WO1998016637A1 - Fanconi-gen i - Google Patents

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WO1998016637A1
WO1998016637A1 PCT/EP1997/005543 EP9705543W WO9816637A1 WO 1998016637 A1 WO1998016637 A1 WO 1998016637A1 EP 9705543 W EP9705543 W EP 9705543W WO 9816637 A1 WO9816637 A1 WO 9816637A1
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nucleic acid
seq
cell cycle
cell
polypeptide
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PCT/EP1997/005543
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Manfred Kubbies
Andreas Machl
Simone Planitzer
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Roche Diagnostics Gmbh
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a pathophysiologically relevant Fanconi anemia (FA) -associated gene, a polypeptide encoded thereby, an antibody directed against the polypeptide and the pharmaceutical use of the nucleic acid, the polypeptide and the antibody.
  • FA Fanconi anemia
  • FA is a rare genetic disorder characterized by progressive pancytopenia, congenital abnormalities and an increased risk of tumor diseases (Glanz and Fraser, J.Med.Genet. 19 (1982) 412-416; Auerbach and Allen, Cancer Genet. Cytogenet. 51 (1991) 1-12). It occurs in about one in 300,000 people.
  • the object of the present invention was to identify new genes which are involved in the DNA regulatory cascade (e.g. cell cycle disorders, DNA repair, tumor genesis / tumor progression) and which may be associated with the pathophysiological phenotype of Fanconi anemia.
  • DNA regulatory cascade e.g. cell cycle disorders, DNA repair, tumor genesis / tumor progression
  • the present invention describes the identification, cloning and characterization of a gene called Fanconi gene I, which codes for a new polypeptide. 5 This gene sequence was found using the differential display technique (Liang and Pardee, Science 257 (1992), 967-971) in comparison of normal fibroblasts and FA fibroblasts.
  • the Fanconi gene I is expressed significantly more in FA fibroblasts than in normal fibroblasts.
  • the Fanconi gene 0 I, the polypeptide encoded by it and antibodies directed against the polypeptide are suitable as diagnostic, therapeutic or preventive agents for diseases which are associated with disorders of the cell cycle, cell activation, cell cycle progression, DNA repair, cytopenia, Tower genesis and 5 tumor progression are directly or indirectly associated.
  • An object of the present invention is a nucleic acid re which
  • (c) comprises a nucleotide sequence which hybridizes with the sequences from (a) or / and (b) under stringent conditions.
  • the in SEQ ID NO. The nucleotide sequence shown in Figure 1 contains an open reading frame which corresponds to a polypeptide with a length of 72 amino acids.
  • the amino acid sequence of this polypeptide is in SEQ ID NO. 2 shown.
  • the present invention also comprises a nucleotide sequence which hybridizes with one of the aforementioned sequences.
  • hybridization according to the present invention is used as in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989), 1,101-1,104).
  • One preferably speaks of a stringent hybridization if, after washing for 1 hour with 1 X SSC and 0.1% SDS at 50 ° C., preferably at 55 ° C., particularly preferably at 62 ° C. and most preferably at 68 ° C.
  • a positive hybridization signal is observed in particular for one hour in 0.2 X SSC and 0.1% SDS at 50 ° C., preferably at 55 ° C., particularly preferably at 62 ° C. and most preferably at 68 ° C.
  • a under such washing conditions with that in SEQ ID NO. 1 nucleotide sequence shown or a nucleotide sequence hybridizing therewith in the context of the degeneration of the genetic code is a nucleotide sequence according to the invention.
  • the nucleotide sequence according to the invention is preferably a DNA. However, it can also comprise an RNA or a nucleic acid analog such as a peptidic nucleic acid.
  • the nucleic acid according to the invention particularly preferably comprises a protein-coding section of the sequence shown in SEQ ID NO. 1 nucleotide sequence shown or a sequence which has a homology of more than 80%, preferably more than 90% and particularly preferably more than 95% to that in SEQ ID NO. 1 shown nucleotide sequence or a preferably at least 20 nt. and particularly preferably at least 50 nt. long section of it.
  • Another object of the present invention is a polypeptide encoded by a nucleic acid as indicated above.
  • This polypeptide preferably has (a) those in SEQ ID NO. 2 amino acid sequence shown or (b) a homology of more than 70%, preferably more than 80% and particularly preferably more than 90% to that in SEQ ID NO. 2 shown amino acid sequence.
  • Nucleic acids according to the invention are preferably obtainable from mammals and in particular from humans. They can be made according to known techniques using short sections of the in SEQ ID NO. 1 nucleotide sequence shown as hybridization probes and / or primers can be isolated by known methods. Furthermore, nucleic acids according to the invention can also be produced by chemical synthesis, where modified nucleotide building blocks, for example 2′-O-alkylated nucleotide building blocks, can optionally also be used instead of the customary nucleotide building blocks. Nucleic acids that are partially or completely composed of modified nucleotide building blocks hen, can be used for example as therapeutic agents, for example as antisense nucleic acids or ribozymes.
  • the invention also encompasses nucleic acid analogs, such as peptidic nucleic acids, whose base sequence corresponds to a nucleic acid according to the invention.
  • the present invention furthermore relates to a vector which contains at least one copy of a nucleic acid according to the invention.
  • This vector can be any prokaryotic or eukaryotic vector on which the DNA sequence according to the invention is preferably under the control of an expression signal (promoter, operator, enhancer, etc.).
  • prokaryotic vectors are chromosomal vectors such as bacteriophages and extrachromosomal vectors such as plasmids, circular plasmid vectors being particularly preferred.
  • Suitable prokaryotic vectors are e.g. in Sambrook et al. , Supra, Chapters 1-4.
  • the vector according to the invention is particularly preferably a eukaryotic vector, e.g. a yeast vector or a vector suitable for higher cells (e.g. a plasmid vector, viral vector, plant vector).
  • a eukaryotic vector e.g. a yeast vector
  • a vector suitable for higher cells e.g. a plasmid vector, viral vector, plant vector.
  • Such vectors are familiar to the person skilled in the field of molecular biology, so that there is no need to go into them here. In this connection, in particular, Sambrook et al. , Supra, Chapter 16.
  • the invention also relates to mu, variants and fragments thereof. These are to be understood as sequences which differ from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.2 by substitution, deletion and / or insertion of individual amino acids or short amino acid segments.
  • variant includes both naturally occurring end allelic variations or splice variations of the Fanconi polypeptide I as well as proteins produced by recombinant DNA technology (in particular in vitro mutagenesis with the help of chemically synthesized oligonucleotides) which, with regard to their biological and / or immunological activity, correspond to those in SEQ ID NO. 2 essentially correspond to the protein shown.
  • This term also includes chemically modified polypeptides. These include polypeptides that are modified on the termini and / or on reactive amino acid side groups by acylation, for example acetylation, or amidation.
  • the invention also relates to a vector which comprises at least a 20 nucleotide long section of the sequence shown in SEQ ID NO. 1 shown sequence contains.
  • This section preferably has a nucleotide sequence which is derived from the protein-coding region of the sequence shown in SEQ ID NO. 1 shown sequence or a region essential for the expression of the protein.
  • These nucleic acids are particularly suitable for the production of therapeutically usable antisense nucleic acids, which are preferably up to 50 nucleotides long.
  • Another object of the present invention is a cell which is transformed with a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention.
  • the cell can be both a eukaryotic and a prokaryotic cell. Methods for transforming cells with nucleic acids are state of the art and therefore need not be explained in more detail. Examples of preferred cells are eukaryotic cells, in particular animal and particularly preferably mammalian cells.
