 4等の有効な免疫調節物質を遊離させたり、活性化させるための組成物も包含される。

感染防御免疫を誘導するための組成物は、より強レ、体液性及び Z又は細胞性免疫を得るために、本発明の抗原タンパク質を下記のようなアジュバントを含む懸濁液又は溶液とした製剤として用いられることが一般的である。アジュバントは、普通、抗原性成分と共に投与されるが、抗原性成分を投与する前または後に与えてもょレ、

哺乳類のワクチン接種に適当なアジュバントとしては、フロイント（F r e u n d ' s ) の完全または不完全アジュバント；水酸化アルミニウム、みょうばん等の無機物ゲル；リゾレシチン、ジメチルォクタデシルアンモニゥムブロマイド等の界面活性剤；硫酸デキストラン、ポリ I C等のポリア二オン；ムラミルぺプチド、タフトシン等のぺプチド： R i b i社製のモノホスフォリルリピド A (M P L ) ；コレラトキシンの Bサブユニットがあるが、これらには限定されない。抗原はリボソームまたは他のマイクロキヤリア一に取り込ませて投与することができる。当然、いくつかの異なる抗原タンパク質を混合して用いることも可能でめる。

アレルギー疾患の予防、治療や診断のための組成物は、本発明の抗原タンパク質を適当な塩溶液や懸濁液の形にして用いれば良い。場合によりポリエチレングリコールゃフヱノールが添加されていても良い。更に上記のようなアジュバントを含む懸濁液又は溶液としてもよい。アジュバントは、普通、抗原と共に投与されるが、抗原投与の前または後に与えてもよい。抗原はまたリボソームまたは他のマイクロキヤリア一に取り込ませて投与することができる。

本発明の医薬用組成物は、所望により各種の添加剤を配合されていてもよく、またその剤型も種々の剤型である事ができる。かかる添加剤としては、所望剤型を形成するための調剤用添加剤類を挙げることができる。これらの添加剤類の例としては、例えばァスコルビン酸、ピオチン、パントテン酸カルシウム、ナイァシン等の栄養剤；メタリン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム（第 1、第 2、第 3 塩）、ピロリン酸ナトリゥム等の隠蔽剤；ソルビン酸カルシウム、安息香酸等の保存料、ァラビヤゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、マンニット、ソルビトール、乳糖、果糖、可溶性澱粉、アミノ酸類、葡萄糖、砂糖、蜂蜜、脂肪酸エステル他の添加剤類又は希釈剤類を挙げることができる。

本発明の医薬用組成物は、経口又は非経口投与することができ、例えば、散剤、顆粒、ペレット若しくは錠剤、コーティング剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤等の経口投与に適した剤型；注射剤、点滴剤、坐剤、点眼剤、点募剤、噴霧剤などの非経口投与に適した剤型にすることができる。本発明の医薬組成物を特にワクチンとして使用する場合、安定剤として適当な濃度のヒト血清アルブミン、ゼラチン、アミノ酸類等、防腐剤として適当な濃度のフヱノール、チメロサール等を必要に応じ添加してもよい。また、該医薬用組成物は液状製剤として用いてもよく、凍結乾燥を行なうことにより乾燥製剤として用いてもよい。乾燥製剤は使用に際して適当な溶剤、例えば注射用蒸留水などで懸濁して用いてもよい。

医薬組成物の投与方法としては、経口、経粘膜（鼻、膣等）、経皮（皮下または皮内）的に、または静脈内に投与すればよい。代表的な投与量は、タンパク質量として、 0 . 0 1 〜 5 . O m gZk g体重の範囲が好ましく、 l g 〜 1 0 0 z gZk g体重の範囲がより好ましいが、必要に応じて、投与量を増加したり、投与回数を増大させればよい。

生体内診断の目的で、個体に対し、例えば、吸入誘発試験、皮膚テスト、鼻や眼の粘膜試験で使用する診断用組成物は、本発明の抗原タンパク質を凍結乾燥粉末、若しくは適当な塩溶液や懸濁液の形にしたものが挙げられ、ポリエチレングリコールやフエノールが添加されていてもよい。パッチテストには、白色ヮセリンを基剤としてラウリル硫酸ナトリゥム等の界面活性剤を添加したものに本発明の抗原タンパク質を混合すればよい。また、 I g E抗体価測定用の抗原として使用する際には、ペーパーディスク、セルローススポンジ、マイクロプレート等の固相体に上記抗原夕ンパク質を固定化して使用することができる。

