JP2001513321A - Ｌ−アラニノールおよびγ−グルタミルイソプロピルアミドを製造するための微生物学的方法 - Google Patents
Ｌ−アラニノールおよびγ−グルタミルイソプロピルアミドを製造するための微生物学的方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｌ−アラニノールおよびγ−グルタミルイソプロピルアミドを製造するための微生物学的方法を提供する。
【解決手段】 式（Ｉ）で表されるＬ−アラニノールの製造方法および式（III）で表されるγ−グルタミルイソプロピルアミドの製造方法であって、イソプロピルアミンからＬ−アラニノールを製造することができるか、又はイソプロピルアミンを唯一の炭素および窒素の供給源とすることができる新規な微生物を利用する方法。
【化１】
【化２】
Description
【０００１】 本発明は、イソプロピルアミンを唯一の炭素及び／又は窒素の供給源として増
殖することができる新規な微生物に関する。本発明はまた、イソプロピルアミン
からＬ−アラニノールを製造し、かつ該Ｌ−アラニノールを異化しない微生物に
関する。後者の微生物は、イソプロピルアミンから出発してＬ−アラニノール（
Ｓ（＋）−２−アミノ−１−プロパノール）を製造するための新規な方法に使用
される。
殖することができる新規な微生物に関する。本発明はまた、イソプロピルアミン
からＬ−アラニノールを製造し、かつ該Ｌ−アラニノールを異化しない微生物に
関する。後者の微生物は、イソプロピルアミンから出発してＬ−アラニノール（
Ｓ（＋）−２−アミノ−１−プロパノール）を製造するための新規な方法に使用
される。
【０００２】 Ｌ−アラニノールは重要な医薬用中間体、一例を挙げれば、オフロキサチン（
ofloxacin）製造のための中間体である（J. Med. Chem 1997, 30, 2283-2286） 。
ofloxacin）製造のための中間体である（J. Med. Chem 1997, 30, 2283-2286） 。
【０００３】 これまで、Ｌ−アラニノールを製造するための化学的方法しか知られていない
。
。
【０００４】 本発明の目的は、Ｌ−アラニノールを製造するための簡易且つ経済的な方法を
提供することである。この目的は、請求項１の微生物、並びに請求項６の方法を
使用することにより達成される。 本発明の微生物は、以下の手段により得られる。 ａ）イソプロピルアミンおよびＬ−アラニノールを唯一の炭素の供給源として増
殖することができる微生物の突然変異誘発、 ｂ）Ｌ−アラニンを唯一の炭素の供給源として増殖することができ、Ｌ−アラニ
ノールおよびイソプロピルアミンを唯一の炭素の供給源として増殖することはで
きない突然変異体の選別。
提供することである。この目的は、請求項１の微生物、並びに請求項６の方法を
使用することにより達成される。 本発明の微生物は、以下の手段により得られる。 ａ）イソプロピルアミンおよびＬ−アラニノールを唯一の炭素の供給源として増
殖することができる微生物の突然変異誘発、 ｂ）Ｌ−アラニンを唯一の炭素の供給源として増殖することができ、Ｌ−アラニ
ノールおよびイソプロピルアミンを唯一の炭素の供給源として増殖することはで
きない突然変異体の選別。
【０００５】 Ｌ−アラニノールおよびイソプロピルアミンを唯一の炭素及び／又は窒素の供
給源として増殖することができる微生物は、土壌試料、スラッジ又は廃水から通
常の微生物学的技術により分離することができ、特に汚染された土壌および汚水
スラッジから分離することができる。
給源として増殖することができる微生物は、土壌試料、スラッジ又は廃水から通
常の微生物学的技術により分離することができ、特に汚染された土壌および汚水
スラッジから分離することができる。
【０００６】 試料からの上記の分離は、微生物を、唯一の炭素及び／又は窒素の供給源とし
てイソプロピルアミンを用いた選別により前記微生物を豊化することによって行
うのが有利である。このようにして得た微生物から出発し、唯一の炭素及び／又
は窒素の供給源としてＬ−アラニノールおよびイソプロピルアミンを用いて、同
様に選別的に豊化することにより、Ｌ−アラニノールおよびイソプロピルアミン
を唯一の炭素および窒素の供給源として増殖することができる安定した微生物が
得られる。
てイソプロピルアミンを用いた選別により前記微生物を豊化することによって行
うのが有利である。このようにして得た微生物から出発し、唯一の炭素及び／又
は窒素の供給源としてＬ−アラニノールおよびイソプロピルアミンを用いて、同
様に選別的に豊化することにより、Ｌ−アラニノールおよびイソプロピルアミン
を唯一の炭素および窒素の供給源として増殖することができる安定した微生物が
得られる。
【０００７】 このようにして得られる「野生型」菌株に、次いで、突然変異誘発を施す。こ
の突然変異誘発は既知の方法（Ｊ．Ｈ．ミラー、分子遺伝学、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９７２ 年）により行うことができる。突然変異法としては、点突然変異法（例えば突然
変異促進性因子若しくはＵＶ照射による点突然変異法）、フレームシフト法、デ
ィリーション法又はトランスポゾン−インサーション法が有利である。
の突然変異誘発は既知の方法（Ｊ．Ｈ．ミラー、分子遺伝学、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９７２ 年）により行うことができる。突然変異法としては、点突然変異法（例えば突然
変異促進性因子若しくはＵＶ照射による点突然変異法）、フレームシフト法、デ
ィリーション法又はトランスポゾン−インサーション法が有利である。
【０００８】 イソプロピルアミン、Ｌ−アラニノール、さらにＬ−アラニノールの分解生成
物各々を、唯一の炭素及び／又は窒素の供給源として利用した増殖試験により、
培養により得られる微生物の突然変異体の培養物から、イソプロピルアミンから
Ｌ−アラニノールを生成し、かつ該Ｌ−アラニノールを異化しない微生物を選別
することができる。「野生型」菌株によりイソプロピルアミンが分解し、アラニ
ノールを経由してＬ−アラニンが生成することが好ましいことを見出した。従っ
て、本発明による微生物の選別は、好ましくは、炭素及び／又は窒素の供給源と
してイソプロピルアミン、Ｌ−アラニノール及びＬ−アラニン各々に基づいて行
う。所望される微生物は、イソプロピルアミンおよびＬ−アラニノールを炭素及
び／又は窒素の供給源としてはもはや増殖することはできないが、Ｌ−アラニン
を炭素及び／又は窒素の供給源として増殖できることに基づいて検出することが
できる。この菌株を以下「アラニノール生産体」という。
物各々を、唯一の炭素及び／又は窒素の供給源として利用した増殖試験により、
培養により得られる微生物の突然変異体の培養物から、イソプロピルアミンから
