WO1998058665A1 - Verwendung proteolytischer enzyme zur vorbeugung bzw. behandlung der transplantatabstossung - Google Patents

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WO1998058665A1
WO1998058665A1 PCT/EP1998/003767 EP9803767W WO9858665A1 WO 1998058665 A1 WO1998058665 A1 WO 1998058665A1 EP 9803767 W EP9803767 W EP 9803767W WO 9858665 A1 WO9858665 A1 WO 9858665A1
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cells
trypsin
enzymes
enzyme
papain
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PCT/EP1998/003767
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Gerhard Stauder
Karl Ransberger
August Heidland
Leczek Paczek
Z. Gaciong
K. Sebeková
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Mucos Pharma Gmbh & Co.
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Definitions

  • the present invention relates to the use of at least one proteolytic enzyme and optionally rutoside for the treatment and / or prevention of graft rejection.
  • the immune system is a biological functional unit with highly specific reaction processes on both the humoral and the cellular level. Disruptions in this complex system are causally involved in the development of numerous diseases. Defects or an overactive immune system lead to so-called immune deficiency diseases and other complications, such as graft rejection, which can be life-threatening.
  • graft rejection is based on immunological reactions that can be suppressed by specific and non-specific immunosuppression.
  • Specific immunosuppressions e.g. Induction of immune tolerance and immunological enhancement are not yet of importance in clinical transplantation.
  • Non-specific measures such as splenectomy, thymectomy, lymphatic drainage and radiation have already been abandoned.
  • Immunosuppressive drugs play the most important role in rejection therapy.
  • Such drugs include antimetabolites such as azathioprine, a 6-mercaptopurine derivative that inhibits DNA and RNA synthesis. Its effect is based primarily on bone marrow depression and the suppression of the production of leukocytes and their precursors. The effect only begins after antigen contact in the proliferation phase.
  • Azathioprine is metabolized in the liver and excreted in the kidney.
  • Ciciosporin A is also used. This is a product of cultivated earth mushrooms. It prevents the interleukin-2 production of helper cells and thus specifically the maturation of the effector cells. Suppressor cells are protected by ciciosporin. Side effects such as nephrotoxicity and hepatotoxicity at high doses must be taken into account.
  • Corticosteroids develop a very quick effect. That is why they are combined with azathioprine for prophylaxis and therapy.
  • the steroids appear to block interleukin-1 and thus prevent the T helper cells from producing interleukin-2. This suppresses the maturation of the cytotoxic T cells from progenitor cells.
  • Corticosteroids have a variety of side effects.
  • polyclonal, heterologous or monoclonal heterologous antibodies against lymphocyte antigens can be administered intravenously or intramuscularly.
  • rejection therapy are also used as prophylaxis for high-risk patients.
  • xenogenic proteins they cause anaphylactic intolerance reactions that can be alleviated with steroid therapy.
  • Cytokines are small proteins with molecular weights of 8,000 to 30,000, with each cytokine having its own amino acid sequence and cell surface receptors. They are made from a variety of different cell types and act on almost every tissue and organ system. The names given to the various cytokines do not follow a logical system, but rather correspond to their biological properties.
  • IL-1 and TNF tumor necrosis factor
  • IL-1 and TNF are the primary pro-inflammatory cytokines, and moreover, these two cytokines act in a synergistic manner in inducing inflammation, shock and death.
  • IL-1 and TNF are the primary pro-inflammatory cytokines, and moreover, these two cytokines act in a synergistic manner in inducing inflammation, shock and death.
  • IL-1 and TNF have been a strong interest in IL-1 and TNF as an essential element in the development of diseases, such as graft rejection, and in the production of systemic acute phase reactions. Neutralizing antibodies could therefore prevent graft
  • a cytokine blockade would be a potential strategy for the treatment and / or prevention of graft rejection.
  • Antibodies are essential molecules for the humoral response.
  • the heavy and light protein chains forming the antibody are each divided into different functional domains.
  • the variable domain of the heavy chain V H is involved in the binding of the antigen, and the subsequent domains C H 1, C 2 and C H 3 are responsible for the so-called effector functions of an antibody, such as the binding of complement proteins.
  • the C H 2 domain in particular is involved in the initial step of complement activation.
  • C H 2 domain is not restricted to immunoglobulins, but the C 2 structure is also very similarly present, for example, in T cell receptor proteins, cell adhesion molecules and the class I and II proteins encoded in the main histocompatibility complex. Numerous proteins with a structure similar to the domain structure of the immunoglobulins are combined to form the proteins of the so-called immunoglobulin superfamily.
  • An overview of proteins containing a C H 2 structure is given in AF Williams and Barcley, "The Immunoglobulin Superfamily Domains for Cell Surface Recognition", Ann. Rev. Immunol., 1988, 6, 381-405.
  • C H 2 structure or “C H 2 domain” means the region of a protein molecule that has a structure similar to the C H 2 domain of IgG.
  • C2 domain or C2 set is also used in the literature for such a structure.
  • the C H 2 structure also frequently has an effector function in the other members of the immunoglobulin superfamily, which can be involved in the development of a wide variety of clinical pictures, including graft rejection.
  • Table 1 lists the immunological reaction partners for a C H 2 structure from various proteins and the pathoimmunological or physiological subsequent reactions which can be caused by the interaction of the C H 2 structure with the immunological reaction partner.
  • the present invention was therefore based on the technical problem of specifying substances which can be used for the treatment of graft rejection.
