FR2760192A1 - Procede d'obtention de nouvelles substances biologiquement actives, les substances ainsi obtenues et les compositions en refermant - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de nouvelles substances biologiquement actives d'origine marine, les substances biologiquement actives ainsi obtenues et les compositions en renfermant. Le procédé d'obtention de la présente invention est caractérisé en ce que l'on soumet une plante de la famille des Dictyotales à un séchage, et/ou à une lyophilisation puis à un broyage, suivi d'un ou plusieurs épuisements de la matière végétale par un solvant organique choisi dans le groupe formé des alcanols inférieurs, des cétones aliphatiques, des alcanes, des cycloalcanes, des solvants halogénés, des solvants aromatiques, des esters, des éthers et similaires, pour obtenir un extrait organique de la plante, on sèche l'extrait organique par évaporation du solvant, on purifie l'extrait organique sec par une ou plusieurs étapes de purification réalisées successivement par affrontement liquide/ liquide, par chromatographie sur colonne basse pression ou haute pression, par chromatographie liquide haute performance, pour obtenir une ou plusieurs fractions actives des plantes de la famille des Dictyotales manifestant une action anti apoptotique par diminution de la synthèse des protéines apparentées à celles de la famille de BAX. Les substances biologiquement actives de l'invention sont utilisées en vue de la réalisation de compositions ou de formulations dépôt destinés à prévenir ou à traiter les affections impliquant une synthèse accrue des protéines apparentées à celles de la famille de BAX.
Description
PROCEDE D'OBTENTION DE NOUVELLES SUBSTANCES
BIOLOGIQUEMENT ACTIVES, LES SUBSTANCES AINSI
OBTENUES ET LES COMPOSITIONS EN RENFERMANT
La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de nouvelles substances biologiquement actives d'origine marine, les substances biologiquement actives ainsi obtenues et les compositions en renfermant.
BIOLOGIQUEMENT ACTIVES, LES SUBSTANCES AINSI
OBTENUES ET LES COMPOSITIONS EN RENFERMANT
La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de nouvelles substances biologiquement actives d'origine marine, les substances biologiquement actives ainsi obtenues et les compositions en renfermant.
Ces nouvelles substances biologiquement actives sont extraites de plantes de la famille des Dictyotales.
Les compositions de la présente invention sont destinées à inhiber le programme de mort cellulaire des cellules d'eucaryotes, en diminuant la synthèse de la protéine BAX. Ces compositions manifestent ainsi une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse de la protéine BAX.
La découverte du phénomène de mort programmée, bien que non récente a fait une avancée importante ces dernières années grâce à l'immunologie et la biologie moléculaire qui mettent à la disposition des chercheurs, des anticorps et des antigènes objectivant les différents intervenants de l'apoptose. Aujourd'hui les principales étapes de l'apoptose sont relativement bien connues. La plupart des travaux sur l'arrêt du programme de mort sont tous conduits par l'amplification génomique des gènes codant les séquences peptidiques impliquées dans le développement de l'apoptose.
L'apoptose est régulée par deux familles de molécules de nature protéique appelées BAX et Bc12. Ces molécules ne sont actives que lorsqu'elles sont accouplées. Le couple hétérodimère : protéines venant de deux familles différentes comme BAX-Bcl2 annule ce programme de mort. Le couple homodimère du type bax-bax l'active. Par conséquent, si on diminue la synthèse de BAX, on augmentera la vie des cellules.
Les substances biologiquement actives de la présente invention interviennent en régulant la synthèse de BAX tout au long de la vie et en diminuant cette synthèse après une agression.
L'apoptose physiologique est essentielle à notre survie. Elle intervient dans notre morphogénése et elle est l'un des phénomènes majeurs du développement de notre cerveau. Chez les insectes, 'apoptose est l'un des phénomènes biologique majeur qui met en place la métamorphose, chez d'autres animaux elle joue un rôle prépondérant lors de la mue. Chez les mamifères et d'autres espèces elle régule les phénomènes immunitaires.
Les plantes desquelles sont extraites les substances biologiquement actives de l'invention, sont des Phéophycées, classe des Fucophyceae, ordre des Dictyotales, famille des Dictyotaceae. Seuls quelques genres appartiennent à la famille des
Dictyotales, il s'agit de Padina, Zonaria ou Dictyota. Le genre Padina regroupe les espèces les plus fréquentes. A titre d'exemple, il est possible de trouver sur le rivage de la Méditérranée les espèces pavonica, boyana (P. tenuis), boergesenii, sur les rives du Pacifique (non repris les espèces déjà citées) : arborescens, australis, boryana, caulens, commersonii, concrescens, crasse, durvillei, elegans, fernandeziana, fraseri, gymnospora, de même sur les rives de l'Océan Atlantique glabra, haitensis, distromatica, dubia. II existe aussi des espèces typiques de l'océan indien. L'une des caractéristiques de ces plantes est de fixer sur leur thalle une couche de carbonate de calcium de type aragonite ou orthorhombique à la surface des frondes. Cette caractéristique est obtenue par l'examen en diffraction
X de la poudre obtenue avec ces plantes. La diffraction des rayons X montre que la poudre de ces plantes présente des pics d'intensité notable aux angles 2 e caractéristiques de l'aragonite.
