WO1999007741A1 - Vaccin meningocoque comportant la valence de souche bz83 - Google Patents

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WO1999007741A1
WO1999007741A1 PCT/FR1998/001730 FR9801730W WO9907741A1 WO 1999007741 A1 WO1999007741 A1 WO 1999007741A1 FR 9801730 W FR9801730 W FR 9801730W WO 9907741 A1 WO9907741 A1 WO 9907741A1
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tbpb
strain
pharmaceutical composition
composition according
restriction
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Application number
PCT/FR1998/001730
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Inventor
Marie-José Quentin-Millet
Bachra Rokbi
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Pasteur Merieux Serums & Vaccins
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    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the present invention is a new pharmaceutical composition intended for the treatment or prevention of meningococcal infections which comprises the TbpB (Tbp2) subunit of the human transferrin receptor (RTH) of a strain of Neisseria meningitidis of the ET complex -5, group BZ83.
  • Tbp2 Tbp2 subunit of the human transferrin receptor (RTH) of a strain of Neisseria meningitidis of the ET complex -5, group BZ83.
  • meningitis is either of viral origin or of bacterial origin.
  • the bacteria mainly responsible are: N. meningitidis and Haemophilus influenzae, respectively involved in approximately 40 and 50% of the cases of bacterial meningitis.
  • the species .Y. meningitidis is subdivided into serogroups according to the nature of the capsular polysaccharides. Although there are a dozen serogroups, 90% of meningitis cases are attributable to 3 serogroups: A. B and C.
  • the polysaccharide of N. meningitidis group B is not or little immunogenic in humans, whether it is in conjugated form or not. Thus, it seems highly desirable to look for a vaccin against Y ' -induced meningitis. meningitidis in particular from serogroup B. other than a polysaccharide-based vaccine.
  • N. meningitidis has a receptor for human transferrin and a receptor for human lactoferrin which allow it to fix these iron chelating proteins and subsequently capture the iron necessary for its growth.
  • the human transferrin receptor of the strain N. meningitidis B 16B6 was purified by Schryvers et al (WO 90/12591) from a membrane extract.
  • This protein as purified appears essentially made up of 2 types of polypeptides: a polypeptide of a high apparent molecular weight of 100 kDa and a polypeptide of a lower apparent molecular weight of approximately 70 kDa, as revealed after electrophoresis on gel of polyacrylamide in the presence of SDS.
  • the purification product in particular implemented by Schryvers, is by definition arbitrary and for the purposes of this patent application, called human transferrin receptor (RTH) and the polypeptides constituting it, subunits.
  • RTH human transferrin receptor
  • the subunits of high molecular weight and of lower molecular weight are respectively called TbpA (or Tb 1) and TbpB (or Tbp 2).
  • a first strain TV called type M982 (or IM2169). has a TbpB which reacts with an antiserum directed against the RTH of the strain M982 but which does not react with an antiserum directed against the RTH of the strain B 16B6 (or IM2394); while the other type, called type B16B6.
  • Strains of type 982 are for example the strain M982, the sequence of the tbpB gene is described in patent application EPA 586 266 and in the EMBL database under the reference number Zl 5130; strains 6940. M978 and S3032 have the 5 'sequences of the tbpB genes are described in WO 95/33049: strains BZ83 and 8680 whose sequences of the tbpB genes are described in WO 95/33049 and WO 97/13860: respectively (these sequences can also be found in the EMBL database under the respective reference numbers Z50732 and Y09977); or also the strains 32/94, 8710 whose sequences can be found in the EMBL database 5 under the respective accession numbers Y09617 and Y09618.
  • TbpB protein rather than Tbpl, has a number of characteristics that make it a potential vaccine candidate: ubiquitous expression. accessibility to the surface of the germ, the ability to induce bactericidal antibodies and variability
  • compositions have already been proposed containing:
  • TbpB of at least one type B 16B6 strain and TbpB of at least one type M982 strain (WO 93/7172).
  • a first method universally in use consists in classifying meningococci into serogroups, serotypes and sub-serotypes on the basis of antigenic differences at the level of capsular polysaccharides, of the outer membrane protein of class 2/3 and of the outer membrane protein of class 1 , respectively. This classification is performed using monoclonal antibodies.
  • the strain M982 is thus listed as being of serogroup B, serotype 9, sub-serotype PI .9 (B: 9: P1.9).
  • MLEE Multi Locus Electrophoresis Enzyme
  • the Pathogenic Neisseriae (1985), ed. Schoolnick G.K. (American Society for Microbiology): 530; Caugant et al, J. Gen. Microbiol. (1986) J_32: 641; Selander et al. Appl. Approx. Microbiol. (1986) 5J: 873; Caugant et al. Genetics (1981) 98: 464; Caugant et al, PNAS (1986) 83_: 4931.
  • MLEE Multi Locus Electrophoresis Enzyme
  • the malic enzyme MAE
  • G6P glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • PEP peptidase
  • IDH isocitrate dehydrogenase
  • glutamate dehydrogenases nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) phosphate dependent (GD I and GD2), alcohol dehydrogenase (ADH), fumarase (FUM), alkaline phosphatase (ALK). indophenol oxidases (IP1 and IP2), adenylate kinase (ADK.) and dehydrogenase (UDH).
  • the electromorphs (or alloenzymes) of each enzyme correspond to alleles of the same genetic locus.
  • a particular combination of the alleles of these enzymes constitutes an electrophoretic (ET) type.
  • ET electrophoretic
  • These types can be grouped into family or complex (cluster).
  • the ET-5 complex consists of 22 very closely related electrophoretic types (the maximum genetic distance is 0.16).
  • the following table indicates the allelic profile of the ET-5 electrophoretic type strains (allele number by locus for each of the 15 enzymes). In bold are indicated the enzymes (G6P and UDH) for which the allele (s) are likely to vary within the ET-5 complex.
  • lineages I-X
  • lineages I-X
  • lineage III groups ET types 24, 24.1 - 4 and 25.
  • tbpB genes were analyzed (a) on the one hand for their restriction profiles by the enzymes Avall, Hincll, Vspl and Xhol after amplification of the gene from the genomic DNA and using the PI primers (SEQ ID NO: 9; PI corresponds to positions 1 15 to 1 13 of the sequence of the M982 tbpB gene, as found in the EMBL library under the accession number Z 15 130) and P2 (antisense; SEQ ID NO: 10: P2 corresponds to positions 2264 to 2244 of the sequence of the M982 tbpB gene, as found in the EMBL library (under accession number Z15130); and (b) on the other hand for the size of the PCR (polymerase chain reaction) fragment, derived from the tbpB gene which can be
  • a ' uncut.
  • NGP355 B 15: P1.15 1975 Non entend 772 A N N B
  • the asterisk indicates the strain M982 which is not part of the ET-5 complex.
  • the size of the fragment indicated is that of the fragment amplified from genomic TADX using the primers P3 and P4. calculated to the nearest base when the complete gene sequence was available (strains M892. BZ83 and 86X0) or determined after migration on a 3% agarose gel by comparison with the PCR fragment generated for M892 strains. BZ83 and 8680.
  • the genomic DNA was first extracted from the dried cultures cultivated on Muelier-Hinton agar plates (MH ⁇ . Difco). DNA extraction was performed using a rapid guanidium isothiocyanate method (Pitcher et al.
  • PCR reactions were carried out in a volume of 100 ⁇ l containing 200 ⁇ f (each) of dCTP. dGTP. dA TP and dTTP (Pharmacia-LKB): 0.2 ⁇ M of each of the primers and 2.5 U of Taq polymerase (Appligen).
  • the amplifications took place in a DNA thermocycler (Biometra. Trio-thermobloc) programmed as follows: initial desaturation at 95 ° C for 5 min then 25 cycles: each including a consecutive denaturation (30 sec, 95 ° C). annealing (30 sec. 58 ° C) and extension of the DNA chain (1 min. 72 ° C). The size of the amplified fragments is determined after electrophoresis of the amplification product on 3% agarose gel.
  • Each of the amplified fragments was purified on a Qiaquick column (Oiagen) and digested with the four enzymes in four separate reactions following the instructions of the manufacturer ( eir England Biolabs). The restriction products were separated by electrophoresis on 2% agarose gel.
  • the largest group contained 17 strains, including the BZ83 strain (percentage representation 54.8%). It was followed by a group of 10 strains characterized by a PCR fragment of single size (844 nt) and identical to that of the PCR fragment obtained with the strain M982. Although the strain M982 is not itself part of this group, it is however designated hereafter under the name of group M982 because of this size identity (it will be noted that the terms group M982 and type M982 do not designate the same thing).
  • the restriction profiles of the tbpB genes exhibit a certain heterogeneity: none of the genes is cut by Avall or by Xhol: as regards Vspl, either there is no restriction site, or it offers a G-type restriction profile: and the restriction profiles obtained with Hind i are even more heterogeneous.
  • the strain 8680 is characterized by a PCR fragment of smaller size than those characterizing the strains of the group M982.
  • the restriction profile of its tbpB gene clearly shows that this strain is related to the M982 group.
  • tbpB genes of strains 32/94, 8726 and 8710 were cloned, sequenced and aligned with the gene sequences.
  • the results of the comparisons are given in Table V below, in terms of percentages of homology (identity) and confirm the relevance of the classification by PCR analysis.
  • TbpB lower molecular weight subunit
  • RTH human transferrin receptor
  • TbpB subunit of a strain, or which derives from, comes from or comes from a strain of N. meningitidis we obviously mean a drift taken in its most general sense; that is to say, not limited to a physical process, but the fruit of an intellectual process. So this expression covers i.a. a recombinantly produced TbpB e.g. in E. coll.
  • the N. meningitidis strain from which TbpB is derived which is useful for the purposes of the present invention is preferably a strain belonging to the ET-5 complex or to lineage III.
  • a strain of group BZ83 belonging to the ET-5 complex is strain 32/94.
  • a strain of group BZ83 forming part of lineage III is strain 90/94.
  • TbpB gene sequences of these strains are given in the sequence identifier below.
  • the TbpB entering into the composition according to the invention comes from a strain of N. meningitidis possessing a DNA sequence coding for TbpB which has a restriction profile downstream consisting of 3 fragments of 1184, 47 7 and 415 nt and a restriction profile by Hindi consisting of 4 fragments of 1 155. 385, 276. and 257 nt.
  • this TbpB has the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2 (strain BZ83).
  • fragments obtained from a TbpB of an adhoc strain can be used. Fragments useful for vaccine purposes can be defined according to the method proposed in WO 95/33049.