2 ) 本発明の核酸を含有する医薬組成物及び診断用組成物

本発明の医薬組成物及び診断用組成物は、哺乳類において、カンジダ*アルビカンスを始めとするカンジダ菌による感染や他の真菌感染に対する感染防御免疫を誘導するためのワクチン、また、カンジダ*アルビカンスを始めとする真菌を原因とするアレルギー疾患の予防、治療や診断に用いることができる。感染防御やアレルギー疾患の治療のために用いる場合、本発明の核酸を哺乳類細胞内で発現可能となるように、適当なプロモーターの下流に本発明の核酸を含んでいるプラスミドをそのまま、又はレトロウイルスやアデノウイルスに入れ、適当な塩溶液や懸濁液の形とする。また本発明の核酸をリボソームまたは他のマイクロキヤリア一に取り込ませたり、適当なポリカチオン系脂質に混合してもよい。

前記核酸は、細胞内への移行性または細胞内での安定性を高めることができる化学的修飾を含んだものを用いてもよい。前記化学修飾としては、例えば、ホスホロチォェ一ト、ホスホロジチォエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデ一トなどの誘導体があげられる。

本発明の医薬組成物の投与方法としては、筋肉内、皮下、静脈内、経口、直腸内、経皮、経鼻、舌下、腹腔内等に投与すればよい。代表的な投与量は、核酸量として 0 . 0 1 g〜 1 O m g/ k g体重の範囲が好ましく、 l g 〜5 m g Z k g体重の範囲がより好ましいが、必要に応じて、投与量を増加したり、投与回数を増大させればよい。

6 . 本発明の抗体又は抗体断片

本発明の抗体は、本発明の抗原タンパク質に特異的に結合する抗体である。ここで、抗体としては、本発明の抗原タンパク質に特異的に結合する限り、抗体断片をも包含する。

本発明の抗体は常法により得ることができ、ポリクローナル抗体でも、モノク口一ナル抗体のいずれでもよい。また、本発明においては、本発明の抗原タンパク質に特異的に結合する単鎖抗体であってもよい。該抗体又は抗体断片は、カンジダ ·アルビカンス或いはその類縁菌による感染症における真菌の検出や、カンジダ ·アルビカンス或いはその類縁菌によるアレルギー疾患におけるアレルゲン同定等に利用可能である。

本発明の抗体又は抗体断片を、感染症における真菌の検出、アレルギー疾患におけるアレルゲン同定等に用いる場合、公知の蛍光物質や放射性物質によりラベルされていてもよい。また、本発明の抗原タンパク質の精製等に使用することもできる。この場合、例えば、本発明の抗体又は抗体断片を担体などに固定化することにより、本発明の抗原夕ンパク質の精製を一層容易に精製することが可能になる。

7 . 本発明の抗原タンパク質をコ一ドする核酸に特異的に結合する核酸

本発明の抗原タンパク質をコ一ドする核酸に特異的に結合する核酸は、ハイブリダイゼーシヨンによる本発明の抗原タンパク質をコードする核酸の検出に用いるプローブや D N Aポリメラ一ゼを用いた D N A増幅方法による検出等に用いるプライマーとして利用可能である。本発明の抗原夕ンパク質をコードする核酸に特異的に結合する核酸は、抗原タンパク質をコードする核酸のセンス側またはァンチセンス側いずれかに結合するものが含まれる。該核酸は公知の蛍光物質や放射性物質によりラベルされていてもよい。実施例

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例 1 . 感染抵抗性の誘導及び C D 4陽性 T細胞の感染抵抗性への関与

1 ) 感染抵抗性の誘導

カンジダ 'アルビカンス（C . アルビカンス） T I MM 1 7 6 8をサブロー

•デキストロース培地で一晩振とう培養し、細胞を遠心で回収、生理食塩水で洗浄した。得られた細胞を 1 X 1 0 ⁶ 、 1 X 1 0 ⁷ 、 1 X 1 0 ⁸ 個 Zm 1 となるように生理食塩水に懸濁した。各々の懸濁液に等量の I F A (フロイン卜の不完全アジュバント）を加えて混合し、この混合物を C57BL Z6 マウスに一匹当たり 0. 1 m lずつ皮下接種して、カンジダ生細胞でマウスを免疫した。一週間後、上記と同様に調製したカンジダ生細胞を同量ずつ皮下接種し、マウスをさらに免疫した。即ち、一匹のマウスに対して、 5 X 1 0⁴ 個、 5 X 1 0⁵ 個、又は 5 X 1 0 ⁶ 個のカンジダ生細胞で二回免疫したことになる。対照として、カンジダ生細胞の懸濁液の代わりに生理食塩水を用いて、該生理食塩水と等量の I F Aを混合したものを一週間隔で二回皮下接種により投与した。

