WO1999014345A2 - Arzneimittel zur therapie einer manifesten lyme-borreliose - Google Patents

Arzneimittel zur therapie einer manifesten lyme-borreliose Download PDF

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of Lyme disease and a vaccine against Lyme disease, as well as a method for obtaining an active substance for treating Lyme disease and a method for obtaining a vaccine for Lyme disease.
  • Lyme disease is a tick-borne infectious disease caused by Spirochete Borrelia burgdorferi.
  • the disease is a chronic progressive infection that affects many organs, such as the skin, central and peripheral nervous system, heart, liver, kidney, musculoskeletal system, and joints.
  • Various symptoms such as acute arthritis and neuroborreliosis, can disappear spontaneously, but usually recur episodically.
  • Spirochetes have been isolated from untreated patients repeatedly, and there are numerous signs of persistent infections even after antibiotic therapy. Since reliable treatment of this disease through therapy with antibiotics is therefore difficult, great efforts are made to research the pathogen itself and the host's immune response to infection with B. burgdorferi.
  • a high titer of antibodies against B. burgdorferi is usually found in the course of the infection, but this does not provide any protection against the infection.
  • OspA outer surface lipoprotein A
  • B. burgdorferi could be an effective vaccine for the prophylaxis of Lyme disease (EP 0 41 8 827).
  • Laboratory studies in mice have shown that extensive protection against a disease in infection can be obtained by OspA-specific antibodies (Schaible et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1 990), 3768-3772) .
  • these antibodies are only effective if they are present at the time the pathogen is transmitted.
  • One reason for this could be that OspA is mainly expressed on spirochetes in ticks, but is no longer expressed after transmission to a mammalian host.
  • OspA-specific antibodies can be used to prevent the transmission of the disease, but are ineffective and therefore unsuitable for therapeutic applications for the treatment of the outbreak.
  • Recent studies show that after active immunization with recombinant OspC, mice could be protected against a tick-borne infection (Preac-Mursic et al., Infection 20 (1 992), 342-349; RD Gilmore et al., Infect. Immun. 64 (1,996), 2234-2239).
  • the immunization protocol used there does not lead to the elimination of infectious spirochetes from the vector, as has been shown by OspA-specific antibodies.
  • the invention was therefore based on the object of providing a medicament for the treatment of Lyme disease.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of Lyme disease which is characterized in that it comprises as an active ingredient an antibody which is specific for the 24 kDa antigen (OspC) from B. burgdorferi.
  • OspC 24 kDa antigen
  • the pharmaceutical composition for the treatment of Lyme disease preferably comprises, as an active ingredient, an antibody which is specific for the 24 kDa antigen (OspC) from B. burgdorferi and which is shown in SEQ ID NO. 2 sequence shown.
  • FIG. 1 shows a Western blot analysis of NMS and IS, which were used for passive immunization of C. B.-1 7 scid mice.
  • Lane 1 shows a standard of mouse mAbs against Hsp70 (70 kDa), Hsp60 (60 kDa), Flagellin (41 kDa), OspB (34 kDa), OspA (31 kDa), OspC (24 kDa), pLA7 (20 kDa) and p7.5 (7.5 kDa).
  • Lane 2 NMS collected from naive BALB / c mice.
  • Lane 3 Polyclonal immune serum, formed in BALB / c mice, immunized with rLip-OspA in ABM2 adjuvant.
  • Lane 4 Polyclonal IS generated in BALB / c mice immunized with rOspC in ABM2 adjuvant as described herein.
  • burgdorferi-specific (IgG) and OspC-specific antibodies (IgM and IgG) in sera from individual mice were determined by ELISA using either whole cell lysates (B. burgdorferi strain ZS7) or rOspC (ZS7) Substrates examined.
  • the data represent the mean of individual serum samples examined (AKR / N and C57BL / c: 10 mice / group; BALB / c: 7 mice; A).
  • Correlation between serum levels of total B. Burgdor feri-specific IgG antibodies, OspC-specific IgG antibodies (day 23 pi) and the ability to recultivate spirochetes from ear tissue (day 90 pi) were analyzed by correlation assay (B).
  • FIG. 3 shows the DNA sequence and the protein sequence of the 24 kDa antigen (OspC) from B. burgdorferi (SEQ ID NO. 2)
  • FIG. 4 shows the construction of the plasmid pG OspC-ZS, which contains the OspC gene.
  • mice were subcutaneously (sc) with 1 ⁇ 10 3 low-passage (two to four in vitro passages) organisms B. burgdorferi of the strain ZS7 (Schaible et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1 990), 3768-3772) vaccinated in the tail.
  • a B. burgdorferi strain ZS7, a glutathione-S-transferase OspC fusion protein (rOspC) was prepared using known techniques (R. Wallich et al., Infect. Immun. 64 (1,995), 3327-3353).
  • mice were inoculated with either 10 ⁇ g rLip-OspA or 10 ⁇ g rOspC in 1 00 / vl ABM2 adjuvant (Sebak, Aldenbach, Germany) and injected twice with the same antigen preparation
  • the immune serum was collected over a period of approximately 2 months after the last refreshment and contained the following concentrations of OspA or OspC-specific antibodies (Ak), as with an ELISA using rLip-OspA or rOspC as Substrate was determined: Anti-OspA IS, 3.2 mg / ml or Anti-OspC IS, 300 / yg / ml.
  • Normal mouse serum (NMS) was collected from naive BALB / c mice. The specificities the immune sera and NMS generated were verified by Western blot analysis.