  • WO 95/33049 teaches that the study of TbpB subunits whatever the origin strain, makes it possible to highlight, three main structural domains associated at least one of them has special properties.
  • the domains of TbpB M982 and TbpB B 16B6 were fixed as shown in Table VI below, indicating the position of the amino acids, bounds included in the different domains, and by reference to the numbering appearing in SEQ ID NO 4 and 8.
  • TbpBs of type M982 or B 16B6 after alignment of a M982 or B 16B6 type sequence with the reference sequence, maximum homology.
  • first domain (1 - 334) the position of the domains of the TbpB subunit of the strain 8680 is indicated as follows: first domain (1 - 334). second domain (335 - 530) and third domain (531 - 677).
  • the only N-terminal domain therefore constitutes an element of choice for purposes ia vaccine.
  • the comparative study of the TbpBs M982 and B 16B6 sequences aligned to the maximum of homology highlights four adjustable hv perv portions located within the hinge region (also called the hinge domain, as it appears in the table above) of TbpB M982; portions which are absent in TbpB B 16B6. These arable hvper portions are found in all M982 type TbpBs. Type B 16B6 strains lack it. Subsequently, the term "hinge region of type M982" means a hinge region which has these four hvpervariable portions.
  • the hinge region of strains of the M982 type constitutes a major problem in the production of a vaccine. Indeed, if this region is immunodominant, during an immunization, the antibodies induced will be directed mainly against this region and therefore the immune response will be specific for the TbpB protein of the homologous strain.
  • a composition according to the invention can also contain a TbpB originating from a strain of group M982 or of the group illustrated by 8680 (group 8680).
  • composition according to the invention may further comprise (i) a first additional TbpB originating from a strain of ⁇ ' . meningitidis forming part of the ET-5 complex and possessing a DNA sequence coding for TbpB (a) which does not contain restriction sites Aval and Xhol or, preferably and, (b) from which it is possible to generate by PCR using primers P3 of formula 5'- AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3 'and P4 of formula 5'-
  • GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3 ' a polynucleotide of 840 to 850 nucleotides. preferably 844 nucleotides (strain of group M982); or (ii) a fragment of said first additional TbpB.
  • the first additional TbpB comes from a strain of N. meningitidis having a DNA sequence coding for TbpB which contains 1 Vspl restriction site and 3 Hindi restriction sites.
  • this TbpB comes from a strain of .Y meningitidis having a DNA sequence coding for TbpB which has a restriction profile by Vspl consisting of 2 fragments of 131 1 and 769 nt and a restriction profile by Hin i consisting of 4 fragments of 1229, 319, 281 and 259 nt.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can also further comprise
  • TbpB a second additional TbpB originating from a strain of N. meningitidis belonging to the ET-5 complex and having a DNA sequence coding for TbpB
  • (a) which contains 1 Avall restriction site. 2 Vspl restriction sites. 1 Xhol restriction site and 2 restriction sites Hin i or, preferably and, (b) from which it is possible to generate by PCR. using primers P3 of formula 5'- AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3 'and P4 of formula 5'-
  • the second additional TbpB comes from a strain of N. meningitidis having a DNA sequence coding for TbpB which has a restriction profile by Avall consisting of 2 fragments of 1507 and 445 nt, a restriction profile by Vspl consisting of 3 fragments of 1298, 470 and 266 nt, a restriction profile by A7? OI consisting of 2 fragments of 1551 and 483 nt and a restriction profile by Hindi consisting of 3 fragments of 1191, 527 and 3 16 nt .
  • this second additional TbpB has the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 6 (strain 8680).
  • a composition according to the invention may also contain one or more TbpBs caused by strains of other electrophoretic complexes.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can also comprise (i) a TbpB having an amino acid sequence whose degree of homology with the sequence shown in SEQ ID NO: 4. of the amino acid in position 1 to the amino acid in position 691. is at least 85%, advantageously at least 90% or (ii) a fragment of said TbpB.
  • it will be the TbpB of the strain M982 which has the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can also further comprise (i) a TbpB having an amino acid sequence whose degree of homology with the sequence shown in SEQ ID NO: 8, of the amino acid in position 1 at the amino acid in position 579. is at least 95%, preferably 100% (type B strain 16B6): or (ii) a fragment of said TbpB.
  • a fragment of these can also be used. Useful fragments can be determined as explained in WO 95/33049.
  • the TbpBs useful for the purposes of the present invention may be in dissociated form from the high molecular weight subunit (Tbpl) of the N. meningitidis strain from which TbpB is derived or else in association with this Tbpl, thus forming a Tbpl - TbpB complex considered to be the receptor for human transferrin; in other words, they can be in the form devoid of their corresponding high molecular weight subunits (Tbpl s) or else associated with the latter, so as to form an RTH.
  • Tbpl high molecular weight subunit
  • Tbpl s high molecular weight subunits
  • the TbpB subunit according to the invention Whether in dissociated form or in the form of a Tbp 1 -TbpB complex, the TbpB subunit according to the invention must be substantially purified; that is to say, separated from the environment in which it exists naturally. Among others, it may be a preparation notably devoid of the eytoplasmic and periplasmic proteins of A ', meningitidis.
  • a TbpB subunit useful for the purposes of the present invention may be in dissociated form from the high molecular weight subunit (Tbp 1) of the strain of A ' . meningitidis from which TbpB originates or else in association with this Tbpl, thus forming a Tbpl -TbpB complex considered as the receptor for human transferrin.
  • Tbp 1 high molecular weight subunit
  • the TbpB subunit according to the invention must be substantially purified: that is to say separated from the environment in which it exists naturally. Among others, it may be a preparation in particular devoid of the eytoplasmic and periplasmic proteins of N. meningitidis.
  • TbpBs purified from the meningococcal strains according to methods already known (see inter alia WO 97/13860) or else obtained by recombinant route in a homologous expression system or heterologous.
  • a suitable expression system is within the reach of those skilled in the art insofar as it has the tbpB gene sequences.
  • it needs to construct an expression cassette in which a DNA fragment coding for a mature TbpB or a fragment thereof will be placed under the control of an appropriate promoter.
  • This DNA fragment may or may not be fused to a DNA block coding for the homologous signal peptide or for a heterologous signal peptide. depending on whether we are looking for the secretion of the polypeptide.
  • this secretion will be sought and a signal sequence derived from a gene coding for a lipoprotein will be used.
  • the host cell can be a mammalian cell, a bacterium or a yeast: the latter two being preferred. Again, the choice of a particular line is within the reach of the skilled person.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition which comprises a DNA molecule coding for (i) the TbpB of the human transferrin receptor (RTH) of a strain of Neisseria meningitidis having a DNA sequence coding for TbpB. (a) which contains 2 Avall restriction sites, 3 Hindi restriction sites, no sp restriction site and no Vspl and Xhol or restriction site. preferably and, (b) from which it is possible to generate by PCR (polymerase chain reaction) using primers P3 of formula 5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3 'and P4 of formula 5'-GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3 '. a polynucleotide of 765 to 7 nucleotides, preferably of 772 nucleotides (strain of group BZ83); or (ii) a fragment of said TbpB.
  • RTH human transferrin receptor
  • the DNA molecule codes for a TbpB which comes from a strain of N. meningitidis belonging to the ET-5 complex or to lineage III.
  • this DNA molecule codes for a TbpB which comes from a strain of A 7 , meningitidis having a DNA sequence coding for TbpB which has a px Avall restriction profile consisting of 3 fragments of 1184, 477 and 415 nt and a restriction profile by Hindi consisting of 4 fragments of 1 155. 385. 276, and 257 nt.
  • this DNA molecule codes for a TbpB which has the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2 (strain BZ83).
  • a composition according to the DNA-based invention can further comprise a first DNA molecule coding for (i) a TbpB originating from a strain of A meningitidis forming part of the ET-5 complex and possessing a DNA sequence coding for TbpB (a) which does not contain restriction sites Avall and A7? oI or, and preferably.
  • the first additional DNA molecule codes for a TbpB which comes from a strain of N. meningitidis having a DNA sequence coding for TbpB. which contains 1 Vspl restriction site and 3 Hin i restriction sites.
  • this DNA molecule codes for a TbpB which comes from a strain of A ', meningitidis having a DNA sequence coding for TbpB which has a restriction profile by Vspl consisting of 2 fragments of 13 1 1 and 769 nt and a Vietnamese restriction profile consisting of 4 fragments of 1229, 319, 281 and 259 nt.
  • a composition according to the invention based on DNA can also further comprise a second additional DNA molecule coding for (i) a TbpB originating from a strain of N. meningitidis belonging to the ET-5 complex and having a sequence of DNA encoding TbpB (a) which contains 1 Avall restriction site, 2 Vspl restriction sites, 1 Xhol restriction site and 2 Hindi or. preferably and. (b) from which it is possible to generate by PCR using primers P3 of formula 5'- AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3 'and P4 of formula 5'-
  • GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3 ' a polynucleotide of 800 to 810 nucleotides. preferably 805 nucleotides (strain of group 8680): or (ii) a fragment of said TbpB.
  • the second additional DNA molecule codes for a TbpB which comes from a strain of .Y. meningitidis having a DNA sequence coding for TbpB which has a restriction profile by Avall consisting of 2 fragments of 1507 and 445 nt. a restriction profile by Vspl consisting of 3 fragments of 1298, 4 " 0 and 266 nt. a restriction profile by Xhol consisting of 2 fragments of 1551 and 483 nt and a restriction profile by Hindi consisting of 3 fragments of 1191, 527 and 316 nt
  • this DNA molecule codes for a TbpB which has the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 6 (strain 8680).
  • a composition according to the invention based on DNA may further comprise a DNA molecule coding for (i) a TbpB having an amino acid sequence of which the degree of homology with the sequence shown in SEQ ID NO: 4 is at least 85%, advantageously at least 90%; or (ii) a fragment of said TbpB.
  • it will be a DNA molecule coding for the TbpB of the strain M982 which has the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4.
  • a composition according to the invention based on DNA can also further comprise a DNA molecule coding for (i) a TbpB having an amino acid sequence whose degree of homology with the sequence shown in SEQ ID NO : 8 is at least 95%. preferably 100% (strain type B16B6); or (ii) a fragment of said TbpB.
  • the DNA molecule can advantageously be a plasmid which is unable both to replicate and to integrate substantially in the genome of a mammal.
  • the coding sequence cited above is placed under the control of a promoter allowing expression in a mammalian cell.
  • This promoter can be ubiquitous or specific for a tissue.