Dictyotales, il s'agit de Padina, Zonaria ou Dictyota. Le genre Padina regroupe les espèces les plus fréquentes. A titre d'exemple, il est possible de trouver sur le rivage de la Méditérranée les espèces pavonica, boyana (P. tenuis), boergesenii, sur les rives du Pacifique (non repris les espèces déjà citées) : arborescens, australis, boryana, caulens, commersonii, concrescens, crasse, durvillei, elegans, fernandeziana, fraseri, gymnospora, de même sur les rives de l'Océan Atlantique glabra, haitensis, distromatica, dubia. II existe aussi des espèces typiques de l'océan indien. L'une des caractéristiques de ces plantes est de fixer sur leur thalle une couche de carbonate de calcium de type aragonite ou orthorhombique à la surface des frondes. Cette caractéristique est obtenue par l'examen en diffraction
X de la poudre obtenue avec ces plantes. La diffraction des rayons X montre que la poudre de ces plantes présente des pics d'intensité notable aux angles 2 e caractéristiques de l'aragonite.
Une autre caractéristique de ces plantes est leur capacité de survie dans des conditions difficiles en préservant leur propre vie végétative et non en utilisant la sporulation. Des mécanismes identiques à cette plante sont retrouvés dans nos cellules. En effet, ces algues étaient présentes au début de la construction de notre arbre d'évolution.
La présente invention concerne un procédé d'obtention des substances biologiquement actives extraites de plantes de la famille des Dictyotales.
Dans un premier temps, la plante de la famille des Dictyotales est soumise, après récolte, à un séchage, si possible à l'abri de la lumière, pour garder intactes ses propriétés pharmacologiques.
On procède au séchage des plantes broyées ou brutes, par ventilation sans chauffage et on obtient ainsi un matériel végétal de couleur marron foncé sur lequel contrastent vivement les stries blanches de carbonate de calcium.
Une autre méthode, bien que moins économique, donne également satisfaction elle consiste à égoutter fortement les plantes, puis à les sécher sous vide d'air. La lyophilisation de la plante, broyée ou non, permet d'une manière avantageuse d' obtenir un produit anhydre.
Ces deux dernières techniques donnent un matériel de couleur vert brun foncé, très fragile et facilement réduit en poudre, ce qui facilite l'extraction par un solvant pour obtenir les substances biologiquement actives de l'invention.
L'intérêt d'une plante fortement séchée est d'obtenir une matière végétale qui se conserve bien (à l'abri de l'humidité) et à partir de laquelle il sera possible d'extraire la ou les substances actives, stabilisée(s) ou non, sans être gêné par la présence d'un solvant polaire. De plus, les plantes complètement séchées sont plus faciles à réduire en poudre.
Le procédé d'obtention des substances biologiquement actives est caractérisé en ce que l'on soumet une plante de la famille des Dictyotales à un séchage, et/ou à une lyophilisation, à un broyage, suivi d'un ou plusieurs épuisement de la matière végétale par un solvant organique choisi dans le groupe formé des alcanols (éthanol...), des cétones (acétone...), des alcanes à chaînes courtes (pentane, hexane, heptane...), des cycloalcanes (cyclohexane...), des solvants halogénés (chloroforme, dichlorométhane...), des solvants aromatiques, des esters (acétate d'éthyle...), des éthers et similaires, pour obtenir un extrait organique de la plante, on sèche l'extrait organique par évaporation du solvant, on purifie l'extrait organique sec par une ou plusieurs étapes de purification réalisées successivement par affrontement liquide/liquide, par chromatographie sur colonne basse pression ou haute pression, par chromatographie liquide haute performance, pour obtenir une ou plusieurs fractions actives des plantes de la famille des
Dictyotales manifestant une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse des protéines apparentées à celles de la famille de BAX par les cellules.
Dictyotales manifestant une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse des protéines apparentées à celles de la famille de BAX par les cellules.
Les solvants organiques peuvent être utilisés seul ou en association. De manière générale, on peut utiliser des solvants organiques miscibles à l'eau, ainsi que tous les solvants susceptibles d'extraire les substances actives des frondes de la plante.
Les solvants seront de préférence encore choisis parmi les solvants volatils dès lors que l'on désire obtenir des substances biologiquement actives débarrassées de solvant.
Le solvant organique sera de préférence l'acétone ou l'éthanol.
Lors de la macération, on a utilisé, avec de bons résultats, des rapports très variables de matière sèche par rapport au solvant. Les volumes mis en oeuvre pour une même quantité de matière sèche varient de 1 à 50. De même, les temps de contact entre le solvant organique et la matière végétale varient de 12 heures à 5 jours.