  • Serum antibodies against B. burgdorferi OspA or OspC were quantified by a solid phase ELISA as described in the prior art (Kramer et al., Immunobiol. 1 81 (1 990), 357-366), 1 ⁇ g / ml total cell lysate B. burgdorferi, strain ZS7, rLip-OspA (ZS7) or rOspC (ZS7) were used as substrates.
  • Western blot analysis was carried out as described in the prior art (MM Simon et al., J. Infect. Dis. 1 64 (1 991), 1 23-1 32) using a total cell lysate from B. burgdorferi Strain ZS7 performed as an antigen preparation.
  • mice 6-8 week old female CB-17 scid mice were injected intraperitoneally (ip) with either an OspA or an OspC-reactive polyclonal immune serum 1 hour before infection. Control mice received 100 // I NMS. For infection, the mice were injected into the tail with 1 ⁇ 10 3 B. burgdorferi ZS7 organisms.
  • scid mice were first infected with 1 ⁇ 10 3 ZS7 spirochetes (sc), and then they were repeatedly administered (four times at 3 to 4 day intervals) different amounts of polyclonal immune serum, which was either OspA or Ospc specific (ip), starting on day 1 0, 1 9 or 60 after infection (pi).
  • the animals were evaluated for the development of clinical arthritis in the tibiotarsal joints observed.
  • the hardness of arthritis in the right and left tibiotarsal joints was assessed as follows: 4- 4-, severe; + moderately difficult; ⁇ , mild swelling; ( ⁇ ), redness; -, no clinical signs.
  • mice were examined for the presence of spirochetes by culturing ear tissue samples, following the procedure described in the prior art (Sinsky et al., J. Clin. Microbiol. 27 (1 989), 1 723- 1 727).
  • mice were sacrificed at the times indicated after the infection.
  • the tibiotarsal joint, the heart, the liver and the muscles adjacent to the tibiotarsal joint were fixed in 10% formaldehyde, embedded in paraffin and stained with hematoxylin and eosin.
  • the inflamed lesions were rated as follows: 4- 4- 4-, very severe; 4- 4-, difficult; 4-, moderate; ⁇ , mild; -, no.
  • OspC-specific IgM antibodies were first detectable on the 4th day after the infection, peaked on the 1st day after the infection and then decreased to baseline values on the 24th day after the infection. OspC-specific IgG antibodies were first observed on day 1 pi with a peak on day 23 pi (maximum values for AKR / N, C57BL / 6: about 8 // g / ml; BALB / c: about 3 ⁇ g / ml).
  • Antibody titers in AKR / N and C57BL / 6 mice decreased over time, but remained at detectable levels (approximately 3 // g / ml) up to 90 days pi.
  • BALB / c mice formed lower levels of OspC-specific IgG antibodies in the early phase of infection, but serum titers increased over time after infection.
  • mice that received immune serum that either for OspC or OspA (3 ⁇ g specific antibodies / mouse) 1 hour before infection showed no pathological changes in any of the four organs when examined on day 45 pi.
  • mice that received an immune serum directed against OspC (10 ⁇ g specific antibodies / mouse) on the 10th or 19th day after the inoculation showed, if at all, only slight inflamed lesions in joints, heart, liver and muscle.
  • immune serum directed against OspA (10 ⁇ g specific antibody / mouse) had no effect on the development or progression of inflammation in the affected organs (day 1 9 pi).
  • OspC-GST fusion protein Production of OspC-GST fusion protein and purification of rec.
  • OspC-GST Cleavage of OspC-GST using thrombin and purification.
  • four OspC-GST protein preparations were digested with thrombin protease overnight and OspC from GST via a glutation Seph. 4B column separated.

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Abstract

Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Lyme-Krankheit umfasst als Wirkstoff einen Antikörper, der spezifisch für das 24kDa-Antigen (OspC) von B. burgdorferi ist, vorzugsweise einen Antikörper, der spezifisch für das 24kDa-Antigen (OspC) von B. burgdorferi mit der in SEQ ID NO. 2 dargestellten Sequenz ist.

Description

Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Lyme-Krankheit und einen Impfstoff gegen die Lyme- Krankheit sowie ein Verfahren zur Gewinnung eines Wirkstoffes zur Behandlung der Lyme-Krankheit und ein Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffs gegen die Lyme-Krankheit.
Die Lyme-Borreliose ist eine von Zecken übertragene Infektionskrankheit, die durch Spirochete Borrelia burgdorferi hervorgerufen wird. Die Krankheit ist eine chronische progressive Infektion, die viele Organe, wie etwa die Haut, das zentrale und periphere Nervensystem, das Herz, die Leber, die Niere, das muskuluskelettale System und Gelenke befällt. Verschie- dene Symptome, wie etwa akute Arthritis und Neuroborreliose, können spontan verschwinden, treten jedoch zumeist episodisch wieder auf. Spirocheten wurden wiederholt aus unbehandelten Patienten isoliert, und es gibt zahlreiche Anzeichen für persistente Infektionen selbst nach einer Therapie mit Antibiotika. Da eine zuverlässige Behandlung dieser Krank- heit durch Therapie mit Antibiotika deshalb schwierig ist, werden große Anstrengungen unternommen, den Erreger selbst und die Immunantwort des Wirts auf Infektion mit B. burgdorferi zu erforschen. Bei den von der Lyme-Krankheit betroffenen Presonen wird zwar zumeist ein hoher Titer an Antikörpern gegen B. burgdorferi im Verlauf der Infektion festgestellt, der aber keinen Schutz gegen die Infektion bewirkt.
