WO1997035964A1 - Particules magnetiques fines contenant des proteines utiles auxquelles elles sont liees, procede de production et utilisation de ces particules - Google Patents

Particules magnetiques fines contenant des proteines utiles auxquelles elles sont liees, procede de production et utilisation de ces particules Download PDF

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WO1997035964A1
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magnetic
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membrane
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Tadashi Matsunaga
Shinji Kamiya
Kenryo Namba
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Definitions

  • the present invention relates to protein-bound magnetic fine particles and a method for producing the same, novel proteins and genes related thereto, and a method for measuring a target substance using the protein-bound magnetic fine particles.
  • Bioactive proteins such as enzymes and antibodies immobilized on magnetic microparticles can be induced by magnetic means. Because it can be collected and separated, it is expected to be used in various industries including the medical and fermentation fields.
  • an object of the present invention is to solve the drawbacks of the conventional technology of immobilizing an enzyme, an antibody, or a labeled compound on magnetic microparticles by a chemical method, and to provide a method for measuring a target substance that can obtain high detection sensitivity, and a method for measuring the same
  • An object of the present invention is to provide magnetic fine particles to be used.
  • the present invention comprises, firstly, magnetic fine particles produced in the cells of magnetic bacteria, and a hybrid protein bound to an organic film covering the magnetic fine particles, and the hybrid protein is naturally contained in the organic film.
  • the useful protein-bound magnetic microparticles which are hybrid proteins in which a polypeptide chain containing at least a membrane-bound portion of a membrane protein formed by binding and at least one other useful protein are biologically bound, provide.
  • FIG. 1 is a diagram showing the distribution of the hydrophilic region and the hydrophobic region of the amino acid sequence of the mps protein obtained by the analysis using the Kyte-doo little method.
  • Fig. 5 illustrates the production of 5A, and is a restriction enzyme cleavage site map of the plasmid.
  • FIG. 3 is an illustration of a method for preparing the plasmids pKLC and pKSL prepared in Example 1.
  • FIG. 4 is a map of restriction enzyme cleavage sites of plasmid pKLC.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of a method for preparing the plasmid pKSG prepared in Example 2.
  • FIG. 6 is a map of restriction enzyme cleavage sites of plasmid pKLC.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram of a method for preparing the plasmid pKSA prepared in Example 3.
  • FIG. 8 is a map of restriction enzyme cleavage sites of plasmid pKSA.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram of a method for preparing the plasmid pNELS prepared in Example 4.
  • FIG. 10 is a map of restriction enzyme cleavage sites of plasmid pNELS.
  • FIG. 11 is an explanatory diagram of a method for preparing the plasmid pNELSC prepared in Example 5.
  • FIG. 12 is a map of restriction enzyme cleavage sites of plasmid pNELSC.
  • FIG. 13 is an explanatory diagram of a method for preparing the plasmid pNPML prepared in Example 6.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram of a method for preparing the plasmid pKZMPL prepared in Example 7. : BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the magnetic fine particles used in the present invention are fine particles made of magnetite having a particle size of about 50 to 150 nm, which are produced in the cells of magnetic bacteria.
  • magnetic bacteria that can be used include, for example, microorganisms of the species Magnetospirillum (eg, strains-"FERM BP-5458"), MS-1 (IF0 15272, ATCC 31632, DSM 3856) SR-1 (IF0 15272 DSM 6361), and microorganisms of the species Desulfovibrio (eg, strain RS-1 (FERM P-13283)).
  • the magnetic microparticles produced in the cells of these magnetic bacteria are coated with an organic film mainly composed of phospholipids.
  • Various membrane proteins are bound to the organic film.
  • the membrane protein used in the present invention preferably has a relatively strong bond to the organic film and a part of the membrane protein is exposed to the outside of the membrane. Particularly, both ends are exposed to the outside. Is preferred.
  • the membrane-bound portion of the membrane protein is used as a means for immobilizing a useful protein to an organic membrane.
  • the exposed part binds useful proteins to their membrane proteins. Used to combine.
  • biological binding refers to the case where two proteins are integrated as a polypeptide in a fused state, as well as the binding by antigen-antibody reaction and the reaction by ligand-receptor reaction. Bonding and the like.
  • bonding form examples include the following. These may be selected depending on the type of the membrane protein used as the fixing means and the like.
  • a first useful protein of the two useful proteins is biologically bound to one end of a polypeptide chain containing a membrane-bound portion, and a second useful protein is attached to the other end of the bound protein.
  • a form in which useful proteins are linked in series. The binding order of the two useful proteins may be appropriately selected depending on the type of the protein used and the like.
  • the protein-protein bond may be in the form of a direct biological bond, or may be interposed by a third protein via a biological bond. It may be in a form of bridge connection.
  • three or more useful proteins may be bound in a combined form of the forms (b) and (c).
  • the “polypeptide chain containing at least a membrane-binding portion of a membrane protein” may be only an amino acid sequence corresponding to the membrane-binding portion, or may be derived from the membrane protein outside thereof. It may have an amino acid sequence that is not derived.
  • the above-mentioned useful protein-bound magnetic microparticles use transformed magnetic bacteria. Can be manufactured.
  • the present invention secondly provides a method for producing the above-mentioned useful protein-bound magnetic fine particles, which comprises a gene encoding at least a membrane-bound portion of a membrane protein originally produced by binding to an organic membrane.
  • the fusion DNA sequence is expressed by culturing a magnetic bacterium transformed with a recombinant plasmid containing the fusion DNA sequence of the fragment and the DNA sequence encoding the useful protein, thereby expressing the fusion protein.
  • useful protein-bound magnetic microparticles which is produced in the cells in a state of being bound to an organic film covering the magnetic microparticles.
  • Transformation of a magnetic bacterium with the above recombinant plasmid can be performed by a known method.
  • Examples of the magnetic bacterium used as a host include those exemplified above.
  • the useful protein of interest is transformed into a polypeptide chain containing a membrane-bound portion of a membrane-bound protein in the cells. Generated in a state fused with The fusion protein is in a state of being bound to the organic film covering the magnetic fine particles.
  • the useful protein-bound magnetic microparticles can be easily collected by using magnetism after disrupting or dissolving the cells of magnetic bacteria grown by culturing by a usual method.
  • a magnetic bacterium serving as a source of a membrane protein used as a means for immobilizing a useful protein and a magnetic bacterium serving as a host of the recombinant plasmid may be the same or different. Good.
  • any membrane protein that is tightly bound to the organic film that coats the magnetic microparticles inside the bacterial cells of the magnetic bacterium, and that is preferably produced with a part of the membrane exposed outside the organic film is a protein-bound magnetic material according to the present invention. It can be used for the production method of fine particles. As long as the gene encoding at least the membrane-binding portion of such a membrane protein is known, it becomes publicly known.
  • a recombinant plasmid containing a fusion DNA sequence containing this gene fragment and one or more DNA sequences encoding one or more desired useful proteins is prepared according to the method described in By transforming a suitable magnetic bacterium with the recombinant brassmid and culturing the obtained transformed magnetic bacterium, magnetic microparticles having the useful protein bound thereto are produced in the cells of the transformed magnetic bacterium. You.
  • the present inventors have found the mps protein and mag A protein produced by the magnetic bacterium AMB-1 (FER BP-5458). .
  • the mps protein is an isolated and produced protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (shown together with the base sequence of the corresponding structural gene) in the sequence listing below.
  • This protein was isolated and purified as follows.
  • the magnetic bacterium AMB-1 was cultured until stationary phase, and after centrifugation, the cells were disrupted by a French press.
  • the cell membrane fraction was separated from this crushed product, and the magnetic fine particle fraction was further separated and purified using a summary cobalt magnet. Then 1% Tr The mixture was stirred in a yton lOmM Tris buffer for 2 hours to separate the magnetic fine particles from the organic film.
  • the extract thus treated was subjected to protein electrophoresis.
  • mps protein the protein with the highest content was named mps protein. It was confirmed that the band position of this mps protein was found to be a protein coded from the mps structural gene described below, and was located at a molecular weight of 34.49 kDa.
  • FIG. 1 shows the result of analyzing the distribution of the hydrophilic region and the hydrophobic region of the amino acid sequence of the mps protein by the 1 ⁇ 16-01001116 method. From this result, the range from the central N-terminal to the 73rd to 24th amino acid residues (region A in Fig. 1) is relatively hydrophobic and contributes to the binding to the organic membrane. The range of amino acid residues 1 to 72 on the N-terminal side and the range of amino acid residues 23 to 31 on the C-terminal side are relatively hydrophilic. Highly exposed almost entirely outside the organic film. The range of the 73rd to 234th amino acid residues at the center is the membrane-bound portion.
  • the above mps protein is encoded by the mps structural gene.
  • the mps structural gene is composed of a DNA sequence represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 described in the below-mentioned sequence listing.
  • the mps structural gene shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing was isolated and purified from the magnetic bacterium AMB-1 as follows.
  • the mps protein separated as described above was subjected to amino acid sequencing by the Edman degradation method, and the N-terminal amino acid sequence was determined.
  • a primer was prepared from the N-terminal amino acid sequence, and the gene fragment encoding the N-terminal portion of the mps protein present only in the organic membrane was cloned by PCR. This gene break Based on the fragment, a sph I fragment of about 2 k around it was cloned by gene walking. As a result of sequencing and analysis of this gene fragment, a 954 kb mps structural gene sequence was determined, and the amino acid sequence described above was derived from the gene sequence.
  • a promoter exists within a range of about 700 nucleotides upstream of the sequence of the mps structural gene. Other known promoters can also be used.
  • the DNA sequence coding for the membrane-binding portion in the mps structural gene is in the range of 217 to 702 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • the method for producing useful protein-bound magnetic microparticles includes a gene fragment containing at least a DNA sequence in this range (corresponding to the above-mentioned gene fragment corresponding to the polypeptide chain containing the membrane-bound portion in the membrane protein described above). This is hereinafter referred to as “membrane junction gene fragment”) and is used for fusion with a DNA sequence encoding a desired useful protein.
  • the membrane-binding portion gene fragment may be composed of only a DNA sequence encoding the membrane-binding portion, or a DNA sequence originally present or absent in the mps structural gene at the 3 ′ end or 5 ′ end thereof. May be included. Part or all of the DNA sequence originally contained in the mps structural gene may be present as it is. Rather, the presence of a DNA sequence that is relatively hydrophilic and encodes a portion exposed to the outside of the organic membrane is advantageous because useful proteins produced in a bound state are expressed in an exposed form outside the organic membrane.
  • the B1 region the range from the 1st base to the 21st base
  • the B2 region the 703th base to the 951st base
  • the region of C1 in FIG. 1 the range of 154th base to 216th base
  • a DNA sequence encoding base 703 to base 768 is present.
  • the membrane-binding portion gene fragment contains, as an essential element, a gene encoding the membrane-binding portion of the above-mentioned membrane protein, and may be composed of only this.
  • the nucleotide sequence originally present in the mps structural gene may be present at the 3 ′ terminal side and at the 5 ′ terminal side. Alternatively, at one or both of the 3′-end and the 5′-end, a DNA sequence artificially extended so as to generate a restriction enzyme cleavage site may be conveniently present.
  • the membrane-bound gene fragment plays an important role in expressing a membrane-bound portion, which is a means for immobilizing a useful protein to an organic membrane.
  • the amino acid sequence of the mag A protein is as shown in SEQ ID NO: 4 (shown together with the base sequence of the corresponding mag A gene) in the sequence listing below, and the first to sixth amino acids from the N-terminus.
  • the range of the amino acid residue is a hydrophilic region, and the range of the 7th to 380th amino acid residue is the hydrophobic region, and the range of the 38th to 43th amino acid is the next.
  • the range of residues is the second hydrophilic region.
  • the long hydrophobic region at the center is the membrane-bound portion, and the hydrophilic regions at both ends are exposed from the membrane. Specifically, the hydrophobic region contains about four short hydrophilic portions, and it is presumed that these portions are partially exposed from the membrane.
  • the hydrophobic region of the magA protein binds the protein to the organic film of the magnetic microparticles, and the hydrophilic regions at both ends are exposed from the organic film.
  • This hydrophobic region is the membrane-binding portion of the magA protein to the organic membrane.
  • the mag A protein was isolated and purified as follows.
  • the magnetic bacterium AMB-1 was cultured until stationary phase, and after centrifugation, cells were disrupted by a French press. Magnetic fine particles were extracted from this crushed material using a summary drum cobalt magnet and purified. Next, the mixture was stirred in l ° / oTryton 10 mM Tris buffer for 2 hours to separate the magnetic particles and the membrane.
  • SDS-PAGE protein electrophoresis
  • mag A protein (m ag A structural gene) was found to be composed of the DNA sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 described in the sequence listing below.
  • a promoter sequence is adjacent to the upstream of the mag A gene sequence (J. Biochem. 118, 23-27 (1995)).
  • the mag A protein is generally encoded by a DNA sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • magA gene represented by SEQ ID NO: 5 was found from the magnetic bacterium AMB-1 as follows, and was isolated and purified.
  • transposable gene Tn5 By introducing the transposable gene Tn5, a transposable gene having a drug resistance factor (Km), into the magnetic bacterium AMB-1, mutagenesis is generated nonspecifically in the genome, A mutant that lacked the function of refining magnetic fine particles was produced. Next, cells that did not respond magnetically to the drug resistance factor (K m) as an indicator were isolated, and genomics were extracted from this mutant. After digestion with EcoRI, a gene fragment containing the magA gene is isolated by Southern hybridization using the formation of a hybrid with the transposon Tn5 as an index, and cloned into pUC19. Purification was performed. Figure 2 shows the plasmid pUM5A prepared here. As a result of the gene analysis, 1.3 kb of the magA gene was found.
  • Km drug resistance factor
  • the DNA sequence encoding the membrane-binding portion in the magA structural gene is in the range of 19 to 114 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • at least a gene fragment containing a DNA sequence in this range is used for fusion with a DNA sequence encoding a desired useful protein.
  • the membrane-binding portion gene fragment may be composed of only a gene encoding the membrane-binding portion of magA protein, or may include a part or all of the hydrophilic region.
  • the gene fragment at the membrane junction contains a gene encoding the membrane junction, and the DNA sequence generated at the fusion site with the DNA sequence encoding the useful protein has amino acid synthesis.
  • a DNA sequence encoding a useful protein may be introduced in a form close to the DNA sequence encoding the binding portion, or a DNA sequence encoding a hydrophobic region and a DNA sequence encoding a useful protein may be introduced.