  • the use of at least one proteolytic enzyme and optionally rutoside is provided for the treatment of graft rejection.
  • Lymphocytes play an important role in graft rejection.
  • the interaction of lymphocytes with either the specialized endothelium in the lymphoid organ or activated endothelial cells represents the first critical step in the migration of the lymphocytes to the foreign tissues.
  • the adhesion of lymphocytes to endothelial cells has a large number of receptor-ligand interactions, for example of LAF-1 on ICAM-1 and ICAM-2, CD44 and VLA4 on VCAM-1.
  • the CD44 molecule is of particular interest because it has a variety of proinflammatory functions and plays an important role in regulating the function of other adhesion molecules. CD44 molecules can also be involved in the activation of T lymphocytes.
  • CD44 is a highly glycosylated protein which is found in humans and is present on many cells, in particular in peripheral blood (M. Stoll in Leukocyte Typing IV, editor: W. Knapp et al., Pp. 619-622, Oxford University ty press). Variants of this molecule can also be detected on certain cells of the skin and on some epithelial cells in embryonic development. All variants consist of a constant part (KT) and a variable part (VT).
  • KT constant part
  • VT variable part
  • the immunoglobulins modulated by the proteolytic enzyme or enzymes are distinguished by the fact that their binding capacity for the complement component C1q is reduced. This applies to natural C1 q-binding immunoglobulins (subclasses IgG1, IgG2, IgG3, IgM and partly IgA).
  • the changed C1 q binding capacity is - without being bound by any theory - probably caused by a change in the conformation of the C H 2 domain due to the action of the enzyme.
  • the conformational change can either be caused directly by an enzyme-induced change in the C H 2 domain, or the proteolytic enzymes cause a structural change in the regions adjacent to the C 2 domain, and these changes influence the conformation of the C H 2 domain .
  • proteolytic enzymes in particular bromelain, structurally modify various epitopes of the CD44 surface molecule. Because of the high degree of glycosylation of the CD44 variants, this finding was not predictable. Due to the enzymatic structural modulation of CD44, the cell loses its metastatic properties.
  • trypsin, bromelain, papain and optionally rutin or a combination thereof is used as the proteolytic enzyme.
  • the enzymes used according to the invention can be isolated inexpensively from the following raw materials.
  • Bromelain is a proteolytically active enzyme from the pineapple juice and can also be isolated from ripe fruit.
  • Papain is a proteolytic enzyme obtained from the milk sap of the immature, meaty fruits of the Carica Papaya melon tree. Pure papain is a crystalline polypeptide with an MG. from 23350 consisting of a chain of 212 amino acid residues with 4 disulfide bridges; Sequence and spatial structure are known. Papain is used in a variety of ways: due to its protein-splitting properties as "meat tenderizer” or "short salt", for clarifying beer, for making bread and hard biscuits, in leather preparation, in the textile industry for degassing silk and for preventing wool matting, in the tobacco industry for quality improvement, for the recovery of silver from used photographic material, furthermore in bacteriology for the extraction of peptone.
  • papain is already used to support enzymatic digestion, for enzymatic wound cleaning and as an additive to denture cleaning agents.
  • papain preparations are also available bound to plastic polymers or agarose.
  • Papain has also been used as a catalyst for the synthesis of oligopeptides.
  • Trypsin is a proteolytic enzyme that is also formed in the pancreas and is already used therapeutically in conjunction with other enzymes. It belongs to the serine proteinases. Crystalline trypsin has an MG. of approx. 23300, is soluble in water but not in alcohol, has an optimum effect at pH 7-9 and cleaves peptide chains on the carboxy side of the basic amino acid residues L-lysine and L-arginine. The spatial structure of the 223 amino acid trypsin is known.
  • Rutoside can preferably also be added to the medicament.
  • Rutoside is a glycoside that belongs to the flavonoids.
  • the combined use of 20 to 100 mg bromelain, 40 to 120 mg papain and 10 to 50 mg trypsin per dose unit is particularly effective.
  • a combination of 90 mg bromelain, 120 mg papain and 100 mg rutoside x 3H 2 O is very particularly preferred.
  • a combination of 48 mg trypsin, 90 mg bromelain and 100 mg rutoside x 3H 2 O is used.
  • the medicament can furthermore contain all customary auxiliaries and / or carriers.
  • Auxiliaries and carriers include e.g. Lactose, magnesium stearate, stearic acid, talc, methacrylic acid, copolymer type A, Shellack, Makrogol 6000, di-butyl phthalate, vanillin, titanium dioxide, white clay, polyindone, yellow wax and carnauba wax.
  • the RPMI 1640 cell culture medium was used with the following additives: NaHCO 3 ( biochrom, 2 g / 1); L-glutamine (biochrom, 2 mM), Na pyruvate (biochrom,
  • Freshly isolated, human, peripheral, mononuclear blood cells were used as targets for the enzymes to be examined. After the usual isolation using Ficoll, the cells were washed several times and used fresh in the experiments. Neutrophil granulocytes were also isolated from fresh citrate blood. Here, the lymphocytes / monocytes were separated using a 2-stage Ficoll gradient.
  • Monoclonal antibodies were used for the specific recognition of the surface structures of the leukocytes. These recognize a defined epitope on the respective antigens, which occurs only once in the structure of the antigens examined by us.
  • Overview 1 shows the surface markers examined, the monoclonal antibodies and the analyzed target cells.