Es wurde festgestellt, dass das äußere Oberflächenlipoprotein A (OspA) von B. burgdorferi ein wirksamer Impfstoff für die Prophylaxe der Lyme- Erkrankung sein könnte (EP 0 41 8 827) . Laboruntersuchungen an Mäu- sen haben gezeigt, dass ein weitgehender Schutz gegen eine Erkrankung in Infektion durch OspA-spezifische Antikörper erhalten werden kann (Schaible et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 ( 1 990), 3768-3772) . Diese Antikörper sind jedoch nur wirksam, wenn sie zur Zeit der Übertragung des Erregers vorliegen. Ein Grund hierfür könnte sein, dass OspA hauptsächlich auf Spirocheten in Zecken exprimiert wird, nach ihrer Transmission auf einen Säugerwirt jedoch nicht mehr exprimiert wird. Folglich können OspA-spezifische Antikörper zwar verwendet werden, um die Übertragung der Krankheit zu verhindern, sind aber wirkungslos und somit ungeeignet für therapeutische Anwendungen zur Behandlung der ausgebrochenen Krankheit. Kürzliche Untersuchungen zeigen, dass nach aktiver Immunisierung mit rekombinantem OspC Mäuse gegen eine Zecken-übertragene Infektion geschützt werden konnten (Preac-Mursic et al. , Infection 20 ( 1 992), 342-349; R.D. Gilmore et al., Infect. Immun. 64 ( 1 996) , 2234-2239) . Das dort verwendete Immunisierungsprotokoll führt jedoch nicht zur Eliminierung von infektiösen Spirocheten vom Vektor, wie durch OspA-spezifische Antikörper gezeigt wurde.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Arzneimittel zur Behandlung der Lyme-Krankheit bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Lyme-Krankheit, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24 kDa-Antigen (OspC) von B. burgdorferi ist. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass eine spontante Auflösung der Erkrankung und/oder Eliminierung von Spirocheten in verschiedenen Mausarten unter Verwendung von hohen Titern an OspC-spezifischen Antikörpern erzielt wurde. Bevorzugt umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Lyme-Krankheit als Wirkstoff einen Antikörper, der spezifisch für das 24 kDa-Antigen (OspC) von B. burgdorferi mit der in SEQ ID NO. 2 dargestellten Sequenz ist.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass der passive Transfer von polyklonalem OspC-reaktivem Immunserum in B. burgdorferi-infizierte scid-Mäuse zu einer vollständigen Auflösung von chronischer Arthritis und Carditis wie zur Eliminierung des Pathogens führt. Für eine wirksame Bekämpfung einer Infektion scheint ein kritischer Grenzwert von OspC- spezifischen Antikörpern wichtig zu sein, der zwischen 3 und 1 0 μg Anti- OspC-Antikörper liegt. Dies bedeutet, dass Spirocheten OspC im Säugerwirt exprimieren und für Schutzantikörper im betroffenen Gewebe während der Infektion empfindlich sind. Deshalb ist ein Angreifen von OspC für eine erfolgreiche therapeutische Behandlung der Lyme-Erkrankung relevant.
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Immunseren aus B. burg- dorferi-infizierten Mäusen einen vollständigen Schutz gegen eine Erkrankung und Infektion nur dann gewährleisteten, wenn sie vor, nicht aber wenn sie nach einer Inokulation mit dem Pathogen verabreicht wurden. In der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass die spontane Auflösung der Infektion mit Antikörpern gegen OspC möglich ist, wobei die Spirocheten im Wirbeltier inaktiviert werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass es möglich ist, mit polyklonalen OspC-spezifischen Immunseren sowohl Arthritis als auch Carditis aufzulösen und bestehende Spirochetin- fektionen in C.B.-1 7 scid-Mäusen zu heilen, unabhängig davon, ob die Antikörper vor dem Auftreten (z.B. 1 0 Tage vor der Infektion) oder alternativ zu einem Zeitpunkt, an dem die Krankheit voll ausgebrochen (am 1 9. Tag nach Infektion) war oder es sich um eine chronische Erkrankung handelte (Tag 60 nach Infektion). Die vollständige Auflösung der Erkrankung und Eliminierung des Pathogens war Dosisabhängig und wurde mit 1 μg bis 1 0 mg Anti-OspC- Antikörper/Maus, bevorzugt 5 μg bis 20 μg Anti OspC-Antikörper/Maus erzielt.
Entzündliche Läsionen an Gelenken oder im Herzen von B. burgdorferi- inokulierten scid-Mäusen wurden durch polyklonale Immunseren gegen
OspC vollständig aufgelöst, selbst wenn sie zu einem Zeitpunkt verab- reicht wurden, zu dem eine chronische Erkrankung vorlag, d.h. am 60. Tag p.i.
Nachstehend wird die Erfindung anhand der Figuren der Zeichnung und der Beispiele erläutert.