Ｌ−アラニノールを生成し、かつ該Ｌ−アラニノールを異化しない微生物を選別
することができる。「野生型」菌株によりイソプロピルアミンが分解し、アラニ
ノールを経由してＬ−アラニンが生成することが好ましいことを見出した。従っ
て、本発明による微生物の選別は、好ましくは、炭素及び／又は窒素の供給源と
してイソプロピルアミン、Ｌ−アラニノール及びＬ−アラニン各々に基づいて行
う。所望される微生物は、イソプロピルアミンおよびＬ−アラニノールを炭素及
び／又は窒素の供給源としてはもはや増殖することはできないが、Ｌ−アラニン
を炭素及び／又は窒素の供給源として増殖できることに基づいて検出することが
できる。この菌株を以下「アラニノール生産体」という。
【０００９】 「野生型」菌株と「アラニノール生産体」は、共にシュードモナス属に属する
ことが好ましく、特にシュードモナスsp. Kei 171、Kie171-B（DSM 11521）およ
びKie 171-B1（DSM 11629）種に属することが好ましい。該菌株には、これらと 機能的に同等である変異種および突然変異体も含まれる。これらの微生物は、ブ
タペスト条約の下、シュードモナスsp. Kie 171-B（DSM 11521）が１９９７年４
月２３日に、Kie-B1（DSM 11629）が１９９７年６月２５日に、Kie 171（DSM 12
360）が１９９８年８月５日にドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニ ズメン・ウント・ツェルクルトゥーレンＧｍｂＨ「微生物および細胞培養物のド
イツ寄託所」、マシェローダーヴェク １ｂ、Ｄ−３８１２４ ブラウンシュバイ
クに寄託されている。
ことが好ましく、特にシュードモナスsp. Kei 171、Kie171-B（DSM 11521）およ
びKie 171-B1（DSM 11629）種に属することが好ましい。該菌株には、これらと 機能的に同等である変異種および突然変異体も含まれる。これらの微生物は、ブ
タペスト条約の下、シュードモナスsp. Kie 171-B（DSM 11521）が１９９７年４
月２３日に、Kie-B1（DSM 11629）が１９９７年６月２５日に、Kie 171（DSM 12
360）が１９９８年８月５日にドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニ ズメン・ウント・ツェルクルトゥーレンＧｍｂＨ「微生物および細胞培養物のド
イツ寄託所」、マシェローダーヴェク １ｂ、Ｄ−３８１２４ ブラウンシュバイ
クに寄託されている。
【００１０】 本発明の目的において、「機能的に同等である変異種および突然変異体」とは
、親微生物から誘導され、実質的に同じ特徴及び機能を有する微生物をいう。こ
のような変異種および突然変異体は、例えばＵＶ照射により任意に形成され得る
。 Kie 171-B（DSM 11521）の科学的説明 シュードモナスsp. ＲＮＡグループ１ 菌株の特徴 細胞形状 ロッド状 幅 μｍ ０．７〜０．８ 長さ μｍ １．５〜３．５ 可動性 ＋ べん毛 モノポラー、１ グラム反応 − ３％ＫＯＨ溶菌 ＋ アミノペプチダーゼ（セルニー） ＋ オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ｗ 蛍光性 − 緑膿菌 − ＡＤＨ ＋ ウリアーゼ − ゼラチン加水分解 − 硝酸塩還元 ＋ 脱窒素 − 基質利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ フェニル酢酸塩 ＋ Ｄ−グルコース ＋ マルトース − トレハロース − マンニトール − 馬尿酸塩 − アラビノース − マンノース − ｍ−イノシトール − ゲラニオール ＋ アゼライン酸塩 ＋ α−ケトグルコン酸塩 − レシチナーゼ − スクロー
スからの生成物（Laevan) − ＡＤＨ： アルコール デヒドロナーゼ の略語 培養温度４１℃ １６Ｓ ＤＮＡ分析により、この菌株はシュードモナス シトロネラソウと同じ
であることがわかった。
、親微生物から誘導され、実質的に同じ特徴及び機能を有する微生物をいう。こ
のような変異種および突然変異体は、例えばＵＶ照射により任意に形成され得る
。 Kie 171-B（DSM 11521）の科学的説明 シュードモナスsp. ＲＮＡグループ１ 菌株の特徴 細胞形状 ロッド状 幅 μｍ ０．７〜０．８ 長さ μｍ １．５〜３．５ 可動性 ＋ べん毛 モノポラー、１ グラム反応 − ３％ＫＯＨ溶菌 ＋ アミノペプチダーゼ（セルニー） ＋ オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ｗ 蛍光性 − 緑膿菌 − ＡＤＨ ＋ ウリアーゼ − ゼラチン加水分解 − 硝酸塩還元 ＋ 脱窒素 − 基質利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ フェニル酢酸塩 ＋ Ｄ−グルコース ＋ マルトース − トレハロース − マンニトール − 馬尿酸塩 − アラビノース − マンノース − ｍ−イノシトール − ゲラニオール ＋ アゼライン酸塩 ＋ α−ケトグルコン酸塩 − レシチナーゼ − スクロー
スからの生成物（Laevan) − ＡＤＨ： アルコール デヒドロナーゼ の略語 培養温度４１℃ １６Ｓ ＤＮＡ分析により、この菌株はシュードモナス シトロネラソウと同じ
であることがわかった。
【００１１】 当業者に通常知られた培養基中での選別後、生体内変化が実際に起こる前に、
微生物は一般的に、当業者に通常知られた培養基中で培養される。表１に記載の
培養基は、選別および培養として使用することができる。
微生物は一般的に、当業者に通常知られた培養基中で培養される。表１に記載の
培養基は、選別および培養として使用することができる。
【００１２】 式
【化５】
【００１３】 で表されるＬ−アラニノールを製造するための本発明の方法は、 式
【化６】
【００１４】 で表されるイソプロピルアミン（以下、ＩＰＡと略記する）を、「アラニノール
生産体」を用いて変換する態様で実行する。
生産体」を用いて変換する態様で実行する。
【００１５】 上記シュードモナス属の「アラニノール生産体」が該方法に適切であり、特に
シュードモナスsp. Kie 171-B（DSM 11521）およびKie-B1（DSM 11629）、並び にこれらと機能的に同等である変異種および突然変異体が適切である。生体内変
化は、休止細胞（もはや炭素およびエネルギーの供給源を必要としない非増殖細
胞）又は増殖細胞を用いて行われ得る。生体内変化用の培養基としては、当業者
に通常知られた培養基を使用することができ、例えば、低濃度リン酸塩緩衝液、
ヘペス緩衝液および「栄養酵母肉汁」（Nutrient Yeast Broth；NYB）のような 完全培地、若しくはクーラ等により記載された鉱物塩培養基（Arch. Microbiol.