  • the freshly isolated and prepared cells were incubated with the enzymes bromelain, papain and trypsin (pharmaceutical ingredients from Mucos) with the concentrations given in the legends of the tables and figures.
  • bromelain papain: trypsin, based on 40 ⁇ g / ml, “BPT”).
  • Three enzyme concentrations (40, 10, 2.5 ⁇ g / ml) were examined. The incubation took place in serum-free medium at 37 ° C.
  • the proteases were set up immediately before the incubations.
  • the cell culture media contained 0.01% sodium azide. This addition prevents the cells from re-expressing receptor molecules during the incubation process or the washing processes. After washing out the cell culture medium, the cells can be reactivated (not demonstrated).
  • the evaluation and analysis of the data was carried out independently of the measurement process on the flow cytometer using device-specific software.
  • the raw representation comprises an optically impressive, but relatively confusing histogram, in which various individual measurements are shown superimposed on one another.
  • the effect of the enzymes can be made optically transparent compared to the reference.
  • it is not the percentage of a subpopulation of the total leukocyte population that is the measured variable, but rather the relative receptor density, which is shown as the fluorescence intensity.
  • data can be derived which reflect the relative fluorescence intensity of the individual measurement. This is a measure of the relative receptor or surface molecule density in a measured cell population.
  • the bar graphs show the median of the relative fluorescence in logarithmic representation. Compared to the reference, the reduction in the density of the respective surface molecule as a function of the enzyme concentration can thus be represented.
  • the tables contain the data from independent experiments. The donor numbers are only valid for the respective table and cannot be transferred to other tables. If, for example, a value of 40% is given in the table, this means that in this antigen 40% of all surface molecules are changed by the enzyme in such a way that the specific monoclonal antibody no longer recognizes its epitope. If no reduction is observed, the value "0" appears in the tables. The percentage given thus expresses the enzyme performance compared to the individual antigens. Values up to 20% are not considered relevant in individual cases.
  • the data were evaluated using non-linear regression.
  • the median of the fluorescence intensity versus the enzyme concentration used and the reference are correlated with one another, and from this the amount of enzyme can be calculated which leads to a 50% reduction in the relative fluorescence intensity or in the structure of the changed receptor density.
  • Figure I CD2 modulation by proteases; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: lymphocytes.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD2.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype. The incubation time with the enzymes was 60 min.
  • the data from donor 1 (see Tab. 1) are shown as the mean of double determinations and standard deviation.
  • FIG. 2 CD4 (epitope Leu3a) modulation by proteases; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: lymphocytes.
  • the Positive control (reference) are untreated cells that have been incubated with the monoclonal antibody specific for CD4.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype. The incubation time with the enzymes was 60 min.
  • the data from donor 2 (see Tab. 2) are shown as the mean of double determinations and standard deviation.
  • Figure 3 CD4 (Epitope OKT4 and Leu3a) modulation by trypsin; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: lymphocytes.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD4.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype.
  • the incubation time with the enzymes was 60 min.
  • the data from a donor (see Table 3) are shown as the mean of double determinations and standard deviation.
  • Figure 4 CD25 modulation by proteases; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: PHA blasts.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD25.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype. The incubation time with the enzymes was 60 min.
  • the data from donor 1 are shown as the mean of duplicate determinations and standard deviation.
  • Figure 5 Reduction of the Leu3a antigen density by trypsin. Freshly isolated human peripheral, mononuclear blood cells were incubated with trypsin in the serum-free medium, then washed and labeled with the monoclonal antibody anti-Leu3a. The reduction in the relative fluorescence density of CD4 in the lymphocyte population is the measure of enzyme activity. The half-effect concentration of trypsin compared to the epitope Leu3a of CD4 is calculated using the fitted curve. Results
  • Table 1 CD2 modulation by proteases; Target cells: lymphocytes. The percentage reduction in the medium of the relative fluorescence intensity is given, which is a measure of the enzyme performance. The incubation time with the enzymes was 60 min. The results of three experiments with cells from three different donors are shown.
  • CD4 epitopope Leu3a modulation by proteases
  • Target cells lymphocytes.
  • the percentage reduction in the median of the relative fluorescence intensity, which is a measure of the enzyme performance, is given.
  • the incubation time with the enzymes was 60 min. The results of two experiments with cells from two different donors are shown.
  • Table 3 Modulation of the CD4 epitopes Leu3a and OKT4 by trypsin; Target cells: lymphocytes. The percentage reduction in the median of the relative fluorescence intensity, which is a measure of the enzyme performance, is given. The incubation time with the enzymes was 60 min. The data from a donor are shown.
  • Enzyme epitope 40 ⁇ g / ml 20 ⁇ g / ml 10 ⁇ g / ml
  • Table 4 CD25 modulation by proteases; Target cells: lymphocytes, monocytes, NK cells. The percentage reduction in the median of the relative fluorescence intensity, which is a measure of the enzyme performance, is given. The incubation time with the enzymes was 60 min. The results of two experiments with cells from two different donors are shown. The cells were mitogen stimulated for 3 days prior to the experiment.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym zur Behandlung und/oder Vorbeugung der Transplantatabstoßung. Bevorzugte proteolytische Enzyme sind Trypsin, Bromelain und Papain. Außerdem kann Rutosid verwendet werden.

Description

Verwendung proteolytischer Enyzme zur Vorbeugung bzw. Behandlung der Transplantatabstoßung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enyzm und gegebenenfalls Rutosid zur Behandlung und/oder Vorbeugung der Transplantatabstoßung.
