WO1999007199A2 - Verfahren zur herstellung von l-alaninol und gamma-glutamylisopropylamid und mikroorganismusstamm des genus pseudomonas - Google Patents

Verfahren zur herstellung von l-alaninol und gamma-glutamylisopropylamid und mikroorganismusstamm des genus pseudomonas Download PDF

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Jan Rudolf Van Der Ploeg
Thomas Leisinger
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Definitions

  • the invention relates to new microorganisms which are capable of growing with isopropylamine as the sole source of C and / or N, and to microorganisms which produce L-alaninol from isopropylamine and do not catabolize the latter.
  • the latter are used for a new process for the production of L-alaninol (S - (+) - 2-amino-l-propanol) starting from isopropylamine.
  • L-alaninol is an important intermediate for the production of pharmaceuticals, for example for the production of ofloxacin (J. Med. Chem 1997, 30, 2283-2286)
  • the object of the present invention was to provide a simple and inexpensive process for the preparation of L-alaninol.
  • microorganisms according to the invention are obtainable by the steps.
  • Microorganisms that are capable of growing on isopropylamine and L-alaninol as the only source of C and / or N can be selected and isolated from soil samples, sludge or wastewater, in particular contaminated soils and sewage sludge, using standard microbiological techniques.
  • the isolation is expediently carried out by enriching the desired microorganisms from a sample by selection with isopropylamine as the only C and / or N source.
  • selective enrichment with L-alaninol as the only C - and / or N source selected stable microorganisms which are capable of utilizing isopropylamine and L-alaninol as the only C and N source
  • the "wild stems" obtained in this way are then subjected to mutagenesis, the mutagenesis being able to be carried out according to methods known per se (JH Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972).
  • Appropriate mutation methods are the point mutation method, for example with the aid of mutagenic agents or UV radiation, the frameshift method, the deletion method or the transposon insertion method
  • microorganisms according to the invention are therefore preferably selected for isopropylamine, L-alaninol and L-alanine as the only C- and / or N source.
  • desired microorganisms can be recognized from the fact that they are no longer able to grow on isopropylamine and L-alaninol, but on L-alanine as the only C and / or N source. These strains are referred to below as "alaninol producers"
  • D-alanine L-2-amino-2-methylacetaldehyde, L- or D, L-lactic acid or their salts
  • pyruvate Both the "wild stems" and the "alaninol producers" preferably belong to the genus Pseudomonas, in particular to the species Pseudomonas sp Kie 171, Kie 171-B (DSM 1 1521) and Kie 171-B 1 (DSM 1 1629) are also included their functionally equivalent variants and mutants.
  • microorganisms Pseudomonas sp Kie 171-B were released on April 23, 1997, Kie-Bl (DSM 1 1629) on June 25, 1997 and Kie 171 (DSM 12360) on 05 08 1998 deposited with the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, in accordance with the Budapest Treaty
  • “Functionally equivalent variants and mutants” are understood to mean microorganisms which are derived from the original organisms and which have the properties and functions which are essential to the invention. These variants and mutants can be accidentally formed, for example, by UV radiation
  • this strain could be similar to Pseudomonas citronellolis.
  • the microorganisms are usually cultured (attracted) in a medium customary for the specialist prior to the actual biotransformation.
  • the medium described in Table 1 can be used as the selection and growth medium.
  • IPA isopropylamine
  • Kie 171-B (DSM 11521) and Kie-B l (DSM 11629) and their functionally equivalent variants and mutants
  • the biotransformation can be carried out with resting cells (non-growing cells that no longer need a C and energy source) or with growing cells
  • Suitable media for the biotransformation are the commercially customary, for example low-molecular phosphate buffers, Hepes buffers and full media such as "Nutrient Yeast Broth” (NYB) or mineral salt media as described in Kulla et al, (Aren. Microbiol. 135, 1 (1983)) or in Table 1
  • the biotransformation is expediently carried out with a single or continuous addition of IPA such that the concentration of IPA does not exceed 10% by weight, preferably 1% by weight
  • the pH can range from 4 to 10, preferably from 5 to 9
  • Biotransformation is expediently carried out at a temperature of 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C.
  • L-alaninol can be isolated by customary work-up methods, for example by distillation of the basic, cell-free fermentation broth
  • ⁇ -Glutamylisopropylamide is an important intermediate for the production of gluta-in-transport inhibitors (WO 91/12232).
  • Aerobic microorganisms which are able to utilize IPA as the only C and N source were enriched on minimal medium (Table 1) in the presence of 25 mM IPA as the only C source.
