WO1998030573A1 - Antiadhäsive sulfatid-mimetika - Google Patents

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WO1998030573A1
WO1998030573A1 PCT/EP1998/000111 EP9800111W WO9830573A1 WO 1998030573 A1 WO1998030573 A1 WO 1998030573A1 EP 9800111 W EP9800111 W EP 9800111W WO 9830573 A1 WO9830573 A1 WO 9830573A1
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cooh
disease
compound
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PCT/EP1998/000111
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Alexander Töpfer
Gerhard KRETSCHMAR
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Glycorex Ab
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/14—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to a sulfur, selenium or tellurium atom of a saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the invention relates to mimetics of the so-called sulfatides (3-O-sulfated galactosylceramides) in which the natural ceramide is substituted by a simple dialkylated unit.
  • This aglycone can be attached either O-, S- or C-glycosidic.
  • these mimetics can be used instead of one or more
  • the invention also relates to the preparation of these compounds and their use in the manufacture of medicaments and diagnostics.
  • blood cells such as B. leukocytes, neutrophils, granulocytes and
  • monocytes are a multi-stage, very complex process that is only known in partial steps (Review: T. A. Springer, Cell 76, 301 - 314, 1994).
  • receptors Numerous specific signaling molecules such as interleukins, leukotrienes and tumor necrosis factor (TNF), their G-protein coupled receptors and in particular tissue-specific cell adhesion molecules are involved in this process, which ensure a precisely controlled recognition of the immune and endothelial cells.
  • the most important adhesion molecules involved which will be referred to below as receptors, include the selectins (E-, P- and L-selectins), integrins and the members of the immunoglobulin superfamily. The three selectin receptors determine the initial phase of leukocyte adhesion.
  • E-selectin is expressed on endothelial cells a few hours after stimulation, for example by interleukin-1 (IL-1 ⁇ ) or tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ), while P-selectin is stored in platelets and endothelial cells and after stimulation by thrombin, peroxide radicals or substance P is presented on the cell surfaces, among other things.
  • L-selectin is permanently expressed on leukocytes, but is quickly cleaved from the leukocytes again in the course of the inflammation.
  • Reperfusion injuries such as myocardial ischemia / infarction (MI), acute pneumonia after surgery, traumatic shock and stroke, psoriasis, dermatitis, ARDS (respiratory distress syndrome in adults) as well as the re-occurring after surgical interventions (example angioplasty and by-pass operations) Stenosis.
  • MI myocardial ischemia / infarction
  • psoriasis dermatitis
  • ARDS respiratory distress syndrome in adults
  • Fig. 1 sulfatide
  • the aim of this work is to provide more effective inhibitors of leukocyte adhesion, which are derived from the sulfatide (FIG. 1).
  • Sulfatide analogues with sulfate or carboxymethyl groups on various hydroxyl groups of galactose or glucose and an ⁇ - or ⁇ -glycosidic ceramide have already been synthesized and examined biologically (EP 671 406, EP 671 407 and AU 9537864-A; Bristol-Myers Squibb).
  • a mimetic which is identical to the natural sulfatide apart from the ceramide glycon has also been described (US 5,486,536; University of Michigan; without data).
  • the 3-0 sulfated galactose has a 2,2-dialkylethyl radical at the anomeric center.
  • the object of the present invention is to provide sulfatide mimics which, instead of the ceramide, have a 1,2-dialkylated glycerol building block as aglycon and are acid-stable. These should also be much easier and cheaper to manufacture.
  • R 1 , R 2 independently of one another - (CH 2 ) n -CH 3 , where n is an integer from 10 to 30, R 3 - R 6 independently of one another OH, OSO 3 H, OCH 2 COOH, CH (COOH) 2
  • R 1 and R 2 are particularly preferably - (CH 2 ) 15 -CH 3 and X are oxygen.
  • R 3 and R 4 or R 3 and R 6 are optionally OSO 3 H.
  • a compound of formula 1a which is characterized in that X is oxygen,
  • R 3 and R 4 mean OSO 3 H and R 5 and R 6 OH.
  • R 3 and R 4 are OSO 3 H
  • R 5 and R 6 are O-benzylidene.
  • R 4 and R 5 are OH.
  • R 1 and R 2 - (CH 2 ) 15 -CH 3 R 3 and R 6 are OSO 3 H and R 4 and R 5 are O-isopropylidene.
  • a further preferred embodiment of the present invention is a compound of the formula I in which X is CH 2 O and R 1 and R 2 - (CH 2 ) 15 -CH 3 :
  • a compound of formula 1e which is particularly characterized in that
  • R 3 and R 4 O-benzoyl
  • R 5 and R 6 are OCH 2 COOH.
  • R 3 and R 4 optionally denote OH, the other variables having the meanings mentioned under No. 5.
  • R 6 is CH (COOH) 2 .
  • R 3 , R 4 and R 5 can optionally be O-benzyl, the other variables having the meanings given under No. 7 (compound 1f).
  • X is preferably sulfur and R 1 and R 2 - (CH 2 ) 15 -CH 3 in formula
  • R 3 and R 4 are O (CH 2 ) 2 CH (COOH) 2 and R 5 and R 6 are O-benzylidene.
  • R 5 and R 6 are OH.
  • the object set at the outset is further achieved by a process for the preparation of a compound of the formula I, which is characterized in that a peracetylated glycosyl donor, preferably a peracetylated galactosyltrichloroacetimidate, preferably the imidate 2a, with an alcohol of the formula III,
  • Variables R 1 and R 2 have the meanings mentioned, preferably with the readily available compounds 3 or 5, to give the corresponding O-glycoside or S-glycoside (for example compounds 4 and 6, respectively).
  • a 1-O-acetyl-substituted and otherwise perbenzylated glycosyl donor for example compound 2b (FIG. 3)
  • trimethylsilyl cyanide after which the anomer Cyanide, for example compound 7 (FIG. 3), converts to a methyl ester (for example compound 8 in FIG. 3) which reduces to a C-1-hydroxymethylglycoside (for example compound 9 in FIG. 3) and with a two-chain alkyl donor, for example compound 10 (in FIG. 3).
  • the benzyl protective groups have been split off (for example by hydrogenolysis), the free hydroxyl groups are functionalized with the preferred acidic groups.
  • C-1-hydroxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl- ⁇ -D-galactopyranoside 9 can be prepared, which is combined with the bromide 10 (or the corresponding tosylate or triflate) to the C- Glycoside 11 is alkylated.
  • the compounds 4, 6 and 11 are deprotected to the compounds 12, 15 and 19 and derivatized to the compounds of the formula I.
  • Fig. 5 If, instead of the ⁇ -glycosides just presented, the corresponding glycosides are to be synthesized, the corresponding perbenzylated donor is used instead of the peracetylated donor 2a for the synthesis of the O- and S-glycosides.
  • the various options for controlling the anomeric configuration in glycosylations are well known.
  • the desired parameters can be changed by changing the experimental parameters - when introducing the cyanide - such as solvent, catalyst and temperature as well as the choice of the leaving group anomeric configuration of the cyanide can be obtained.
  • the affinity of the compounds of the formula I according to the invention for selectins can be checked using the cell adhesion assays described below.
  • ligands and adhesion molecules have a wide variety of specificities, the desired specificity of the assay can only be achieved via the binding partner.
  • Genetically engineered soluble fusion proteins from the extracytoplasmic domain of E- or P-selectin and the constant region of a human immunoglobulin of the IgG1 subclass were used as binding partners.
  • ELAM-Rg The genetic construct "ELAM-Rg", published by Walz et al., In 1990, was used to produce soluble L-selectin-IgG1 fusion protein.
  • the plasmid DNA was transfected into COS-7 cells (ATCC) using DEAE dextran (molecular biological methods: see Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Struhl, K. and Smith, JA 1990. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, New York).
  • the culture supernatant is obtained, freed from cells and cell fragments by centrifugation and brought to 25 mM Hepes pH 7.0, 0.3 mM PMSF, 0.02% sodium azide and stored at + 4 ° C. (Walz, G., Aruffo, A., Kolanus, W., Bevilacqua, M. and Seed, B. 1990. Recognition by ELAM-1 of the sialyl-Lex determinant on myeloid and tumor cells. Science 250, 1132-1135 .)
  • CD62Rg published by Aruffo et al., 1991, is used to produce the soluble P-selectin-IgG1 fusion protein.
  • the further procedure corresponds to the production of L-selectin-IgG1 shown under A1.