  • a DNA sequence encoding the hydrophilic region may be partially present therebetween.
  • a DNA sequence artificially extended so as to generate a convenient restriction enzyme cleavage site may be present at one or both ends of the membrane-bound gene fragment.
  • the ScaI cleavage site introduced into the magA gene is a 5'-terminal restriction enzyme cleavage site that is functional as a site for inserting a DNA sequence encoding a useful protein of interest.
  • the 3'-terminal restriction enzyme cleavage sites include a Sphl cleavage site and a Dral II cleavage site.
  • the SphI cleavage site and the DraI1I cleavage site are one of the convenient sites because they exist in the hydrophilic region slightly downstream from the hydrophobic region of the magA gene.
  • a membrane-binding portion gene fragment encoding a polypeptide chain containing at least a membrane-binding portion of a membrane protein such as an mps protein or a mag A protein; and (b) — or two or more desired useful proteins.
  • a fusion DNA sequence of is prepared.
  • the DNA sequence encoding one or more useful proteins may be fused to one or both of the 3′-end and the 5′-end of the membrane-binding-region gene fragment.
  • the DNA sequence introduced at the 3 'end and the DNA sequence introduced at the 5' end may encode the same protein or different proteins. May be encoded. The advantages of merging both are obtained in the following cases.
  • this subunit can be formed quickly and completely.
  • two or more DNA sequences encoding two or more proteins may be sequentially fused in series to either the 5 'end or the 3' end.
  • the type of the gene encoding another protein to be fused is not particularly limited.
  • the transformed magnetic bacterium that produces the useful protein-bound magnetic microparticles of the present invention has been transformed with the above-mentioned recombinant plasmid containing the fusion DNA sequence.
  • the recombinant plasmid can be obtained by introducing the above-mentioned fused DNA sequence into an appropriate vector plasmid by a known method.
  • a vector used for preparation of a recombinant plasmid for example, a pRK415 strain and a pKT230 strain can be used. Integrate the gene into the selected vector. Determine the restriction enzymes to be used in the order of gene integration so that the vector is most efficient and the genes are aligned in the desired direction. Once the procedure for introducing the gene has been determined, the DNA is cleaved with a restriction enzyme, and the target gene fragment to be introduced is separated by electrophoresis. After that, ligase is performed using ligase and DNA is ligated. If the connecting portions of the gene fragments do not match, the terminal portion is smoothed and ligated. Restriction enzymes, ligases, enzymes for blunting the ends, and the like can all be obtained using commercially available products. Finally, check the restriction enzyme cleavage pattern to see if the desired plasmid is obtained.
  • Transformation of a magnetic bacterium with the above plasmid can be performed by a known method.
  • the magnetic bacteria used as a host may be the same or different from the magnetic bacteria that are the source of the membrane protein used. Preferably they are of the same species. Typical examples of magnetic bacteria that can be used include AMB-1 but are not limited thereto.
  • microorganisms of the species Magnetospiril lum eg, strain AMB_1 (FERM BP-5458), MS
  • SR-1 IF0 15272 DSM 6361
  • microorganisms of the species Orochi e sul fovibrio eg, strain RS_1 (13283)
  • the target protein is produced in a state where it is fused with the polypeptide chain encoded by the membrane-binding gene fragment and is bound to the organic membrane covering the magnetic fine particles.
  • the thus-produced useful protein-bound magnetic fine particles can be easily collected by utilizing the magnetism after disrupting or dissolving the cells of the grown magnetic bacteria by a usual method.
  • the above method for producing a useful protein is difficult to obtain in a pure form by a conventional production method, even if the protein is a useful protein having no functionality.
  • it is useful as a method for producing the protein.
  • the useful protein is obtained in a state of being bound to the magnetic fine particles.
  • the useful protein can be easily separated and purified from other cell components by a magnetic method using a magnet or the like as described above.
  • the gene encoding a useful protein fused to the membrane-binding portion of the membrane protein, or the protein expressed thereby When used for the purpose of medical treatment, industry utilizing fermentation, etc., a protein having some function, for example, a physiological activity is used.
  • the present invention is not limited to this, and the present invention can be used for the production of proteins that are difficult to separate and obtain by ordinary methods. That, c such protein is produced on the magnetic fine particles in the form of a fusion protein can be collected magnetically easily separated
  • functional proteins include, for example, antigens, antibodies, pro Immune-related proteins such as tin A, proteins having binding ability such as lectin and avidin, enzymes such as coenzymes, hydrolases, oxidoreductases, isomerases, transferases, lyases, and restriction enzymes Is mentioned.
  • the above method for producing a useful protein is difficult to obtain in a pure form by a conventional production method, even if the protein is a useful protein having no functionality.
  • it is useful as a method for producing the protein.
  • the useful protein is obtained in a state of being bound to the magnetic fine particles.
  • the useful protein can be easily separated and purified from other cell components by a magnetic method using a magnet or the like according to the above method. Magnetic fine particles in which binding protein and labeled protein are bound
  • the present invention provides, as one embodiment of the above-mentioned useful protein-bound magnetic fine particles, a magnetic fine particle in which a binding protein and a labeled protein are bonded as useful proteins, and a method for measuring a target substance using the same.
  • the magnetic fine particles in which the binding protein and the labeled protein are bonded to each other are coated with the magnetic fine particles generated in the bacterial cells of the magnetic bacterium. Characterized in that it is bonded to a polypeptide chain containing at least a membrane-bound portion of a membrane protein formed by binding to an organic membrane by a biological bond in a state close to each other. Microparticles are provided. Target substance measurement method
  • the binding protein and the labeled protein bind to the organic membrane covering the magnetic microparticles formed in the cells of the magnetic bacterium to form a polypeptide chain containing at least a membrane-bound portion of the membrane protein formed. , Characterized in that they are in close proximity to each other and are linked by biological binding.
  • a method for measuring a target substance is provided.
  • the function of the labeled protein bound to the magnetic microparticles is reduced mainly due to physical (steric) damage. Therefore, the detection signal from the labeled protein, for example, the amount of luminescence decreases when the labeled protein is a luminescence-related enzyme, according to the amount of aggregation of the magnetic fine particles and, consequently, the reaction amount of the target substance.
  • the target substance can be detected or quantified.
  • the agglutination reaction can be easily promoted after the reaction, for example, by applying an alternating magnetic field.
  • binding form between the binding protein and the labeled protein examples include the following. These can be selected depending on the type of membrane protein used as the fixing means.
  • binding protein and a labeled protein are respectively bound to different ends of a polypeptide chain.
  • the binding of a functional protein such as a binding protein or a labeled protein may be in a form directly fused to the polypeptide chain, or a third protein may be fused to a terminal portion of the polypeptide chain, and the third protein may be fused.
  • the functional protein may be bound by a biological bond.
  • binding protein and the labeled protein are fused to one end of the polypeptide chain, and the other functional protein is fused to the other end of the fused functional protein.
  • binding proteins The binding order of the labeled proteins can be determined by selecting an appropriate order according to the type of the protein used.
  • the condition that the binding protein and the target protein are bonded to the polypeptide chain “in a state of being close to each other” means that there is no other peptide between each other, or It means that there are only ⁇ 1000 peptides. At this time, it is necessary that the activity of the mutual proteins does not decrease due to steric hindrance or the like, and that the activity of the third protein binding to the binding protein does not decrease.
  • the target substance that can be measured by the above method may be any target substance as long as there is a binding protein capable of specifically binding to the target substance.
  • the method of specific binding is not limited, and examples thereof include an antigen-antibody reaction and a ligand-receptor binding reaction.
  • target substances that can be measured by the above-mentioned method include, for example, substances capable of binding to proteins as antigens, antibodies, and ligands (substrates that bind to enzymes, coenzymes, regulatory factors; lectins that bind to receptors, Hormones, neurotransmitters, etc.), any one of protein A and antibodies, polysaccharides that bind to lectins, complex saccharides, and avidin that binds to avidins such as avidin and streptavidin. It is well known that various substances such as antibodies, animal and plant cells, bacteria, and viruses can function as antigens, and are the subject of the measurement method of the present invention. [Binding protein]
  • the binding protein bound to the magnetic microparticle is a protein that can specifically bind to a target substance in a target sample.
  • the binding protein is selected according to the target substance described above.
  • Examples of the binding protein include an antibody, a protein that acts as an antigen, a protein that binds to the above ligand, protein A and the remaining antibody, and other immune-related proteins, lectin, avidin, and the like. .
  • the labeled protein that is a functional protein that generates a signal for detection includes, for example, a fluorescent protein such as green fluorescein protein, a fluorescent dye-binding protein, or luciferase, alkaline phosphatase, ⁇
  • a fluorescent protein such as green fluorescein protein, a fluorescent dye-binding protein, or luciferase, alkaline phosphatase
  • Optical measurement of luminescence-related enzymes involved in bioluminescence or chemiluminescence such as lucoxidase, / 3-D-galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • the former is preferred because it can be measured directly using optical means.
  • the mps-1uc fusion gene was used to express the firefly luciferase gene (1 uc gene, manufactured by Toyo Ink) in a magnetic bacterium and to generate the luminescent protein encoded by the gene on an organic film covering the magnetic microparticles.
  • the plasmid p KSL to which was bound was prepared by the method shown in FIG.
  • the vector can be transfected into the magnetic bacterium AM B-1 by conjugative transfer, and the plasmid pRK415 (N.T.Neen, S. Tamaki, D. Ko bayashiand D. Tra 11 inger, 1988, Gene 70: 191—197) were used.
  • pRK415 was digested with BamHI and SacI, and the 1 uc gene digested with BamHI and SacI was integrated to prepare plasmid pKLC. Further, plasmid pKLC was digested with BamHI present upstream of the 1 uc gene.
  • an F-primer having a sequence complementary to the 5 ′ end of the DNA sequence containing the mps structural gene and a promoter site located upstream thereof, and further designing a BamHI cleavage site Amplified by PCR using R-primer, which has a sequence complementary to the 3 'end of the DNA sequence and has a BamHI cleavage site designed, and BamHI cleavage at both ends
  • a binding DNA sequence to which a site was added was prepared.
  • the amplified binding DNA sequence was ligated with plasmid pKLC to generate plasmid pKSL.
  • FIG. 4 shows a map of restriction sites of pKSL.
  • E. coli S17-1 used as a donor cell in conjugative transfer has the tra gene, conjugative transfer is possible without helper plasmid when performing conjugative transfer.
  • About 8 ⁇ 10 7 cells / ml of mid- to late-logarithmic magnetic bacteria cultured in MSGM medium were used for conjugative transmission.
  • the suspension was used so as to have i 0 10 cell sZ m 1.
  • the bacteria were mixed at 1:50 (magnetic bacteria: E. coli), spotted on an agar plate, and mating was performed.
  • MS GM medium Six hours later, the spot was cut with a scalpel, and the cells were collected using about 5 ml of MS GM medium. This suspension was inoculated into MSGM medium supplemented with tetracycline 2.5 / gZm1. Cells grown at 25 ° C and proliferated were used as mating mediators. At this time, E. coli does not grow on MSGM medium.
  • conjugation transfer magnetic microparticles were separated from magnetic bacteria cultured in MSGM medium. After collecting the magnetic bacteria by centrifugation, wash the cells twice with 1 O mM Tris buffer, suspend the cells at a concentration not exceeding 0.1 lgwetce 11 / m1, and output 5 times at 120 W for 30 seconds. Was subjected to ultrasonic crushing.
  • a Sm-Co magnet was applied to the outer wall surface of the container and treated for 30 minutes to separate magnetic fine particles from the suspension.
  • the cell membrane components were separated by centrifuging the suspension at 5,000 G for 15 minutes, and the cytoplasm was separated by ultracentrifugation at 100,000 G for 1.5 hours.
  • the luciferase activity of each fraction of the magnetic microparticles, cell membrane and cytoplasm was determined by measuring the amount of luminescence with a luminometer using a pikin gene luminescence kit (manufactured by Toyo Ink). And the expression level were measured. Table 1 shows the results.
  • a gene encoding the antigen-recognition site of the anti-Egret IgG antibody (IGG Gene, Pharmacia)
  • An antibody protein encoded by the gene is coated with magnetic microparticles Phospholipid as the main component
  • a plasmid p KSG to which an mps-igg fusion gene was bound was prepared by the method shown in Fig. 5 to form it on an organic film.
  • the plasmid pRK415 which can transfer a gene to the magnetic bacterium AMB-1 by conjugative transfer and has a tetracycline resistance gene, was used as the vector.
  • pRK415 was digested with EcoRI, blunt-ended, and the ig gene was incorporated to produce plasmid pKGC.
  • an F-primer and an R-primer having a sequence complementary to the mps structural gene and a gene fragment containing a promoter site located upstream thereof, and further having a DNA sequence designed for a BamHI cleavage site was used to generate a binding DNA sequence having BamHI cleavage sites added to both ends.
  • the amplified binding DNA sequence was connected to plasmid pKGC to prepare plasmid pKSG.
  • FIG. 6 shows a map of p KSG restriction sites.
  • the igg gene can be translated to produce a fusion protein without deviation from the translation of mps.
  • This plasmid was introduced into wild-type AMB-1 by conjugative transfer in the same manner as in Example 1 to prepare a conjugative transmitter.
  • the zygote was cultured, the cells were collected and disrupted, and the magnetic particles were collected.
  • Imnoassay was performed using Egret IgG as an antigen.
  • the immunoassay employs a sandwich method using an anti-heron IgG antibody labeled with alkaline phosphatase as a secondary antibody. It was measured with a luminometer. As a result, it was possible to detect the antigen.
  • ProteinA gene isolated from p EZZ18 manufactured by Pharmacia
  • the protein encoded by the gene is generated by mp s
  • a plasmid pKSA to which the protein A fusion gene was bound was prepared by the method shown in FIG.
  • the plasmid pRK415 which can transfer a gene to the magnetic bacterium AMB-1 by conjugative transfer and has a tetracycline resistance gene, was used as the vector.
  • pRK415 was cut with EcoRI. Separately, a PCR was performed using primers having Eco RI cleavage sites designed at both ends, and an Eco RI cleavage site was added to create a protein A gene, which was then cut with Eco RI as described above.
  • Plasmid pK AC was prepared by incorporating it into RK4 15.
  • an F-primer and an R-primer having a sequence complementary to a gene fragment containing an mps structural gene and a promoter site located upstream thereof, and further having a DNA sequence designed for a BamHI cleavage site.