  • the present invention also relates to the use of the polypeptide according to the invention or fragments of this polypeptide as an immunogen for the production of antibodies.
  • the production of antibodies can be carried out in the usual way by immunizing experimental animals with the complete polypeptide or fragments thereof and subsequent recovery of the resulting polyclonal antisera.
  • monoclonal antibodies can be obtained from the antibody-producing cells of the test animals in a known manner by cell fusion. Human monoclonal antibodies can also be produced by known methods.
  • the recombinant Fanconi I protein or peptide fragments, in particular N- or C-terminal peptides thereof, are preferred as the immunogen.
  • Another object of the present invention is thus an antibody against the Fanconi I protein or a variant thereof, preferably an antibody that shows no cross-reaction with other Fanconi-associated proteins such as the FAC protein.
  • the antibody is particularly preferably directed against the entire polypeptide or against a peptide sequence which has the amino acids 1-20 or 53-72 of that in SEQ ID NO. 2 corresponds to the amino acid sequence shown.
  • Fanconi I protein a nucleic acid coding therefor and an antibody directed against it creates the prerequisites for a targeted search for effectors of this protein.
  • Substances which have an inhibitory or activating effect on the polypeptide according to the invention are able to selectively influence the cell functions controlled by the polypeptide. Therefore, they can be used in the therapy of corresponding clinical pictures such as cytopenias or tumors.
  • the invention thus also relates to a method for identifying effectors of the Fanconi I protein, in which cells which express the protein are brought into contact with various potential effector substances, for example low molecular weight substances, and the cells are alerted to changes, for example cell-activating , cell-inhibiting, cell proliferative and / or cell genetic changes, analyzed. In this way, binding targets can also be created of the Fanconi I protein.
  • the results presented also create the conditions for targeted diagnosis of diseases that are causally or indirectly linked to changes in the activity of the Fanconi protein I. These studies can be carried out using specific nucleic acid probes for detection at the nucleic acid level, e.g. at the gene or transcript level, or with the aid of antibodies against the Fanconi protein I for detection at the polypeptide level.
  • the present invention thus relates to a pharmaceutical composition which contains, as active components, nucleic acids, vectors, cells, polypeptides and antibodies as indicated above.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can furthermore contain pharmaceutically customary excipients, auxiliaries and / or additives and optionally further active components.
  • the pharmaceutical composition can be used in particular for the diagnosis, therapy or prevention of diseases which are associated with disorders of the cell cycle, cell activation, cell cycle progression, DNA repair and with cytopenias, tumor genesis or / and tumor progression.
  • the composition according to the invention can also be used to diagnose a predisposition to such diseases in individuals, in particular in diabetes. gnostics of a risk for. Cytopenias or / and tumor diseases are used.
  • Yet another object of the present invention is a method for the diagnosis of the above-mentioned diseases, whereby a patient or a sample originating from a patient, e.g. bring a sample of a body fluid or a tissue into contact with a pharmaceutical composition according to the invention and qualitatively or quantitatively determine the nucleotide sequence and / or the expression of the nucleic acid according to the invention.
  • These determination methods can be carried out, for example, at the nucleic acid level by using nucleic acid hybridization probes or via reverse transcription / PCR or at the protein level by antibodies using cyto- or histochemical methods.
  • the use of the pharmaceutical composition as a marker for the occurrence of cytopenias, tumors or other proliferation-associated diseases or a predisposition to the pathophysiological changes mentioned is particularly preferred.
  • the present invention also relates to a method for the therapy or prevention of one of the aforementioned diseases, wherein the patient is administered a pharmaceutical composition according to the invention which contains the active component in an amount effective against the disease.
  • a pharmaceutical composition according to the invention which contains the active component in an amount effective against the disease.
  • pharmaceutical compositions which are suitable for therapeutic purposes include bispecific antibodies and antibody-toxin or antibody-enzyme conjugates.
  • Further preferred pharmaceutical compositions for therapeutic purposes are antisense nucleic acids, gene therapeutic vectors or other low molecular weight activators or inhibitors.
  • SEQ ID NO. 1 shows a nucleotide sequence which contains genetic information coding for the Fanconi gene I
  • SEQ ID NO. 2 shows the amino acid sequence of an open reading frame of the one shown in SEQ ID NO. 1 nucleotide sequence shown, SEQ ID NO. 3 the nucleic acid primer SP1,
  • SEQ ID NO. 4 the nucleic acid primer SP2
  • SEQ ID NO. 5 the nucleic acid primer SP3,
  • SEQ ID NO. 6 the nucleic acid primer SP4 and
  • SEQ ID NO. 7 the nucleic acid primer SP5.
  • H94-38 and H94-17 were isolated from fetal lung tissue and provided by D. Schindler (University of Würzburg). The H94-38 cells
  • H94-17 control cells show no increased MMC sensitivity.
  • the cells were cultured at 37 ° C. with 7% CO 2 and 95% moisture in 20 MEM medium with Earle's salts (BRL, Gaithersburg MD, USA) with the addition of 10% fetal calf serum (Hyclone, Logan, UT, USA).
  • RNA preparation the cells were synchronized by removing the serum (0.1%) and stimulated with 10% fetal calf serum after 48 h. After a further 30 h, the cells were subconfluent and could be harvested for RNA isolation.
  • RNA kit from Gen Hunter (Brookline, MA, USA) was used for the mRNA differential display.
  • the total RNA was isolated from synchronized cell cultures with the Tripure reagent (Boehringer Mannheim GmbH, DE) according to the manufacturer's instructions. Until use, the RNA was stored as isopropanol-precipitated RNA pellets, covered with 70% ethanol at -80 ° C.
  • DNAse I (Boehringer Mannheim GmbH) was added to 1-5 ug total RNA in 1 X DNAse I reaction buffer and incubated at 37 ° C for 30 min.
  • RNA samples were quantified by measuring the absorbance at 260 nm and analyzed on an agarose gel. 0.2 ⁇ g of total RNA was used for reverse transcription. A total of 8 ⁇ g of total RNA was isolated from 1 ⁇ 10 6 fibroblasts.
  • the reverse transcription of the RNA was carried out in duplicate batches of 20 ⁇ l in 1 ⁇ reverse transcription buffer, 20 ⁇ M dNTPs and 2 ⁇ M each of the single-base anchor primer T n A, T X1 G or TC.
  • the solution was warmed to 65 ° C for 5 min, cooled to 37 ° C for 10 min and then 100 U Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) reverse transcriptase was added. After incubation for one hour at 37 ° C, the mixture was heated to 75 ° C for 5 min and then stored at -20 ° C.
  • MMLV Moloney Murine Leukemia Virus
  • the PCR was carried out in a reaction solution, the 1/10 volume of the reverse transcription approach, 2 ⁇ M dNTPs, 0.2 ⁇ M of the respective T ⁇ : 1 N primer ⁇ , 0.2 ⁇ M of a primer with an arbitrarily defined sequence, 10 ⁇ Ci Qf [35S] dATP and 1 U Taq DNA polymerase (Boehringer Mannheim GmbH) contained.
  • the PCR was carried out in a Perkin-Elmer 2400 Gene Amp. PCR system for a total of 40 cycles at 94 ° C. for 30 seconds, _40 ° C. for 2 minutes, 72 ° C. for 30 seconds and finally 72 ° C. for 5 minutes.