  • 100 ml of this medium were placed in 300 ml Erlenmeyer flasks and inoculated with different clear sludge samples (2 ml) from the LONZA AG clearing plant in Visp, Switzerland. The flasks were incubated at 30 ° C for 5 days. Then 1 ml of the medium was used to inoculate another flask with the fresh medium Flask was again incubated under the same conditions. In total, this enrichment cycle was repeated five times. The enriched bacteria were then spread on minimal medium with agar (15 g / 1) and 25 mM IPA to form individual colonies.
  • the isolated IPA-utilizing microorganisms were further selected under the same conditions for the ability to utilize L-alaninol as the only C source.
  • the strain Pseudomonas sp Kie-171 wild-type strain was finally isolated in this way
  • the growth of the strain Kie 171 was tested on various C sources (in each case 20 mM, pH 7.0) in 25 ml minimal medium. The growth was monitored by measuring the OD 650 . The results are described in Table 2. There was growth on the following C sources: isopropylamine, L-alaninol, L-alanine, D-alanine, L-lactate, D, L-lactate, propionic acid, propane-l, 2-diol, ethanolamine and propionic acid aldehyde.
  • Mutants for the production of L-alaninol from IPA should not be able to utilize either IPA or L-alaninol. They should only transform IPA into L-alaninol
  • Kie 171 was grown to 20 mM IPA to an OD f , 50 of 0.6 (exponential phase).
  • N-methyl-N '-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) was suspended in a Strain Kie 171 [concentration of 0.5 ⁇ g / ⁇ l cells (2.5 ⁇ 10 cells / ml)] given in C-free medium after 30 minutes
  • E coli S17-1 ⁇ pir which contains the plasmid pUT mi-Tn5 with the kanamycin (Km) resistance gene, was conjugated to Pseudomonas sp Kie 171.
  • the donor strain E coli S17-1 ⁇ pir was conjugated to a fresh Luria bread ( LB) plate with 200 ⁇ g A picillin per ml grown at 37 ° C.
  • Pseudomonas sp Kie 171 was cultivated on an MM (minimal medium) plate (Table 1) with 20 mM IPA at 30 ° C.
  • E coli S17-1 ⁇ pir colony was used to inoculate 25 ml LB medium containing 200 ⁇ g / ml ampicillin and 50 ⁇ g / ml km. This culture was grown overnight at 150 rpm at 37 ° C. Pseudomonas sp Kie 171 was also used
  • the colonies subsequently obtained were tested for growth on various C sources (IPA, L-alaninol, L-alanine, L-lactate, L-alanine and L-glutamate) in the presence of 50 ⁇ g / ml km. This took place first on solid medium and then in liquid culture. Mutants that were unable to utilize IPA and L-alaninol were examined further. The mutant Kie 171-B1 was isolated, which grew neither on IPA nor on L-alaninol, but could still utilize L-alanine, L-lactate and L-alanine and L-glutamate.
  • C sources IPA, L-alaninol, L-alanine, L-lactate, L-alanine and L-glutamate
  • a 25 ml overnight pre-culture from Kie 171-B (DSM 11521) was used for the biotransformation of IPA to L-alaninol. This was grown on minimal medium with 20 mM L-glutamate and used to inoculate a culture of 250 ml in a 1 liter bottle of the same medium. After culturing Kie 171-B until the beginning of the exponential phase (OD 650 from 0.4 to 0.6), IPA (10 mM) was added. After an OD 650 of 1 to 1.3 had been reached, the culture was run at 4000 rpm for 15 min. centrifuged and the sediment washed twice with half the amount of culture medium without a C source.
  • the cells could then be taken up in the desired volume of minimal medium (Table 1) without a C source, so that 5 ml of a concentrated cell suspension (OD 6JO ⁇ 13) was obtained.
  • a concentrated cell suspension OD 6JO ⁇ 13
  • this culture of resting cells was shaken at 150 rpm at 30 ° C.
  • the samples were taken at various times (16 h, 25 h and 40 h) In both initial concentrations of IPA (10 mM and 20 mM) a final concentration of 7 mM L-alaninol was reached after the biotransformation. This corresponded to a yield of 37% and 59% respectively.
  • the rest was non-metabolized IPA
  • L-alaninol was derivatized with 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-glucopyranosyl isothiocyanate.
  • a Machereyl-Nagel NUCLEOSIL 120 3 C I8 AB column was used at 40 ° C Detection takes place at 250 nm
  • Pseudomonas sp Kie 171 -B 1 was used for this experiment. This strain was grown analogously to Example 4 on MM medium with glutamate and kanamycin. After cultivation to the exponential phase, 10 mM IPA was added for enzyme induction. This culture was added for a further 3 h at 30 ° C and 150 rpm shaken Then the cells were centrifuged, washed with MM medium and concentrated to an OD546 «13 25 ml of this cell suspension were then filled into 100 ml serum bottles, which were sealed with rubber stoppers

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Abstract

Beschrieben wird ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol der Formel (I), und ein Verfahren zur Herstellung von η-Glutamylisopropylamid der Formel (III), unter Verwendung neuer Mikroorganismen, die entweder befähigt sind, aus Isopropylamin L-Alaninol zu produzieren oder befähigt sind, Isopropylamin als einzige C- und N-Quelle zu verwerten.