135, 1 (1983)）又は表１に記載された鉱物塩培養基を挙げることができる。
シュードモナスsp. Kie 171-B（DSM 11521）およびKie-B1（DSM 11629）、並び にこれらと機能的に同等である変異種および突然変異体が適切である。生体内変
化は、休止細胞（もはや炭素およびエネルギーの供給源を必要としない非増殖細
胞）又は増殖細胞を用いて行われ得る。生体内変化用の培養基としては、当業者
に通常知られた培養基を使用することができ、例えば、低濃度リン酸塩緩衝液、
ヘペス緩衝液および「栄養酵母肉汁」（Nutrient Yeast Broth；NYB）のような 完全培地、若しくはクーラ等により記載された鉱物塩培養基（Arch. Microbiol.
135, 1 (1983)）又は表１に記載された鉱物塩培養基を挙げることができる。
【００１６】 生体内変化は、ＩＰＡを、ＩＰＡ濃度が１０質量％を超えないように、好まし
くは１質量％を超えないように一度に、または連続的に加えて行うことが有利で
ある。
くは１質量％を超えないように一度に、または連続的に加えて行うことが有利で
ある。
【００１７】 生体内変化は、ｐＨ４〜１０、好ましくは５〜９の領域をとり得、１０〜５０
℃、好ましくは２０〜４０℃の温度で行うことが有利である。 Ｌ−アラニノールは、１〜１００時間の通常の変換時間が経過した後、通常の
ワークアップ法（例えば、基本的な、細胞を含まない発酵肉汁の蒸留）により分
離することができる。
℃、好ましくは２０〜４０℃の温度で行うことが有利である。 Ｌ−アラニノールは、１〜１００時間の通常の変換時間が経過した後、通常の
ワークアップ法（例えば、基本的な、細胞を含まない発酵肉汁の蒸留）により分
離することができる。
【００１８】 驚くべきことに、「野生型」菌株および「アラニノール生産体」は、 式
【化７】
【００１９】 で表されるγ−グルタミルイソプロピルアミドを生成することもまた見出された
。該γ−グルタミルイソプロピルアミドは、グルタミン移送抑制薬を製造するた
めの重要な中間体である（ＷＯ 91/12232）。
。該γ−グルタミルイソプロピルアミドは、グルタミン移送抑制薬を製造するた
めの重要な中間体である（ＷＯ 91/12232）。
【００２０】 γ−グルタミルイソプロピルアミドを製造するための本発明の方法は、 式
【化８】
【００２１】 で表されるＩＰＡを、「野生型」菌株又は「アラニノール生産体」の増殖細胞を
用いて変換する態様で実行される。
用いて変換する態様で実行される。
【００２２】 上記シュードモナス属の「野生型」菌株又は「アラニノール生産体」が本方法
には特に適切であり、中でもシュードモナスsp. Kie 171、Kie 171Bおよびこれ らと機能的に同等である変異種および突然変異体が適切である。
には特に適切であり、中でもシュードモナスsp. Kie 171、Kie 171Bおよびこれ らと機能的に同等である変異種および突然変異体が適切である。
【００２３】 さもなければ、γ−グルタミルイソプロピルアミドを製造するための方法は、
Ｌ−アラニノールの製造方法と同様の条件下で行われる。
Ｌ−アラニノールの製造方法と同様の条件下で行われる。
【００２４】
実施例１ イソプロピルアミンを唯一の炭素および窒素の供給源として利用することがで きる微生物の分離 ＩＰＡを唯一の炭素および窒素の供給源として利用することができる好気性の
微生物を、最小培地（表１）上で、唯一の炭素の供給源として２５ｍＭのＩＰＡ
の存在下で濃縮した。この培養基１００ｍｌを３００ｍｌエルレンマイヤーフラ
スコに入れ、各々にロンザＡＧ、ヴィスプ、スイス、の下水処理設備から得られ
た異なる下水スラッジ試料（２ｍｌ）を接種した。該フラスコを５日間、３０℃
において振とうせずに培養した。次いでこれらの培養基１ｍｌを、新しい培養基
を含むフラスコにさらに接種し、該フラスコを同様の条件下で培養した。この全
濃縮サイクルを５回繰り返した。次いでこの濃縮バクテリアを、寒天（１５ｇ／
ｌ）およびＩＰＡ（２５ｍＭ）を含有する最小培地上にすじ状に塗り付け、個々
のコロニーを形成した。
微生物を、最小培地（表１）上で、唯一の炭素の供給源として２５ｍＭのＩＰＡ
の存在下で濃縮した。この培養基１００ｍｌを３００ｍｌエルレンマイヤーフラ
スコに入れ、各々にロンザＡＧ、ヴィスプ、スイス、の下水処理設備から得られ
た異なる下水スラッジ試料（２ｍｌ）を接種した。該フラスコを５日間、３０℃
において振とうせずに培養した。次いでこれらの培養基１ｍｌを、新しい培養基
を含むフラスコにさらに接種し、該フラスコを同様の条件下で培養した。この全
濃縮サイクルを５回繰り返した。次いでこの濃縮バクテリアを、寒天（１５ｇ／
ｌ）およびＩＰＡ（２５ｍＭ）を含有する最小培地上にすじ状に塗り付け、個々
のコロニーを形成した。
【００２５】 この分離されたＩＰＡ利用型微生物の中から、Ｌ−アラニノールを唯一の炭素
の供給源として利用することができるものがさらに選別された。このようにして
、菌株シュードモナスsp. Kie-171（野生型菌株）が最後に分離された。
の供給源として利用することができるものがさらに選別された。このようにして
、菌株シュードモナスsp. Kie-171（野生型菌株）が最後に分離された。
【００２６】
【表１】
【００２７】 ＩＰＡの異化経路を決定するために、様々な炭素の供給源（各々２０ｍＭ、ｐ
Ｈ７．０）について、菌株Kie 171の増殖試験を２５ｍｌの最小培地中で行った 。増殖に続いて、６５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６５０）を測定した。結果
を表２に示す。増殖は以下の炭素供給源について生じた。すなわち、イソプロピ