  • the samples were denatured in sequencing gel loading buffer at 80 ° C for 2 min before separation on a 5-6% denaturing polyacrylamide sequencing gel. Double PCR runs were carried out for each sample and separated side by side on the same polyacrylamide gel. The dried gel was analyzed by autoradiography for differentially expressed genes.
  • Reproducible bands corresponding to differentially expressed genes were excised from the gel.
  • the cDNA was eluted from gel pieces by boiling in 100 ul sterile water for 15 min.
  • the DNA in the supernatant was collected by ethanol precipitation in the presence of glycogen.
  • the DNA was then used for reamplification with the appropriate primers and PCR conditions as indicated above, except that dNTP concentrations of 20 ⁇ M were used and the reaction mixture did not contain any radioisotopes.
  • the amplified PCR fragments obtained in this way were separated on an agarose gel and eluted by centrifugation of the corresponding gel piece in a 0.45 ⁇ m Millipore Durapore membrane tube. The samples were stored at -20 ° C for Northern analysis.
  • Northern blot analysis was performed according to standard procedures according to Sambrook et al. (1989), Supra.
  • the nucleic acids were transferred to positively charged nylon membranes (Boehringer Mannheim GmbH) by downward-directed capillary transfer with 10 X SSC and cross-linked.
  • the probes generated in this way were hybridized against total RNA. After hybridization for 16-20 h at 42 ° C, the filter was washed twice in 1 X SSC, 0.1% SDS at room temperature for 15 min and then in 1 X SSC 0.1% SDS at 50 ° C for 1 h . Then the membranes were examined autoradiographically.
  • PCR fragments which proved to be differential in the Northern blot were ligated into the vector pCR TM 2.1 using the TA cloning kit (INVITROGEN) according to the manufacturer's instructions and the E.coli strain INV ⁇ F 'was transformed with this construct.
  • Clones containing the differential fragment-vector plasmid were prepared according to standard Sambrook et al. (1989, Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) and the plasmids isolated. The nucleotide sequence of the insert was determined using the automatic DNA sequencer 370A and the DNA sequencing kit (part number 402079) from Applied Biosystems using the sequencing primer M13 / pUC (Boehringer Mannheim Cat No. 1010 077) and the reverse sequencing primer M13 / pUC (Boehringer Mannheim Cat No. 1010 093).
  • the 5 'region of the nucleotide sequence found was determined using the 5' / 3'RACE kit (Boehringer Mannheim Cat No. 1734 792) using the sequence-specific primers SP1: 5'ACT CTC CAG GAA ATC 3 '(SEQ ID NO. 3) , SP2: 5 'GAC AGT GCA GAT CAT CTG TAC CAA 3' (SEQ ID NO. 4) and SP3: 5 'GGC AAT TGT AAG CAA ACA GTA TCA 3' (SEQ ID NO. 5) and identified as described above in ligated and sequenced the vector pCR TM 2.1.
  • the FA-1 gene described in Example 4 was cloned into the eukaryotic expression vector pCDNA3 (Invitrogen) by standard methods (Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, 1989). Expression is regulated by the CMV promoter / enhancer and the BGH polyA signal. The Neo gene is used as the selection gene (under the control of the SV40 expression cassette).
  • CHO cells were used to produce a stable cell line expressing FA-1.
  • 20 ⁇ g of lipofectamine (Gibco; in 750 ⁇ l of MEM-alpha medium) were mixed with 10 ⁇ g of DNA (in 750 ⁇ l of MEM-alpha medium), incubated for 45 minutes at room temperature and then diluted with 6 ml of MEM-alpha medium.
  • This mixture was placed on 5 x 10 ⁇ CHO cells in T75 cell culture flasks (Nunc) in MEM-alpha medium (Gibco) for 6 hours. Incubation was at 37 ° C.
  • the cells were then washed with MEM-alpha / 10% FCS (fetal calf serum) and cultured in fresh medium at 37 ° C.
  • FCS fetal calf serum
  • mice were immunized intraperitoneally with recombinant human FA-1 protein (made in CHO cells). The first immunization was carried out in Freund's complete adjuvant and all further immunizations were carried out in Freund's incomplete adjuvant. The dose was 50-100 ⁇ g.
  • follow-up immunizations were carried out at approximately 4-week intervals until a serum titer of 1: 50,000 was reached.
  • the spleen cells of the immunized animals were then immortalized with the myeloma cell line P3X63.Ag8.653.
  • the fusion was carried out according to standard methods (J. Immunol. Methods 39 (1980), 285-308).
  • the fusion ratio spleen cells to myeloma cell was 1: 1.
  • the fusion products were sown on 24 cell culture dishes (Nunc) in HA medium based on RPMI / 10% FCS (Boehringer Mannheim). Positive primary cultures were cloned 2 weeks after fusion using FACS (Becton Dickinson) as single cells in 96 cell culture plates (Nunc) in RPMI / 10% FCS.
  • the hybridoma cell clones obtained in this way were expanded in vivo.
  • 5 ⁇ 10 6 hybridoma cells were inoculated intraperitoneally into mice pretreated with Pristan (Sigma Chemical Company). After 10-21 days, 2-3 ml of ascites were removed from each mouse and the monoclonal antibody obtained therefrom by conventional methods.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein pathophysiologisch relevantes Fanconi-Anämie (FA)-assoziiertes Gen, ein davon codiertes Polypeptid, einem gegen das Polypeptid gerichteten Antikörper sowie die pharmazeutische Anwendung der Nucleinsäure, des Polypeptids und des Antikörpers.

Description

Fanconi-Gen I
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein pathophysiologisch relevantes Fanconi-Anämie (FA) -assoziiertes Gen, ein davon codiertes Polypeptid, einen gegen das Polypeptid gerichteten Antikörper sowie die pharmazeutische Anwendung der Nucleinsäu- re, des Polypeptids und des Antikörpers.
FA ist eine seltene genetische Erkrankung, die durch progressive Pancytopenie, kongenitale Abnormitäten und ein erhöhtes Risiko für Tumorerkrankungen gekennzeichnet ist (Glanz und Fräser, J.Med.Genet. 19 (1982) 412-416; Auerbach und Allen, Cancer Genet . Cytogenet . 51 (1991) 1-12). Sie tritt bei etwa einer von 300.000 Personen auf.
Obwohl die molekulare Basis der Erkrankung unbekannt ist, liefert die Hypersensitivitat gegenüber der clastogenen Wirkung von DNA-Quervernetzungsmitteln einen guten Marker für den FA-Genotyp (Auerbach und Wolmann, Nature 261 (1976), 494-496). Zellen aus FA-Patienten zeigen multiple Chromatidbrüche und - austausche nach Kontakt mit Mitomycin C (MMC) oder Diepoxybu- tan (DEB) in Konzentrationen, die eine geringe clastogene
Wirkung auf normale Zellen haben (Sasaki und Tonomura, Cancer
Res. 33 (1973), 1829-1836 und Auerbach, Exp . Hematol . 21
(1993) , 731) . Nach Inkubation von FA-Lymphozyten und Fibrobla- sten mit MMC ist ein Defekt in der G2 -Phase des Zellzyklus ersichtlich, der sich sowohl in einer Verzögerung des G2 -Phasenübergangs als auch in einem vollständigen Arrest äußert (Kubbies et al . , Am. J.Hum. Genet . 37 (1985), 1022; Hoehn et al . , Fanconi Anemia, Clinical, Cytogenic and Experimental Aspects (1989) , Springer Verlag Berlin-Heidelberg; Seyschab et al., Blood 85 (1995), 2233-2237).