Description

Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol und von γ-Glutamylisopropylamid
Die Erfindung betrifft neue Mikroorganismen, die befähigt sind, mit Isopropylamin als einziger C- und/oder N-Quelle zu wachsen, sowie Mikroorganismen, die aus Isopropylamin L-Alaninol produzieren und letzteres nicht katabolisieren. Letztere werden für ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol (S-(+)-2-Amino-l-propanol) ausgehend von Isopropylamin eingesetzt.
L-Alaninol ist ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von Pharmazeutika, beispielsweise zur Herstellung von Ofloxacin (J. Med. Chem 1997, 30, 2283-2286)
Bisher sind nur chemische Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol bekannt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird mit den Mikroorganismen ge ass Anspruch 1 und dem Verfahren gemass Anspruch 6 gelost.
Die erfindungsgemassen Mikroorganismen sind erhältlich durch die Schritte.
a) Mutagenese von Mikroorganismen, die befähigt sind, auf Isopropylamin und L-Alaninol als einziger C-Quelle zu wachsen, b) Selektion von Mutanten, die befähigt sind, auf L- Alanin, nicht aber auf Isopropylamin und L-Alaninol als einziger C-Quelle zu wachsen.
Mikroorganismen, die befähigt sind, auf Isopropylamin und L-Alaninol als einziger C- und/oder N-Quelle zu wachsen, können aus Bodenproben, Schlamm oder Abwasser, insbesondere kontaminierten Böden und Klärschlamm, unter Zuhilfenahme üblicher mikrobiologischer Techniken selektioniert und isoliert werden. Zweckmäßig erfolgt die Isolierung dadurch, daß die gewünschten Mikroorganismen durch Selektion mit Isopropylamin als einziger C- und/oder N-Quelle aus einer Probe angereichert werden Ausgehend von den so erhaltenen Mikroorganismen werden dann in gleicher Weise durch selektive Anreicherung mit L-Alaninol als einziger C- und/oder N-Quelle stabile Mikroorganismen selektiert, die befähigt sind, Isopropylamin und L-Alaninol als einzige C- und N-Quelle zu verwerten
Die so erhaltenen "Wildstamme" werden dann einer Mutagenese unterworfen, wobei die Mutagenese nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden kann (J H Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) Zweckmassige Mutationsmethoden sind die Punktmutations-Methode, beispielsweise mit Hilfe mutagener Agentien oder UV-Strahlung, die Frameshift-Methode, die Deletionsmethode oder die Transposon-Insertionsmethode
Aus der durch Züchtung erhaltenen Kultur mutierter Mikroorganismen können durch Wachstumstests auf Isopropylamin, L-Alaninol und einem weiteren Stoffwechselabbauprodukt von L-Alaninol als jeweils einziger C- und/oder N-Quelle diejenigen Mikroorganismen selektionert werden, die aus Isopropylamin L-Alaninol produzieren und letzteres nicht katabolisieren Es wurde gefunden, daß der Abbau von Isopropylamin durch die "Wildstamme" über L-Alaninol bevorzugt zu L-Alanin fuhrt Bevorzugt erfolgt die Selektion der erfmdungsgemaßen Mikroorganismen daher auf Isopropylamin, L-Alaninol und L-Alanin als jeweils einziger C- und/oder N-Quelle Die gewünschten Mikroorganismen sind daran zu erkennen, daß sie nicht mehr auf Isopropylamin und L-Alaninol, wohl aber auf L-Alanin als einziger C- und/oder N-Quelle zu wachsen vermögen. Diese Stamme werden im folgenden als "Alaninol-Produzenten" bezeichnet