Figurenbeschreibung:
Figur 1 zeigt eine Western Blot-Analyse von NMS und IS, welche für passive Immunisierung von C. B.-1 7 scid-Mäusen verwendet wurden. Spur 1 zeigt einen Standard von Maus mAks gegen Hsp70 (70 kDa), Hsp60 (60 kDa), Flagellin (41 kDa), OspB (34 kDa), OspA (31 kDa), OspC (24 kDa), pLA7 (20 kDa) und p7, 5 (7,5 kDa) . Spur 2: NMS, gesammelt von naiven BALB/c-Mäusen. Spur 3: Polyklonales Immunse- rum, gebildet in BALB/c-Mäusen, immunisiert mit rLip-OspA in ABM2- Adjuvans. Spur 4: Polyklonales IS, gebildet in BALB/c-Mäusen, immunisiert mit rOspC in ABM2-Adjuvans, wie hierin beschrieben.
Figur 2 Kinetik des Auftretens von B. burgdorferi-spezifischen (IgG) oder OspC- spezifischen (IgM/IgG) Antikörpern (A) und Korrelationsanalyse von Serumgehalten von entweder Gesamt-B. burgdorferi-spezifischen oder OspC-spezifischen Antikörpern (IgG) und Elimination von Spirocheten von infizierten Mäusen (B) . AKR/N, C57BL/6 und BALB/c-Mäuse (6 bis 8 Wochen alt) wurden durch Spritzeninjektion mit 1 03 Spirocheten in den Schwanz (s.c.) infiziert. Die Mengen an B. burgdorferi-spezifischen (IgG) und OspC-spezifischen Antikörpern (IgM und IgG) in Seren von einzelnen Mäusen wurden mit ELISA unter Verwendung von entweder Gesamtzell- lysaten (B. burgdorferi-Stamm ZS7) oder rOspC (ZS7) als Substrate untersucht. Die Daten stellen das Mittel von einzelnen untersuchten Serumproben dar (AKR/N und C57BL/c: 1 0 Mäuse/Gruppe; BALB/c: 7 Mäuse; A) . Korrelation zwischen Serumgehalten von Gesamt-B. burgdor- feri-spezifischen IgG-Antikörpern, OspC-spezifischen IgG-Antikörpern (Tag 23 p.i.) und die Möglichkeit, Spirocheten aus Ohrgewebe zu rekultivieren (Tag 90 p.i.) wurde durch Korrelationsassay (B) analysiert.
Figur 3 zeigt die DNA-Sequenz und die Proteinsequenz des 24 kDa- Antigens (OspC) von B. burgdorferi (SEQ ID NO. 2)
Figur 4 zeigt die Konstruktion des Plasmids pG OspC-ZS, welches das OspC-Gen enthält.
Tabelle 1
Unterschiedliche therapeutische Wirkungen von Immunseren gegen OspA und OspC an etablierten B. burgdorferi-
Infektionen von C.B.-17 scid-Mäusen
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Figure imgf000008_0002
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Tabelle 2
Therapeutische Wirkung eines Immunserums gegen OspC 60 Tage nach der Infektion von C.B.-17 scid-Mäusen mit
103 B. burgdorferi-ZS7
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Tabelle 3
Histopathologische Untersuchung von betroffenen Organen aus einzelnen infizierten scid-Mäusen nach einer therapeutischen Behandlung mit Immunseren
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nicht getestet
Beispiel 1
Materialien und Methoden
a) Mäuse und Infektion mit B. burgdorferi. Ausgewachsene Mäuse der Stämme AKR/N (H-2k), C57BL/6 (H-2b),
BALB/c (H-2d) und C.B.-1 7 seid (H-2d) wurden unter spezifischen patho- genfreien Bedingungen gezüchtet. Zwischen 6 und 8 Wochen alte weibliche Tiere wurden für die Experimente verwendet. Die Mäuse wurden subkutan (s.c.) mit 1 x 1 03 niedrigpassagierten (zwei bis vier in vitro Passagen) Organismen B. burgdorferi des Stammes ZS7 (Schaible et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 ( 1 990), 3768-3772) in den Schwanz geimpft.
b) Rekombinante Antigene. Ein vollständiges rekombinantes lipidiertes OspA (rLip-OspA) von B. burgdorferi, Stamm ZS7, wurde wie beschrieben (Gern et al., Immunol. Lett. 39 ( 1 994) , 249-258) hergestellt. Ein Glutathion-S-Transferase OspC Fusionsprotein (rOspC) von B. burgdorferi, Stamm ZS7, wurde unter Verwendung bekannter Techniken (R. Wallich et al., Infect. Immun. 64 ( 1 995), 3327-3353) hergestellt.
c) Polyklonales Immunserum.
BALB/c-Mäuse wurden mit entweder 10 μg rLip-OspA oder 10 μg rOspC in 1 00 /vl ABM2 Adjuvans (Sebak, Aldenbach, Deutschland) in den Schwanz geimpft und zweimal mit der gleichen Antigenpräparation in
Abständen von 10 Tagen aufgefrischt. Das Immunserum (IS) wurde über einen Zeitraum von rund 2 Monaten nach der letzten Auffrischung gesammelt und enthielt die folgenden Konzentrationen von OspA- oder OspC-spezifischen Antikörpern (Ak), wie mit einem ELISA unter Verwen- düng von rLip-OspA oder rOspC als Substrat bestimmt wurde: Anti-OspA IS, 3, 2 mg/ml bzw. Anti-OspC IS, 300 /yg/ml. Normales Mausserum (NMS) wurde von naiven BALB/c-Mäusen gesammelt. Die Spezifitäten der erzeugten Immunseren und NMS wurden durch Western Blot-Analyse verifiziert. Wie in Figur 1 gezeigt (Spur 3, 4) reagierte ein polyklonales Immunserum von entweder OspA- oder OspC-immunisierten Mäusen selektiv mit Proteinen mit 31 kDa (OspA) bzw. 24 kDa (OspC) aus einem Gesamtzelllysat von ZS7 Spirocheten. Es wurde keine Reaktivität mit NMS gefunden (Figur 1 , Spur 2) .
d) Analyse von Serumantikörpern durch ELISA und Western Blot.
