WO1998039019A1 - Procede d'obtention de substances biologiquement actives, les substances ainsi obtenues et les compositions en renfermant - Google Patents

Procede d'obtention de substances biologiquement actives, les substances ainsi obtenues et les compositions en renfermant Download PDF

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WO1998039019A1
WO1998039019A1 PCT/FR1998/000410 FR9800410W WO9839019A1 WO 1998039019 A1 WO1998039019 A1 WO 1998039019A1 FR 9800410 W FR9800410 W FR 9800410W WO 9839019 A1 WO9839019 A1 WO 9839019A1
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biologically active
active substances
family
bax
synthesis
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PCT/FR1998/000410
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Inventor
Gilles Gutierrez
Druon Note
Lionel Viornery
Original Assignee
Inovat S.A.R.L.
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)

Definitions

  • the present invention relates to a process for obtaining new biologically active substances of marine origin, the biologically active substances thus obtained and the compositions containing them.
  • compositions of the present invention are intended to inhibit the cell death program of eukaryotic cells, by decreasing the synthesis of the BAX protein. These compositions thus manifest an anti-apoptotic action by reducing the synthesis of the BAX protein.
  • Apoptosis is regulated by two families of protein molecules called BAX and Bcl2. These molecules are only active when they are coupled.
  • the heterodimeric pair proteins from two different families like BAX-Bcl2 cancels this death program.
  • the homodimer pair of the bax-bax type activates it. Therefore, if we decrease BAX synthesis, we will increase cell life.
  • the biologically active substances of the present invention intervene by regulating the synthesis of BAX throughout life and by decreasing this synthesis after an attack.
  • apoptosis is essential to our survival. It intervenes in our morphogenesis and it is one of the major phenomena of the development of our brain. In insects, apoptosis is one of the major biological phenomena that sets up metamorphosis, in other animals it plays a predominant role during the moult. In mammals and other species it regulates immune phenomena.
  • the plants from which the biologically active substances of the invention are extracted are Pheophyceae, class of Fucophyceae, order of Dictyotales, family of Dictyotaceae. Only a few genera belong to the Dictyotales family, these are Padina, Zonaria or Dictyota.
  • the genus Padina includes the most frequent species. As an example, it is possible to find on the Mediterranean shore the species pavonica, boyana (P.
  • the present invention relates to a process for obtaining biologically active substances extracted from plants of the Dictyotales family. Initially, the plant of the Dictyotales family is subjected, after harvest, to drying, if possible protected from light, to keep its pharmacological properties intact.
  • Crushed or raw plants are dried, by ventilation without heating, and a dark brown plant material is obtained, on which the white streaks of calcium carbonate strongly contrast.
  • Another method although less economical, is also satisfactory: it consists of strongly draining the plants, then drying them under vacuum. Lyophilization of the plant, ground or not, advantageously makes it possible to obtain an anhydrous product.
  • the advantage of a strongly dried plant is to obtain a vegetable material which keeps well (protected from humidity) and from which it will be possible to extract the active substance (s), stabilized (s ) or not, without being bothered by the presence of a polar solvent. In addition, completely dried plants are easier to powder.
  • the process for obtaining biologically active substances is characterized in that a plant of the Dictyotales family is subjected to drying, and / or to lyophilization, to grinding, followed by one or more depletion of the material.
  • vegetable by an organic solvent chosen from the group formed by alkanols (ethanol, etc.), ketones (acetone, etc.), short-chain alkanes (pentane, hexane, heptane, etc.), cycloalkanes (cyclohexane, etc.) .), halogenated solvents (chloroform, dichloromethane ...), aromatic solvents, esters (ethyl acetate ...), ethers and the like, to obtain an organic extract of the plant, the extract is dried organic by evaporation of the solvent, the dry organic extract is purified by one or more purification steps carried out successively by liquid / liquid confrontation, by chromatography on a low pressure column or high pressure, by high performance liquid chromatography
  • Organic solvents can be used alone or in combination. In general, organic solvents miscible with water can be used, as well as all the solvents capable of extracting the active substances from the fronds of the plant.
  • the solvents will preferably also be chosen from volatile solvents when it is desired to obtain biologically active substances free of solvent.
  • the organic solvent will preferably be acetone or ethanol.
  • the plant of the Dictyotales family once dried, and / or lyophilized and ground, is subjected to one or more depletions by bringing the plant into contact with acetone, for 4 to 5 days and in the proportions of 1 gram of dry vegetable matter for 5 ml of acetone.
  • the acetone extract obtained is dried by evaporation of the solvent, then purified by the purification steps defined below.
  • the first purification step is carried out by liquid / liquid confrontation.
  • the acetone residue or dry extract is taken up in a methanol / water mixture which is faced with hexane.