  • CD4 IgG1 hinge
  • the genetic construct "CD4: IgG1 hinge” published by Zettlemeissl et al., 1990 is used to produce the soluble CD4-IgG1 fusion protein.
  • the further procedure corresponds to the production of L-selectin-IgG1 shown under A1.
  • 96-well microtiter test plates (Nunc Maxisorb) are incubated with 100 ⁇ l of a goat anti-human IgG antibody (Sigma) diluted in 50 mM Tris pH 9.5 (1 + 100) for 2 hours at room temperature. After removing the antibody solution, it is washed once with PBS.
  • the composition of the blocking buffer is:
  • binding buffer has the composition: 50 mM Hepes, pH 7.5; 100 mM NaCl; 1 mg / ml BSA;
  • test substance 5 ⁇ l of the test substance are pipetted in, mixed by swirling the plate and incubated for 10 minutes at room temperature.
  • the microplate is completely immersed in the stop buffer at a 45 angle (25 mM Tris, pH 7.5; 125 mM NaCl; 0.1% BSA;
  • the stop buffer is removed from the wells by inverting and the procedure is repeated twice.
  • the BCECF-AM-labeled cells adhering to the well are measured in a cytofluorimeter (Millipore) with a sensitivity setting of 4, an excitation wavelength of 485/22 nm and an emission wavelength of 530/25 nm.
  • the first phase which is decisive for the further disease process, is the activation of leukocytes within the bloodstream, especially in the pre- and postcapillary area.
  • the leukocytes After the leukocytes have left the axial flow of the blood, the leukocytes first attach to the inner wall of the vessel, i.e. on the vascular endothelium. All subsequent leukocyte effects, i.e. the active migration through the vessel wall and the subsequent oriented migration in the tissue are foam reactions (Harlan, J.M., Leukocyte-endothelial interaction, Blood 65, 513 - 525, 1985).
  • Integrins and 3. selectins While the adhesion between molecules of the Ig gene superfamily and the protein-protein bonds takes place, the focus in the cooperation between selectins is lectin-carbohydrate bonds (Springer, TA, adhesion receptors of the immune system. Nature 346, 425 - 434, 1990; Huges, G., Cell adhesion molecules - the key to an universal panacea, Scrips Magazine 6, 30 -
  • the test substance is applied i.v. on animals (10mg / kg).
  • the experimental increase in blood cell adhesion is triggered by systemic administration of lipopolysaccharide (LPS, 15 mg / kg) 15 minutes after application from the test substance by cytokine activation (Foster SJ, Mc Cormick LM, Ntolosi BA and Campbell D., Production of TNF-alpha by LPS-stimulated murine, rat and human blood and its pharmacological modulation, Agents and Actions 38, C77 - C79, 1993, January 18, 1995).
  • LPS lipopolysaccharide
  • Arrhythmias measured (total test duration approx. 90 min). In 6 of 7 untreated hearts perfused with leukocytes, pronounced arrhythmias occur due to leukocyte infiltration, while the hearts treated with an active substance (RGDS peptide, chondroitin sulfate) develop reduced leukocyte accumulation and arrhythmias.
  • the investigated compound 3a was in the range of approx.
  • the compounds according to the present invention and their physiologically tolerable salts are very suitable for use as medicinal products in mammals, in particular the
  • the present invention therefore further relates to a medicament comprising at least one compound of the formula I and the use thereof for the manufacture of a medicament for the therapy or prophylaxis of diseases which are associated with excessive cell adhesion mediated by selectin receptors in the tissue affected by the disease, for example rheumatism , Cardiovascular diseases such as reperfusion injuries, ischemia or heart attack.
  • the medicinal products are particularly suitable for the treatment of acute and chronic inflammations, which can be characterized pathophysiologically by a disturbance in the cell circulation, for example lymphocytes, monocytes and neutrophilic granulocytes.
  • autoimmune diseases such as acute polyarthritis, rheumatoid arthritis and insulin-dependent diabetes (diabetes mellitus IDDM), acute and chronic graft rejection, shock lung (ARDS, adult respiratory distress syndrome), inflammatory and allergic skin diseases such as psoriasis and contact eczema, Cardiovascular diseases such as myo- cardiac infarction, reperfusion injuries after thrombolysis, angioplasty or by-pass surgery, septic shock and systemic shock.
  • ARDS adult respiratory distress syndrome
  • Cardiovascular diseases such as myo- cardiac infarction, reperfusion injuries after thrombolysis, angioplasty or by-pass surgery, septic shock and systemic shock.
  • Another potential indication is the treatment of metastatic tumors, because tumor cells carry surface antigens that have both sialyl Lewis X and sialyl Lewis A structures as recognition epitopes.
  • these drugs which are stable in the acidic environment of the stomach, can also be used in combination with antibiotics for the anti-adhesive therapy of Helicobacter pylori and related microorganisms. Therapy of the cerebral form of malaria is also conceivable with the help of these drugs.
  • the medicaments according to the invention are generally administered intravenously, orally or parenterally or as implants, but rectal use is also possible in principle.
  • Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, tablets, dragées, (micro) capsules, suppositories, syrups, emulsions, suspensions, aerosols, drops or injectable solutions in ampoule form and preparations with a protracted active ingredient release, in the case of which Manufacture usually find carriers and additives and / or auxiliaries such as explosives, binders, coatings, swelling agents, lubricants or lubricants, flavors, sweeteners or solubilizers.
  • Examples of commonly used carriers or auxiliaries are Magnesium carbonate, titanium dioxide, lactose, mannitol and other sugars, talc, milk protein, gelatin, starch, vitamins, cellulose and their derivatives, animal and vegetable oils, polyethylene glycols and solvents such as sterile water, alcohols, glycerol and polyhydric alcohols.
  • the pharmaceutical preparations are preferably produced and administered in dosage units.
  • Fixed dosage units are tablets, capsules and suppositories.
  • the daily dose can be administered either as a single dose in the form of a single dose unit or else several small dose units or as a multiple dose divided at certain intervals.
  • the daily dose to be administered may also depend on the number of receptors expressed during the course of the disease. It is conceivable that only a few receptors are expressed on the cell surface in the initial stage of the disease and, consequently, the daily dose to be administered is lower than in the case of severely diseased patients.
  • the medicaments according to the invention are produced by bringing a compound according to the present invention into a suitable administration form with conventional carriers and, if appropriate, additives and / or auxiliaries.
  • Connection 16 is established from 15 analogously to connection 13.
  • Compound 18 is prepared by alkylation of 16 with 17 in dimethylformamide with sodium hydride.
  • Cyanide 7 is treated with sodium methoxide solution and then acidified with 1 M hydrochloric acid. The methyl ester 8 is obtained. This is reduced to ether 9 with ethereal lithium aluminum hydride solution at 0 ° C.
  • C-glycoside 11 is obtained by alkylation of 9 with 10.
  • Compound 10 is obtained by bromination of compound 3.
  • Compound 19 is obtained by hydrogenolysis of 11 with 10% palladium-carbon in a hydrogen atmosphere under normal pressure.
  • Compound 21 is prepared by bromination of compound 20.
  • Compound 1f is prepared by malonylating compound 21 with dimethyl malonate followed by alkaline saponification.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Mimetika der Formel (I) der sogenannten Sulfatide (3-O-sulfatierte Galactosylceramide), bei denen das natürliche Ceramid durch eine einfache dialkylierte Einheit substituiert ist. Die Anknüpfung dieses Aglycons kann sowohl O-, S- oder C-glycosidisch erfolgen. Des weiteren können diese Mimetika statt einer, auch mehrere Sulfat- oder andere saure Gruppen enthalten. Die Erfindung betrifft ausserdem die Herstellung dieser Verbindungen, deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln und Diagnostika. In der Formel (I) bedeuten R1, R2 unabhängig voneinander -(CH¿2?)n-CH3, n eine ganze Zahl von 10 bis 30, R?3-R6¿ unabhängig voneinander OH, OSO¿3?H, OCH2COOH, CH(COOH)2, O(CH2)2CH(COOH)2 oder nicht-toxische Salze der entsprechenden Säuren, mit der Maßgabe, daß mindestens ein Rest R?3-R6¿ ungleich OH ist, wobei die Hydroxy-Gruppen mit Schutzgruppen wie beispielsweise Benzyl, Benzyliden oder Isopropyliden versehen sei können, und X O, S, (CH¿2?)2O oder CH2O.