  • ubiquitous promoters mention is made of the early promoter of Cytomegalovirus (described in the patent and US No. 4, 168,062) and the promoter of the irus of Rous sarcoma (described in Norton & Coffin, Molec. Cell. Biol. (1985) 5: 281) .
  • the desmin promoter (Li et al.
  • Gene (1989) 78: 244443; Li & Paulin..!. Biol. Chem. (1993) 268: 10403) is a selective promoter which allows expression in muscle cells and also in skin cells.
  • a specific promoter of muscle cells is for example the promoter of the myosin or dystrophin gene.
  • Plasmid vectors which can be used for the purposes of the present invention are described i.a. in WO 94/21797 and Hartikka et al. Human Gene Therapv (1996) 7: 1205.
  • the DNA molecule or molecules may or may not be formulated.
  • the choice of formulation is very varied.
  • the DNA can simply be diluted in a physiologically acceptable solution with or without a carrier. When the latter is present, it can be isotonic or weakly hypertonic and have low ionic strength. For example, these conditions can be fulfilled with a sucrose solution e.g. 20%.
  • the DNA molecule (s) may be associated with agents which promote entry into the cell. It can be (ii) a chemical agent which modifies cell permeability, such as bupiv acaine (see for example WO 94/16737) or (ii) an agent which associates with the polynucleotide and acts as a vehicle facilitating the transport of polynucleotide.
  • a chemical agent which modifies cell permeability such as bupiv acaine (see for example WO 94/16737) or (ii) an agent which associates with the polynucleotide and acts as a vehicle facilitating the transport of polynucleotide.
  • the latter can in particular be cationic polymers eg of polysaccharide or a polyamine eg of derivatives of spermine (see WO 93/18759). They can also be fusogenic peptides eg GALA or Gramicidine S (see WO 93/19768) or else peptides
  • Liposomes can also be anionic or cationic lipids.
  • Anionic or neutral lipids have been known for a long time as being able to serve as transport agents, for example in the form of liposomes, to a large number of compounds including polynucleotides.
  • a detailed description of these liposomes, their constituents and their manufacturing processes is for example provided by Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990).
  • Cationic lipids are also known and commonly used as transport agents for polynucleotides.
  • Lipofectin I also known under the name of DOTMA (N- [l - (2,3-dioleyloxy) piOpylJ-NNN-trimethylammonium chloride).
  • DOTAP (1,2-bis (oleyloxy) -3- (trimethylammonio) propane), DDAB (dimethyldioctadecylammonium bromide), DOGS (dioctadecylamidoglycyl spermine) and cholesterol derivatives such as DC-chol (3 beta - (N - (N'.N'-dimethyl aminoethane) - carbamoyl) cholesterol).
  • DC-chol 3 beta - (N - (N'.N'-dimethyl aminoethane) - carbamoyl) cholesterol.
  • the cationic lipids are preferably used with a neutral lipid such as DOPE (dioleyl phosphatidylethanolamine) as is for example described in WO 90/1 1092.
  • Gold or tungsten microparticles can also be used as a transport agent, as described in WO 91/359. WO 9347706 and Tang et al. Nature
  • the polynucleotide is precipitated on the microparticles in the presence of calcium chloride and spermidine and then the whole is administered by jet at high speed in the dermis or in the epidermis. using a needle-free device such as those described in US Pat. Nos. 4,945,050 and No. 5,015,580 and WO 94/24243.
  • the amount of DNA that can be used to vaccinate an individual depends on a number of factors such as for example the strength of the promoter used to express the antigen, the immunogenicity of the product expressed, the condition of the mammal to which is intended for administration (eg, weight, age, and general health), method of administration and type of formulation.
  • administration by the intramuscular route requires a larger amount of DNA than administration by the intradermal route using a needle-free device.
  • a dose suitable for prophylactic or therapeutic use in an adult of the human species is from approximately 1 ⁇ g to approximately 5 mg, preferably from approximately 10 ⁇ g to approximately 1 mg, and very particularly preferably from approximately 25 ⁇ g to approximately 500 ⁇ g.
  • composition according to the present invention based on DNA contains several DNA molecules (one coding for TbpB of a strain of group BZ83 and the others for TbpB of a strain of another group or type), these molecules can exist in a separate form from each other (eg. a plasmid / coding sequence) or else can constitute one or more sets (eg. one and the same plasmid / two or more coding sequences).
  • a composition according to the present invention based on DNA can also contain compounds other than the immunogenic agent itself, the nature of these compounds depending to a certain extent on the administration route.
  • the pharmaceutical composition can include different formulating agents. For information, it is indicated that, in general, a DNA molecule may not require the addition of an adjuvant.
  • compositions according to the invention are in particular useful for inducing an immune response in humans against ⁇ '. meningitidis, inter alia a vaccine effect in order to protect the humans against infections with A " . meningitidis, in prevention or therapy.
  • compositions according to the present invention can be manufactured in a conventional manner.
  • they can be formulated with a diluent, carrier or a pharmaceutically acceptable carrier, eg water or a saline solution.
  • a diluent or carrier can be selected depending on the mode and route of administration and according to standard pharmaceutical practices.
  • Appropriate carriers or diluents as well as what is essential for the development of a pharmaceutical composition are described in Remi ⁇ gto ⁇ 's Pharmaceutical Sciences, a standard reference book in this field.
  • the compositions based on TbpBs can also contain an adjuvant.
  • a composition according to the invention can be administered by any conventional route of administration used in the field of vaccines.
  • the systemic route ia is used.
  • the parenteral route which itself can be chosen from intravenous, intramuscular, intradermal, intraepidermal and subcutaneous routes; the latter four, however, being preferred to the intravenous route.
  • the operation which consists in administering a pharmaceutical composition according to the present invention can be repeated one or more times, leaving a certain time interval between each administration: interval which is of the order week or month. Its precise determination is within the reach of those skilled in the art and may vary depending on various factors such as the nature of the immunogenic agent, the age of the individual, etc.
  • EXAMPLE 1 Meningococcal vaccine comprising four strain valences (BZ83, 8680, M982 and B16B6)
  • the RTH of each of the strains is purified according to the method described for the RTH of the strain 8680, in Example 1 of WO 97/13860.
  • the TbpB of each of the strains is purified according to the method described for the TbpB of the strain 8680. in Example 2 of WO 97/13860.
  • TbpBs Preparation of recombinant TbpBs
  • expression plasmids are constructed in which the sequences coding for the mature TbpBs are fused to the r / pB signal sequence of E. coli (Takase et al, J. Bact. (1983) 169: 50692) and placed under the control of the araB promoter (of Salmonella typhimurium (Horvvitz et al. Gene (1981) J_4: 309. Cagnon et al, Protein Engineering (1991) ) 4 (7): 843 and Legrain et al. Prot. Express. Purif. (1995) 6: 570).
  • plasmids also have an origin of functional replication in E. coli, a kanamycin resistance gene and the cer locus (Summers & Sherratt, Cell (1984) 36: 1097).
  • each of these plasmids is used to transform the E coli BL21 strain.
  • each of the selected transformants is cultured in a 20 liter fermenter in TGM 16 medium (Slos et al. Prot. Express. Purif. (1994) 6: 518) in the absence of ampicillin.
  • TGM 16 medium Slos et al. Prot. Express. Purif. (1994) 6: 5178
  • 0.2% arabinose expression inducer
  • cells were harvested and stored at - 20 C C.
  • Bacterial pellets are resuspended in Tris buffer and subjected to lysis at high pressure (Rannie). A series of washes and centrifugations follows.
  • the final pellet is dissolved in Tris buffer containing zvvittergent Z3-14, then ultracentrifuged. The supernatant is loaded onto a Q-Sepharose column. The direct eluate containing the TbpB is loaded onto a second column of Q-Sepharose and the TbpB is eluted in NaCl gradient. In order to remove the degradation products and endotoxins, the fraction containing TbpB is purified by gel filtration on an S-300 chromatography column. The final preparations are sterilized by filtration and subjected to freezing. 1D. Vaccine compositions
  • a vaccine composition is obtained by mixing equimolar amounts of each of the preparations TbpBs BZ83, 8680, M982 and B I 6B6 to obtain a final concentration of TbpBs of the order of 0.2 mg / ml.

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Abstract

L'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant (i) la sous-unité de moindre poids moléculaire (TbpB) du récepteur de la transferrine humaine (RTH) d'une souche de Neisseria meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB, (a) qui contient 2 sites de restriction AvaII, 3 sites de restriction HincII, aucun site de restriction VspI et aucun site de restriction XhoI ou (b) à partir de laquelle il est possible de générer par PCR (polymérase chain reaction) à l'aide des amorces P3 de formule 5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3' et P4 de formule 5'-GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3', un polynucléotide de 765 à 775 nucléotides. Une telle souche est par exemple la souche BZ83 dont la séquence d'ADN codant pour TbpB est montrée dans le SEQ ID NO 1.

Description

Vaccin Meningocoque Comportant la Valence de Souche BZ83
La présente invention a pour objet une nouvelle composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des infections à méningocoques qui comporte la sous-unité TbpB (Tbp2) du récepteur de la transferrine humaine (RTH) d'une souche de Neisseria meningitidis du complexe ET-5, groupe BZ83.
D'une manière générale, les méningites sont soit d'origine virale, soit d'origine bactérienne. Les bactéries principalement responsables sont : N. meningitidis et Haemophilus influenzae, respectivement impliquées dans environ 40 et 50 % des cas de méningites bactériennes.
On dénombre en France, environ 600 à 800 cas par an de méningites à .Y. meningitidis. Aux Etats-Unis, le nombre de cas s'élè\ e à env iron 2 500 à 3 000 par an.
L'espèce .Y. meningitidis est subdivisée en sérogroupes selon la nature des polysaccharides capsulaires. Bien qu'il existe une douzaine de sérogroupes, 90 % des cas de méningites sont attribuables à 3 sérogroupes : A. B et C.
Il existe des vaccins efficaces à base de polysaccharides capsulaires pour prévenir les méningites à N. meningitidis sérogroupes A et C. Ces polysaccharides tels quels ne sont que peu ou pas immunogéniques chez les enfants de moins de 2 ans et n'induisent pas de mémoire immunitaire. Toutefois, ces inconv énients peuvent être surmontés en conjuguant ces polysaccharides à une protéine porteuse.
Par contre, le polysaccharide de N. meningitidis groupe B n'est pas ou peu immunogène chez l'homme, qu'il soit sous forme conjuguée ou non. Ainsi, il apparaît hautement souhaitable de rechercher un v accin à rencontre des méningites induites par Y'. meningitidis notamment du sérogroupe B. autre qu'un v accin à base de polysaccharide.