  • the hydromethanol phase is faced, after concentration and dilution in water, with ether. In this way, the final ethereal phase is biologically active.
  • the second purification step is carried out by chromatography on a low pressure column.
  • the support used is a Sephadex LH 20 ® type gel.
  • Elution is carried out by a chloroform / methanol gradient.
  • the biologically active fraction is eluted in chloroform / methanol in the proportions 97/3 volume by volume. When rinsing the column with a 70/30 chloroform / methanol mixture, a second residual fraction is eluted.
  • the next purification step takes place by semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the dimensions of the column are 250 mm in length and 10 mm in diameter.
  • the support used is a diol grafted silica and the eluent is a 95/5 hexane / isopropanol mixture.
  • the flow rate is 8 ml / min.
  • the active fractions are eluted between 0 and 20 min, 25 and 35 min and / or 40 and 50 min. The other fractions are rejected or used for other purposes.
  • a biologically active fraction consisting of one or more substances which cause a decrease in BAX synthesis when brought into contact with cells.
  • the new biologically active substances extracted from plants of the Dictyotales family are characterized in that they exhibit, when the exhaustions have been carried out with acetone, retention times, in semi-preparative high performance liquid chromatography on the diol grafted silica support and with a 95/5 hexane / isopropanol eluent, between 0 and 20 min, 25 and 35 min and / or 40 and 50 min.
  • the present invention also relates to the new biologically active substances capable of being thus obtained, extracted from plants of the Dictyotales family. These substances have an anti-apoptotic action by reducing the synthesis of proteins related to those of the BAX family, in particular in the presence of free radicals or a rise in temperature.
  • biologically active substances allow the stabilization of the phenomenon of cell death induced in stem cells, the prolongation of cell life and the protection of "cell capital”.
  • the biologically active substances according to the invention extracted from plants of the family of Dictyotales show very interesting pharmacological properties, and therefore find use in therapy, in cosmetics, in food, in human and veterinary dietetics.
  • the biologically active substances capable of being obtained according to the process of the invention are used for the production of depot compositions or formulations intended to prevent and / or treat conditions involving an increased synthesis of the BAX protein.
  • the present invention also relates to pharmaceutical, cosmetic and / or food compositions exhibiting an anti-apoptotic action by reducing the synthesis of the BAX protein, characterized in that they contain, as active principle, one or more biologically active substances capable of 'be obtained according to the method of the invention, in combination or in admixture with an inert excipient or vehicle, non-toxic, suitable for the intended use, and optionally one or more active ingredients with complementary action.
  • compositions according to the invention are intended for administration by the digestive, parenteral, percutaneous or topical route.
  • the compositions are therefore presented in the form of naked or coated tablets, dragees, capsules, capsules, pills, tablets, cachets, syrups, powders to be ingested or for external use; solutes or suspensions packaged in ampoules; creams, gels or ointments; solutions for percutaneous use in a penetrating polar solvent.
  • the present invention also relates to the deposition formulations having an anti-apoptotic action by reducing the synthesis of the BAX protein, characterized in that they contain, as active principle, one or more biologically active substances capable of being obtained according to the process. of the invention, in combination or in mixture with an inert excipient or vehicle, non-toxic, poorly absorbable, and optionally one or more active ingredients with complementary action.
  • the accepted activity criterion is the inhibition of the synthesis of the BAX protein.
  • the assay of BAX synthesized by the keratinocytes is carried out by an immuno absorption method called ELISA sandwich.
  • the cells are prepared according to the technique of Germain et al., From samples of healthy skin from cosmetic surgery. After removal of the adipose tissue, the skin is cut into small fragments of 2 mm ⁇ 2 mm which are incubated in a thermolysin solution (500 ⁇ g / ml of HEPES buffer) at 37 ° C. for 2 hours. The epidermis is then easily separated from the dermis using very fine sterile forceps. The flaps of epidermis thus detached are incubated in a solution of trypsin (0.05% in the HBSS buffer) -EDTA (0.1% in the HBSS buffer) at 37 ° C. for 30 minutes in order to dissociate the keratinocytes. After two rinses in HBSS buffer, the keratinocyte cells are counted using a Coulter Counter (Coultronics) and then cultured in KMK medium (SIGMA). Experimental protocol :
  • the freshly isolated keratinocytes are seeded at a rate of one million per dish in the KMK culture medium.
  • the keratinocyte cultures are treated the day before with 1% of an ethanolic solution containing (test boxes) or not (control boxes) the active principle.
  • the culture dishes are placed in a water bath at a temperature of 43 ° for 30 minutes. They are then transferred to the CO 2 incubator at 37 ° C for another 2 hours. The cells are then lysed by an X 100 buffer and the BAX protein contained in the cell lysate is assayed by the sandwich ELISA technique.