Das Immunsystem ist eine biologische Funktionseinheit mit hochspezifischen Reaktionsabläufen sowohl auf humoraler wie auch auf zellulärer Ebene. Störungen in diesem komplexen System sind an der Entstehung zahlreicher Krankheiten ursächlich beteiligt. So führen Defekte oder eine Überfunktion des Immunsystems zu sogenannten Immundefektkrankheiten und anderen Komplikationen, wie z.B. auch einer Transplantatabstoßung, die lebensbedrohliche Ausmaße annehmen kann.
Bei einer Transplantation von Fremdgewebe in einen menschlichen oder tierischen Körper kommt es häufig zu einer Abstoßungsreaktion dieses Fremdgewebes. Diese sogenannte Transplantatabstoßung beruht auf immunologischen Reaktionen, die durch spezifische und unspezifische Immunsuppression unterdrückt werden können. Spezifische Immunsuppressionen, wie z.B. die Induktion einer Immuntoleranz und immunologisches Enhancement haben in der klinischen Transplantation noch keine Bedeutung. Unspezifische Maßnahmen, wie Splenek- tomie, Thymektomie, Lymphdrainage und Bestrahlung wurden bereits wieder verlassen.
Immunsuppressive Medikamente spielen die wichtigste Rolle in der Abstoßungstherapie. Solche Medikamente sind z.B. Antimetaboliten wie Azathioprin, ein 6- Mercaptopurin-Abkömmling, der die DNA- und RNA-Synthese hemmt. Damit beruht seine Wirkung vor allem auf der Knochenmarkdepression und auf der Unterdrückung der Produktion von Leukozyten und deren Vorläufern. Die Wirkung beginnt erst nach Antigenkontakt in der Proliferationsphase. Azathioprin wird in der Leber metabolisiert und über die Niere ausgeschieden. Weiterhin wird Ciciosporin A eingesetzt. Dies ist ein Produkt von kultivierten Erdpilzen. Es verhindert die lnterleukin-2-Produktion von Helferzellen und damit spezifisch die Reifung der Effektorzellen. Suppressorzellen werden durch Ciciosporin geschont. Nebenwirkungen, wie Nephrotoxizität und Hepatotoxizität bei hoher Dosierung müssen berücksichtigt werden.
Corticosteroide entwickeln eine sehr rasche Wirkung. Deshalb werden sie mit Azathioprin für Prophylaxe und Therapie kombiniert. Die Steroide scheinen Inter- leukin-1 zu blockieren und damit die T-Helferzellen an der Produktion von Inter- leukin-2 zu hindern. Dies unterdrückt die Reifung der cytotoxischen T-Zellen aus Vorläuferzellen. Corticosteroide weisen allerdings eine Vielzahl von Nebenwirkungen auf.
Femer können, wenn eine Transplantatabstoßung auftritt, polyklonale, heterolo- ge oder monoklonale heterologe Antikörper gegen Lymphozytenantigene intravenös oder intramuskulär appliziert werden. Der Schwerpunkt einer solchen Antikörperapplikation ist die Abstoßungstherapie. Sie werden außerdem als Prophylaxe bei Risikopatienten eingesetzt. Als xenogene Proteine rufen sie anaphylakti- sche Unverträglichkeitsreaktionen hervor, die unter Steroidtherapie gemildert werden können.
Wichtige Stoffwechselstoffe, die bei der Transplantatabstoßung eine Rolle spielen, sind die Cytokine. Cytokine sind kleine Proteine mit Molekulargewichten von 8000 bis 30000, wobei jedes Cytokin eine eigene Aminosäuresequenz und Zell- oberflächenrezeptoren aufweist. Sie werden von einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen hergestellt und wirken auf fast jedes Gewebe und Organsystem. Die Namen, die den verschiedenen Cytokinen gegeben wurden, folgen keinem logischen System, sondern entsprechen vielmehr ihrer biologischen Eigenschaft. IL-1 und TNF (Tumomekrosefaktor) sind die primären proinflammatorischen Cytokine, und außerdem wirken diese zwei Cytokine in einer synergistischen Weise bei der Induktion von Entzündungen, Schock und Tod. Ein starkes Interesse hat sich auf IL-1 und TNF als wesentliches Element bei der Entstehung von Krankheiten, wie z.B. auch der Transplantatabstoßung, und bei der Produktion von systemischen Akutphasenreaktionen gerichtet. Neutralisierende Antikörper könnten einer Transplantatabstoßung daher vorbeugen.
Eine Cytokinblockade wäre also eine potentielle Strategie für die Behandlung und/oder Vorbeugung der Transplantatabstoßung.
Antikörper stellen für die humorale Antwort wesentliche Moleküle dar. Die den Antikörper bildenden schweren und leichten Proteinketten sind jeweils in verschiedene funktioneile Domänen unterteilt. So ist die variable Domäne der schweren Kette VH an der Bindung des Antigens beteiligt, und die nachfolgenden Domänen CH1 , C 2 und CH3 sind für die sogenannten Effektorfunktionen eines Antikörpers, wie beispielsweise die Bindung von Komplementproteinen, verantwortlich. Insbesondere die CH2-Domäne ist am initialen Schritt der Komplementaktivierung beteiligt.
