DE19726244A1 - Verwendung proteolytischer Enzyme zur Vorbeugung bzw. Behandlung der Transplantatabstoßung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym und gegebenenfalls Rutosid zur Be­ handlung und/oder Vorbeugung der Transplantatabstoßung.

Das Immunsystem ist eine biologische Funktionseinheit mit hoch­ spezifischen Reaktionsabläufen sowohl auf humoraler wie auch auf zellulärer Ebene. Störungen in diesem komplexen System sind an der Entstehung zahlreicher Krankheiten ursächlich beteiligt. So führen Defekte oder eine Überfunktion des Immunsystems zu soge­ nannten Immundefektkrankheiten und anderen Komplikationen, wie z. B. auch einer Transplantatabstoßung, die lebensbedrohliche Ausmaße annehmen kann.

Bei einer Transplantation von Fremdgewebe in einen menschlichen oder tierischen Körper kommt es häufig zu einer Abstoßungsreak­ tion dieses Fremdgewebes. Diese sogenannte Transplantatabstoßung beruht auf immunologischen Reaktionen, die durch spezifische und unspezifische Immunsuppression unterdrückt werden können. Spezi­ fische Immunsuppressionen, wie z. B. die Induktion einer Immunto­ leranz und immunologisches Enhancement haben in der klinischen Transplantation noch keine Bedeutung. Unspezifische Maßnahmen, wie Splenektomie, Thymektomie, Lymphdrainage und Bestrahlung wurden bereits wieder verlassen.

Immunsuppressive Medikamente spielen die wichtigste Rolle in der Abstoßungstherapie. Solche Medikamente sind z. B. Antimetaboliten wie Azathioprin, ein 6-Mercaptopurin-Abkömmling, der die DNA- und RNA-Synthese hemmt. Damit beruht seine Wirkung vor allem auf der Knochenmarkdepression und auf der Unterdrückung der Produk­ tion von Leukozyten und deren Vorläufern. Die Wirkung beginnt erst nach Antigenkontakt in der Proliferationsphase. Azathioprin wird in der Leber metabolisiert und über die Niere ausgeschie­ den.

Weiterhin wird Ciclosporin A eingesetzt. Dies ist ein Produkt von kultivierten Erdpilzen. Es verhindert die Interleukin-2- Produktion von Helferzellen und damit spezifisch die Reifung der Effektorzellen. Suppressorzellen werden durch Ciclosporin ge­ schont. Nebenwirkungen, wie Nephrotoxizität und Hepatotoxizität bei hoher Dosierung müssen berücksichtigt werden.

Corticosteroide entwickeln eine sehr rasche Wirkung. Deshalb werden sie mit Azathioprin für Prophylaxe und Therapie kombi­ niert. Die Steroide scheinen Interleukin-1 zu blockieren und da­ mit die T-Helferzellen an der Produktion von Interleukin-2 zu hindern. Dies unterdrückt die Reifung der cytotoxischen T-Zellen aus Vorläuferzellen. Corticosteroide weisen allerdings eine Vielzahl von Nebenwirkungen auf.

Ferner können, wenn eine Transplantatabstoßung auftritt, poly­ klonale, heterologe oder monoklonale heterologe Antikörper gegen Lymphozytenantigene intravenös oder intramuskulär appliziert werden. Der Schwerpunkt einer solchen Antikörperapplikation ist die Abstoßungstherapie. Sie werden außerdem als Prophylaxe bei Risikopatienten eingesetzt. Als xenogene Proteine rufen sie anaphylaktische Unverträglichkeitsreaktionen hervor, die unter Steroidtherapie gemildert werden können.

Wichtige Stoffwechselstoffe, die bei der Transplantatabstoßung eine Rolle spielen, sind die Cytokine. Cytokine sind kleine Pro­ teine mit Molekulargewichten von 8000 bis 30000, wobei jedes Cytokin eine eigene Aminosäuresequenz und Zelloberflächenrezep­ toren aufweist. Sie werden von einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen hergestellt und wirken auf fast jedes Gewebe und Or­ gansystem. Die Namen, die den verschiedenen Cytokinen gegeben wurden, folgen keinem logischen System, sondern entsprechen vielmehr ihrer biologischen Eigenschaft. IL-1 und TNF (Tumor­ nekrosefaktor) sind die primären proinflammatorischen Cytokine, und außerdem wirken diese zwei Cytokine in einer synergistischen Weise bei der Induktion von Entzündungen, Schock und Tod.