  • optical density optical density of the protein
  • the active fraction (F.A.) is eluted between 0 and 20 min
  • the non-active fraction (FNA) is eluted between 20 and 25 min and 35 and 40 min.
  • Table II illustrates the effect of the active fractions (AF) containing one or more active biological substances on the expression of the BAX protein synthesized by human fibroblasts from surgical explants coming from individuals of different ages obtained by the technique classic. Identical number of cells in each experiment, and cells with the same number of passages.
  • AF active fractions
  • BAX assay by the ELISA sandwich method expression of the DO values, revelation by peroxidase.
  • FA concentration of the active fraction is 1% (fibroblast cultures are treated with 1% of an ethanolic solution containing the active principle).
  • BAX synthesis increases with age. Treatment of the cells with a 1% solution of active fraction lowers the production of the BAX protein to a level close to that observed with cells from a young subject.
  • Table III illustrates the effect of the active fraction (AF) containing one or more active biological substances on the expression of the bax protein synthesized by human keratinocytes originating from surgical explants originating from individuals of different ages. Number of identical cells (10 6 cells) in each experiment, and cells with the same number of passages (P1).
  • Bax assay by the sandwich ELISA method expression of the D.O. values revelation by peroxidase after 48 hours of incubation.
  • the concentration of active fractions is 1%.
  • Table III is illustrated by FIGS. 2 and 3.
  • the synthesis of BAX by keratinocytes increases with age, and in the presence of the active fraction (F.A.) this is reduced.
  • BAX synthesis increases with age. Treatment of the cells with a 1% solution of active fraction lowers the production of the BAX protein to a level close to that observed with cells from a young subject. The older a cell, the more effective the treatment with active fractions on keratinocytes.
  • the free radicals produced in this experiment are obtained by xanthine xanthine oxidase.
  • Table IV is illustrated by Figures 4 and 5.
  • the xanthine-xanthine oxidase reaction produces free radicals which stimulate the synthesis of bax by keratinocytes. This stimulation is less strong on older keratinocytes.
  • TABLE V The addition of active fractions (AF) in the culture medium restores normal synthesis of the BAX protein in the presence of free radicals.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de nouvelles substances biologiquement actives d'origine marine, les substances biologiquement actives ainsi obtenues et les compositions en renfermant. Le procédé d'obtention de la présente invention est caractérisé en ce que l'on soumet une plante de la famille des Dictyotales à un séchage, et/ou à une lyophilisation puis à un broyage, suivi d'un ou plusieurs épuisements de la matière végétale par un solvant organique choisi dans le groupe formé des alcanols inférieurs, des cétones aliphatiques, des alcanes, des cycloalcanes, des solvants halogénés, des solvants aromatiques, des esters, des éthers et similaires, pour obtenir un extrait organique de la plante, on sèche l'extrait organique par évaporation du solvant, on purifie l'extrait organique sec par une ou plusieurs étapes de purification réalisées successivement par affrontement liquide/liquide, par chromatographie sur colonne basse pression ou haute pression, par chromatographie liquide haute performance, pour obtenir une ou plusieurs fractions actives des plantes de la famille des Dictyotales manifestant une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse des protéines apparentées à celles de la famille de BAX. Les substances biologiquement actives de l'invention sont utilisées en vue de la réalisation de compositions ou de formulations dépôt destinées à prévenir et/ou à traiter les affections impliquant une synthèse accrue des protéines apparentées à celles de la famille de BAX.

Description

PROCEDE D ' OBTENTION DE SUBSTANCES BIOLOGIQUEMENT ACTIVES , LES SUBSTANCES AINSI OBTENUES ET LES COMPOSITION EN RENFERMANT
La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de nouvelles substances biologiquement actives d'origine marine, les substances biologiquement actives ainsi obtenues et les compositions en renfermant.
Ces nouvelles substances biologiquement actives sont extraites de plantes de la famille des Dictyotales.
Les compositions de la présente invention sont destinées à inhiber le programme de mort cellulaire des cellules d'eucaryotes, en diminuant la synthèse de la protéine BAX. Ces compositions manifestent ainsi une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse de la protéine BAX.
La découverte du phénomène de mort programmée, bien que non récente a fait une avancée importante ces dernières années grâce à l'immunologie et la biologie moléculaire qui mettent à la disposition des chercheurs, des anticorps et des antigènes objectivant les différents intervenants de l'apoptose. Aujourd'hui les principales étapes de l'apoptose sont relativement bien connues. La plupart des travaux sur l'arrêt du programme de mort sont tous conduits par l'amplification génomique des gènes codant les séquences peptidiques impliquées dans le développement de l'apoptose.