Das Vorhandensein einer CH2-Domäne ist jedoch nicht auf Immunglobuline beschränkt, sondern die C 2-Struktur ist beispielsweise auch in T-Zell-Rezeptor- proteinen, Zeiladhäsionsmolekülen und den im Haupthistokompatibilitätskomplex kodierten Proteinen der Klasse I und II sehr ähnlich vorhanden. Zahlreiche Proteine mit einer zu der Domänenstruktur der Immunglobuline ähnlichen Struktur werden zu den Proteinen der sogenannten Immunglobulinsuperfamilie zusammengefaßt. Eine Übersicht über Proteine, enthaltend eine CH2-Struktur, ist gegeben in A.F. Williams and Barcley, "The Immunoglobulin Superfamily-Domains for Cell Surface Recognition", Ann. Rev. Immunol., 1988, 6, 381-405.
Im folgenden wird unter dem Begriff CH2-Struktur bzw. CH2-Domäne der Bereich eines Proteinmoleküls verstanden, der eine ähnliche Struktur wie die CH2- Domäne von IgG aufweist. In der Literatur wird für eine solche Struktur auch der Begriff C2-Domäne oder C2-Set verwendet. Wie oben für die Immunglobuline erläutert, besitzt die CH2-Struktur auch in den weiteren Mitgliedern der Immunglobulinsuperfamilie häufig eine Effektorfunktion, die an der Entstehung verschiedenster Krankheitsbilder, unter anderem der Transplantatabstoßung, beteiligt sein kann.
In Tabelle 1 sind die immunologischen Reaktionspartner für eine CH2-Struktur aus verschiedenen Proteinen sowie die durch die Interaktion der CH2-Struktur mit dem immunologischen Reaktionspartner hervorrufbaren pathoimmunologischen bzw. physiologischen Folgereaktionen aufgelistet.
TABELLE 1
Immunologische Reaktionspartner von CH2-haltigen Strukturen
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Stoffe, die solche Antikörper positiv oder negativ beeinflussen, könnten daher eine wichtige Rolle bei der Behandlung der Transplantatabstoßung spielen.
Der vorliegenden Erfindung lag daher das technische Problem zugrunde, Stoffe anzugeben, die zur Behandlung der Transplantatabstoßung verwendbar sind.
Diese Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Gemäß Anspruch 1 ist die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym und gegebenenfalls Rutosid zur Behandlung von Transplantatabstoßung vorgesehen.
Lymphozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Transplantatabstoßung. Die Interaktion von Lymphozyten mit entweder dem spezialisierten Endothel in dem lymphoiden Organ oder aktivierten Endothelialzellen stellt den ersten kritischen Schritt bei der Wanderung der Lymphozyten zu den Fremdgeweben dar. Die Adhäsion von Lymphozyten an Endothelialzellen weist eine Vielzahl von Rezeptor- Liganden-Interaktionen auf, z.B. von LAF-1 an ICAM-1 und ICAM-2, CD44 und VLA4 an VCAM-1. Das CD44-Molekül ist besonders von Interesse, da es vielzählige proinflammatorische Funktionen aufweist und bei der Regulierung der Funktion anderer Adhäsionsmoleküle eine wichtige Rolle spielt. CD44-Moleküle können auch an der Aktivierung von T-Lymphozyten beteiligt sein. Auf den T- Zellen unterstützt die Ligandenbindung an das CD44-Molekül die T-Zellaktivie- rung, die Freisetzung von lnterleukin-2 und die T-Zelladhäsion in Monozyten. CD44 ist ein im Menschen vorkommendes, stark glykosiliertes Protein, das auf vielen Zellen, insbesondere des peripheren Blutes, vorhanden ist (M. Stoll in Leukocyte Typing IV, Herausgeber: W. Knapp et al., S. 619-622, Oxford Universi- ty Press). Varianten dieses Moleküls können auch auf bestimmten Zellen der Haut und auf manchen Epithelzellen in der embryonalen Entwicklung nachgewiesen werden. Alle Varianten bestehen aus einem konstanten Teil (KT) und variablen Teil (VT).
Die durch das bzw. die proteolytischen Enzyme modulierten Immunglobuline zeichnen sich dadurch aus, daß deren Bindungsfähigkeit für die Komplementkomponente C1q erniedrigt ist. Dies gilt für natürliche C1 q-bindende Immunglobuline (Subklassen lgG1, lgG2, lgG3, IgM und teilweise IgA).
Die geänderte C1 q-Bindungsfähigkeit wird - ohne an eine Theorie gebunden zu sein - vermutlich durch eine Konformationsänderung der CH2-Domäne aufgrund der Enzymeinwirkung verursacht. Dabei kann die Konformationsänderung entweder durch eine enyzmatisch verursachte Änderung unmittelbar in der CH2- Domäne hervorgerufen werden, oder die proteolytischen Enzyme bewirken eine Strukturänderung in den der C 2-Domäne benachbarten Bereichen, und diese Änderungen beeinflussen die Konformation der CH2-Domäne.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß proteolytische Enzyme, insbesondere Bromelain, verschiedene Epitope des CD44-Oberflächenmoleküls strukturell modifizieren. Wegen des hohen Glykosilierungsgrades der CD44-Varianten ist dieser Befund nicht vorhersehbar gewesen. Durch die enzymatische Strukturmodulation von CD44 verliert die Zelle ihre metastasierenden Eigenschaften.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain, Papain und gegebenenfalls Rutin verwendet oder eine Kombination derselben. Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme lassen sich kostengünstig aus den folgenden Rohmaterialien isolieren.