Weitere Wachstumssubstrate und mögliche Abbauprodukte von Isopropylamin, die ebenfalls als einzige C- und/oder N-Quelle und damit zur Selektion dienen können, sind D-Alanin, L-2-Amino-2-methylacetaldehyd, L- oder D,L-Milchsaure bzw deren Salze, und Pyruvat Sowohl die "Wildstamme" als auch die "Alaninol-Produzenten" gehören bevorzugt zur Gattung Pseudomonas, insbesondere zur Spezies Pseudomonas sp Kie 171, Kie 171-B (DSM 1 1521) und Kie 171-B 1 (DSM 1 1629) Umfasst werden auch deren fimktionell äquivalente Varianten und Mutanten Die Mikroorganismen Pseudomonas sp Kie 171-B (DSM 1 1521) wurden am 23 04 1997, die Kie-Bl (DSM 1 1629) am 25 06 1997 und die Kie 171 (DSM 12360) am 05 08 1998 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, gemass Budapester Vertrag hinterlegt
Unter "funktionell äquivalenten Varianten und Mutanten" werden Mikroorganismen verstanden, die sich von den Ursprungsorganismen ableiten und in ihren erfindungswesentlichen Eigenschaften und Funktionen mit diesen übereinstimmen Solche Varianten und Mutanten können zufallig z B durch UV-Bestrahlung gebildet werden
Wissenschaftliche Beschreibung des Stammes Kie 171-B (DSM 11521)
Pseudomonas sp RNA-Gruppe 1
Eigenschaften des Stammes Zellform Stabchen
Breite μm 0,7 - 0,8
Lange μm 1,5 - 3,5
Beweglichkeit +
Geissein monopolar, 1
Gram-Reaktion Lyse durch 3% KOH + Aminopeptidase (Cerny) +
Oxidase + Katalase w
Fluoreszens Pyocyanin
ADH +
Urease
Hydrolyse von Gelatine
Nitratreduktion +
Denitrifikation
Substratverwertung
Citrat +
Malat +
Phenyiacetat +
D-Glucose +
Maltose
Trehaiose
Mannitol
Hippurat
Arabinose
Mannose + m-Inosit
Geraniol +
Azelat + α-Ketogluconat
Lecithinase
Abkürzungen:
Levan aus Saccharose - ADH: Alkoholdehydrogenase
Wachstum bei 41 °C +
Nach Analyse mittels der 16S-DNA könnte dieser Stamm eine Ähnlichkeit mit Pseudomonas citronellolis aufweisen.
Nach Selektion in einem fachmännisch üblichen Medium werden die Mikroorganismen vor der eigentlichen Biotransformation üblicherweise in einem für die Fachwelt üblichen Medium kultiviert (angezogen). Als Selektions- und Anzuchtsmedium kann das in Tabelle 1 beschriebene Medium verwendet werden. Das erfindungsgemasse Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol der Formel
Figure imgf000007_0001
wird derart durchgeführt, dass man Isopropylamin, im folgenden als IPA abgekürzt, der Formel
Figure imgf000007_0002
mittels den "Alaninol-Produzenten" umsetzt.
Für das Verfahren besonders geeignet sind die zuvor beschriebenen "Alaninol-Produzenten" der Gattung Pseudomonas, insbesondere der Spezies Pseudomonas sp. Kie 171-B (DSM 11521) und Kie-B l (DSM 11629) sowie deren fünktionell äquivalente Varianten und Mutanten
Die Biotransformation kann mit ruhenden Zellen (nicht wachsende Zellen, die keine C- und Energiequelle mehr benotigen) oder mit wachsenden Zellen durchgeführt werden
Als Medien für die Biotransformation können die fachmannisch üblichen, beispielsweise niedermolare Phosphatpuffer, Hepes-Puffer und Vollmedien wie "Nutrient Yeast Broth" (NYB) oder Mineralsalzmedien wie beschrieben bei Kulla et al , (Aren. Microbiol. 135, 1 (1983)) oder in Tabelle 1, verwendet werden
Zweckmassig wird die Biotransformation unter einmaliger oder kontinuierlicher Zugabe von IPA so durchgeführt, dass die Konzentration an IPA 10 Gew.%, vorzugsweise 1 Gew % nicht übersteigt Der pH-Wert kann in einem Bereich von 4 bis 10 vorzugsweise von 5 bis 9 liegen Die
Biotransformation wird zweckmassig bei einer Temperatur von 10 bis 50 °C, vorzugsweise von 20 bis 40 °C, durchgeführt
Nach einer üblichen Umsetzungszeit von 1 bis 100 h kann L-Alaninol durch übliche Aufarbeitungsmethoden wie beispielsweise durch Destillation der basischen, zellfreien Fermentationsbruhe isoliert werden
Überraschenderweise wurde nun auch gefunden, dass die "Wildstamme" und die "Alaninol- Produzenten" γ-Glutamylisopropylamid der Formel
Figure imgf000008_0001
produzieren. γ-Glutamylisopropylamid ist ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von Gluta in-Transport-Inhibitoren (WO 91/12232).