ルアミン、Ｌ−アラニノール、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−乳酸塩、Ｄ、
Ｌ−乳酸塩、プロピオン酸、プロパン−１，２−ジオール、エタノールアミンお
よびプロピオンアルデヒドである。以下の炭素供給源については増殖が生じなか
った。すなわち、Ｄ−アラニノール、Ｄ、Ｌ−アラニノール、アセトン、２−プ
ロパノール、１−プロパノール、プロピルアミン、メチルアミン、２−アミノペ
ンタン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、イソプロパノール、Ｌ−セリン、Ｌ−２−ア
ミノ−１−ブタノール、Ｄ、Ｌ−プロパン−１，２−ジオール、Ｌ−プロパン−
１，２−ジオール、Ｄ−プロパン−１，２−ジオール、エチルアミン、Ｄ−２−
アミノブタン、マロン酸、メチルアミンおよびヒドロキシアセトンである。
Ｈ７．０）について、菌株Kie 171の増殖試験を２５ｍｌの最小培地中で行った 。増殖に続いて、６５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６５０）を測定した。結果
を表２に示す。増殖は以下の炭素供給源について生じた。すなわち、イソプロピ
ルアミン、Ｌ−アラニノール、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−乳酸塩、Ｄ、
Ｌ−乳酸塩、プロピオン酸、プロパン−１，２−ジオール、エタノールアミンお
よびプロピオンアルデヒドである。以下の炭素供給源については増殖が生じなか
った。すなわち、Ｄ−アラニノール、Ｄ、Ｌ−アラニノール、アセトン、２−プ
ロパノール、１−プロパノール、プロピルアミン、メチルアミン、２−アミノペ
ンタン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、イソプロパノール、Ｌ−セリン、Ｌ−２−ア
ミノ−１−ブタノール、Ｄ、Ｌ−プロパン−１，２−ジオール、Ｌ−プロパン−
１，２−ジオール、Ｄ−プロパン−１，２−ジオール、エチルアミン、Ｄ−２−
アミノブタン、マロン酸、メチルアミンおよびヒドロキシアセトンである。
【表２】
【００２８】 実施例２ＩＰＡの異化経過が停止している菌株 Kie 171の突然変異体の分離 ａ）点突然変異法の利用 ＩＰＡからＬ−アラニノールを製造するための突然変異体は、ＩＰＡ又は
Ｌ−アラニノールのいずれをも利用することができるものであってはならない。
該変異体は、唯一、ＩＰＡをＬ−アラニノールに変換するものでなければならな
い。このような突然変異体を製造するために、Kie 171 を、６５０ｎｍにおける
光学密度（ＯＤ６５０）が０．６（指数増殖相）になるまで２０ｍＭのＩＰＡ上
で培養した。突然変異誘発物質として、炭素を含有しない培養基中の菌株Kie 17
1 懸濁液［細胞（２．５×１０９cells／ml）の０．５μg／mlの濃度］にＮ−メ
チル−Ｎ‘−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を加えた。３０分間
培養した後、ＭＮＮＧを炭素を含有しない最小培地で洗浄することにより抽出し
た。炭素を含有しない最小培地（表１）中の一連の稀釈液を調製し、生成した調
製物を固体のＬ−グルタミン酸塩培養基（最小培地、Ｌ−グルタミン酸塩２０ｍ
Ｍと寒天１５ｇ／ｌ）上に広げ、３０℃で培養した。次いで得られたコロニーに
ついて、様々な炭素の供給源（濃度２０ｍＭのＩＰＡ、Ｌ−アラニノール、Ｌ−
アラニンおよびＬ−プロピオン酸）に関して増殖試験を行った。増殖は、まず、
固体培養基上で起こり、次いで液体培養物中で起こった。ＩＰＡおよびＬ−アラ
ニノールを利用することができない突然変異体についてさらに研究した。突然変
異体であるシュードモナスsp. Kie 171-B（DSM 11521）を分離した。該突然変異
体はＩＰＡおよびＬ−アラニノール上のいずれにおいても増殖しないが、Ｌ−ア
ラニン、プロピオン酸およびＬ−グルタミン酸を利用することができた。 ｂ）トランスポゾン−インサーション法の利用 トランスポゾン突然変異体を製造するために、「Ｔｎ５およびＴｎ１０誘
導ミニトランスポゾンのグラム陰性菌中の安定した表現型の分析および構造」de
V. およびチミス K. N.、Meth. Enzymol. 第２３５巻、３８６〜４０５頁、１ ９９４年、（実質的なLorenzoプロトコル）には、以下の記載がされている。す なわち、 カナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子を有するプラスミドpUT mini-Tn5を含有す
るE. coli S17-1 λ pirを、シュードモナス sp. Kie 171と共役させた。このた
めに菌株E. coli S17-1 λ pir供与体を、１ml当たり２００μｇのアンピシリン
を含有する新しいルリア肉汁（Luria broth；ＬＢ）平板上において３７℃で増 殖した。シュードモナスsp. Kie 171 を、２０ｍＭのＩＰＡを含有するＭＭ（最
小培地）平板（表１）上において３０℃において培養した。E. coli S17-1 λ p
ir コロニーに、２００μｇ／mlのアンピシリンと５０μｇ／mlのＫｍを含有す るＬＢ培養基２５mlを接種した。この培養物を１５０rpm、３７℃で一晩培養し た。同様に、シュードモナスsp. Kie 171 を、２０ｍＭのＩＰＡを含有するＭＭ
２５ml中で、１５０rpm、３０℃において振とうした。
Ｌ−アラニノールのいずれをも利用することができるものであってはならない。
該変異体は、唯一、ＩＰＡをＬ−アラニノールに変換するものでなければならな