Bromelain ist ein proteolytisch wirksames Enzym aus dem Preßsaft der Ananas und kann auch noch aus reifen Früchten isoliert werden.
Papain ist ein proteolytisches Enzym, das aus dem Milchsaft der unreifen, fleischigen Früchte des Melonenbaums Carica Papaya gewonnen wird. Reines Papain ist ein kristalines Polypeptid mit einem MG. von 23350, das aus einer Kette von 212 Aminosäureresten mit 4 Disulfid-Brücken besteht; Sequenz und Raumstruktur sind bekannt. Papain wird vielfältig eingesetzt: Aufgrund seiner Proteinspaltenden Eigenschaft als "Fleischzartmacher" oder "Mürbesalz", zum Klären von Bier, zur Brot- und Hartkeksherstellung, in der Lederzubereitung, in der Tex- til-lndustrie zum Entbasten von Seide und zur Verhinderung von Wollverfilzung, in der Tabak-Industrie zur Qualitätsverbesserung, zur Rückgewinnung von Silber aus verbrauchtem photographischem Material, ferner in der Bakteriologie zur Pepton-Gewinnung. In der Medizin dient Papain bereits zur Unterstützung der enzymatischen Verdauung, zur enzymatischen Wundreinigung und als Zusatz zu Zahnprothese-Reinigungsmitteln. Für Spezialzwecke werden Papain-Präparate auch an Kunststoffpolymere oder Agarose trägergebunden angeboten. Papain ist auch als Katalysator zur Synthese von Oligopeptiden verwendet worden.
Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das ebenfalls im Pankreas gebildet wird und in Verbindung mit anderen Enzymen bereits therapeutisch eingesetzt wird. Es gehört zu den Serin-Proteinasen. Kristallines Trypsin hat ein MG. von ca. 23300, ist in Wasser, nicht aber in Alkohol löslich, besitzt ein Wirkungsoptimum bei pH 7-9 und spaltet Peptid-Ketten spezifisch Carboxy-seitig der basischen Aminosäurereste L-Lysin und L-Arginin. Die räumliche Struktur des aus 223 Aminosäuren bestehenden Trypsins ist bekannt.
Eine besonders gute Wirksamkeit zeigt sich bei der Verwendung einer Kombination der Enzyme Bromelain, Papain und/oder Trypsin. Neben der bemerkenswer- ten und unerwarteten Wirkung dieser Enzyme bei der Behandlung der Transplantatabstoßung hat die kombinierte Verwendung der genannten Enzyme weiterhin den Vorteil, daß auch bei einer Langzeitanwendung keine schädigenden Nebenwirkungen auftreten.
Weiterhin kann vorzugsweise zusätzlich Rutosid dem Medikament beigemischt werden. Rutosid ist ein Glycosid, das zu den Flavonoiden gehört.
Eine besonders gute Wirksamkeit hat die kombinierte Verwendung von 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit.
Ganz besonders bevorzugt ist eine Kombination von 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid x 3H2O.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombination von 48 mg Trypsin, 90 mg Bromelain und 100 mg Rutosid x 3H2O verwendet.
Das Medikament kann weiterhin alle üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthalten.
Als Hilfs- und Trägerstoffe kommen z.B. Lactose, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talkum, Methacrylsäure, Copolymerisat Typ A, Shellack, Makrogol 6000, Di- butylphthalat, Vanillin, Titandioxid, weißer Ton, Polyindon, gelbes Wachs und Carnaubawachs in Frage.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung im einzelnen erläutern.
Beispiel 1
Material und Methoden
1. Material
Es wurde das Zellkulturmedium RPMI 1640 mit folgenden Zusätzen verwendet: NaHCθ3 (Biochrom, 2 g/1 ); L-Glutamin (Biochrom, 2 mM), Na-Pyruvat (Biochrom,
1 mM), NaN3 (Sigma, 0,01 %). Im Falle einer Stimulation der Zellen wurde entweder Phythämagglutinin M (Biochrom, 5 μg/ml) oder γ-lnterferon (100 U/ml) eingesetzt. Die Stimulation der Zellen erfolgte dabei über 1-3 Tage mit Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum (Biochrom).
Als Targets für die zu untersuchenden Enzyme wurden frisch isolierte, humane, periphere, mononukleäre Blutzellen (Citratblut) verwendet. Nach der üblichen Isolation mittels Ficoll wurden die Zellen mehrfach gewaschen und frisch bei den Experimenten eingesetzt. Neutrophile Granulozyten wurden ebenfalls aus frischem Citratblut isoliert. Hierbei erfolgte die Abtrennung von den Lympho- zyten/Monozyten mittels eines 2-Stufen-Ficoll-Gradienten.
2. Verwendete monoklonale Antikörper
Für die spezifische Erkennung der Oberflächenstrukturen der Leukozyten wurden monoklonale Antikörper verwendet. Diese erkennen auf den entsprechenden An- tigenen jeweils ein definiertes Epitop, welches bei den von uns untersuchten An- tigenen nur ein einziges Mal in der Struktur vorkommt. In Übersicht 1 sind die untersuchten Oberflächenmarker, die monoklonalen Antikörper sowie die analysierten Targetzellen dargestellt.