二回目の免疫の一週間後、全ての免疫マウス及び対照マウスに、サブロー 'デキストロ一ス培地で培養して得られた C. アルビカンス TIMM 1768細胞を 2. 5 X 1 0⁶ 個ずつ静脈内に投与して感染させた。感染後、 30日間マウスの生死を観察した。結果を表 1に示す。

投与物 1回当りの平均生存日数 30曰後生存数

投与量（個）土標準偏差 /"使用マウス数生理食塩水 4.0 土 1.4 0/5

生菌

表 1より、上記投与量で対照マウス（非免疫マウス）は全例 1 0日以内に死亡したが、免疫マウスは明らかに感染抵抗性を獲得していることが分かつた。

2) CD 4陽性 T細胞による感染抵抗性の獲得

5 X 1 0⁸ 個のカンジダ 'アルビカンス生細胞を用いて、上記 1 ) と同様の方法で一週間の間隔で二回免疫された BALBZc マウスに対して、最終免疫後 23日目、 26日目、及び 29日目の計 3回、抗 CD 4抗体（ATCC T I B 207 より調製）又は抗 CD 8抗体（ATCC T I B 1 05より調製）を一匹当り 0. 3 mgずつ腹腔内に投与した。最終免疫後 2 9日目にサブロー ·デキストロース培地で培養して得られた C. アルビカンス TIMM 0136細胞を 1 x 1 0⁵ 個ずっ静脈内に投与した。対照として、非免疫マウス、及び免疫をするが抗体を投与しないマウスを用意し、これらにも同様に C. アルビカンス TI讀 0136細胞を 1 X 1 0⁶ 個ずつ静脈内に投与した。その投与後 7日目に腎臓内の生残 C. アルビカンス細胞数を測定した。

抗 CD 4抗体及び抗 CD 8抗体は常法に従い、ハイプリドーマを s c i dマウス腹腔に注射しハイプリドーマを増殖させた腹水より精製した。また得られた抗体はフローサイトメーター（オルソダイァグノスチック社製）により各細胞が除かれていることを確認した。

その結果、抗 CD 4抗体の投与により腎臓内の菌数の抑制が有意に阻害され、感染抵抗性に C D 4陽性 T細胞が重要な役割を果たしていることが明らかとなつた。実施例 2. 感染抵抗性哺乳類の血清の採取とその性質、及び各種吸収血清の作製

1 ) 感染抵抗性哺乳類の血清の採取

実施例 1— 2) と同様の方法で、アジュバントに CFA (フロイントの完全ァジュバント） 5 1 0⁶ 個の（：. アルビカンス TI園 1768生細胞で 3回免疫された BALBZc マウスより、最終免疫後 7日目に常法により血清を採取した。このものを抗カンジダ血清とした。

2 ) 感染抵抗性哺乳類の血清の性質

実施例 2— 1 ) で得られた抗カンジダ血清の性質を検討した。

まず抗原成分として C. アルビカンス細胞壁画分（CW) 、細胞質画分（HS S) 、細胞膜画分（LSP) を調製した。

C. アルビカンス TIMM 1768 のサブロー寒天斜面培養物の一白金耳分を 5 m l の YPD培地（イーストエキストラクト 1重量％、ポリペプトン 2重量％、グルコ —ス 2重量を入れた試験管に植菌した。 30°Cで 24時間振とう培養後、その培養液 50 t Lを、 YPD培地 500 m lを入れた 2 L容三角フラスコに植菌し、 35^eCで一晩振とう培養した。この 2 L容三角フラスコを合計四つ用いて培養した。

