WO1998011212A1 - Ptx-sensitive g-proteine, ihre herstellung und verwendung - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to new human G-Proteme, in particular ß3-Schemhe ⁇ ten G-Proteme, processes for their preparation and their use in diagnostics and therapy
  • G-proteins are of outstanding importance in intracellular signal transduction. They mediate the forwarding of extra cellular signals after stimulation of hormone receptors and other receptors, which undergo a conformational change after receptor activation. This leads to the activation of G-proteins, which can subsequently activate or inhibit intracellular effectors (e.g. ion channels, enzymes). Heterotomeric G-proteins are composed of three subunits, the ⁇ , ⁇ and ⁇ subunits. So far, several different ⁇ subunits, 5 ⁇ subunits and approx.
  • PTX pertussis tox
  • ß ⁇ subunits perform essential functions in G-prototype activation and in the modulation of intracellular reactions. All previously known G-protein ß subunits have high homologies at the level of the nucleotide sequence and at the level of the amino acid sequence. These similarities are not only within the human ß subunits found (ßl, ß2, ß3) but also in comparison to ß subunits of other species, for example fruit flies or yeast.
  • All previously known G-Prot ß subunits belong to the so-called "WD repeat" proteins.
  • the N-terminus of the ß-subunit mainly interacts with ⁇ -subunits, the C-terminus is involved in the interaction with receptors.
  • ß sub-units form so-called propeller structures.
  • the ß-propellers of the Gß subunits consist of 7 "ß-propellers - blades", each propeller blade consisting of 4 amino acid regions arranged in antiparallel.
  • the seven-fold symmetry of the ß-propeller can be demonstrated at the level of the amino acid sequence, which contains 7 so-called WD repeats.
  • a WD repeat motif comprises approximately 40 amino acids and has a number of conserved amino acids, including Trp-Asp dipeptide sequences. This WD mot v often ends the WD repeat (Fig. 1).
  • hypertensives have G-protein ⁇ 3 subunits which consist only of 6 instead of the otherwise described 7 WD repeat motifs. These hypertensives showed an increased cellular activation of PTX-sensitive G proteins compared to normotonics.
  • the molecular analysis revealed a new amino acid sequence for the ß3 subunit in these hypertensives, which is shortened by 41 amino acids compared to the known sequence.
  • the sequence is shown in SEQ ID NO: 2. Formally, it emerges from the well-known human ⁇ 3 subunit by deleting amino acids 167-207.
  • the reason for the appearance of the truncated Gß3 subunit in hypertensives is probably an alternative splicing of the corresponding gene.
  • the intron begins behind nucleotide 497 of the open reading frame (numbering according to SEQ ID NO: 1).
  • An intron could also be detected using PCR on genomic DNA, starting at nucleotide 620.
  • the shortened form is evidently the result of the deletion of a complete exon.
  • Another object of the invention is a method for producing shortened forms of human Gß3 subunits as mentioned above, by expressing a nucleic acid sequence coding therefor in a host organism.
  • the recombinant expression is preferably carried out by producing a gene construct which, in addition to the coding nucleic acid sequence, also contains further signal and regulatory sequences, such as promoters, terminators, riboseal binding sites, polyadenylation sites and the like.
  • the general procedure for the recombinant expression of a gene is familiar to the person skilled in the art.
  • Another object of the invention is the use of the nucleic acid sequences according to the invention for the production of medicaments for gene therapy treatment.
  • these nucleic acid sequences in direct form or after producing a corresponding gene vector in the cells of patients, an increased activatability of G proteins can be achieved in these.
  • Diseases which are associated with a G protein malfunction are to be understood as diseases in which the G protein is involved in signal transduction and does not fulfill its function in a physiological manner.
  • the diseases include cardiovascular diseases, metabolic disorders and immune diseases.
  • Cardiovascular diseases include: hypertension, gestational hypertension (gestosis, "hypertension in pregnancy"), coronary heart disease, localized and / or generalized atherosclerosis, stenosis of the blood vessels, restenosis after revascularizing vascular interventions (e.g. PTCA with and without stent implantation), Apoplex tendency. Thrombosis tendency and increased platelet aggregation.
  • Metabolic disorders include: Metabolic syndrome, insulin resistance and hyperinsulinemia, type II diabetes mellitus, diabetic complications (e.g. nephropathy, neuropathy, retmopathy, etc.). Disorders, disturbed central chemoreception (C0 2 tolerance, acidosis tolerance, sudden child death (SIDS)).
  • immune diseases disturbed strength of the body's immune response (formation of immunoglobulins, aggressiveness of T cells and NK cells), impaired general tendency to proliferate including wound healing ability, tendency to tumor development and proliferation including metastatic potential of malignant transformed cells, duration of the Latency after HIV infection until the clinical onset of the disease, Kaposi's sarcoma, tendency to cirrhosis of the liver, graft tolerance and graft rejection.
  • Another object of the invention is the use of the nucleic acid sequences according to the invention for the diagnosis of
  • Another object of the invention is the use of nucleic acid sequences which are complementary to the nucleic acid sequences coding for the shortened form of the Gß3 subunit. Such sequences can be used as antisense constructs for the treatment or prevention of diseases which are associated with a G-protein malfunction.
  • Another object of the invention is a method for determining a relative risk of disease in diseases associated with G-protein malfunction for a subject, characterized in that the gene sequence for human G-protein ⁇ 3-lower unit of the subject with the gene sequence SEQ ID NO : l compares and, if it matches SEQ ID N0: 1, assigns the subject an increased risk of disease.
  • body material which contains the genetic information of the subject is removed from a subject. This will usually achieved by taking blood and isolating the nucleic acid from it.
  • the gene structure for the G-protein ⁇ 3 subunit is determined from the isolated nucleic acid of the test subject and compared with the sequence given in SEQ ID N0: 1.