Dans le cas présent, la plante de la famille des Dictyotales une fois séchée, et/ou lyophylisée et broyée, est soumise à un ou plusieurs épuisements par la mise en contact de la plante avec de l'acétone, pendant 4 à 5 jours et dans les proportions de 1 gramme de matière végétale sèche pour 5 ml d'acétone.
L'extrait acétonique obtenu est séché par évaporation du solvant, puis purifié par les étapes de purification définies ci-après.
La premiére étape de purification est réalisée par affrontement liquide/liquide. Le résidu ou extrait sec acétonique est repris par un mélange méthanol/eau qui est affronté à de l'hexane. Dans un deuxième temps, la phase hydrométhanolique est affrontée, après concentration et dilution dans l'eau, à l'éther.
De cette manière, la phase éthérée finale est biologiquement active.
La deuxième étape de purification est réalisée par chromatographie sur colonne basse pression. Le support utilisé est un gel de type Sephadex LH 20 8.
L'élution s'effectue par un gradient chloroforme/méthanol. La fraction biologiquement active est éluée en chloroforme/méthanol dans les proportions 97/3 volume à volume. Lors du rinçage de la colonne par un mélange chloroforme/méthanol 70/30 on élue une deuxième fraction résiduelle.
L'étape suivante de purification a lieu par chromatographie liquide haute performance (HPLC) semi préparative. Les dimensions de la colonne sont de 250 mm de longueur et de 10 mm de diamètre. Le support utilisé est une silice greffée diol et l'éludant est un mélange hexane/isopropanol 95/5. Le débit est de 8 ml/min.
Les fractions actives sont éluées entre 0 et 20 min, 25 et 35 min et/ou 40 et 50 min.
Les autres fractions sont rejetées ou utilisées à d'autres fins.
D'autres étapes de purification sont encore enviseagable.
A l'issue de ces étapes de purification, on obtient une fraction biologiquement active constituée d'une ou plusieurs substances qui provoquent une diminution de la synthèse de BAX lors de la mise en contact avec des cellules.
Ainsi, les nouvelles substances biologiquement actives extraites de plantes de la famille des Dictyotales sont caractérisées en ce qu'elles présentent, lorsque les épuisements ont été effectués à l'acétone, des temps de rétention, en chromatographie liquide haute performance semi-préparative sur le support silice greffé diol et avec un éluant hexane/isopropanol 95/5, compris entre 0 et 20 min, 25 et 35 min et/ou 40 et 50 min.
On procède ensuite à différentes méthodes analytiques (spectres UV, IR, RMN, chromatographie sur couche mince...) qui permettent la caractérisation de la ou des substances biologiquement actives, extraites dans ces conditions des plantes de la famille des Dictyotales.
La présente invention a encore pour objet les nouvelles substances biologiquement actives susceptibles d'être ainsi obtenues, extraites de plantes de la famille des
Dictyotales.
Dictyotales.
Ces substances présentent une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse des protéines apparentées à celles de la famille de BAX, en particulier en présence de radicaux libres ou d'une élévation de température.
Ainsi les substances biologiquement actives permettent la stabilisation du phénomène de mort cellulaire induite dans les cellules souches, la prolongation de la vie cellulaire et la protection du capital cellulaire .
Les substances biologiquement actives selon l'invention, extraites de plantes de la famille des Dictyotales manifestent des propriétés pharmacologiques très intéressantes, et trouvent de ce fait un emploi en thérapeutique, en cosmétique, en alimentation, en diététique humaine et vétérinaire.
Les substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention sont utilisées en vue de la réalisation de compositions ou formulations dépôts destinés à prévenir et/ou à traiter les affections impliquant une synthèse accrue de la protéine BAX.
La présente invention concerne encore les compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires présentant une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse de la protéine BAX, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif une ou plusieurs substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, approprié à l'usage envisagé, et éventuellement un ou plusieurs principes actifs à action complémentaire.
Les compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires selon l'invention sont destinées à l'administration par voie digestive, parentérale, percutanée ou topique. Les compositions sont donc présentées sous forme de comprimés nus ou enrobés, de dragées, de capsules, de gélules, de pilules, de tablettes, de cachets, de sirops, de poudres à ingérer ou à usage externe ; de solutés ou de suspensions conditionnés en ampoules ; de crèmes, de gels ou de pommades ; de solutions à usage percutané dans un solvant polaire pénétrant.
La présente invention concerne également les formulations dépôt présentant une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse de la protéine BAX, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif une ou plusieurs substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, peu résorbable, et éventuellement un ou plusieurs principes actifs à action complémentaire.
Les exemples et résultats suivants illustrent l'invention. Ils ne la limitent en aucune façon.
EXEMPLE I
Etude de l'activité inhibitrice de la synthèse de la protéine BAX par les substances extraites de plantes de la famille des Dictyotales.
Etude de l'activité inhibitrice de la synthèse de la protéine BAX par les substances extraites de plantes de la famille des Dictyotales.
Le critère d'activité admis est l'inhibition de la synthèse de la protéine BAX.
Le dosage de BAX synthétisé par les kératinocytes est effectué par une méthode d'immuno absorption appelée ELISA sandwich.