A cette fin. différentes protéines de la membrane externe de Λ'. meningitidis ont déjà été proposées. Il s'agit en particulier du récepteur membranaire de la transferrine humaine.
D'une manière générale, la grande majorité des bactéries ont besoin de fer pour leur croissance et elles ont développé des systèmes spécifiques d'acquisition de ce métal. En ce qui concerne notamment N. meningitidis qui est un pathogène strict de l'homme, le fer ne peut être prélev é qu'à partir de protéines humaines de transport du fer telles que la transferrine et la lactoferrine puisque la quantité de fer sous forme libre est négligeable chez l'homme (de l'ordre de 10" ' ° M), en tout cas insuffisante pour permettre la croissance bactérienne.
Ainsi, N. meningitidis possède un récepteur de la transferrine humaine et un récepteur de la lactoferrine humaine qui lui permettent de fixer ces protéines chélatrices du fer et de capter par la suite le fer nécessaire à sa croissance.
Le récepteur de la transferrine humaine de la souche N. meningitidis B 16B6 a été purifié par Schryvers et al (WO 90/12591 ) à partir d'un extrait membranaire. Cette protéine telle que purifiée apparaît essentiellement constituée de 2 types de polypeptides : un polypeptide d'un poids moléculaire apparent élevé de 100 kDa et un polypeptide d'un poids moléculaire apparent moindre d'environ 70 kDa, telles que révélés après électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.
Le produit de la purification notamment mise en oeuv re par Schryvers est par définition arbitraire et pour les besoins de la présente demande de brevet, appelé récepteur de la transferrine humaine (RTH) et les polypeptides le constituant, des sous-unités. Dans la suite du texte, les sous-unités de poids moléculaire élev é et de poids moléculaire moindre sont respectivement appelées TbpA (ou Tb l ) et TbpB (ou Tbp2).
Depuis les travaux pionniers de Schryv ers et al. on a découvert que l'espèce \ meningitidis se répartissait essentiellement en 2 types de souches qui différaient par la constitution de leurs RTH respectifs (voir WO 93/6861 et WO 93/7172). Un premier tv pe de souche, dit type M982 (ou IM2169). possède une TbpB qui réagit avec un antisérum dirigé contre le RTH de la souche M982 mais qui ne réagit pas av ec un antisérum dirigé contre le RTH de la souche B 16B6 ( ou IM2394) ; tandis que l'autre type, dit type B16B6. possède une TbpB qui réagit avec un antisérum dirigé contre le RTH de la souche B 16B6 mais qui ne réagit pas avec un antisérum dirigé contre le RTH de la souche M982. Il existe donc bien une diversité antigénique au niveau de la sous-unité de moindre poids moléculaire. Cette diversité est toutefois restreinte puisqu'elle se résout en 2 grands types, contrairement à ce qui est suggéré par Griffiths et al, FEMS icrobiol. Lett. ( 1990) 69 : 31.
Des souches de type 982 sont par exemple la souche M982 dont la séquence du gène tbpB est décrite dans la demane de brevet EPA 586 266 et dans la banque de données EMBL sous le numéro de référence Zl 5130 ; les souches 6940. M978 et S3032 ont les séquences 5' des gènes tbpB sont décrites dans WO 95/ 33049 : les souches BZ83 et 8680 dont les séquences des gènes tbpB sont décrites dans WO 95/ 33049 et WO 97/13860 : respectivement (ces séquences peuvent être aussi trouvées dans la banque de données EMBL sous les numéros de référence respectifs Z50732 et Y09977) ; ou encore les souche 32/94, 8710 dont les séquences peuvent être trouvées dans la banque de données EMBL 5 sous les numéros d'accession respectifs Y09617 et Y09618. Ces souches ainsi que d'autres sont disponibles auprès du Dr Caugant. Centre de Référence des éningocoques collaborant avec l'Organisation Mondiale de la Santé. Institut National de la Santé Publique, Oslo. Norvège (voir Thèse de Doctorat présentée devant l'Université Claude Bernard - Lyon I par Bachra Rokbi. soutenue le 10 Oct. 1995, intitulée "Etude de la 10 variabilité antigénique et moléculaire du récepteur de la transferrine humaine de Λ'. meningitidis). Les caractéristiques des souches citées sont présentées dans le tableau IV ci-après. La séquence d'ADN codant pout la TbpB de la souche B 16B6 est décrite dans EPA 586 266.
15 L'étude des fragments d'ADN codant pour div erses TbpB a révélé une différence dans la taille de ces fragments selon le type dont ils étaient issus. Ceci a permis de faire évoluer les définitions des types M982 et B 16B6. originellement fournies dans WO 93/6861. On convient maintenant de définir les types de souches en fonction de la taille du gène TbpB : environ de 2,1 à 2,3 kb pour TbpB de type M982 et 1 .8 kb pour TbpB de type 0 B 16B6.
La protéine TbpB, plutôt que Tbpl , possède un certain nombre de caractéristiques qui en font un candidat vaccinal potentiel : une expression ubiquitaire. une accessibilité à la surface du germe, la capacité d'induire des anticorps bactéricides et une variabilité
25 limitée puisque comme cela vient d'être exposé, deux groupes majeurs ont été identifiés à ce jour.
En vertu de cette découverte, on a déjà proposé des compositions pharmaceutiques contenant :
(i) le RTH d'au moins une souche de type B 16B6 et le RTH d'au moins une souche de type M982 (WO 93/6861 ) ; ou
(ii) la TbpB d'au moins une souche de type B 16B6 et la TbpB d'au moins une souche de type M982 (WO 93/7172).
Les souches responsables des cas de méningites de part le monde (cas isolés ou épidémie) sont collectées, étudiées et classées selon divers critères. Une première méthode universellement en usage, consiste à classer les méningocoques en sérogroupes, serotypes et sous-serotypes sur la base de différences antigéniques au niveau des polysaccharides capsulaires, de la protéine de membrane externe de classe 2/3 et de la protéine de membrane externe de classe 1 , respectivement. Cette classification s'effectue à l'aide d'anticorps monoclonaux. Par exemple, la souche M982 est ainsi répertoriée comme étant de sérogroupe B, sérotype 9, sous-sérotype PI .9 (B:9:P1.9).
Une autre méthode de classement d'usage international, repose sur la mobilité électrophorétique de certaines enzymes métaboliques. Il s'agit du MLEE (Multi Locus Electrophoresis Enzyme) dont l'emploi est en particulier décrit dans Olyhoek et al. in « The Pathogenic Neisseriae », ( 1985), éd. Schoolnick G.K. (American Society for Microbiology) : 530 ; Caugant et al, J. Gen. Microbiol. ( 1986) J_32 : 641 ; Selander et al. Appl. Env . Microbiol. ( 1986) 5J_ : 873 ; Caugant et al. Genetics ( 1981 ) 98 : 464 ; Caugant et al, PNAS ( 1986) 83_ : 4931. D'une manière générale, on analyse les 15 enzymes suivantes : l'enzyme malique (MAE), la glucose-6-phosphate déhydrogénase (G6P). la peptidase (PEP), l'isocitrate déhydrogénase (IDH ). les glutamate déhydrogénases nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) phosphate dépendante (GD I et GD2), l'alcool déhydrogénase (ADH), la fumarase (FUM), la phosphatase alcaline (ALK). les indophénol oxydases (IP1 et IP2), l'adénylate kinase (ADK.) et la déhydrogénase (UDH ). Les électromorphes (ou alloenzymes) de chaque enzyme correspondent à des allèles d'un même locus génétique. Une combinaison particulière des allèles de ces 15 enzymes constitue un type électrophorétique (ET). Ces types peuvent être regroupés en famille ou complexe (cluster). Par exemple, le complexe ET-5 est constitué de 22 types électrophorétiques très étroitement reliés (la distance génétique maximum est de 0.16 ). Dans le tableau suivant, on indique le profil allélique des souches de type électrophorétique ET-5 (numéro de l'allèle par locus pour chacune des 15 enzymes). En gras sont indiquées les enzymes (G6P et UDH) pour lesquelles le ou les allèles sont susceptibles de varier au sein du complexe ET-5.
Tableau
Figure imgf000006_0001
Différents types ou complexes électrophorétiques proches peuvent se retrouver au sein de lineages. A ce jour, 10 lineages (I à X) représentant chacun un ensemble d'au moins cinq types électrophorétiques proches les uns des autres, ont été définis comme décrit par exemple dans Caugant et al, J. Infect. Dis. ( 1990) J_62 : 867. Par exemple, le lineage III regroupent les types ET 24, 24.1 - 4 et 25.
Au cours des derniers 25 ans, les souches responsables d'un grand nombre de méningites de part le monde (e.g., Etats-Unis (Oregon, état de Washington). Norvège, Cuba, Chili, Brésil, Pays-Bas, Nouvelle-Zélande) se sont révélées appartenir au complexe ET-5 ou au lineage III II est donc très vite apparu souhaitable de proposer un vaccin comportant un antigène, par exemple une TbpB pro enant d'une souche de ce complexe. En fait c'est ce qui est déjà réalisé dans les différentes compositions vaccinales déjà connues dans la mesure où elles emploient une TbpB provenant de la souche 8680 (v oir WO 97/13860). Cette souche appartient en effet au complexe ET-5.
Cependant on a maintenant découvert que les isolais cliniques appartenant au complexe ET-5 présentaient une certaine variabilité au niveau du gène tbpB. L'étude a porté sur 3 1 isolats responsables de récentes épidémies de méningites par le monde. Les gènes tbpB ont été analysés (a) d'une part pour leurs profils de restriction par les enzymes Avall, Hincll, Vspl et Xhol après amplification du gène à partir de l'ADN génomique et à l'aide des amorces P I (SEQ ID NO : 9 ; P I correspond aux positions 1 15 à 1 13 de la séquence du gène M982 tbpB, tel que trouvé dans la banque EMBL. sous le numéro d'accession Z 15 130) et P2 (anti-sens ; SEQ ID NO : 10 : P2 correspond aux positions 2264 à 2244 de la séquence du gène M982 tbpB. tel que trouv é dans la banque EMBL. sous le numéro d'accession Z15130) ; et (b) d'autre part pour la taille du fragment PCR (polymérase chain reaction), dérivé du gène tbpB qui peut être amplifié à partir de l'ADN génomique à l'aide des amorces P3 (SEQ ID NO : 1 1 ) et P4 (anti-sens ; SEQ ID NO : 12 ).