Das erfindungsgemasse Verfahren zur Herstellung von γ-Glutamylisopropylamid wird derart durchgeführt, dass man IPA der Formel
Figure imgf000008_0002
mit wachsenden Zellen der "Wildstamme" oder der "Alaninol-Produzenten" umsetzt
Für das Verfahren besonders geeignet sind die zuvor beschriebenen "Wildstamme" oder "Alaninol-Produzenten" der Gattung Pseudomonas, insbesondere der Spezies Pseudomonas sp Kie 171 , Kie 171 B sowie deren fünktionell äquivalente Varianten und Mutanten
Ansonsten wird das Verfahren zur Herstellung von γ-Glutamylisopropylamid unter den gleichen Bedingungen wie das Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol durchgeführt Beispiele:
Beispiel 1
Isolation von Mikroorganismen, die iahig sind, Isopropylamin als einzige C- und N-Quelle zu verwerten
Aerobe Mikroorganismen, die fähig sind, IPA als einzige C- und N-Quelle zu verwerten, wurden auf Minimalmedium (Tabelle 1) in Anwesenheit von 25 mM IPA als einziger C-Quelle angereichert Dabei wurden 100 ml dieses Mediums in 300 ml Erlenmeyerkolben gegeben und jeweils mit verschiedenen Klarschlammproben (2 ml) aus der LONZA AG Klaranlage in Visp, Schweiz, beimpft Die Kolben wurden ruhend bei 30 °C 5 Tage lang inkubiert Dann wurde 1 ml des Mediums verwendet, um einen weiteren Kolben mit dem frischem Medium zu beimpfen Dieser Kolben wurde wiederum unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Insgesamt wurde dieser Anreicherungszyklus fünf mal wiederholt. Danach wurden die angereicherten Bakterien auf Minimal-Medium mit Agar (15 g/1) und 25 mM IPA zu Einzelkolonien ausgestrichen.
Die isolierten IPA-verwertenden Mikroorganismen wurden unter den gleichen Bedingungen weiterhin auf die Fähigkeit, L-Alaninol als einzige C-Quelle zu verwerten, selektioniert. Auf diese Weise wurde schliesslich der Stamm Pseudomonas sp Kie-171 (Wildtypstamm) isoliert
Tabelle 1:
pH-Wert der Losung = 7,0
Um den Abbauweg von IPA zu bestimmen, wurde das Wachstum des Stammes Kie 171 auf verschiedenen C-Quellen (jeweils 20 mM, pH 7,0) in 25 ml Minimal-Medium getestet. Das Wachstum wurde durch Messung der OD650 verfolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 beschrieben. Es fand Wachstum auf folgenden C-Quellen statt: Isopropylamin, L-Alaninol, L- Alanin, D- Alanin, L-Lactat, D,L-Lactat, Propionsaure, Propan-l,2-diol, Ethanolamin und Propionsaurealdehyd Auf folgenden C-Quellen fand kein Wachstum statt: D-AIaninol, D,L- Alaninol, Aceton, 2-Propanol, 1-Propanol, Propylamin, Methylamin, 2-Aminopentan, tert- Butylamin, Isopropanol, L-Serin, L-2-Amino-l-butanol, D,L-Propan-l,2-diol, L-Propan-1,2- diol, D-Propan- l ,2-diol, Ethylamin, D-2-Aminobutan, Malonsaure, Methylamin und Hydroxyaceton
Tabelle 2:
Kein Wachstum nach 5 Tagen Wachstum innerhalb 2 Tage
Aceton Propanol Isopropylamin
Hydroxyaceton 2-Propanol L-Alaninol
Isopropanol D-Alaninol Propionsaure
D,L-Alaninol 2-Amino-propandiol L-Lactat
D,L-Propan-l,2-diol D,L-Lactat
L-Serin L-Propan-l,2-diol L-Alanin tert-Butylamin D-Propan-l,2-diol D-Alanin
Ethylamin Ethylamin Propan-l,2-diol
L-2- Amino- 1 -butanol D-2-Aminobutan Ethanolamin
Propylamin Malonsaure Propionsaurealdehyd
Methylamin (±)-2-Aminopentan
Beispiel 2
Isolierung von Mutanten des Stammes Kie 171, deren IPA-Abbau-Weg unterbrochen ist
mittels Punktmutations-Methode