Les cellules sont préparées selon la technique de Germain et col., à partir de prélèvements de peaux saines provenant de chirurgie esthétique. Après élimination du tissu adipeux, la peau est coupée en petits fragments de 2 mm X 2 mm qui sont incubés dans une solution de thermolysine (500 ,ug/ml du tampon HEPES) à 37 C pendant 2 heures. L'épiderme est alors séparé facilement du derme à l'aide de pinces stériles très fines. Les lambeaux d'épiderme ainsi détachés sont incubés dans une solution de trypsine (0,05 % dans le tampon HBSS)-EDTA (0,1 % dans le tampon HBSS) à 37 C pendant 30 minutes afin de dissocier les kératinocytes.
Après deux rinçages dans le tampon HBSS, les cellules kératinocytaires sont comptées à l'aide d'un Coulter Counter (Coultronics) puis mises en culture dans le milieu KMK (SIGMA).
Protocole exPérimental .
Les kératinocytes fraîchement isolés sont ensemencés à raison d'un million par boîte dans le milieu de culture KMK. Les cultures de kératinocytes sont traitées la veille avec 1 % d'une solution éthanolique contenant (boîtes essais) ou pas (boîtes témoins) le principe actif.
Le lendemain, les boîtes de culture sont mises dans un bain-marie à la température de 43" pendant 30 minutes. Elles sont ensuite transférées dans l'incubateur à CO2 à 37 C pendant encore 2 heures. Les cellules sont alors lysées par un tampon X 100 et la protéine BAX contenue dans le lysat cellulaire est dosée par la technique ELISA sandwich.
ELISA Sandwich . Dilution au 1/200 de l'anticorps monoclonal anti-bax dans un tampon carbonate
bicarbonate, pH : 9,6.
bicarbonate, pH : 9,6.
. Distribution de la solution d'anticorps dans une microplaque (96 puits) à raison
de 100 l/puits.
de 100 l/puits.
Incubation une nuit à 4 C (ou une heure à 37 C).
. Elimination du surnageant.
. Addition du lysat cellulaire (100 l/puits) contenant la protéine BAX.
Incubation à température ambiante pendant une heure.
Rinçage des puits 3 fois avec 200 pI du tampon PBS contenant 0,1 % de Tween
20.
20.
. Addition de la solution d'anticorps anti-bax (100 l/puits).
Incubation une heure à température ambiante.
Rinçage 3 fois avec 200 pI du tampon PBS contenant 0,1 % de Tween 20.
. Addition d'une solution du second anticorps anti-lgG de lapin couplé à la
peroxydase (50 l/puits).
peroxydase (50 l/puits).
Incubation à température ambiante pendant une heure.
Rinçage 3 fois avec 200 pLI du tampon PBS contenant 0,1 % de Tween 20.
. Addition du substrat (50 Ill/puits).
Incubation à température ambiante pendant 30 min.
. Addition de 10 pI/puits d'une solution d'acide sulfurique 1 N.
. Lecture de la microplaque à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques
(METERTECH).
(METERTECH).
Dosage de BAX par la méthode d'ELISA sandwich:
Les valeurs sont exprimées en densité optique (D.O.) (densité optique de la protéine BAX), la révélation se fait par la peroxydase.
Les valeurs sont exprimées en densité optique (D.O.) (densité optique de la protéine BAX), la révélation se fait par la peroxydase.
Comme indiqué précédemment la fraction active (F.A.) est éluée entre 0 et 20 min, 25 et 35 min et 40 et 50 min par HPLC semi-préparative sur support silice greffée diol. L'éluant est I'hexane/isopropanol 95/5.
La fraction non active (FNA) est éluée entre 20 et 25 min et 35 et 40 min.
TABLEAU I : Dosage de BAX sur une culture de kératinocytes humains.
<tb>
<SEP> moyenne <SEP> écart
<tb> <SEP> (D.O) <SEP> type
<tb> témoin <SEP> (1) <SEP> 0.166 <SEP> 0,219 <SEP> 0,196 <SEP> 0,198 <SEP> 0,194 <SEP> 0,195
<tb> FA: <SEP> 0-20. <SEP> 25-35 <SEP> et <SEP> 40-50 <SEP> min <SEP> (3) <SEP> 0,095 <SEP> 0,101 <SEP> 0,094 <SEP> 0,110 <SEP> 0,107 <SEP> 0,101 <SEP> 0,007
<tb> (1) et (2): différence non statistiquement significative: p = 58,43 % (1) et (3): différence statistiquement significative: p
L'addition de la fraction active contenant les substances biologiquement actives de l'invention dans la culture, permet une nette inhibition de la synthèse de BAX.