Description

Beschreibung
Antiadhäsive Sulfatid-Mimetika
Die Erfindung betrifft Mimetika der sogenannten Sulfatide (3-O-sulfatierte Galacto- sylceramide) bei denen das natürliche Ceramid durch eine einfache dialkylierte Einheit substituiert ist. Die Anknüpfung dieses Aglycons kann sowohl O-, S- oder C-gly- cosidisch erfolgen. Desweiteren können diese Mimetika statt einer, auch mehrere
Sulfat- oder andere saure Gruppen enthalten. Die Erfindung betrifft außerdem die Herstellung dieser Verbindungen sowie deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln und Diagnostika.
Die Zirkulation von Blutzellen wie z. B. Leukozyten, Neutrophilen, Granulozyten und
Monozyten ist auf molekularer Ebene ein vielstufiger, sehr komplexer Prozess, der nur in Teilschritten bekannt ist (Review: T. A. Springer, Cell 76, 301 - 314, 1994).
Jüngste Forschungsergebnisse zeigten, daß die in der Immunüberwachung ent- scheidende Rezirkulation der Lymphozyten sowie die Lokalisierung von Neutrophilen und Monozyten an Entzündungsherden sehr ähnlichen molekularen Mechanismen gehorchen. So kommt es bei akuten und chronischen Entzündungsprozessen zur Adhäsion der Leukozyten an Endothelzellen und Auswanderung in den Entzündungsherd und in die sekundären lymphatischen Organe.
An diesem Vorgang sind zahlreiche spezifische Signalmoleküle wie z.B. Interleuki- ne, Leukotriene und Tumornekrosefaktor (TNF), deren G-Protein gekoppelte Rezeptoren und insbesondere gewebespezifische Zelladhäsionsmoleküle beteiligt, die eine genau kontrollierte Erkennung der Immun- und Endothelzellen gewährleisten. Zu den wichtigsten hierbei beteiligten Adhäsionsmolekülen, die im folgenden als Rezeptoren bezeichnet werden sollen, gehören die Selektine (E-, P- und L-Selektine), Integrine und die Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie. Die drei Selektinrezeptoren bestimmen die Anfangsphase der Leukozytenadhäsion. E-Selektin wird auf Endothelzellen einige Stunden nach der Stimulierung beispielsweise durch lnterleukin-1 (IL-1 ß) oder Tumornekrosefaktor (TNF-α) exprimiert, während P-Selektin in Blutplättchen und Endothelzellen gespeichert wird und nach Sti- mulierung durch Thrombin, Peroxidradikale oder Substanz P u. a. auf den Zelloberflächen präsentiert wird. L-Selektin wird dauerhaft auf Leukozyten exprimiert, wird im Verlauf der Entzündung jedoch rasch wieder von den Leukozyten abgespalten.
Die in der Anfangsphase entzündlicher Prozesse durch Selektin-Rezeptoren ver- mittelte Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen ist eine natürliche und notwendige Immunantwort auf diverse Entzündungsreize und Verletzungen des vasculären Gewebes. Der Verlauf einer Reihe von akuten und chronischen Erkrankungen wird jedoch durch die übermäßige Adhäsion von Leukozyten und deren Infiltration in das betroffene Gerwebe sowie durch die Schädigung gesunden Gewebes im Sinne ei- ner Autoimmunreaktion ungünstig beeinflußt. Dazu zählen beispielsweise Rheuma,
Reperfusionsverletzungen wie myokardiale Ischämie/Infarkt (MI), akute Lungenentzündung nach operativem Eingriff, traumatischer Schock und Schlaganfall, Psoria- sis, Dermatitis, ARDS (Atemnotsyndrom bei Erwachsenen) sowie die nach chirurgischen Eingriffen (Beispiel Angioplastie und By-Pass Operationen) auftretende Re- Stenose.
Der natürliche Ligand mit der Struktur des komplexen Oligosaccharids Sialyl Lewis- X (SLeX) wurde schon erfolgreich in Tierversuchen bei P-Selektin abhängigen Lungenverletzungen (M. S. Mulligan et al., Nature 1993, 364, 149) und bei myokardialen Reperfusionsverletzungen (M. Buerke et al., J. Clin. Invest. 1994, 93, 1140) verwendet. In ersten klinischen Prüfungen bei Myokarinfarkt mußten jedoch Dosen von mehreren Gramm dieses Wirkstoffes verabreicht werden, da derselbe nur eine sehr geringe Bioverfügbarkeit besitzt (Mitteilung der Firma Cytel Corp/La Jolla, CA., publiziert in Scrip No 2137, 14 Juni 1996, Seite 22). Diese hohe Wirkstoffdosis steht auch im Einklang mit der bekanntermaßen schwachen Affinität der natürlichen SleX/A-
Liganden zu den Selektin-Rezeptoren in statischen in vitro-Testsystemen: So inhi- biert SLeX in allen bekannten in vitro-Testsystemen die Zelladhäsion an Selektinre- zeptoren erst bei einer relativ hohen Konzentration im Bereich von IC50 ca.1 mM oder darüber (Jacob et al., Biochemistry 1995, 34, 1210).
Neben SLeX/A-Liganden inhibieren auch verschiedene anionische Polymere wie
Heparin, Fucoidan und Dextransulfat die P-Selektin vermittelte Zelladhäsion (Skin- ner, M. P., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 164, 1373 - 1379, 1989 und J. Biol. Chem., 266, 5371 - 5374, 1991). Außerdem binden die sogenannten Sulfatide (3-O-sulfatierte Galactosylceramide), die von aktivierten Granulozyten produziert werden, an P-Selektin (Aruffo, A. et al., Cell 67, 35 - 44, 1991).
Figure imgf000005_0001
R = I( CC HH.2U)7 CC HH,. Hαuptkom ponente
Figure imgf000005_0002
R = N eben kom onente
Figure imgf000005_0003
Fig. 1 : Sulfatid
Ziel dieser Arbeiten ist die Bereitstellung wirksamerer Inhibitoren der Leukozytenadhäsion, die sich vom Sulfatid (Fig. 1) ableiten.
Sulfatidanaloga mit Sulfat- oder Carboxymethylgruppen an verschiedenen Hydroxy- gruppen der Galactose oder Glucose und einem α- oder ß-glycosidischen Ceramid sind bereits synthetisiert und biologisch untersucht worden (EP 671 406, EP 671 407 und AU 9537864-A; Bristol-Myers Squibb). Auch ein Mimetikum welches bis auf das Ceramidaglycon mit dem natürlichen Sulfatid identisch ist wurde bereits beschrieben (US 5,486,536; University of Michigan; ohne Daten). Die 3-0 sulfatierte Galactose weist am anomeren Zentrum einen 2,2-Dialkylethylrest auf.
Der Nachteil dieser Sulfatidanaloga liegt in der aufwendigen Synthese des Agly- cons, besonders im Falle des Ceramids.
Alle bisher beschriebenen Sulfatidanaloga haben ferner den Nachteil, daß diese Verbindungen eine glycosidische und damit säurelabile Bindung aufweisen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Sulfatidmi- metika, welche statt des Ceramids einen 1,2-dialkylierten Glycerinbaustein als Agly- con aufweisen und säurestabil sind. Diese sollten außerdem wesentlich einfacher und billiger herstellbar sein.
Die gestellte Aufgabe wird gelöst durch eine Verbindung der Formel I
Figure imgf000006_0001
worin bedeuten
R1, R2 unabhängig voneinander -(CH2)n-CH3, wobei n eine ganze Zahl von 10 bis 30, R3 - R6 unabhängig voneinander OH, OSO3H, OCH2COOH, CH(COOH)2
O(CH2)2CH(COOH)2 oder nicht-toxische Salze der entsprechenden Säuren, mit der Maßgabe, daß mindestens ein Rest R3 - R6 ungleich OH ist, wobei die Hydroxy-Gruppen mit Schutzgruppen wie beispiels weise Benzyl, Benzyliden oder Isopropyliden versehen sein können, und X O, S, (CH2)2O oder CH2O.
Nachfolgend sind Beispiele für Verbindungen mit den genannten, bevorzugten Ei- genschaften angeführt, welche vorzugsweise mit den sauren Gruppen -OSO3H,
-OCH2COOH, -CH(COOH)2 und -O-(CH2)2CH(COOH)2 substituiert sind.
Besonders bevorzugt bedeuten R1 und R2 -(CH2)15-CH3 und X Sauerstoff. Wahlweise bedeuten R3 und R4 oder R3 und R6 OSO3H.
