【発明の詳細な説明】
ＢＺ８３株の結合価を有する髄膜炎菌ワクチン
本発明の主題は、ＥＴ−５複合体のナイセリア・メニンジティディス（Neisse
ria meningitidis）株グループＢＺ８３のヒトトランスフェリン受容体（ＨＴＲ
）のＴｂｐＢ（Ｔｂｐ２）サブユニットを含有してなる、髄膜炎菌感染症治療用
または予防用の新規医薬組成物である。
一般に、髄膜炎は、ウイルス起源または細菌起源のいずれかである。主な原因
細菌は、ナイセリア・メニンジティディスおよびヘモフィルス・インフルエンゼ
（Haemophilus influenzae）であり、これらは、各々、細菌性髄膜炎のケースの
約４０％および約５０％に関係している。
フランスでは、年間約６００〜８００件のナイセリア・メニンジティディス髄
膜炎が記録されている。アメリカ合衆国では、この件数は、年間約２５００〜３
０００件にのぼる。
ナイセリア・メニンジティディス種は、莢膜多糖の性質に従って血清グループ
に細別される。１２種類の血清グループが存在するが、髄膜炎のケースの９０％
は、３種類の血清グループ：Ａ、ＢおよびＣが原因である。
ナイセリア・メニンジティディス血清グループＡおよびＣが原因である髄膜炎
を予防するために、莢膜多糖をベースとした有効なワクチンがある。これらの多
糖は、それ自体では、２歳の子供では免疫原性を全く示さず、免疫記憶を誘発し
ない。しかしながら、これらの欠点は、これらの多糖を担体タンパク質にコンジ
ュゲートさせることにより回避できる。
対照的に、ナイセリア・メニンジティディス、グループＢの多糖は、コンジュ
ゲートした形であるか否かに関係なく、ヒトにおいて免疫原性を全く示さない。
かくして、多糖類をベースとしたワクチン以外の、特にナイセリア・メニンジテ
ィディス血清グループＢにより誘発される髄膜炎に対するワクチンの探究が非常
に望まれている。
この目的で、既に、ナイセリア・メニンジティディスの外膜の種々のタンパク
質が提案されている。この点で、ヒトトランスフェリンに関する膜受容体に特別
な注意が向けられた。
一般に、大多数の細菌は、それらの増殖のために鉄を必要とし、該細菌は、こ
の金属を獲得するための特異的な系を発生させた。遊離形の鉄の量は、ヒトにお
いてごくわずか（１０-18Ｍ程度）であり、いずれにしても細菌を増殖させるの
に不充分であるので、特に、ヒトの病原体であるナイセリア・メニンジティディ
スに関して、鉄は、トランスフェリンおよびラクトフェリンなどのヒト鉄輸送タ
ンパク質からのみ摂取される。
かくして、ナイセリア・メニンジティディスは、ヒトトランスフェリンに対す
る受容体およびヒトラクトフェリンに対する受容体を有しており、これにより、
これらの鉄キレート形成性タンパク質と結合し、次いで、その増殖に必要とされ
る鉄を摂取することを可能にしている。
Schryvers et al.（PCT出願WO90/12591）により、ナイセリア・メニンジティ
ディス株Ｂ１６Ｂ６のヒトトランスフェリン受容体が膜抽出物から精製された。
この精製されたタンパク質は、実質的には、１００ｋＤの高い見掛分子量を有す
るポリペプチドおよび約７０ｋＤの低い見掛分子量を有するポリペプチドの２つ
のタイプのポリペプチドからなる（ＳＤＳの存在下、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動の後に視覚化された）。
特にSchryversにより行われた精製生成物は、任意の定義により、かつ、本発
明の目的のために、ヒトトランスフェリン受容体（ＨＴＲ）と称し、それを構成
するポリペプチドをサブユニットと称する。本明細書では、以下、高分子量のサ
ブユニットおよび低分子量のサブユニットを、各々、ＴｂｐＡ（Ｔｂｐ１）およ
びＴｂｐＢ（Ｔｂｐ２）と称する。
Schryvers et al.の先駆的研究以来、ナイセリア・メニンジティディス種は、
実質的に、各々のＨＴＲの構成が異なる２つのタイプの株に分割されることが見
出された（PCT出願WO 93/6861およびWO 93/7172）。Ｍ９８２型（またはＩＭ２
１６９型）と称される第一の株の型は、Ｍ９８２株のＨＴＲを指向する抗血清と
は反応するが、Ｂ１６Ｂ６（またはＩＭ２３９４）株のＨＴＲを指向する抗血清
とは反応しないＴｂｐＢを有し；一方、Ｂ１６Ｂ６型と称される他のタイプは、
Ｂ１６Ｂ６株のＨＴＲを指向する抗血清とは反応するが、Ｍ９８２株のＨＴＲを
指向する抗血清とは反応しないＴｂｐＢを有する。したがって、抗原多様性が低
分子量のサブユニットのレベルで存在する。しかしながら、Griffiths et al.，
FEMS Microbiol．Lett．(1990)69:31により示唆されているところとは反対に２
つの主要なタイプに減少しているので、この多様性は、限定される。
Ｍ９８２型の株は、例えば、ｔｂｐＢ遺伝子の配列がヨーロッパ特許出願586
266に記載されており、ＥＭＢＬデータバンクにおいてリファレンス番号Ｚ１５
１３０の下に見出せるＭ９８２株；ｔｂｐＢ遺伝子の５'配列がPCT出願WO 95/33
049に記載されている６９４０株、Ｍ９７８株およびＳ３０３２株；各々、ｔｂ
ｐＢ遺伝子の配列がPCT出願WO 95/33049およびWO 97/13860に記載されているＢ
Ｚ８３株および８６８０株（これらの配列は、ＥＭＢＬデータバンクにおいて、
各々、リファレンス番号Ｚ５０７３２およびＹ０９９７７の下に見出すこともで
きる）；または配列が、ＥＭＢＬデータバンクにおいて、各々、アクセス番号Ｙ
０９６１７およびＹ０９６１８の下に見出せる３２／９４株および８７１０株で
ある。これらの株は、他の株と同様に、ノルウェー、オスロの世界保健機構、国
家公衆衛生研究所（Natinal Institute of Public Health）と共同研究している
Centre de Reference des MeningocoquesのCaugant博士から入手可能である（19
95年10月10日にBachra RokbiによりClaude Bernard University−Lyon Iに提出
された「ナイセリア・メニンジティデイスのヒトトランスフェリン受容体の
と題する博士論文を参照）。引用された株の特徴を下記表４に示す。Ｂ１６Ｂ６
株のＴｂｐＢをコードしているＤＮＡ配列は、ヨーロッパ特許出願586 266に開