Mutanten für die Herstellung von L-Alaninol aus IPA sollen weder IPA noch L-Alaninol verwerten können Sie sollen IPA ausschliesslich in L-Alaninol transformieren Zur Herstellung solcher Mutanten wurde Kie 171 auf 20 mM IPA bis zu einer ODf,50 von 0,6 (exponentielle Phase) angezogen Als mutagenes Agens wurde N-Methyl-N '-nitro- N-nitrosoguanidin (MNNG) zu einer Suspension des Stammes Kie 171 [Konzentration von 0,5 μg/μl Zellen (2,5 xlO Zellen/ml)] in C-freiem Medium gegeben Nach 30 minutiger
Inkubation wurde MNNG mit C-freiem Minimal-Medium herausgewaschen Es wurden Verdunnungsrethen in C-freiem Minimal-Medium (Tabelle 1 ) hergestellt und die erhaltenen Präparate auf L-Glutamat Fest-Medium (Minimal-Medium, 20 mM L-Glutamat und 15 g/1 Agar-Agar) ausgestrichen und bei 30 °C inkubiert Die daraufhin erhaltenen Kolonien wurden bezuglich Wachstum auf verschiedenen C-Quellen (IPA, L-Alaninol, L-Alanin und
L-Propionsaure in einer Konzentration von 20 mM) getestet Dies fand zuerst auf Festmedium und danach in Flussigkultur statt Mutanten, die IPA sowie L-Alanmol nicht verwerten konnten, wurden weiter untersucht Es wurde die Mutante Pseudomonas sp Kie 171-B (DSM 1 1521) isoliert, die weder auf IPA noch auf L-Alaninol wuchs, aber weiterhin L-Alanin, Propionsaure und L-Glutamat verwerten konnte
mittels Transposon Insertionsmethode
Für die Herstellung der Transposon Mutanten wurde im Wesentlichen das Protokoll von Lorenzo, de V and Timmis K N "Analysis and construction of stable phenotypes in Gram-negative bacteπa with Tn5 and Tn 10-deπved minitransposons" Meth Enzymol Band 235, Seiten 386 - 405, 1994, verfolgt
E coli S17-1 λ pir, welches das Plasmid pUT mιni-Tn5 mit dem Kanamycin (Km) Resistenz-Gen enthalt, wurde mit Pseudomonas sp Kie 171 konjugiert Dabei wurde der Donorstamm E coli S17-1 λ pir auf einer frischen Luria Broth (LB)-Platte mit 200 μg A picillin pro ml bei 37 °C aufgezogen Pseudomonas sp Kie 171 wurde auf einer MM (Minimal-Medium)-Platte (Tabelle 1) mit 20 mM IPA bei 30 °C kultiviert Eine E coli S17-1 λ pir Kolonie wurde zum Animpfen von 25 ml LB-Medium, welches 200 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Km enthielt, verwendet Diese Kultur wurde über Nacht bei 150 rpm bei 37 °C aufgezogen Pseudomonas sp Kie 171 wurde ebenfalls über
Nacht in 25 ml MM mit 20 mM IPA bei 150 rpm und 30 °C geschüttelt Danach wurden die Zellen Pseudomonas sp. Kie 171, sowie E. coli S17-1 λ pir durch
15-minütiges zentrifügieren bei 4000 rpm geerntet und zweimal mit 5 ml 0,9% NaCl gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurden die Zellen in 500 μl 0,9% NaCl aufgenommen. 500 μl E. coli und 500 μl Pseudomonas sp. Kie 171 wurden miteinander auf einer LB-Platte ohne Km vermischt. Dabei wurde die E. coli Zeil-Suspension als ein
Tropfen zentral auf die Platte aufgetragen. Pseudomonas sp. Kie 171 wurde kurz danach auf die selbe Stelle pipettiert, damit die Organismen eng in Kontakt stehen für eine erfolgreiche Konjugation. Diese Platte wurde während eines Zeitraumes von 8 h bei 30 °C inkubiert. Die Zellen wurden danach in 2 ml 0,9% NaCl aufgenommen. Jeweils 300 μl der Zellsuspension wurden direkt auf MM-Platten mit 50 μg/ml Km, 10 mM L-Lactat und 10 mM L-Alanin ausplattiert und bei 30 °C inkubiert. Die daraufhin erhaltenen Kolonien wurden auf verschiedene C-Quellen (IPA, L-Alaninol, L-Alanin, L-Lactat, L-Alanin und L-Glutamat) in Anwesenheit von 50 μg/ml Km bezüglich des Wachstum getestet. Dies fand zuerst auf Festmedium und danach in Flüssigkultur statt. Mutanten, die IPA sowie L-Alaninol nicht verwerten konnten, wurden weiter untersucht. Es wurde die Mutante Kie 171-B1 isoliert, die weder auf IPA noch auf L- Alaninol wuchs, aber weiterhin L-Alanin, L-Lactat und L-Alanin und L-Glutamat verwerten konnte.