  • the gene structure can be determined by sequencing the nucleic acid. This can be done either directly from the genomic DNA or after amplification of the nucleic acid, for example using the PCR technique.
  • the gene structure can occur at the mRiMA or cDNA level.
  • the determination by sequencing after PCR amplification of the cDNA is preferred.
  • the primers suitable for the PCR reaction can easily be derived for the person skilled in the art from the sequences set out in SEQ ID NO: 1.
  • the procedure is advantageously such that a strand and counter strand binding primer are chosen before and after the deletion site.
  • gene comparison can also be carried out using other methods, for example by selective hybridization or by appropriate mapping with restriction enzymes.
  • the proteins according to the invention can be used to produce specific antibodies which specifically recognize the shortened form of the Gß3 subunit. Using such antibodies, protein-chemical tests can then be carried out in addition to or alternatively to the genetic tests, if necessary using conventional ELISA methods.
  • Another object of the invention is the production of transgenic animals that carry the gene modification described above (shortening the Gß3-Sche ⁇ nhe ⁇ t). Such transgenic animals are particularly important as animal models for the investigation and therapy of the diseases described above.
  • the methods for producing transgenic animals are generally known to the person skilled in the art.
  • G proteins The activation of G proteins from cells of normotensive subjects and hypertensive patients was characterized in detail.
  • the stimulated incorporation of radioactively labeled [ 35 S] GTP ⁇ S according to the method described by Wieland et al. described method (Wieland, T., Liedel, K., Kaldenberg Stasch, S., Meyer zu He ⁇ ngdorf, D, Schmidt, M, and Jakobs, K H. Analysis of receptor-G protem mteractions m permeabilized cells Naunyn - Schmiedeberg 's Arch. Pharmacol 351: 329 336, 1995).
  • G proteins were first activated by stimulation of cells permeabilized with Digitonm using the peptide mastoparan-7.
  • This peptide mimics the configuration of an activated, G protein-coupled receptor, so that it can be used to induce receptor-independent, direct G protein activation (Ross, EM and Higashi ia, T. Regulation of G-protein activation by mastoparan and other cationic peptides. Methods Enzy ol. 237: 27-38, 1994).
  • the binding of GTP ⁇ S induced by MAS - 7 is completely PTX-sensitive, so that the activation of heterotimeric G-type proteins of the Gi type is thus quantified.
  • Fig. 2 shows the concentration dependence of the G protein activation induced by Mast ⁇ paran-7 (MAS-7) in normotonia (NT) and hypertension (HT).
  • MAS-7 induces a strong [ 35 S] GTP ⁇ S binding on HT cells, the EC50 of which is approx. 5 ⁇ iM (Fig. 2). A binding maximum is reached at about 25 to 50 ⁇ M MAS-7. In contrast, the same [ 35 S] GTP ⁇ S binding to NT cells requires a tenfold higher concentration (Fig. 2).
  • Fig. 3 shows the time course of the binding of [ 35 S] GTP ⁇ S stimulated by mastoparan-7 to cell lines of the normotome nucleus (NT) and hypertensive (HT).
  • Fig. 4 shows the GDP dependency of the binding of [ 35 S] GTP ⁇ S, which was muted by mastoparan-7 st, to isolated cell membranes of normotome nuclei and hypertensives. It can be seen that the maximum of the stimulated [ 35 S] GTP ⁇ S binding on membranes of hypertensive patients is already at lower concentrations of GDP takes place (approx. 0.2 ⁇ mol / L), whereas a concentration of 1 ⁇ mol / L GDP is required for the same effect with normotome cores.
  • G proteins were extracted from membranes of normotonic and hypertensive cells by adding cholate (Mitchell, J., Northup, JK, and Schimmer, BP Defective guanyl nucleotidebmdmg prote ß ⁇ sub units in a forskolin resistant mutant of the Yl adrenocortical cell lme. Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (19): 8933-8937, 1992).
  • Fig. 6 shows the influence of cholate extracts from normotonic and hypertensive cells on the Rhodopsm-stimulated binding of [ 35 S] GTP ⁇ S to ⁇ t.
  • cholate extracts from hypertensive cells require the rhodopsm-catalyzed binding of [ 35 S] GTP ⁇ S to ⁇ t to be significantly higher than is mediated by cholate extracts from normotome nuclei.
  • the new protein consists of 299 amino acids. Compared to the previously described human Gß3 subunit, there is a deletion in the area of the 4th WD repeat. However, due to the regularity of the sequence of certain amino acids, it can be predicted that the new, short Gß3 protein also forms a regular propeller structure, whereby this new propeller no longer consists of seven (Fig. 1), but now consists of 6 propeller blades (Fig 7).
  • the intron begins behind base 497 of the open reading frame when the A of the ATG start codon is defined as +1.
  • GGA CAC CAC GTG ⁇ tgaggctgaacattgctggtgctggggcttgggagtgggcccgg cctttctaaca ⁇ tctccctccatttt ⁇ ca ⁇ TGC CTT GTG GGA
  • MOLECULE TYPE cDNA to mRNA
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • MOLECULE TYPE Protein

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Abstract

Beta-3 Untereinheit eines humanen G-Proteins, die aus höchstens sechs WD-Repeat-Motiven besteht.