Übersicht 1 : Analysierte Oberflächenmarker, verwendete monoklonale Antikörper und Targetzellen der Enzymbehandlung
Figure imgf000011_0001
1 Phycoerythrin, rote Fluoreszenz;
2 Fluoreszeinisothiocyanat, grüne Fluoreszenz;
3 Becton Dickinson, Heidelberg;
4 Ortho Diagnostics 3. Inkubationsbedingunqen
Die frisch isolierten und aufbereiteten Zellen wurden mit den Enzymen Bromelain, Papain und Trypsin (Arzneimittel-Inhaltsstoffe der Fa. Mucos) mit den jeweils in den Legenden der Tabellen und Abbildungen angegebenen Konzentrationen inkubiert. Bei der Mischung der drei Enzyme entsprach das Mischungsverhältnis 22,7 : 15,5 : 11 ,9 (Bromelain : Papain : Trypsin, bezogen auf 40 μg/ml, "BPT"). Es wurden drei Enzymkonzentrationen (40, 10, 2,5 μg/ml) untersucht. Die Inkubation fand in serumfreiem Medium bei 37°C statt.
Die Proteasen wurden unmittelbar vor den Inkubationen angesetzt. In den Zellkulturmedien war 0,01 % Natriumazid enthalten. Durch diesen Zusatz werden die Zellen daran gehindert, während des Inkubationsprozesses oder der Waschvorgänge Rezeptormoleküle erneut zu exprimieren. Nach dem Auswaschen des Zellkulturmediums sind die Zellen wieder aktivierbar (nicht demonstriert).
Nach entsprechender Inkubation der Zellen mit den jeweiligen Enzymen, Auswaschen der Enzyme und der Markierung mit monoklonalen Antikörpern (nach Angaben der Hersteller) wurde sofort die Analyse der Oberflächenmarker vorgenommen.
4. Analytische Durchflußcytometrie
Alle Untersuchungen zur Modulation von Zelloberflächenmolekülen wurden mittels analytischer Durchflußcytometrie (FACSCAN, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) unter Verwendung einer gerätespezifischen Software (Lysis I) durchgeführt. Bei entsprechender Einstellung des Gerätes sowie der Mitführung von Referenzen, d.h. Zellen, die ohne Enzyme aber in derselben Prozedur behandelt wurden, erfolgte die Messung. Für jede Subklasse der monoklonalen Antikörper wurde eine entsprechende fluoreszenzkonjugierte Isotypenkontrolle mitgeführt. Hierbei handelt es sich um Maus- Immunglobulin, mit welchem die Kapazität der unspezifischen Bindung der Targetzellen flußcytometrisch erfaßt wird.
Pro Histogramm wurden 10 000 Zellen gemessen. Die jeweilige Zellpopulation wurde mit einem sogenannten "elektronischen Gate" separiert, in dem sich dann mindestens 3 500 Zellen befanden.
5. Darstellung der Ergebnisse
Die Auswertung und Analyse der Daten erfolgte unabhängig vom Meßvorgang auf dem Durchflußcytometer mittels einer gerätespezifischen Software. Dabei wurden jeweils die Histogramme der Kontrollen, d. h. der unbehandelten Zellproben, mit den Histogrammen der enzymbehandelten Zellen verglichen.
Die Rohdarstellung umfaßt ein optisch eindrucksvolles, aber relativ unübersichtliches Histogramm, bei dem verschiedene Einzelmessungen übereinander gelagert abgebildet sind. Hier läßt sich insbesondere die Wirkung der Enzyme im Vergleich zur Referenz optisch transparent machen. Für diese Untersuchungen ist nicht der prozentuale Anteil einer Subpopulation an der gesamten Leukozytenpopulation die Meßgröße, sondern die relative Rezeptordichte, die sich als Fluoreszenzintensität darstellt.
Aus diesen Histogrammen, die beispielhaft sind und illustrativen Charakter haben, lassen sich Daten ableiten, welche die relative Fluoreszenzintensität der Einzelmessung reflektieren. Diese ist ein Maß für die relative Rezeptor- oder Oberflächenmoleküldichte bei einer gemessenen Zellpopulation.
Die Säulengraphiken zeigen in logarithmischer Darstellung den Mediän der relativen Fluoreszenz. Es läßt sich so gegenüber der Referenz die Reduktion der Dichte des jeweiligen Oberflächenmoleküls in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration darstellen. In den Tabellen sind die Daten unabhängiger Experimente enthalten. Die Nummern der Spender haben nur für die jeweilige Tabelle Gültigkeit und sind nicht auf andere Tabellen übertragbar. Wird in der Tabelle beispielsweise ein Wert von 40 % angegeben, so bedeutet das, daß bei diesem Antigen 40 % aller Oberflächenmoleküle durch das Enzym so verändert ist, daß der spezifische monoklonale Antikörper sein Epitop nicht mehr erkennt. Wird keine Reduktion beobachtet, so erscheint in den Tabellen der Wert "0". Die angegebene Prozentzahl drückt somit die Enzymleistung gegenüber den einzelnen Antigenen aus. Werte bis zu 20 % werden im Einzelfall als nicht relevant angesehen.
Für eine Bewertung der Wirkung der Enzyme auf die einzelnen Antigene ist es günstig, einen geeigneten Vergleichsmaßstab zu wählen. Bis auf wenige Ausnahmen wurden alle Untersuchungen unter standardisierten inkubationsbedingungen durchgeführt. Damit kann für diese experimentellen Bedingungen die aus früheren Forschungsberichten bekannte Halbeffektkonzentration angegeben werden.