Gegenwärtig sind innerhalb der FA-Population mindestens 5 verschiedene Ko plementationsgruppen bekannt (Duckworth-Ry- siecki et al . , Somatic Cell Mol. Genet. 11 (1985), 35; Strath- dee et al . , Nature 356 (1992), 763; Joenje et al . , Blood 86
(1995) , 2156-2160) . Das Gen für die Komplementationsgruppe C s wurde vor kurzem beschrieben (Strathdee et al . , Nature 356
(1992), 763 und W093/22435) , aber die Art der molekularen Wirkungsweise des FA-C Proteins ist immer noch unbekannt (Ga- vish et al . , Am. J.Hum. Genet . 53 (1993), 685; Yamashita et al . , Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91 (1994), 6712; Youssoufian et al . , 0 J.Biol.Chem. 270 (1995), 9876-9882). Weiterhin wurden für die zwei Komplementationsgruppen FAA und FAD die chromosomale Lokalisierung angegeben (Pronk et al . , Nature Genet. 11
(1995), 338-340; Whitney et al . , Nature Genet. 11 (1995), 341- 343) . 5
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, neue Gene zu identifizieren, die in der DNA-Regulationskaskade beteiligt sind (z.B. Zellzyklusstörungen, DNA-Reparatur, Tumorgenese/Tumorprogression) und die mit dem pathophysiologischen 0 Phänotyp der Fanconi -Anämie assoziiert sein können.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung eines Gens, das als Fanconi - Gen I bezeichnet wird und für ein neues Polypeptid codiert. 5 Gefunden wurde diese Gensequenz unter Verwendung der Differential-Display-Technik (Liang und Pardee, Science 257 (1992) , 967-971) im Vergleich von Normal -Fibroblasten und FA-Fibrobla- sten. Das Fanconi -Gen I wird in FA-Fibroblasten signifikant stärker exprimiert als in Normal -Fibroblasten. Das Fanconi -Gen 0 I, das davon codierte Polypeptid sowie gegen das Polypeptid gerichtete Antikörper sind als diagnostische, therapeutische oder präventive Mittel für Erkrankungen geeignet, die mit Störungen des Zellzyklus, der Zellaktivierung, der Zellzyklus- progression, der DNA-Reparatur, Cytopenien, Turmorgenese und 5 Tumorprogression direkt oder indirekt assoziiert sind.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäu- re , welche
(a) die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder einen Protein-codierenden Abschnitt davon,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nucleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter strin- genten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz umfaßt.
Die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Nucleotidsequenz enthält einen offenen Leserahmen, der einem Polypeptid mit einer Länge von 72 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids ist in SEQ ID NO. 2 dargestellt.
In der EMBL EST Sequenzdatenbank werden humane cDNA-Klone 290799 (Zugangsnummer N71961) , 270393 (Zugangsnummer N33066) und 66812 (Zugangsnummer T64946) offenbart, die Teilbereiche der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nucleotidsequenz enthalten. Es finden sich jedoch dort keinerlei Anhaben über einen vollstän- digen offenen Leserahmen oder über die mögliche biologische Funktion der angegebenen Sequenzen.
Neben der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Nucleotidsequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz umfaßt die vorliegende Erfindung auch noch eine Nucleotidsequenz, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisiert. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al . (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Har- bor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104) verwendet. Vorzugsweise spricht man von einer stringenten Hybridisierung, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 X SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für eine Stunde in 0,2 X SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62 °C und am meisten bevorzugt bei 68 °C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Nucleotidsequenz oder einer damit im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz hybridisierende Nucleotidsequenz ist eine erfindungs- gemäße Nucleotidsequenz.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz eine DNA. Sie kann jedoch auch eine RNA oder ein Nucleinsäureana- logon wie eine peptidische Nucleinsaure umfassen. Besonders bevorzugt umfaßt die erfindungsgemäße Nucleinsaure einen Pro- tein-codierenden Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nucleotidsequenz oder eine Sequenz, die eine Homologie von mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90% und besonders bevorzugt mehr als 95% zu der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nucleo- tidsequenz oder einem vorzugsweise mindestens 20 nt . und besonders bevorzugt mindestens 50 nt . langen Abschnitt davon aufweist .
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein von einer Nucleinsaure wie oben angegeben codiertes Polypeptid. Dieses Polypeptid weist vorzugsweise (a) die in SEQ ID NO. 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder (b) eine Homologie von mehr als 70%, vorzugsweise mehr als 80% und besonders bevorzugt mehr als 90% zu der in SEQ ID NO. 2 dargestellten Amino- säuresequenz auf.
Erfindungsgemäße Nucleinsäuren sind vorzugsweise aus Säugern und insbesondere aus dem Menschen erhältlich. Sie können nach bekannten Techniken unter Verwendung kurzer Abschnitte der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Nucleotidsequenz als Hybridisierungs- sonden oder/und Primer nach bekannten Methoden isoliert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nucleinsäuren auch durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei anstelle der üblichen Nucleotidbausteine gegebenenfalls auch modifi- zierte Nucleotidbausteine, z.B. 2 ' -O-alkylierte Nucleotidbausteine eingesetzt werden können. Nucleinsäuren, die teilweise oder vollständig aus modifizierten Nucleotidbausteinen beste- hen, können beispielsweise als therapeutische Mittel, z.B. als Antisense-Nucleinsäuren oder Ribozyme, eingesetzt werden.
Weiterhin umfaßt die Erfindung auch Nucleinsäureanaloga wie etwa peptidische Nucleinsäuren, deren Basensequenz einer erfindungsgemäßen Nucleinsaure entspricht.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nu- cleinsäure enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokary- ontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße DNA-Sequenz vorzugsweise unter Kontrolle eines Expressionssignals (Promotor, Operator, Enhancer etc.) befindet. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromo- somale Vektoren wie etwa Bakteriophagen und extrachromosomale Vektoren wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontische Vektoren sind z.B. bei Sambrook et al . , Supra, Kapitel 1 - 4 beschrieben.
Besonders bevorzugt ist der erfindungsgemäße Vektor ein eukaryontischer Vektor, z.B. ein Hefevektor oder ein für höhere Zellen geeigneter Vektor (z.B. ein Plasmidvektor, viraler Vektor, Pflanzenvektor) . Derartige Vektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig, so daß hier nicht näher darauf eingegangen werden muß. Insbesondere wird in diesem Zusammenhang auf Sambrook et al . , Supra, Kapitel 16 verwiesen.
Neben dem in SEQ ID NO .2 dargestellten Polypeptid betrifft die Erfindung auch Mu eine, Varianten und Fragmente davon. Darunter sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion oder/und Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von der in SEQ ID NO.2 dargestellten Aminosäuresequenz unterscheiden.