Description

PTX-sens i t ive G-Proteme , ihre Herstellung und Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue humane G-Proteme, insbesondere ß3-Unteremheιten der G-Proteme, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
Heterotnmere Guan nukleotid-bmdende Proteine (G-Proteme) haben eine herausragende Bedeutung bei der intrazellularen Signaltransduktion Sie vermitteln die Weiterleitung extra zellularer Signale nach Stimulation von Hormonrezeptoren und anderen Rezeptoren, welche nach Rezeptoraktivierung eine Kon formationsanderung durchmachen. Dies fuhrt zur Aktivierung von G-Protemen, welche nachfolgend intrazellulare Effektoren (z.B Ionenkanale, Enzyme) aktivieren oder hemmen können Heterotnmere G-Proteme sind aus drei Untereinheiten, den α- , ß- und γ-Unter einheiten zusammengesetzt. Bislang wurden mehrere unterschied- liehe α-Unteremheiten, 5 ß-Untereinheiten und ca. 12 γ-Unterem- heiten mittels biochemischer und molekularbiologischer Methoden nachgewiesen (Birnbaumer, L and Birnbaumer, M. Signaltrans - duction by G proteins- 1994 edition. J.Recept . Res . 15:213-252, 1995; Offermanns, S. and Schultz, G. Complex Information process g by the transraembrane signaling System mvolving G proteins. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol . 350:329-338, 1994; Nürnberg, B., Gudermann, T., and Schultz, G. Receptors and G proteins as pπmary components of transmembrane Signal trans duction Part 2 G proteins: strueture and function. J.Mol.Med. 73 123-132, 1995; Neer, E.J. Heterotrimeric G proteins- Organizers of Transmembrane Signals. Cell 80:249-257, 1995; Rens- Do iano, S. and Hamm, H.E. Structural and functional relation- ships of heterotrimeric G-proteins. FASEB J. 9:1059-1066, 1995).
Die rezeptorvermittelte Aktivierung bestimmter α-Unteremheiten kann durch Vorbehandlung mit Pertussistox (PTX) gehemmt werden. Dazu gehören insbesondere die α-Isoformen il, αι2 und αι3, sowie unterschiedliche αo -Untereinheiten. Solche G-Proteine werden auch als "PTX-sensitive G-Proteme" bezeichnet.
ßγ-Untere heiten erfüllen wesentliche Funktionen bei der G-Protemaktivierung sowie bei der Modulation intrazellularer Reaktionen. Alle bisher bekannten G-Protein-ß-Unteremheiten weisen auf der Ebene der Nukleotidsequenz und auf der Ebene der Aminosauresequenz hohe Homologien auf Dabei werden diese Ähnlichkeiten nicht nur innerhalb der humanen ß-Untereinneiten gefunden (ßl, ß2, ß3 ) sondern auch im Vergleich zu ß-Unterem- heiten anderer Spezies, beispielsweise Fruchtfliege oder Hefe.
Aus Rontgenstrukturanalysen konnten diejenigen Aminosäuren in α, ß und γ-Untereinheiten ermittelt werden, welche untereinander in Kontakt stehen und die für die geordnete Ausbildung des Hetero- trimers erforderlich sind.
Alle bislang bekannten G-Protem ß-Untereinheiten gehören zu den sog. "WD-Repeat" -Proteinen. Der N-Terminus der ß-Untereinhei t interagiert vorwiegend mit γ-Untereinheiten, der C-Terminus ist an der Interaktion mit Rezeptoren beteiligt.
ß-Unteremheiten bilden sogenannte Propellerstrukturen aus. Die ß-Propeller der Gß-Untereinheiten bestehen aus 7 "ß-Propeller - blättern", wobei jedes Propellerblatt aus 4 antiparallel angeordneten Aminosäurebereichen besteht. Die siebenfache Symmetrie der ß-Propeller läßt sich auf Ebene der Aminosauresequenz nachweisen, die 7 sogenannte WD-Repeats beinhaltet. Ein WD-Repeat Motiv umfaßt ca. 40 Aminosäuren und weist eine Anzahl konservierter Aminosäuren auf, darunter Trp-Asp-Dipeptidsequenzen . Dieses WD-Mot v beendet häufig das WD repeat (Abb. 1).
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß beispielsweise bei Hypertonikern G-Protein ß3-Untereinheiten vorkommen, die nur aus 6 anstatt der sonst beschriebenen 7 WD-Repeat Motiven bestehen. Diese Hypertoniker wiesen eine gesteigerte zellulare Aktivierbar- keit von PTX-sensitiven G-Proteinen gegenüber Normotonikern auf.
Die molekulare Analyse ergab eine neue Aminosauresequenz für die ß3-Untereinheit bei diesen Hypertonikern, die gegenüber der bekannten Sequenz um 41 Aminosäuren verkürzt ist. Die Sequenz ist in SEQ ID NO: 2 dargestellt. Formal geht sie aus der bekannten humanen ß3-Untereinheit durch Deletion der Aminosäuren 167-207 hervor.
Die entsprechende dafür codierende DNA-Sequenz ist in SEQ ID NO:l beschrieben.
Die Ursache für das Auftreten der verkürzten Gß3-Untereinheit bei Hypertonikern ist vermutlich ein alternatives Spleißen des entsprechenden Gens. Es findet sich auf DNA-Ebene genau vor der putativen Spleißstelle ein Intron. Das Intron beginnt hinter dem Nukleotid 497 des offenen Leserahmens (Numerierung gemäß SEQ ID NO: 1) . Mittels PCR an genomischer DNA konnte auch ein Intron beginnend etwa bei Nukleotid 620 nachgewiesen werden. Die verkürzte Form kommt offenbar durch Deletion eines kompletten Exons zustande. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Her- Stellung von verkürzten Formen von humanen Gß3-Untereinheiten wie sie oben erwähnt sind, durch Expression einer dafür codierenden Nukleinsäuresequenz in einem Wirtsorganismus.