得られた約 2Lの培養液（約 7 x 1 0⁷ 細胞 Zm l ) から、 2,000 xg、 10分間の遠心により細胞を集めた。細胞を 500 m 1の滅菌水で 2回洗浄後、 500 m 1の SSB溶液（0.8 M ソルビトール入り 50 ID リン酸緩衝液（pH 7.5) ) で 1回洗浄した。細胞を約 500 m 1の SSB溶液に懸灝後、 100 m EDTA入り SSB溶液を 70m

1、そして 2-メルカプトエタノールを 1 m 1加え、緩やかに振とうした。続いて、この懸濁液に、 1 m lあたり 3. 3mgのザィモリエース 2 0 T (生化学工業社製）を含有する SSB溶液を 70m l加え、 35°Cで 1時間緩やかに振とうした。さらに、 1 m 1あたり 1 2 mgのトリコデルマ ·ライジングェンザィム（シグマ社製）を含有する SSB溶液を 70m 1加え、 35°Cで 1時間緩やかに振とうした。得られた懸濁液を 2,000 xg、 10分間の遠心にかけ、プロトプラスト細胞を集めると共に、上清を細胞壁画分（CW) とした。

上記の様にして得られたプロトプラスト細胞に滅菌生理食塩水を 140 m 1加え

(この懸濁液 l m lあたりプロトプラスト細胞は約 1 X 1 0⁹ 個）、充分攪拌した後、氷上に 10分間静置した。プロトプラスト細胞がバーストしたことを確認後、 10,000xg、 30分間遠心し、得られた沈殿を不溶性画分（LS Pという）とした。遠心上清をさらに 100， 000 xg、 60分間遠心し、その結果得られた遠心上清を可溶性画分（HSSという）とした。 LSPを 1 4 0m 1の生理食塩水に懸濁後、超音波処理し、さらに沸騰水浴下、 5分間加熱処理して殺菌し、膜タンパク質等を含有する LSP抗原液とした。また、 CWについても同様に超音波処理、加熱処理を行って CW抗原液を得た。なお HSSについては、そのままの液を H SS抗原液とした。

上記のようにして得られた LSP抗原液のタンパク質濃度は 2.3 mg/m l、 HS S抗原液のタンパク質濃度は 3.5 mgZm l、 CW抗原液のタンパク質濃度は 2 . l mgZm lであった（タンパク質量は BSA を標準としてビシンコニン酸（BC A ) 試薬により定量した）。抗原成分として得られた CW抗原液、 LSP抗原液、 HSS抗原液を、各々のタンパク質濃度が 10 g 1 となるように PBS で希釈後、ィムノ 'モジュール [ヌンク（Nunc) 社製] に 50 z lずつ加え、 4°Cにー晚放置し、各ィムノ，モジユールをそれぞれの抗原でコーティングした。 1重量％牛血清アルブミンを入れた PBS溶液で、コーティングされたィムノ ·モジュールのブロッキング処理を行つた。次いで、 60倍に希釈した抗カンジダ血清又はコントロール血清をィムノ · モジュールに 50 1加え、 37°Cで 1時間ィンキュベートした後、パーォキシダーゼ標識抗マウス I gG抗体（2000倍希釈）と 37°Cで 1時間インキュベートした。インキュベート後、 PBS で洗浄し、次いで基質溶液を加えた。 15分後、 405nmでの吸光度を測定した。該吸光度が高いほど抗原を認識する抗体量が多い、即ち抗原に対する抗体価が高い事を示す。その結果を表 2に示す。なお、上記コント口一ル血清は生菌の代わりに生理食塩水を用いて該生理食塩水と等量の C F Aを混合したものを 1週間隔で 3回皮下接種により投与したマウスの血清より調製した

表 2

吸光度

抗原画分

抗カンジダ血清コントロール血清

CW 0. 0 1 3 0. 0 0 6

LSP 0. 0 5 1 0. 0 0 6

HSS 0. 2 3 7 0. 0 0 6 表 2より明らかなように、抗カンジダ血清は HSSに対する抗体価が最も高いが、 LSPに対しても抗体価を有していることが明らかとなった。 CWに対する抗体価は低かった。