Ein starkes Interesse hat sich auf IL-1 und TNF als wesentliches Element bei der Entstehung von Krankheiten, wie z. B. auch der Transplantatabstoßung, und bei der Produktion von systemischen Akutphasenreaktionen gerichtet. Neutralisierende Antikörper könnten einer Transplantatabstoßung daher vorbeugen.

Eine Cytokinblockade wäre also eine potentielle Strategie für die Behandlung und/oder Vorbeugung der Transplantatabstoßung.

Antikörper stellen für die humorale Antwort wesentliche Moleküle dar. Die den Antikörper bildenden schweren und leichten Protein­ ketten sind jeweils in verschiedene funktionelle Domänen unter­ teilt. So ist die variable Domäne der schweren Kette VH an der Bindung des Antigens beteiligt, und die nachfolgenden Domänen C_H1, C_H2 und C_H3 sind für die sogenannten Effektorfunktionen ei­ nes Antikörpers, wie beispielsweise die Bindung von Komplement­ proteinen, verantwortlich. Insbesondere die C_H2-Domäne ist am in­ itialen Schritt der Komplementaktivierung beteiligt.

Das Vorhandensein einer C_H2-Domäne ist jedoch nicht auf Immunglo­ buline beschränkt, sondern die C_H2-Struktur ist beispielsweise auch in T-Zell-Rezeptorproteinen, Zelladhäsionsmolekülen und den im Haupthistokompatibilitätskomplex kodierten Proteinen der Klasse I und II sehr ähnlich vorhanden. Zahlreiche Proteine mit einer zu der Domänenstruktur der Immunglobuline ähnlichen Struk­ tur werden zu den Proteinen der sogenannten Immunglobulinsuper­ familie zusammengefaßt. Eine Übersicht über Proteine, enthaltend eine C_H2-Struktur, ist gegeben in A.F. Williams and Barcley, "The Immunoglobulin Superfamily-Domains for Cell Surface Recogniti­ on", Ann. Rev. Immunol., 1988, 6, 381-405.

Im folgenden wird unter dem Begriff C_H2-Struktur bzw. C_H2-Domäne der Bereich eines Proteinmoleküls verstanden, der eine ähnliche Struktur wie die C_H2-Domäne von IgG aufweist. In der Literatur wird für eine solche Struktur auch der Begriff C2-Domäne oder C2-Set verwendet.

Wie oben für die Immunglobuline erläutert, besitzt die C_H2- Struktur auch in den weiteren Mitgliedern der Immunglobulinsu­ perfamilie häufig eine Effektorfunktion, die an der Entstehung verschiedenster Krankheitsbilder, unter anderem der Transplanta­ tabstoßung, beteiligt sein kann.

In Tabelle 1 sind die immunologischen Reaktionspartner für eine C_H2-Struktur aus verschiedenen Proteinen sowie die durch die In­ teraktion der C_H2-Struktur mit dem immunologischen Reaktionspart­ ner hervorrufbaren pathoimmunologischen bzw. physiologischen Folgereaktionen aufgelistet.

Immunologische Reaktionspartner von C_H2-haltigen Strukturen

Immunologische Reaktionspartner von C_H2-haltigen Strukturen

Stoffe, die solche Antikörper positiv oder negativ beeinflussen, könnten daher eine wichtige Rolle bei der Behandlung der Trans­ plantatabstoßung spielen.

Der vorliegenden Erfindung lag daher das technische Problem zu­ grunde, Stoffe anzugeben, die zur Behandlung der Transplantatab­ stoßung verwendbar sind.

Diese Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Gemäß Anspruch 1 ist die Verwendung von mindestens einem proteo­ lytischen Enzym und gegebenenfalls Rutosid zur Behandlung von Transplantatabstoßung vorgesehen.

Lymphozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Transplantatab­ stoßung. Die Interaktion von Lymphozyten mit entweder dem spe­ zialisierten Endothel in dem lymphoiden Organ oder aktivierten Endothelialzellen stellt den ersten kritischen Schritt bei der Wanderung der Lymphozyten zu den Fremdgeweben dar. Die Adhäsion von Lymphozyten an Endothelialzellen weist eine Vielzahl von Re­ zeptor-Liganden-Interaktionen auf, z. B. von LAF-1 an ICAM-1 und ICAM-2, CD44 und VLA4 an VCAM-1. Das CD44-Molekül ist besonders von Interesse, da es vielzählige proinflammatorische Funktionen aufweist und bei der Regulierung der Funktion anderer Adhäsions­ moleküle eine wichtige Rolle spielt. CD44-Moleküle können auch an der Aktivierung von T-Lymphozyten beteiligt sein. Auf den T- Zellen unterstützt die Ligandenbindung an das CD44-Molekül die T-Zellaktivierung, die Freisetzung von Interleukin-2 und die T- Zelladhäsion in Monozyten.

CD44 ist ein im Menschen vorkommendes, stark glykosiliertes Pro­ tein, das auf vielen Zellen, insbesondere des peripheren Blutes, vorhanden ist (M. Stoll in Leukocyte Typing IV, Herausgeber: W. Knapp et al., S. 619-622, Oxford University Press). Varianten dieses Moleküls können auch auf bestimmten Zellen der Haut und auf manchen Epithelzellen in der embryonalen Entwicklung nachge­ wiesen werden. Alle Varianten bestehen aus einem konstanten Teil (KT) und variablen Teil (VT).

Die durch das bzw. die proteolytischen Enzyme modulierten Im­ munglobuline zeichnen sich dadurch aus, daß deren Bindungsfähig­ keit für die Komplementkomponente C1q erniedrigt ist. Dies gilt für natürliche C1q-bindende Immunglobuline (Subklassen IgG1, IgG2, IgG3, IgM und teilweise IgA).

Die geänderte C1q-Bindungsfähigkeit wird - ohne an eine Theorie gebunden zu sein - vermutlich durch eine Konformationsänderung der C_H2-Domäne aufgrund der Enzymeinwirkung verursacht. Dabei kann die Konformationsänderung entweder durch eine enzymatisch verursachte Änderung unmittelbar in der C_H2-Domäne hervorgerufen werden, oder die proteolytischen Enzyme bewirken eine Struktu­ ränderung in den der C_H2-Domäne benachbarten Bereichen, und diese Änderungen beeinflussen die Konformation der C_H2-Domäne.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß proteolytische Enzy­ me, insbesondere Bromelain, verschiedene Epitope des CD44- Oberflächenmoleküls strukturell modifizieren. Wegen des hohen Glykosilierungsgrades der CD44-Varianten ist dieser Befund nicht vorhersehbar gewesen. Durch die enzymatische Strukturmodulation von CD44 verliert die Zelle ihre metastasierenden Eigenschaften.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain, Papain und gegebenenfalls Rutin ver­ wendet oder eine Kombination derselben.

Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme lassen sich kostengünstig aus den folgenden Rohmaterialien isolieren.

Bromelain ist ein proteolytisch wirksames Enzym aus dem Preßsaft der Ananas und kann auch noch aus reifen Früchten isoliert wer­ den.

Papain ist ein proteolytisches Enzym, das aus dem Milchsaft der unreifen, fleischigen Früchte des Melonenbaums Carica Papaya ge­ wonnen wird. Reines Papain ist ein kristallines Polypeptid mit einem MG. von 23350, das aus einer Kette von 212 Aminosäurere­ sten mit 4 Disulfid-Brücken besteht; Sequenz und Raumstruktur sind bekannt. Papain wird vielfältig eingesetzt: Aufgrund seiner Protein-spaltenden Eigenschaft als "Fleischzartmacher" oder "Mürbesalz", zum Klären von Bier, zur Brot- und Hartkeksherstel­ lung, in der Lederzubereitung, in der Textil-Industrie zum Ent­ basten von Seide und zur Verhinderung von Wollverfilzung, in der Tabak-Industrie zur Qualitätsverbesserung, zur Rückgewinnung von Silber aus verbrauchtem photographischem Material, ferner in der Bakteriologie zur Pepton-Gewinnung. In der Medizin dient Papain bereits zur Unterstützung der enzymatischen Verdauung, zur en­ zymatischen Wundreinigung und als Zusatz zu Zahnprothese-Reini­ gungsmitteln. Für Spezialzwecke werden Papain-Präparate auch an Kunststoffpolymere oder Agarose trägergebunden angeboten. Papain ist auch als Katalysator zur Synthese von Oligopeptiden verwen­ det worden.

Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das ebenfalls im Pankreas gebildet wird und in Verbindung mit anderen Enzymen bereits the­ rapeutisch eingesetzt wird. Es gehört zu den Serin-Proteinasen. Kristallines Trypsin hat ein MG. von ca. 23300, ist in Wasser, nicht aber in Alkohol löslich, besitzt ein Wirkungsoptimum bei pH 7-9 und spaltet Peptid-Ketten spezifisch Carboxy-seitig der basischen Aminosäurereste L-Lysin und L-Arginin. Die räumliche Struktur des aus 223 Aminosäuren bestehenden Trypsins ist be­ kannt.

Eine besonders gute Wirksamkeit zeigt sich bei der Verwendung einer Kombination der Enzyme Bromelain, Papain und/oder Trypsin. Neben der bemerkenswerten und unerwarteten Wirkung dieser Enzyme bei der Behandlung der Transplantatabstoßung hat die kombinierte Verwendung der genannten Enzyme weiterhin den Vorteil, daß auch bei einer Langzeitanwendung keine schädigenden Nebenwirkungen auftreten.

Weiterhin kann vorzugsweise zusätzlich Rutosid dem Medikament beigemischt werden. Rutosid ist ein Glycosid, das zu den Flavo­ noiden gehört.

Eine besonders gute Wirksamkeit hat die kombinierte Verwendung von 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit.

Ganz besonders bevorzugt ist eine Kombination von 90 mg Brome­ lain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid × 3H₂O.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombina­ tion von 48 mg Trypsin, 90 mg Bromelain und 100 mg Rutosid × 3H₂O verwendet.

Das Medikament kann weiterhin alle üblichen Hilfs- und/oder Trä­ gerstoffe enthalten.

Als Hilfs- und Trägerstoffe kommen z. B. Lactose, Magnesiumstea­ rat, Stearinsäure, Talkum, Methacrylsäure, Copolymerisat Typ A, Shellack, Makrogol 6000, Dibutylphthalat, Vanillin, Titandioxid, weißer Ton, Polyindon, gelbes Wachs und Carnaubawachs in Frage.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung im einzelnen erläu­ tern.

Beispiel 1 Material und Methoden 1. Material

Es wurde das Zellkulturmedium RPMI 1640 mit folgenden Zusätzen verwendet: NaHCO₃ (Biochrom, 2 g/l); L-Glutamin (Biochrom, 2 mM), Na-Pyruvat (Biochrom, 1 mM), NaN₃ (Sigma, 0,01%).

Im Falle einer Stimulation der Zellen wurde entweder Phythämag­ glutinin M (Biochrom, 5 µg/ml) oder γ-Interferon (100 U/ml) ein­ gesetzt. Die Stimulation der Zellen erfolgte dabei über 1-3 Tage mit Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (Biochrom).

Als Targets für die zu untersuchenden Enzyme wurden frisch iso­ lierte, humane, periphere, mononukleäre Blutzellen (Citratblut) verwendet. Nach der üblichen Isolation mittels Ficoll wurden die Zellen mehrfach gewaschen und frisch bei den Experimenten einge­ setzt. Neutrophile Granulozyten wurden ebenfalls aus frischem Citratblut isoliert. Hierbei erfolgte die Abtrennung von den Lymphozyten/Monozyten mittels eines 2-Stufen-Ficoll-Gradienten.

2. Verwendete monoklonale Antikörper

Für die spezifische Erkennung der Oberflächenstrukturen der Leu­ kozyten wurden monoklonale Antikörper verwendet. Diese erkennen auf den entsprechenden Antigenen jeweils ein definiertes Epitop, welches bei den von uns untersuchten Antigenen nur ein einziges Mal in der Struktur vorkommt. In Übersicht 1 sind die untersuch­ ten Oberflächenmarker, die monoklonalen Antikörper sowie die analysierten Targetzellen dargestellt.