  • amplified by PCR to prepare a binding DNA sequence having BamHI cleavage sites added to both ends.
  • the amplified binding DNA sequence was ligated with plasmid pKAC to generate plasmid pKSA.
  • FIG. 8 shows a map of restriction enzyme cleavage sites of pK S ⁇ .
  • This plasmid was introduced into wild type AMB-1 by conjugative transfer to produce a conjugative transmitter. Since E.co1iS17-1 used as a donor cell in conjugative transmission has the ti: a gene, conjugative transmission is possible without helper plasmid when performing conjugative transmission. Bonding a magnetic bacterium about 8 X 10 'cells / ml late from mid-log phase cultured in MS GM medium to transfer, donor cells are scraped colonies generated by introducing plasmid day before 1 0 9 From 10 1 0 ce 1
  • the suspension was used so as to obtain 1 sZm 1.
  • the bacteria were mixed with 1:50 (magnetic bacteria: Escherichia coli), spotted on an agar plate, and mated. Six hours later, the spot was cut off with a scalpel, and the cells were collected using about 5 ml of MS GM medium.
  • This suspension The solution was inoculated on MSGM medium supplemented with 2.5 ⁇ g of tetracycline Zm1. Cells grown at 25 ° C and grown were used as mating mediators. At this time, E. coli does not grow in the MS GM medium.
  • magnetic microparticles were separated from magnetic bacteria cultured in MSGM medium. After collecting the magnetic bacteria by centrifugation, wash them twice with 1 OmM Tris buffer, and suspend the cells at a concentration not exceeding 0.1 lg wet c e 1 1 and output 1 2
  • the firefly luciferase gene (1 uc gene) was introduced into the 5 'end of the mps structural gene, and a plasmid pNELS containing the 1 uc- mps fusion DNA sequence was prepared by the method shown in Fig. 9. .
  • the NcoI cleavage site and the EcoNI cleavage site of pRK415 were each deleted by blunt-end treatment to prepare plasmid pRK415NE.
  • pRK4l5NE was digested with SacI to prepare plasmid pNEPL into which the mps promoter-1uc fusion gene was incorporated.
  • FIG. 1 shows a map of the restriction enzyme cleavage site of pNELS.
  • This plasmid was introduced into wild-type AMB-1 by conjugative transfer to prepare a conjugative transmitter.
  • the zygote was cultured and proliferated, the cells were collected and disrupted, and the magnetic particles were collected using a magnet.
  • the luciferase activity of the magnetic microparticles was measured for luminescence with a luminometer using a pick-up luminescence kit (manufactured by Toyo Ink). Table 2 shows the results.
  • Plasmid pNELSC containing the 1 uc-mps-cat fusion DNA sequence was used to co-express the firefly luciferase gene and the clonal ramphenico-l-acetyltransferase (CAT) gene on magnetic microparticles. It was manufactured by the method shown in FIG.
  • the SphI cleavage site was added by PCR to amplify the cat gene fragment.
  • the SphI cleavage site of the amplified cat gene fragment was blunt-ended. This was connected to the pNELS prepared in Example 4 which had been cut with NurI and then blunt-ended to prepare plasmid pNELSC.
  • Fig. 12 shows a map of the restriction site of pNE LSC. This plasmid was introduced into wild type AMB-1 by conjugative transfer to produce a conjugative transmitter. The zygote was cultured and proliferated, the cells were collected and crushed, and the magnetic particles were collected with a magnet.
  • the luciferase activity of the magnetic microparticles was measured using a luminometer using a Pitka Gene luminescence kit (manufactured by Toyo Ink). As a result, luciferase activity equivalent to that of P NE LM was shown.
  • CAT activity was performed on the magnetic fine particles, and as a result, CAT activity was detected.
  • the CAT assay was carried out by detecting a chloramphenicol acetylated compound obtained by a reaction between chloramphenic acid acetyltransferase and chloramphenicol by thin layer chromatography.
  • each protein connected to both ends of the mps structural gene protein showed the same activity as when the protein was connected alone.
  • By constructing a fusion gene in which genes coding for proteins with different functions are connected to both ends of the mps structural gene protein it becomes possible to co-express it on magnetic microparticles. It was possible to produce magnetic fine particles having the following functions.
  • the firefly luciferase gene (1 uc gene, manufactured by Toyo Ink) was introduced at the 3 'end of the magA gene, and the protein A gene (protein A gene, manufactured by Pharmacia) was inserted at the 5' end of the magA gene.
  • a plasmid pNPAML containing the protein A—mag A—1 uc fusion DNA sequence introduced into E. coli was prepared by the method shown in FIG.
  • the final vector is capable of gene transfer by conjugative transfer to the magnetic bacterium AMB-1 and has a plasmid p RK4 15 (tetrahydroquinone-resistant gene) (NTNeen, S. Tamaki, D. Ko bayashiand D. Tra 1 linger, 1988, Gene 70: 191-197) was used.
  • the plasmid pRK415N lacking the NcoI cleavage site of the plasmid pRK415 was cut with EcoRI, blunt-ended, and amplified by PCR.
  • the plasmid pNAML was prepared by incorporating the A—mag A—1 uc fusion DNA sequence.
  • the recombinant plasmid obtained in I was introduced into wild-type AMB-1 by conjugative transfer to prepare a conjugative transmitter. Since E. coli S17-1 used as a donor cell in conjugative transfer has the tra gene, conjugative transfer is possible without helper plasmid when performing conjugative transfer. For conjugative transfer, about 8 x 107 c e ls / ml of mid- to late-logarithmic magnetic bacteria cultured in MS GM medium were used, and the donor cells introduced plasmid the day before and scraped off the resulting colonies.
  • the suspension was used so as to have 10 ce 11 sZm 1.
  • the bacteria were mixed at 1:50 (magnetic bacteria: E. coli), spotted on an agar plate, and mated. Six hours later, the spot was cut out with a scalpel, and cells were collected using about 5 ml of MS GiM medium. This suspension was inoculated into MSGM medium supplemented with 2.5 ⁇ g / ml of tetracycline. Cells cultured at 25 ° C and proliferated were used as mating mediators. At this time, E. coli is M
  • the separated magnetic fine particles were suspended in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4), and an anti-human IgG antibody was added thereto to bind to the protein A on the magnetic fine particles.
  • Excess antibody was washed by repeatedly collecting the magnetic particles magnetically using a Sm-Co magnet and suspending the particles again in PBS to obtain magnetic particles in which the antibody was bound to protein A.
  • a microparticles (A-immobilized antibody-bound magnetic microparticles) and anti-human IgG antibody and luciferase-immobilized magnetic microparticles (antibody-bound magnetic microparticles) were used for comparison, and the luciferase emission on the magnetic microparticles was caused by aggregation generated by the antigen-antibody reaction.
  • Table 1 shows the results of measuring the change in the amount. The amount of luminescence was measured with a luminometer using a Pika Gene luminescence kit (manufactured by Toyo Ink), and the maximum detection sensitivity was compared by measuring the diluted antigen.
  • the detection sensitivity was highest for the protein A-expressed antibody-bound magnetic microparticles. This is because, in comparison with the chemical immobilization method, when a protein is expressed by genetic recombination, the binding site to the magnetic fine particles is genetically controlled and there is no decrease in activity. Genetic control allows protein A and luciferase to bind in close proximity to each other, so that antigen binding can effectively inhibit luciferase luminescence.
  • the active site may be used for the immobilization process, or depending on the state of the bound protein, steric hindrance may occur and the binding site may not appear on the surface. Therefore, it is difficult to control the amount of immobilization and simultaneously stably immobilize two types of proteins.
  • the firefly luciferase gene (1 uc gene, manufactured by Toyo Ink) was introduced at the 3 'end of the mps gene, and the protein A gene (protein A gene, manufactured by Pharmacia) was introduced at the 5' end of the mps gene.
  • a plasmid pKZMPL containing the protein A-mps-1 uc fusion DNA sequence was prepared by the method shown in Fig. 14. Was.
  • the final vector is capable of transferring a gene by conjugative transfer to the magnetic bacterium AMB-1 and has a plasmid pRK415 (tetramethyllin resistance gene) (NT Neen, S. Tamaki, D. Ko bayashiand D. ⁇ ra 1 linger, 1 988, Gene 70: 191-197) was used.
  • pRK415 tetramethyllin resistance gene
  • BamHI cleavage site was added by PCR using a primer designed with a BamHI cleavage site to pUC18E lacking the EcoRI cleavage site of plasmid pUC18.
  • the mps gene fragment containing the promoter sequence was amplified.
  • the amplified mps gene fragment was connected to plasmid pUC18E cut at the BamHI cleavage site to prepare plasmid pUCEPMPS.
  • Plasmid pRK415 was cut with BamHI and SacI, and the 1 uc gene cut with BamHI and SacI was incorporated to prepare plasmid pKLC. Furthermore, plasmid pKLC was digested with BamHI present upstream of the 1 uc gene.
  • Plasmid pUCEZMP is cleaved with BamHI, the protein A—mps fusion DNA sequence is excised, connected to BamHI cleaved plasmid pKLC, and protein A—mps—1 uc fusion
  • a plasmid pKZMPL containing the DNA sequence was prepared.
  • the recombinant plasmid obtained in I was introduced into wild-type AMB-1 by conjugative transfer to produce a conjugative transmitter.
  • E. coli S17-1 used as a donor cell in conjugative transfer has a tra gene, so conjugative transfer can be performed without helper plasmid.
  • For conjugative transfer about 8 ⁇ 10 7 cells / ml of mid- to late-logarithmic magnetic bacteria cultured in MS GM medium were used. 0 The suspension was used so as to be 10 ce 11 s / m 1.
  • the bacteria were mixed at 1:50 (magnetic bacteria: E. coli), spotted on an agar plate, and mated.
  • MS GM medium Six hours later, the spot was cut out with a scalpel, and the cells were collected using about 5 ml of MS GM medium. This suspension was inoculated on MS GM medium supplemented with 2.5 ⁇ g / ml of tetracycline. Cells grown at 25 ° C and grown were used as mating mediators. At this time, E. coli does not grow on MS GM medium.
  • magnetic microparticles were separated from magnetic bacteria cultured in MSGM medium. After collecting the magnetic bacteria by centrifugation, wash the cells twice with 10 mM Tris buffer, suspend the cells at a concentration not exceeding 0.1 lgwetce 1 1 / m1, and output 120 W, 30 seconds 5 The sonication was performed twice. While the cell disruption suspension is ice-cooled in the container, the Sm-Co magnet is applied to the outer wall of the container for 30 minutes, and the magnetic particles are separated from the suspension, and thus the fluorescent particles are put on the magnetic particles. Magnetic fine particles in which luciferase and protein A were simultaneously expressed were obtained.
  • the separated magnetic fine particles were suspended in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4), an anti-human IgG antibody was added, and the magnetic fine particles were bound to protein A on the magnetic fine particles.
  • Excess antibody was washed by repeatedly collecting magnetic fine particles magnetically using a Sm-Co magnet and suspending them again in PBS to obtain magnetic fine particles in which the antibody was bound to protein A.
  • a suspension (PBS) of magnetic microparticles simultaneously expressing firefly luciferase conjugated with anti-human IgG antibody and protein A was used as an antigen for human I.
  • gG was added to perform an antigen-antibody reaction.
  • the antigen-antibody reaction was performed by magnetically agitating the magnetic microparticles by applying an alternating magnetic field (Japanese Patent Laid-Open No. 2-281181) c.
  • a chemical bonding method using the conventionally used darthal aldehyde Magnetic particles (protein A-immobilized antibody-bound magnetic microparticles) with protein A and luciferase immobilized thereon Japanese Patent Publication No.
  • the detection sensitivity was highest for the protein A-expressed antibody-bound magnetic microparticles. This is because, in comparison with the chemical immobilization method, when a protein is expressed by genetic recombination, the binding site to the magnetic fine particles is genetically controlled and there is no decrease in activity. Genetic control allows protein A and luciferase to bind in close proximity to each other, thus effectively inhibiting luciferase luminescence by antigen binding.
  • the active site may be used for the immobilization process, or depending on the state of the bound protein, steric hindrance may occur and the binding site may not appear on the surface. Therefore, it is difficult to immobilize control and at the same time two kinds of proteins stable immobilization amount c
  • the present invention it is not necessary to perform a treatment such as immobilization, and only by culturing transformed magnetic bacteria and separating magnetic fine particles generated in the cells, enzymes, antibodies, and other useful proteins can be used. Can be stably obtained in a state of being bonded to the organic film.
  • the useful protein is a functional protein, it is immobilized on magnetic microparticles. Since functional proteins can be magnetically controlled, their functions can be efficiently exerted at the required localities.
  • any protein can be produced on magnetic microparticles by introducing a gene encoding a required protein into a plasmid vector and transforming a magnetic bacterium with the obtained recombinant plasmid.
  • the required protein-bound magnetic microparticles can be semi-permanently produced simply by maintaining and culturing the same strain, and the protein content and activity between production lots There is no variation, and the merit of low cost is large. Moreover, the magnetic microparticles thus obtained always contain the same amount of protein having the same activity.
  • the target protein can be separated and recovered magnetically in a short time, and efficient separation and purification can be performed.
  • the reaction between a minute amount of a target substance and the binding protein on the magnetic fine particles is accelerated by, for example, an alternating magnetic field to aggregate the magnetic fine particles, and the fluorescent protein based on the second protein is used.
  • the target substance can be easily measured by measuring the change in the amount of emitted light.
  • the magnetic fine particles used in the present invention do not need to be subjected to a treatment such as immobilization, and all functional proteins are bound to the magnetic fine particles by biological binding, so that the activity accompanying the immobilization does not decrease. Furthermore, the reactivity of the immobilization is uniform and the cost is low.
  • the expression position of the protein can be controlled generously, the ability to bind the binding protein and the labeled protein in close proximity significantly improves the detection sensitivity. Therefore, for example, when protein A is expressed as an intervening protein, and then an antibody is bound to the protein and used in an antigen-antibody reaction, the luminescence of luciferinase closer to the antigen can be easily inhibited by stabilization. Very sensitive measurement is possible. Industrial applicability
  • the present invention has the following applicability, for example.