Les profils de restriction des gènes tbpB des souches M982. BZ83 et 8680 sont présentés dans le tableau II ci-après. On note que la souche M982 n'appartient pas au complexe ET-5. Néanmoins elle est étudiée car elle sert de référence pour l'ensemble des souches possédant un gène tbpB de 2, 1 à 2,3 kb. Tableau II
Figure imgf000008_0001
A' : non coupé.
Ces profils ont été appelés par des lettres dans le tableau III ci-après
Tableau III
Figure imgf000008_0002
Les résultats pour l'ensemble des souches sont présentés dans le tableau IV ci-après
Tableau IV
Taille du
Souche Sérogroupe Année Origine produit PCR Profil de restriction
(nt) ( ) du gène tbpB (h) avec
A va II Vspl Xhol Hin i
BZ83 B:15: - 1984 Pays-Bas 772 A N N B
BZ169 B:15:P1.16 1985 Pavs-Bas 772 A N N B
NG080 B:15:P1.16 1981 Norway 772 A N N B
NG1/84 B:15:P1.16 1985 Noπège 772 A N N B
NGP355 B:15:P1.15 1975 Non ège 772 A N N B
NGPB24 B:15:P1.7.16 1984 Non ège 772 A N N B
NGPB37 B:15:P1.7,16 1987 Non ège 772 A N N B
3294 B:15:P1.7.16 1994 Non ège 772 A N N B
44 B:I5:P1.7.16 1993 Finlande 772 A N N B
5 B:15:P1.7.16 1993 Finlande 7^2 A N N B
Glll'91 B:15:P1.3.15 1991 Islande 772 Λ N N B 359/91 B:15:P1.3.15 1 91 Islande 772 A N N B
MΛ-5850 B:4:P1.15 1985 Espagne 772 \ N N B
281 B:4:P1.15 1992 Fspagne 772 A N N B
8679 B:15:P1.3 1987 Chili 772 Λ N N B
ΛΘ15 B:4:P1.12 1988 Afrique du 772 Λ N N B Sud
AO20 B:4:P1.15 1989 Afrique du 772 \ N N B Sud
8680 B:15:P1.3 1987 Chili 805 C D F r
8726 B:4:P1.3 1987 Chili 805 C D F I
NG3'83 B:15:P1.16 1984
Figure imgf000009_0001
805 C D F F
* M9.S2 B.9:P1. i S.1 H44 \ G Λ 1
NG 144/82 B:15:P1.16 1982 Non ège 844 \ i N II
58-94 B: 15: 12, 13a 1994 Non ège 844 \ G N I
92 '94 B: 15:7, 16 1994 Non ège 844 \ G N I
50491 B:4:- 1991 Argentine 844 N G N J
M871 B:15:P1.7,16 1992 Israël 844 \ G N F
230.89 B:4:P1.15 1989 Cuba 844 \ N N t
BB393 B:15: 1.3 1986 Chili 844 \ N N F
BB396 B:15: 1.3 1986 Chile 844 N N N F
8694 B:15:- 1987 Chili 844 \ N N t
8696 B:15:P1.3 1987 Chili 844 N N N F
8710 B:15:P1.3 1987 Chili 832 N N N (i
L'astérisque signale la souche M982 qui ne fait pas partie du complexe ET- 5. (a) La taille du fragment indiqué est celle du fragment amplifié à partir de TADX génomique à l'aide des amorces P3 et P4. calculée à la base près lorsque la séquence complète du gène était disponible (souches M892. BZ83 et 86X0) ou déterminée après migration sur un gel 3 % d'agarose par comparaison avec le fragment PCR généré pour les souches M892. BZ83 et 8680. Pour mener à bien cette étude, on a tout d'abord extrait l'ADN génomique des s ches cultivées sur des plaques d'agar Muelier-Hinton (MHΛ. Difco). L'extraction de l'ADN a été effectuée en utilisant une méthode rapide au guanidium isothiocyanate (Pitcher et al. Letters in Applied Microbiology (1989) 8 : 151). les réactions PCR ont été mises en oeuvre sous un volume de 100 μl contenant 200 μλf (chacun) de dCTP. dGTP. dA TP et dTTP (Pharmacia-LKB) : 0.2 μM de chacune des amorces et 2.5 U de Taq polymérase (Appligène). Les amplifications ont eu lieu dans un DNA thermocycler (Biometra. Trio-thermobloc) programmé comme suit : dé aturation initiale à 95°C pendant 5 min puis 25 cycles : chacuns comprenant une dénaturation consécutive (30 sec, 95°C). annealing (30 sec. 58°C) et extension de la chaîne d'ADN ( 1 min. 72°C). La taille des fragments amplifiés est déterminée après électrophorèse du produit d'amplification sur gel d'agarose à 3 %.
(b) Profils de restriction des gènes amplifiés par PCR partir de l'ADN génomique. à l'aide des amorces PI et P2 ; Les lettres A à G et N font référence aux profils de restriction indiqués dans le tableau III (H correspond au profil de restriction : 1230. 320,270. 210 et 80 nt ; J correspond au profil de restriction : 1350, 570 et 330 nt). Pour mener à bien cette étude, l'ADN des souches a été préparé comme décrit ci-dessus en (a) puis amplifié dans les conditions suivantes : 25 cycles : chacuns comprenant une dénaturation de l'ADN (1 min, 94°C). annealing (2 min. 58CC). et extension (3 min, 72°C). Chacun des fragments amplifiés a été purifié sur une colonn Qiaquick (Oiagen) et digéré par les quatre enzymes dans quatre réactions séparées en suivant les instructions du fabriquant Λ'eir England Biolabs). Les produits de restriction ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %.
On a ainsi montré que la variabilité évoquée ci avant se résolvait en 3 groupes majeurs ( voir Tableau IV). Le groupe le plus important contenait 1 7 souches, dont la souche BZ83 (pourcentage de représentation 54.8 %). Il était suivi d'un groupe de 10 souches caractérisé par un fragment PCR de taille unique (844 nt) et identique à celle du fragment PCR obtenue avec la souche M982. Bien que la souche M982 ne fasse pas elle- même partie de ce groupe, on le désigne cependant par la suite sous le nom de groupe M982 en raison de cette identité de taille (on notera que les termes groupe M982 et type M982 ne désignent pas la même chose). Parmi ces 1 0 souches, les profils de restriction des gènes tbpB présentent une certaine hétérogénéité : aucun des gènes n'est coupé par Avall ni par Xhol : en ce qui concerne Vspl, soit il n'y a pas de site de restriction, soit il offre un profil de restriction de type G : et les profils de restriction obtenus avec Hind i sont encore plus hétérogènes. En terme de représentation, venait ensuite un groupe de 3 souches parmi lesquelles la souche 8680. Bien que la souche 8710 se caractérise par un fragment PCR de taille plus petite que ceux caractérisant les souches du groupe M982. le profil de restriction de son gène tbpB montre bien que cette souche s'apparente au groupe M982.
Pour confirmer la valeur de prédiction de la classification basée sur le type du fragment PCR, les gènes tbpB des souches 32/94, 8726 et 8710 (citées dans tableau IV ci- avant) ont été clones, séquences et alignés avec les séquences des gènes tbpB des souches prototype BZ83. M982 et 8680 en utilisant le programme d'alignement multiple Clustal d'Infobiogen (Dessen et al, Bisance : "un programme français pour accéder aux banques de données de séquences biomoléculaires" ( 1990) Cabios 6 : 355). Les résultats des comparaisons sont donnés dans le tableau V ci-après, en termes de pourcentages d'homologie (identité) et confirment bien la pertinence de la classification par analyse PCR.
Tableau V
Figure imgf000011_0001
Les travaux concernant l'analyse du gène tbpB rapportés ci-avant ont fait l'objet d'une publication (Rokbi et al. Clin. Diag. Lab. lmmunol. (Sept. 1997) 4 (5) : 522.
Depuis on a découvert que des souches n'appartenant pas au complexe ET-5 possédaient des gènes tbpB dont le profil par enzymes de restriction étaient identiques à celui du gène tbpB de la souche BZ83. Certaines de ces souches appartiennent au lineage III : il s'agit par exemple de la souche 90'94 (Collection Dr Caugant).
Sachant que la sélection des isolats testés représente des épidémies d'origine territoriale variée et compte tenu de l'importante représentation parmi eux du groupe illustré par la souche BZ83. il n'est pas douteux que les souches de ce groupe soient prédominantes dans les récentes épidémies. Il apparaît souhaitable d'inclure dans un vaccin une TbpB provenant d'une souche du groupe illustré par la souche BZ83, appelle ci-après groupe BZ83. C'est pourquoi l'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant (i) la sous-unité de moindre poids moléculaire (TbpB) du récepteur de la transferrine humaine (RTH) d'une souche de Neisseria meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB, (a) qui contient 2 sites de restriction Avall, 3 sites de restriction Hin i. aucun site de restriction Vspl et aucun site de restriction Vspl et Xhol ou, de préférence et. (b) à partir de laquelle il est possible de générer par PCR (polymérase chain reaction) à l'aide des amorces P3 de formule 5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3' et P4 de formule 5'-GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3', un polynucleotide de 765 à 775 nucleotides, de préférence de 772 nucleotides (souche du groupe BZ83) ; ou (ii) un fragment de ladite TbpB.
Par "sous-unité TbpB d'une souche, ou qui dériv e, provient ou est issue d'une souche de N. meningitidis" on entend bien évidemment une dérive prise dans son sens le plus général ; c'est-à-dire non limitée à un procédé physique, mais le fruit d'un processus intellectuel. Ainsi cette expression recouvre i.a. une TbpB produite par voie recombinante e.g. dans E. coll.
La souche de N. meningitidis dont est issue la TbpB utile aux fins de la présente invention, est de préférence une souche appartenant au complexe ET- 5 ou au lineage III. Par exemple, une souche du groupe BZ83 faisant partie du complexe ET-5 est la souche 32/94. Une souche du groupe BZ83 faisant partie du lineage III est la souche 90/94. Les séquences des gènes tbpB de ces souches sont données dans l'identificateur de séquence ci-après.
Selon un mode avantageux, la TbpB entrant dans la composition selon l'invention provient d'une souche de N. meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui présente un profil de restriction a Aval l constitué de 3 fragments de 1 184, 477 et 415 nt et un profil de restriction par Hindi constitué de 4 fragments de 1 155. 385, 276. et 257 nt. De préférence, cette TbpB possède la séquence d'acides aminés telle que montrée dans le SEQ ID NO : 2 (souche BZ83).
De manière alternative on peut utiliser des fragments obtenus à partir d'une TbpB d'une souche adhoc. Des fragments utiles à des fins vaccinales peuvent être définis selon la méthode proposée dans WO 95/33049.