<tb> <SEP> (D.O) <SEP> type
<tb> témoin <SEP> (1) <SEP> 0.166 <SEP> 0,219 <SEP> 0,196 <SEP> 0,198 <SEP> 0,194 <SEP> 0,195
<tb> FA: <SEP> 0-20. <SEP> 25-35 <SEP> et <SEP> 40-50 <SEP> min <SEP> (3) <SEP> 0,095 <SEP> 0,101 <SEP> 0,094 <SEP> 0,110 <SEP> 0,107 <SEP> 0,101 <SEP> 0,007
<tb> (1) et (2): différence non statistiquement significative: p = 58,43 % (1) et (3): différence statistiquement significative: p
L'addition de la fraction active contenant les substances biologiquement actives de l'invention dans la culture, permet une nette inhibition de la synthèse de BAX.
TABLEAU Il : Dosage de BAX par ELISA sandwich synthétisé par les fibroblastes.
Le tableau Il illustre l'effet des fractions actives (FA) contenant une ou plusieurs substances biologiques actives sur l'expression de la protéine BAX synthétisée par des fibroblastes humains issus d'explants chirurgicaux provenant d'individus d'âges différents obtenus par la technique classique.
Nombre de cellules identique dans chaque expérimentation, et cellules au même nombre de passages.
Dosage de BAX par la méthode d'ELISA sandwich : expression des valeurs en
D.O, révélation par la peroxydase.
D.O, révélation par la peroxydase.
<tb>
<SEP> moyenne <SEP> écart
<tb> <SEP> (D.O) <SEP> type
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> non <SEP> traité <SEP> (1) <SEP> 0,049 <SEP> 0,049 <SEP> 0.047 <SEP> 0,052 <SEP> 0.075 <SEP> 0,054 <SEP> 0,012
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> traité <SEP> avec <SEP> F.A. <SEP> (2) <SEP> 0,064 <SEP> 0,053 <SEP> 0,050 <SEP> 0,060 <SEP> 0.051 <SEP> 0,056 <SEP> 0,006
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> non <SEP> traité <SEP> (3) <SEP> 0,149 <SEP> 0,136 <SEP> 0.132 <SEP> 0,141 <SEP> 0.130 <SEP> 0.138 <SEP> 0,008
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> traité <SEP> avec <SEP> F.A. <SEP> (4) <SEP> 0,081 <SEP> 0,069 <SEP> 0,063 <SEP> 0,080 <SEP> 0.060 <SEP> 0.071 <SEP> 0,010
<tb> (1) et (2): différence non statistiquement significative (1) et (4): différence non statistiquement significative (FA) : la concentration de la fraction active est de 1 % (les cultures de fibroblastes sont traitées avec 1 % d'une solution éthanolique contenant le principe actif).
<tb> <SEP> (D.O) <SEP> type
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> non <SEP> traité <SEP> (1) <SEP> 0,049 <SEP> 0,049 <SEP> 0.047 <SEP> 0,052 <SEP> 0.075 <SEP> 0,054 <SEP> 0,012
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> traité <SEP> avec <SEP> F.A. <SEP> (2) <SEP> 0,064 <SEP> 0,053 <SEP> 0,050 <SEP> 0,060 <SEP> 0.051 <SEP> 0,056 <SEP> 0,006
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> non <SEP> traité <SEP> (3) <SEP> 0,149 <SEP> 0,136 <SEP> 0.132 <SEP> 0,141 <SEP> 0.130 <SEP> 0.138 <SEP> 0,008
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> traité <SEP> avec <SEP> F.A. <SEP> (4) <SEP> 0,081 <SEP> 0,069 <SEP> 0,063 <SEP> 0,080 <SEP> 0.060 <SEP> 0.071 <SEP> 0,010
<tb> (1) et (2): différence non statistiquement significative (1) et (4): différence non statistiquement significative (FA) : la concentration de la fraction active est de 1 % (les cultures de fibroblastes sont traitées avec 1 % d'une solution éthanolique contenant le principe actif).
Le tableau Il est illustré par la figure 1.
La synthèse de BAX augmente avec l'âge. Le traitement des cellules par une solution à 1 % de fraction active abaisse la production de la protéine BAX à un niveau voisin de celui observé avec des cellules provenant d'un sujet jeune.
TABLEAU III Dosage de BAX par ELISA sandwich synthétisé par les kératinocytes.
Le tableau III illustre l'effet de la fraction active (FA) contenant une ou plusieurs substances biologiques actives sur l'expression de la protéine bax synthétisée par des kératinocytes humains issus d'explant chirurgicaux provenant d'individus d'âges différents.
Nombre de cellules identiques (106 cellules) dans chaque expérimentation, et cellules ayant un même nombre de passages (P1).
Dosage de bax par la méthode ELISA sandwich : expression des valeurs en D.O.
révélation par la peroxydase après 48 heures d'incubation.
La concentration en fractions actives est de 1 %.