実施例 3. C. アルビカンス cDNA発現ライブラリ一による抗原タンパク質のスクリ一二ング

1 ) C. アルビカンスの cDNA発現ライブラリーの作製

C. アルビカンス TI M1768株の cDNA発現ライブラリーを作製するため、菌体より全 RNAを抽出、精製した。すなわち、上記の菌を 200 m l YPD培地で 35 'C で培養後、遠心（20 0 Orpm、 5分間）により菌体を回収し、一度蒸留水で洗浄した。菌体を液体窒素により急速凍結し、乳鉢により凍結菌体を粉末状に破砕した。この菌体粉末より、 RNA ェクストラクシヨンキット [フアルマシア（Ph a rma c i a) 社製） ] を用いて全 RNAを回収、精製した。この全 RNAからオリゴテックス一 dT 30くスーパ一 > (宝酒造社製）を用いて、ボリ（A) + RNAを調製した。 cDNA合成キット（宝酒造社製）を用いて、ポリ（A) + R NA5 zgから cDNAを合成した。合成された c DNAをラムダファージべク夕一； ISCREEN-1 [ノヴァジヱン（Novagen ) 社製] と連結した後、 Phage Maker ™ System P agePack Extract (ノヴァジェン社製）によりインビトロパッケ一ジングを行い c DNAライブラリーを構築した。

2) C. アルビカンス生細胞免疫による抗カンジダ血清と認識する抗原タンパク質のィムノスクリ一ニング

C. アルビカンス生細胞免疫による抗血清と反応するタンパク質を発現しているファージクローンをィムノスクリーニングにより検出した。なお、ファージべクタ一； ISCREEN-1を用いて作成された c DNAライブラリ一において、その c D N Aは T 7夕グ配列等を含むぺプチドとの融合タンパク質または c D N A内の翻訳開始コドンから始まるポリペプチドとして発現した。

すなわち、 cDNAライブラリーを宿主大腸菌 BL21(DE3)pLysE株に接種し、トップァガロース（0. 7重量％ァガロースを含む LB培地）と混合後、 2 XYT (1.6重量％パクトトリプトン、 1重量％イーストエキストラクト、 0.5 重量％ NaCl ) プレート上に重層し、 37°C、 6時間培養することにより、ファージブラークを形成させた。生じたプラーク上にナイロンメンブレン [Hyb on d— N、アマシャム（Ame r s ham) 社製] を重ね、 4てで一夜静置した後、 3 7°Cで 4時間保温した。メンブレンをプレートから剝がし、 PBST (組成は 1 0 OmM NaC l, 1 0 mMリン酸バッファ一 ρ H 7. 5， 0. 1 %Twe e n 20) で 1 0分間洗浄した後、そのメンブレンを適当量のブロックエース（大日本製薬社製）に浸すことによりブロッキングした。一夜室温で放置後、このメンブレンを実施例 2— 1 ) で調製した抗カンジダ血清（5 00倍希釈液）と 3 時間室温でインキュベートした。インキュベート後洗浄し、次いでバーオキシダーゼ標識抗マウス I gG抗体（ 1 ひ 00倍希釈）と 1時間室温でインキュベートした。インキュベート後洗浄し、次いで SuperSignal Substrate Western Blotti ng [ピアス（Pierce) 社製] により発光させ、抗カンジダ血清と反応するファージプラークを検出した。

5 X 1 0⁴ 個のプラークをスクリーニングした結果、抗血清と反応するファージプラークは 1 0 0〜1 5 0個存在した。これらのうち、特に強く反応したブラ —クに注目し、さらにクローニングを行った。クローニングされたファージを宿主大腸菌 BM25.8株に接種することにより、大腸菌内でォ一トマチックサブクローニングがおこり、ファージ DNA に存在する cDNAを含む領域がプラスミド DN Aへ自動的にサブクロ一ニングされた。このプラスミドを含む大腸菌からプラスミドを精製し、 cDNAの塩基配列を決定した。塩基配列の解析の結果、 2クロ —ンはサッカロミセス ·セレピシェ（S. セレピシェ）のトリオ一スフォスフエ一トイソメラ一ゼ (triosephosphate isomerase ) とホモロジ一を有する新規遺伝子であり、全長の c DN Aを有していた。さらに、 S. セレピシェのリシル t RNAシンテタ一ゼ（lysy卜 tRNA synthetase ) と S. セレピシェの第 3染色体の DNA 9 8とホモロジ一を有する新規遺伝子もそれぞれ 1 クローン存在した。これらの cDNAはそれぞれの遺伝子の一部分を含んでおり、この領域内に抗血清と反応する抗原決定基が存在していることが明らかとなった。上記の新規遺伝子である s. セレピシェのトリオースフォスフエ一トイソメラーゼホモログ遺伝子、 S. セレピシェリシル t RNAシンテターゼホモログ遺伝子及び S. セレピシェ第 3染色体の DNA 9 8のホモログ遺伝子の塩基配列は各々配列表の配列番号： 1 0、配列番号： 1 1、配列番号： 1 2に示す通りであり、この塩基配列よりこれらの核酸は各々配列表の配列番号： 1、配列番号： 2、配列番号： 3に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。