1. Eine Verbindung der Formel 1a, die sich dadurch auszeichnet, daß X Sauerstoff,
R1 und R2 -(CH2)15-CH3
R3 und R4 OSO3H und R5 und R6 OH bedeuten.
Figure imgf000007_0001
2. Eine Verbindung der Formel 1b, die sich dadurch auszeichnet, daß X Sauerstoff,
R1 und R2 -(CH2)15-CH3 R3 und R4 OSO3H und R5 und R6 O-Benzyliden bedeuten.
Figure imgf000008_0001
1 b
3. Eine Verbindung der Formel 1c, die sich dadurch auszeichnet, daß X Sauerstoff,
R1 und R2 -(CH2)15-CH3
R3 und R6 OSO3H und
R4 und R5 OH bedeuten.
Figure imgf000008_0002
4. Eine Verbindung der Formel 1d, die sich dadurch auszeichnet, daß X Sauerstoff,
R1 und R2 -(CH2)15-CH3 R3 und R6 OSO3H und R4 und R5 O-Isopropyliden bedeuten.
Figure imgf000009_0001
Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der Formel I, in welcher X CH2O und R1 und R2 -(CH2)15-CH3 bedeuten:
Eine Verbindung der Formel 1e, die sich insbesondere dadurch auszeichnet, daß
X CH2O,
R1 und R2 _(CH2)15-CH3
R3 und R4 O-Benzoyl und
R5 und R6 OCH2COOH bedeuten.
Figure imgf000009_0002
1e 6. Wahlweise bedeuten R3 und R4 OH, wobei die übrigen Variablen die unter Nr. 5 genannten Bedeutungen haben.
7. Eine Verbindung, die sich dadurch auszeichnet, daß X CH2O,
R1 und R2 -(CH2)15-CH3
R3, R4 und R5 OH und
R6 CH(COOH)2 bedeuten.
Wahlweise können R3, R4 und R5 O-Benzyl bedeuten, wobei die übrigen Variablen die unter Nr. 7 angegebenen Bedeutungen haben (Verbindung 1f).
Figure imgf000010_0001
1 f
Vorzugsweise bedeuten X Schwefel und R1 und R2 -(CH2)15-CH3 in Formel
9. Eine Verbindung der Formel 1g, die sich insbesondere dadurch auszeichnet, daß
X Schwefel,
R1 und R2 -(CH2)15-CH3
R3 und R4 O(CH2)2CH(COOH)2 und R5 und R6 O-Benzyliden bedeuten.
Figure imgf000011_0001
10. Eine Verbindung, die sich dadurch auszeichnet, daß ferner X Schwefel
R1 und R2 -(CH2)15-CH3
R3 und R4 O(CH2)2CH(COOH)2 und
R5 und R6 OH bedeuten.
Die eingangs gestellte Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, welches sich dadurch auszeichnet, daß man einen peracetylierten Glycosyldonor, vorzugsweise ein peracetyliertes Galactosyltri- chloracetimidat, vorzugsweise das Imidat 2a, mit einem Alkohol der Formel III,
'OFM
OR
oder einen Mercaptan der Formel V,
wobei die
Figure imgf000011_0002
Variablen R1 und R2 die genannten Bedeutungen haben, vorzugsweise mit den leicht erhältlichen Verbindungen 3 oder 5, zum entsprechenden O-Glycosid bzw. S-Glycosid umsetzt (beispielsweise Verbindungen 4 bzw. 6).
Nach Abspaltung der Acetylschutzgruppen wird ein Teil der freien Hydroxylgruppen entweder direkt oder nach entsprechender Schützung der übrigen Hydroxylgruppen mit den sauren Gruppen, vorzugsweise -OSO3H, -OCH2COOH, -CH(COOH)2 oder -O-(CH2)2CH(COOH)2, versehen, wonach gegebenenfalls die eingeführten Schutzgruppen wieder abgespalten werden.
Zur Herstellung der C-glycosidisch verknüpften Verbindungen (s. Nr. 5 bis 8) wird vorzugsweise ein 1-O-Acetyl-substituierter und im übrigen perbenzylierter Glycosyldonor, beispielsweise Verbindung 2b (Fig. 3), mit Trimethylsilylcyanid umgesetzt, wonach man das anomere Cyanid, beispielsweise Verbindung 7 (Fig. 3), zu einem Methylester umsetzt (beispielsweise Verbindung 8 in Fig. 3), der zu einem C-1-Hy- droxymethylglycosid (z. B. Verbindung 9 in Fig. 3) reduziert und mit einem zweiketti- gen Alkyldonor, beispielsweise Verbindung 10 (in Fig. 3), alkyliert wird. Nach Abspaltung der Benzylschutzgruppen (beispielsweise durch Hydrogenolyse) werden die freien Hydroxylgruppen mit den bevorzugten sauren Gruppen funktionalisiert.
Ausgehend von 2b läßt sich beispielsweise C-1-Hydroxymethyl-2,3,4,6-tetra-O- benzyl-ß-D-galactopyranosid 9 herstellen, welches mit dem Bromid 10 (oder dem entsprechenden Tosylat oder Triflat) zum C-Glycosid 11 alkyliert wird.
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
Fig. 3
Die Verbindungen 4, 6 und 11 werden zu den Verbindungen 12, 15 und 19 entschützt und zu den Verbindungen der Formel I derivatisiert.
Figure imgf000014_0001
Fig 4 11
Figure imgf000015_0001
Fig. 5 Sollen statt der soeben vorgestellten ß-Glycoside, die entsprechenden -Glycoside synthetisiert werden, so wird zur Synthese der O- und S-Glycoside statt des peracetylierten Donors 2a, der entsprechende perbenzylierte Donor verwendet. Die verschiedenen Möglichkeiten zur Steuerung der anomeren Konfiguration bei Glycosy- lierungen sind hinreichend bekannt.
Auch bei der Synthese der C-Glycoside, beispielsweise über das anomere Cyanid 7 (Fig. 3), kann durch Veränderung der experimentellen Parameter - bei der Cyanid- einführung - wie Lösungsmittel, Katalysator und Temperatur sowie der Wahl der Ab- gangsgruppe, die gewünschte anomere Konfiguration des Cyanids erhalten werden.
Bei der anschließenden Behandlung des anomeren Cyanids mit methanolischer Na- triummetanolatlösung ist zu beachten, daß aufgrund der CH-Acidität der C-glycosi- dischen Cyanide und Carbonsäureester, beispielsweise der Verbindungen 7 und 8 (Fig. 3) bei zu hohem pH-Wert das α-Cyanid (z. B. 7α) zum ß-Ester (z. B. 8ß, Fig. 3) isomerisiert. Dieser Effekt, der bei der gezielten Synthese der ß-C-Glycoside durchaus erwünscht ist, läßt sich bei der Synthese der α-C-Glycoside dadurch ausschließen, daß mit ausreichend verdünnter Methanolatlösung gearbeitet wird.
Die in den Abbildungen vorgestellten Entschützungsreaktionen wie Debenzylierung und Deacetylierung sowie die Einführung verschiedener Schutzgruppen (z. B. Benzyliden, Isopropyliden) und saurer Gruppen (z. B. Sulfat, Carboxymethyl, Malonyl) sind dem Fachmann hinreichend bekannt und bedürfen keiner besonderen Erläuterung.
Die Affinität der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I an Selektine kann anhand der nachfolgend beschriebenen Zelladhäsionsassays überprüft werden.
Primärassays zur Untersuchung der Wirkung der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Zellanheftung an rekombinante, lösliche Selektin-Fusions- proteine. Um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Interaktion zwischen den E- und P-Selektinen (alte Nomeklatur ELAM-1 bzw. GMP-140) mit ihren Liganden zu testen, wird ein Assay verwendet, der jeweils nur für eine dieser Interaktionen spezifisch ist. Die Liganden werden in ihrer natürlichen Form als Oberflä- chenstrukturen auf promyelozytischen HL60 Zellen angeboten. Da HL60 Zellen
Liganden und Adhäsionsmoleküle unterschiedlichster Spezifität aufweisen, kann die gewünschte Spezifität des Assays nur über den Bindungspartner erbracht werden. Als Bindungspartner wurden gentechnisch hergestellte lösliche Fusionsproteine aus der jeweils extrazytoplasmatischen Domäne von E- bzw. P-Selektin und der kon- stanten Region eines humanen Immunglobulins der Subklasse lgG1 verwendet.