Die rekombinante Expression geschieht bevorzugt durch Herstellen eines Genkonstruktes, das neben der codierenden Nukleinsäuresequenz auch noch weitere Signal- und Regulationssequenzen enthält, wie Promotoren, Terminatoren, Riboso ale Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen und ähnliche. Die allgemeine Vorgehensweise zur rekombinanten Expression eines Gens ist dem Fachmann gelaufig.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erf indungsgemaßen Nukleinsauresequenzen zur Herstellung von Arzneimitteln zur gentherapeutischen Behandlung. Durch Einbringen dieser Nukleinsauresequenzen in direkter Form oder nach Herstellung eines entsprechenden Genvektors in Zellen von Patienten kann in diesen eine erhöhte Aktivierbarkeit von G-Proteinen erreicht werden.
Dies ist bei einer Reihe von Erkrankungen, bei denen eine G-Protein assoziierte Fehlsteuerung vorliegt, wünschenswert.
Unter Krankheiten, die mit einer G-Protein Fehlsteuerung assoziiert sind, sind solche Erkrankungen zu verstehen, bei denen das G-Protein in der Signaltransduktion mvolviert ist und seine Funktion nicht in physiologischer Weise erfüllt.
Bei den Erkrankungen handelt es sich u.a. um Herz-Kreislauf Erkrankungen, Stoffwechselstorungen und Immunerkrankungen.
Als Herz-Kreislauf Erkrankungen sind zu nennen: Hypertonie, Schwangerschaftshypertonie (Gestose, "hypertension in pregnancy" ) , koronare Herzkrankheit, lokalisierte und/oder generalisierte Atherosklerose, Stenosen der Blutgefäße, Restenose nach revaskularisierenden Gef ßeingriffen (z.B. PTCA mit und ohne Stentimplantation) , Apoplexneigung. Thromboseneigung und gesteigerte Thrombozytenaggregation.
Als Stoff echselstorungen sind zu nennen: Metabolisches Syndrom, Insulinresistenz und Hyperinsulinämie, Typ II-Diabetes mellitus, diabetische Komplikationen (z.B. Nephro- pathie, Neuropathie, Retmopathie, etc.) Fettstoffwecnsel - Störungen, gestörte zentrale Chemorezeption (C02-Toleranz , Azido- setoleranz, plötzlicher Kindstod (SIDS)).
Als Immunerkrankungen sind zu nennen: Gestorte Starke der körpereigenen Immunantwort (Bildung von Immunglobulinen, Aggressivität von T-Zellen und NK-Zellen) , gestörte generelle Proliferationsneigung inkl. Wundheilungs- vermogen, Neigung zur Tumorentstehung und Proliferation inkl. Metastasierungspotential maligne transformierter Zellen, Dauer der Latenzzeit nach HIV-Infektion bis zum klinischen Ausbruch der Erkrankung, Kaposi-Sarkom, Neigung zu Leberzhirrose, Trans - plantatoleranz und Transplantatabstoßung .
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erf indungsgemaßen Nukleinsauresequenzen zur Diagnostik von
Erkrankungen, vor allem auch zur Ermittlung des Risikos, ein einer Krankheit, die mit G-Protem-Fehlsteuerung assoziiert ist, zu erkranken.
Neben der Ermittlung des Risikos für bestimmte Erkrankungen können auch allgemeine physiologische Daten und Aussagen durch die erfindungsgemäße Verwendung gemacht werden, beispielsweise zu zentralen Chemorezeption, C0 -Toleranz, Azidosetoleranz, Gefahr des plötzlichen Kindstods (SIDS) , Tauglichkeit für bestimmte Sportarten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Nukleins uresequenzen, die komplementär sind zu den für die verkürzte Form der Gß3-Untereinheit codierenden Nukleinsaure - Sequenzen. Solche Sequenzen lassen sich als Antisense Konstrukte verwenden zur Behandlung oder zur Prävention von Erkrankungen, die mit einer G-Protein Fehlsteuerung assoziiert sind.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Ermittlung eines relativen Erkrankungsrisikos an mit G-Protein- Fehlsteuerung assoziierten Krankheiten für einen Probanden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gensequenz für humanes G-Protein ß3-Untere heit des Probanden mit der Gensequenz SEQ ID NO:l vergleicht und für den Fall, daß sie mit SEQ ID N0:1 übereinstimmt, dem Probanden ein erhöhtes Erkrankungsrisiko zuordnet .
Bei dem erf indungsgemaßen Verfahren zur Ermittlung des relativen Erkrankungsrisikos wird einem Probanden Korpermaterial entnommen, das die genetische Information des Probanden enthalt. Dies wird in der Regel durch Blutentnahme und Isolierung der Nukleinsaure hieraus erreicht.
Aus der isolierten Nukleinsaure des Probanden wird die Gen Struktur für das G-Protein ß3 Untereinheit ermittelt und mit der in SEQ ID N0:1 angegebenen Sequenz verglichen.
Die Ermittlung der Genstruktur kann durch Sequenzierung der Nukleinsaure erfolgen. Dies kann entweder direkt aus der genomischen DNA oder nach Amplif lzierung der Nukleinsaure beispielsweise mittels PCR-Technik erfolgen.
Die Genstruktur kann auf auf mRiMA oder cDNA Ebene erfolgen.
Bevorzugt ist die Ermittlung durch Sequenzierung nach PCR-Ampli fikation der cDNA. Die für die PCR-Reaktion geeigneten Primer lassen sich für den Fachmann leicht aus den in SEQ ID NO:l dar gestellten Sequenzen ableiten. Man verfahrt dabei vorteilhaf ter - weise so, daß jeweils ein Strang und Gegenstrang bindender Primer vor und nach der Deletionsstelle gewählt wird.
Der Genvergleich kann jedoch auch mit anderen Methoden, beispielsweise durch selektive Hybridisierung oder durch entsprechende Kartierung mit Restriktionsenzymen durchgeführt werden.