い。このような突然変異体を製造するために、Kie 171 を、６５０ｎｍにおける
光学密度（ＯＤ６５０）が０．６（指数増殖相）になるまで２０ｍＭのＩＰＡ上
で培養した。突然変異誘発物質として、炭素を含有しない培養基中の菌株Kie 17
1 懸濁液［細胞（２．５×１０９cells／ml）の０．５μg／mlの濃度］にＮ−メ
チル−Ｎ‘−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を加えた。３０分間
培養した後、ＭＮＮＧを炭素を含有しない最小培地で洗浄することにより抽出し
た。炭素を含有しない最小培地（表１）中の一連の稀釈液を調製し、生成した調
製物を固体のＬ−グルタミン酸塩培養基（最小培地、Ｌ−グルタミン酸塩２０ｍ
Ｍと寒天１５ｇ／ｌ）上に広げ、３０℃で培養した。次いで得られたコロニーに
ついて、様々な炭素の供給源（濃度２０ｍＭのＩＰＡ、Ｌ−アラニノール、Ｌ−
アラニンおよびＬ−プロピオン酸）に関して増殖試験を行った。増殖は、まず、
固体培養基上で起こり、次いで液体培養物中で起こった。ＩＰＡおよびＬ−アラ
ニノールを利用することができない突然変異体についてさらに研究した。突然変
異体であるシュードモナスsp. Kie 171-B（DSM 11521）を分離した。該突然変異
体はＩＰＡおよびＬ−アラニノール上のいずれにおいても増殖しないが、Ｌ−ア
ラニン、プロピオン酸およびＬ−グルタミン酸を利用することができた。 ｂ）トランスポゾン−インサーション法の利用 トランスポゾン突然変異体を製造するために、「Ｔｎ５およびＴｎ１０誘
導ミニトランスポゾンのグラム陰性菌中の安定した表現型の分析および構造」de
V. およびチミス K. N.、Meth. Enzymol. 第２３５巻、３８６〜４０５頁、１ ９９４年、（実質的なLorenzoプロトコル）には、以下の記載がされている。す なわち、 カナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子を有するプラスミドpUT mini-Tn5を含有す
るE. coli S17-1 λ pirを、シュードモナス sp. Kie 171と共役させた。このた
めに菌株E. coli S17-1 λ pir供与体を、１ml当たり２００μｇのアンピシリン
を含有する新しいルリア肉汁（Luria broth；ＬＢ）平板上において３７℃で増 殖した。シュードモナスsp. Kie 171 を、２０ｍＭのＩＰＡを含有するＭＭ（最
小培地）平板（表１）上において３０℃において培養した。E. coli S17-1 λ p
ir コロニーに、２００μｇ／mlのアンピシリンと５０μｇ／mlのＫｍを含有す るＬＢ培養基２５mlを接種した。この培養物を１５０rpm、３７℃で一晩培養し た。同様に、シュードモナスsp. Kie 171 を、２０ｍＭのＩＰＡを含有するＭＭ
２５ml中で、１５０rpm、３０℃において振とうした。
【００２９】 次いでシュードモナスsp. Kie 171およびE. coli S17-1 λ pirの細胞を ４０００rpmで１５分間遠心分離により収穫し、これを０．９％のＮａＣｌ ５ml
で２回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を０．９％のＮａＣｌ ５００μｌ中に取 り入れた。５００μｌのE. coli と５００μｌのシュードモナスsp. Kie171とを
ＫｍのないＬＢ平板上で互いに混合した。この場合、E. coli 細胞懸濁液を平板
の中央に一滴たらし、その後素早くシュードモナスsp. Kie 171 を同じ箇所にピ
ペットで移した。このようにすることにより、微生物は接合に有利なように極め
て近接する。このプレートを３０℃で８時間培養した。次いで該細胞を０．９％
のＮａＣｌ ２mlに取り入れた。細胞懸濁液のアリコート３００μｌを、５０μ ｇ／mlのＫｍ、１０ｍＭのＬ−乳酸塩および１０ｍＭのＬ−アラニンを含有する
ＭＭ平板上で直接平板培養し、３０℃で保温した。次いで得られたコロニーにつ
いて、５０μｇ／mlのＫｍの存在下、様々な炭素の供給源（ＩＰＡ、Ｌ−アラニ
ノール、Ｌ−アラニン、Ｌ−乳酸塩、Ｌ−アラニンとＬ−グルタミン酸塩）に関
して増殖試験を行った。まず、該試験を固体培養基上で行い、次いで液体培養物
中で行った。ＩＰＡ又はＬ−アラニノールを利用することができない突然変異体
についてさらに研究した。突然変異体Kie 171-B1を分離した。該変異体は、ＩＰ
ＡおよびＬ−アラニノールのいずれについても増殖しないが、Ｌ−アラニン、Ｌ
−乳酸塩、およびＬ−アラニンとＬ−グルタミン酸塩を利用することができる。 実施例３ＩＰＡのＬ−アラニノールへの生体内変化 ＩＰＡのＬ−アラニノールへの生体内変化用に、Kie 171-B（DSM 11521）の一
晩の前培養物２５mlを使用した。これを、２０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩を含有
する最小培地上で培養し、１ lフラスコ内の同じ培養基２５０mlの培養物に接種
した。
で２回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を０．９％のＮａＣｌ ５００μｌ中に取 り入れた。５００μｌのE. coli と５００μｌのシュードモナスsp. Kie171とを
ＫｍのないＬＢ平板上で互いに混合した。この場合、E. coli 細胞懸濁液を平板
の中央に一滴たらし、その後素早くシュードモナスsp. Kie 171 を同じ箇所にピ
ペットで移した。このようにすることにより、微生物は接合に有利なように極め
て近接する。このプレートを３０℃で８時間培養した。次いで該細胞を０．９％