Herstellung von L-Selektin-lgG1
Zur Herstellung von löslichem L-Selektin-lgG1 Fusionsprotein wurde das von Walz et al., 1990 publizierte genetische Konstrukt "ELAM-Rg" verwendet. Zur Expression wurde die Plasmid DNA in COS-7 Zellen (ATCC) mittels DEAE-Dextran transfiziert (Molekularbiologische Methoden: siehe Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Struhl, K. und Smith, J. A. 1990. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, New York). Sieben Tage nach der Transfection wird der Kulturüberstand gewonnen, durch Zentrifugation von Zellen und Zellfragmenten befreit und auf 25 mM Hepes pH 7,0, 0,3 mM PMSF, 0,02 % Natriumazid gebracht und bei + 4 °C aufgehoben. (Walz, G., Aruffo, A., Kolanus, W., Bevilacqua, M. und Seed, B. 1990. Recognition by ELAM-1 of the sialyl-Lex determinant on myeloid and tumor cells. Science 250, 1132 - 1135.)
Herstellung von P-Selektin-lgG1
Zur Herstellung des löslichen P-Selektin-lgG1 Fusionsproteins wird das von Aruffo et al., 1991 publizierte genetische Konstrukt "CD62Rg" verwendet. Die weitere Vor- gehensweise entspricht der unter A1 dargestellten Herstellung von L-Selektin-lgG1. Aruffo, A., Kolanus, W., Walz, G., Fredman, P. und Seed, B. 1991. CD62/-P-Selectin recognition of myeloid and tumor cell sulfatides. Cell 67, 35 - 44.
Herstellung von CD4-lgG1
Zur Herstellung des löslichen CD4-lgG1 Fusionsproteins wird das von Zettlemeissl et al., 1990 publizierte genetische Konstrukt "CD4:lgG1 hinge" verwendet. Die weitere Vorgehensweise entspricht der unter A1 dargestellten Herstellung von L-Selektin- lgG1. (Zettelmeissl, G., Gregersen, J.-P., Duport, J. M., Mehdi, S., Reiner, G. und Seed, B. 1990. Expression and characterization of human CD4: Immunoglobulin
Fusion Proteins. DNA and Cell Biology 9, 347 - 353.)
Durchführung des HL60 Zelladhäsionsassays auf rekombinanten, löslichen Adhäsionsmolekülen
1. 96er Mikrotitertestplatten (Nunc Maxisorb) werden mit 100 μl eines in 50 mM Tris pH 9,5 verdünnten (1 + 100) Ziege anti human IgG Antikörpers (Sigma) 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Antikörperlösung wird einmal mit PBS gewaschen.
2. 150 μl des Blockierungspuffers werden für 1 Std. bei Raumtemperatur in den Näpfchen belassen. Die Zusammensetzung des Blockierungspuffers ist:
0,1 % Gelatine, 1 % BSA, 5 % Kalbserum, 0,2 mM PMSF, 0,02 % Natriuma- zid. Nach Entfernen des Blockierungspuffers wird einmal mit PBS ge- waschen.
3. In die Näpfchen werden je 100 μl Zellkulturüberstand von entsprechend transfektierten und exprimierenden COS-Zellen pipettiert. Die Inkubation erfolgt 2 Std. bei Raumtemperatur. Nach Entfernen des Zellkulturüberstandes wird einmal mit PBS gewaschen. 4. In die Näpfchen werden 20 μl Bindungspuffer gegeben. Der Bindungspuffer hat die Zusammensetzung: 50 mM Hepes, pH 7,5; 100 mM NaCI; 1 mg/ml BSA;
2 mM MgCI2; 1mM CaCI2; 3 mM MnCI2; 0,02 % Natriumazid; 0,2 mM PMSF.
Dazu werden 5 μl der Testsubstanz pipettiert, durch Schwenken der Platte vermischt und 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert.
5. 50 ml einer HL60 Zellkultur mit 200.000 Zellen/ml werden 4 Min. bei 350 g zentrifugiert. Das Pellet wird in 10 ml RPMI 1640 resuspendiert und die Zellen erneut zentrifugiert. Zur Markierung der Zellen werden 50 μg BCECF-AM (Molecular Probes) in 5 μl wasserfreiem DMSO aufgelöst; anschließend werden 1 ,5 ml RPMI 1640 auf die BCECF-AM/DMSO-Lösung gegeben. Mit dieser Lösung werden die Zellen resuspendiert und 30 Min. bei 37°C inkubiert. Nach zweiminütiger Zentrifugation bei 350 g wird das markierte Zellpellet in
11 ml Bindungspuffer resuspendiert und die resuspendierten Zellen in 100 μl Aliquots in die Mikrotiterplatten-Näpfchen verteilt. Die Platte wird 10 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen, um die Zellen auf den Boden der Testplatte sedimentieren zu lassen. Dabei haben die Zellen Gelegenheit an das beschichtete Plastik zu adhärieren.
6. Zum Abstoppen des Tests wird die Mikrotiterplatte im 45 Winkel gänzlich in den Stoppuffer getaucht (25 mM Tris, pH 7,5; 125 mM NaCI; 0,1 % BSA;
2 mM MgCI2; 1 mM CaCI2; 3 mM MnCI2; 0,02 % Natriumazid). Durch Invertie- rung wird der Stoppuffer aus den Näpfchen entfernt und die Prozedur noch zweimal wiederholt.
7. Die Messung der in den Näpfchen festhaftenden, BCECF-AM-markierten Zellen erfolgt in einem Cytofluorimeter (Millipore), bei einer Empfindlichkeitsein- Stellung von 4, einer Anregungswellenlänge von 485/22 nm und einer Emissionswellenlänge von 530/25 nm. Leukozyten-Adhäsion - Prüfung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen in vivo (Intravitalmikroskopie an der Ratte):
Bei entzündlichen Prozessen und anderen, die Zytokine aktivierenden Zuständen spielt die Gewebszerstörung durch einwandernde oder die MikroZirkulation blockierende Leukozyten eine entscheidende Rolle. Die erste und für den weiteren Krankheitsprozeß entscheidende Phase ist die Aktivierung von Leukozyten innerhalb der Blutbahn, insbesondere im prä- und postkapillären Bereich. Dabei kommt es, nachdem die Leukozyten den Axialstrom des Blutes verlassen haben, zu einem ersten Anheften der Leukozyten an der Gefäßinnenwand, d.h. am Gefäßendothel. Alle darauf folgenden Leukozyteneffekte, d.h. die aktive Durchwanderung durch die Gefäßwand und die anschließende orientierte Wanderung im Gewebe, sind Foigereaktio- nen (Harlan, J. M., Leukocyte-endothelial interaction, Blood 65, 513 - 525, 1985).
Diese rezeptorvermittelte Interaktion von Leukozyten und Endothelzellen wird als ein initiales Zeichen des Entzündungsprozesses angesehen. Neben den schon physiologisch exprimierten Adhäsionsmolekülen kommt es unter der Einwirkung von Entzündungsmediatoren (Leukotriene, PAF) und Zytokinen (TNF-alpha, Interleukinen) zur zeitlich gestuften, massiven Expression von Adhäsionsmolekülen auf den Zellen. Sie werden derzeit in drei Gruppen eingeteilt: 1. Immunglobulin-Gensuperfamilie, 2.
Integrine und 3. Selektine. Während die Adhäsion zwischen Molekülen der Ig-Gen- superfamilie und den Protein-Protein-Bindungen abläuft, stehen bei der Kooperation zwischen Selektinen Lektin-Kohlehydrat-Bindungen im Vordergrund (Springer, T. A., Adhesion receptors of the immune System. Nature 346, 425 - 434, 1990; Huges, G., Cell adhesion molecules - the key to an universal panacea, Scrips Magazine 6, 30 -
33, 1993; Springer, T. A., Traffic Signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration; The multistep paradigm. Cell 76, 301 - 314, 1994).