Zur Berechnung der Halbeffektkonzentration wurden die Daten mittels nichtlinearer Regression ausgewertet. Der Mediän der Fluoreszenzintensität versus eingesetzter Enzymkonzentration und Referenz werden zueinander in Beziehung gesetzt, und daraus läßt sich die Menge an Enzym berechnen, die zu einer 50%igen Reduktion der relativen Fluoreszenzintensität bzw. der in der Struktur veränderten Rezeptordichte führt.
Abbildung I: CD2-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD2 spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 (vgl. Tab. 1 ) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 2: CD4(Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen, monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 2 (vgl. Tab. 2) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 3: CD4(Epitope OKT4 und Leu3a)-Modulation durch Trypsin; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von einem Spender (vgl. Tab. 3) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 4: CD25-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: PHA-Blasten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD25 spezifischen, monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 5: Reduktion der Leu3a-Antigendichte durch Trypsin. Frisch isolierte humane periphere, mononukleäre Blutzellen wurden mit Trypsin im serumfreien Medium inkubiert, anschließend gewaschen und mit dem monoklonalen Antikörper anti-Leu3a markiert. Die Reduktion der relativen Fluoreszenzdichte von CD4 der Lymphozytenpopulation ist das Maß der Enzymaktivität. Die Halbeffektkonzentration von Trypsin gegenüber dem Epitop Leu3a von CD4 wird über die gefit- tete Kurve berechnet. Ergebnisse
Tabelle 1 : CD2-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Mediums der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von drei Experimenten mit Zellen von drei verschiedenen Spendern dargestellt.
Enzym Nr. 40 μg/ml 10 μg/ml 2,5 μg/ml
Bromelain 1 11 ,1 17,9 17,4
2 6,1 12,2 14,3
3 0 0 0
Papain 1 22,4 21 ,4 34,7
2 5,4 9,5 17,0
3 0 0 0
Trypsin 1 75,7 73,6 73,0
2 83,7 21 ,1 0,7
3 96,3 85,4 50,9
BPT 1 71 ,9 54,7 38,2
2 74,1 8,8 18,4
3 94,8 72,6 25,2
Tabelle 2: CD4(Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimenten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt.
Enzym Nr. 40 μg/ml 10 μg/ml 2,5 μg/ml
Bromelain 1 24,6 0 0
2 16,2 0 0
Papain 1 2,5 3,2 0
2 0 0 5,7 Trypsin 1 99,3 93,0 64,1
2 99,4 96,2 57,5
BPT 1 98,3 49,3 23,0
2 99,4 79,2 20,2
Tabelle 3: Modulation der CD4-Epitope Leu3a und OKT4 durch Trypsin; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Daten von einem Spender dargestellt.
Enzym Epitop 40 μg/ml 20 μg/ml 10 μg/ml
Trypsin Leu3a 98,5 96,7 87,1
OKT4 6,5 6,3 19,5
Epitop 5 μg/ml 2,5 μg/ml 1 ,25 μg/ml
Trypsin Leu3a 65,2 41 ,9 28,8
OKT4 13,3 10,8 9,3
Tabelle 4: CD25-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lymphozyten, Monozyten, NK-Zellen. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimenten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt. Vor dem Experiment wurden die Zellen 3 Tage mitogenstimuliert.
Enzym Nr. 40 μg/ml 10 μg/ml 2,5 μg/ml
Bromelain 1 90,7 80,1 59,7 2 62,6 43,6 0
Papain 1 92,2 81 ,0 60,7 2 62,6 43,6 0
Trypsin 1 91 ,2 88,2 71 ,0 2 78,9 73,9 52,8
BPT 1 92,1 89,7 50,9 2 79,4 44,1 12,2 Tabelle 5: Berechnete Halbeffektkonzentration (μg/ml) von Bromelain, Papain, Trypsin und deren Kombination für die 50 %ige Reduktion der Dichte von zellulären Oberflächenmolekülen. Die Enzyminkubation betrug 1 Stunde.
Enzyme CD2 CD43 CD254
Bromelain Halbeffektkonz.1 n w n w 18,4
Bereich2 - 14-23
Papain Halbeffektkonz.1 n w n w 12,4
Bereich2 - 11-14
Trypsin Halbeffektkonz.1 1 ,5 2,5 < 2,5
Bereich2 1-2 2,3-3,1
B-P-T5 Halbeffektkonz.1 9,3 16,4 16,0
Bereich2 7,5-14 15,5-18 13-19
1 berechnet aus Mittelwerten von 2 oder 3 unabhängigen Experimenten
2 minimaler und maximaler Wert, 95 % Konfidenzbereich = 1 δ, geschätzt
3 Modulation von CD4-Epitop Leu3a
4 auf stimulierten Zellen präsent
5 Mischung der Proteasen im Verhältnis 22,7 : 15,5 : 11 ,9 -Bromelain : Papain : Trypsin n w: nicht wirksam im untersuchten System (max. 40 μg Enzym/ml, 1 h Inkubation)

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym und gegebenenfalls Rutosid zur Behandlung und/oder Vorbeugung der Transplantatabstoßung.
2. Vewendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain oder Papain oder eine Kombination von einem oder mehreren dieser Enzyme verwendet wird.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Rutosid verwendet wird.
4. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit verwendet werden.
5. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid pro Dosiseinheit verwendet werden.
6. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 48 mg Trypsin und 100 mg Rutosid pro Dosiseinheit verwendet werden.
7. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß 10 bis 100 mg, vorzugsweise 10 mg Rutosid x 3H2O pro Dosiseinheit verwendet werden.
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