<tb>
<SEP> moyenne <SEP> écart
<tb> <SEP> (D.O) <SEP> type
<tb> 5 <SEP> 5 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (1) <SEP> 0,376 <SEP> 0.313 <SEP> 0.288 <SEP> 0,326 <SEP> 0,045
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> traité <SEP> avec <SEP> F.A. <SEP> (2) <SEP> 0,321 <SEP> 0,286 <SEP> 0,251 <SEP> 0,286 <SEP> 0,035
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (3) <SEP> 0,471 <SEP> 0,419 <SEP> 0,386 <SEP> 0.425 <SEP> 0,043
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> avec <SEP> F.A. <SEP> (4) <SEP> 0,342 <SEP> 0,316 <SEP> 0.293 <SEP> 0,317 <SEP> 0,025
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (5) <SEP> 0,629 <SEP> 0.562 <SEP> 0,512 <SEP> 0,568 <SEP> 0,059
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> avec <SEP> F.A. <SEP> (6) <SEP> 0.467 <SEP> 0.419 <SEP> 0.355 <SEP> 0.414 <SEP> 0,056
<tb> Vérification <SEP> 11 <SEP> 0,434 <SEP> 0,386 <SEP> 0,348 <SEP> 0,389
<tb> (1) et (2): différence = -0,040
variation (%) = -12,18 (3) et (4) : différence = -0,108
variation (%) = -25,47 (5) et (6): différence = -0,154
variation (%) = -27,13
Le tableau III est illustré par les figures 2 et 3. La synthèse de BAX par les kératinocytes s'accroit avec l'âge, et en présence de la fraction active (F.A.) celle-ci est diminuée.
<tb> <SEP> (D.O) <SEP> type
<tb> 5 <SEP> 5 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (1) <SEP> 0,376 <SEP> 0.313 <SEP> 0.288 <SEP> 0,326 <SEP> 0,045
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> traité <SEP> avec <SEP> F.A. <SEP> (2) <SEP> 0,321 <SEP> 0,286 <SEP> 0,251 <SEP> 0,286 <SEP> 0,035
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (3) <SEP> 0,471 <SEP> 0,419 <SEP> 0,386 <SEP> 0.425 <SEP> 0,043
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> avec <SEP> F.A. <SEP> (4) <SEP> 0,342 <SEP> 0,316 <SEP> 0.293 <SEP> 0,317 <SEP> 0,025
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (5) <SEP> 0,629 <SEP> 0.562 <SEP> 0,512 <SEP> 0,568 <SEP> 0,059
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> avec <SEP> F.A. <SEP> (6) <SEP> 0.467 <SEP> 0.419 <SEP> 0.355 <SEP> 0.414 <SEP> 0,056
<tb> Vérification <SEP> 11 <SEP> 0,434 <SEP> 0,386 <SEP> 0,348 <SEP> 0,389
<tb> (1) et (2): différence = -0,040
variation (%) = -12,18 (3) et (4) : différence = -0,108
variation (%) = -25,47 (5) et (6): différence = -0,154
variation (%) = -27,13
Le tableau III est illustré par les figures 2 et 3. La synthèse de BAX par les kératinocytes s'accroit avec l'âge, et en présence de la fraction active (F.A.) celle-ci est diminuée.
La synthèse de BAX augmente avec l'âge. Le traitement des cellules par une solution à 1 % de fraction active abaisse la production de la protéine BAX à un niveau voisin de celui observé avec des cellules provenant d'un sujet jeune.
Plus une cellule est âgée, plus le traitement par les fractions actives sont efficaces sur les kératinocytes.
EXEMPLE Il
Etude de la synthèse de la protéine BAX en présence de radicaux libres.
Etude de la synthèse de la protéine BAX en présence de radicaux libres.
Les radicaux libres produits dans cette expérimentation sont obtenus par la xanthine xanthine-oxydase.
TABLEAU IV: Les radicaux libres stimulent la synthèse de la protéine BAX.
<tb>
<SEP> moyenne <SEP> écart
<tb> <SEP> (DO) <SEP> type
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (1) <SEP> 10.376 <SEP> 0.313 <SEP> 0.288 <SEP> 0,326 <SEP> 0.045
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (2) <SEP> 0,466 <SEP> 0,448 <SEP> 0.410 <SEP> 0,441 <SEP> 0,029
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (3) <SEP> 0.471 <SEP> 0,419 <SEP> 0,386 <SEP> 0.425 <SEP> 0,043
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (4) <SEP> 0,485 <SEP> 0,494 <SEP> 0.432 <SEP> 0,470 <SEP> 0.034
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (5) <SEP> 0,629 <SEP> 0,562 <SEP> 0.512 <SEP> 0.568 <SEP> 0,059
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (6) <SEP> 0,613 <SEP> 0,619 <SEP> 0,552 <SEP> 0.595 <SEP> 0.037
<tb> (1) et (2): différence = 0,116
variation (%) = 35,52 (3) et (4): différence = 0,045
variation (%) = 10,58 (5) et (6) : différence = 0,027
variation (%) = 4,76
Le tableau IV est illustré par les figures 4 et 5.