  • all enzymes that are considered ideal to work site-specifically are magnetic microparticles. It is worth expressing on the child surface. For example, when it is desired to carry out an enzyme reaction locally in a reaction system in a biochemical reaction, magnetic fine particles expressing this enzyme are useful. In addition, in the case of a disease of an enzyme system, when it is desired to administer the enzyme specifically to an organ, it can be treated by magnetically inducing the enzyme expressed on the surface of the magnetic fine particles.
  • a gene for a protein capable of binding to DNA or RNA for example, a protein gene such as repressor
  • the magnetic microparticles can be used as carriers for gene transfer. It can be used. Proteins such as repressors have the property of losing binding in the presence of certain substances. This can be used for gene transfer.
  • LacI is an example of a Libressa protein. LacI is a protein that controls the expression of the gene for lactose-degrading enzyme, and is a repressor that suppresses gene transcription by binding to the downstream of the promoter.
  • This LacI loses its ability to bind to DNA by binding to lactose and chemicals such as IPTG. In other words, it is a mechanism that is expressed when there is a substrate that degrades. There is also a specific DNA domain to which LacI binds. Lac I can bind to a gene incorporating a DNA domain.
  • the LacI by expressing the LacI on the surface of the magnetic fine particles, the LacI binds to a gene incorporating a DNA domain.
  • LacI loses its ability to bind to DNA by a substance called IPTG. This can be used to magnetically transfer DNA from a specific location and release the DNA by the addition of IPTG. In this way, the messenger can be transported to the required location.
  • the magnetic fine particles of the present invention are applied to gene transfer carriers and the like in gene therapy.
  • a therapeutic method that suppresses the expression of the target gene by forming an RNA hybrid by expressing antisense RNA formed from the complementary strand of the target gene is currently being actively studied.
  • Expression of RNA can be used as a means to carry DNA:
  • a metal-binding protein can be expressed on the surface of the magnetic fine particles, and this can be used for metal recovery or detection. 3 Recovery and detection can be performed by magnetic recovery.
  • Proteins that are generally said to be difficult to separate and purify can be easily separated and purified by expressing them on a magnetic microparticle as a fusion protein with the mps protein. That is, the protein expressed on the surface of the magnetic fine particles can be easily recovered finally by magnetism.
  • a magnetic microparticle obtained from magnetic bacteria
  • An antibody can be simultaneously expressed on magnetic particles expressing a reporter gene such as luciferase, or protein A can be expressed and magnetic particles combined with an antibody can be used as a reagent for immunoassay.
  • a reporter gene such as luciferase
  • protein A can be expressed and magnetic particles combined with an antibody can be used as a reagent for immunoassay.
  • stirring can be performed by an external magnetic field, and an antigen-antibody reaction can be promoted.
  • the reporter gene is sterically inhibited by aggregation due to the antigen-antibody reaction, and luciferase inhibits luminescence. Since the luminescence inhibitory effect varies depending on the degree of aggregation, the antigen can be quantified.
  • a magnetic fine particle in which a binding protein and a labeled protein are bonded as a useful protein and to a magnetic fine particle in which a luminescent functional protein such as luciferase (a luminescence-related enzyme) is bonded.
  • the antibody is expressed, or the protein A is expressed, and the magnetic particles to which the antibody is bound are used as a reagent for immunoassay. That is, by using magnetic fine particles as a carrier, stirring can be performed by an external magnetic field, and an antigen-antibody reaction can be promoted.
  • the luminescent functional protein is sterically inhibited by aggregation due to the antigen-antibody reaction, Lase inhibits luminescence.
  • the amount of antigen can be determined.
  • the nucleotide sequences shown in the sequence listing below are from the 5 'end to the 3' end from left to right. Each letter represents the next base.
  • N A or G or C or TZU
  • CAC GAG AAG GGC CAC GAC ACC GAA ACC CGG CTG AAG CAC AAT TTC GGC 384 His Glu Lys Gly His Asp Thr Glu Thr Arg Leu Lys His Asn Phe Gly
  • GGC AAT ACC GTC CTG ATG CTC GAA CAC GCC ATC TAT TCG GTG ATC AGC 672
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Magnetospirullwn
  • GGC AAT ACC GTC CTG ATG CTC GAA CAC GCC ATC TAT TCG GTG ATC AGC 672
  • Val Val Gly Tyr lie Leu Ala Gly Val Val Leu Gly Pro Ser Gly Phe
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Magnetospirullum
  • Sequence type nucleic acid
  • GTN GTN CCN ATG ATG YTN GTN YTN GAR WSN TTY GAR ACN AAR GCN YTN 528

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Description

明 細 書 有用タンパク質結合磁気微粒子、 その製造方法及び使用方法 技術分野
本発明は、 タンパク質結合磁気微粒子及びその製造方法、 並びにそれらに関連 した新規なタンパク質、 遺伝子等、 並びに該タンパク質結合磁気微粒子を用いる 標的物質の測定方法等に関する。 背景技術
磁気微粒子に固定化された酵素、 抗体等の生理活性を有するタンパク質は、 磁 気的手段で誘導することができるため、 従来困難であった局所的な位置への誘導 が可能であり、 磁気により集めたり、 分離したりすることができるため、 医療や 発酵の分野を初めとする各種産業において利用が期待されている。
従来、 磁気微粒子への生理活性物質の固定化は特公平 6— 1 2 9 9 4に示され るように磁性細菌より磁気微粒子をアルカリ処理で分離し、 これを T/一アミノプ 口ピルトリエトキシシランゃグルタルアルデヒ ドで処理したのち、 これに生理活 性物質を化学的に固定化することが行われていた。 また、 酵素処理により、 磁性 細菌から脂質から成る有機薄膜に被覆された状態で磁気微粒子を分離し、 グルタ ルアルデヒ ド処理後にタンパクの固定化を行う方法も知られている。 また、 S P D Pを用いる化学的結合法により生理活性物質を磁気微粒子に固定化する方法も 知られている （特開平 5 _ 2 0 9 8 8 4 ) 。
さらに、 これらの方法で化学的に生理活性物質を固定化した磁気微粒子を用い て抗原抗体反応を行なわせる、 抗原又は抗体の測定方法が提案されている （特開 平 4— 2 8 5 8 5 7、 同 5— 2 0 9 8 8 4、 特開平 5— 9 9 9 2 6 ) 。
上述の酵素、 抗体等のタンパク質を磁気微粒子への固定化は化学的に行うもの であるため、 固定化処理に長時間を要する、 固定化処理によりタンパク質の生理 活性が低下する、 得られる固定化タンパク質の固定化量にロッ ト間バラツキが大 きくかつ活性のバラツキも大きい、 固定化に用いられるタンパク質は一般に高価 であるので固定化タンパク質は高コス卜にならざるを得ない、 等の問題があった c また、 上述の標識抗体を磁気微粒子に結合して用いる方法は、 抗体にあらかじ め標識化合物を化学的に結合させたり、 物理的に吸着させておく必要がある。 こ のために、 抗体の活性が低下したり、 処理による損失が生じたりする問題があつ た。 さらには、 磁気微粒子への標識化合物の固定化量や結合の仕方が変化し、 こ れが測定データのバラツキの原因になる恐れがあるほか、 高コス卜になる等の問 題があった。
そこで、 本発明の課題は、 化学的な方法で酵素や抗体あるいは標識化合物を磁 気微粒子に固定化する従来技術の欠点を解決し、 高い検出感度が得られる標的物 質の測定方法、 及びそれに使用する磁気微粒子を提供することにある。
発明の開示
有用タンパク質結合磁気微粒子
本発明は、 第一に、 磁性細菌の菌体内に生成する磁気微粒子と、 該磁気微粒子 を被覆する有機膜に結合したハイプリッドタンパク質とからなり、 該ハイプリッ ドタンパク質が本来的に該有機膜に結合して生成する膜タンパク質の少なくとも 膜結合部分を含むポリぺプチド鎖と、 少なくとも一種の他の有用タンパク質とが 生物学的に結合してなるハイプリッドタンパク質である、 有用タンパク質結合磁 気微粒子を提供する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 Kyt e- doo l i t t l e法による解析で得られた m p s タンパク 質のア ミ ノ酸配列の親水性領域一疎水性領域の分布を示す図である 第 2図は、 プラスミ ド p UM 5 Aの作製を説明し、 該プラスミ ドの制限酵素 切断部位地図である。
第 3図は、 例 1で調製したプラスミ ド p K L C及び p K S Lの調製方法の説明 図である。
第 4図は、 プラスミ ド p K L Cの制限酵素切断部位地図である。 第 5図は、 例 2で調製したプラスミ ド p KS Gの調製方法の説明図である。 第 6図は、 プラスミ ド p KLCの制限酵素切断部位地図である。
第 7図は、 例 3で調製したプラスミ ド p KS Aの調製方法の説明図である。 第 8図は、 プラスミ ド p KS Aの制限酵素切断部位地図である。
第 9図は、 例 4で調製したプラスミ ド p NE L Sの調製方法の説明図である。 第 1 0図は、 プラスミ ド p NE L Sの制限酵素切断部位地図である。