Methode: Die induzierte Adhäsion von Leukozyten wird mit einer intravitaimikroskopischen
Untersuchungstechnik im Mesenterium der Ratte quantifiziert (Atherton A. and Born G.V.R., Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphnu- clear leukocytes to blood vessel walls. J. Physiol. 222, 447 - 474, 1972). Unter Inhalations-Athernarkose wird eine Dauernarkose durch intramuskuläre Injektion von Urethan (1 ,25 mg/kg KG) eingeleitet. Nach Freipräparation von Gefäßen (V. femora- lis zur Injektion von Substanzen und A. carotis zur Blutdruckmessung) werden Katheter in diese eingebunden. Danach wird das entsprechende transparente Gewebe (Mesenterium) nach den in der Literatur bekannten Standardmethoden freigelegt und auf dem Mikroskoptisch ausgelagert und mit 37 °C warmen Paraffinöl überschichtet (Menger, M. D. and Lehr, H., A. Scope and perspetives of intravital microscopy-bridge over from in vitro to in vivo, Immunology Today 14, 519 - 522,
1993). Die Applikation der Testsubstanz erfolgt i.v. am Tier (10mg/kg). Die experimentelle Erhöhung der Blutzell-Adhäsion wird durch systemische Verabreichung von Lipopolysaccharid (LPS, 15 mg/kg) 15 Min. nach Applikation aus Testsubstanz durch Zytokin-Aktivierung ausgelöst (Foster S. J., Mc Cormick L.M., Ntolosi B. A. and Campbell D., Production of TNF-alpha by LPS-stimulated murine, rat and human blood and its pharmacological modulation, Agents and Actions 38, C77 - C79, 1993, 18.01.1995). Die dadurch verursachte erhöhte Adhäsion von Leukozyten am Endothel wird direkt vitalmikroskopisch oder mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen quantifiziert. Alle Meßvorgänge werden per Videokamera aufgenommen und auf einem Videorekorder gespeichert. Über einen Zeitraum von 60 Min. wird alle 10 Min. die Anzahl der rollenden Leukozyten (d.h. alle sichtbar rollenden Leukozyten, die langsamer als die strömenden Erythrozyten sind) und die Anzahl an haftenden Leukozyten am Endothel (Verweildauer länger als 5 Sek.) erfaßt. Nach Beendigung des Versuches werden die narkotisierten Tiere schmerzfrei durch systemische Injektion von T61 exzitationsfrei eingeschläfert. Zur Auswertung werden die Ergebnisse jeweils von 8 behandelten mit 8 unbehandelten Tieren (Kontrollgruppe) verglichen (Angabe der Ergebnisse in Prozenten).
Reperfusionsmodell zur Untersuchug des Einflusses der Adhäsion von Neutrophilen im Verlauf der Ischämie/Reperfusion am offenen Kaninchen-Herzen: Die Herzen werden bei konstantem Druck nach der Langendorff-Technik mit Nährlösung sowie mit/ohne Leukozyten bzw. Wirkstoff perfundiert. Danach wird eine Ischämie durch Unterbinden der linken Koronarartherie (30 min) hervorgerufen. Nach Reperfusion (30 min) wird die Leukozytenakkumulierung histologisch ausge- wertet. Im Versuchsverlauf werden außerdem an 256 Elektroden Potentiale und
Arrhythmien gemessen (Gesamtversuchsdauer ca. 90 min). Bei 6 von 7 unbehan- delten mit Leukozyten perfundierten Herzen treten ausgeprägte Arrhythmien aufgrund der Leukozyteninfiltration auf, während die mit einem Wirkstoff (RGDS-Pepti- de, Chondroitinsulfat) behandelten Herzen verminderte Leukozyten Akkumulierung und Arrhythmien entwickeln. Die untersuchte Verbindung 3a war im Bereich von ca.
1 μM hochwirksam (starke Verminderung der Arrhythmien).
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sowie deren physiologisch verträglichen Salze eignen sich aufgrund ihrer wertvollen pharmakologischen Eigen- Schäften sehr gut zur Anwendung als Heilmittel bei Säugern, insbesondere dem
Menschen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ferner ein Arzneimittel enthaltend wenigstens eine Verbindung gemäß Formel I sowie deren Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie oder Prophylaxe von Krankheiten, welche mit einer übermäßigen, durch Selektinrezeptoren vermittelten Zelladhäsion in dem von der Krankheit betroffenen Gewebe einhergehen, beispielsweise Rheuma, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, wie Reperfusionsverletzungen, Ischämie oder Herzinfarkt. Die Arzneimittel eignen sich im besonderen zur Behandlung von akuten und chroni- sehen Entzündungen, die sich pathophysiologisch durch eine Störung der Zellzirkulation, beispielsweise von Lymphozyten, Monozyten und neutrophilen Granulozyten, kennzeichnen lassen. Hierzu zählen Autoimmunerkrankungen wie akute Polyarthri- tis, rheumatoide Arthritis und Insulin-abhängige Diabetes (Diabetes mellitus IDDM) akute und chronische Transplantatabstoßungen, Schocklunge (ARDS, adult respira- tory distress syndrome), entzündliche und allergische Hauterkrankungen wie beispielsweise Psoriasis und Kontakt-Ekzeme, Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Myo- kardinfarkt, Reperfusionsverletzungen nach Thrombolyse, Angioplastie oder By- Pass-Operationen, septischer Schock und systemischer Schock. Eine weitere potentielle Indikation ist die Behandlung metastasierender Tumoren, denn Tumorzellen tragen Oberflächenantigene, die sowohl Sialyl-Lewis-X als auch Sialyl -Lewis-AStrukturen als Erkennungsepitope besitzen. Darüberhinaus können diese Arzneimittel, die stabil im sauren Milieu des Magens sind, zur antiadhäsiven Therapie von Helicobacter pylori und verwandten Mikroorganismen ggf. auch in Kombination mit Antibiotika eingesetzt werden. Ferner ist mit Hilfe dieser Arzneimittel eine Therapie der cerebralen Form der Malaria denkbar.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen intravenös, oral oder parenteral oder als Implantate verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro-) Kapseln, Zäpf- chen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lösungen in Ampullenform sowie Präparate mit protrahierte Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung üblicherweise Trägerstoffe und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig ver- wendete Träger- oder Hilfsstoffe seien z.B. Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Vitamine, Cel- lulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche öle, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Alkohole, Glycerin und mehrwertige Alkohole genannt.
Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht. Feste Dosierungseinheiten sind Tabletten, Kapseln und Suppositorien.
Für die Behandlung eines Patienten sind je nach Wirksamkeit der Verbindung, Art der Applikation, Art und Schwere der Erkrankung, Alter und Körpergewicht des Pa- tienten, unterschiedliche Tagesdosen notwendig. Unter Umständen kennen jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber mehrerer kleiner Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilten Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen. Die zu verabreichende Tagesdosis kann außerdem von der Anzahl der während des Krankheitsverlaufs expri- mierten Rezeptoren abhängig sein. Es ist vorstellbar, daß im Anfangsstadium der Krankheit nur wenige Rezeptoren auf der Zelloberfläche exprimiert werden und demzufolge die zu verabreichende Tagesdosis geringer ist als bei stark erkrankten Patienten.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden dadurch hergestellt, daß man eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung mit üblichen Träger- sowie gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffen in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.
Ferner ist die Verwendung von Verbindungen gemäß der Formel I für die Herstellung eines Mittels zur Diagnose einer Krankheit, welche mit einer übermäßigen, durch Selektinrezeptoren vermittelten Zelladhäsion in dem von der Krankheit betrof- fenen Gewebe einhergeht, denkbar.
Beispiele für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen:
Beispiel 1 :
a) Synthese von 3-hydroxy-1 ,2-di-hexadecyloxy-propan (3): Eine Mischung aus NaH (3,55 g, 148,2 mmol), (R)-3-Benzyloxy-1 ,2-propandiol (9 g, 49,4 mmol) und Dimethylformamid (675 ml) wird 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird 1-Bromhexadecan (42,2 ml, 138,32 mmol) zugetropft. Nach 18 h wird Eiswasser zugegeben, dreimal mit Diethylether extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte dreimal mit Wasser gewaschen. Es wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und chromatografϊert (Hexan - Hexan/Essigester 50 : 1 - 20 : 1 - 10 : 1). Man erhält (R)-3-Benzyloxy-1,2-di-hexadecyloxy-propan (30,8 g; 99 %). Diese Verbindung wird in Methanol/Dioxan/Essig-säure (2 : 3 : 0,01 ; 255 ml) gelöst, mit Pd/C (10 %; 5 g) versetzt und 18 h in einer Wasserstoffatmosphäre unter Normal- druck hydriert. Es wird filtriert, eingeengt und der Rückstand chromatografiert (Hexan/Essigester 6 : 1 → 5 : 1). Man erhält Verbindung 3 (21 ,38 g, 81 %). 1H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ = 0.88 (2t, 6H, 2CH3), 1.28 (m, 52H, 26 (CH)2), 1.58 (m, 4H, 2 (CH)2), 2.19 (dd, 1 H, OH), 3.40-3.77 (m, 9H, 4 O(CH)2, O(CH)).
b) Synthese von 2,3-di-hexadecyloxy-propyl-O-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galac topyranosid (4): Zu einer Mischung aus O-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-D-galactopyranosyl)-trichloraceti- midat (3 g, 6,1 mmol) und Verbindung 3 (4,1 g, 7,6 mmol) in Dichlormethan (30 ml) gibt man eine 1 M Trimethylsilyltrifluormethansulfonat-Lösung (0,61 ml). Nach 30 Min. wird mit Natriumhydrogencarbont (0,5 g) neutralisiert, filtriert, eingeengt und der
Rückstand chromatografiert (Hexan/Essigester 10 : 1 - 7 : 1 - 5 : 1). Man erhält Verbindung 4 (4,14 g, 78 %).