のＮａＣｌ ２mlに取り入れた。細胞懸濁液のアリコート３００μｌを、５０μ ｇ／mlのＫｍ、１０ｍＭのＬ−乳酸塩および１０ｍＭのＬ−アラニンを含有する
ＭＭ平板上で直接平板培養し、３０℃で保温した。次いで得られたコロニーにつ
いて、５０μｇ／mlのＫｍの存在下、様々な炭素の供給源（ＩＰＡ、Ｌ−アラニ
ノール、Ｌ−アラニン、Ｌ−乳酸塩、Ｌ−アラニンとＬ−グルタミン酸塩）に関
して増殖試験を行った。まず、該試験を固体培養基上で行い、次いで液体培養物
中で行った。ＩＰＡ又はＬ−アラニノールを利用することができない突然変異体
についてさらに研究した。突然変異体Kie 171-B1を分離した。該変異体は、ＩＰ
ＡおよびＬ−アラニノールのいずれについても増殖しないが、Ｌ−アラニン、Ｌ
−乳酸塩、およびＬ−アラニンとＬ−グルタミン酸塩を利用することができる。 実施例３ＩＰＡのＬ−アラニノールへの生体内変化 ＩＰＡのＬ−アラニノールへの生体内変化用に、Kie 171-B（DSM 11521）の一
晩の前培養物２５mlを使用した。これを、２０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩を含有
する最小培地上で培養し、１ lフラスコ内の同じ培養基２５０mlの培養物に接種
した。
【００３０】 指数増殖相の開始（６５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６５０）が０．４〜０
．６）までKie 171-B を培養した後、ＩＰＡ（１０ｍＭ）を加えた。ＯＤ６５０ が１〜１．３に達した後、培養物を４０００rpmで１５分間遠心分離し、沈渣を 炭素の供給源を含有しない培地の半量で２回洗浄した。次いで該細胞を、炭素の
供給源のない所望の容積の最小培地（表１）に取り入れ、これにより５mlの濃縮
された細胞懸濁液（ＯＤ６５０が約１３）を得た。１０又は２０ｍＭのＩＰＡを
加えた後、この休止細胞の培養物を１５０rpm、３０℃で振とうした。該試料を さまざまな時間（１６時間、２５時間および４０時間）において回収した。ＩＰ
Ａ初濃度が１０ｍＭおよび２０ｍＭの双方とも、生体内変化後、Ｌ−アラニノー
ルの最終濃度は７ｍＭに達した。これは３７％又は５９％の収量に相当する。残
りのＩＰＡは代謝されなかった。ＧＣ−ＭＳによるアラニノールの検出 生体内変化により生成したアラニノールがＧＣ−ＭＳにより細胞を含有しない
溶液中で検出された。分裂パターンは参照化合物のものと同定された。 ＨＰＬＣによるＬ−アラニノールの検出 ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノジルイソチオ
シアネートによりＬ−アラニノールを誘導した。分析には、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−
ＮＵＣＬＥＯＳＩＬ １２０ ３ Ｃ１８ＡＢカラムを４０℃において使用した 。検出は２５０ｎｍで行った。 可動性相： 溶液Ａ Ｈ２Ｏ 溶液Ｂ アセトニトリル 溶液Ｃ ２５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ２．３）
．６）までKie 171-B を培養した後、ＩＰＡ（１０ｍＭ）を加えた。ＯＤ６５０ が１〜１．３に達した後、培養物を４０００rpmで１５分間遠心分離し、沈渣を 炭素の供給源を含有しない培地の半量で２回洗浄した。次いで該細胞を、炭素の
供給源のない所望の容積の最小培地（表１）に取り入れ、これにより５mlの濃縮
された細胞懸濁液（ＯＤ６５０が約１３）を得た。１０又は２０ｍＭのＩＰＡを
加えた後、この休止細胞の培養物を１５０rpm、３０℃で振とうした。該試料を さまざまな時間（１６時間、２５時間および４０時間）において回収した。ＩＰ
Ａ初濃度が１０ｍＭおよび２０ｍＭの双方とも、生体内変化後、Ｌ−アラニノー
ルの最終濃度は７ｍＭに達した。これは３７％又は５９％の収量に相当する。残
りのＩＰＡは代謝されなかった。ＧＣ−ＭＳによるアラニノールの検出 生体内変化により生成したアラニノールがＧＣ−ＭＳにより細胞を含有しない
溶液中で検出された。分裂パターンは参照化合物のものと同定された。 ＨＰＬＣによるＬ−アラニノールの検出 ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノジルイソチオ
シアネートによりＬ−アラニノールを誘導した。分析には、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−
ＮＵＣＬＥＯＳＩＬ １２０ ３ Ｃ１８ＡＢカラムを４０℃において使用した 。検出は２５０ｎｍで行った。 可動性相： 溶液Ａ Ｈ２Ｏ 溶液Ｂ アセトニトリル 溶液Ｃ ２５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ２．３）
【表３】
【００３１】 保留時間： Ｌ−アラニノール 5.46 分 Ｄ−アラニノール 5.69 分 実施例４シュードモナスsp. Kie 171-B1 によるＩＰＡのＬ−アラニノールへの生体内変 化 。
【００３２】 ＩＰＡのＬ−アラニノールへの生体内変化用に、シュードモナス sp. Kie 171
-B1 の一晩の前培養物を使用した。これを、２０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩およ
び５０ｍｇ／mlのＫｍを含有するＭＭ培養基上で培養し、１ ｌフラスコ中の同 じ培養基の２５０ml培養物に接種した。Kie 171-B1 を指数増殖相（０．４〜０ ．６のＯＤ６５０）に培養した後、１０ｍＭのＩＰＡを加えた。この培養物をさ