第 1 1図は、 例 5で調製したプラスミ ド p NE L S Cの調製方法の説明図であ る。
第 1 2図は、 プラスミ ド p NE LS Cの制限酵素切断部位地図である。
第 1 3図は、 例 6で調製したプラスミ ド p NP AM Lの調製方法の説明図であ 第 1 4図は、 例 7で調製したプラスミ ド p KZMP Lの調製方法の説明図であ る: 発明を実施するための最良の形態
本発明で使用される磁気微粒子は磁性細菌の菌体内に生産される、 粒径約 5 0〜 1 5 0 n mのマグネタイ トからなる微粒子である。 利 用することができる磁性細菌と しては、 例えば Magnetospirillum種 の微生物 （例 ： 菌株通 - "FERM BP-5458) , MS-1 (IF0 15272, ATCC 31632, DSM 3856) SR-1 (IF0 15272 DSM 6361) 、 及び Desulfovib rio 種の微生物 （例 ： 菌株 RS- 1 (FERM P- 13283)) が挙げられる。
これらの磁性細菌の菌体中に生産される磁気微粒子はリ ン脂質を 主成分とする有機膜で被覆されている。 該有機膜には種々の膜タ ン パク質が結合している。 本発明に用いられる膜タ ンパク質は、 有機 膜に比較的強固に結合しつつその一部が膜の外に露出している もの が好ま しく 、 特に両末端が外に露出 している こ とが好ま しい。 膜タ ンパク質の膜結合部分は有用タンパク質の有機膜への固定手段と し て利用される。 露出部分は有用タンパク質をその膜タンパク質に結 合させるのに利用される。
この有用タンパク質のポリペプチ ド鎖への結合は生物学的結合に よ り行われる。 ここで、 「生物学的結合」 とは二種のタンパク質が 融合された状態でポリぺプチ ドと して一体化している場合のほか、 抗原抗体反応による結合、 リ ガン ド ' リセプタ一反応による結合等 が挙げられる。
結合形態と しては、 例えば次の場合が挙げられる。 これらは、 固 定手段と して使用される膜タンパク質の種類等によ り選べばよい。
( a)—種の有用タンパク質が膜結合部分含有ポリペプチ ド鎖の一方 の末端に生物学的に結合される形式。
( b )二種の有用タンパク質が膜結合部分含有ポリペプチ ド鎖の異な る末端にそれぞれ結合される形式。
( c )二種の有用タ ンパク質のう ちの第一の有用タンパク質が膜結合 部分含有ポリペプチ ド鎖の一末端に生物学的に結合しており 、 その 結合したタンパク質の他末端に第二の有用タンパク質が直列に結合 している形式。 二種の有用タンパク質の結合順序は、 用いられるタ ンパク質の種類等によ り適切な順序を選べばよい。
上の（a)〜（c )のいずれの場合も、 タンパク質同士の結合は、 直接 的な生物学的結合の形でもよいし、 第三のタンパク質が介在して生 物学的結合によ り橋渡し結合する形式でもよい。
さ らに、 （b)、 （c ) の形式の組み合わさった形式で三以上の有用タ ンパク質が結合されてもよい。
なお、 上記において 「膜タンパク質の少なく と も膜結合部分を含 むポリペプチ ド鎖」 は、 膜結合部分に対応するア ミ ノ酸配列のみで もよいし、 その外側に該膜タンパク質に由来する又は由来しないァ ミ ノ酸配列を有していてもよい。
有用タ ンパク質結合磁気微粒子の製造方法
上記の有用タンパク質結合磁気微粒子は形質転換磁性細菌を用い て製造する こ と ができ る。
即ち、 本発明は、 第二に、 上記の有用タンパク質結合磁気微粒子 の製造方法と して、 本来的に有機膜に結合して生成する膜タンパク質の少な くとも膜結合部分をコ一ドする遺伝子断片と該有用タンパク質をコードする D N A配列との融合 D N A配列を含む組換えプラスミ ドにより形質転換された磁性細 菌を培養することにより、 前記融合 D N A配列を発現させ、 該有用タンパク質を 含む融合タンパク質を、 磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した状態で該菌体内 に生成させることからなる、 有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方法を提供す る。
磁性細菌の上記組換えプラス ミ ドによる形質転換は公知の方法に よ り行う こ とができる。 宿主と して用いる磁性細菌と しては、 上で 例示のものが挙げられる。
こ う して得られた形質転換された磁性細菌を適切な条件下で培養 するこ とによ り菌体内に目的とする有用タンパク質が膜結合性タン パク質の膜結合部分を含むポリペプチ ド鎖と融合した状態で生成す る。 該融合タンパク質はその磁気微粒子を被覆している有機膜に結 合した状態にある。
また、 該有用タンパク質結合磁気微粒子は、 培養によ り増殖した 磁性細菌の菌体を通常の方法によって破碎又は溶解したのち磁気を 利用 して容易に集めるこ とができる。
本発明において有用タンパク質の固定手段と して利用される膜タ ンパク質の起源 （ソース） となる磁性細菌と、 前記組換えプラ ス ミ ドの宿主となる磁性細菌とは同一種でも異なる種類でもよい。
一般に、 磁性細菌の菌体内に磁気微粒子を被覆する有機膜に強固 に結合して、 好ま しく はその一部が有機膜外に露出した状態で生成 する膜タンパク質はいずれも本発明によるタンパク質結合磁気微粒 子の製造方法に利用するこ とができる。 このよ う な膜タンパク質の 少なく と も膜結合部分をコー ドする遺伝子が判り さえすれば、 公知 の手法に従ってこの遺伝子断片と所望の一又は二以上の有用タンパ ク質をコ一 ドする一又は二以上の DNA配列と を含む融合 DNA配列を含 む組換えプラス ミ ドを作製し、 該組換えブラスミ ドで適当な磁性細 菌を形質転換し、 得られた形質転換磁性細菌を培養するこ とによ り、 該形質転換磁性細菌の菌体内に前記有用タンパク質が結合した磁気 微粒子が産生される。
本発明にこのよ う にして利用される膜タンパク質の代表的な例 と して、 本発明者らは磁性細菌 A M B — 1 (FER BP-5458) の生産 する m p s タンパク質と m a g Aタンパク質を見出した。
〔磁性細菌 A M B — 1 の寄託に関する情報〕
寄託機関
名称 ： 工業技術院生命工学工業技術研究所 （National Ins t i tute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Techonology)
あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3号 （郵便番号
3 0 5 )
寄託日 1 9 9 2年 1 1 月 1 2 日
受託番号 F E R M B P — 5 4 5 8 以下、 これらのタ ンパク質、 及びそれらをコー ドする遺伝子を例 に具体的に説明する。
[m p s タ ンパク 質の利用]
m p s タンパク質は後記の配列表の配列番号 1 で示されるア ミ ノ 酸配列 （対応する構造遺伝子の塩基配列と と もに示す） からなる、 単離、 生成されたタ ンパク質である。
このタ ンパク質は次のよ う に して単離、 精製された。 磁性細菌 A M B — 1 を定常期まで培養し、 遠心集菌後フ レンチプレスによ り細 胞を破砕した。 この破砕物から細胞膜分画を分離し、 さ らにサマ リ ゥム コバル ト磁石で磁気微粒子分画を分離し精製した。 次に 1 %Tr yton lOmM ト リ ス緩衝液中で 2時間撹袢し、 磁気微粒子と有機膜を 分離した。 このよ う に処理した抽出物についてタンパク電気泳動
( S D S - P A G E) を行い、 泳動パターンを細胞膜上に存在する タンパク質と比較したと ころ、 細胞膜には存在しない有機膜上に特 異的なスポッ トが三つ確認された。 これら三つの有機膜上のタンパ ク質の内、 最も含有量の多いタンパク質を m p s タンパク質と命名 した。 この m p s タンパク質のバン ドの位置は、 後述の m p s構造 遺伝子からコー ドされるタンパク質と して導かれたものの分子量 34. 49 kDa のと ころに当たるこ とが確認された。
この m p s タンパク質のア ミ ノ酸配列の親水性領域一疎水性領域 の分布を1^16-010011 16法によ り解析した結果を第 1 図に示す。 こ の結果よ り 、 中央の N—末端から第 7 3 〜 2 3 4 ァ ミ ノ酸残基の範 囲 （第 1 図において領域 A) が比較的疎水性が高く 有機膜への結合 に寄与しており 、 N末端側の第 1 〜第 7 2ア ミ ノ酸残基の範囲及び C末端側の第 2 3 5〜第 3 1 7ア ミ ノ酸残基の範囲が比較的親水性 が高く 有機膜の外に概ね露出している。 中央の第 7 3 〜 2 3 4ア ミ ノ酸残基の範囲が膜結合部分である。
m p s 遺伝ナ ：
上記の m p s タンパク質は m p s構造遺伝子によ り コ一 ドされる。 該 m p s構造遺伝子は後述の配列表に記載の配列番号 2で示され る塩基配列で表される D N A配列からなる。
該 m p s構造遺伝子と して、 配列表の配列番号 3 で示される もの が磁性細菌 AMB— 1 から、 次のよ う にして単離、 精製された。
上述のよ う にして分離された m p s タンパク質についてェ ドマン 分解法によ りア ミ ノ酸シーケンスを行ない、 N—末端ァ ミ ノ酸配列 を決定した。 N—末端アミ ノ酸配列からプライマ一を作製し、 P C R法によ り有機膜にのみ存在する m p s タンパク質の、 N—末端部 分をコー ドしている遺伝子断片をク ローニングした。 この遺伝子断 片を基に、 ジーンウォーキングによ りその周辺の約 2 k の s p h I 断片をク ロ一ニングした。 この遺伝子断片のシークェンスを行な い解析した結果、 9 5 4 k b の m p s構造遺伝子配列を決定し、 そ の遺伝子配列から前記のァ ミ ノ酸配列を導いた。
該 m p s構造遺伝子の配列の上流側約 7 0 0ヌク レオチ ドの範囲 内にプロモータ一が存在する。 プロモータ一と しては他の公知のも のを使用するこ と もできる。
該 m p s構造遺伝子中の、 膜結合部分をコー ドする D N A配列は、 前記配列番号 2及び配列番号 3 で示された塩基配列中の 2 1 7 〜 7 0 2の範囲である。 前記の有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方 法には、 少なく と もこの範囲の D N A配列を含む遺伝子断片 （該遺 伝子断片を前述の膜タンパク質中の膜結合部分を含むポリペプチ ド 鎖に対応する ものであり 、 以下、 「膜結合部遺伝子断片」 という） が所望の有用タンパク質をコー ドする D N A配列との融合に用いら れる。 この とき、 膜結合部遺伝子断片は膜結合部分をコー ドする D N A配列のみから構成されてもよいし、 その 3 ' 末端側又は 5 ' 末端側 に元々 m p s構造遺伝子に存在する又は存在しない D N A配列が含まれてもよレ、。 元々 m p s構造遺伝子に含まれている D N A配列の一部又は全部がそのまま存在 してもよい。 むしろ、 比較的親水性が高く有機膜の外側に露出する部分をコード する D N A配列が存在すると、 結合した状態で生成する有用タンパク質が有機膜 外に露出した形で発現するので有利である。 即ち、 第 1図における領域 Aの外側 に B 1の領域 （第 1塩基〜第 2 1 6塩基の範囲） の少なくとも一部及び 又は B 2の領域 （第 7 0 3塩基〜第 9 5 1塩基の範囲） の少なくとも一部をコードする D N A配列、 より具体的には例えば、 第 1図における C 1の領域 （第 1 5 4塩基 〜第 2 1 6塩基の範囲） 及び/又は領域 C 2 (第 7 0 3塩基〜第 7 6 8塩基の範 囲） をコードするの D N A配列が存在することが好ましい。
該膜結合部遺伝子断片は前記の膜タンパク質の膜結合部分をコードする遺伝子 を必須の要素として含み、 これのみで構成されていてもよいが、 上述のようにそ の 3 ' 末端側及びノ又は 5 ' 末端側に元々 m p s構造遺伝子に存在する塩基配列 が存在してもよい。 あるいは、 3' 末端側、 5' 末端側の一方又は両方に、 都合 のよレ、制限酵素切断部位が生じるように人工的に延長された D N A配列が存在し てもよい。 この膜結合部遺伝子断片は、 有用タンパク質の有機膜への固定手段で ある膜結合部分を発現する重要な役割を演じる。
[m a g Aタンパク質の利用]
m a g Aタンパク質のァ ミ ノ酸配列は、 後記の配列表の配列番号 4 に示す （対応する m a g A遺伝子の塩基配列と と もに表示） 通り であり、 N末端から第 1 〜第 6ア ミ ノ酸残基の範囲が親水性領域で あり 、 それに続く 第 7〜第 3 8 0ア ミ ノ酸残基の範囲が疎水性領域 であり 、 続く 第 3 8 1 〜 4 3 4 ア ミ ノ酸残基の範囲が第二の親水性 領域である。 中央の長い疎水性領域が膜結合部分であり 、 両端の親 水性領域は膜から露出 した状態にある。 詳細には、 疎水性領域は短 い親水性部分を約 4箇所含んでおり 、 これらの部分は膜から一部露 出 しているものと推定される。 m a g Aタ ンパク 質の疎水性領域が 該タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合させ、 両端の親水性領域 は有機膜から露出する。 この疎水性領域が m a g Aタ ンパク 質の有 機膜への膜結合部分である。
m a g Aタ ンパク質は次のよ う にして単離、 精製された。 磁性細 菌 AM B— 1 を定常期まで培養し、 遠心集菌後フ レンチプレスによ り細胞を破砕した。 この破砕物からサマ リ ゥムコバル ト磁石で磁気 微粒子を抽出 し、 精製した。 次に l °/oTryton 10mM ト リ ス緩衝液中 で 2時間撹拌し、 磁気微粒子と膜を分離した。 このよ う に処理した 抽出物についてタ ンパク電気泳動 （ S D S — P A G E ) を行ったと ころ、 後述する m a g A構造遺伝子からコー ドされるタンパク質の 分子量と して既知である、 46.8kDa のと ころにバン ドが確認された = 本発明者らは、 この m a g Aタンパク質をコー ドする遺伝子 （m a g A構造遺伝子という） 力 後述の配列表に記載の配列番号 5の 塩基配列で表される D N A配列からなるこ とを見出した。 該 m a g A遺伝子の配列の上流にはプロモータ一配列が隣接している （J. B iochem. 118， 23-27 (1995) ) 。 m a g Aタンパク質は一般的には 配列番号 6の塩基配列で表される D N A配列でコー ドされる。
上記の配列番号 5で表される m a g A遺伝子は、 磁性細菌 AM B — 1 から次のよ う にして見いだされ、 単離、 精製された。
磁性細菌 A M B— 1 に、 薬剤耐性因子 （ Km) を持った転移性の 遺伝子である ト ラ ンスポゾン T n 5 を導入するこ とでゲノ ムに部位 非特異的にミ ューテーシ ヨ ンを生じさせ、 磁気微粒子精製機能を欠 損 したミ ュータン トを作製した。 次に、 薬剤耐性因子 （K m) を指 標に磁気応答しない菌体を分離し、 このミ ユ ータ ン トからゲノ ムを 抽出 した。 EcoRI で切断後、 サザンハイブリ ダィゼ一シヨ ンで 卜ラ ンスポゾン T n 5 とのハイプリ ッ ドの形成を指標に m a g A遺伝子 を含む遺伝子断片を単離し、 p U C 1 9 にク ローニングするこ とで 精製を行った。 こ こで作製したプラ ス ミ ド p UM 5 Aを第 2図に示 す。 遺伝子解析の結果、 m a g A遺伝子 1 . 3 k b を見出 した。