Die oben beschriebenen diagnostischen Verfahren können auch auf Proteinebene durchgeführt werden. Beispielsweise können die erfindungsgemaßen Proteine dazu verwendet werden, spezifische Antikörper herzustellen, die die verkürzte Form der Gß3-Unter emheit gezielt erkennen. Mittels solcher Antikörper können dann ggf. mittels üblicher ELISA-Methoden proteinchemische Untersuchungen zusatzlich oder alternativ zu den genetischen Untersuchungen durchgeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von transgenen Tieren, die die oben beschriebene Genveranderung (Verkürzung der Gß3-Untereιnheιt) tragen. Solche transgenen Tiere sind vor allem als Tiermodelle für die Untersuchung und Therapie der oben beschriebenen Krankheiten von großer Bedeutung. Die Verfahren zur Erzeugung transgener Tiere sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der Erfindung. Experimenteller Teil
1 Funktionelle Ergebnisse zur G Protein-Aktivierung bei essentieller Hypertonie
Es erfolgte eine detaillierte Charakterisierung der Aktivierung von G- Proteinen aus Zellen normotensiver Probanden und hyper tensiver Patienten. Dazu wurde der stimulierte Einbau von radioaktiv markiertem [35S] GTPγS nach der von Wieland et al. beschrie- benen Methode (Wieland, T., Liedel, K., Kaldenberg Stasch, S., Meyer zu Heπngdorf , D , Schmidt, M , and Jakobs, K H. Analysis of receptor-G protem mteractions m permeabilized cells Naunyn - Schmiedeberg ' s Arch. Pharmacol 351:329 336, 1995) quantifiziert. Die Aktivierung von G- Proteinen erfolgte zunächst durch Stimulation von mit Digitonm permeabiliserten Zellen mittels des Peptids Mastoparan-7. Dieses Peptid ahmt die Konfiguration eines aktivierten, G Protem-gekoppelten Rezeptors nach, so daß damit eine rezeptorunabhangige, direkte G Proteinaktivierung induziert werden kann (Ross, E.M. and Higashi i a, T. Regulation of G-protein activation by mastoparan and other cationic peptides. Methods Enzy ol. 237:27-38, 1994). Die durch MAS - 7 induzierte Bindung von GTPγS ist vollständig PTX-sensitiv, so daß damit die Aktivierung heterotπmerer G-Proteme vom Gi Typ quantifiziert wird. In Abb. 2 ist die Konzentrationsabhangigkei t der durch Mastιparan-7 (MAS-7) induzierten G- Proteinaktivierung bei Normotonie (NT) und Hypertonie (HT) dargestellt. An HT-Zellen induziert MAS-7 e ne starke [35S] GTPγS -Bindung, deren EC50 bei ca. 5 μiM liegt (Abb. 2). Ein Bindungsmaximum wird bei etwa 25 bis 50 μM MAS-7 erreicht. Im Gegensatz dazu werden für die gleiche [35S] GTPγS -Bindung an NT-Zellen lOfach höhere Konzentration benotigt (Abb. 2). Diese Daten belegen, daß die Aktivierung PTX sensitiver G-Proteme in HT-Zellen deutlich weniger aktivierten Rezeptor benotigt als die in NT-Zellen.
in Abb. 3 ist der Zeitverlauf der durch Mastoparan-7 stimulierten Bindung von [35S] GTPγS an Zellmien von Normotomkern (NT) und Hypertonikern (HT) dargestellt.
Die Bindung von [35S] GTPγS an Hypertonikerzellen erfolgt deutlich beschleunigt (Geschwindigkeitskonstanten 0,005 s - bei Normotonie versus 0,01 s l bei Hypertonie).
In Abb. 4 ist die GDP -Abhängigkeit der durch Mastoparan-7 st mu lierten Bindung von [35S] GTPγS an isolierte Zellmembranen von Normotomkern und Hypertonikern dargestellt. Man erkennt, daß das Maximum der stimulierten [35S] GTPγS -Bindung an Membranen von Hypertonikern bereits bei geringeren Konzentrationen von GDP erfolgt (ca. 0,2 μmol/L), wahrend für den gleichen Effekt bei Normotomkern eine Konzentration von 1 μmol/L GDP benotigt wird.
In ähnlicher Weise benotigt die maximale, durch Mastoparan-7 stimulierte Bindung von [35S] GTPγS an Membranpraparationen von Hypertonikerzellen eine geringe Konzentration an freiem Mg2+ (ca 0,01 mmol/L), wahrend für die gleiche maximale [35S] GTPγS Bindung an Membranen von Normotonikerzellen eine freie Mg2+-Konzentratιon von 0,1 mmol/1 erforderlich ist (Abb. 5).
Nachfolgend wurden Experimente zur Rekonstitution der gesteiger ten Aktivierbarkeit von G Proteinen aus Hypertonikerzellen durchgeführt Dazu wurden aus Rinderauge der Photorezeptor Rhodopsm, sowie die G- Proteme-α-Untereinheit Transducm (αt) gereinigt (Phillips, W.J., Wong, S.C., and Ceπone, R.A Rhodopsm/trans ducm mteractions . II Influence of the transducm-ßγ subunit romplex on the couplmg of the transducm a subunit to rhodopsm J.Biol.Chem. 267:17040 17046, 1992). Zusatzlich wurden aus Mem branen von Normotoniker- und Hypertonikerzellen G Proteine durch Zugabe von Cholat extrahiert (Mitchell, J., Northup, J.K., and Schimmer, B.P. Defective guanyl nucleotidebmdmg prote ßγ sub units in a forskolin resistant mutant of the Yl adrenocortical cell lme. Proc.Natl . Acad . Sei . U. S . A. 89 (19) : 8933 - 8937 , 1992). Es wurde die durch Rhodopsm (= Rezeptor) induzierte spezifische Bindung von [35S] GTPγS an α-Transducin (αt) gemessen und der Einfluß von Cholatextrakten aus Membranen von Normotoniker und Hypertonikerzellen auf diese Bindung wurde untersucht. Die Proteinkonzentration der Cholatextrakte war bei allen Versuchen identisch.