らに３０℃、１５０rpmで振とうした。７２時間後、この培地６０mlを取り出し 、該細胞を４０００rpmで２０分間遠心分離にかけた。液体窒素中で凍結した後 、さらなる処理をすることなく細胞を含有しない上澄み３０mlを凍結乾燥して固
体にした。２０倍の濃度の溶液がこの凍結乾燥体から得られ、ＧＣ測定によりそ
の中からアラニノールが検出された。 実施例５γ−グルタミルイソプロピルアミド（γ−ＧＩＰＡ）の形成 シュードモナスKie 171 およびシュードモナス sp. Kie 171-B はＩＰＡ上で増 殖中にγ−ＧＩＰＡを排出。
-B1 の一晩の前培養物を使用した。これを、２０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩およ
び５０ｍｇ／mlのＫｍを含有するＭＭ培養基上で培養し、１ ｌフラスコ中の同 じ培養基の２５０ml培養物に接種した。Kie 171-B1 を指数増殖相（０．４〜０ ．６のＯＤ６５０）に培養した後、１０ｍＭのＩＰＡを加えた。この培養物をさ
らに３０℃、１５０rpmで振とうした。７２時間後、この培地６０mlを取り出し 、該細胞を４０００rpmで２０分間遠心分離にかけた。液体窒素中で凍結した後 、さらなる処理をすることなく細胞を含有しない上澄み３０mlを凍結乾燥して固
体にした。２０倍の濃度の溶液がこの凍結乾燥体から得られ、ＧＣ測定によりそ
の中からアラニノールが検出された。 実施例５γ−グルタミルイソプロピルアミド（γ−ＧＩＰＡ）の形成 シュードモナスKie 171 およびシュードモナス sp. Kie 171-B はＩＰＡ上で増 殖中にγ−ＧＩＰＡを排出。
【００３３】 ＩＰＡ上でのシュードモナス sp. Kie 171の増殖中、およびＩＰＡの存在下Ｌ
−グルタミン酸塩上での該菌株の突然変異体であるシュードモナス sp. Kie 171
-B の増殖中に、γ−ＧＩＰＡが培養基中に排出された。比較的大量のバイオマ スを培養することにより、該化合物１００ｍｇを分離し、その構造を１Ｈ−ＮＭ
Ｒ、１３Ｃ−ＮＭＲおよびＭＳを用いて同定した。シュードモナス sp. Kie 171
-B の休止細胞によりＩＰＡがＬ−アラニノールに変換されるとき、γ−ＧＩＰ Ａは形成されなかった。
−グルタミン酸塩上での該菌株の突然変異体であるシュードモナス sp. Kie 171
-B の増殖中に、γ−ＧＩＰＡが培養基中に排出された。比較的大量のバイオマ スを培養することにより、該化合物１００ｍｇを分離し、その構造を１Ｈ−ＮＭ
Ｒ、１３Ｃ−ＮＭＲおよびＭＳを用いて同定した。シュードモナス sp. Kie 171
-B の休止細胞によりＩＰＡがＬ−アラニノールに変換されるとき、γ−ＧＩＰ Ａは形成されなかった。
【００３４】 これはＨＰＬＣ測定により証明された。従って、γ−ＧＩＰＡは増殖中の細胞
によってのみ形成される。
によってのみ形成される。
【表４】
【００３５】 実施例６ １８Ｏ２の存在下における、ＩＰＡのＬ−アラニノールへの生体内変化 。
【００３６】 本実験にはシュードモナス sp. Kie 171-B1 を使用した。この菌株は、グルタ
ミン酸塩およびカナマイシンを含有するＭＭ培養基上で実施例４と同様の態様で
培養した。指数増殖相まで培養した後、酵素誘発のためにＩＰＡ１０ｍＭを加え
た。この培養物を、３０℃、１５０rpmでさらに３時間振とうした。次いでこの 細胞を遠心分離し、ＭＭ培養基で洗浄し、５４６ｎｍにおける光学密度（ＯＤ５ ４６ ）が約１３になるまで濃縮した。続いてこの細胞懸濁液１３．２５mlを１０
０mlの漿液瓶に注ぎ、ゴム製の栓で閉じた。試料１では雰囲気を未処理のままと
した。試料２では全雰囲気を２回、１８Ｏ２（９６％）と交換した。生体内変化
の開始時に、１ＭのＩＰＡ溶液（ｐＨ７．０）０．５mlを両試料に加えた（溶液
中のＩＰＡ濃度：２０ｍＭ）。
ミン酸塩およびカナマイシンを含有するＭＭ培養基上で実施例４と同様の態様で
培養した。指数増殖相まで培養した後、酵素誘発のためにＩＰＡ１０ｍＭを加え
た。この培養物を、３０℃、１５０rpmでさらに３時間振とうした。次いでこの 細胞を遠心分離し、ＭＭ培養基で洗浄し、５４６ｎｍにおける光学密度（ＯＤ５ ４６ ）が約１３になるまで濃縮した。続いてこの細胞懸濁液１３．２５mlを１０
０mlの漿液瓶に注ぎ、ゴム製の栓で閉じた。試料１では雰囲気を未処理のままと
した。試料２では全雰囲気を２回、１８Ｏ２（９６％）と交換した。生体内変化
の開始時に、１ＭのＩＰＡ溶液（ｐＨ７．０）０．５mlを両試料に加えた（溶液
中のＩＰＡ濃度：２０ｍＭ）。
【００３７】 該試料を、３０℃、１５０rpmでさらに８時間振とうした。試料１では６．９ ｍＭのアラニノールが検出され、試料２では０．４８ｍＭのアラニノールが検出
された。次いで該細胞を遠心分離し、細胞を含有しない上澄み液中の水を回転式
エバポレーターで除去した。トリフルオロ無水酢酸を残渣に加え、Ｎ−トリフル
オロアセチルアラニノールを形成した。この化合物から、ＧＣ／ＭＳにより１８ Ｏ取り込み率を決定した。
された。次いで該細胞を遠心分離し、細胞を含有しない上澄み液中の水を回転式
エバポレーターで除去した。トリフルオロ無水酢酸を残渣に加え、Ｎ−トリフル
オロアセチルアラニノールを形成した。この化合物から、ＧＣ／ＭＳにより１８ Ｏ取り込み率を決定した。
【００３８】 次のトリフルオロアセチル誘導体のピークを用いて取り込み率を決定した。
【表５】
【００３９】 ＳＩＭスペクトル評価により、試料２の１８Ｏ取り込み率は３７．２％である
ことがわかった。 従って、ＩＰＡのアラニノールへの生体内変化は、オキシゲナーゼがこの反応
を引き起こすという事実により説明することができる。試料２における１８Ｏ取
り込み量が比較的低いのは、細胞の不十分な洗浄の際に、１６Ｏ−標識アラニノ