示されている。
種々のＴｂｐＢをコードしているＤＮＡフラグメントの研究は、誘導されるタ
イプによるこれらのフラグメントの大きさの差異を明らかにした。これにより、
最初にPCT出願WO 93/6861において与えられたＭ９８２型およびＢ１６Ｂ６型の
定義を変えることが可能となった。現在は、ＴｂｐＢ遺伝子の大きさに従って株
の型を定義するのが適当である：Ｍ９８２型のＴｂｐＢについて約２．１〜２．
３kbおよびＢ１６Ｂ６型のＴｂｐＢについて１．８kb。
タンパク質Ｔｂｐ１よりもタンパク質ＴｂｐＢの方が有効なワクチン候補にす
る多くの特徴を有する：遍在的に発現すること、微生物の表面での入手容易性、
殺菌性抗体を誘発する能力および前記したとおり２つの主要グループがある程度
まで同定されていたので限定された変異性。
この知見により、
（ｉ）少なくとも１つのＢ１６Ｂ６型の株のＨＴＲおよび少なくとも１つのＭ
９８２型の株のＨＴＲ（PCT出願WO 93/6861）；または
（ii）少なくとも１つのＢ１６Ｂ６型の株のＴｂｐＢまたは少なくとも１つの
Ｍ９８２型の株のＴｂｐＢ（PCT出願WO 93/7172）
を含有する医薬組成物が既に提案されている。
世界中に及ぶ髄膜炎のケース（単発ケースまたは流行ケース）の原因である株
が回収され、研究され、種々の基準に基づいて分類された。一般に用いられる第
一の方法は、髄膜炎菌を、各々、クラス２／３外膜タンパク質およびクラス１外
膜タンパク質の莢膜多糖のレベルでの抗原差異に基づいて血清グループ、血清型
またはサブ血清型に分類することからなる。この分類は、モノクローナル抗体を
用いて行われる。かくして、例えば、Ｍ９８２株は、血清グループＢ、血清型９
、サブ血清型Ｐ１.９（Ｂ：９：Ｐ１.９）と分類される。
国際的に用いられる別の分類方法は、ある種の代謝酵素の電気泳動移動度に基
づいている。それは、ＭＬＥＥ（マルチ−ローカス電気泳動酵素（Multi-Locus
Electrophoresis Enzyme））であり、その使用は、特に、Olyhoek et al.，“Th
e Pathogenic Neisseriae”，(1985)，Schoolnick G.K.編（American Society f
or Microbiology):530；Caugant et al.，J．Gen．Microbiol．(1986)132:641；
Selander et al.，Appl．Env．Microbiol．(1986)51:873;Caugant et al.，Gene
tics（1981）98:464;Caugant et al.，PNAS（1986）83:4931に記載され
ている。概略、以下の１５種類の酵素を分析する：リンゴ酸酵素（ＭＡＥ）、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐ）、ペプチダーゼ（ＰＥＰ）、
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤ）、リン酸依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤ１およびＧ
Ｄ２）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、フマラーゼ（ＦＵＭ）、アル
カリホスファターゼ（ＡＬＫ）、ヨードフェノールオキシダーゼ（ＩＰ１および
ＩＰ２）、アデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）およびデヒドロゲナーゼ（ＵＤＨ）。
各酵素のエレクトロモルフ（electromorph）（またはアロザイム）は、同一遺伝
子座の対立遺伝子に相当する。これらの１５種類の酵素の対立遺伝子の特別な組
み合わせにより電気泳動タイプ（ＥＴ）が構成される。これらのタイプは、ファ
ミリーまたは複合体（クラスター）にグループ分けすることができる。例えば、
ＥＴ−５複合体は、非常に密接に関係している（最大遺伝距離は、０.１６であ
る）２２種類の電気泳動タイプからなる。下記表に、ＥＴ−５電気泳動タイプの
株の対立遺伝子プロフィル（１５種類の酵素の各々についての遺伝子座当たりの
対立遺伝子数）を示す。対立遺伝子がＥＴ−５複合体内で変化すると思われる酵
素（Ｇ６ＰおよびＵＤＨ）を太字で示す。表１ 種々の関連する電気泳動複合体または電気泳動タイプが系列内に存在する。現
在までに、例えばCaugant et al.，J．Infect．Dis．(1990)162:867に記載され
ているように、各々が、お互いに関係し合う少なくとも５つの電気泳動タイプか
らなる組を表す１０の系列（ＩからＸまで）が定義されている。例えば、系列II
Iは、ＥＴタイプ２４、２４.１−４および２５をひとまとめにしている。
過去２５年間、世界中（例えば、アメリカ合衆国（オレゴン州、ワシントン州
）、ノルウェー、キューバ、チリ、ブラジル、オランダ、ニュージーランド）に
及ぶ多くの髄膜炎のケースの原因となる株は、ＥＴ−５複合体または系列IIIに
属することが判明した。したがって、抗原、例えば、この複合体の株から得ら
れたＴｂｐＢを含むワクチンの提供が非常に急速に望まれるようになった。実際
、すでに知られている種々のワクチン組成物は８６８０株から得られたＴｂｐＢ
を使用しており、これはすでに行われているものである（PCT出願WO 97/13860を
参照）。この株は、実際、ＥＴ−５複合体に属している。
しかしながら、今、ＥＴ−５複合体に属する臨床的な単離体が、ｔｂｐＢ遺伝
子のレベルで、ある変異性を示すことを見出した。この研究は、最近の世界中の
流行性髄膜炎の原因である３１種類の単離体について行った。ｔｂｐＢ遺伝子を
、
（ａ）一方では、プライマーＰ１（配列番号９；Ｐ１は、ＥＭＢＬライブラリー
において受託番号Ｚ１５１３０の下に見出されるＭ９８２ ｔｂｐＢ遺伝子の配
列の１１５位〜１１３位に相当する）およびＰ２（アンチセンス；配列番号１０
；Ｐ２は、ＥＭＢＬライブラリーにおいて受託番号Ｚ１５１３０の下に見出され
るＭ９８２ ｔｂｐＢ遺伝子の配列の２２６４位〜２２４４位に相当する）を用
いてゲノムＤＮＡから該遺伝子を増幅させた後の酵素ＡｖａＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ
、ＶｓｐＩおよびＸｈｏＩによるｔｂｐＢ遺伝子の制限プロフィルについて、
（ｂ）他方では、プライマーＰ３（配列番号１１）およびＰ４（アンチセンス；
配列番号１２）を用いてゲノムＤＮＡから増幅されるｔｂｐＢ遺伝子由来のＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼ連鎖反応）フラグメントの大きさについて、分析した。
Ｍ９８２株、ＢＺ８３株および８６８０株のｔｂｐＢ遺伝子の制限プロフィル
を下記表２に示す。Ｍ９８２株がＥＴ−５複合体に属さないことに注意すべきで
ある。しかしながら、Ｍ９８２株を研究したのは、２.１〜２.３ｋｂのｔｂｐＢ
遺伝子を有する株の全てについて参照となるからである。
表２ ＮＣ：切断されない。
これらのプロフィルは、下記表３の文字で表される：表３ 全ての株についての結果を下記表４に示す：表４ 星印は、ＥＴ−５複合体の一部ではないＭ９８２株を表す。
（ａ）示したフラグメントの大きさは、プライマーＰ３およびＰ４を用いてゲ
ノムＤＮＡから増幅されたフラグメントの大きさであり、遺伝子の完全な配列が
入手可能である場合（Ｍ８９２株、ＢＺ８２株および８６８０株）には１塩基の
範囲まで計算し、または、Ｍ８９２株、ＢＺ８３株および８６８０株について生
じたＰＣＲフラグメントとの比較により３％アガロースゲル上での移動後に測定
した。この研究を成功裏に行うために、まずミュラー−ヒントン寒天プレート（
ＭＨＡ、ディフコ（Difco））上で培養した株からゲノムＤＮＡを抽出した。ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ（ファルマシア−エルケイビー（Ph
armacia-LKB））各２００μＭ；該プライマー各０.２μＭおよびＴａｑポリメラ
ーゼ（アプリジェン（Appligene））２.５Ｕを含有する１００μｍの容量でＰＣ
Ｒ反応を行った。増幅は、以下のようにプログラムされたＤＮＡサーモサイクラ
ー（Biometra、Trio-thermobloc）中で行われた：９５℃で５分間の最初の変性
、次いで、各サイクルが次の変性（３０秒、９５℃）、アニーリング（３０秒、
５８℃）およびＤＮＡ鎖の伸長（１分、７２℃）からなるサイクル２５回。増幅
フラグメントの大きさは、３％アガロースゲル上での増幅産生物の電気泳動後に
決定される。
（ｂ）プライマーＰ１およびＰ２を用いてＰＣＲによりゲノムＤＮＡから増幅
された遺伝子の制限プロフィル；文字Ａ〜ＧおよびＮは、表３に示される制限プ
ロフィルを表す（Ｈは、制限プロフィル：１２３０、３２０、２７０、２１０お
よび８０ｎｔ（ヌクレオチド）に相当し；Ｊは、制限プロフィル：１３５０、５
７０および３３０ｎｔに相当する）。この研究を成功裏に行うために、上記（ａ
）の記載に従って株のＤＮＡを調製し、次いで、以下の条件下で増幅させた：各
サイクルがＤＮＡの変性（１分、９４℃）、アニーリング（２分、５８℃）およ
び伸長（３分、７２℃）からなるサイクル２５回。各増幅フラグメントをQiaqui
ckカラム（キアゲン（Qiagen））上で精製し、製造者の取扱説明書（ニュー・イ
ングランド・バイオラブズ（New England Biolabs））に従って４つの別反応で
４つの酵素により消化した。２％アガロースゲル上での電気泳動法
により制限産生物を分離した。
かくして、上記変異性は、３つの主要グループに減少したことが示された（表
４を参照）。最も重要なグループは、ＢＺ８３株を含む１７種類の株を含んでい
た（表示の５４.８％）。次に、Ｍ９８２株を用いて得られたＰＣＲフラグメン
トと同一の大きさ（８４４ｎｔ）のＰＣＲフラグメントにより特徴付けられた１
０種類の株のグループが続いた。Ｍ９８２株自体は、このグループの一員ではな
いが、本明細書では、このサイズ同一性のためにＭ９８２グループの名称の下に
続いて示される（Ｍ９８２グループとＭ９８２型とは、同一のものを示さないこ
とに注意する）。これらの１０種類の株のうち、ｔｂｐＢ遺伝子の制限プロフィ
ルは、いくつかの相違点を示す：ＡｖａＩＩまたはＸｈｏＩで切断される遺伝子
は全くない；ＶｓｐＩに関しては、制限部位を有していないか、または、Ｇタイ
プの制限プロフィルを提供する；ＨｉｎｃＩＩで得られた制限プロフィルは、さ
らに異なっている。表示に関しては、次に、３種類の株のグループがあり、その
中に８６８０株があった。８７１０株は、Ｍ９８２グループの株を特徴付けるも
のよりも小さいＰＣＲフラグメントにより特徴付けられるが、そのｔｂｐＢ遺伝
子の制限プロフィルは、実際、この株がＭ９８２グループに関係していることを
示す。
ＰＣＲフラグメントタイプに基づく分類の予想的価値を確認するために、３２
／９４株、８７２６株および８７１０株（上記表４に記載した）のｔｂｐＢ遺伝
子をクローン化し、配列決定し、インフォバイオジェン・マルチプル・クラスタ
ル整列プログラム（Infobiogen multiple Clustal alignment programme）（Des
sen et al.，Bisance:“a French programme for accessing the biomolecular
sequences databases”(1990)Cabios 6:355）を用いてプロトタイプのＢＺ８３
株、Ｍ９８２株および８６８０株のｔｂｐＢ遺伝子の配列と並ベた。比較結果を
ホモロジー（同一性）の％により下記表５に示し、ＰＣＲ分析による分類の適切
さを確認する。表５ 上記ｔｂｐＢ遺伝子の分析に関する研究は、刊行物（Rokbi et al.，Clin．Di
ag．Lab．Immunol．(Sept．1997)4(5):522）の主題であった。
次に、ＥＴ−５複合体に属さない株が、制限酵素プロフィルがＢＺ８３株のｔ
ｂｐＢ遺伝子のものと同一であるｔｂｐＢ遺伝子を有することが見出された。こ
れらの株のいくつかは、III系列に属している；１つは、例えば、９０／９４株
（Caugant博士所蔵）である。
試験された単離体の選択が様々な土地を起点とする流行病を代表することが知
られており、ＢＺ８３株により説明されるグループがそれらの大半を占めている
とすれば、このグループの株が最近の流行病において支配的であることは疑わし
くない。ＢＺ８３株により説明されるグループ（以下、ＢＺ８３グループと称す