L'apoptose est régulée par deux familles de molécules de nature proteique appelées BAX et Bcl2. Ces molécules ne sont actives que lorsqu'elles sont accouplées. Le couple hétérodimère : protéines venant de deux familles différentes comme BAX- Bcl2 annule ce programme de mort. Le couple homodimère du type bax-bax l'active. Par conséquent, si on diminue la synthèse de BAX, on augmentera la vie des cellules. Les substances biologiquement actives de la présente invention interviennent en régulant la synthèse de BAX tout au long de la vie et en diminuant cette synthèse après une agression.
L'apoptose physiologique est essentielle à notre survie. Elle intervient dans notre morphogénèse et elle est l'un des phénomènes majeurs du développement de notre cerveau. Chez les insectes, l'apoptose est l'un des phénomènes biologiques majeurs qui met en place la métamorphose, chez d'autres animaux elle joue un rôle prépondérant lors de la mue. Chez les mammifères et d'autres espèces elle régule les phénomènes immunitaires.
Les plantes desquelles sont extraites les substances biologiquement actives de l'invention, sont des Phéophycées, classe des Fucophyceae, ordre des Dictyotales, famille des Dictyotaceae. Seuls quelques genres appartiennent à la famille des Dictyotales, il s'agit de Padina, Zonaria ou Dictyota. Le genre Padina regroupe les espèces les plus fréquentes. A titre d'exemple, il est possible de trouver sur le rivage de la Méditerranée les espèces pavonica, boyana (P. tenuis), boergesenii, sur les rives du Pacifique (non repris les espèces déjà citées) : arborescens, australis, boryana, caulens, commersonii, concrescens, crasse, durvillei, elegans, fernandeziana, fraseri, gymnospora, de même sur les rives de l'Océan Atlantique : glabra, haitensis, distromatica, dubia. Il existe aussi des espèces typiques de l'océan Indien. L'une des caractéristiques de ces plantes est de fixer sur leur thalle une couche de carbonate de calcium de type aragonite ou orthorhombique à la surface des frondes. Cette caractéristique est obtenue par l'examen en diffraction X de la poudre obtenue avec ces plantes. La diffraction des rayons X montre que la poudre de ces plantes présente des pics d'intensité notable aux angles 2 θ caractéristiques de l'aragonite.
Une autre caractéristique de ces plantes est leur capacité de survie dans des conditions difficiles en préservant leur propre vie végétative et non en utilisant la sporulation. Des mécanismes identiques à cette plante sont retrouvés dans nos cellules. En effet, ces algues étaient présentes au début de la construction de notre arbre d'évolution. La présente invention concerne un procédé d'obtention des substances biologiquement actives extraites de plantes de la famille des Dictyotales. Dans un premier temps, la plante de la famille des Dictyotales est soumise, après récolte, à un séchage, si possible à l'abri de la lumière, pour garder intactes ses propriétés pharmacologiques.
On procède au séchage des plantes broyées ou brutes, par ventilation sans chauffage et on obtient ainsi un matériel végétal de couleur marron foncé sur lequel contrastent vivement les stries blanches de carbonate de calcium. Une autre méthode, bien que moins économique, donne également satisfaction : elle consiste à egoutter fortement les plantes, puis à les sécher sous vide d'air. La lyophilisation de la plante, broyée ou non, permet d'une manière avantageuse d'obtenir un produit anhydre.
Ces deux dernières techniques donnent un matériel de couleur vert brun foncé, très fragile et facilement réduit en poudre, ce qui facilite l'extraction par un solvant pour obtenir les substances biologiquement actives de l'invention.
L'intérêt d'une plante fortement séchée est d'obtenir une matière végétale qui se conserve bien (à l'abri de l'humidité) et à partir de laquelle il sera possible d'extraire la ou les substances actives, stabilisée(s) ou non, sans être gêné par la présence d'un solvant polaire. De plus, les plantes complètement séchées sont plus faciles à réduire en poudre.
Le procédé d'obtention des substances biologiquement actives est caractérisé en ce que l'on soumet une plante de la famille des Dictyotales à un séchage, et/ou à une lyophilisation, à un broyage, suivi d'un ou plusieurs épuisement de la matière végétale par un solvant organique choisi dans le groupe formé des alcanols (éthanol...), des cétones (acétone...), des alcanes à chaînes courtes (pentane, hexane, heptane...), des cycloalcanes (cyclohexane...), des solvants halogènes (chloroforme, dichlorométhane...), des solvants aromatiques, des esters (acétate d'éthyle...), des éthers et similaires, pour obtenir un extrait organique de ia plante, on sèche l'extrait organique par évaporation du solvant, on purifie l'extrait organique sec par une ou plusieurs étapes de purification réalisées successivement par affrontement liquide/liquide, par chromatographie sur colonne basse pression ou haute pression, par chromatographie liquide haute performance, pour obtenir une ou plusieurs fractions actives des plantes de la famille des Dictyotales manifestant une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse des protéines apparentées à celles de la famille de BAX par les cellules.