Serumantikörper gegen B. burgdorferi OspA bzw. OspC wurden durch einen Festphasen-ELISA, wie im Stand der Technik beschrieben (Kramer et al., Immunobiol. 1 81 ( 1 990), 357-366), quantifiziert, wobei 1 μg/ml Gesamtzelllysat von B. burgdorferi, Stamm ZS7, rLip-OspA (ZS7) bzw. rOspC (ZS7) als Substrate verwendet wurden. Die Western Blot-Analyse wurde, wie im Stand der Technik beschrieben (M.M. Simon et al., J. Infect. Dis. 1 64 (1 991 ), 1 23-1 32), unter Verwendung eines Gesamtzell- lysats des B. burgdorferi-Stammes ZS7 als Antigenpräparation durchgeführt.
e) Passiver Transfer von Immunserum zum Schutz vor und zur Be- handlung einer Infektion.
Für passiven Schutz wurden 6 bis 8 Wochen alte weibliche C.B.-1 7 scid- Mäuse intraperitoneal (i.p.) entweder mit einem OspA- oder einem OspC- reaktiven polyklonalen Immunserum 1 Stunde vor der Infektion injiziert. Kontrollmäuse erhielten 100 //I NMS. Zur Infektion wurden die Mäuse s.c. mit 1 x 103 B. burgdorferi ZS7 Organismen in den Schwanz injiziert. Alternativ wurden für die passive Behandlung einer bestehenden Infektion scid-Mäuse zunächst mit 1 x 1 03 ZS7 Spirocheten (s.c.) infiziert, und es wurden ihnen anschließend wiederholt (vier mal in Abständen von 3 bis 4 Tagen) verschiedene Mengen von polyklonalem Immunserum verabreicht, das entweder für OspA oder Ospc spezifisch war (i.p.), wobei am Tag 1 0, 1 9 oder 60 nach der Infektion (p.i.) begonnen wurde. Die Tiere wurden hinsichtlich der Entwicklung von klinischer Arthritis in den tibiotarsalen Gelenken beobachtet. Die Härte der Arthritis wurde in dem rechten und linken tibiotarsalen Gelenk wie folgt beurteilt: 4- 4- , schwer; + mäßig schwer; ± , milde Schwellung; ( ± ) , Rötung; -, keine klinischen Zeichen.
Zu den angegebenen Zeiten wurden die Mäuse hinsichtlich der Anwesenheiten von Spirocheten durch Kultivierung von Ohrgewebeproben untersucht, wobei, wie im Stand der Technik beschrieben, vorgegangen wurde (Sinsky et al., J. Clin. Microbiol . 27 (1 989), 1 723-1 727) .
Für histopathologische Untersuchungen wurden die Mäuse zu den angegebenen Zeiten nach der Infektion getötet. Das tibiotarsale Gelenk, das Herz, die Leber und die dem tibiotarsalen Gelenk benachbarten Muskeln wurden in 10 %igem Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Die entzündeten Läsionen wurden wie folgt beurteilt: 4- 4- 4- , sehr schwer; 4- 4- , schwer; 4- , mäßig; ± , mild; -, keine.
Beispiel 2 Ergebnisse:
Drei Inzucht-Maus-Stämme, AKR/N, BALB/c und C57BL/6 mit unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber einer B. burgdorferi-induzierten Erkrankung (U.E. Schaible et al., Eur. J. Immunol. 21 (1 991 ), 2397- 2405) wurden mit 1 03 Spirocheten infiziert. Die Kinetik der spezifischen Antikörperantworten, der Entwicklung von Arthritis sowie der Beständigkeit von Spirocheten wurden bis zu 90 Tage nach der Infektion beobachtet. Alle mit B. burgdorferi geimpften Tiere waren infiziert, wie durch Serokonversion gezeigt (Figur 2A) . Alle Tiere bildeten ähnliche Mengen von B. burgdorferi-spezifischen IgG-Antikörpern, welche zuerst am 1 4. Tag nach der Infektion nachweisbar waren und während dem gesamten Beobachtungszeitraum ständig anstiegen. Darüberhinaus entwickelten alle Mäuse beträchtliche, aber variable Mengen von OspC-spezifischen IgM- und IgG-Antikörpern (Figur 2A) . OspC-spezifische IgM-Antikörper waren zuerst am 4. Tag nach der Infektion nachweisbar, erreichten einen Höhepunkt am 1 4. Tag nach der Infektion und fielen danach auf Grund- linienwerte am 24. Tag nach der Infektion ab. OspC-spezifische IgG- Antikörper wurden zunächst am 1 4. Tag p.i. beobachtet mit einem Höhepunkt am 23. Tag p.i. (Höchstwerte für AKR/N, C57BL/6: etwa 8 //g/ml; BALB/c: etwa 3 μg/ml) . Die Antikörpertiter in AKR/N- und C57BL/6-Mäusen nahmen im Laufe der Zeit ab, aber blieben bei detek- tierbaren Gehalten (etwa 3 //g/ml) bis zu 90 Tagen p.i. Im Gegensatz dazu bildeten BALB/c-Mäuse geringere Mengen von OspC-spezifischen IgG-Antikörpern in der frühen Phase der Infektion, aber die Serumtiter nahmen im Verlauf der Zeit nach der Infektion zu. Wie von früheren Studien zu erwarten (Schaible et al., Immunol. Lett. 36 ( 1 993), 21 9-226; L. Gern et al., J. Infect. Dis. 1 67 ( 1 993), 971 -975) wurden in keinem der Seren von infizierten Mäusen während des gesamten Beobachtungszeitraums von 90 Tagen Antikörper gegen OspA nachweisbar, weder durch ELISA- noch durch Western Blot-Analyse unter Verwendung eines spirochetalen Lysats oder rekombinantem OspA.