る）の株から得られたＴｂｐＢをワクチンに含ませるのが望ましいと思われる。
したがって、本発明の主題は、（ｉ）（ａ）２つのＡｖａＩＩ制限部位および
３つのＨｉｎｃＩＩ制限部位を含有しており、ＶｓｐＩ制限部位ならびにＶｓｐ
ＩおよびＸｈｏＩ制限部位を含有しておらず、かつ、好ましくは、（ｂ）式5'-A
AGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3'で示されるプライマーＰ３および式5'-GAAGACGAGT
CGGAAACAAAGGGATG-3'で示されるプライマーＰ４を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ
連鎖反応）により７６５〜７７５ヌクレオチド、好ましくは７７２ヌクレオチド
のポリヌクレオチドを生じることができる、ＴｂｐＢをコードしているＤＮＡ配
列を有するナイセリア・メニンギティデイス株（ＢＺ８３グループの株）のヒト
トランスフェリン受容体（ＨＴＲ）の低分子量サブユニット（ＴｂｐＢ）；また
は（ii）該ＴｂｐＢのフラグメントを含有してなる医薬組成物である。
「株のＴｂｐＢサブユニット、または、ナイセリア・メニンジティディス株か
ら誘導、発生、または、得られるＴｂｐＢサブユニット」とは、明らかに、その
最も一般的な意味において取られる誘導体を意味すると解すべきである；すなわ
ち、物理的プロセスに限定されず、知的プロセスの結果である。かくして、この
表現は、とりわけ、例えばイー・コリ(E．coli)における組換え経路により産生
されるＴｂｐＢを包含する。
本発明の目的のために有用なＴｂｐＢが得られるナイセリア・メニンジティデ
ィス株は、ＥＴ−５複合体またはIII系列に属する株であるのが好ましい。例え
ば、ＥＴ−５複合体の一員であるＢＺ８３グループの株は、３２／９４株である
。III系列の一員であるＢＺ８３グループの株は、９０／９４株である。これら
の株のｔｂｐＢ遺伝子の配列は、以下の配列識別名で示す。
有利な具体例によると、本発明の組成物に含まれるＴｂｐＢは、１１８４ｎｔ
、４７７ｎｔおよび４１５ｎｔの３つのフラグメントからなるＡｖａＩＩ制限プ
ロフィルおよび１１５５ｎｔ、３８５ｎｔ、２７６ｎｔおよび２５７ｎｔの４つ
のフラグメントからなるＨｉｎｃＩＩ制限プロフィルを示すＴｂｐＢをコードし
ているＤＮＡ配列を有するナイセリア・メニンジティディス株から得られる。好
ましくは、このＴｂｐＢは、配列番号２に示されるアミノ酸を有する（ＢＺ８３
）。
別法としては、ａｄｈｏｃ株のＴｂｐＢから得られたフラグメントを用いるこ
とができる。ワクチンのために有用なフラグメントは、PCT出願WO 95/33049に提
案された方法により定義することができる。
PCT出願WO 95/33049は、起源の株に関係なく、ＴｂｐＢサブユニットの研究に
より、少なくとも１つが特性に関係している３つの主要な構造ドメインを示すこ
とができることを教示している。定義によると、Ｍ９８２ ＴｂｐＢおよびＢ１
６Ｂ６ ＴｂｐＢのドメインは、アミノ酸の位置、含まれる種々のドメインの制
限を示すことにより、かつ、配列番号４および８に示す番号付けを引用して、下
記表６に示されるように確定された。表６ この定義は、同様に、Ｍ９８２型またはＢ１６Ｂ６型配列を参照配列とホモロ
ジーを最大にするように並べた後、全てのＭ９８２型またはＢ１６Ｂ６型Ｔｂｐ
Ｂに適用する。かくして、例えば、８６８０株のＴｂｐＢサブユニットのドメイ
ンの位置は、以下のとおり示される：第一ドメイン（１−３３４）、第二ドメイ
ン（３３５−５３０）および第三ドメイン（５３１−６７７）。
Ｎ−末端ドメインまたは第一ドメインがその全体においてトランスフェリン結
合部位を含有しており、したがって、おそらく外部に暴露されているということ
が知られており、その結果、Ｎ−末端ドメインだけが、とりわけ、ワクチンのた
めの選択の要素を構成する。
さらにまた、ホモロジーを最大になるように並べたＭ９８２およびＢ１６Ｂ６
ＴｂｐＢ配列の比較研究は、４つの超可変部がＭ９８２ ＴｂｐＢのヒンジ部（
上記表に示したように、ヒンジドメインとも称される）内に局在し、Ｂ１６Ｂ６
ＴｂｐＢにはこの超可変部がないことを示した。これらの超可変部は、全ての
Ｍ９８２型ＴｂｐＢに存在する。Ｂ１６Ｂ６型株は、それらを欠いている。本明
細書では、「Ｍ９８２型ヒンジ部」とは、これらの４つの超可変部を有するヒン
ジ部を意味すると解される。
種々のＭ９８２型ＴｂｐＢの配列の比較により、ヒンジ部の変異性が他の２つ
のドメインのものよりも大きいことも知られている。ヒンジ部は、ヒトトランス
フェリン結合機能に必須であるとは思われていなかったので、この領域の役割は
、少なくとも一部は、後に別の株と接触した個体の免疫系による株の認識を回避
するために「スクリーン」タイプの変異性を誘発することであると仮定された。
この仮説について、Ｍ９８２型株のヒンジ部は、ワクチンの調製において重要
な課題を構成する。実際、この領域が免疫優位性を有する場合、免疫化の間、誘
発された抗体は、この領域に対して優先的に指向され、その結果、免疫応答は、
同種株のＴｂｐＢタンパク質に対して特異的となる。
上記観察結果および仮説を考慮して、全Ｍ９８２型ＴｂｐＢではなく、少なく
ともそれらの４つの超可変部を欠いているかまたは第二および第三ドメインを欠
いているＴｂｐＢを、とりわけ、ワクチンのために用いることが既に提案されて
いる。
本発明の組成物は、また、Ｍ９８２グループの株または８６８０により示され
るグループ（８６８０グループ）の株から得られたＴｂｐＢも含有する。
かくして、本発明組成物は、さらに、（ｉ）ＥＴ−５複合体の一員であり、（
ａ）ＡｖａＩＩおよびＸｈｏＩ制限部位を含有せず、または、好ましくはおよび
、（ｂ）式5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3'で示されるプライマーＰ３および
式5'-GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3'で示されるプライマーＰ４を用いてＰＣＲ
により８４０〜８５０ヌクレオチド、好ましくは８４４ヌクレオチドのポリヌク
レオチドを生じることができるＴｂｐＢをコードしているＤＮＡ配列を有するナ
イセリア・メニンギティデイス株（Ｍ９８２グループの株）から得られた第１付