Analysierte Oberflächenmarker, verwendete monoklo­ nale Antikörper und Targetzellen der Enzymbehandlung

Analysierte Oberflächenmarker, verwendete monoklo­ nale Antikörper und Targetzellen der Enzymbehandlung

3. Inkubationsbedingungen

Die frisch isolierten und aufbereiteten Zellen wurden mit den En­ zymen Bromelain, Papain und Trypsin (Arzneimittel-Inhaltsstoffe der Fa. Mucos) mit den jeweils in den Legenden der Tabellen und Abbildungen angegebenen Konzentrationen inkubiert. Bei der Mi­ schung der drei Enzyme entsprach das Mischungsverhältnis 22,7 : 15,5 : 11,9 (Bromelain : Papain : Trypsin, bezogen auf 40 µg/ml, "BPT"). Es wurden drei Enzymkonzentrationen (40, 10, 2,5 µg/ml) untersucht. Die Inkubation fand in serumfreiem Medium bei 37°C statt.

Die Proteasen wurden unmittelbar vor den Inkubationen angesetzt. In den Zellkulturmedien war 0,01% Natriumazid enthalten. Durch diesen Zusatz werden die Zellen daran gehindert, während des In­ kubationsprozesses oder der Waschvorgänge Rezeptormoleküle erneut zu exprimieren. Nach dem Auswaschen des Zellkulturmediums sind die Zellen wieder aktivierbar (nicht demonstriert).

Nach entsprechender Inkubation der Zellen mit den jeweiligen En­ zymen, Auswaschen der Enzyme und der Markierung mit monoklonalen Antikörpern (nach Angaben der Hersteller) wurde sofort die Analy­ se der Oberflächenmarker vorgenommen.

4. Analytische Durchflußcytometrie

Alle Untersuchungen zur Modulation von Zelloberflächenmolekülen wurden mittels analytischer Durchflußcytometrie (FACSCAN, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) unter Verwendung einer gerätespezi­ fischen Software (Lysis I) durchgeführt. Bei entsprechender Ein­ stellung des Gerätes sowie der Mitführung von Referenzen, d. h. Zellen, die ohne Enzyme aber in derselben Prozedur behandelt wur­ den, erfolgte die Messung.

Für jede Subklasse der monoklonalen Antikörper wurde eine ent­ sprechende fluoreszenzkonjugierte Isotypenkontrolle mitgeführt. Hierbei handelt es sich um Maus-Immunglobulin, mit welchem die Kapazität der unspezifischen Bindung der Targetzellen flußcytome­ trisch erfaßt wird.

Pro Histogramm wurden 10 000 Zellen gemessen. Die jeweilige Zell­ population wurde mit einem sogenannten "elektronischen Gate" se­ pariert, in dem sich dann mindestens 3 500 Zellen befanden.

5. Darstellung der Ergebnisse

Die Auswertung und Analyse der Daten erfolgte unabhängig vom Meßvorgang auf dem Durchflußcytometer mittels einer gerätespezi­ fischen Software. Dabei wurden jeweils die Histogramme der Kon­ trollen, d. h. der unbehandelten Zellproben, mit den Histogram­ men der enzymbehandelten Zellen verglichen.

Die Rohdarstellung umfaßt ein optisch eindrucksvolles, aber re­ lativ unübersichtliches Histogramm, bei dem verschiedene Einzel­ messungen übereinander gelagert abgebildet sind. Hier läßt sich insbesondere die Wirkung der Enzyme im Vergleich zur Referenz optisch transparent machen. Für diese Untersuchungen ist nicht der prozentuale Anteil einer Subpopulation an der gesamten Leu­ kozytenpopulation die Meßgröße, sondern die relative Rezeptor­ dichte, die sich als Fluoreszenzintensität darstellt.

Aus diesen Histogrammen, die beispielhaft sind und illustrativen Charakter haben, lassen sich Daten ableiten, welche die relative Fluoreszenzintensität der Einzelmessung reflektieren. Diese ist ein Maß für die relative Rezeptor- oder Oberflächenmoleküldichte bei einer gemessenen Zellpopulation.

Die Säulengraphiken zeigen in logarithmischer Darstellung den Median der relativen Fluoreszenz. Es läßt sich so gegenüber der Referenz die Reduktion der Dichte des jeweiligen Oberflächenmo­ leküls in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration darstellen.

In den Tabellen sind die Daten unabhängiger Experimente enthal­ ten. Die Nummern der Spender haben nur für die jeweilige Tabelle Gültigkeit und sind nicht auf andere Tabellen übertragbar. Wird in der Tabelle beispielsweise ein Wert von 40% angegeben, so bedeutet das, daß bei diesem Antigen 40% aller Oberflächenmole­ küle durch das Enzym so verändert ist, daß der spezifische mono­ klonale Antikörper sein Epitop nicht mehr erkennt. Wird keine Reduktion beobachtet, so erscheint in den Tabellen der Wert "0". Die angegebene Prozentzahl drückt somit die Enzymleistung gegen­ über den einzelnen Antigenen aus. Werte bis zu 20% werden im Einzelfall als nicht relevant angesehen.