1H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ = 0.88 (2t, 6H, 2CH3), 1.26 (m, 52H, 26 (CH)2), 1.55 (m, 4H, 2 (CH)2), 1.98, 2.05, 2.05, 2.15 (4s, 12H, 4 OAc), 3.36-3.66 (m, 8H), 3.88 (m, 2H), 4.16 (m, 2H), 4.52 (d, 1 H, 1-H), 5.02 (dd, 1H, 3-H), 5.19 (dd, 1 H, 2-H), 5.38
(dd, 1H, 4-H).
c) Synthese von 2,3-di-hexadecyloxy-propyl-O-ß-D-galactopyranosid (12): Verbindung 4 (3,3 g, 3,8 mmol) wird in Methanol gelöst und mit einer 1 M Natrium- methanolatlösung (1 ,2 ml) versetzt. Nach 2 h wir mit 1 M Essigsäure neutralisiert und eingengt. Verbindung 12 wird ohne Reinigung direkt in die nächste Stufe eingesetzt.
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 0.87 (2t, 6H, 2CH3), 1.25 (m, 52H, 26 (CH)2), 1.50 (m, 4H, 2 (CH)2), 4.13 (d, 1H, 1-H).
d) Synthese von 2,3-di-hexadecyloxy-propyl-O-4,6-O-benzyliden-δ-D-galactopy- ranosid (13): Eine Mischung aus Verbindung 12 (1 ,5 g, 2,1 mmol), Acetonitril (250 ml), Benzalde- hyddimethyacetal (2,36 ml, 15,75 mmol) und p-Toluolsulfonsäure (300 mg) wird 5 h bei 50°C gerührt. Man läßt auf Raumtemperatur abkühlen, neutralisiert mit Kalium- carbonat (500 mg), filtriert und engt das Filtrat im Vakuum ein. Der Rückstand wird chromatografiert (Toluol/Aceton 4 : 1). Man erhält Verbindung 13 (1 ,14 g, 68 %). 1H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ = 0.88 (2t, 6H, 2CH3), 1.25 (m, 52H, 26 (CH)2), 1.55 (m, 4H, 2 (CH)2), 4.33 (d, 1 H, 1-H), 5.55 (s, 1H, CHPh), 7.35-7.50 (m, 5H, Ph).
e) Synthese von 2,3-di-hexadecyloxy-propyl-O-4,6-O-benzyliden-2,3-di-O- oxysulfonyl-ß-D-galactopyranosid (1 b): Eine Mischung aus Verbindung 13 (0,32 g, 0,40 mmol) und SO3-Pyridin-Komlex (0,64 g, 4,0 mmol) in Pyridin (10 ml) wird 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung gibt man Wasser (5 ml) und Natriumhydrogencarbonat (0,5 g) zu. Nach beendeter Gasentwicklung wird eingeengt, der Rückstand in Methanol (5 ml) aufgenommen, filtriert und eingeengt. Nach Chromatografie (Dichlormethan/Methanol 7 : 1) erhält man Verbindung 1b (0,28 g, 74 %).
1H-NMR (300 MHz, CDCI3/CD3OD): δ = 0.89 (2t, 6H, 2CH3), 1.28 (m, 52H, 26 (CH)2), 1.57 (m, 4H, 2 (CH)2), 3.96 (dd, 1H), 4.14, 4.26 (2d, 2H), 5.62 (s, 1H, CHPh), 7.35, 7.45 (2m, 5 H, Ph).
f) Synthese von 2,3-di-hexadecyloxy-propyl-O-4,6-O-benzyliden-2,3-di-O- oxysulfonyl-ß-D-galactopyranosid (1a): Verbindung 1b (157 mg, 0,165 mmol) wird in Essigsäure/Methanol 1 : 1 (10 ml) ge- löst und mit Palladiumkohle (10 %, 200 mg) versetzt. Die Mischung wird in einer
Wasserstoffatmosphäre 18 h gerührt. Zur Aufarbeitung werden Wasser (20 ml) und Methanol (20 ml) zugegeben, auf 40 - 50°C erwärmt und filtriert. Der Filter wird mit warmem Methanol nachgespült. Das Filtrat wird eingeengt, der Rückstand mit warmem Methanol (20 ml) aufgenommen, filtriert und bei 0°C auskristallisiert. Man er- hält Verbindung 1a (108 mg, 76 %).
1H-NMR (300 MHz, CDCI3/CD3OD): δ = 0.88 (2t, 6H, 2CH3), 1.26 (m, 52H, 26 (CH)2), 1.53 (m, 4H, 2 (CH)2).
Massenspektrum (TSQ 700, Finnigan/MAT), Electrospray ionization (ESI): (M-H)" =
862.
Beispiel 2:
a) Synthese von 2,3-di-hexadecyloxy-propyl-O-3,4-O-isopropyliden-ß-D-galacto- pyranosid (14):
Eine Mischung aus Verbindung 12 (2,03 g, 2,89 mmol), Dimethoxypropan (120 ml) und p-Toluolsulfonsäure (150 mg) wird 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Zur selektiven Abspaltung der gemischten Acetale werden Wasser (75 ml) und p-Toluolsulfonsäure (150 mg) zugegeben. Nach 2 h werden Essigsäureethylester (1200 ml) und gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung (400 ml) zugegeben und 30 Min. gerührt. Die organische Phase wird abgetrennt und mit Natriumhydrogencarbonatlö- sung (3 x 150 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingengt. Flash-Chromatografie (Toluol/Essigsäureethylester 2 : 1) liefert Verbindung 14 (1 ,85 g, 86 %).
1H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ = 0.88 (2t, 6H, 2CH3), 1.26 (m, 52H, 26 (CH)2),1.28, 1.34 (2 s, 6 H, isoprop.), 1.56 (m, 4H, 2 (CH)2), 2.45 (bd, 1 H, OH), 3.01 (bs, 1 H, OH), 4.23 (d, 1H, 1-H).
b) Synthese von 2,3-di-hexadecyloxy-propyl-O-3,4-O-isopropyliden-2,6-di-O- oxysulfonyl-δ-D-galactopyranosid (1 d):
Verbindung 1d wird wie bei 1b beschrieben aus Verbindung 14 hergestellt. 1H-NMR (300 MHz, CDCI3/CD3OD): δ = 0.89 (2t, 6H, 2CH3), 1.28 (m, 52H, 26
(CH)2),1.33, 1.51 (2 s, 6 H, isoprop.), 1.57 (m, 4H, 2 (CH)2), 3.88 (dd, 1 H), 4.32 (dd, 1 H), 4.40 (dd, 1 H), 4.51 (dd, 1 H), 4.74 (d, 1 H, 1-H).
c) Synthese von 2,3-di-hexadecyloxy-propyl-O-2,6-di-O-oxysulfonyl-ß-D-galacto- pyranosid (1c):
Eine Lösung aus Vebindung 1d (1 ,4 g, 1 ,55 mmol) wird in einer Mischung aus Triflu- oressigsäure/Wasser (1 : 1 , 84 ml) 4 h bei 40°C gerührt. Die Mischung wird eingeengt und mittels Flash-Chromatografie (Dichlormethan/Methanol 20 : 1 - 10 : 1 - 5 : 1) gereinigt. Man erhält Verbindung 1c (1 ,18 g, 88 %).
1H-NMR (300 MHz, CDCI3/CD3OD): δ = 0.89 (2t, 6H, 2CH3), 1.28 (m, 52H, 26 (CH)2), 1.57 (m, 4H, 2 (CH)2).