加ＴｂｐＢ；または（ii）該第１付加ＴｂｐＢのフラグメントを含有してなる。
有利な具体例によると、第１付加ＴｂｐＢは、１つのＶｓｐＩ制限部位および
３つのＨｉｎｃＩＩ制限部位を含有するＴｂｐＢをコードしているＤＮＡ配列を
有するナイセリア・メニンジティディス株から得られる。好ましくは、このＴｂ
ｐＢは、１３１１ｎｔおよび７６９ｎｔの２つのフラグメントからなるＶｓｐＩ
制限プロフィルおよび１２２９、３１９、２８１および２５９ｎｔの４つのフラ
グメントからなるＨｉｎｃＩＩ制限プロフィルを示すＴｂｐＢをコードしている
ＤＮＡ配列を有するナイセリア・メニンジティディス株から得られる。
本発明の医薬組成物は、さらに、（ｉ）ＥＴ−５複合体の一員であり、（ａ）
１つのＡｖａＩＩ制限部位、２つのＶｓｐＩ制限部位、１つのＸｈｏＩ制限部位
および２つのＨｉｎｃＩＩ制限部位を含有し、または、好ましくはおよび、（ｂ
）式5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3'で示されるプライマーＰ３および式
5'-GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3'で示されるプライマーＰ４を用いてＰＣＲに
より８００〜８１０ヌクレオチド、好ましくは８０５ヌクレオチドのポリヌクレ
オチドを生じることができるＴｂｐＢをコードしているＤＮＡ配列を有するナイ
ヤリア・メニンジティディス株（８６８０グループの株）から得られる第２付加
ＴｂｐＢ；または（ii）該第２付加ＴｂｐＢのフラグメントをも含有してなる。
有利な具体例によると、第２付加ＴｂｐＢは、１５０７ｎｔおよび４４５ｎｔ
の２つのフラグメントからなるＡｖａＩＩ制限プロフィル、１２９８ｎｔ、４７
０ｎｔおよび２６６ｎｔの３つのフラグメントからなるＶｓｐＩ制限プロフィル
、１５５１ｎｔおよび４８３ｎｔの２つのフラグメントからなるＸｈｏＩ制限プ
ロフィルならびに１１９１ｎｔ、５２７ｎｔおよび３１６ｎｔの３つのフラグメ
ントからなるＨｉｎｃＩＩ制限プロフィルを示すＴｂｐＢをコードしているＤＮ
Ａ配列を有するナイセリア・メニンジティディス株から得られる。好ましくは、
この第２付加ＴｂｐＢは、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する（８６８
０株）。
ＥＴ−５複合体の株から得られるＴｂｐＢに加えて、本発明の組成物は、また
、他の電気泳動複合体の株から得られる１つ以上のＴｂｐＢを含有してもよい。
特に、（ｉ）Ｍ９８２型の株のＴｂｐＢ、すなわち、約２．１〜２．３ｋｂのｔ
ｂｐＢ遺伝子を有しており、Ｍ９８２ ＴｂｐＢとのホモロジー（同一性）（ア
ミノ酸配列のレベルでのホモロジー）の程度がＥＴ−５複合体の株のＴｂｐＢお
よびＭ９８２ ＴｂｐＢを比較することにより観察されるものよりも高い株のＴ
ｂｐＢまたは（ii）Ｂ１６Ｂ６型の株のＴｂｐＢ、すなわち、約１．８ｋｂのｔ
ｂｐＢ遺伝子を有する株のＴｂｐＢを加えることが予測される。
かくして、本発明の医薬組成物は、さらに、（ｉ）１位のアミノ酸から６９１
位のアミノ酸までの配列番号４に示される配列とのホモロジーの程度が少なくと
も８５％、有利には少なくとも９０％であるアミノ酸配列を有するＴｂｐＢまた
は（ii）該ＴｂｐＢのフラグメントを含有してなる。好ましくは、配列番号４に
示されるアミノ酸配列を有するＭ９８２株のＴｂｐＢである。
本発明の医薬組成物は、さらに、（ｉ）１位のアミノ酸から５７９位のアミノ
酸までの配列番号８で示される配列とのホモロジーの程度が少なくとも９５％、
好ましくは１００％であるアミノ酸配列を有するＴｂｐＢ（Ｂ１６Ｂ６型の株）
；または該ＴｂｐＢのフラグメントを含有してなる。
種々の可能な付加ＴｂｐＢについての別法として、そのフラグメントを用いる
ことも可能である。有用なフラグメントは、PCT出願WO 95/33049に説明されてい
るように決定される。
本発明の目的ために有用なＴｂｐＢは、ＴｂｐＢが誘導されるナイセリア・メ
ニンジティディス株の高分子量のサブユニット（Ｔｂｐ１）から解離した形態で
あるか、または、このＴｂｐ１と会合してヒトトランスフェリン受容体と考えら
れるＴｂｐ１−ＴｂｐＢ複合体を形成している；すなわち、それらは、高分子量
の対応するサブユニット（Ｔｂｐ１）を欠いている形態であるか、または、それ
と会合してＨＴＲを形成している。解離した形態またはＴｂｐ１−ＴｂｐＢ複合
体の形態のいずれであっても、本発明のＴｂｐＢサブユニットは、実質的に精製
されるべきである；すなわち、自然に存在する媒質から分離される。とりわけ、
特にナイセリア・メニンジティディスの細胞質タンパク質およびペリプラズムタ
ンパク質を含まない調製物である。
本発明の目的ために有用なＴｂｐＢサブユニットは、ＴｂｐＢが誘導されるナ
イセリア・メニンジティディス株の高分子量のサブユニット（Ｔｂｐ１）から解
離した形態であるか、またはこのＴｂｐ１と会合してヒトトランスフェリン受容
体と考えられるＴｂｐ１−ＴｂｐＢ複合体を形成している。解離した形態または
Ｔｂｐ１−ＴｂｐＢ複合体の形態のいずれであっても、本発明のＴｂｐＢサブユ
ニットは、実質的に精製されるべきである；すなわち、自然に存在する媒質から
分離される。とりわけ、特にナイセリア・メニンジティディスの細胞質タンパク
質およびペリプラズムタンパク質を含まない調製物である。
本発明の目的ために、すでに知られている方法（とりわけ、PCT出願WO 97/138
60を参照）に従って髄膜炎菌株から精製されたか、または、同種または異種の発
現系における組換え経路により得られる１つ以上のＴｂｐＢを用いることができ
る。
適切な発現系は、それらがｔｂｐＢ遺伝子の配列を有するので、当業者の能力
の範囲内である。それらは、特に、成熟ＴｂｐＢまたはそのフラグメントをコー
ドしているＤＮＡフラグメントが適切なプロモーターの制御下に置かれる発現カ
セットを構築することが必要である。このＤＮＡフラグメントは、ポリペプチド
の分泌が要求されるか否かによって、同種シグナルペプチドまたは異種シグナル
ペプチドをコードしているＤＮＡブロックと縮合されていたりいなかったりであ
る。好ましくは、この分泌は、要求されるであろうし、リポタンパク質をコード