Eine enge Korrelation zwischen Serumtitern von Anti-OspC-Antikörpern und spontaner Auflösung der Infektion konnte gefunden werden. Wie in Figur 2B gezeigt war die Menge an OspC-spezifischen IgG-Antikörpern in den 8 Mäusen, aus denen keine Spirocheten rekultiviert werden konnten, beträchtlich höher als in solchen, von denen positive Kulturen erhalten wurden ( 1 0 ± 5 //g/ml gegenüber 4,8 ± 2,8 /g/ml) . Auf der anderen Seite wurde keine Korrelation zwischen dem Gesamtgehalt an B. burgdorferi-spezifischen IgG-Antikörpern und Eliminierung von Spirocheten gefunden. Dies zeigt, dass OspC-spezifische Antikörper in der Lage sind, Spirocheten in Wirbeltieren zu inaktivieren und eine Infektion zu bekämpfen. Beispiel 3
Es wurden Passivtransferexperimente durchgeführt, um zu untersuchen, ob es mit polyklonalem IS, das spezifisch für rOspC ist, möglich ist, eine nachgewiesene B. burgdorferi-lnfektion in scid-Mäusen zu heilen. Ein für rLip-OspA-spezifisches polyklonales Immunserum diente als Kontrolle. Es wurde herausgefunden, dass unterschiedliche Dosismengen von OspC- spezifischen Antikörpern für die Prävention bzw. Behandlung der Infektion nötig waren. Ein passiver Transfer von 3 μg OspC-spezifischen Antikörpern in scid-Mäuse 1 Stunde vor der Infektion führte zu einem vollständigen Schutz gegen die Erkrankung und Infektion in allen untersuchten Mäusen (Tabelle 1 ). Wie zuvor gezeigt, wurde ein vollständiger Schutz auch mit 3 μg OspA-spezifischen Antikörpern, nicht aber mit Normal-Maus-Serum unter ähnlichen Bedingungen beobachtet (Tabelle 1 und M.M. Simon et al., J. Infect. Dis. 1 64 ( 1 991 ), 1 23-1 32). Im Gegensatz dazu verhinderte eine wiederholte Verabreichung von 3 //g/Maus OspC-spezifischen Antikörpern (4 x in Zeitabständen von 3 bis 4 Tagen), wobei am 1 0. Tag nach der Infektion begonnen wurde, einem Zeitpunkt, an dem sich Spirocheten verbreitet haben und die Entzündung von Gelenken und Herz anfängt, nur teilweise die Entwicklung von klinischer Arthritis. Spirocheten konnten in dieser Menge nicht inaktiviert werden.
Für die Passivtransferexperimente wurden deshalb Immunseren verwendet, die 1 0 μg Anti-OspC-Antikörper enthielten. Wie in Tabelle 1 gezeigt, verhinderte ein solches wiederholt verabreichtes Immunserum ( 1 0 μg, 4 x in Abständen von 3 bis 4 Tagen), wobei entweder am 10. oder 1 9. Tag nach der Infektion begonnen wurde, vollständig das Auftreten von und heilte aufgetretene klinische Arthritis in allen infizierten scid-Mäusen. Spirocheten konnten aus den Ohrgewebeproben nicht rekultiviert wer- den. Im Gegensatz dazu und wie aus früheren Untersuchungen erwartet (Schaible et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 ( 1 990), 3768-3772) hatte ein wiederholter passiver Transfer von ähnlichen Mengen von anti-OspA- spezifischen Antikörpern am 10. oder 1 9. Tag keine Wirkung auf klinische Arthritis und Infektion. Höchst bemerkenswert und überraschend ist es, dass anti-OspC-spezifische Antikörper in der Lage waren, eine chronische Erkrankung und Infektion in Mäusen aufzulösen. Dies wird durch die Tatsache verdeutlicht, dass der passive Transfer des jeweiligen Immunserums, angefangen am 60. Tag p.i. zu einer beträchtlichen Verringerung von klinischer Arthritis innerhalb 1 0 Tagen nach der Behandlung und zu einer praktisch vollständigen Auflösung in den folgenden 30 Tagen führte (Tabelle 2) . Während das Pathogen aus dem Ohrge- webe von allen infizierten scid-Mäusen vor der Behandlung (am Tag 38 p.i.) rekultiviert werden konnte, enthielt keine der Proben, die von den gleichen Tieren am 20. Tag nach dem Antikörpertransfer (Tag 80 p.i.) genommen wurden, detektierbare Mengen an Spirocheten. Kein Rückfall von klinischer Arthritis wurde bis zu 40 Tage nach der Behandlung beobachtet, unabhängig davon, ob das Immunserum ( 1 0 //g/Maus anti- OspC-spezifische Antikörper) am 1 0., 1 9. oder 60. Tag p.i. transferiert wurde.