WO 95/33049 enseigne que l'étude des sous-unités TbpB quelque soit la souche d'origine, permet de mettre en évidence, trois domaines de structure principaux associes pour au moins l'un d'entre eux à des propriétés particulières. Par définition, les domaines de TbpB M982 et TbpB B 16B6 ont été fixés comme le montre le tableau VI ci-après, en indiquant la position des acides aminés, bornes incluses des différents domaines, et par référence à la numérotation apparaissant dans les SEQ ID NO 4 et 8.
Figure imgf000013_0001
Cette définition s'applique de même à toutes les TbpBs de type M982 ou B 16B6. après alignement d'une séquence type M982 ou B 16B6 sur la séquence de référence, au maximum d'homologie. Ainsi, à titre d'exemple, on indique la position des domaines de la sous-unité TbpB de la souche 8680 comme suit : premier domaine ( 1 - 334). deuxième domaine (335 - 530) et troisième domaine (531 - 677).
Sachant que le domaine N-terminal ou premier domaine comporte dans son intégralité le site de liaison à la transferrine et se trouv e donc très vraisemblablement exposé vers l'extérieur, le seul domaine N-terminal constitue par conséquent un élément de choix à des fins i.a. vaccinales.
D'autre part, l'étude comparative des séquences TbpBs M982 et B 16B6 alignées au maximum d'homologie, met en évidence quatre portions hv perv ariables localisées au sein de la région charnière (aussi appelée domaine charnière, comme cela apparaît dans le tableau ci-dessus) de TbpB M982 ; portions qui sont absentes dans la TbpB B 16B6. Ces portions hvper ariables se retrou ent chez toutes les TbpBs de type M982. Les souches de type B 16B6 en sont dépourvues. Par la suite, on entend par "région charnière de type M982" une région charnière qui possède ces quatre portions hvpervariables.
Par comparaison des séquences de diverses TbpBs de type M982. on sait aussi que la région charnière présente une variabilité supérieure à celle des deux autres domaines. Dans la mesure où la région charnière ne semblait pas indispensable à la fonction de fixation de la transferrine humaine, on a postulé que le rôle de cette région est au moins en partie d'induire une variabilité-"écran" afin d'éviter la reconnaissance d'une souche par le système immunitaire d'un individu ayant connu ultérieurement une autre souche.
Dans cette hypothèse, la région charnière des souches de type M982 constitue un problème majeur dans la réalisation d'un vaccin. En effet si cette région est immunodominante, lors d'une immunisation, les anticorps induits seront dirigés majoritairement contre cette région et par conséquent la réponse immunitaire sera spécifique de la protéine TbpB de la souche homologue.
En tenant compte des observations et hypothèses évoquées ci-dessus, il donc été déjà proposé d'utiliser i.a. à des fins vaccinales, non plus des TbpBs de type M982 entières, mais des TbpBs au moins délétées de leurs quatre portions hypervariables ou de façon alternativ e, délétées des deuxième et troisième domaines.
Une composition selon l'invention peut aussi contenir une TbpB provenant d'une souche du groupe M982 ou du groupe illustré par 8680 (groupe 8680).
Ainsi, une composition selon l'invention peut comprendre en outre (i) une première TbpB additionnelle provenant d'une souche de Λ'. meningitidis faisant partie du complexe ET-5 et possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB (a) qui ne contient pas de sites de restriction Aval et Xhol ou, de préférence et, (b) à partir de laquelle il est possible de générer par PCR à l'aide des amorces P3 de formule 5'- AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3' et P4 de formule 5'-
GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3', un polynucleotide de 840 à 850 nucleotides. de préférence de 844 nucleotides (souche du groupe M982) ; ou (ii) un fragment de ladite première TbpB additionnelle.
Selon un mode avantageux, la première TbpB additionnelle provient d'une souche de N. meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui contient 1 site de restriction Vspl et 3 sites de restriction Hindi. De manière préférée, cette TbpB prov ient d'une souche de .Y meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui présente un profil de restriction par Vspl constitué de 2 fragments de 131 1 et 769 nt et un profil de restriction par Hin i constitué de 4 fragments de 1229, 319, 281 et 259 nt.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut aussi comprendre en outre
(i) une deuxième TbpB additionnelle provenant d'une souche de N. meningitidis faisant partie du complexe ET-5 et possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB (a) qui contient 1 site de restriction Avall. 2 sites de restriction Vspl. 1 site de restriction Xhol et 2 sites de restriction Hin i ou, de préférence et, (b) à partir de laquelle il est possible de générer par PCR. à l'aide des amorces P3 de formule 5'- AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3' et P4 de formule 5'-
GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3'. un polynucleotide de 800 à 810 nucleotides. de préférence de 805 nucleotides (souche du groupe 8680) ; ou (ii) un fragment de ladite deuxième TbpB additionnelle.
Selon un mode avantageux, la deuxième TbpB additionnelle provient d'une souche de N. meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui présente un profil de restriction par Avall constitué de 2 fragments de 1507 et 445 nt, un profil de restriction par Vspl constitué de 3 fragments de 1298, 470 et 266 nt, un profil de restriction par A7?oI constitué de 2 fragments de 1551 et 483 nt et un profil de restriction par Hindi constitué de 3 fragments de 1 191 , 527 et 3 16 nt. De manière préférée, cette deuxième TbpB additionnelle possède la séquence d'acides aminés telle que montrée dans le SEQ ID NO : 6 (souche 8680).
Outre des TbpBs provenant de souches du complexe ET-5. une composition selon l'invention peut aussi contenir une ou plusieurs TbpBs prov enant de souches d'autres complexes électrophorétiques. En particulier, on prévoit d'adjoindre (i) une TbpB d'une souche du type M982 c'est-à-dire d'une souche possédant un gène tbpB d'environ 2.1 à 2.3 kb et dont le degré d'homologie (identité) avec la TbpB M982 serait plus important que ceux observés en comparant les TbpBs des souches du complexe ET-5 et la TbpB M982 (homologie au niv eau de la séquence d'acides aminés) ou ( ii ) une TbpB d'une souche du type B 16B6 c'est-à-dire d'une souche possédant un gène tbpB d'environ 1 ,8 kb.
Ainsi, une composition pharmaceutique selon l'invention peut comprendre en outre (i) une TbpB possédant une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence montrée dans le SEQ ID NO : 4. de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 691. est d'au moins 85 %, de manière avantageuse d'au moins 90 % ou (ii) un fragment de ladite TbpB. De manière préférée, il s'agira de la TbpB de la souche M982 qui possède la séquence d'acides aminés telle que montrée dans le SEQ ID NO : 4.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut aussi comprendre en outre (i) une TbpB possédant une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence montrée dans le SEQ ID NO : 8, de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 579. est d'au moins 95 %, de préférence 100 % (souche de type B 16B6) : ou (ii) un fragment de ladite TbpB. En alternative aux diverses TbpBs additionnelles possibles, on peut aussi utiliser un fragment de ces dernières. Les fragments utiles peuvent être déterminés comme cela est expliqué dans WO 95/33049.
Les TbpBs utiles aux fins de la présente invention peuvent être sous forme dissociée de la sous-unité de haut poids moléculaire (Tbpl ) de la souche de N. meningitidis dont est issue la TbpB ou bien en association a ec cette Tbpl , formant ainsi un complexe Tbpl - TbpB considéré comme le récepteur de la transferrine humaine ; en d'autres termes, elles peuvenr être sous forme dépourvue de leurs sous-unités de haut poids moléculaire (Tbpl s) correspondantes ou bien associée à cette dernière, de manière à former un RTH. Qu'elle soit sous forme dissociée ou sous forme de complexe Tbp l -TbpB, la sous-unité TbpB selon l'invention doit être substantiellement purifiée ; c'est-à-dire séparée de l'environnement dans lequel elle existe de manière naturelle. Entre autres, il peut s'agir d'une préparation notamment dépourvue des protéines eytoplasmiques et périplasmique^ de A', meningitidis .
Une sous-unité TbpB utile aux fins de la présente inv ention peut être sous forme dissociée de la sous-unité de haut poids moléculaire (Tbp l ) de la souche de A'. meningitidis dont est issue la TbpB ou bien en association av ec cette Tbpl , formant ainsi un complexe Tbpl -TbpB considéré comme le récepteur de la transferrine humaine. Qu'elle soit sous forme dissociée ou sous forme de complexe Tbp l -TbpB. la sous-unité TbpB selon l'invention doit être substantiellement purifiée : c'est-à-dire séparée de l'environnement dans lequel elle existe de manière naturelle. Entre autres, il peut s'agir d'une préparation notamment dépourvue des protéines eytoplasmiques et périplasmiques de N. meningitidis.
Aux fins de la présente invention, on peut utiliser une ou des TbpBs purifiées à partir des souches de méningocoque selon des méthodes déjà connues (voir entre autre WO 97/13860) ou bien obtenues par v oie recombinante dans un système d'expression homologue ou hétérologue.
Un système d'expression approprié est à la portée de l'homme de l'art dans la mesure où il dispose des séquences de gènes tbpB. Il lui faut en particulier construire une cassette d'expression dans laquelle un fragment d'ADN codant pour une TbpB mature ou un fragment de celle-ci sera placé sous le contrôle d'un promoteur approprié. Ce fragment d'ADN peut être ou non fusionné à un bloc d'ADN codant pour le peptide signal homologue ou pour un peptide signal hétérologue. selon que l'on recherche ou non la sécrétion du polypeptide. De préférence, cette sécrétion sera recherchée et on utilisera une séquence signal dérivée d'un gène codant pour une lipoprotéine.
Des éléments tels qu'un bloc d'ADN codant pour un peptide signal hétérologue (région signal) ou un promoteur existent déjà en assez grand nombre et sont connus de l'homme du métier. Ses compétences générales lui permettront de choisir une région signal ou un promoteur particulier qui seront adaptés à la cellule-hôte dans laquelle il envisage l'expression.
Aux fins du procédé selon l'inv ention, la cellule-hôte peut être une cellule de mammifère, une bactérie ou une levure : ces deux dernières étant préférées. Là aussi, le choix d'une lignée particulière est à la portée de l'homme du métier.