Les solvants organiques peuvent être utilisés seul ou en association. De manière générale, on peut utiliser des solvants organiques miscibles à l'eau, ainsi que tous les solvants susceptibles d'extraire les substances actives des frondes de la plante. Les solvants seront de préférence encore choisis parmi les solvants volatils dès lors que l'on désire obtenir des substances biologiquement actives débarrassées de solvant.
Le solvant organique sera de préférence l'acétone ou l'éthanol.
Lors de la macération, on a utilisé, avec de bons résultats, des rapports très variables de matière sèche par rapport au solvant. Les volumes mis en oeuvre pour une même quantité de matière sèche varient de 1 à 50. De même, les temps de contact entre le solvant organique et la matière végétale varient de 12 heures à 5 jours.
Dans le cas présent, la plante de la famille des Dictyotales une fois séchée, et/ou lyophilisée et broyée, est soumise à un ou plusieurs épuisements par la mise en contact de la plante avec de l'acétone, pendant 4 à 5 jours et dans les proportions de 1 gramme de matière végétale sèche pour 5 ml d'acétone.
L'extrait acetonique obtenu est séché par évaporation du solvant, puis purifié par les étapes de purification définies ci-après.
La première étape de purification est réalisée par affrontement liquide/liquide. Le résidu ou extrait sec acetonique est repris par un mélange méthanol/eau qui est affronté à de l'hexane. Dans un deuxième temps, la phase hydrométhanolique est affrontée, après concentration et dilution dans l'eau, à l'éther. De cette manière, la phase éthérée finale est biologiquement active. La deuxième étape de purification est réalisée par chromatographie sur colonne basse pression. Le support utilisé est un gel de type Sephadex LH 20 ®. L'élution s'effectue par un gradient chloroforme/méthanol. La fraction biologiquement active est éluée en chloroforme/méthanol dans les proportions 97/3 volume à volume. Lors du rinçage de la colonne par un mélange chloroforme/méthanol 70/30 on élue une deuxième fraction résiduelle.
L'étape suivante de purification a lieu par chromatographie liquide haute performance (HPLC) semi préparative. Les dimensions de la colonne sont de 250 mm de longueur et de 10 mm de diamètre. Le support utilisé est une silice greffée diol et l'éluant est un mélange hexane/isopropanol 95/5. Le débit est de 8 ml/min. Les fractions actives sont éiuées entre 0 et 20 min, 25 et 35 min et/ou 40 et 50 min. Les autres fractions sont rejetées ou utilisées à d'autres fins.
D'autres étapes de purification sont encore envisageables.
A l'issue de ces étapes de purification, on obtient une fraction biologiquement active constituée d'une ou plusieurs substances qui provoquent une diminution de la synthèse de BAX lors de la mise en contact avec des cellules. Ainsi, les nouvelles substances biologiquement actives extraites de plantes de la famille des Dictyotales sont caractérisées en ce qu'elles présentent, lorsque les épuisements ont été effectués à l'acétone, des temps de rétention, en chromatographie liquide haute performance semi-préparative sur le support silice greffé diol et avec un éluant hexane/isopropanol 95/5, compris entre 0 et 20 min, 25 et 35 min et/ou 40 et 50 min.
On procède ensuite à différentes méthodes analytiques (spectres UV, IR, RMN, chromatographie sur couche mince...) qui permettent la caractérisation de la ou des substances biologiquement actives, extraites dans ces conditions des plantes de la famille des Dictyotales.
La présente invention a encore pour objet les nouvelles substances biologiquement actives susceptibles d'être ainsi obtenues, extraites de plantes de la famille des Dictyotales. Ces substances présentent une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse des protéines apparentées à celles de la famille de BAX, en particulier en présence de radicaux libres ou d'une élévation de température.
Ainsi les substances biologiquement actives permettent la stabilisation du phénomène de mort cellulaire induite dans les cellules souches, la prolongation de la vie cellulaire et la protection du « capital cellulaire ».
Les substances biologiquement actives selon l'invention, extraites de plantes de la famille des Dictyotales manifestent des propriétés pharmacologiques très intéressantes, et trouvent de ce fait un emploi en thérapeutique, en cosmétique, en alimentation, en diététique humaine et vétérinaire.
Les substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention sont utilisées en vue de la réalisation de compositions ou formulations dépôts destinés à prévenir et/ou à traiter les affections impliquant une synthèse accrue de la protéine BAX.
La présente invention concerne encore les compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires présentant une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse de la protéine BAX, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif une ou plusieurs substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, approprié à l'usage envisagé, et éventuellement un ou plusieurs principes actifs à action complémentaire.