している遺伝子から誘導されたシグナル配列が用いられるであろう。
異種シグナルペプチドをコードしているＤＮＡブロック（シグナル領域）また
はプロモーターなどの成分は、すでに、かなり多数存在しており、当業者に知ら
れている。当業者の一般的な能力により、シグナル領域または発現が予測される
宿主細胞に適している特定のプロモーターが選択されるであろう。
本発明の方法のために、宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌または酵母であって
よい；後者の２つが好ましい。ここで、再度、特定の系の選択は、当業者の能力
の範囲内である。
＊＊＊＊＊＊＊＊
本発明の主題は、（ｉ）（ａ）２つのＡｖａＩＩ制限部位、３つのＨｉｎｃＩ
Ｉ制限部位を含有しており、ＶｓｐＩ制限部位ならびにＶｓｐＩおよびＸｈｏＩ
制限部位を含有しておらず、または、好ましくはおよび、（ｂ）式5'-AAGACCAAG
GCGGATACGGTTTTGC-3'で示されるプライマーＰ３および式5'-GAAGACGAGTCGGAAACA
AAGGGATG-3'で示されるプライマーＰ４を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応
）により７６５〜７７５ヌクレオチド、好ましくは７７２ヌクレオチドのポリヌ
クレオチドを生じることができるＴｂｐＢをコードしているＤＮＡ配列を有する
ナイセリア・メニンジティディス株（ＢＺ８３グループの株）のヒトトランスフ
ェリン受容体（ＨＴＲ）のＴｂｐＢ；または（ii）該ＴｂｐＢのフラグメントを
コードしているＤＮＡ分子を含有してなる医薬組成物でもある。
好ましくは、該ＤＮＡ分子は、ＥＴ−５複合体またはIII系列に属するナイセ
リア・メニンジティディス株から得られるＴｂｐＢをコードする。
好都合な具体例によると、このＤＮＡ分子は、１１８４ｎｔ、４７７ｎｔおよ
び４１５ｎｔの３つのフラグメントからなるＡｖａＩＩ制限プロフィルならびに
１１５５ｎｔ、３８５ｎｔ、２７６ｎｔおよび２５７ｎｔの４つのフラグメント
からなるＨｉｎｃＩＩ制限プロフィルを示すＴｂｐＢをコードしているＤＮＡ配
列を有するナイセリア・メニンジティディス株から得られるＴｂｐＢをコードす
る。好ましくは、このＤＮＡ分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有す
るＴｂｐＢをコードする（ＢＺ８３株）。
本発明のＤＮＡをベースとする組成物は、さらに、（ｉ）ＥＴ−５複合体の一
員であり、（ａ）ＡｖａＩＩおよびＸｈｏＩ制限部位を含有しておらず、または
、好ましくはおよび、（ｂ）式5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3'で示されるプ
ライマーＰ３および式5'-GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3'で示されるプライマー
Ｐ４を用いてＰＣＲにより８４０〜８５０ヌクレオチド、好ましくは８４４ヌク
レオチドのポリヌクレオチドを生じることができるＴｂｐＢをコードしているＤ
ＮＡ配列を有するナイセリア・メニンジティディス株（Ｍ９８２グループの株）
から得られるＴｂｐＢ；または（ii）該ＴｂｐＢのフラグメントをコードしてい
る第１ＤＮＡ分子を含有してなる。
有利な具体例によると、第１付加ＤＮＡ分子は、１つのＶｓｐＩ制限部位およ
び３つのＨｉｎｃＩＩ制限部位を含有するＴｂｐＢをコードしているＤＮＡ配列
を有するナイセリア・メニンジティディス株から得られるＴｂｐＢをコードして
いる。好ましくは、このＤＮＡ分子は、１３１１ｎｔおよび７６９ｎｔの２つの
フラグメントからなるＶｓｐＩ制限プロフィルおよび１２２９ｎｔ、３１９ｎｔ
、２８１ｎｔおよび２５９ｎｔの４つのフラグメントからなるＨｉｎｃＩＩ制限
プロフィルを示すＴｂｐＢをコードしているＤＮＡ配列を有するナイセリア・メ
ニンジティディス株から得られるＴｂｐＢをコードしている。
本発明のＤＮＡをベースとする組成物は、また、さらに、（ｉ）ＥＴ−５複合
体の一員であり、（ａ）１つのＡｖａＩＩ制限部位、２つのＶｓｐＩ制限部位、
１つのＸｈｏＩ制限部位および２つのＨｉｎｃＩＩ制限部位を含有し、または、
好ましくはおよび、（ｂ）式5'-AAGACCAAGGCGGATACGGTTTTGC-3'で示されるプラ
イマーＰ３および式5'-GAAGACGAGTCGGAAACAAAGGGATG-3'で示されるプライマーＰ
４を用いてＰＣＲにより８００〜８１０ヌクレオチド、好ましくは８０５ヌクレ
オチドのポリヌクレオチドを生じることができるＴｂｐＢをコードしているＤＮ
Ａ配列を有するナイセリアメニンジティディス株（８６８０グループの株）から
得られるＴｂｐＢ；または（ii）該ＴｂｐＢのフラグメントをコードしている第
２付加ＤＮＡ分子を含有してなる。
有利な具体例によると、第２付加ＤＮＡ分子は、１５０７ｎｔおよび４４５ｎ
ｔの２つのフラグメントからなるＡｖａＩＩ制限プロフィル、１２９８ｎｔ、４
７０ｎｔおよび２６６ｎｔの３つのフラグメントからなるＶｓｐＩ制限プロフィ
ル、１５５１ｎｔおよび４８３ｎｔの２つのフラグメントからなるＸｈｏＩ制限
プロフィルならびに１１９１ｎｔ、５２７ｎｔおよび３１６ｎｔの３つのフラグ
メントからなるＨｉｎｃＩＩ制限プロフィルを示すＴｂｐＢをコードしているＤ
ＮＡ配列を有するナイセリア・メニンジティディス株から得られるＴｂｐＢをコ
ードしている。好ましくは、このＤＮＡ分子は、配列番号６に示されるアミノ酸
配列を有するＴｂｐＢ（８６８０株）をコードしている。
本発明のＤＮＡをベースとする組成物は、さらに、（ｉ）配列番号４に示され
る配列とのホモロジーの程度が少なくとも８５％、有利には少なくとも９０％で
あるアミノ酸配列を有するＴｂｐＢ；または（ii）該ＴｂｐＢのフラグメントを
コードしているＤＮＡ分子を含有してなる。好ましくは、これは、配列番号４に
示されるアミノ酸配列を有するＭ９８２株のＴｂｐＢをコードしているＤＮＡ分
子である。
本発明のＤＮＡをベースとする組成物は、さらに、（ｉ）配列番号８に示され
る配列とのホモロジーの程度が少なくとも９５％、好ましくは１００％であるア
ミノ酸配列を有するＴｂｐＢ（Ｂ１６Ｂ６型の株）；または（ii）該ＴｂｐＢの
フラグメントをコードしているＤＮＡ分子を含有してなる。