3) 吸収抗カンジダ血清による C. アルビカンス抗原タンパク質のスクリーニング

C. アルビカンス生細胞免疫血清由来の吸収抗血清を用いて、上記 1 ) 記載の cDNAライブラリ一より C. アルビカンス抗原タンパク質のィムノスクリー二ングを行った。すなわち、抗カンジダ血清と HSSと CWを 1 : 1 : 1 (vZv /v) に混合した溶液を作製し、これを吸収抗血清とした。

この吸収抗血清を用いて、実施例 3— 2) と同様の方法により抗原分子のスクリーニングを行った。用いた抗血清は、吸収抗血清の 50 0倍希釈液である。この抗血清と反応するファージプラークについて、さらにクローニングを行った。クローニングされた c DNAの塩基配列の解析の結果、 1 クローンは S. セレビシェの E G D 2遺伝子とホモロジ一を有する新規遺伝子をほとんど全長含んでおり、 1クローンは ATP シンターゼデルタ鎖（ATP synthase delta chain) とホモロジ一を有する新規遺伝子の一部分であることが明らかとなった。得られた塩基配列情報を各々配列表の配列番号： 1 3、配列番号： 1 4に示す。また、この塩基配列は各々配列表の配列番号： 4、配列番号： 5に示したアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドしている。

また、既知の HSP 70 SSBタイプの cDNAの一部分を含むクローンが 4クローン得られ、各々 C末側の 294アミノ酸、 1 62アミノ酸、 1 1 8アミノ酸、 1 0 1アミノ酸をコードしている c DNAであった。この結果、 HSP 7 0 SSBタイプ抗原は、 C末側の 1 1 8アミノ酸の領域内に抗血清と反応する抗原決定基が存在していることが明らかとなった。最も長い 2 9 4アミノ酸をコードする HSP 7 0 S SBタイプ遺伝子の塩基配列、及び該塩基配列から推定されるアミノ酸配列は各々配列番号： 1 8、配列番号： 9に示す通りである。次に、 HSSを加えて得られた吸収抗血清に対しては陽性であるが、 HSSと CWを加えて得られた上記の吸収抗血清に対しては陰性のファージプラークが存在していたので、これらプラークの c DNAを上記 2) と同様の方法により解析した。 2クローンが S. セレピシェの BMH 2遺伝子とホモロジ一を有する新規遺伝子を全長含んでおり、 1クローンは S. セレピシェのリボソームタンパク質の L 7遺伝子とホモロジ一を有する新規遺伝子をほとんど全長含んでいた。 1クローンは S. セレピシェの YNL 0 8 3W とホモロジ一を有する新規遺伝子の一部分 ( 1 1 5アミノ酸）を含んでいた。

これらの新規遺伝子である S. セレピシェの BMH 2ホモログ遺伝子、 S. セレピシェのリボソームし 7タンパク質ホモログ遺伝子、 S. セレピシェの YNL 0 8 3W ホモログ遺伝子の塩基配列は各々配列表の配列番号： 1 5、配列番号： 1 6 、配列番号： 1 7に示す通りであり、この塩基配列よりこれらの遺伝子は各々配列表の配列番号： 6、配列番号： 7、配列番号： 8に示したアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドしている。実施例 4. C. アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清に認識される抗原タンパク質の製造

実施例 3— 2) 及び 3— 3) において得られた cDNAは、 S. セレピシェの YNL 0 8 3 W とホモロジ一を有する遺伝子以外は全て、融合タンパク質として発現していた。 YNL 0 8 3W とホモロジ一を有する遺伝子は c DN A内の開始コドン（ATG) よりポリペプチドを発現していた。融合タンパク質の発現を示す一例としてトリオースフォスフエ一トイソメラーゼ（TP I ) とホモロジ一を有する遺伝子と、リシル t RNAシンテクーゼとホモロジ一を有する遺伝子より発現されるボリべプチドを明らかにした。