該 m a g A構造遺伝子中の、 膜結合部分をコー ドする D N A配列 は、 前記配列番号 4 で示された塩基配列中の 1 9〜 1 1 4 0 の範囲 である。 前記の有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方法には、 少 なく と もこの範囲の D N A配列を含む遺伝子断片 （膜結合部遺伝子 断片） が所望の有用タンパク質をコ一 ドする D N A配列との融合に 用いられる。 この場合も、 該膜結合部遺伝子断片には m a g Aタ ン パク質の膜結合部分をコー ドする遺伝子のみから構成されてもよい し、 親水性領域の一部又は全部を含んでもよい。 膜結合部遺伝子断 片は膜結合部分をコー ドする遺伝子を含み、 有用タンパク質をコー ドする D N A配列との融合部に生成する D N A配列がア ミ ノ酸合成 に適したものとなる限り 制限されない。 前記結合部分をコー ドする D N A配列に近接する形で有用タンパク質をコー ドする D N A配列 が導入されてもよいし、 疎水性領域をコー ドする D N A配列と有用 タンパク質をコー ドする D N A配列との間に前記親水性領域をコー ドする D N A配列が部分的に存在してもよい。 また、 膜結合部遺伝 子断片の一方又は両方の末端に、 都合のよい制限酵素切断部位が生 じる よ う に人工的に延長された D N A配列が存在してもよい。 特に 5 ' 末端側の親水性領域は短いので、 これらは全て存在していても ょレ、し、 必要に応じこの部分が延長されていてもよレ、。 目的とする 有用タンパク質をコ一 ドする D N A配列を挿入する部位と して機能 的な 5 ' 末端側の制限酵素切断部位と しては、 m a g A遺伝子内に 導入した S c a I 切断部位があり 、 3 ' 末端側の制限酵素切断部位 と しては S p h l 切断部位、 D r a l I I 切断部位がある。 S p h I 切断部位と D r a I 1 I 切断部位は m a g A遺伝子の疎水性領域 から僅かに下流側に寄った親水性領域内に存在するので、 好都合な 部位の一つである。
[融合 DNA配列]
(a)m p sタンパク質や ma g Aタンパク質のような膜タンパク質の少なくと も膜結合部分を含むポリペプチド鎖をコードする膜結合部遺伝子断片と、 （b) — 又は二以上の所望の有用タンパク質との融合 D N A配列を調製する。
一種又は二種以上の有用タンパク質をコードする D N A配列は膜結合部遺伝子 断片の 3' 末端側及び 5' 末端側のいずれか一方に融合されてもよいし、 両方に 融合されてもよい。 両方に融合される場合には、 3 ' 末端に導入される DNA配 列と 5 ' 末端に導入される DN A配列とは同一のタンパク質をコ一ドするもので もよレ、し、 異なるタンパク質をコードするものでもよい。 両方に融合する利点は、 次のような場合に得られる。
1 ) 両末端に同一のタンパク質をコードする DN A配列を導入することで、 磁気 微粒子への該タンパク質の固定化量を向上させることができる。
2 ) 5 ' 末端と 3 ' 末端に 2つの連続する複合酵素系又は酵素と補酵素再生酵素 などのタンパク質をコードする D N A配列を導入することで、 酵素系の反応を迅 速に進めることができる。
3 ) 5 ' 末端と 3 ' 末端にサブユニットを形成するタンパク質をコードする D N A配列を導入することで、 このサブュニッ トを迅速にかつ完全に形成させること ができる。
また、 二種以上のタンパク質をコードする二種以上の D N A配列を 5 ' 末端と 3 ' 末端のいずれか一方に順次直列式に融合させてもよい。
融合される、 別のタンパク質をコードする遺伝子の種類は特に限定されるもの ではない。
[組み換えプラスミ ド]
本発明の有用タンパク質結合磁気微粒子を産生する形質転換磁性細菌は、 上記 の融合 D N A配列を含有する組み換えプラスミ ドで形質転換されたものである。 該組み換えプラスミ ドは、 前記の融合 D N A配列を公知の方法により適当なベ クタ一プラスミ ドに導入することにより得られる。
組み換えプラスミ ドの調製に用いるベクタ一としては、 例えば、 p R K 4 1 5 の系統、 p K T 2 3 0の系統のものを用いることができる。 選択したベクタ一に 遺伝子を組み込む。 ベクターに最も効率よく、 また遺伝子が目的の向きに並ぶよ うに、 遺伝子を組み込む順、 用いる制限酵素を決定する。 遺伝子を導入する手順 が決定したなら、 制限酵素によって D N Aを切断し、 電気泳動を行うことにより 導入する目的遣伝子断片を分離する。 その後、 リガーゼを用いてライゲ一シヨン を行レ、 D N Aを連結する。 遺伝子断片の連結部分が合わない場合は末端部分を平 滑化処理し、 ライゲ一シヨンを行う。 制限酵素、 リガーゼ、 末端平滑化用の酵素 などは全て市販のものを用いて行うことができる。 最後に目的のプラスミ ドがで きているかどうか制限酵素の切断パターンを確認する。
[形質転換磁性細菌] 磁性細菌の上記プラスミ ドによる形質転換は公知の方法により行うことができ る。 宿主として用いる磁性細菌は、 用いられる膜タンパク質のソースである磁性 細菌と同一種でも異なる種類のものでもよい。 同一種であることが好ましい。 使 用することができる磁性細菌としては、 AM B— 1が代表的であるが、 これに限 らず、 例えば、 Magnetospiri l lum種の微生物 （例：菌株 AMB_1 (FERM BP- 5458) , M S-KIFO 15272, ATCC 31632, DSM 3856) SR- 1 (IF0 15272 DSM 6361) 、 及ひ e sul fovibrio 種の微生物 （例：菌株 RS_1 ( 微ェ研菌寄 13283) ) が挙げられる。 こうして得られた磁性細菌を適切な条件下で培養することにより菌体内に目的 とする有用タンパク質を有する磁気微粒子が生成する。 具体的には、 目的とする タンパク質は、 膜結合部遣伝子断片によりコードされるポリぺプチド鎖と融合し た状態で、 その磁気微粒子を被覆している有機膜に結合した状態で生成する。 こ うして生成した有用タンパク質結合磁気微粒子は、 増殖した磁性細菌の菌体を通 常の方法によって破砕又は溶解したのち磁気を利用して容易に集めることができ る。
また、 上記の有用タンパク質の製造方法は、 そのタンパク質が機能性を有しな い有用タンパク質である場合であっても、 そのタンパク質が従来の製造方法によ つては純粋な形で得ることが困難であるときには、 該タンパク質の製造方法とし て有用である。 この場合有用タンパク質は磁気微粒子に結合した状態で得られる 力 上記の方法で磁石等を用いる磁気的方法で容易に他の細胞成分から分離、 精 製することができる。
本発明において、 膜タンパク質の膜結合部分と融合される有用なタンパク質を コードする遺伝子も、 それにより発現されるタンパク質も特に限定されない。 医 療、 発酵を利用する産業等の目的に使用される場合には何らかの機能、 例えば、 生理活性を有するタンパク質が用いられる。 しかし、 これに限定されるものでは なく、 通常の方法では分離、 取得が困難であるタンパク質の製造に本発明を利用 することができる。 即ち、 このようなタンパク質を融合タンパク質の形で磁気微 粒子上に生成させ、 磁気的に容易に分離し集めることができる c
有用タンパク質の内、 機能性タンパク質としては、 例えば、 抗原、 抗体、 プロ ティン A等の免疫関連タンパク質、 レクチン、 アビジン等の結合能を有するタン パク質、 補酵素、 加水分解酵素、 酸化還元酵素、 異性化酵素、 転移酵素、 脱離酵 素、 制限酵素等の酵素類が挙げられる。
また、 上記の有用タンパク質の製造方法は、 そのタンパク質が機能性を有しな い有用タンパク質である場合であっても、 そのタンパク質が従来の製造方法によ つては純粋な形で得ることが困難であるときには、 該タンパク質の製造方法とし て有用である。 この場合有用タンパク質は磁気微粒子に結合した状態で得られる が、 上記の方法で磁石等を用いる磁気的方法で容易に他の細胞成分から分離、 精 製することができる。 結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合した磁気微粒子
本発明は前記の有用タンパク質結合磁気微粒子の一態様として、 有用タンパク 質として結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合した磁気微粒子、 及びこれ を利用する標的物質の測定方法を提供する。
即ち、 本発明によれば、 結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合された磁 気微粒子において、 前記の結合性タンパク質と標識タンパク質と力';、 磁性細菌の 菌体内に生成する磁気微粒子を被覆している有機膜に結合して生成する膜タンパ ク質の少なくとも膜結合部分を含むポリぺプチド鎖に、 相互に近接した状態で、 生物学的結合により結合していることを特徴とする、 磁気微粒子が提供される。 標的物質の測定方法
また、 本発明によれば、 （A) 試料中の標的物質を測定するために、 前記標的物質に特異的に結合する結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合さ れた磁気微粒子を前記試料に加え、 これにより前記標的物質が試料に存在する場 合にはこれと前記結合性タンパク質とが反応して磁気微粒子が凝集するように し：
(B) 次に、 凝集後の前記標識タンパク質に基づく信号を測定し；
(0 (B) で得られた信号強度を、 標準試料から得られる信号強度と比較する ことにより、 試料中の標的物質を検定する ；
ことを含む、 標的物質の測定方法において、
前記の結合性タンパク質と標識タンパク質とが、 磁性細菌の菌体内に生成す る磁気微粒子を被覆している有機膜に結合して生成する膜タンパク質の少なくと も膜結合部分を含むポリペプチド鎖に、 相互に近接した状態で、 生物学的結合に より結合したものであることを特徴とする、
標的物質の測定方法が提供される。
上記の方法においては、 試料中の標的物質の量に応じて凝集が起こる結果、 磁 気微粒子に結合した標識タンパク質の機能が主として物理的 （立体的） 障害を受 けて低下する。 そのために、 磁気微粒子の凝集量、 ひいては標的物質の反応量に 応じて標識タンパク質からの検出信号、 例えば標識タンパク質が発光関連酵素で ある場合には発光量が低下する。 これを光学的測定方法等により測定することで 標的物質を検出しあるいは定量することができる。 凝集反応は、 反応後に例えば 交番磁界を加えることで容易に促進することができる。
[機能性タンパク質が結合した磁気微粒子]
具体的には、 結合性タンパク質と標識タンパク質の結合形態としては、 例えば 次の場合が挙げられる。 これらは、 固定手段として使用される膜タンパク質の種 類等により選べばよレ、。
(a) 結合性タンパク質と標識タンパク質とがそれぞれポリべプチド鎖の異なる末 端に結合される形式。 このとき、 結合性タンパク質や標識タンパク質という機能 性タンパク質の結合は、 該ポリペプチド鎖に直接融合する形でもよいし、 第三の タンパク質がポリベプチド鎖の末端部に融合し、 そして該第三のタンパク質に機 能性タンパク質が生物学的結合により結合する形でもよい。
(b) 結合性タンパク質と標識タンパク質のレ、ずれか一方の機能性タンパク質が前 記ポリぺプチド鎖の一末端に融合しており、 その融合した機能性タンパク質の他 末端に他方の機能性タンパク質が直列に融合している形式。 結合性タンパク質と 標識タンパク質の結合順序は、 用いられるタンパク質の種類等により適切な順序 を選べばよレ、。
上の（a) 、 (b) いずれの場合でも、 有機膜への結合部分を含むポリペプチド鎖 と機能性タンパク質等との融合タンパク質を得る必要があるが、 それは対応する 融合 D N A配列を含む組み換えプラスミ ドを調製し、 これで形質転換された磁性 細菌を培養することにより、 前記融合 D N A配列を発現させ、 所要の機能性タン パク質を含む融合タンパク質を、 磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した状態で 該菌体内に生成させることができ、 上記の方法に用いる磁気微粒子が得られる。 上記の磁気微粒子において、 結合性タンパク質と標的タンパク質とが前記ポリ ペプチド鎖に 「相互に近接した状態で」 結合している、 とは、 相互の間に他のぺ プチドが存在しないか、 あるいは 1〜 1 0 0 0個のぺプチドしか存在しないこと を意味する。 このとき、 立体障害などにより相互のタンパク質の活性が低下しな レ、こと、 および結合性タンパク質に結合する第三のタンパク質の活性が低下しな いことが必要である。
[標的物質]
上記の方法により測定することができる標的物質は、 それに特異的に結合する 能力を有する結合性タンパク質が存在しさえすればいずれでもよい。 特異的な結 合の方式は限定されず、 例えば抗原抗体反応、 リガンド · リセプター結合反応等 が挙げられる。
したがって、 上記の方法により測定することができる標的物質としては、 例え ば、 抗原、 抗体、 リガンドとしてタンパク質に結合しうる物質 （酵素に結合する 基質、 補酵素、 調節因子； リセプターと結合するレクチン、 ホルモン、 神経伝達 物質など） 、 プロテイン Aと抗体のいずれか一方、 レクチンと結合する多糖類 ' 複合糖類、 アビジン、 ス トレプトアビジン等のアビジン類と結合するピオチン等 が挙げられる。 抗体、 動植物細胞、 細菌、 ウィルス等様々なものが抗原として機 能しうることは周知であり、 本発明の測定方法の対象となる。 [結合性タンパク質]
磁気微粒子に結合される結合性タンパク質は標的である試料中の標的物質と特 異的に結合し得るタンパク質である。
結合性タンパク質は、 上記の標的物資に対応して選択される。 該結合性タンパ ク質としては、 例えば、 抗体、 抗原として作用するタンパク質、 上記のリガンド と結合するタンパク質、 プロテイン Aと抗体の残る他方、 その他の免疫関連タン パク質、 レクチン、 アビジン等が挙げられる。
[標識タンパク質]
上記の方法において、 検出用信号を発生する機能タンパクである標識タンパク 質としては、 例えば、 グリーンフルオレセンスプロテイン等の蛍光性タンパク、 蛍光色素結合タンパク、 あるいはルシフェラ一ゼ、 アルカリホスファタ一ゼ、 ぺ ルォキシダ一ゼ、 /3— D—ガラク トシダ一ゼ、 グルコースォキシダ一ゼ、 グルコ —スー 6—リン酸脱水素酵素などの生物発光もしくは化学発光に関与する発光関 連酵素等の光学的測定手段で測定可能なもの；補酵素、 加水分解酵素、 酸化還元 酵素、 異性化酵素、 転移酵素、 脱離酵素、 制限酵素等の活性を別途測定する酵素 類が挙げられる。 前者が直接に光学的手段を用いて測定できる点で好ましい。 実施例
例
I . 組み換えプラスミ ドの調製
蛍ルシフユラ一ゼ遺伝子 （ 1 u c遺伝子、 東洋インキ製） を磁性細菌内で発現 させ、 該遺伝子でコードされる発光タンパク質を磁気微粒子を被覆する有機膜上 に生成させるため、 m p s— 1 u c融合遺伝子を結合したプラスミ ド p K S Lを 第 3図に示す方法で作製した。
べクターには磁性細菌 AM B— 1に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、 テ トラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミ ド p R K 4 1 5 (N . T . N e e n , S . T a m a k i , D. Ko b a y a s h i a n d D. T r a 1 1 i n g e r , 1 988, Ge n e 70 : 1 91— 1 97) を用いた。 p RK4 1 5を B am H I と S a c Iで切断し、 B a mH I と S a c Iで切断した 1 u c遺伝子を組み 込み、 プラスミ ド pKLCを作製した。 更にプラスミ ド pKLCを 1 u c遺伝子 の上流 に存在する B a mH Iで切断した。