In Abb. 6 ist der Einfluß von Cholatextrakten von Normotoniker und Hypertonikerzellen auf die durch Rhodopsm stimulierte Bindung von [35S] GTPγS an αt dargestellt.
Hier wird ersichtlich, daß Cholatextrakte aus Hypertonikerzellen die durch Rhodopsm katalysierte Bindung von [35S] GTPγS an αt deutlich starker fordern, als dies durch Cholatextrakte von Normotomkern vermittelt wird.
Die gezeigten Experimente erlauben die folgenden Schluß - folgerungen-
• Bei Hypertonikerzeilen liegt eine gesteigerte Aktivierbarkeit von G-Protemen vor. Diese erfolgt im Vergleich zur G- Proteinaktivierung bei Normotonikerzellen der Weise effizienter, als Hypertonikerzellen deutlich weniger akti vierten Rezeptor benotigen und zusätzlich die Kinetik der G- Proteinaktivierung deutlich beschleunigt ist (Abb. 2 und 3 ) .
• Zudem benotigt die maximale G-Protemaktivierung bei Hyper- tonikerzellen im Vergleich zu Normotonikerzellen deutlich geringere Konzentrationen an freiem GDP und an freiem Mg-2-'* . Dies fuhrt zu der Schlußfolgerung, daß die Proteininter - aktionen von α- , ß- und γ-Unteremheiten in Hypertoniker - zellen gegenüber der in Normotonikerzellen deutlich effizienter erfolgen (Abb. 4 und 5) .
• Die durch Rhodopsm katalysierte Bindung von [35S] GTPγS an αt wird durch Cholatextrakte aus Hypertonikerzellen deutlich mehr verst rkt als durch Cholatextrakte aus Normotoniker - zellen. Dies beweist, daß die verstärkte G-Protemaktivierung bei Hypertonikerzellen in einem vitro- System rekonsti- tuierbar ist (Abb. 6). Zudem kann aus diesen Befunden die eindeutige Schlußfolgerung gezogen werden, daß die zugrundeliegende Alteration in Hypertonikerzellen bei ßγ-Untere hei - ten heterotrimerer G- Proteine zu suchen ist. In dem genannten Rekonsti tutionssyste werden bei Anwesenheit von αt die in den Cholatextrakten noch vorhandenen α-Unteremheiten nicht mehr aktiviert. Zudem aktiviert der zugegebene Fotorezeptor Rhodopsm spezifisch nur das zugegebene αt, nicht hingegen die endogen in Cholatextrakten verbliebenen α-Unteremheiten.
Das neue Protein besteht aus 299 Aminosäuren. Gegenüber der vormals beschriebenen humanen Gß3 -Untereinheit findet sich eine Deletion im Bereich des 4. WD-Repeats. Aufgrund der Regelmäßig - keit der Abfolge bestimmter Aminosäuren laßt sich jedoch vorhersagen, daß das neue, kurze Gß3-Protem ebenfalls eine regelrechte Propellerstruktur ausbildet, wobei dieser neue Propeller nicht mehr aus sieben (Abb. 1), sondern nunmehr aus 6 Propellerblattern besteht (Abb. 7) .
Da sowohl der N-Terminus, als auch der C-Terminus der neuen, kurzen Gß3- Untereinheiten gegenüber der früher bekannten Gß3 -Untereinheit unverändert sind, läßt sich eine ungestörte Interaktion mit α- und γ-Untereinheiten heterotrimerer G- Proteine sowie mit koppelnden Rezeptoren vorhersagen. Im Zusammenhang mit den oben beschriebenen, funktionellen Ergebnissen ergibt sich, daß die neue, kurze Gß3 -Untereinheit funktionell die bei Hypertonikern beobachtete, gesteigerte Aktivierung heterotrimerer G- Proteine vermittelt. Als Ursache für das Auftreten der verkürzten Gß3 -Untereinheiten bei Hypertonikern wird ein alternatives Spleißen des 'für humanes Gß3 -kodierenden Gens angenommen. Tatsächlich findet sich auf DNS- Ebene genau vor der putativen Spleißstelle ein Intron (Abb. 10) .
Das Intron beginnt hinter der Base 497 des offenen Leserahmens, wenn das A des ATG- Startcodons als +1 definiert ist.
Die Introngrenzen und die "Branch-site" sind kursiv wiedergegeben und unterstrichen.
GGA CAC CAC GTG ≤tgaggctgaacattgctggtgctggggcttgggagtgggcccgg cctttctctaacaαtctccctccattttσαcaσ TGC CTT GTG GGA
Da mittels PCR an genomischer DNS auch ein Intron beginnend bei ca. Base 620 des offenen Leserahmens nachweisbar ist, ist die hier beschriebene verkürzte Form des humanen Gß3 offensichtlich das Ergebnis eines alternativen Spleißens des ursprünglichen Gß3 , wobei es zur Deletion eines kompletten Exons kommt.
SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE INFORMATION: (i) ANMELDER:
(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: Carl-Bosch-Strasse 38
(C) ORT: Ludwigshafen
(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-67056
(G) TELEPHON: 0621/6048526 (H) TELEFAX: 0621/6043123 (I) TELEX: 1762175170
(ii) ANMELDETITEL: PTX-sensitive G-Proteme , Herstellung und Verwendung (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA) (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LANGE: 1394 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaure
(C) STRANGFORM: Doppel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRUNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..900
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: ATG GGG GAG ATG GAG CAA CTG CGT CAG GAA GCG GAG CAG CTC AAG AAG 48 Met Gly Glu Met Glu Gin Leu Arg Gin Glu Ala Glu Gin Leu Lys Lys
1 5 10 15
CAG ATT GCA GAT GCC AGG AAA GCC TGT GCT GAC GTT ACT CTG GCA GAG 96 Gin Ile Ala Asp Ala Arg Lys Ala Cys Ala Asp Val Thr Leu Ala Glu
20 25 30
CTG GTG TCT GGC CTA GAG GTG GTG GGA CGA GTC CAG ATG CGG ACG CGG 144 Leu Val Ser Gly Leu Glu Val Val Gly Arg Val Gin Met Arg Thr Arg
35 40 45
CGG ACG TTA AGG GGA CAC CTG GCC AAG ATT TAC GCC ATG CAC TGG GCC 192 Arg Thr Leu Arg Gly His Leu Ala Lys Ile Tyr Ala Met His Trp Ala 50 55 60 ACT GAT TCT AAG CTG CTG GTA AGT GCC TCG CAA GAT GGG AAG CTG ATC 240 Thr Asp Ser Lys Leu Leu Val Ser Ala Ser Gin Asp Gly Lys Leu Ile 65 70 75 80
GTG TGG GAC AGC TAC ACC ACC AAC AAG GTG CAC GCC ATC CCA CTG CGC 288 Val Trp Asp Ser Tyr Thr Thr Asn Lys Val His Ala Ile Pro Leu Arg
85 90 95
TCC TCC TGG GTC ATG ACC TGT GCC TAT GCC CCA TCA GGG AAC TTT GTG 336 Ser Ser Trp Val Met Thr Cys Ala Tyr Ala Pro Ser Gly Asn Phe Val
100 105 110
GCA TGT GGG GGG CTG GAC AAC ATG TGT TCC ATC TAC AAC CTC AAA TCC 384 Ala Cys Gly Gly Leu Asp Asn Met Cys Ser Ile Tyr Asn Leu Lys Ser
115 120 125
CGT GAG GGC AAT GTC AAG GTC AGC CGG GAG CTT TCT GCT CAC ACA GGT 432 Arg Glu Gly Asn Val Lys Val Ser Arg Glu Leu Ser Ala His Thr Gly
130 135 140
TAT CTC TCC TGC TGC CGC TTC CTG GAT GAC AAC AAT ATT GTG ACC AGC 480 Tyr Leu Ser Cys Cys Arg Phe Leu Asp Asp Asn Asn Ile Val Thr Ser 145 150 155 160
TCG GGG GAC ACC ACG TGT GCC AAG CTC TGG GAT GTG CGA GAG GGG ACC 528 Ser Gly Asp Thr Thr Cys Ala Lys Leu Trp Asp Val Arg Glu Gly Thr
165 170 175
TGC CGT CAG ACT TTC ACT GGC CAC GAG TCG GAC ATC AAC GCC ATC TGT 576 Cys Arg Gin Thr Phe Thr Gly His Glu Ser Asp Ile Asn Ala Ile Cys
180 185 190
TTC TTC CCC AAT GGA GAG GCC ATC TGC ACG GGC TCG GAT GAC GCT TCC 624 Phe Phe Pro Asn Gly Glu Ala Ile Cys Thr Gly Ser Asp Asp Ala Ser
195 200 205
TGC CGC TTG TTT GAC CTG CGG GCA GAC CAG GAG CTG ATC TGC TTC TCC 672 Cys Arg Leu Phe Asp Leu Arg Ala Asp Gin Glu Leu Ile Cys Phe Ser
210 215 220
CAC GAG AGC ATC ATC TGC GGC ATC ACG TCT GTG GCC TTC TCC CTC AGT 720 His Glu Ser Ile Ile Cys Gly Ile Thr Ser Val Ala Phe Ser Leu Ser 225 230 235 240
GGC CGC CTA CTA TTC GCT GGC TAC GAC GAC TTC AAC TGC AAT GTC TGG 768 Gly Arg Leu Leu Phe Ala Gly Tyr Asp Asp Phe Asn Cys Asn Val Trp
245 250 255
GAC TCC ATG AAG TCT GAG CGT GTG GGC ATC CTC TCT GGC CAC GAT AAC 816 Asp Ser Met Lys Ser Glu Arg Val Gly Ile Leu Ser Gly His Asp Asn
260 265 270
AGG GTG AGC TGC CTG GGA GTC ACA GCT GAC GGG ATG GCT GTG GCC ACA 864 Arg Val Ser Cys Leu Gly Val Thr Ala Asp Gly Met Ala Val Ala Thr
275 280 285
GGT TCC TGG GAC AGC TTC CTC AAA ATC TGG AAC TGAGGAGGCT GGAGAAAGGG 917 Gly Ser Trp Asp Ser Phe Leu Lys Ile Trp Asn
290 295 300
AAGTGGAAGG CAGTGAACAC ACTCAGCAGC CCCCTGCCCG ACCCCATCTC ATTCAGGTGT 977 TCTCTTCTAT ATTCCGGGTG CCATTCCCAC TAAGCTTTCT CCTTTGAGGG CAGTGGGGAG 1037 CATGGGACTG TGCCTTTGGG AGGCAGCATC AGGGACACAG GGGCAAAGAA CTGCCCCATC 1097 TCCTCCCATG GCCTTCCCTC CCCACAGTCC TCACAGCCTC TCCCTTAATG AGCAAGGACA 1157 ACCTGCCCCT CCCCAGCCCT TTGCAGGCCC AGCAGACTTG AGTCTGAGGC CCCAGGCCCT 1217 AGGATTCCTC CCCCAGAGCC ACTACCTTTG TCCAGGCCTG GGTGGTATAG GGCGTTTGGC 1277 CCTGTGACTA TGGCTCTGGC ACCACTAGGG TCCTGGCCCT CTTCTTATTC ATGCTTTCTC 1337 CTTTTTCTAC CTTTTTTTCT CTCCTAAGAC ACCTGCAATA AAGTGTAGCA CCCTGGT 1394 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 299 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: Met Gly Glu Met Glu Gin Leu Arg Gin Glu Ala Glu Gin Leu Lys Lys
1 5 10 15
Gin Ile Ala Asp Ala Arg Lys Ala Cys Ala Asp Val Thr Leu Ala Glu
20 25 30
Leu Val Ser Gly Leu Glu Val Val Gly Arg Val Gin Met Arg Thr Arg
35 40 45
Arg Thr Leu Arg Gly His Leu Ala Lys Ile Tyr Ala Met His Trp Ala