<tb> <SEP> (DO) <SEP> type
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (1) <SEP> 10.376 <SEP> 0.313 <SEP> 0.288 <SEP> 0,326 <SEP> 0.045
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (2) <SEP> 0,466 <SEP> 0,448 <SEP> 0.410 <SEP> 0,441 <SEP> 0,029
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (3) <SEP> 0.471 <SEP> 0,419 <SEP> 0,386 <SEP> 0.425 <SEP> 0,043
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (4) <SEP> 0,485 <SEP> 0,494 <SEP> 0.432 <SEP> 0,470 <SEP> 0.034
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> témoin <SEP> (5) <SEP> 0,629 <SEP> 0,562 <SEP> 0.512 <SEP> 0.568 <SEP> 0,059
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (6) <SEP> 0,613 <SEP> 0,619 <SEP> 0,552 <SEP> 0.595 <SEP> 0.037
<tb> (1) et (2): différence = 0,116
variation (%) = 35,52 (3) et (4): différence = 0,045
variation (%) = 10,58 (5) et (6) : différence = 0,027
variation (%) = 4,76
Le tableau IV est illustré par les figures 4 et 5.
La réaction xanthine -xanthine oxydase produit des radicaux libres qui stimulent la synthèse de bax par les kératinocytes. Cette stimulation est moins forte sur les kératinocytes âgés.
TABLEAU V : L'addition des fractions actives (F.A.) dans le milieu de culture rétablit une synthèse normale de la protéine BAX en présence de radicaux libres.
<tb>
<SEP> moyenne <SEP> écart
<tb> <SEP> (D.O) <SEP> type
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (1) <SEP> 0,466 <SEP> 0.448 <SEP> 0,410 <SEP> 0,441 <SEP> 0,029
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> + <SEP> F.A. <SEP> (2) <SEP> 0,301 <SEP> 0,326 <SEP> 0,270 <SEP> 0,299 <SEP> 0.028
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (3) <SEP> 0,485 <SEP> 0,494 <SEP> 0,432 <SEP> 0,470 <SEP> 0,034
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> + <SEP> F.A. <SEP> (4) <SEP> 0,332 <SEP> 0,305 <SEP> 0,293 <SEP> 0,310 <SEP> 0,020
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (5) <SEP> 0,613 <SEP> 0.619 <SEP> 0,552 <SEP> 0,595 <SEP> 0,037
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> + <SEP> F.A. <SEP> (6) <SEP> 0,408 <SEP> 0,403 <SEP> 0,341 <SEP> 0,384 <SEP> 0,037
<tb> (1 ) et (2): différence = -0,142
variation (%) = -32,25 (3) et (4): différence = -0,160
variation (%) = -34,09 (5) et (6): différence = -0,211
variation (%)=-35,43
Le tableau V est illustré par les figures 6 et 7.
<tb> <SEP> (D.O) <SEP> type
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (1) <SEP> 0,466 <SEP> 0.448 <SEP> 0,410 <SEP> 0,441 <SEP> 0,029
<tb> 5 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> + <SEP> F.A. <SEP> (2) <SEP> 0,301 <SEP> 0,326 <SEP> 0,270 <SEP> 0,299 <SEP> 0.028
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (3) <SEP> 0,485 <SEP> 0,494 <SEP> 0,432 <SEP> 0,470 <SEP> 0,034
<tb> 42 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> + <SEP> F.A. <SEP> (4) <SEP> 0,332 <SEP> 0,305 <SEP> 0,293 <SEP> 0,310 <SEP> 0,020
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> (5) <SEP> 0,613 <SEP> 0.619 <SEP> 0,552 <SEP> 0,595 <SEP> 0,037
<tb> 61 <SEP> ans <SEP> HX-XO <SEP> + <SEP> F.A. <SEP> (6) <SEP> 0,408 <SEP> 0,403 <SEP> 0,341 <SEP> 0,384 <SEP> 0,037
<tb> (1 ) et (2): différence = -0,142
variation (%) = -32,25 (3) et (4): différence = -0,160
variation (%) = -34,09 (5) et (6): différence = -0,211
variation (%)=-35,43
Le tableau V est illustré par les figures 6 et 7.
Le traitement par les fractions actives (F.A.) des kératinocytes cultivés en présence de radicaux libres diminue la synthèse de la protéine BAX. Si cette diminution est plus importante sur les cellules âgées, elle est à peu près constante en valeur relative quelque soit l'âge des cellules.
Claims (11)
1. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives, caractérisé
ce que l'on soumet une plante de la famille des Dictyotales à un séchage,
et/ou à une lyophilisation puis à un broyage, suivi d'un ou plusieurs
épuisements de la matière végétale par un solvant organique choisi dans le
groupe formé des alcanols, des cétones, des alcanes à chaînes courtes, des
cycloalcanes, des solvants halogénés, des solvants aromatiques, des esters,
des éthers et similaires, pour obtenir un extrait organique de la plante, on
sèche l'extrait organique par évaporation du solvant, on purifie l'extrait
organique sec par une ou plusieurs étapes de purification réalisées
successivement par affrontement liquide/liquide, par chromatographie sur
colonne basse pression ou haute pression, par chromatographie liquide haute
performance pour obtenir une ou plusieurs fractions actives des plantes de la
famille des Dictyotales manifestant une action anti apoptotique par diminution
de la synthèse des protéines apparentées à celles de la famille de BAX par
les cellules.
2. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives selon la
revendication 1, caractérisé en ce que les rapports utilisés entre la matière
végétale et le solvant organique sont de préférence de 1 g de matière
végétale sèche pour 5 ml de solvant, et les temps de contact entre la matière
végétale et le solvant organique sont compris entre 12 heures et 5 jours.
3. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives selon les
revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on utilise en tant que solvant
organique l'acétone.
4. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives selon l'une des
revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la première étape de purification,
réalisée par affrontement liquide/liquide, consiste à reprendre l'extrait sec
acétonique par un mélange méthanol/eau affronté à de l'hexane, puis la
phase hydrométhanolique est affrontée à l'éther.
5. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives selon l'une des
revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la deuxième étape de purification,
réalisée par chromatographie sur colonne basse pression, consiste à éluer,
sur un support gel de type Sephadex, la fraction éthérée biologiquement
active par un gradient chloroforme/méthanol, puis à éluer une deuxième
fraction résiduelle en rinçant la colonne par un mélange
chloroforme/méthanol.
6. Procédé d'obtention des substances biologiquement actives selon l'une des
revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la troisième étape de purification
est réalisée par chromatographie liquide haute performance semi-préparative,
sur un support silice greffée diol, avec un éluant hexane/isopropanol, et en ce
que les fractions actives sont éluées entre 0 et 20 min, 25 et 35 min et/ou 40
et 50 min.
7. Les substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues selon ie
procédé de l'une des revendications 1 à 6, présentant une action anti
apoptotique par diminution de la synthèse des protéines apparentées de la
famille BAX.
8. Substances biologiquement actives selon la revendication 7, caractérisées en
ce qu'elles présentent en chromatographie liquide haute performance semi
préparative sur le support silice greffé diol et avec un éluant
hexane/isopropanol, des temps de rétention compris entre 0 et 20 min, 25 et
35 min et/ou 40 et 50 min.
9. Compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires présentant
une action anti-apoptotique par diminution de la synthèse de la protéine BAX,
caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif une ou
plusieurs substances biologiquement actives susceptibles d'être obtenues
selon le procédé de l'une des revendications 1 à 6, en association ou en
mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, approprié à
l'usage envisagé, et éventuellement un ou plusieurs principes actifs à action
complémentaire.
10. Compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires selon la
revendication 9 dans lesquelles l'excipient ou le véhicule inerte est l'un de
ceux qui conviennent pour l'administration par voie digestive. parentérale.
percutanee ou topique.
11. Utilisation des substances biologiquement actives susceptibles d'être
obtenues selon le procédé de l'une des revendications 1 à 6, en vue de la
réalisation de compositions ou de formulations dépôt destinés à prévenir
et/ou à traiter les affections impliquant une synthèse accrue de la protéine
BAX.
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| FR9702506A FR2760192B1 (fr) | 1997-03-03 | 1997-03-03 | Procede d'obtention de nouvelles substances biologiquement actives, les substances ainsi obtenues et les compositions en refermant |
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Publications (2)
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Cited By (2)
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| FR2803523A1 (fr) * | 2000-01-10 | 2001-07-13 | Texinfine Sa | Nouvelles compositions a base d'extraits de dictyotales et leur utilisation |
| FR2827303A1 (fr) * | 2001-07-13 | 2003-01-17 | Texinfine Sa | Procede d'obtention d'une preparation titree d'algues et les preparations titrees en resultant |
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1997
- 1997-03-03 FR FR9702506A patent/FR2760192B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-03-03 WO PCT/FR1998/000410 patent/WO1998039019A1/fr active Application Filing
- 1998-03-03 AU AU68376/98A patent/AU6837698A/en not_active Abandoned
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| KYOKO HAYASHI ET AL.: "A SCREENING STRATEGY FOR SELECTION OF ANTI-HSV-1 AND ANTI-HIV EXTRACTS FROM ALGAE", PHYTOTHERAPY RESEARCH, vol. 10, 1996, pages 233 - 237, XP002048307 * |
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| V. KOSOVEL ET AL.: "ALGAE AS POSSIBLE SOURCES OF ANTITUMORAL AGENTS.", PHARMACOLOGICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 20, no. SUP V, 1988, pages 27 - 31, XP002048306 * |
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| WO2001051069A1 (fr) * | 2000-01-10 | 2001-07-19 | Texinfine S.A. | Utilisation d'extraits de dictyotales en vue de la production d'une composition topique |
| FR2827303A1 (fr) * | 2001-07-13 | 2003-01-17 | Texinfine Sa | Procede d'obtention d'une preparation titree d'algues et les preparations titrees en resultant |
| WO2003006685A1 (fr) * | 2001-07-13 | 2003-01-23 | Texinfine S.A. | Procede d'obtention d'une preparation titree d'algues et les preparations titrees en resultant |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| WO1998039019A1 (fr) | 1998-09-11 |
| FR2760192B1 (fr) | 1999-05-21 |
| AU6837698A (en) | 1998-09-22 |
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