次に、 mp s構造遺伝子とその上流に位置するプロモータ部位を含む DNA配 列の 5'末端部と相補的な配列を有しさらに B a mH I切断部位をデザインした F—プライマ一と、 該 DN A配列の 3' 末端部と相補的な配列を有しさらに B a mH I切断部位をデザインした配列を有する R—プライマ一とを用いて、 PCR により増幅し、 両端に B a mH I切断部位を付加した結合性 D N A配列を作製し た。 増幅した結合性 DN A配列をプラスミ ド pKLCと接続し、 プラスミ ド p K S Lを作製した。 p KS Lの制限酵素切断部位地図を第 4図に示す。 こう して m p s構造遺伝子の読み枠とずれることなく 1 u c遺伝子は翻訳され融合タンパク 質を生産することが出来る。
II. 接合伝達体の作製
次に、 Iで得られた組み換えプラスミ ドを E. coli S17-1 にエレク トロポレ一 シヨンにより導入したのち、 接合伝達により野生株 AMB— 1に導入し、 接合伝 達体の作製を行った。 接合伝達における供与菌体として用いた E. coli S17-1 は t r a遺伝子を有しているため、 接合伝達を行う際、 ヘルパープラスミ ドなしで 接合伝達が可能である。 接合伝達には M S G M培地で培養した対数期中期から後 期の磁性細菌約 8 X 107 c e l l s/m lを用い、 供与菌体は前日にプラス ミ ドを導入し発生したコロニーをかき取って 109 から i 01 0 c e l l sZ m 1になるように懸濁して用いた。 1 : 50 (磁性細菌：大腸菌） で菌を混合し、 寒天プレート上にスポットし、 メイティングを行った。 6時間後スポットをメス で切り取り 5m 1程度の MS GM培地を用い菌体を回収した。 この懸濁液をテト ラサイクリン 2. 5 / gZm 1を添加した MSGM培地に植菌した。 25°Cで培 養し、 増殖した細胞を接合伝達体とした。 この際、 大腸菌は MSGM培地では増 殖しない。 次に接合伝達後 M S GM培地で培養した磁性細菌より磁気微粒子の分離を行つ た。 磁性細菌を遠心分離により集菌後 1 O mMトリスバッファーで 2回洗浄後、 菌体濃度 0 . l g w e t c e 1 1 /m 1を超えない濃度で懸濁し、 出力 1 2 0 W、 3 0秒間 5回の超音波破砕を行った。 細胞破碎懸濁液を容器内で氷冷しな がら S m— C o磁石を容器外壁面に当てて 3 0分処理し、 磁気微粒子を懸濁液中 から分離した。 さらに懸濁液を 5， 0 0 0 G、 1 5分遠心分離することで細胞膜 成分を分離し、 1 0 0， 0 0 0 G、 1 . 5時間超遠心する事で細胞質を分離した。 磁気微粒子、 細胞膜及び細胞質の各分画のルシフヱ一ラ一ゼ活性をピッ力ジー ン発光キット （東洋インキ製） を用いルミノメ一ターで発光量を測定することで 行い、 導入したルシフユラ一ゼ遺伝子の発現及び発現量を測定した。 結果を表 1 に示す。
表 1
Figure imgf000021_0001
(単位：キロカウント/ μ gタンパク質） 表 1に示すように、 大腸菌ではほとんど発現しないが細胞質分画の発光量が高 く、 水溶性タンパク質であることを示している。 磁性細菌では細胞質分画、 細胞 膜分画、 磁気微粒子分画の各分画で発光が確認されたが、 磁気微粒子分画が最も 発光量が高く、 磁気微粒子表面でのタンパク質の発現効率が高いことが示された。 即ち、 水溶性ではあるが膜結合性タンパク質である m p s融合タンパク質が磁気 微粒子分画で最も多く発現しており、 磁気微粒子を被覆する有機膜上での 1 u c タンパク質の生産及び分離が示された。 例 2
抗ゥサギ I g G抗体の抗原認識部位をコ一ドした遺伝子 （ i g g遣伝子、 ファ ルマシア社） を該遺伝子でコ一ドされる抗体タンパク質を磁気微粒子を被覆する リン脂質を主成分とする有機膜上に生成させるため、 mp s— i g g融合遗伝子 を結合したプラスミ ド p KSGを第 5図に示す方法で作製した。
即ち、 ベクタ一には磁性細菌 AMB— 1に接合伝達による遺伝子導入が可能で あり、 テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミ ド p RK41 5を用いた。 p RK4 1 5を E c o R Iで切断し平滑末端化し i g g遺伝子を組み込み、 プラス ミ ド p KG Cを作製した。
次に、 mp s構造遺伝子及びその上流に位置するプロモータ部位を含む遺伝子 断片と相補的な配列を有しさらに B a mH I切断部位をデザインした D N A配列 を有する F—プライマーと R—プライマ一とを用いて PC Rにより増幅し、 B a mH I切断部位を両端に付加した結合性 DN A配列を作製した。 増幅した結合性 DNA配列をプラスミ ド p KGCと接続し、 プラスミ ド p KSGを作製した。 p KSGの制限酵素切断部位地図を第 6図に示す。 こうして mp sの読み訳とずれ ることなく i g g遺伝子は翻訳され融合タンパク質を生産することが出来る。 このプラスミ ドを例 1と同様にして接合伝達により野生株 AMB— 1に導入し、 接合伝達体を作製した。 接合伝達体を培養し、 細胞を回収、 破砕を行い、 磁気微 粒子を回収した。 この磁気微粒子を用いて、 ゥサギ I g Gを抗原としたィムノア ッセィを行った。 ィムノアツセィはアル力リフォスフアスターゼ標識した抗ゥサ ギ I gG抗体を 2次抗体として用いたサンドィツチ法を用い、 検出はアルカリフ ォスファスターゼと、 AMPPD (B o e h r i n g e r a n n h e i m B i o c h em i c a) との反応による発光をルミノメ一ターで測定した。 この 結果、 抗原を検出することが可能であった。 この実験により、 接合伝達体の磁気 微粒子に抗体が mp s融合タンパク質として結合することによって、 抗体固定化 操作なしに抗原検出システムに用いることが可能な磁気微粒子を生産することが できた。 例 3
プロティン A遺伝子 （P r o t e i nA g e n e, フアルマシア社製 p E Z Z 1 8より分離） を該遺伝子でコードされるタンパク質を磁気微粒子を被覆する リン脂質を主成分とする有機膜上に生成させるため、 mp s—プロテイン A融合 遺伝子を結合したプラスミ ド p KS Aを第 7図に示す方法で作製した。
即ち、 ベクターには磁性細菌 AMB— 1に接合伝達による遺伝子導入が可能で あり、 テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミ ド p RK41 5を用いた。 p RK4 1 5を E c o R Iで切断した。 別途、 両端に E c o R I切断部位をデザィ ンしたプライマ一を用いて PC R法により増幅した、 E c o R I切断部位を付加 してプロティン A遺伝子作り、 これを上記の E c o R Iで切断した p RK4 1 5 に組み込み、 プラスミ ド pK ACを作製した。
次に、 mp s構造遺伝子とその上流に位置するプロモータ部位を含む遺伝子断 片と相補的な配列を有しさらに B a mH I切断部位をデザインした D N A配列を 有する F—プライマ一と R—プライマーとを用いて PC Rにより増幅し、 B am H I切断部位を両端に付加した結合性 DN A配列を作製した。 増幅した結合性 D NA配列をプラスミ ド pKACと接続し、 プラスミ ド p KS Aを作製した。 pK S Αの制限酵素切断部位地図を第 8図に示す。 こうして mp sの読み訳とずれる ことなくプロティン A遺伝子は翻訳され融合タンパク質を生産することが出来る。 このプラスミ ドを接合伝達により野生株 AM B— 1に導入し、 接合伝達体の作 製を行った。 接合伝達における供与菌体として用いた E. c o 1 i S 1 7- 1 は t i: a遺伝子を有しているため、 接合伝達を行う際、 ヘルパープラスミ ド なしで接合伝達が可能である。 接合伝達には MS GM培地で培養した対数期中期 から後期の磁性細菌約 8 X 10 ' c e l l s/m lを用い、 供与菌体は前日に プラスミ ドを導入し発生したコロニーをかき取って 1 09 から 10 1 0 c e 1
1 sZm 1になるように懸濁して用いた。 1 : 50 (磁性細菌：大腸菌） で菌を 混合し、 寒天プレート上にスポットし、 メイティングを行った。 6時間後スボッ トをメスで切り取り 5m 1程度の MS GM培地を用い菌体を回収した。 この懸濁 液をテトラサイクリン 2. 5 μ gZm 1を添加した MSGM培地に植菌した。 2 5°Cで培養し、 増殖した細胞を接合伝達体とした。 この際、 大腸菌は MS GM培 地では増殖しない。
次に接合伝達後 MS GM培地で培養した磁性細菌より磁気微粒子の分離を行つ た。 磁性細菌を遠心分離により集菌後 1 OmMトリスバッファーで 2回洗浄後、 菌体濃度 0. l g we t c e 1 1 1を超えない濃度で懸濁し、 出力 1 2
0 W、 30秒間 5回の超音波破砕を行つた。 細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しな がら Sm—C o磁石を容器外壁面に当てて 30分処理し、 磁気微粒子を懸濁液中 から分離し、 こうして磁気微粒子上にプロテイン Aが発現した磁気微粒子を得た。 この磁気微粒子に対し、 プロテイン Aの I gGとの結合能に注目し、 抗杉花粉、 抗小麦、 抗卵 I gGと混合した。 混合した粒子は洗浄し、 抗体固定化量を測定し たところ、 従来用いられてきた特開平 5— 209884号公報に記載の S PD P を用いる化学結合法と同程度の固定化が可能であることが示された。 また、 同公 報に記載の実施例 1 と同様に、 抗原検出実験を行った結果 3種の抗原はどれも検 出可能であった。 このよにプロテイン A— mp s融合タンパク質を用いて様々な
1 gGを磁気微粒子表面に簡便に結合させることが可能であり、 従来の化学結合 に劣らない抗原検出が可能であることが示された。 例 4
蛍ルシフヱラ一ゼ遺伝子 （ 1 u c遺伝子） を mp s構造遺伝子の 5' 末端側に 導入し、 1 u c— mp s融合 DN A配列を含むプラスミ ド p NE LSを第 9図に 示す方法で作製した。
( 1 ) ベクターには磁性細菌 AMB— 1に接合伝達による遺伝子導入が可能であ り、 テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミ ド p RK4 1 5を用いた。 p R K 4 1 5の N c o I切断部位と E c o N I切断部位をそれぞれ平滑末端化処理に より欠損つせ、 プラスミ ド p RK4 1 5 NEを作製した。 p RK4 1 5 NEを S a c Iで切断し、 mp sプロモータ— 1 u c融合遺伝子を組み込んだプラスミ ド pNE PLを作製した。
(2) 次に、 S c a I切断部位をデザインしたプライマーを用い PC Rにより S c a I切断部位を付加して mp s遺伝子断片を増幅した。 増幅した mp s遺伝子 断片の S c a I切断部位を平滑末端化し、 E c oN Iで切断後平滑末端化したブ ラスミ ド p NE PLと接続し、 プラスミ ド pNELSを作製した。 p NELSの 制限酵素切断部^ Ϊ地図を第 1図 0に示す。
(3) このプラスミ ドを接合伝達によって野生株 AMB— 1に導入し、 接合伝達 体を作製した。 接合伝達体を培養して増殖させ、 細胞を回収、 破碎を行い、 磁気 微粒子を磁石を用いて回収した。 この磁気微粒子のルシフェラーゼ活性を、 ピッ カジ一ン発光キッ ト （東洋インキ製） を用いルミノメータ一で発光量を測定した。 結果を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000025_0001
(単位：キロカウント /μ gタンパク質） 次に、 磁気微粒子上における mp sタンパク質の C末端及び N末端の露出方向 を確認するために、 mp s構造遺伝子の 3' 末端に 1 u c遺伝子を結合したブラ スミ ド p KS Lを保持する接合伝達体由来の磁気微粒子と、 mp s構造遺伝子の 5' 末端に 1 u c遺伝子を結合したプラスミ ド p NELSを保持する接合伝達体 由来の磁気微粒子において、 抗ルシフェラ一ゼ I g G及びアルカリホスファタ一 ゼ標識抗ゥサギ I gGを用いてィムノアツセィを行った。 検出はアルカリホスフ ァタ一ゼと AM PPD (B o e h r i n g e r Ma n n h e i m B i o c h em i c a) との反応による発光をルミノメ一ターで測定した。 結果を表 3に示 す。 表 3
Figure imgf000026_0001
(単位：キロカウント Zmgタンパク質） この実験により、 mp sタンパク質の N末端及び C末端は磁気微粒子を被覆す る有機膜の外側に露出していることが明らかとなった。 従って機能性タンパク質 の性質に応じて mp sタンパク質の N末端に融合した融合タンパク質として生成 させるか C末端に融合した融合タンパク質として生成させるかを選択することが できる。 例 5
蛍ルシフェラ一ゼ遣伝子及びク口ラムフエニコ一ルァセチルランスフェラーゼ (CAT) 遺伝子を磁気微粒子上に同時発現させるため、 1 u c— mp s— c a t融合 DN A配列を含むプラスミ ド pNELSCを第 1図 1に示す方法で作製し た。
c a t遺伝子に該遺伝子の S D配列を削除し S p h I切断部位をデザィンした プライマーを用い、 P CRにより S p h I切断部位を付加して c a t遺伝子断片 を増幅した。 増幅した c a t遺伝子断片の S p h I切断部位を平滑末端化した。 これを、 例 4で調製した p NE L Sを Nu r Iで切断した後平滑末端化したもの と接続し、 プラスミ ド p NE L S Cを作製した。 p NE L S Cの制限酵素切断部 位地図を第 1 2図に示す。 このプラスミ ドを接合伝達によって野生株 AM B— 1 に導入し、 接合伝達体を作製した。 接合伝達体を培養して増殖させ、 細胞を回収、 破砕を行い、 磁石で磁気微粒子を回収した。 この磁気微粒子のルシフェラーゼ活 性を、 ピツカジーン発光キット （東洋インキ製） を用いルミノメーターで発光量 を測定したところ P NE LMと同等のルシフェラ一ゼ活性を示した。
次に、 この磁気微粒子上の CATアツセィを行った結果、 CAT活性が検出さ れた。 CATアツセィは、 クロラムフエニコ一ルァセチルランスフェラーゼとク 口ラムフエニコ一ルとの反応によるクロラムフエ二コールァセチル化体を薄層ク 口マトグラフィ一により検出することで行った。 この結果、 mp s構造遺伝子タ ンパク質の両末端に接続したそれぞれのタンパク質は、 該タンパク質を単独で接 続したときと同等の活性を示した。 この実験より、 mp s構造遺伝子タンパク質 の両末端に機能の異なるタンパク質をコ一ドする遺伝子を接続した融合遺伝子を 構築することで、 磁気微粒子上に同時発現することが可能になり、 これより多数 の機能を有する磁気微粒子を生産することができた。
例 6
I . 組み換えプラスミ ドの調製
蛍ルシフェラ一ゼ遺伝子 （ 1 u c遺伝子、 東洋インキ製） を ma gA遺伝子 の 3 ' 末端側に導入し、 プロテイン A遺伝子を （p r o t e i n A遺伝子、 ファ ルマシア製） を ma g A遺伝子の 5' 末端側に導入したプロテイン A— m a g A — 1 u c融合 DN A配列を含むプラスミ ド pNPAMLを第 1 3図に示す方法で 作製した。
最終的なベクターには磁性細菌 AMB— 1に接合伝達による遺伝子導入が可 能であり、 テトラサイクリン耐性遣伝子を持つプラスミ ド p RK4 1 5 (N. T. N e e n , S . T a m a k i , D. Ko b a y a s h i a n d D. T r a 1 l i n g e r, 1 988， Ge n e 70 : 1 91 - 1 97) を用いた。