Unter den Begriff "Variante" fallen sowohl natürlich vorkom- mende allelische Variationen oder Spleißvariationen des Fanconi -Polypeptids I sowie durch rekombinante DNA-Technologie (insbesondere in vitro-Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden) erzeugte Proteine, die hin- sichtlich ihrer biologischen oder/und immunologischen Aktivität dem in SEQ ID NO. 2 dargestellten Protein im wesentlichen entsprechen. Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch modifizierte Polypeptide. Hierzu gehören Polypeptide, die an den Termini oder/und an reaktiven Aminosäureseitengrup- pen durch Acylierung, z.B. Acetylierung, oder Amidierung modifiziert sind.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der mindestens einen 20 Nucleotide langen Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 dargestell- ten Sequenz enthält. Vorzugsweise besitzt dieser Abschnitt eine Nucleotidsequenz, die aus dem Protein-codierenden Bereich der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Sequenz oder einem für die Expression des Proteins wesentlichen Bereich stammt. Diese Nucleinsäuren eignen sich besonders zur Herstellung von thera- peutisch einsetzbaren Antisense-Nucleinsäuren, die vorzugsweise bis zu 50 Nucleotide lang sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nucleins ure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryontische als auch eine prokaryontische Zelle sein. Verfahren zur Transformation von Zellen mit Nucleinsäuren sind allgemeiner Stand der Technik und brauchen daher nicht näher erläutert zu werden. Beispiele für bevorzugte Zellen sind eukaryontische Zellen, insbesondere tierische und besonders bevorzugt Säugerzellen.
Ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern. Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem vollstän- digen Polypeptid oder Fragmenten davon und anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach der Methode von Köhler und Milstein oder deren Weiterentwicklungen können aus den Antikörper-produzierenden Zellen der Versuchstiere auf bekannte Weise durch Zellfusion monoklo- nale Antikörper erhalten werden. Ebenso können nach bekannten Methoden humane monoklonale Antikörper hergestellt werden.
Als Immunogen bevorzugt sind das rekombinante Fanconi I-Pro- tein oder Peptidfragmente, insbesondere N- oder C-terminale Peptide hiervon.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Antikörper gegen das Fanconi I -Protein oder eine Variante davon, vorzugsweise ein Antikörper, der keine Kreuzreaktion mit anderen Fanconi -assoziierten Proteinen wie etwa dem FAC- Protein zeigt. Besonders bevorzugt ist der Antikörper gegen das gesamte Polypeptid oder gegen eine Peptidsequenz gerichtet, die den Aminosäuren 1-20 oder 53-72 der in SEQ ID NO . 2 dargestellten Aminosäuresequenz entspricht.
Die Bereitstellung des Fanconi I-Proteins, einer dafür codierenden Nucleinsaure und eines dagegen gerichteten Antikörpers schafft die Voraussetzung für eine gezielte Suche nach Effek- toren dieses Proteins. Stoffe, die auf das erfindungsgemäße Polypeptid inhibitorisch oder aktivierend wirken, sind in der Lage, die durch das Polypeptid gesteuerten Zellfunktionen selektiv zu beeinflussen. Daher können sie bei der Therapie entsprechender Krankheitsbilder wie z.B. Cytopenien oder Tu- more eingesetzt werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des Fanconi I-Proteins, wobei man Zellen, die das Protein expri- mieren, mit verschiedenen potentiellen Effektorsubstanzen, z.B. niedermolekularen Stoffen, in Kontakt bringt und die Zellen auf Veränderungen, z.B. zellaktivierende, zeilinhibierende, zellproliferative oder/und zellgenetische Veränderungen, analysiert. Auf diese Weise lassen sich auch Bindetargets des Fanconi I-Proteins identifizieren.
Bei Krankheitsbildern, die auf einen Ausfall des Fanconi I- Proteins zurückzuführen sind, kann eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche die Übertragung einer für das Fanconi-Protein I codierenden Nucleinsaure mittels Vektoren, z.B. viralen Vektoren, in das entsprechende Zielgewebe umfaßt. Andererseits kann bei Krankheitsbildern, die auf eine unkontrollierte Expression des Fanconi-Proteins I zurückzuführen sind, eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche zu einer Blockierung dieser Expression führt.
Die vorgestellten Ergebnisse schaffen überdies die Voraussetzung für eine gezielte Diagnostik von Krankheiten, die mit Veränderungen der Aktivität des Fanconi -Proteins I ursächlich oder indirekt verbunden sind. Diese Untersuchungen können mit Hilfe spezifischer Nucleinsäuresonden zum Nachweis auf Nucleinsäureebene, z.B. auf Gen- oder Transkriptebene, oder mit Hilfe von Antikörpern gegen das Fanconi-Protein I zum Nachweis auf Polypeptidebene durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponenten Nucleinsäuren, Vektoren, Zellen, Polypeptide und Antikörper wie zuvor angege- ben enthält.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- oder/und Zusatzstoffe sowie gegebenenfalls weitere aktive Komponenten enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann insbesondere zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Erkrankungen eingesetzt werden, die mit Störungen des Zellzyklus, der Zell- aktivierung, der Zellzyklusprogression, der DNA-Reparatur sowie mit Cytopenien, der Tumorgenese oder/und der Tumorpro- gression assoziiert sind. Weiterhin kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung auch zur Diagnostik einer Prädisposition für solche Erkrankungen bei Individuen, insbesondere bei der Dia- gnostik eines Risikos für. Cytopenien oder/und Tumorerkrankun- gen eingesetzt werden.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnostik der oben genannten Erkrankungen, wobei man einen Patienten oder eine aus einem Patienten stammende Probe, z.B. eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes, mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in Kontakt bringen und die Nucleotidsequenz oder/und die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsaure qualitativ oder quantitativ bestimmt. Diese Bestimmungsmethoden können beispielsweise auf Nucleinsäureebene durch Verwendung von Nucleinsäure-Hybridisierungssonden oder über Reverse Transkription/PCR bzw. auf Proteinebene durch Antikörper nach cyto- oder histochemischen Methoden erfolgen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung als Marker für das Auftreten von Cytopenien, Tumoren oder anderer proliferationsassoziierter Erkrankungen oder einer Prädisposition für die genannten pathophysiologischen Verände- rungen.
Schließlich betrifft die vorliegene Erfindung auch ein Verfahren zur Therapie oder Prävention einer der zuvor genannten Erkrankungen, wobei man dem Patienten ein erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die die aktive Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält. Spezifische Beispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen, welche für therapeutische Zwecke geeignet sind, sind beispielsweise bispezifische Antikörper und Antikörper-Toxin- oder Antikörper-Enzymkonjugate . Weitere bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen für therapeutische Zwecke sind Anti- sense-Nucleinsäuren, gentherapeutische Vektoren oder andere niedermolekulare Aktivatoren oder Inhibitoren.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und das Sequenzprotokoll näher erläutert. Es zeigen: SEQ ID NO. 1 eine Nucleotidsequenz, die für das Fanconi -Gen I codierende genetische Information enthält,
SEQ ID NO. 2 die Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Nucleotidsequenz, SEQ ID NO. 3 den Nukleinsäureprimer SP1,
SEQ ID NO. 4 den Nukleinsäureprimer SP2,
SEQ ID NO. 5 den Nukleinsäureprimer SP3 ,
SEQ ID NO. 6 den Nukleinsäureprimer SP4 und
SEQ ID NO. 7 den Nukleinsäureprimer SP5.
BEISPIELE
Beispiel 1;
5 Kultivierung von Zellen
Primäre diploide humane Fibroblasten H94-38 und H94-17 wurden aus fötalem Lungengewebe isoliert und von D. Schindler (Universität Würzburg) zur Verfügung gestellt. Die H94-38 Zellen
10 wurden durch Zellzyklusanalyse als Fanconi -Anämie-Phänotyp diagnostiziert und weisen eine verlängerte G2 -Phase sowie einen Anstieg des G2-Phasenarrests bei Zugabe von MMC auf. Aus Komplementationsuntersuchungen geht hervor, daß die H94-38 Zellen nicht zu den Fanconi -Komplementationsgruppen A, B, C
15 und D, sondern vermutlich zur Komplementationsgruppe E gehören. H94-17 Kontrollzellen zeigen keine erhöhte MMC-Sensitivi- tät .