Les compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires selon l'invention sont destinées à l'administration par voie digestive, parentérale, percutanée ou topique. Les compositions sont donc présentées sous forme de comprimés nus ou enrobés, de dragées, de capsules, de gélules, de pilules, de tablettes, de cachets, de sirops, de poudres à ingérer ou à usage externe ; de solutés ou de suspensions conditionnés en ampoules ; de crèmes, de gels ou de pommades ; de solutions à usage percutané dans un solvant polaire pénétrant. La présente invention concerne également les formulations dépôt présentant une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse de la protéine BAX, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif une ou plusieurs substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, peu résorbable, et éventuellement un ou plusieurs principes actifs à action complémentaire.
Les exemples et résultats suivants illustrent l'invention. Ils ne la limitent en aucune façon.
EXEMPLE I
Etude de l'activité inhibitrice de la synthèse de la protéine BAX par les substances extraites de plantes de la famille des Dictyotales.
Le critère d'activité admis est l'inhibition de la synthèse de la protéine BAX.
Le dosage de BAX synthétisé par les kératinocytes est effectué par une méthode d'immuno absorption appelée ELISA sandwich.
Les cellules sont préparées selon la technique de Germain et col., à partir de prélèvements de peaux saines provenant de chirurgie esthétique. Après élimination du tissu adipeux, la peau est coupée en petits fragments de 2 mm X 2 mm qui sont incubés dans une solution de thermolysine (500 μg/ml du tampon HEPES) à 37° C pendant 2 heures. L'epiderme est alors séparé facilement du derme à l'aide de pinces stériles très fines. Les lambeaux d'épiderme ainsi détachés sont incubés dans une solution de trypsine (0,05 % dans le tampon HBSS)-EDTA (0,1 % dans le tampon HBSS) à 37° C pendant 30 minutes afin de dissocier les kératinocytes. Après deux rinçages dans le tampon HBSS, les cellules kératinocytaires sont comptées à l'aide d'un Coulter Counter (Coultronics) puis mises en culture dans le milieu KMK (SIGMA). Protocole expérimental :
Les kératinocytes fraîchement isolés sont ensemencés à raison d'un million par boîte dans le milieu de culture KMK. Les cultures de kératinocytes sont traitées la veille avec 1 % d'une solution éthanolique contenant (boîtes essais) ou pas (boîtes témoins) le principe actif.
Le lendemain, les boîtes de culture sont mises dans un bain-marie à la température de 43° pendant 30 minutes. Elles sont ensuite transférées dans l'incubateur à CO2 à 37° C pendant encore 2 heures. Les cellules sont alors lysées par un tampon X 100 et ia protéine BAX contenue dans le lysat cellulaire est dosée par la technique ELISA sandwich.
ELI SA Sandwich :
• Dilution au 1/200 de l'anticorps monoclonal anti-bax dans un tampon carbonate- bicarbonate, pH : 9,6. • Distribution de la solution d'anticorps dans une microplaque (96 puits) à raison de 100 μl/puits.
• Incubation une nuit à 4° C (ou une heure à 37° C).
• Elimination du surnageant.
• Addition du lysat cellulaire (100 μl/puits) contenant la protéine BAX. • Incubation à température ambiante pendant une heure.
• Rinçage des puits 3 fois avec 200 μl du tampon PBS contenant 0,1 % de Tween 20.
• Addition de la solution d'anticorps anti-bax (100 μl/puits).
• Incubation une heure à température ambiante. • Rinçage 3 fois avec 200 μl du tampon PBS contenant 0,1 % de Tween 20.
• Addition d'une solution du second anticorps anti-lgG de lapin couplé à la peroxydase (50 μl/puits).
• Incubation à température ambiante pendant une heure.
• Rinçage 3 fois avec 200 μl du tampon PBS contenant 0,1 % de Tween 20. • Addition du substrat (50 μl/puits).
• Incubation à température ambiante pendant 30 min.
• Addition de 10 μl/puits d'une solution d'acide sulfurique 1 N. • Lecture de la microplaque à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (METERTECH).
Dosage de BAX par la méthode d'ELISA sandwich :
Les valeurs sont exprimées en densité optique (D.O.) (densité optique de la protéine
BAX), la révélation se fait par la peroxydase.
Comme indiqué précédemment la fraction active (F.A.) est éluée entre 0 et 20 min,
25 et 35 min et 40 et 50 min par HPLC semi-préparative sur support silice greffée diol. L'éluant est l'hexane/isopropanol 95/5.
La fraction non active (FNA) est éluée entre 20 et 25 min et 35 et 40 min.