Beispiel 3:
Biotransformation von IPA zu L-Alaninol
Für die Biotransformation von IPA zu L-Alaninol benützte man eine 25 ml Übernacht- Vorkultur von Kie 171-B (DSM 11521). Diese wurde auf Minimal-Medium mit 20 mM L-Glutamat angezogen und zum Animpfen einer Kultur von 250 ml in einer 1 1 Flasche desselben Mediums benützt. Nach Kultivierung von Kie 171-B bis zum Beginn der exponentiellen Phase (OD650 von 0,4 bis 0,6) wurde IPA (10 mM) zugegeben. Nach Erreichen einer OD650 von 1 - 1,3 wurde die Kultur bei 4000 rpm 15 min. zentrifügiert und das Sediment zweimal mit der halben Menge an Kulturmedium ohne C-Quelle gewaschen. Anschliessend konnten die Zellen im gewünschten Volumen Minimal-Medium (Tabelle 1) ohne C-Quelle aufgenommen werden, so dass 5 ml einer konzentrierten Zeilsuspension (OD6JO ~13) erhalten wurde Nach Zugabe von 10 bzw 20 mM IPA schüttelte man diese Kultur ruhender Zellen mit 150 rpm bei 30 °C Die Entnahme der Proben fand zu verschiedenen Zeitpunkten (16 h, 25 h und 40h) statt Mit beiden Anfangskonzentrationen von IPA (10 mM und 20 mM) wurde nach der Biotransformation eine Endkonzentration von 7 mM L-Alaninol erreicht Dies entsprach einer Ausbeute von 37% bzw 59%o Der Rest war nicht metabolisiertes IPA
Nachweis von Alaninol mittels GC-MS:
Alaninol, welches durch Biotransformation hergestellt wurde, konnte in der zellfreien Losung mittels GC-MS nachgewiesen werden Das Fragmentierungmuster war identisch zu dem der Referenzverbindung
Nachweis von L-Alaninol mittels HPLC: L-Alaninol, wurde mit 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-ß-D-glucopyranosyl-isothiocyanate derivatisiert Zur Analyse wurde eine Machereyl-Nagel NUCLEOSIL 120 3 CI8 AB Säule bei 40 °C verwendet Die Detektion erfolgt bei 250 nm
Laufmittel Losung A H2O Losung B Acetonitril
Losung C 250 mM KH2PO4 (pH 2 3)
Figure imgf000014_0001
Rentensionszeiten L-Alaninol 5,46 min D-Alaninol 5,68 min Beispiel 4:
Biotransformation von IPA zu L-Alaninol durch Pseudomonas sp. Kie 171-B1
Für die Biotransformation von IPA zu L-Alaninol wurde eine Über-Nacht-Vorkultur von Pseudomonas sp Kie 171 -B 1 benutzt. Diese wurde auf MM-Medium mit 20 mM L-Glutamat mit 50 mg/ml Km angezogen und zum Animpfen einer Kultur von 250 ml in einer 1 1 Flasche desselben Mediums benützt. Nach Kultivierung von Kie 171 -B 1 bis zur exponentiellen Phase (OD65o von 0,4 - 0,6) wurde 10 mM IPA zugegeben. Diese Kultur wurde weiter bei 30 °C und 150 rpm geschüttelt. Nach 72 h wurden 60 ml des Kulturmediums entnommen. Die Zellen wurden bei 4000 rpm 20 min. abzentrifügiert, 30 ml des zellfreien Überstandes wurden nach Gefrieren in flussigem Stickstoff ohne weitere Behandlung bis zur Trockene lyophilisiert. Eine 20-fach konzentrierte Lösung wurde aus dem Lyophilisat hergestellt. Darin konnte mittels GC- Messungen Alaninol nachgewiesen werden.
Beispiel 5:
Bildung von γ-Glutamylisopropylamid (γ-GIPA)
Pseudomonas Kie 171 und Pseudomonas sp. Kie 171-B scheiden γ-GIPA während des Wachstums auf IPA aus.