ールがキャリーオーバーされたという事実により説明することができる。
ことがわかった。 従って、ＩＰＡのアラニノールへの生体内変化は、オキシゲナーゼがこの反応
を引き起こすという事実により説明することができる。試料２における１８Ｏ取
り込み量が比較的低いのは、細胞の不十分な洗浄の際に、１６Ｏ−標識アラニノ
ールがキャリーオーバーされたという事実により説明することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 13/02 (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ライジンガー、トーマス スイス国、シーエイチ − 8032 チュー リヒ、チューリヒベルクシュトラーセ ７ (72)発明者 キーナー、アンドレアス スイス国、シーエイチ − 3930 ビス プ、マイゼンベーク ５ (72)発明者 ハインツマン、クラウス スイス国、シーエイチ − 3932 ビスペ ーターミネン、ウンターシュタルデン （番地なし) (72)発明者 ギリガン、トーマス アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07450 リッジウッド、ウッドサイド・ア ベニュー 130 Ｆターム(参考） 4B064 AE01 AE19 CD12 DA01 4B065 AA41X AC14 BA18 CA16 CA17
Claims (10)
- 【請求項１】 イソプロピルアミンをＬ−アラニノールに変換することがで
き、かつ後者を異化しないことを特徴とする微生物。 - 【請求項２】 下記（ａ）および（ｂ）により得られる請求項１に記載の微
生物。 ａ）イソプロピルアミンおよびＬ−アラニノールを唯一の炭素の供給源とし
て増殖することができる微生物を突然変異誘発すること、 ｂ）Ｌ−アラニンを唯一の炭素の供給源として増殖することができるが、Ｌ
−アラニノールおよびイソプロピルアミンを唯一の炭素の供給源として増殖する
ことができない突然変異体の選別。 - 【請求項３】 シュードモナス属に属する請求項１又は２に記載の微生物。
- 【請求項４】 シュードモナス ｓｐ．Ｋｉｅ １７１−Ｂ種（ＤＳＭ１１５
２１）およびＫｉｅ １７１−Ｂ１種（ＤＳＭ１１６２９）、並びにこれらと機 能的に同等である変異種および突然変異体である請求項１〜３のいずれか１項に
記載の微生物。 - 【請求項５】 イソプロピルアミンを唯一の炭素の供給源として増殖するこ
とができることを特徴とする微生物。 - 【請求項６】 式 【化１】 で表されるＬ−アラニノールの製造方法であって、 請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物を利用して 式 【化２】 で表されるイソプロピルアミンをＬ−アラニノールに変換することを特徴とする
製造方法。 - 【請求項７】 シュードモナス属の微生物を利用して生体内変化を行うこと
を特徴とする請求項６に記載の製造方法。 - 【請求項８】 イソプロピルアミンを、その濃度が１０質量％を超えないよ
うに加えて生体内変化を行うことを特徴とする請求項６又は７に記載の製造方法
。 - 【請求項９】 生体内変化を、温度１０〜５０℃、ｐＨ４〜１０で行うこと
を特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の製造方法。 - 【請求項１０】 式 【化３】 で表されるγ−グルタミルイソプロピルアミドの製造方法であって、 請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物の増殖中の細胞を利用して 式 【化４】 で表されるイソプロピルアミンを式IIIで表される生成物に変換することを特徴 とする製造方法。
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| CH1876/97 | 1997-08-08 | ||
| CH189797 | 1997-08-12 | ||
| CH1897/97 | 1997-08-12 | ||
| PCT/EP1998/005029 WO1999007199A2 (de) | 1997-08-08 | 1998-08-07 | Verfahren zur herstellung von l-alaninol und gamma-glutamylisopropylamid und mikroorganismusstamm des genus pseudomonas |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP2000506811A Pending JP2001513321A (ja) | 1997-08-08 | 1998-08-07 | Ｌ−アラニノールおよびγ−グルタミルイソプロピルアミドを製造するための微生物学的方法 |
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- 1998-08-07 EP EP98947422A patent/EP1002121A1/de not_active Withdrawn
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999007199A3 (de) | 1999-04-29 |
| AU9434798A (en) | 1999-03-01 |
| WO1999007199A2 (de) | 1999-02-18 |
| EP1002121A1 (de) | 2000-05-24 |
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