50 55 60
Thr Asp Ser Lys Leu Leu Val Ser Ala Ser Gin Asp Gly Lys Leu Ile 65 70 75 80
Val Trp Asp Ser Tyr Thr Thr Asn Lys Val His Ala Ile Pro Leu Arg
85 90 95
Ser Ser Trp Val Met Thr Cys Ala Tyr Ala Pro Ser Gly Asn Phe Val
100 105 110
Ala Cys Gly Gly Leu Asp Asn Met Cys Ser Ile Tyr Asn Leu Lys Ser
115 120 125
Arg Glu Gly Asn Val Lys Val Ser Arg Glu Leu Ser Ala His Thr Gly
130 135 140
Tyr Leu Ser Cys Cys Arg Phe Leu Asp Asp Asn Asn Ile Val Thr Ser 145 150 155 160
Ser Gly Asp Thr Thr Cys Ala Lys Leu Trp Asp Val Arg Glu Gly Thr
165 170 175
Cys Arg Gin Thr Phe Thr Gly His Glu Ser Asp Ile Asn Ala Ile Cys
180 185 190
Phe Phe Pro Asn Gly Glu Ala Ile Cys Thr Gly Ser Asp Asp Ala Ser
195 200 205
Cys Arg Leu Phe Asp Leu Arg Ala Asp Gin Glu Leu Ile Cys Phe Ser
210 215 220
His Glu Ser Ile Ile Cys Gly Ile Thr Ser Val Ala Phe Ser Leu Ser 225 230 235 240
Gly Arg Leu Leu Phe Ala Gly Tyr Asp Asp Phe Asn Cys Asn Val Trp
245 250 255
Asp Ser Met Lys Ser Glu Arg Val Gly Ile Leu Ser Gly His Asp Asn 260 265 270 Arg Val Ser Cys Leu Gly Val Thr Ala Asp Gly Met Ala Val Ala Thr
275 280 285
Gly Ser Trp Asp Ser Phe Leu Lys Ile Trp Asn 290 295

Claims

Patentansprüche
1. Beta-3 Untereinheit eines humanen G-Proteins, die aus höchstens sechs WD-Repeat-Motiven besteht.
2. Protein nach Anspruch 1 mit der m SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz .
3. Nukleinsäuresequenz codierend für ein Protein nach Anspruch 1 oder 2.
4. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 3 mit der in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz.
5. Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der vorstehenden Ansprüche ggf. mit geeigneten Regulationssignalen versieht und m einem Wirtsorganismus zur Expression bringt.
6. Verfahren nach Anspruch 5 wobei die Expression in Immunzellen immundef izienter Personen erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6 wobei es sich um HIV positive Personen handelt.
8. Verfahren nach Anspruch 5 wobei die Expression in humanen Korperzellen erfolgt.
9. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der vor¬ stehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von mit G-Protein-Fehlsteuerung assoziierten Krankheiten.
10. Verwendung einer Genveränderung im Gen für humanes G-Protein ß3-Untereinheit zur Diagnostik von Erkrankungen.
11. Verwendung einer Genveränderung im Gen für humanes G-Protein ß3-Untereinheit zur Ermittlung des Risikos, an einer Krank¬ heit, die mit G-Protein-Fehlsteuerung assoziiert ist, zu erkranken .
12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Genveränderung die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleinsäuresequenz umfaßt.
5 13. Verwendung nach Anspruch 10-12, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit eine Herz-Kreislauf-Erkrankung, eine Stoff - wechselstorung oder eine Immunerkrankung ist.
14. Verwendung nach Anspruch 10-12, dadurch gekennzeichnet, daß 10 die Krankheit Hypertonie ist.
15. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Erzeugung transgener Tiere.
15 16. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu der Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 3 oder 4 ist zur Herstellung eines Antisense-Arzneimittels zur Therapie oder Prävention von Krankheiten.
20 17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheiten Hypertonie, Schwangerschaftshypertonie, koronare Herzkrankheit, Restenose nach angioplastischen Verfahren oder Apoplex ist.
25 18. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheiten eine diabetische Folgeerkrankung wie Nepropathie, Polyneuropathie oder Retionpathie ist.
19. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die 30 Krankheit ein metastasierender Tumor ist.
20. Verfahren zur Ermittlung eines relativen Erkrankungsrisikos an mit G-Protein-Fehlsteuerung assoziierten Krankheiten für einen Probanden, indem man die Gensequenz für humanes
35 G-Protein ß3-Untereinheit des Probanden mit der Gensequenz SEQ ID NO: 1 vergleicht und für den Fall, daß sie mit SEQ ID NO: 1 übereinstimmt, dem Probanden ein erhöhtes Erkrankungsrisiko zuordnet.
40 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genvergleich durch Sequenzierung, Restriktionsanalyse oder selektive Hybridisierung vornimmt.
22. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Her- 45 Stellung von spezifisch gegen dieses Protein gerichteten Antikörpern.
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