L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique qui comprend une molécule d'ADN codant pour (i) la TbpB du récepteur de la transferrine humaine (RTH ) d'une souche de Neisseria meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB. (a) qui contient 2 sites de restriction Avall, 3 sites de restriction Hindi, aucun site de restriction l'sp et aucun site de restriction Vspl et Xhol ou. de préférence et, (b) à partir de laquelle il est possible de générer par PCR (polymérase chain reaction) à l'aide de^ amorces P3 de formule 5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3' et P4 de formule 5'-GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3'. un polynucleotide de 765 à 7 nucleotides, de préférence de 772 nucleotides (souche du groupe BZ83 ) ; ou (ii ) un fragment de ladite TbpB.
De préférence, la molécule d'ADN code pour une TbpB qui provient d'une souche de N. meningitidis appartenant au complexe ET- 5 ou au lineage III.
Selon un mode avantageux, cette molécule d'ADN code pour une TbpB qui provient d'une souche de A7, meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui présente un profil de restriction p x Avall constitué de 3 fragments de 1 184, 477 et 415 nt et un profil de restriction par Hindi constitué de 4 fragments de 1 155. 385. 276, et 257 nt. De préférence, cette molécule d'ADN code pour une TbpB qui possède la séquence d'acides aminés telle que montrée dans le SEQ ID NO : 2 (souche BZ83).
Une composition selon l'inv ention à base d'ADN peut comprendre en outre une première molécule d'ADN codant pour (i ) une TbpB provenant d'une souche de A meningitidis faisant partie du complexe ET-5 et possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB (a) qui ne contient pas de sites de restriction Avall et A7?oI ou, de préférence et. (b) à partir de laquelle il est possible de générer par PCR à l'aide des amorces P3 de formule 5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3' et P4 de formule 5'- GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3', un polynucleotide de 840 à 850 nucleotides, de préférence de 844 nucleotides (souche du groupe M982) ; ou (ii) un fragment de ladite TbpB.
Selon un mode avantageux, la première molécule d'ADN additionnelle code pour une TbpB qui provient d'une souche de N. meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB. qui contient 1 site de restriction Vspl et 3 sites de restriction Hin i. De manière préférée, cette molécule d'ADN code pour une TbpB qui provient d'une souche de A', meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui présente un profil de restriction par Vspl constitué de 2 fragments de 13 1 1 et 769 nt et un profil de restriction par Hindi constitué de 4 fragments de 1229, 319, 281 et 259 nt.
Une composition selon l'invention à base d'ADN peut aussi comprendre en outre une deuxième molécule d'ADN additionnelle codant pour (i ) une TbpB provenant d'une souche de N. meningitidis faisant partie du complexe ET-5 et possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB (a) qui contient 1 site de restriction Avall, 2 sites de restriction Vspl, 1 site de restriction Xhol et 2 sites de restriction Hindi ou. de préférence et. (b) à partir de laquelle il est possible de générer par PCR à l'aide des amorces P3 de formule 5'- AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3' et P4 de formule 5'-
GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3', un polynucleotide de 800 à 810 nucleotides. de préférence de 805 nucleotides (souche de groupe 8680) : ou (ii) un fragment de ladite TbpB.
Selon un mode avantageux, la deuxième molécule d'ADN additionnelle code pour une TbpB qui provient d'une souche de .Y. meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui présente un profil de restriction par Avall constitué de 2 fragments de 1507 et 445 nt. un profil de restriction par Vspl constitué de 3 fragments de 1298, 4"0 et 266 nt. un profil de restriction par Xhol constitué de 2 fragments de 1551 et 483 nt et un profil de restriction par Hindi constitué de 3 fragments de 1 191 , 527 et 316 nt. De manière préférée, cette molécule d'ADN code pour une TbpB qui possède la séquence d'acides aminés telle que montrée dans le SEQ ID NO : 6 (souche 8680).
Une composition selon l'invention à base d'ADN peut comprendre en outre une molécule d'ADN codant pour (i) une TbpB possédant une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence montrée dans le SEQ ID NO : 4 est d'au moins 85 %, de manière avantageuse d'au moins 90 % ; ou (ii) un fragment de ladite TbpB. De manière préférée, il s'agira d'une molécule d'ADN codant pour la TbpB de la souche M982 qui possède la séquence d'acides aminés telle que montrée dans le SEQ ID NO : 4.
Une composition selon l'invention à base d'ADN peut aussi comprendre en outre une molécule d'ADN codant pour (i) une TbpB possédant une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence montrée dans le SEQ ID NO : 8 est d'au moins 95 %. de préférence 100 % (souche de type B16B6) ; ou (ii) un fragment de ladite TbpB.
La molécule d'ADN peut avantageusement être un plasmide qui est incapable à la fois de se répliquer et de s'intégrer de manière substantielle dans le génome d'un mammifère. La séquence codante citée ci-dessus est placée sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression dans une cellule de mammifère. Ce promoteur peut être ubiquitaire ou spécifique d'un tissu. Parmi les promoteurs ubiquitaires. on cite le promoteur précoce du Cytomégalovirus (décrit dans le brev et US n° 4, 168,062) et le promoteur du v irus du sarcome de Rous (décrit dans Norton & Coffin, Molec. Cell. Biol. ( 1985) 5 : 281 ). Le promoteur desmine (Li et al. Gène ( 1989) 78 : 244443 ; Li & Paulin. .!. Biol. Chem. ( 1993) 268 : 10403) est un promoteur sélectif permet l'expression dans les cellules musculaires et aussi dans les cellules de la peau. Un promoteur spécifique des cellules musculaires est par example le promoteur du gène de la myosine ou de la dystrophine. Des vecteurs plasmidiques que l'on peut utiliser aux fins de la présente invention sont décrits i.a.. dans WO 94/21797 et Hartikka et al. Human Gène Therapv ( 1996) 7 : 1205.
Dans une composition selon la présente invention à base d'ADN, la ou les molécules d'ADN peuvent être formulées ou non. Le choix de la formulation est très varié. L'ADN peut être simplement dilué dans une solution acceptable d'un point de vue physiologique avec ou sans porteur. Lorsque ce dernier est présent, il peut être isotonique ou faiblement hypertonique et avoir basse force ionique. Par exemple, ces conditions peuvent être remplies par une solution de sucrose e.g. à 20 %.
De manière alternative, la ou les molécules d'ADN peuv ent être associées avec des agents qui favorise l'entrée dans la cellule. Ce peut être (ii) un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire, telle que la bupiv acaine (voir par exemple WO 94/16737) ou (ii) un agent s'associant au polynucleotide et agissant en tant que véhicule facilitant le transport du polynucleotide. Ce dernier peut être notamment des polymères cationiques e.g. de la polv lysine ou une polyamine e.g. des dérivés de la spermine (voir WO 93/18759). Ce peut être également des peptides fusogéniques e.g. du GALA ou de la Gramicidine S (voir WO 93/19768) ou bien encore des peptides dérivés des protéines de fusion virales.
II peut aussi s'agir de lipides anioniques ou cationiques. Les lipides anioniques ou neutres sont connus depuis longtemps comme pouvant servir d'agents de transport, par exemple sous forme de liposomes, à un grand nombre de composés y compris les polynucléotides. Une description détaillée de ces liposomes, de leurs constituants et de leurs procédés de fabrication est par exemple fournit par Liposomes : A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press ( 1990).
Les lipides cationiques sont aussi connus et communément utilisés comme agents de transport pour les polynucléotides. On cite par exemple la LipofectinI aussi connue sous le nom de DOTMA (N-[ l -(2,3-dioleyloxy) piOpylJ-N.N.N-trimethylammonium chloride). le DOTAP ( l ,2-bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio) propane), le DDAB (dimethyldioctadecylammonium bromide), le DOGS (dioctadecylamidoglycyl spermine) et les dérivés du cholestérol tel que le DC-chol (3 bêta -(N-(N'.N'-dimethyl aminoethane)- carbamoyl) cholestérol). Une description de ces lipides est fournie par EP 187,702, WO 90/1 1092, le brevet US N° 5,283,185, WO 91 /15501. WO 95/26356 et le brev et US Nc 5,527,928. Les lipides cationiques sont utilisés de préférence av ec un lipide neutre tel que la DOPE (dioleyl phosphatidylethanolamine) comme cela est par exemple décrit dans WO 90/1 1092.
Des microparticules d'or ou de tungstène peuvent aussi être utilisées comme agent de transport, tel que c'est décrit dans WO 91/359. WO 9347706 et Tang et al. Nature
• ( 1992) 356 : 152. Dans ce cas là, le polynucleotide est précipité sur les microparticules en présence de chlorure de calcium et de spermidine puis l'ensemble est administré par jet à haute vitesse dans le derme ou dans l'épiderme. à l'aide d'un appareil sans aiguille tel que ceux décrits dans les brevets US N° 4,945,050 et N° 5,015.580 et WO 94/24243.
La quantité d'ADN qui peut être utilisée pour vacciner un individu dépend d'un certains nombre de facteurs tels que par exemple la force du promoteur utilisé afin d'exprimer l'antigène, l'immunogénicité du produit exprimé, la condition du mammifère auquel est destinée l'administration (e.g.. le poids, l'âge, et l'état de santé général), le mode d'administration et le type de formulation. On indique en particulier, que l'administration par voie intramusculaire requiert une quantité d'ADN plus importante que l'administration par voie intradermique à l'aide d'un appareil sans aiguille. En général une dose appropriée à un usage prophylactique ou thérapeutique chez un adulte de l'espèce humaine est d'environ 1 μg à environ 5 mg, de préférence d'environ 10 μg à environ 1 mg, et de manière tout particulièrement préférée d'environ 25 μg à environ 500 μg.
Lorsqu'une une composition selon la présente invention à base d'ADN contient plusieurs molécules d'ADN (l'une codant pour la TbpB d'une souche du groupe BZ83 et les autres pour la TbpB d'une souche d'un autre groupe ou type), ces molécules peuvent exister sous forme séparée les unes des autres (e.g.. un plasmide / séquence codante) ou bien peuvent constituer un ou des ensembles (e.g.. un seul et même plasmide / deux séquences codantes ou plus).
Une composition selon la présente invention à base d'ADN peut en outre contenir des composés autres que l'agent immunogène lui-même, la nature de ces composés dépendant dans une certaine mesure i.a.. de la voie d'administration. Ainsi comme on l'a déjà vu précédemment, la composition pharmaceutique peut inclure différents agents de formulation. A titre d'information, on indique que d'une manière générale, une molécule d'ADN peut ne pas réquérir l'adjonction d'un adjuvant.
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Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont notamment utiles pour induire une réponse immunitaire chez les humains à rencontre de Λ'. meningitidis, entre autre un effet vaccinal de manière à protéger les humains contre des infections à A". meningitidis, en prévention ou en thérapie.