すなわち、実施例 3— 2) において得られた TPI とホモロジ一を有する遺伝子を含むプラスミド、及びリシル t RNAシンテターゼとホモロジ一を有する遺伝子を含むプラスミドを、それぞれ大腸菌 BL 21 (DE 3) pLysSへ形質転換し、形質転換体を得た。これらの形質転換体をアンピシリンを含む LB培地に植菌し、 37°Cで 3. 5時間培養した。 I PTG (イソプロピル— 1一チォー —D—ガラクトシド）を終濃度 ImMとなるように添加し、さらに 2. 5時間培養を続けた。培養液を遠心し菌体を回収、洗浄後、菌体を 30 1の 1 xSDS サンプルバッファーに懸濁した。 100 で、 5分間加熱処理した後、遠心し、その上清の一部分を SDS—ポリアクリルアミドゲル（12.5%ゲル）電気泳動にかけ、ポリペプチドの発現を確認した。

発現する融合タンパク質の予想分子量は TPI ホモログが 63kDa (TPI ホモログ 27 kDa+T7タグ領域 36 kD a) で、リシル t RN Aシンテターゼホモログは 50 kD a (リシル t RNAシンテターゼホモログ 14 kDa+T7夕グ領域 36 kDa) である。これらの融合タンパク質は予想された分子量のポリぺプチドとして発現していることが第 1図より明らかとなった。

第 1図のレーン 1におけるサンプルはリシル tRNAシンテ夕一ゼホモログ遺伝子を導入した形質転換体の発現誘導前（IPTG添加前）、レーン 2におけるサンプルは誘導後（IPTG添加後）より得られたポリペプチドである。レーン 3におけるサンプルは TPI ホモログ遺伝子を導入した形質転換体の発現誘導前、レーン 4におけるサンプルは誘導後より得られたポリペプチドである。産業上の利用可能性

本発明の抗原タンパク質は力ンジダ ·アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清に認識される抗原であり、カンジダ 'アルビカンス感染の治療及び診断に有用である。また、本発明の核酸は本発明の抗原タンパク質をコードするものであり、カンジダ 'アルビカンス感染の治療及び診断に有用である。

Claims

請求の範囲

1 . カンジダ ·アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識されることを特徴とする、抗原タンパク質。

2 . 抗原タンパク質が、

(A— 1 ) 配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するボリぺプチド、

(A— 2 ) 配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、 1 個以上のァミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたァミノ酸配列を有するポリぺプチド、

(A— 3 ) 配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のいずれかを有する核酸にコードされるポリペプチド、又は

(A— 4 ) 配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のいずれかにおいて、 1 個以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸にコードされるポリべプチドである、請求項 1記載の抗原タンパク質。

3 . 請求項 1又は 2記載の抗原タンパク質と免疫学的に同等な抗原タンパク質

4 . カンジダ ·アルビ力ンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質をコ一ドする核酸。

5 . 核酸が、

( B— 1 ) 配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するボリペプチドをコードする核酸、 (B— 2) 配列番号： 1〜9に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、 1 個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、

(B- 3) 配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のいずれかを有する核酸

(B- 4) 配列番号： 1 0〜1 8に示される塩基配列のいずれかにおいて、 1 個以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸、又は

(B— 5) (B— 1 ) 〜（B— 4) いずれか記載の核酸または該核酸に相補的な核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸である、請求項 4記載の核酸。

6. 請求項 4又は 5記載の核酸を含有してなるベクタ一。

7. 請求項 6記載のベクタ一によつて形質転換されてなる形質転換体。

8. 請求項 7記載の形質転換体を、請求項 4又は 5記載の核酸にコードされる抗原タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、カンジダ*ァルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質の生産方法。

9. 請求項 1〜 3いずれか記載の抗原タンパク質、又は請求項 8記載の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有することを特徴とする医薬組成物。

1 0. 請求項 1〜3いずれか記載の抗原タンパク質、又は請求項 8記載の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有することを特徴とする診断用組成物。

1 1 . 請求項 4又は 5記載の核酸を含有することを特徴とする医薬組成物。

1 2 . 請求項 4又は 5記載の核酸を含有することを特徴とする診断用組成物。

1 3 . 請求項 1〜3いずれか記載の抗原タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片。

1 4 . 請求項 4又は 5記載の核酸に特異的に結合する核酸。