ＤＮＡ分子は、有利には、複製されることおよび実質的に哺乳動物のゲノムに
組み込まれることが不可能なプラスミドである。上記コード配列は、哺乳動物細
胞中で発現可能なプロモーターの制御下に置かれる。このプロモーターは、遍在
しているかまたは組織に対して特異的である。遍在するプロモーターとしては、
サイトメガロウイルス初期プロモーター（米国特許4,168,062に記載されている
）およびラウス肉腫ウイルスプロモーター(Norton & Coffin，Molec．Cell．Bio
l．(1985)5:281に記載されている）が挙げられる。デスミンプロモーター（Li e
t al.，Gene（1989）78:244443；Li & Paulin，J．Biol．Chem．(1993)268:1040
3）は、選択プロモーターであり、筋肉細胞中で発現可能であり、皮膚の細胞中
でも発現可能である。筋肉細胞に対して特異的なプロモーターは、例えば、ミオ
シンまたはジストロフィン遺伝子のプロモーターである。本発明のために用いる
ことができるプラスミドベクターは、PCT出願WO 94/21797およびHartikka et al
.，Human Gene Therapy（1996）7:1205に記載されている。
本発明のＤＮＡをベースとする組成物において、ＤＮＡ分子は、製剤化される
かまたは製剤化されない。製剤の選択は、広く変えられる。該ＤＮＡは、担体を
有するかまたは有さずに生理学上許容される溶液に簡単に希釈される。担体が存
在する場合、それは、等張性であるか、または、弱い高張性であり、低いイオン
強度を有する。例えば、これらの条件は、例えば２０％のショ糖溶液により満た
される。
別法としては、ＤＮＡ分子は、細胞への進入を促進する薬剤と組合される。こ
れは、（ii）ブピバカイン（例えば、PCT出願WO 94/16737を参照）のような細胞
浸透性を改良する化学薬剤または（ii）ポリヌクレオチドと組み合わせてポリヌ
クレオチドの輸送を促進するビヒクルとして作用する薬剤である。後者は、特に
、陽イオン重合体、例えば、ポリリシン、または、ポリアミン、例えば、スペル
ミン誘導体（例えば、PCT出願WO 93/18759を参照）である。これは、また、紡錘
菌産生ペプチド（fusogenic peptide）、例えば、ＧＡＬΛまたはグラミシジン
（Gramicidin）Ｓ（PCT出願WO 93/19768を参照）またはウイルス融合タンパク質
から誘導されたペプチドである。
それらは、また、陰イオンまたは陽イオン脂質である。陰イオンまたは中性脂
質は、長い間、ポリヌクレオチドを含む多くの化合物のために、例えばリポソー
ムの形態で、輸送剤（transporting agent）として作用することができることが
知られてきた。これらのリポソーム、それらの成分およびそれらの製造方法は、
例えば、Liposomes:A Practical Approach，RPC New Ed，IRL press(1990)によ
り詳細に説明されている。
陽イオン脂質も知られており、一般に、ポリヌクレオチドについての輸送剤と
して用いられる。例えば、名称ＤＯＴＭＡ（Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキ
シ)−プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）によっても知ら
れているLipofectinTM、ＤＯＴＡＰ(１,２−ビス(オレイルオキシ)−３−(トリ
メチルアンモニオ)プロパン)、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウム
ブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミノグリシルスペルミン）およびＤＣ
−ｃｈｏｌ（３−ベーター(Ｎ−(Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン)−カルバモ
イル)コレステロール）などのコレステロール誘導体が挙げられる。これらの脂
質は、ヨーロッパ特許出願187,702、PCT出願WO 90/11092、米国特許5,283,185、
PCT出願WO 91/15501およびWO 95/26356ならびに米国特許5,527,928により説明さ
れている。陽イオン脂質は、好ましくは、例えばPCT出願WO 90/11092に記載され
ているようにＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）などの天
然脂質と共に用いられる。
PCT出願WO 91/359およびWO 93/17706ならびにTang et al.，Nature（1992）35
6:152に記載されているように、金またはタングステンの微粒子もまた輸送剤と
して用いられる。この特定の場合、ポリヌクレオチドは、塩化カルシウムおよび
スペルミジンの存在下、微粒子上に沈殿され、次いで、米国特許4,945,050およ
び5,015,580ならびにPCT出願WO 94/24243に記載されている装置のような無針（n
eedle-free）装置を用いて全体が真皮または表皮に高速ジェットにより投与され
る。
個体にワクチン接種するために用いることができるＤＮＡの量は、抗原を発現
するために用いられるプロモーターの強度、投与される哺乳動物の状態（例えば
、体重、年齢および一般的な健康状態）、投与の形態および製剤のタイプなどの
多くの因子に依存する。特に、筋肉内投与経路が、無針装置を用いる皮内投与経
路
よりも多量のＤＮＡを必要とすることが示される。一般に、ヒトの成人における
予防用または治療用の適切な用量は、約１μｇ〜約５mg、好ましくは、約１０μ
ｇ〜約１mgであり、特に好ましくは、約２５μｇ〜約５００μｇである。
本発明のＤＮＡをベースとする組成物は、いくつかのＤＮＡ分子（１つは、Ｂ
Ｚ８３グループの株のＴｂｐＢをコードしているものであり、他には、別のグル
ープまたは型の株のＴｂｐＢをコードしているものである）を含有し、これらの
分子は、お互いに分離された形態（例えば、プラスミド／コード配列）で存在す
るか、または、１つ以上のユニット（例えば、１つの同プラスミド／２つ以上の
コード配列）を構成する。