Beispiel 3:
a) Synthese von 3-Mercapto-1 ,2-di-hexadecyloxy-propan (5): Die primäre Hydroxy-Gruppe von Verbindung 3 wird mit Trifluormetansulfonsäurean- hydrid in Pyridin umgesetzt und das so erhaltene Triflat mit Kaliumthioacetat umgesetzt. Die S-Acetyl-Gruppe wird mit Natriummethanolat in Methanol abgespalten. Man erhält Verbindung 5.
b) Synthese von 2,3-Di-hexadecyloxy-propyl-S-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galac- tothiopyranosid (6): Verbindung 6 wird aus 2a und 5 analog zu Verbindung 4 hergestellt.
c) Synthese von 2,3-Di-hexadecyloxy-propyl-S-ß-D-galactothiopyranosid (15): Verbindung 15 wird aus 6 analog zu Verbindung 12 hergestellt.
d) Synthese von 2,3-Di-hexadecyloxy-propyl-S-4,6-O-benzyliden-ß-D-galactot hiopyranosid (16):
Verbindung 16 wird aus 15 analog zu Verbindung 13 hergestellt.
e) Synthese von 2,3-Di-hexadecyloxy-propyl-S-2,3-di-O-2-allyloxy-ethyl-4,6-O- benzyliden-ß-D-galactothiopyranosid (18):
Verbindung 18 wird durch Alkylierung von 16 mit 17 in Dimetylformamid mit Natriumhydrid hergestellt.
f) Synthese von 2,3-Di-hexadecyloxy-propyl-S-4,6-O-benzyliden-2,3-di-O-2- malonyl-ethyl-ß-D-galactothiopyranosid (1 g): Verbindung 1g wird durch Deallylierung, Tosylierung, Malonylierung und alkalische Verseifung aus Verbindung 18 hergestellt.
Beispiel 4:
a) Synthese von (2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-galactopyranosyl)-cyanid(7): Verbindung 7 wird durch Umsetzung von 2b mit Trimethylsilylcyanid unter der Katalyse von Bortrifluorid-Etherat in Acetonitril hergestellt.
b) Synthese von C-1-Hydroxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-ß-D-galactopyrano- sid (9):
Cyanid 7 wird mit Natriummethanolatlösung behandelt und anschließend mit 1 M Salzsäure angesäuert. Man erhält den Methylester 8. Dieser wird mit etherischer Lithiumaluminiumhydrid-Lösung bei 0°C zu Verbindung 9 reduziert.
c) Synthese von C-1-2,3-Di-hexadecyloxy-propyloxymethyl-2,3,4,6-tetra-O- benzyl-ß-D-galactopyranosid (11):
C-Glycosid 11 wird durch Alkylierung von 9 mit 10 erhalten. Verbindung 10 wird durch Bromierung von Verbindung 3 erhalten.
d) Synthese von C-1-2,3-Di-hexadecyloxy-propyloxymethyl-ß-D-galactopyrano sid (19).
Verbindung 19 wird durch Hydrogenolyse von 11 mit 10 %iger Palladiumkohle in einer Wasserstoffatmosphäre unter Normaldruck erhalten.
e) Synthese von C-1-2,3-Di-hexadecyloxy-propyloxymethyl-2,3,4-tri-O-benzyl-ß- D-galactopyranosid (20):
Verbindung 20 wird durch selektive 6-O-Tritylierung von 19, Benzylierung der ver- bliebenen freien OH-Gruppen und anschließende Abspaltung der 6-O-Tritylgruppe erhalten. f) Synthese von C-1-2,3-Di-hexadecyloxy-propyloxymethyl-6-bromo-2,3,4-tri-O- benzyl-ß-D-galactopyranosid (21):
Verbindung 21 wird durch Bromierung von Verbindung 20 hergestellt.
g) Synthese von C-1-2,3-Di-hexadecyloxy-propyloxymethyl-6-malonyl-2,3,4-tri- O-benzyl-ß-D-galactopyranosid (1f):
Verbindung 1f wird durch Malonylierung von Verbindung 21 mit Malonsäuredimethy- lester und anschließende alkalische Verseifung hergestellt.
Beispiel 5:
Hemmung der Zelladhäsion in vitro:
IC50-Werte für E-Selektin [mM] und für P-Selektin [mM]:
Figure imgf000030_0001

Claims

Patentansprüche
1. Eine Verbindung der Formel I
Figure imgf000031_0001
worin bedeuten
R1, R2 unabhängig voneinander -(CH2)n-CH3 n eine ganze Zahl von 10 bis 30,
R3 - R6 unabhängig voneinander OH, OSO3H,
OCH2COOH, CH(COOH)2 O(CH2)2CH(COOH)2 oder nicht-toxische Salze der entsprechenden Säuren, mit der Maßgabe, daß mindestens ein Rest R3 - R6 ungleich OH ist, wobei die Hydroxy-
Gruppen mit Schutzgruppen wie beispielsweise Benzyl, Benzyliden oder Isopropyliden versehen sein können, und X O, S, (CH2)2O oder CH2O.
2. Verbindung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß
X Sauerstoff und
R1 und R2 -(CH2)15-CH3 bedeuten.
3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R3 und R4 OSO3H bedeuten.
4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R5 und R6 OH bedeuten.
5. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R5 und R6 O-Benzyliden bedeuten.
6. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R3 und R6 OSO3H bedeuten.
7. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
R4 und R5 OH bedeuten.
8. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß R3 und R6 O-Isopropyliden bedeuten.
9. Verbindung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß X CH2O und
R1 und R2 -(CH2)15-CH3 bedeuten.
10. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
R3 und R4 O-Benzoyl und
R5 und R6 OCH2COOH bedeuten.
11. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß R3 und R4 OH und
R5 und R6 OCH2COOH bedeuten.
12. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß R3, R4 und R5 Benzyl und R6 CH(COOH)2 bedeuten.
13. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß R3, R4 und R5 OH und
R6 CH(COOH)2 bedeuten.
14. Verbindung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß
X Schwefel und
R1 und R2 -(CH2)15-CH3 bedeuten.
15. Verbindung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß R3 und R4 O(CH2)2CH(COOH)2 und
R5 und R6 O-Benzyliden bedeuten.
16. Verbindung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß R3 und R4 O(CH2)2CH(COOH)2 und R5 und R6 OH bedeuten.
17. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man einen peracetylierten Glycosyldonor mit dem Alkohol der Formel III,
Figure imgf000033_0001
oder dem Mercaptan der Formel V,
HS γ OR1 v,
OR2
glycosyliert, wobei R1 und R2 die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen ha- ben, die Acetylgruppen abspaltet und einen Teil der freien Hdroxylgruppen entweder direkt mit sauren Gruppen oder aber mit Schutzgruppen versieht und die übrigen freien Hydroxylgruppen (oder einen Teil davon) mit sauren Gruppen versieht, wonach gegebenenfalls die eingeführten Schutzgruppen wieder abgespalten werden.
18. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 und 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man einen perbenzylierten Glycosyldonor mit Trimethylsilylcyanid umsetzt, das anomere Cyanid anschließend zum Methylester umsetzt und diesen zum C-1-Hydroxymethylglycosid reduziert, wonach die primäre Hydroxylgruppe mit einem zweikettigen Alkyldonor alkyliert wird und nach Abspaltung der Benzylschutzgruppen die freien Hydroxylgruppen zu sauren Gruppen funktionalisiert werden.
19. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Verwendung als Arzneimittel.
20. Arzneimittel enthaltend wenigstens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
21. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie oder Prophylaxe einer Krankheit, welche mit einer übermäßigen, durch Selektinrezeptoren vermittelten Zelladhäsion in dem von der Krankheit betroffenen Gewebe einhergeht.
22. Verwendung nach Anspruch 21 dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit eine Herz-Kreislauf-Erkrankung ist.
23. Verwendung nach Anspruch 21 dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit eine Autoimmunerkrankung wie rheumatoide Arthritis oder Osteoarthritis ist.
24. Verwendung nach Anspruch 21 dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit eine Tumorerkrankung wie Leukämie, Lungenkarzinom, Adenokarzinom oder Mammakarzinom ist.
25. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 für die Herstellung eines Mittels zur Diagnose einer Krankheit, welche mit einer übermäßigen, durch Selektinrezeptoren vermittelten Zelladhäsion in dem von der Krankheit betroffenen Gewebe einhergeht.
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