Beispiel 4
Die therapeutische Wirkung eines polyklonalen Immunserums, das gegen OspC gerichtet ist, auf eine vorhandene Erkrankung und Infektion von scid-Mäusen wurde weiter durch histopathologische Untersuchungen der betroffenen Organe bestätigt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurden signifi- kante histopathologische Veränderungen in den Gelenken, im Herz, in der Leber und im Muskel von infizierten, aber ansonsten unbehandelten scid- Mäusen oder solchen, die lediglich NMS erhielten, festgestellt. Wie bereits früher gezeigt wurde (U.E. Schaible et al., Am. J. Pathol. 1 37 ( 1 990) , 81 1 -820) wurden chronische progressive Entzündungsverände- rungen am meisten in tibiotarsalen Gelenken, im Herz und in der Leber festgestellt und bestanden während des gesamten Beobachtungszeitraums (45 Tage p.i.) . Mäuse, die ein Immunserum erhalten hatten, das entweder für OspC oder OspA (3 μg spezifische Antikörper/Maus) 1 Stunde vor der Infektion erhalten hatten, zeigten keine pathologischen Veränderungen an einem der vier Organe, wenn am 45. Tag p.i. untersucht. Darüberhinaus zeigten Mäuse, die ein gegen OspC gerichtetes Immunserum (1 0 μg spezifische Antikörper/Maus) am 10. oder 1 9. Tag nach der Inokulation erhalten hatten, wenn überhaupt nur geringfügige entzündete Läsionen in Gelenken, Herz, Leber und Muskel. Im Gegensatz dazu hatte gegen OspA gerichtetes Immunserum ( 10 μg spezifische Antikörper/Maus) keine Wirkung auf die Entwicklung oder Progression der Entzündung in den betroffenen Organen (Tag 1 9 p.i.) .
Beispiel 5
Herstellung von OspC-GST Fusionsprotein und Reinigung von rek. OspC
Die Klonierung von OspC in den Expressionsvektor pGEX-2T wurde wie folgt durchgeführt:
1 ) Amplifikation des OspC-Gens von Aminosäure 20 - 21 1 mittels PCR
(Primer: ATGGATCCAATAATTCAGGAAAAGATGGG und ATGAATTCCTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTACC)
2) Klonierung des PCR-Fragments in pGEX-2T nach BamHI/EcoRI- Verdau
3) Transformation von E.coii DH5a
4) Expression rek. OspC-GST entsprechend der Vorschrift des Her- stellers (Pharmacia Biotech)
5) Anreicherung von OspC-GST über Gluthatione Seph. 4B-Säulen
6) Spaltung von OspC-GST mittels Thrombin und Reinigung. Hierzu wurden vier OspC-GST Protein-Präparationen über Nacht mit Thrombin Protease verdaut und OspC von GST über eine Glutation Seph. 4B-Säule getrennt.

Claims

Patentansprüche
1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Lyme- Krankheit, d a d u r c h g e k e n n ze i c h n et , dass sie als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24kDa-Antigen (OspC) von B. burgdorferi ist.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Lyme- Krankheit, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass sie als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24kDa-Antigen (OspC) von B. burgdorferi mit der in SEQ ID NO.2 dargestellten Sequenz ist.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, d a d u rc h g e k e n n ze i c h n et , dass sie einen für OspC spezifischen polyklonalen Antikörper umfasst.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass sie einen oder mehrere für OspC spezifische monoklonale Antikörper umfasst.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e k e n n ze i c h n et , dass sie als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für rekombinantes OspC von B. burgdorferi des Stammes ZS7 ist.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass sie Antikörper der Klasse IgG und/oder IgM als Wirkstoff umfasst.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass sie zur intraperetonealen Verabreichung vorgesehen ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass sie 1 μg bis 10 mg Antikörper als Wirkstoff umfasst.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass sie in immundefizienten Versuchstieren, die mit lebensfähigen pathogenen B. burgdorferi Organismen infiziert wurden, das Fortschreiten von Arthritis und Carditis verhindert.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehen- den Ansprüche, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass sie in immundefizienten Scid-Mäusen, die mit lebensfähigen pathogenen B. burgdorferi Organismen des Stammes ZS7 infiziert wurden, das Fortschreiten von Arthritis und Carditis verhindert.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass sie in immundefizienten Versuchstieren, die mit lebensfähigen pathogenen B. burgdorferi Organismen infiziert wurden, zur Heilung von Arthritis und Carditis führt.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass sie in immundefizienten Versuchstieren, die mit lebensfähigen pathogenen B. burgdorferi Organismen infiziert wurden, zur Inakti- vierung der Spirocheten führt.
13. Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass er als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24kDa-Antigen (OspC) von B. burgdorferi ist.
14. Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass er als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24kDa-Antigen (OspC) von B. burgdorferi mit der in SEQ ID NO.2 dargestellten Sequenz ist.
15. Impfstoff nach Anspruch 13 oder 14, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass er einen gegen OspC spezifischen polyklonalen Antikörper umfasst.
16. Impfstoff nach Anspruch 13 oder 14, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass er einen oder mehrere für OspC spezifische monoklonale Antikörper umfasst.
17. Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 16, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass er Antikörper umfasst, die spezifisch für rekombinantes OspC von B. burgdorferi des Stammes ZS7 sind.
18. Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 17, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass er Antikörper der Klasse IgG und/oder IgM als Wirkstoff umfasst.
19. Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 18, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass er in immundefizienten Versuchstieren, die mit lebensfähigen pathogenen B. burgdorferi Organismen infiziert wurden, die Ausbil- düng von Arthritis und Carditis verhindert.
20. Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 19, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass er 0,1 μg bis 1 mg Antikörper als Wirkstoff umfasst.
21. Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 20, d ad u rc h g e k e n n ze i c h n et , dass er weiterhin Antikörper umfasst, die spezifisch für das 31 kDa Antigen (OspA) von B. burgdorferi sind.
22. Verfahren zur Gewinnung eines Wirkstoffs zur Behandlung der Lyme-Krankheit aus einem Versuchstier, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man das Versuchstier mit OspC-Antigen impft und ein Immunserum gewinnt, welches für das OspC-Antigen spezifische
Antikörper enthält.
23. Verfahren nach Anspruch 22, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass man das Versuchstier mit rekombinantem OspC impft.
24. Verfahren nach Anspruch 23, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass man BALB/c-Mäuse mit rekombinantem OspC dreimal in Abständen von 10 Tagen impft und das Immunserum über einen Zeitraum von 2 Monaten nach der letzten Verabreichung des Antigens gewinnt.
25. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes gegen die Lyme- Krankheit aus einem Versuchstier, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass man das Versuchstier mit OspC impft und ein Immunserum gewinnt, das für OspC spezifische Antikörper enthält.
26. Verfahren nach Anspruch 25, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass man das Versuchstier mit rekombinantem OspC impft.
27. Verfahren nach Anspruch 26, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass man BALB/c-Mäuse mit rekombinantem OspC dreimal in Abständen von 10 Tagen impft und das Immunserum über einen
Zeitraum von 2 Monaten nach der letzten Verabreichung des Antigens gewinnt.
28. Polyklonaler Antikörper, erhältlich nach einem der Ansprüche 22 bis 26, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass er für OspC spezifisch ist.
29. Polyklonaler Antikörper, erhältlich nach einem der Ansprüche 22 bis 26, d a d u rc h g e k e n n ze i c h n et , dass er für OspC mit der in SEQ ID NO.2 dargestellten Sequenz spezifisch ist.
30. Monoklonaler Antikörper gegen OspC.
31. Monoklonaler Antikörper gegen OspC der in SEQ ID NO.2 darge- stellten Sequenz.
32. Antigen, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass es mit einem Antikörper gegen OspC nach einem der Ansprü- ehe 1 bis 21 immun reagiert.
33. Antigen nach Anspruch 32, d a d u rc h g e k e n n ze i c h n et , dass es die in Seq. ID NO.2 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein immunogenes Epitop aus dieser Sequenz umfasst.
34. Rekombinante DNA, d ad u rc h g e ke n n ze i c h n et , dass sie für ein Antigen nach einem der Ansprüche 26 oder 27 codiert und (1) die in Seq. ID NO. 1 dargestellte Nukleinsäurese- quenz, (2) eine hier im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Sequenz oder (3) eine mit der Sequenz aus (1) oder/und (2) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Sequenz umfasst.
35. Rekombinanter Vektor, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass er eine oder mehrere Kopien einer rekombinanten DNA nach Anspruch 34 enthält.
36. Verfahren zur Gewinnung von Antigenen nach einem der Ansprü- ehe 32 oder 33, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass man eine B. burgdorferi Genbank mit einem oder mehreren Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 18 untersucht und die Klone isoliert, welche mit dem oder den Antikörpern eine positive Immunreaktion zeigen.
37. Verfahren zur Gewinnung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der Lyme-Krankheit oder eines Impfstoffes gegen die Lyme-Krankheit, d a d u rc h g e k e n n ze i c h n et , dass man Versuchstiere mit einem Antigen nach einem der Ansprüche 32 oder 33 immunisiert und aus dem immunisierten Versuchstier auf übliche Weise protektive, polyklonale oder mono- klonale Antikörper gegen OspC gewinnt.
38. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24kDa Antigen (OspC) von B. burgdorferi ist, zur Behandlung der Lyme- Krankheit.
39. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24kDa Antigen (OspC) von B. burgdorferi ist, als Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit.
40. Verwendung nach einem der Ansprüche 38 oder 39, d ad u rc h g e k e n n ze i c h n et , dass der Wirkstoff ein polyklonaler Antikörper ist.
41. Verwendung nach einem der Ansprüche 38 oder 39, d ad u rc h g e k e n n z e i c h n et, dass der Wirkstoff ein monoklonaler Antikörper ist.
42. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24kDa
Antigen (OspC) von B. burgdorferi ist, zur Herstellung eines Arznei mittels zur Behandlung der Lyme-Krankheit.
43. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24kDa
Antigen (OspC) von B. burgdorferi ist, zur Herstellung eines Arznei mittels als Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 42 oder 43, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass der Wirkstoff ein polyklonaler Antikörper ist.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 42 oder 43, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass der Wirkstoff ein monoklonaler Antikörper ist.
46. Verfahren zur Behandlung der Lyme-Krankheit, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass einem an der Lyme-Krankheit erkrankten Patienten ein phar- mazeutisches Präparat verabreicht wird, welches als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24kDa Antigen (OspC) von B. burgdorferi ist.
7. Verfahren zur Prävention der Lyme-Krankheit, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass einem Patienten ein Impfstoff verabreicht wird, der als Wirkstoff einen Antikörper umfasst, der spezifisch für das 24kDa Antigen (OspC) von B. burgdorferi ist.
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