本発明のＤＮＡをベースとする組成物は、さらに、免疫原性物質自体以外の化
合物を含有し、これらの化合物の性質は、ある程度は、とりわけ投与経路に依存
する。かくして、上記のとおり、医薬組成物は、種々の形成剤を含む。情報とし
て、一般に、ＤＮＡ分子が補助剤の添加を必要としないようにすることができる
ことが示される。
＊＊＊＊＊＊＊＊
本発明の医薬組成物は、予防または治療において、ナイセリア・メニンジティ
ディスに対するヒトにおける免疫応答、とりわけ、ナイセリア・メニンジティデ
ィス感染症に対してヒトを保護するようなワクチン効果を誘発するのに特に有用
である。
本発明の組成物は、慣用手段で調製される。特に、それらは、医薬上許容され
る希釈剤、担体またはビヒクル、例えば、水または生理食塩水を用いて製剤化さ
れる。一般に、希釈剤またはビヒクルは、投与の形態および経路に依存して、標
準的な製薬プラクティスに従って、選択される。適切なビヒクルまたは希釈剤お
よび医薬組成物の調製に必須であるものは、この分野の標準的な参考書であるRe
mington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。ＴｂｐＢをベースとす
る組成物は、また、補助剤を含有してもよい。
本発明の組成物は、ワクチンの分野での使用において慣用的な投与経路により
投与される。便宜的には、全身経路が用いられ、とりわけ、静脈内経路、筋肉内
経路、皮内経路、表皮内経路および皮下経路から選択される非経口経路が用いら
れる；しかしながら、筋肉内経路、皮内経路、表皮内経路および皮下経路は、静
脈内経路よりも好ましい。
予防効果または治療効果を得るために、本発明の医薬組成物を投与することか
らなる操作は、各投与の間にある程度の時間をおいて（１週間または１ヶ月のオ
ーダーの間隔で）、１回または数回繰り返される。その正確な決定は、当業者の
能力の範囲内であり、免疫原性物質の性質、個体の年齢などの種々の因子に従っ
て変わってよい。
本明細書に記載した全ての文献は、引用により本明細書の記載とする。
実施例１：４つの株（ＢＺ８３、８６８０、Ｍ９８２およびＢ１６Ｂ６）を含
有してなる髄膜炎菌ワクチン
１Ａ．天然ＨＴＲの精製
PCT出願WO 97/13860の実施例１において８６８０株のＨＴＲについて記載され
ている方法に従って、各株のＨＴＲを精製する。
１Ｂ．天然ＴｂｐＢの精製
PCT出願WO 97/13860の実施例２において８６８０株のＴｂｐＢについて記載さ
れている方法に従って、各株のＴｂｐＢを精製する。
１Ｃ．組換えＴｂｐＢの調製
各ＴｂｐＢについて、成熟ＴｂｐＢをコードしている配列がイー・コリｒｌｐ
Ｂシグナル配列（Takase et al.，J．Bact．(1983)169:50692）と融合される発
現プラスミドを構築し、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimuri
um）のａｒａＢプロモーター（Horwitz et al.，Gene（1981）14:309、Cagnonet
al.，Protein Engineering（1991）4(7):843およびLegrain et al.，Prot．Expr
ess．Purif．(1995)6:570）の制御下に置く。
これらのプラスミドは、また、イー・コリにおいて機能的な複製起点、カナマ
イシンに対する耐性のための遺伝子およびｃｅｒ座を含有する（Summers & Sher
ratt，Cell（1984）36:1097）
これらのプラスミドの各々は、イー・コリＢＬ２１株を形質転換するように作
用する。
ＴｂｐＢを生成するために、選択された形質転換細胞の各々を、アンピシリン
の不在下、ＴＧＭ１６培地（Slos et al.，Prot．Express．Purif．(1994)6:518
）中、２０リットルの発酵槽中で培養する。指数増殖期（６００nmでの光学密度
が４０よりも大きい）の間、０.２％アラビノース（発現誘発物質）を添加する
。誘発から１時間後、細胞を得、−２０℃で貯蔵する。
細菌ペレットをトリス緩衝液に再懸濁させ、高圧溶解（ラニー（Rannie））に
付す。これに次いで、一連の洗浄および遠心分離に付す。最終ペレットを、ツウ
ィッタージェント（zwittergent）Ｚ３−１４を含有するトリス緩衝液に溶解さ
せ、次いで、超遠心分離に付す。上清をＱ−セファロース（Sepharose）カラム
に入れる。ＴｂｐＢを含有する直接溶離液を第２のＱ−セファロースカラムに入
れ、該ＴｂｐＢをNaCl勾配液で溶離する。分解生成物およびエンドトキシンを除
去するために、ＴｂｐＢを含有するフラクションをＳ−３００クロマトグフィー
カラム上でのゲル濾過により精製する。最終調製物を濾過滅菌し、冷凍する。
１Ｄ．ワクチン組成物
実施例１Ａに記載したと同様に調製した４つのＨＴＲ、または、実施例１Ｂに
記載したと同様に調製した４つのＴｂｐＢ、または、実施例１Ｃに記載したと同
様に調製した４つのＴｂｐＢのいずれかを一緒に用いる。
０.２mg／mlのオーダーの最終ＴｂｐＢ濃度を得るようにＢＺ８３、８６８０
、Ｍ９８２およびＭ１６Ｂ６ＢのＴｂｐＢ調製物の各々を等モル量で混合するこ
とによりワクチン組成物を得る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:36）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ
，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)
，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，
ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ
Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ
，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ
Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，
ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