TABLEAU I : Dosage de BAX sur une culture de kératinocytes humains.
moyenne écart
(D.O) type témoin 0,166 0,219 0,196 0,198 0,195 0,019
(1) 0,194 0,186 0,025
FNA : 20-25 et 35-40 min (2) 0,142 0,206 0,190 0,190 0,101 0,007
FA : 0-20, 25-35 et 40-50 min 0,201
(3) 0,095 0,101 0,094 0,110 0,107
(1) et (2) : différence non statistiquement significative : p = 58,43 % (1) et (3) : différence statistiquement significative : p < 10"5
L'addition de la fraction active contenant les substances biologiquement actives de l'invention dans la culture, permet une nette inhibition de la synthèse de BAX.
TABLEAU II : Dosage de BAX par ELISA sandwich synthétisé par les fibroblastes.
Le tableau II illustre l'effet des fractions actives (FA) contenant une ou plusieurs substances biologiques actives sur l'expression de la protéine BAX synthétisée par des fibroblastes humains issus d'expiants chirurgicaux provenant d'individus d'âges différents obtenus par la technique classique. Nombre de cellules identique dans chaque expérimentation, et cellules au même nombre de passages.
Dosage de BAX par la méthode d'ELISA sandwich : expression des valeurs en D.O, révélation par la peroxydase.
moyenne écart
(D.O) type
5 ans non traité d) 0,049 0,049 0,047 0,052 0,054 0,012
5 ans traité avec F.A. (2) 0,075 0,056 0,006
61 ans non traité (3) 0,064 0,053 0,050 0,060 0,138 0,008
61 ans traité avec F.A. (4) 0,051 0,071 0,010
0,149 0,136 0,132 0,141
0,130
0,081 0,069 0,063 0,080
0,060
(1) et (2) : différence non statistiquement significative (1) et (4) : différence non statistiquement significative
(FA) : la concentration de la fraction active est de 1 % (les cultures de fibroblastes sont traitées avec 1 % d'une solution éthanolique contenant le principe actif).
Le tableau II est illustré par la figure 1.
La synthèse de BAX augmente avec l'âge. Le traitement des cellules par une solution à 1 % de fraction active abaisse la production de la protéine BAX à un niveau voisin de celui observé avec des cellules provenant d'un sujet jeune.
TABLEAU III : Dosage de BAX par ELISA sandwich synthétisé par les kératinocytes.
Le tableau III illustre l'effet de la fraction active (FA) contenant une ou plusieurs substances biologiques actives sur l'expression de la protéine bax synthétisée par des kératinocytes humains issus d'expiants chirurgicaux provenant d'individus d'âges différents. Nombre de cellules identiques (106 cellules) dans chaque expérimentation, et cellules ayant un même nombre de passages (P1).
Dosage de bax par la méthode ELISA sandwich : expression des valeurs en D.O. révélation par la peroxydase après 48 heures d'incubation.
La concentration en fractions actives est de 1 %.
moyenne écart
(D.O) type
5 ans témoin (D 0,376 0,313 0,288 0,326 0,045
5 ans traité avec F.A. (2) 0,321 0,286 0,251 0,286 0,035
42 ans témoin (3) 0,471 0,419 0,386 0,425 0,043
42 ans avec F.A. (4) 0,342 0,316 0,293 0,317 0,025
61 ans témoin (5) 0,629 0,562 0,512 0,568 0,059
61 ans avec F.A. (6) 0,467 0,419 0,355 0,414 0,056
Vérification μ 0,434 0,386 0,348 0,389
(1) et (2) : différence = -0,040 variation (%) = -12,18 (3) et (4) : différence ≈ -0,108 variation (%) = -25,47 (5) et (6) : différence = -0,154 variation (%) = -27,13
Le tableau III est illustré par les figures 2 et 3. La synthèse de BAX par les kératinocytes s'accroît avec l'âge, et en présence de la fraction active (F.A.) celle-ci est diminuée.
La synthèse de BAX augmente avec l'âge. Le traitement des cellules par une solution à 1 % de fraction active abaisse la production de la protéine BAX à un niveau voisin de celui observé avec des cellules provenant d'un sujet jeune. Plus une cellule est âgée, plus le traitement par les fractions actives sont efficaces sur les kératinocytes. EXEMPLE II
Etude de la synthèse de la protéine BAX en présence de radicaux libres.
Les radicaux libres produits dans cette expérimentation sont obtenus par la xanthine xanthine-oxydase.
TABLEAU IV : Les radicaux libres stimulent la synthèse de la protéine BAX.
Figure imgf000014_0001
(1) et (2) : différence = 0,116 variation (%) = 35,52
(3) et (4) : différence = 0,045 variation (%) = 10,58
(5) et (6) : différence = 0,027 variation (%) = 4,76
Le tableau IV est illustré par les figures 4 et 5.