Les compositions selon la présente invention peuvent être fabriquées de manière conventionnelle. En particulier, elles peuvent être formulées av ec un diluant, support ou un porteur acceptable d'un point de vue pharmaceutique e.g.. de l'eau ou une solution saline. En général, le diluant ou le porteur peut être sélectionné en fonction du mode et de la voie d'administration et selon les pratiques pharmaceutiques standard. Des porteurs ou des diluents appropriés ainsi que ce qui est indispensable à l'élaboration d'une composition pharmaceutique sont décrits dans Remiπgtoπ's Pharmaceutical Sciences, un livre de référence standard dans ce domaine. Les compositions à base de TbpBs peuvent aussi contenir un adjuvant.
Une composition selon l'invention peut être administrée par toute voie d'aministration conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins. Avantageusement, on utilise la voie systémique i.a.. la voie parentérale qui elle-même peut être choisie parmi les voies intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intraépidermique et sous-cutanée ; ces quatre dernières étant toutefois préférées à la voie intraveineuse.
Afin d'obtenir un effet protecteur ou thérapeutique, l'opération qui consiste à administrer une composition pharmaceutique selon la présente invention peut être répétée une ou plusieurs fois, en laissant un certain intervalle de temps entre chaque administration : intervalle qui est de l'ordre de la semaine ou du mois. Sa détermination précise est à la portée de l'homme du métier et peut varier en fonction de divers facteurs tels que la nature de l'agent immunogène, l'âge de l'individu, etc.
Tous les documents cités dans la présente demande sont incorporés par référence.
EXEMPLE 1 : Vaccin méningocoque comportant quatre valences de souche (BZ83, 8680, M982 et B16B6)
1A. Purification des RTH natifs
Le RTH de chacune des souches est purifié selon la méthode décrite pour le RTH de la souche 8680, dans l'Exemple 1 de WO 97/13860.
1B. Purification des TbpBs natives
La TbpB de chacune des souches est purifiée selon la méthode décrite pour la TbpB de la souche 8680. dans l'Exemple 2 de WO 97/13860 .
1C. Préparation des TbpBs recombinantes Pour chacunes des TbpBs, des plasmides d'expression sont construits dans lesquelles les séquences codant pour les TbpBs matures sont fusionnées à la séquence signal r/pB de d'E. coli (Takase et al, J. Bact. ( 1983) 169 : 50692) et placées sous le contrôle du promoteur araB (de Salmonella typhimurium (Horvvitz et al. Gène ( 1981 ) J_4 : 309. Cagnon et al, Protein Engineering ( 1991 ) 4(7) : 843 et Legrain et al. Prot. Express. Purif. ( 1995) 6 : 570).
Ces plasmides comportent aussi une origine de réplication fonctionnelle dans E. coli, un gène de résistance à la kanamycine et le locus cer (Summers & Sherratt, Cell ( 1984) 36 : 1097).
Chacun de ces plasmides sert à transformer la souche d'E coli BL21 . Afin de produire les TbpBs, chacun des transformants sélectionnés est mis en culture dans un fermenteur de 20 litres en milieu TGM 16 (Slos et al. Prot. Express. Purif. ( 1994) 6 : 518) en absence d'ampicilline. En phase exponentielle (densité optique à 600 nm supérieure à 40), on ajoute 0,2 % d'arabinose (inducteur de l'expression). Après une heure d'induction, les cellules sont récoltées et conservées à - 20CC. Les culots bactériens sont resuspendus en tampon Tris et soumis à lyse à haute pression (Rannie). Une série de lavages et de centrifugations s'en suit. Le culot final est solubilisé dans du tampon Tris contenant du zvvittergent Z3- 14, puis ultracentrifugé. Le surnageant est chargé sur une colonne de Q-Sépharose. L'éluat direct contenant la TbpB est chargé sur une deuxième colonne de Q-Sépharose et la TbpB est élue en gradient de NaCl. Afin d'enlever les produits de dégradation et les endotoxines, la fraction contenant TbpB est purifiée par gel flltration sur une colonne de chromatographie S-300. Les préparations finales sont stérilisées par filtration et soumise à congélation. 1D. Compositions vaccinales
On utilise ensemble soit les 4 RTHs préparés comme décrit dans l'Exemple 1 A, soit les 4 TbpBs préparées comme décrit dans l'Exemple I B, soit les 4 TbpBs préparées comme décrit dans l'Exemple 1 C.
Une composition vaccinale est obtenue en mélangeant des quantités équimolaires de chacunes des préparations TbpBs BZ83, 8680, M982 et B I 6B6 pour obtenir une concentration finale en TbpBs de l'ordre de 0,2 mg/ml.

Claims

Revendications
1. Une composition pharmaceutique comprenant (i) la sous-unité de moindre poids moléculaire (TbpB) du récepteur de la transfemne humaine (RTH) d'une souche de Neisseria meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB, (a) qui contient 2 sites de restriction Avall, 3 sites de restriction Hindi, aucun site de restriction Vspl et aucun site de restriction Xhol ou, de préférence et, (b) à partir de laquelle il est possible de générer par PCR (polymérase chain reaction) à l'aide des amorces P3 de formule 5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3' et P4 de formule 5'-GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3'. un polynucleotide de 765 à 775 nucleotides. de préférence de 772 nucleotides (souche du groupe BZ83 ) : ou (ii) un fragment de ladite TbpB.
1 Une composition pharmaceutique selon la revendication 1 . dans laquelle la TbpB provient d'une souche de A', meningitidis faisant partie du complexe ET-5 ou du lineage III.
Une composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la TbpB provient d'une souche de A', meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui présente un profil de restriction par Avall constitué de 3 fragments de 1 184, 477 et 415 nt et un profil de restriction par Hin i constitué de 4 fragments de 1 155. 385. 276, et 257 nt (souche du groupe BZ83).
4. Une composition pharmaceutique selon la revendication 3. dans laquelle la TbpB possède la séquence d'acides aminés telle que montrée dans le SEQ ID NO : 2 (souche BZ83).
5. Une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 4, qui comprend en outre (i) une première TbpB additionnelle prov enant d'une souche de A". meningitidis faisant partie du complexe ET-5 et possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB (a) qui ne contient pas de sites de restriction Avall et Xhol ou. de préférence et, (b) à partir de laquelle il est possible de générer par PCR à l'aide des amorces P3 de formule 5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3' et P4 de formule 5'-GAAGACGAGTCGGAÀACAAAGGGATG-3'. un polynucleotide de 840 à 850 nucleotides. de préférence de 844 (souche du groupe M982) ; ou (ii) un fragment de ladite première TbpB additionnelle.
6. Une composition pharmaceutique selon la revendication 5, dans laquelle la première TbpB additionnelle provient d'une souche de N. meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui contient 1 site de restriction Vspl et 3 sites de restriction Hindi (souche du groupe M982).
7. Une composition pharmaceutique selon la revendication 6, dans laquelle la TbpB provient d'une souche de N. meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui présente un profil de restriction par Vspl constitué de 2 fragments de 131 1 et 769 nt et un profil de restriction par Hindi constitué de 4 fragments de 1229, 319. 281 et 259 nt (souche du groupe M982).
8. Une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 7, qui comprend en outre (i) une deuxième TbpB additionnelle provenant d'une souche de λ'. meningitidis faisant partie du complexe ET-5 et possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB (a) qui contient 1 site de restriction Avall, 2 sites de restriction Vspl, 1 site de restriction Xhol et 2 sites de restriction Hindi ou, de préférence et. (b) à partir de laquelle il est possible de générer par PCR à l'aide des amorces P3 de formule 5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3' et P4 de formule 5'- GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3', un polynucleotide de 800 à 810 nucleotides, de préférence de 805 (souche de groupe 8680) ; ou (ii ) un fragment de ladite deuxième TbpB additionnelle.
9. Une composition pharmaceutique selon la revendication 8, dans laquelle la deuxième TbpB additionnelle provient d'une souche de A', meningitidis possédant une séquence d'ADN codant pour TbpB qui présente un profil de restriction par Avall constitué de 2 fragments de 1507 et 445 nt, un profil de restriction par Vspl constitué de 3 fragments de 1298. 470 et 266 nt. un profil de restriction par Xhol constitué de 2 fragments de 1551 et 483 nt et un profil de restriction par Hindi constitué de 3 fragments de 1 191. 527 et 3 16 nt (souche de groupe 8680).
10. Une composition pharmaceutique selon la revendication 9, dans laquelle la deuxième TbpB additionnelle possède la séquence d'acides aminés telle que montrée dans le SEQ ID NO : 6 (souche 8680).
1 1 . Une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 10, qui comprend en outre (i) une TbpB possédant une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence montrée dans le SEQ ID NO : 4 est d'au moins 85 %, de préférence d'au moins 90 % (souche de type M982) ; ou (ii) un fragment de ladite TbpB.
12. Une composition pharmaceutique selon la revendication 1 1 , dans laquelle la TbpB possède la séquence d'acides aminés telle que montrée dans le SEQ ID NO : 4 (souche M982).
13. Une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 12, qui comprend en outre (i) une TbpB possédant une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence montrée dans le SEQ ID NO : 8 est d'au moins 95 % (souche de type B 16B6) ; ou (ii) un fragment de ladite TbpB.
14. Une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 13. dans laquelle la TbpB telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4, la première TbpB additionnelle telle que définie dans l'une des rev endications 5 à 7, la deuxième TbpB additionnelle telle que définie dans l'une des revendications 8 à 10, la TbpB telle que définie dans la revendication 1 1 ou 12. ou la TbpB telle que définie dans la revendication 13. est associée à la sous-unité de haut poids moléculaire (Tbp l ) qui lui correspond, de manière à former un RTH.
15. Une composition pharmaceutique qui comprend une molécule d'ADN codant pour une TbpB telle que définie dans l'une des re endications 1 à 4.
16. Une composition pharmaceutique selon la revendication 15, qui comprend en outre une première molécule d'ADN additionnelle codant pour une TbpB telle que définie dans l'une des revendications 5 à 7.
17. Une composition pharmaceutique selon la revendication 15 ou 16, qui comprend en outre une deuxième molécule d'ADN additionnelle codant pour une TbpB telle que définie dans l'une des revendications 8 à 10.
18. Une composition pharmaceutique selon l'une des rev endications 15 à 17, qui comprend en outre une molécule d'ADN codant pour une TbpB telle que définie dans la revendication 1 1 ou 12.
19. Une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 15 à 18, qui comprend en outre une molécule d'ADN codant pour une TbpB telle que définie dans la re endication 13.
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