Die Zellen wurden bei 37°C mit 7% C02 und 95% Feuchtigkeit in 20 MEM Medium mit Earle's Salzen (BRL, Gaithersburg MD, USA) unter Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (Hyclone, Logan, UT, USA) kultiviert. Zur RNA-Präparation wurden die Zellen durch Serumentzug (0,1%) synchronisiert und nach 48 h mit 10% fötalem Kälberserum stimuliert. Nach weiteren 30 h waren die Zel- 25 len subkonfluent und konnten für die RNA-Isolierung geerntet werden .
Zur Analyse des Zellzyklusstatus in einem Proliferationsassay wurden nach einer Kultivierungsdauer von 30 h in BrdU-haltigem
30 Medium Aliquots dieser Zellkulturen entnommen. Mittels einer hochauflösenden flußzytometrischen BrdU-Hoechst-Quenching- Technik wurden die Anzahl von Zellen in den Zellzyklusphasen G0/G1, S und G2/M wie von Kubbies (in Radbruch, A. (ed.), Flow Cytometry and Cell Sorting, Springer Verlag Berlin-Heidelberg
35 1992, pp 75-85) beschrieben bestimmt. Beispiel 2 :
mRNA Differential -Display
Für den mRNA Differential -Display wurde der RNA-Kit von Gen Hunter (Brookline, MA, USA) verwendet. Die Gesamt-RNA wurde aus synchronisierten Zellkulturen mit dem Tripure-Reagenz (Bo- ehringer Mannheim GmbH, DE) gemäß der Vorschrift des Herstellers isoliert. Bis zur Verwendung wurde die RNA als Isopro- panol-präzipitierte RNA-Pellets, bedeckt mit 70% Ethanol bei -80°C aufbewahrt. DNAse I (Boehringer Mannheim GmbH) wurde zu 1-5 μg Gesamt-RNA in 1 X DNAse I Reaktionspuffer gegeben und bei 37°C für 30 min inkubiert.
Die RNA-Proben wurden durch Messung der Absorption bei 260 nm quantitativ bestimmt und auf einem Agarosegel analysiert. 0,2 μg Gesamt-RNA wurden für die reverse Transkription verwendet. Aus 1 x 106 Fibroblasten wurden insgesamt 8 μg Gesamt- RNA isoliert.
Die reverse Transkription der RNA erfolgte in doppelten Ansätzen von jeweils 20 μl in 1 X reversem Transkriptionspuffer, jeweils 20 μM dNTPs und 2 μM jeweils der einbasigen Ankerpri- mer TnA, TX1G oder T C . Die Lösung wurde 5 min auf 65 °C er- wärmt, 10 min auf 37°C abgekühlt und dann wurden 100 U Moloney Murine Leukemiavirus (MMLV) Reverse Transkriptase zugegeben. Nach Inkubation für eine Stunde bei 37°C wurde das Gemisch für 5 min auf 75°C erhitzt und dann bei -20°C aufbewahrt.
Die PCR wurde in einer Reaktionslösung durchgeführt, die 1/10 Volumen des Ansatzes zur reversen Transkription, 2 μM dNTPs, 0,2 μM des jeweiligen Tι:lN-PrimerΞ, 0,2 μM eines Primers mit willkürlich festgelegter Sequenz, 10 μCi Qf[35S]dATP und 1 U Taq-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim GmbH) enthielt. Die PCR wurde in einem Perkin-Elmer 2400 Gene Amp. PCR-System für insgesamt 40 Zyklen bei 94°C 30 sec,_40°C 2 min, 72°C 30 sec und schließlich 72 °C für 5 min durchgeführt. Es wurden ver- schiedene willkürliche Primer von Gen Hunter (13-mer mit Hind- III Restriktionsstelle) , Operon (Allameda CA, USA) und Genosys (The Woodlands, TX, USA) (jeweils 10-mer Primer mit 60-70% GC- Gehalt) verwendet.
Die Proben wurden in Sequenziergel -Beladungspuffer bei 80°C für 2 min vor der Auftrennung auf einen 5-6% denaturierenden Polyacrylamid-Sequenziergel denaturiert. Für jede Probe wurden doppelte PCR Ansätze durchgeführt und auf dem gleichen Poly- acrylamidgel nebeneinander aufgetrennt. Das getrocknete Gel wurde autoradiographisch auf differentiell exprimierte Gene analysiert .
Reproduzierbare Banden, die differenziell exprimierten Genen entsprechen, wurden aus dem Gel ausgeschnitten. Die cDNA wurde aus Gelstücken durch Kochen für 15 min in 100 μl sterilem Wasser eluiert. Die DNA im Überstand wurde durch Ethanolprä- zipitation in Gegenwart von Glycogen gesammelt. Anschließend wurde die DNA zur Reamplifikation mit den entsprechenden Pri- mern und PCR-Bedingungen wie oben angegeben verwendet, außer daß dNTP-Konzentrationen von 20 μM verwendet wurden und das Reaktionsgemisch keine Radioisotope enthielt.
Die auf diese Weise erhaltenen amplifizierten PCR-Fragemente wurden über ein Agarosegel aufgetrennt und durch Zentrifuga- tion des entsprechenden Gelstücks in einem 0,45 μm Millipore Durapore Membranschlauch eluiert . Die Proben wurden für die Northern-Analyse bei -20°C aufbewahrt.
Auf diese Weise wurden mit 106 verschiedenen Primerkombinatio- nen insgesamt 60 Banden, davon 43 reamplifizierte Banden erhalten, die in FA-Zellen und Kontrollzellen differentiell exprimierten Genen entsprechen. Diese differentielle Expression war reproduzierbar. Beispiel 3 :
Northern-Analyse
Die Northern Blot Analyse wurde gemäß Standardprozeduren gemäß Sambrook et al . (1989), Supra durchgeführt. Die Nucleinsäuren wurden auf positiv-geladene Nylonmembranen (Boehringer Mannheim GmbH) durch nach unten gerichteten Kapillartransfer mit 10 X SSC transferiert und quervernetzt.
Spezifische Sonden wurden direkt aus dem PCR Reamplifikations- ansatz durch Markierung mit dem Hi-Prime Markierungskit (Boehringer Mannheim GmbH) unter Verwendung von Hexamerprimern mit willkürlicher Sequenz markiert. Die Abtrennung freier Nucleo- tide erfolgte unter Verwendung von G50 Sephadex Schleudersäulen (Boehringer Mannheim GmbH) .
Die auf diese Weise erzeugten Sonden wurden gegen Gesamt-RNA hybridisiert. Nach Hybridisierung für 16 - 20 h bei 42 °C wurde der Filter 2 mal in 1 X SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 15 min und anschließend in 1 X SSC 0,1% SDS bei 50°C für 1 h gewaschen. Dann wurden die Membranen autoradiographisch untersucht .
Die Northern-Analyse ergab eine differentielle Expression für ein etwa 480 bp langes PCR-Fragment .