Für eine Bewertung der Wirkung der Enzyme auf die einzelnen Anti­ gene ist es günstig, einen geeigneten Vergleichsmaßstab zu wählen. Bis auf wenige Ausnahmen wurden alle Untersuchungen unter standar­ disierten Inkubationsbedingungen durchgeführt. Damit kann für die­ se experimentellen Bedingungen die aus früheren Forschungsberich­ ten bekannte Halbeffektkonzentration angegeben werden.

Zur Berechnung der Halbeffektkonzentration wurden die Daten mit­ tels nicht-linearer Regression ausgewertet. Der Median der Fluo­ reszenzintensität versus eingesetzter Enzymkonzentration und Re­ ferenz werden zueinander in Beziehung gesetzt, und daraus läßt sich die Menge an Enzym berechnen, die zu einer 50%igen Redukti­ on der relativen Fluoreszenz Intensität bzw. der in der Struktur veränderten Rezeptordichte führt.

Abb. 1

CD2-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lym­ phozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zel­ len, die mit dem für CD2 spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubations­ zeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 (vgl. Tab. 1) als Mittelwert von Doppelbestimmun­ gen und Standardabweichung.

Abb. 2

CD4(Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; Ange­ geben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensität; Tar­ getzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind un­ behandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen, monoklona­ len Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbe­ handelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 2 (vgl. Tab. 2) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.

Abb. 3

CD4(Epitope OKT4 und Leu3a)-Modulation durch Tryp­ sin; Angegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensi­ tät; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen mono­ klonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wur­ den. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Darge­ stellt sind die Daten von einem Spender (vgl. Tab. 3) als Mittel­ wert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.

Abb. 4

CD25-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: PHA- Blasten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zel­ len, die mit dem für CD25 spezifischen, monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubations­ zeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Stan­ dardabweichung.

Abb. 5

Reduktion der Leu3a-Antigendichte durch Trypsin. Frisch isolierte humane periphere, mononukleäre Blutzellen wur­ den mit Trypsin im serumfreien Medium inkubiert, anschließend gewaschen und mit dem monoklonalen Antikörper anti-Leu3a mar­ kiert. Die Reduktion der relativen Fluoreszenzdichte von CD4 der Lymphozytenpopulation ist das Maß der Enzymaktivität. Die Hal­ beffektkonzentration von Trypsin gegenüber dem Epitop Leu3a von CD4 wird über die gefittete Kurve berechnet.

Ergebnisse Tabelle 1

CD2-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lympho­ zyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Mediums der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von drei Experimenten mit Zellen von drei ver­ schiedenen Spendern dargestellt.

Tabelle 2

CD4(Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; Tar­ getzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen be­ trug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimenten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt.

Tabelle 3

Modulation der CD4-Epitope Leu3a und OKT4 durch Trypsin; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozen­ tuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensi­ tät, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Daten von einem Spender dargestellt.

Tabelle 4

CD25-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lym­ phozyten, Monozyten, NK-Zellen. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den En­ zymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimenten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt. Vor dem Experiment wurden die Zellen 3 Tage mitogenstimuliert.

Tabelle 5

Berechnete Halbeffektkonzentration (µg/ml) von Brome­ lain, Papain, Trypsin und deren Kombination für die 50%ige Re­ duktion der Dichte von zellulären Oberflächenmolekülen. Die En­ zyminkubation betrug 1 Stunde.

Claims (7)

1. Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym und ge­ gebenenfalls Rutosid zur Behandlung und/oder Vorbeugung der Transplantatabstoßung.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain oder Papain oder eine Kombination von einem oder mehreren dieser Enzyme verwendet wird.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Rutosid verwendet wird.

4. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit verwendet werden.

5. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid pro Dosiseinheit verwendet werden.

6. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 48 mg Trypsin und 100 mg Rutosid pro Dosiseinheit verwendet werden.

7. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß 10 bis 100 mg, vorzugsweise 10 mg Rutosid × 3H₂O pro Dosiseinheit verwendet werden.