Beim Wachstum von Pseudomonas sp. Kie 171 auf IPA, sowie dessen Mutante Pseudomonas sp Kie 171-B auf L-Glutamat in Anwesenheit von IPA, wurde γ-GIPA in das Medium ausgeschieden. Durch Aufzucht einer grösseren Menge Biomasse konnten 100 mg dieser Verbindung isoliert und dessen Struktur mit Η-NMR, 13C-NMR und MS identifiziert werden. Bei der Transformation von IPA in L-Alaninol durch ruhende Zellen von Pseudomonas sp. Kie 171-B entstand kein γ-GIPA. Dies konnte mit HPLC-Messungen nachgewiesen werden γ-GIPA entsteht folglich nur durch Zellen im Wachstum
Η-NMR (D2O, 400 MHz δl sI. = O) 3,91 ppm (sept, 1H, H-6),
3,75 ppm (t, 1H, H-2),
2,38 ppm (m, 2H, CH2-4),
2,13 ppm (m, 2H, CH2-3),
1,13 ppm(d, 6H, CH3-7 und CH3-8)
13 C-NMR (D2O, 100 Mhz, δ,)10 an = 67,4 ppm) 174,7 und 174,2 ppm (2 x s, C-l und C-5),
55.1 ppm (d, C-2), 42,6 ppm (d, C-6), 32,6 ppm (t, C-4), 27,4 ppm (t, C-3),
22.2 und 22,1 ppm (2 x q, C-7 und C-8)
Beispiel 6:
Biotransformation von IPA zu L-Alaninol in Gegenwart von 18 O/ 2
Für dieses Experiment wurde Pseudomonas sp Kie 171 -B 1 verwendet Dieser Stamm wurde analog zu Beispiel 4 auf MM-Medium mit Glutamat und Kanamycin angezogen Nach Kultivierung bis zur exponentiellen Phase wurde zur Enzyminduktion 10 mM IPA zugegeben Diese Kultur wurde für weitere 3 h bei 30 °C und 150 rpm geschüttelt Danach wurden die Zellen abzentrifügiert, mit MM-Medium gewaschen und auf eine OD546 « 13 aufkonzentriert 25 ml dieser Zellsuspension wurden dann in 100 ml Serumflaschen gefüllt, die mit Gummistopfen verschlossen wurden Bei der Probe 1 wurde die Atmosphäre
18 unbehandelt belassen Bei der Probe 2 wurde die gesamte Luft zweimal gegen O2 (96%) ausgetauscht Beim Start der Biotransformation wurden beide Proben mit 0,5 ml IM IPA- Losung (pH 7,0) versetzt (IPA Konzentration in der Losung 20 mM) Die Proben wurden für weitere 8 h bei 30 °C und 150 rpm geschüttelt. In der Probe 1 wurden 6,9 mM Alaninol und in Probe 2 0,48 mM Alaninol nachgewiesen. Anschliessend wurden die Zellen abzentrifügiert und das Wasser im zellfreien Überstand am
Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde mit Trifluoressigsäureanhydrid versetzt, um N-Trifluoracetylalaninol zu bilden. Von dieser Verbindung wurde am GC/MS die Einbaurate von O bestimmt.
Für die Bestimmung der Einbaurate wurden folgende Peaks vom trifüoracetyliertem Derivat herangezogen:
m e Zuordnung
174 M+ + 1 protoniertes M+ mit einem O
172 M+ + 1 protoniertes M+
158 M+ - 15 Verlust von Methyl von einem M+ mit einem ,«0
156 M+ - 15 Verlust von Methyl
Die Auswertung des SIM Spektrums ergab für die Probe 2 eine Einbaurate von 18 O von 37,2%.
1 S Der Einbau von O bei der Biotransformation von IPA zu Alaninol kann dadurch erklärt
1 fϊ werden, dass eine Oxygenase diese Reaktion katalysiert. Der relativ geringe Einbau von O in der Probe 2 kann dadurch erklärt werden, dass 16O markiertes Alaninol beim unvollständigen Waschen der Zellen mitgeschleppt wurde.

Claims

Patentansprüche:
1 Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass sie befähigt sind, Isopropylamin zu L-Alaninol umzusetzen und letzteres nicht katabolisieren
2 Mikroorganismen nach Anspruch 1, erhaltlich durch. a) Mutagenese von Mikroorganismen, die befähigt sind, auf Isopropylamin und L-Alaninol als einziger C-Quelle zu wachsen, b) Selektion von Mutanten, die befähigt sind, auf L-Alanin, nicht aber auf Isopropylamin und L-Alaninol als einziger C-Quelle zu wachsen.
3 Mikroorganismen nach Anspruch 1 oder 2 der Gattung Pseudomonas
4 Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 der Spezies Pseudomonas sp. Kie 171-B (DSM 1 1521) und Kie 171-B1 (DSM 1 1629), sowie deren fünktionell äquivalente Varianten und Mutanten
5. Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass sie befähigt sind, mit Isopropylamin als einziger C-Quelle zu wachsen
Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol der Formel
Figure imgf000018_0001
dadurch gekennzeichnet, dass man Isopropylamin der Formel
Figure imgf000018_0002
mittels der Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zu L-Alaninol umsetzt
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Biotransformation mittels Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas durchfuhrt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Biotransformation unter Zugabe an Isopropylamin so durchführt, dass die Konzentration 10 Gew. % nicht übersteigt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Biotransformation bei einer Temperatur von 10 bis 50 °C und einem pH von 4 bis 10 durchfuhrt.
10. Verfahren zur Herstellung von γ-Glutamylisopropylamid der Formel
Figure imgf000019_0001
dadurch gekennzeichnet, dass Isopropylamin der Formel
Figure imgf000019_0002
mittels wachsender Zellen der Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zum Produkt der Formel III umgesetzt wird.
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