Northern-Analysen in Zellkultur- und Gewebeproben ergaben eine dominante Bande mit einer Länge von < 1 kb und oftmals eine weitere Bande mit einer Länge von ca. 1,5 - 2,5 kb, die vielleicht auf eine Spleißvariante zurückgeführt werden kann. In Tumorzellen, z.B. HeLa, Raj i und K562, wurden beide Banden beobachtet. In Embryonalgewebe aus dem Knorpel der Augenpigmentschale wurde nur die größere Bande gefunden. Beispiel 4 ;
Charakterisierung von DP-PCR-Fragmenten, die differentiell exprimierten mRNA-Spezies entsprechen
PCR-Fragmente, die sich im Northern Blot als differentiell erwiesen, wurden mittels dem TA Cloning Kit (INVITROGEN) nach Vorschrift des Herstellers in den Vektor pCR™2.1 ligiert und der E.coli Stamm INVαF' mit diesem Konstrukt transformiert. Klone, die das Plasmid aus differenziellem Fragment und Vektor enthielten, wurden gemäß Standardprozeduren nach Sambrook et al . (1989, Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) kultiviert und die Plasmide isoliert. Die Nucleotidsequenz des Inserts wurde mittels des automatischen DNA-Sequenzers 370A und des DNA Sequencing Kits (Part Number 402079) der Firma Applied Biosystems unter Verwendung des Sequencing Primers M13/pUC (Boehringer Mannheim Cat Nr. 1010 077) und des Reverse Sequencing Primers M13/pUC (Boehringer Mannheim Cat Nr. 1010 093) bestimmt.
Der 5 '-Bereich der gefundenen Nucleotidsequenz wurde mittels des 5'/3'RACE Kits (Boehringer Mannheim Cat Nr. 1734 792) unter Verwendung der sequenzspezifischen Primer SP1 : 5'ACT CTC CAG GAA ATC 3' (SEQ ID NO. 3) , SP2 : 5 ' GAC AGT GCA GAT CAT CTG TAC CAA 3' (SEQ ID NO. 4) und SP3 : 5' GGC AAT TGT AAG CAA ACA GTA TCA 3' (SEQ ID NO. 5) identifiziert und wie oben beschrieben in den Vektor pCR™2.1 ligiert und sequenziert. Die Zugehörigkeit beider Fragmente zur selben mRNA wurde durch einen überlappenden Bereich von 120 Nucleotiden mit identischer Basenfolge und eine PCR mit außen liegenden Primern am 5 ' Ende des RACE Fragements (SP4: 5' AAG CCA CAG GCT GGG TGG CTG 3', SEQ ID NO. 6) und am 3 'Ende des Differential Display Fragments (SP5: 5' TTT TCT GAC ACA TGG ATA AAC 3' , SEQ ID NO. 7) mit dem Ergebnis der Sequenz des Fanconi Gens I erwiesen. Die dadurch erhaltene cDNA des Fanconi Gens I wurde wie oben beschrieben in den Vektor pCR™2.1 ligiert und sequenziert. Mittels Northern Blot Analyse wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde die differenzielle Expression der gesamten Fanconi Gen I mRNA nachgewiesen .
Beispiel 5:
Herstellung eines Expressionskonstrukts und Expression
Das im Beispiel 4 beschriebene FA-1 Gen wurde nach Standardverfahren (Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, 1989) in den eukaryontischen Expressionsvektor pCDNA3 (Invitrogen) um- kloniert. Die Regulation der Expression geschieht durch den CMV Promotor/Enhancer und das BGH polyA Signal. Als Selektionsgen wird das Neo-Gen verwendet (unter Kontrolle der SV40 Expressionskassette) .
Für die Herstellung einer stabilen, FA-1 exprimierenden Zelllinie wurden CHO Zellen verwendet. Dabei wurden 20 μg Lipofec- tamin (Gibco; in 750 μl MEM-alpha Medium) mit 10 μg DNA (in 750 μl MEM-alpha Medium) gemischt, 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit 6 ml MEM-alpha Medium verdünnt. Dieses Gemisch wurde für 6 Stunden auf 5 x 10δ CHO Zellen in T75 Zellkulturflaschen (Nunc) in MEM-alpha Medium (Gibco) gegeben. Die Inkubation erfolgte bei 37°C. Anschließend wurden die Zellen mit MEM-alpha/10% FKS (fötales Kälberserum) gewaschen und in frischem Medium für 48 Stunden bei 37 °C kultiviert. Danach wurde durch Zugabe von 1 mg/ml Neomycin (G418, Boehringer Mannheim) der Selektionsdruck angelegt. Die überlebenden Zellen wurden mittls FACS (Becton Dickinson) als Einzelzellen in 96-er Well Zellkulturplatten (Nunc) mit frischem Medium kloniert und unter G418 Selektionsdruck weiter kultiviert, bis ein stabil transfizierter CHO Klon etabliert war.
Unter Verwendung von DHFR als Selektionsgen kann neben der Gewinnung einer stabil transfizierten_ CHO Zellinie zusätzlich eine Genamolifikation des FA-1 Gens erreicht werden. Beispiel 6 ;
Antikörperherstellung
BALB/c Mäuse wurdem mit rekombinantem, humanem FA-1 Protein (hergestellt in CHO Zellen) intraperitoneal immunisiert. Die Erstimmunisierung erfolgte in komplettem Freund' sehen Adjuvans und alle weiteren Immunisierungen wurden in inkomplettem Freund' sehen Adjuvans durchgeführt. Die Dosis betrug 50 - 100 μg. Folgeimmunisierungen wurden in ca. 4-wöchigem Abstand durchgeführt, bis ein Serumtiter von 1:50000 erreicht ist.
Anschließend erfolgte die Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere mit der Myelomzellinie P3X63.Ag8.653. Die Fusion wurde nach Standardverfahren durchgeführt (J. Immunol . Methods 39 (1980) , 285-308) . Das Fusionsverhältnis Milzzellen zu Myelomzelle war dabei 1:1. Die Fusionsprodukte wurden auf 24-er Zellkulturschalen (Nunc) in HA-Medium auf RPMI/10% FKS Basis (Boehringer Mannheim) ausgesät. Positive Primärkulturen wurden 2 Wochen nach Fusion mittels FACS (Becton Dickinson) als Einzelzellen in 96-er Zellkulturplatten (Nunc) in RPMI/10% FKS kloniert.