La réaction xanthine -xanthine oxydase produit des radicaux libres qui stimulent la synthèse de bax par les kératinocytes. Cette stimulation est moins forte sur les kératinocytes âgés. TABLEAU V : L'addition des fractions actives (F.A.) dans le milieu de culture rétablit une synthèse normale de la protéine BAX en présence de radicaux libres.
moyenne écart
(D.O) type
5 ans HX-XO (1) 0,466 0,448 0,410 0,441 0,029
5 ans HX-XO + F.A. 0,301 0,326 0,270 0,299 0,028
(2) 0,485 0,494 0,432 0,470 0,034
42 ans HX-XO 0,332 0,305 0,293 0,310 0,020
(3) 0,613 0,619 0,552 0,595 0,037
42 ans HX-XO + F.A. 0,408 0,403 0,341 0,384 0,037
(4)
61 ans HX-XO
(5)
61 ans HX-XO + F.A.
(6)
(1 ) et (2) : différence = -0,142 variation (%) = -32,25
(3) et (4) : différence = -0,160 variation (%) = -34,09
(5) et (6) différence = -0,211 variation (%) = -35,43
Le tableau V est illustré par les figures 6 et 7.
Le traitement par les fractions actives (F.A.) des kératinocytes cultivés en présence de radicaux libres diminue la synthèse de la protéine BAX. Si cette diminution est plus importante sur les cellules âgées, elle est à peu près constante en valeur relative quel que soit l'âge des cellules.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives, caractérisé en ce que l'on soumet une plante de la famille des Dictyotales à un séchage, et/ou à une lyophilisation puis à un broyage, suivi d'un ou plusieurs épuisements de la matière végétale par un solvant organique choisi dans le groupe formé des alcanols, des cétones, des alcanes à chaînes courtes, des cycloalcanes, des solvants halogènes, des solvants aromatiques, des esters, des éthers et similaires, pour obtenir un extrait organique de la plante, on sèche l'extrait organique par évaporation du solvant, on purifie l'extrait organique sec par une ou plusieurs étapes de purification réalisées successivement par affrontement liquide/liquide, par chromatographie sur colonne basse pression ou haute pression, par chromatographie liquide haute performance pour obtenir une ou plusieurs fractions actives des plantes de la famille des Dictyotales manifestant une action anti apoptotique par diminution de la synthèse des protéines apparentées à celles de la famille de BAX par les cellules.
2. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives selon la revendication 1, caractérisé en ce que les rapports utilisés entre la matière végétale et le solvant organique sont de préférence de 1 g de matière végétale sèche pour 5 ml de solvant, et les temps de contact entre la matière végétale et le solvant organique sont compris entre 12 heures et 5 jours.
3. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on utilise en tant que solvant organique l'acétone.
4. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la première étape de purification, réalisée par affrontement liquide/liquide, consiste à reprendre l'extrait sec acetonique par un mélange méthanol/eau affronté à de l'hexane, puis la phase hydrométhanolique est affrontée à l'éther.
5. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la deuxième étape de purification, réalisée par chromatographie sur colonne basse pression, consiste à éluer, sur un support gel de type Sephadex, la fraction éthérée biologiquement active par un gradient chloroforme/méthanol, puis à éluer une deuxième fraction résiduelle en rinçant la colonne par un mélange chloroforme/méthanol.
6. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la troisième étape de purification est réalisée par chromatographie liquide haute performance semi-préparative, sur un support silice greffée diol, avec un éluant hexane/isopropanol, et en ce que les fractions actives sont éluées entre 0 et 20 min, 25 et 35 min et/ou 40 et 50 min.
7. Les substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'une des revendications 1 à 6, présentant une action anti- apoptotique par diminution de la synthèse des protéines apparentées de la famille BAX.
8. Substances biologiquement actives selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'elles présentent en chromatographie liquide haute performance semi- préparative sur le support silice greffé diol et avec un éluant hexane/isopropanol, des temps de rétention compris entre 0 et 20 min, 25 et 35 min et/ou 40 et 50 min.
9. Compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires présentant une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse de la protéine BAX, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif une ou plusieurs substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'une des revendications 1 à 6, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, approprié à l'usage envisagé, et éventuellement un ou plusieurs principes actifs à action complémentaire.
10. Compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires selon la revendication 9, dans lesquelles l'excipient ou le véhicule inerte est l'un de ceux qui conviennent pour l'administration par voie digestive, parentérale, percutanée ou topique.
11. Utilisation des substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'une des revendications 1 à 6, en vue de la réalisation de compositions ou de formulations dépôt destinées à prévenir et/ou à traiter les affections impliquant une synthèse accrue de la protéine BAX.
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