Zur Gewinnung der monoklonalen Antikörper wurden die so erhal- tenen Hybridomzellklone in vivo expandiert. Dazu wurden 5 x 106 Hybridomzellen intraperitoneal in mit Pristan (Sigma Chemical Company) vorbehandelte Mäuse inokkuliert. Nach 10-21 Tagen wurden je Maus 2-3 ml Ascites entnommen und daraus der mono- klonale Antikörper nach herkömmlichen Methoden gewonnen. SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhofer Str. 112-132
(C) ORT: Mannheim (E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Fanconi-Gen I (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 839 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: beides
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:162..377
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: AAGCCACAGG CTCCCTGGCT GGCGTCAGCT AAAGTGGCTG TTGGGTGTCC GCAGGCTTCT 60 GCCTGGCCGC CGCCGCCTAT AAGCTACCAG GAGGAGCTTT ACGACTTCCC GTCCTGCGGG 120 AAGTGGCGGG CACGATCGCA AGGTAGCGCA GAAGCTTCTC A ATG GCC AGC GCC 173
Met Ala Ser Ala 1
AGC TGC AGC CCC GGC GGC GCA CTC GCC TCA CCT GAG CCT GGG AGG AAA 221 Ser Cys Ser Pro Gly Gly Ala Leu Ala Ser Pro Glu Pro Gly Arg Lys 5 10 15 20
ATT CTT CCA AGG ATG ATC TCC CAC TCA GAG CTG AGG AAG CTT TTC TAC 269 Ile Leu Pro Arg Met Ile Ser His Ser Glu Leu Arg Lys Leu Phe Tyr 25 30 35
TCA GCA GAT GCT GTG TGT TTT GAT GTT GAC AGC ~ACG GTC ATC AGT GAA 317 Ser Ala Asp Ala Val Cys Phe Asp Val Asp Ser Thr Val Ile Ser Glu 40 45 50 GAA GGA ATC GGA TGC TTT CAT TGG ATT TGG AGG AAA TGT GAT CAG GCA 365 Glu Gly Ile Gly Cys Phe His Trp Ile Trp Arg Lys Cys Asp Gin Ala 55 60 65 ACA AGT CAA GGA TAACGCCAAA TGGTATATCA CTGATTTTGT AGAGCTGCTG 417
Thr Ser Gin Gly 70
GGAGAACCGG AAGAATAACA TCCATTGTCA TACAGCTCCA AACAACTTCA GATGAATTTT 477
TACAAGTTAC ACAGATTGAT ACTGTTTGCT TACAATTGCC TATTACAACT TGCTATAAAA 537
AGTTGGTACA GATGATCTGC ACTGTCAAGT AAACTACAGT TAGGAATCCT CAAAGATTGG 597 TTTGTTTGTT TTTAACTGTA GTTCCAGTAT TATATGATCA CTATCGATTT CCTGGAGAGT 657
TTTGTAATCT GAATTCTTTA TGTATATTCC TAGCTATATT TCATACAAAG TGTTTTAAGA 717
GTGGAGAGTC AATTAAACAC CTTTACTCTT AGGAATATAG ATTCGGCAGC CTTCAGTGAA 777
TATTGGTTTT TTTCCCTTTG GTATGTCAAT AAAAGTTTAT CCATGTGTCA GAAAAAAAAA 837
AA 839
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 72 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Ala Ser Ala Ser Cys Ser Pro Gly Gly Ala Leu Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15
Pro Gly Arg Lys Ile Leu Pro Arg Met Ile Ser His Ser Glu Leu Arg 20 25 30
Lys Leu Phe Tyr Ser Ala Asp Ala Val Cys Phe Asp Val Asp Ser Thr 35 40 45 Val Ile Ser Glu Glu Gly Ile Gly Cys Phe His Trp Ile Trp Arg Lys 50 55 60
Cys Asp Gin Ala Thr Ser Gin Gly 65 70
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID-NO : 3 : ACTCTCCAGG AAATC 15 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:_4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM : Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE : linear
(xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 4 : GACAGTGCAG ATCATCTGTA CCAA 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
GGCAATTGTA AGCAAACAGT ATCA 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 6:
AAGCCACAGG CTGGGTGGCT G 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid ( C) STRANGFORM : Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE : l inear
(xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 7 : TTTTCTGACA CATGGATAAA C 21

Claims

Patentansprüche
1. Nucleinsaure, dadurch gekennzeichnet, daß sie
(a) die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder einen Protein-codierenden Abschnitt davon,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nucleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz umfaßt .
2. Nucleinsaure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Protein-codierenden Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nucleotidsequenz umfaßt.
3. Nucleinsaure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Homologie von mehr als 80 % zu der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nucleotidsequenz oder einem Ab- schnitt davon aufweist .
4. Modifizierte Nucleinsaure oder Nucleinsäureanalogon, die eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 - 3 umfaßt .
5. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nucleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Abschnitt davon enthält.
6. Vektor nach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet, daß er die Expression der Nucleinsaure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht.
5
7. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nucleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 trans- ιo formiert ist.
8. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nucleinsaure nach einem der Ansprüche 1 15 bis 3 codiert ist.
9. Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es
20 (a) die in SEQ ID NO. 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder (b) eine Homologie von mehr als 70% zu der in SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
25 10. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 8 oder 9 oder von Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern.
11. Antikörper gegen ein Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9.
30
12. Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen das gesamte Polypeptid oder gegen eine Pep- tidsequenz entsprechend den Aminosäuren 1 - 20 oder 53 - 35 72 aus SEQ ID NO. 2 gerichtet ist.
13. Modifiziertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz nach Anspruch 8 oder 9 umfaßt .
14. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktive Komponente umfaßt:
(a) eine Nucleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
(b) einen Vektor nach Anspruch 5 oder 6,
(c) eine Zelle nach Anspruch 7, (d) ein Polypeptid nach Anspruch 8, 9 oder 13 oder/und (e) einen Antikörper nach Anspruch 11 oder 12.
15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfsoder/und Zusatzstoffe enthält.
16. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15 zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit Störungen des Zellzyklus, der Zellaktivierung, der Zellzykluspro- gression, der DNA-Reparatur, Cytopenien, der Tumorgenese oder/und der Tumorprogression assoziiert sind.
17. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15 zur Diagnostik einer Prädisposition für Erkrankungen, die mit Störungen des Zellzyklus, der Zellaktivierung, der Zellzyklusprogression, der DNA-Reparatur, Cytopenien, der Tumorgenese oder/und der Tumorprogression assoziiert sind.
18. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15 zur Herstellung eines Mittels für die Diagnostik von Erkrankungen, die mit Störungen des Zellzyklus, der Zellaktivierung, der Zellzyklusprogression, der DNA-Repara- tur, Cytopenien, der Tumorgenese oder/und der Tumorprogression assoziiert sind oder eines Mittels für die Diagnostik einer Prädisposition für solche Erkrankungen.
19. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15 zur Herstellung eines Mittels für die Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit Störungen des Zellzyklus, der Zellaktivierung, der Zellzyklusprogression, der DNA-Reparatur, Cytopenien, der Tumorgenese oder/und der Tumorprogression assoziiert sind.
20. Verwendung nach Anspruch 19 zur Herstellung eines Mittels für die Gentherapie.
21. Verfahren zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit Störungen des Zellzyklus, der Zellaktivierung, der Zellzyklusprogression, der DNA-Reparatur, Cytopenien, der Tumorgenese oder/und der Tumorprogression assoziiert sind oder einer Prädisposition für solche Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Patienten oder eine aus dem Patienten stammende Probe mit einer Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15 in Kontakt bringen und die Nucleotidsequenz oder/und die Expression einer Nucleinsaure nach Anspruch 1 bestimmt.
22. Verfahren zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit Störungen des Zellzyklus, der Zellaktivierung, der Zellzyklusprogression, der DNA-Reparatur,
Cytopenien, der Tumorgenese oder/und der Tumorprogression assoziiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Patienten eine Zusammensetzung nach An- spruch 14 oder 15 verabreicht, die die aktive Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält.
23. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren eines Proteins nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen, die das Protein exprimieren, mit verschiedenen potentiellen Effektorsubstanzen in Kontakt bringt, und die Zellen auf Veränderungen analysiert.
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WO1993022435A1 (en) * 1992-04-29 1993-11-11 Hospital For Sick Children Fanconi anemia gene for complementation group c

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COLLET, J.F. ET AL.: "Human L-3-phosphoserine phosphatase : sequence, expression and evidence for a phosphoenzyme intermediate", FEBS LETTERS., vol. 408, no. 3, 26 May 1997 (1997-05-26), AMSTERDAM NL, pages 281 - 284, XP002056286 *
EMBL EST, Zugangsnummer N33066, Sequenzkennzeichen yy05h05.s1, 13-Jan-96, Homo sapiens cDNA Klone 270393 3' *
EMBL EST, Zugangsnummer N71961, Sequenzkennzeichen yz95d08.s1, 20-Mär-1996, Homo sapiens cDNA Klone 290799 3' *

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