( 1 ) B a mH I切断部位と N u r I切断部位をデザインしたプライマ一を用 い PC Rにより B amH I切断部位と Nu r Iを付加した ma g A遺伝子断片を 増幅したのち平滑末端化処理した。 平滑末端化処理した ma g A遺伝子断片を B a mH Iで切断後、 平滑末端化処理したプラスミ ド p E Z Z 1 8に組込み、 ブラ スミ ド p E Z ZMを作製した。
(2) 次に、 B a mH I と S a c Iで切断後、 平滑末端化処理した 1 u c遺伝 子を S p h iで切断し、 平滑末端化処理したプラスミ ド p EZ Z-M組込み、 プロ ティン A— ma g A- 1 u c融合 D N A配列を含むプラスミ ド p EZMLを作製 した。 更に、 Hp a I と S c a I切断部位をデザインしたプライマ一を用い PC Rにより Hp a I と S c a I切断部位を付加したプロテイン A— m a g A— 1 u c融合 D N A配列増幅した。
(3) 次に、 プラスミ ド p RK4 1 5の Nc o I切断部位を欠損させたプラス ミ ド p RK4 1 5 Nを E c o R Iで切断後、 平滑末端化処理し、 PCRにより増 幅したプロテイン A— ma g A— 1 u c融合 D N A配列を組込みプラスミ ド pN AM Lを作製した。
(4) 次に、 プラスミ ド p NAMLを S c a Iで切断し、 プラスミ ド p UM 5
Aを Kp n l と Nc o lで切断し、 平滑末端化処理を行った m a g A遺伝子のプ 口モータ一配列を組込んだ。 こうして ma g A遺伝子のプロモータ一配列とプロ ティン A— ma g A- 1 u c融合 D N A配列を含むプラスミ ド p NPAMLを作 製した。
II. 接合伝達体の作製
次に、 Iで得られた組み換えプラスミ ドを接合伝達により野生株 A MB— 1 に導入し、 接合伝達体の作製を行った。 接合伝達における供与菌体として用いた E. coli S17-1 は t r a遺伝子を有しているため、 接合伝達を行う際、 ヘルパー プラスミ ドなしで接合伝達が可能である。 接合伝達には MS GM培地で培養した 対数期中期から後期の磁性細菌約 8 X 107 c e l l s/m l を用い、 供与菌 体は前日にプラスミ ドを導入し発生したコロニーをかき取って 109 から 1 0
10 c e 1 1 sZm 1になるように懸濁して用いた。 1 : 50 (磁性細菌：大腸 菌） で菌を混合し、 寒天プレート上にスポットし、 メイティングを行った。 6時 間後スポットをメスで切り取り 5 m 1程度の MS GiM培地を用い菌体を回収した。 この懸濁液をテトラサイクリン 2. 5 μ g/m 1を添加した M S GM培地に植菌 した。 25°Cで培養し、 増殖した細胞を接合伝達体とした。 この際、 大腸菌は M
S G M培地では増殖しない。
次に接合伝達後 M S G M培地で培養した磁性細菌より磁気微粒子の分離を行つ た。 磁性細菌を遠心分離により集菌後 1 OmMトリスバッファ一で 2回洗浄後、 菌体濃度 0. l g we t c e 1 ！ /m 1 を超えない濃度で懸濁し、 出力 1 2 0W、 30秒間 5回の超音波破砕を行った。 細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しな がら Sm_C o磁石を容器外壁面に当てて 30分処理し、 磁気微粒子を懸濁液中 から分離し、 こうして磁気微粒子上に蛍ルシフェラーゼ及びプロテイン Aが同時 に発現した磁気微粒子を得た。
次に、 分離した磁気微粒子をリン酸緩衝生理食塩水 （PBS、 pH7. 4) に 懸濁し、 抗ヒ ト I gG抗体を添加し、 磁気微粒子上のプロテイン Aと結合させた。 余剰の抗体は磁気微粒子を Sm— C o磁石を用いて磁気的に回収し再び P B Sに 懸濁する事を繰り返す事で洗浄し、 プロテイン Aに抗体が結合した磁気微粒子を 得た。
次に、 抗ヒ ト I g G抗体を結合させた蛍ルシフェラ一ゼ及びプロテイン Aを同 時に発現させた磁気微粒子 （プロテイン A発現抗体結合磁気微粒子） の懸濁液
(PBS) に抗原としてヒ ト I gGを添加し抗原抗体反応を行った。 抗原抗体反 応は交番磁界を印加することで磁気微粒子を磁気的に撹拌することで行った （特 開平 2— 281 1 42) 。 従来より用いられてきたグルタルアルデヒ ドを用いる 化学結合法 （特広平 6— 1 2994) でプロテイン A及びルシフェラ一ゼを固定 化し、 プロテイン Aに抗ヒ ト I gG抗体を結合させた磁気微粒子 （プロテイン A 固定化抗体結合磁気微粒子） と抗ヒ ト I gG抗体とルシフユラーゼを固定化した 磁気微粒子 （抗体結合磁気微粒子） を比較として用い、 抗原抗体反応によって生 じた凝集により磁気微粒子上のルシフェラーゼの発光量の変化を測定した結果を 表 1に示す。 発光量はピツカジーン発光キット （東洋インキ製） を用いルミノメ 一ターで測定し、 稀釈した抗原を測定する事で、 最高検出感度を比較した。 表 4
Figure imgf000030_0001
表 4に示すようにプロティン A発現抗体結合磁気微粒子が最も検出感度が高 かった。 これは化学的な固定化法と比べ、 遺伝子組み換えによりタンパク質を発 現させた場合は磁気微粒子への結合部位が遺伝的に制御され活性の低下が無いた めである。 また、 遺伝的に制御する事でプロテイン Aとルシフェラーゼを近接し た位置に結合できるため、 抗原結合によりルシフヱラ一ゼの発光を効果的に阻害 できる。 これに対し、 化学的な固定化では固定化処理に活性部位を用いてしまつ たり、 結合したタンパク質の状態によっては立体阻害を起こし結合部位が表面に 出ない場合がある。 従って、 固定化量の制御及び同時に二種類のタンパク質を安 定に固定化することは困難である。 例 7
I . 組み換えプラスミ ドの調製
蛍ルシフェラ一ゼ遺伝子 （ 1 u c遺伝子、 東洋インキ製） を m p s遺伝子の 3 ' 末端側に導入し、 プロテイン A遺伝子を （p r o t e i n A遺伝子、 フアル マシア製） を m p s遺伝子の 5 ' 末端側に導入したプロテイン A— m p s— 1 u c融合 D N A配列を含むプラスミ ド p K Z M P Lを第 1 4図に示す方法で作製し た。
最終的なベクターには磁性細菌 AMB— 1に接合伝達による遺伝子導入が可 能であり、 テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミ ド p RK41 5 (N. T. N e e n , S . T ama k i , D. Ko b a y a s h i a n d D . Γ r a 1 l i n g e r, 1 988, Ge n e 70 : 1 91 - 1 97) を用いた。
(1) プラスミ ド pUC 1 8の E c oR I切断部位を欠損させた p U C 1 8 E に B a mH I切断部位をデザインしたプライマ一を用い P C Rにより B a mH I 切断部位を付加してプロモータ配列を含む mp s遺伝子断片を増幅した。 増幅し た mp s遣伝子断片を B a mH I切断部位で切断したプラスミ ド pUC l 8 Eと 接続し、 プラスミ ド p UCEMP Sを作製した。
(2) 次に、 PCRにより増幅したプロテイン A遺伝子を TAクロ一ニングを したプラスミ ドより、 E c o R Iで切り出した。 切り出したプロテイン A遺伝子 断片を E c o R Iで切断したプラスミ ド p UCEMP Sと接続し、 プラスミ ド p UCEZMPを作製した。
(3) 次に、 プラスミ ド p RK4 1 5を B a mH I と S a c Iで切断し、 B a mH I と S a c Iで切断した 1 u c遺伝子を組込み、 プラスミ ド p KLCを作製 した。 更にプラスミ ド p KLCを 1 u c遺伝子の上流部に存在する B a mH Iで 切断した。
(4) プラスミ ド pUCEZMPを B a mH Iで切断し、 プロテイン A— mp s融合 DN A配列を切り出し、 B amH Iで切断したプラスミ ド p K L Cに接続 し、 プロテイン A— mp s— 1 u c融合 DN A配列を含むプラスミ ド p KZMP Lを作製した。
II. 接合伝達体の作製
次に、 Iで得られた組み換えプラスミ ドを接合伝達により野生株 AMB— 1 に導入し、 接合伝達体の作製を行った。 接合伝達における供与菌体として用いた E. coli S17-1 は t r a遺伝子を有しているため、 接合伝達を行う際、 ヘルパー プラスミ ドなしで接合伝達が可能である。 接合伝達には MS GM培地で培養した 対数期中期から後期の磁性細菌約 8 X 107 c e l l s/m l を用い、 供与菌 体は前日にプラスミ ドを導入し発生したコロニーをかき取って 109 から 1 0 1 0 c e 1 1 s /m 1になるように懸濁して用いた。 1 : 5 0 (磁性細菌：大腸 菌） で菌を混合し、 寒天プレート上にスポッ トし、 メイティングを行った。 6時 間後スポットをメスで切り取り 5 m 1程度の MS GM培地を用い菌体を回収した。 この懸濁液をテ卜ラサイクリン 2. 5 μ g/m 1を添加した M S GM培地に植菌 した。 2 5°Cで培養し、 増殖した細胞を接合伝達体とした。 この際、 大腸菌は M S GM培地では増殖しない。
次に接合伝達後 MS GM培地で培養した磁性細菌より磁気微粒子の分離を行 つた。 磁性細菌を遠心分離により集菌後 1 0 mMトリスバッファ一で 2回洗浄後、 菌体濃度 0. l g w e t c e 1 1 /m 1 を超えない濃度で懸濁し、 出力 1 2 0 W、 3 0秒間 5回の超音波破砕を行った。 細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しな がら S m— C o磁石を容器外壁面に当てて 3 0分処理し、 磁気微粒子を懸濁液中 から分離し、 こうして磁気微粒子上に蛍ルシフ ラーゼ及びプロテイン Aが同時 に発現した磁気微粒子を得た。
次に、 分離した磁気微粒子をリン酸緩衝生理食塩水 （P B S、 p H 7. 4) に懸濁し、 抗ヒ ト I g G抗体を添加し、 磁気微粒子上のプロテイン Aと結合させ た。 余剰の抗体は磁気微粒子を Sm— C o磁石を用いて磁気的に回収し再び P B Sに懸濁する事を繰り返す事で洗浄し、 プロティン Aに抗体が結合した磁気微粒 子を得た。
次に、 抗ヒ ト I g G抗体を結合させた蛍ルシフェラ一ゼ及びプロテイン Aを 同時に発現させた磁気微粒子 （プロテイン A発現抗体結合磁気微粒子） の懸濁液 (P B S) に抗原としてヒ ト I g Gを添加し抗原抗体反応を行った。 抗原抗体反 応は交番磁界を印加することで磁気微粒子を磁気的に撹拌することで行った （特 開平 2— 2 8 1 1 4 2) c 従来より用いられてきたダルタルアルデヒ ドを用いる 化学結合法 （特公平 6— 1 2 9 94 ) でプロテイン A及びルシフユラーゼを固定 化し、 プロテイン Aに抗ヒ ト I g G抗体を結合させた磁気微粒子 （プロテイン A 固定化抗体結合磁気微粒子） と抗ヒ ト I g G抗体とルシフェラ一ゼを固定化した 磁気微粒子 （抗体結合磁気微粒子） を比較として用い、 抗原抗体反応によって生 じた凝集により磁気微粒子上のルシフユラ一ゼの発光量の変化を測定した結果を 表 1に示す。 発光量はピツカジーン発光キッ ト （東洋インキ製） を用いルミノメ 一ターで測定し、 稀釈した抗原を測定する事で、 最高検出感度を比較した 表 5
Figure imgf000033_0001
表 5に示すようにプロティン A発現抗体結合磁気微粒子が最も検出感度が高 かった。 これは化学的な固定化法と比べ、 遺伝子組み換えによりタンパク質を発 現させた場合は磁気微粒子への結合部位が遺伝的に制御され活性の低下が無いた めである。 また、 遺伝的に制御する事でプロテイン Aとルシフェラーゼを近接し た位置に結合できるため、 抗原結合によりルシフユラ一ゼの発光を効果的に阻害 できる。 これに対し、 化学的な固定化では固定化処理に活性部位を用いてしまつ たり、 結合したタンパク質の状態によっては立体阻害を起こし結合部位が表面に 出ない場合がある。 従って、 固定化量の制御及び同時に二種類のタンパク質を安 定に固定化することは困難である c
〔発明の利点〕
本発明によれば、 固定化等の処理を行う必要がなく、 形質転換された磁性細菌 を培養し、 菌体内に生成した磁気微粒子を分離するだけで酵素、 抗体その他の有 用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合した状態で安定して得ることができる。 有用タンパク質が機能性タンパク質である場合には、 磁気微粒子に固定化された 機能性タンパク質を磁気的に制御することができるので、 所要の局所へ効率的に その機能を発揮させることができる。
また、 所要のタンパク質をコードする遺伝子をプラスミ ドベクタ一に導入し、 得られた組換えプラスミ ドで磁性細菌を形質転換することでどのようなタンパク 質も磁気微粒子上に生成させることができる。
高価な酵素、 抗体等のタンパク質を用意する必要はなく、 同じ菌株を維持し培 養するだけで所要のタンパク質結合磁気微粒子を半永久的に製造することができ、 製造ロット間のタンパク質含有量や活性にバラツキがなく、 しかも低コスト化の メリットも大きレ、。 しかも、 こう して得られる磁気微粒子は、 常に同一活性を有 するタンパク質を同一の量で含有するものである。
さらに、 タンパク質を磁気微粒子上に生産するため目的とするタンパク質を磁 気的に短時間で分離回収でき、 効率的な分離精製が出来る。
本発明の標的物質測定方法によれば、 微量な標的物質と磁気微粒子上の結合性 タンパク質との反応を例えば交番磁場によって加速して磁気微粒子を凝集させ、 かつ第二のタンパク質に基づく蛍光あるレ、は発光光量の変化を測定することによ つて容易に標的物質を測定することができる。 また、 本発明に用いる磁気微粒子 は、 固定化等の処理を行う必要がなく、 機能性タンパク質はすべて生物学的結合 により磁気微粒子に結合されるので固定化に伴う活性の低下はおこらない。 しか も固定化の反応性が均一であり、 低コストである。 また、 遣伝的にタンパク質の 発現位置を制御できるため結合性タンパク質と標識タンパク質とを近接して結合 することが可能であることは検出感度を著しく向上させる。 従って、 例えばプロ ティン Aを介在タンパク質として発現させた後、 これに抗体を結合し、 抗原抗体 反応に用いた場合、 抗原の結合により近接したルシフニラ一ゼの発光を容易に立 体阻害出来るために非常に高感度な測定が可能となる。 産業上の利用可能性
本発明は、 例えば、 次のような利用可能性を有する。
1)酵素結合担体
一般に部位特異的に働くことが理想であると考えられる酵素はすべて磁気微粒 子表面で発現させる価値がある。 例えば、 生化学反応において反応系の中で局所 的にある酵素反応を行いたい場合にはこの酵素を発現させた磁気微粒子は有用で ある。 また、 ある酵素系の疾患においては器官に特異的にその酵素を投与したい 場合磁気微粒子表面に発現させた酵素を磁気的に誘導することによって、 治療す ることが可能である。
2) DNA キャリア
DNA や RNA との結合能を持つタンパク質、 例えばリプレッサ一などのタンパク 質の遺伝子を結合性 DN A配列と融合し、 本発明により磁気微粒子に固定すると、 この磁気微粒子を遺伝子の輸送を行うキャリアとして用いることが可能である。 リプレッサーなどのタンパク質はある特定の物質の存在下で結合力を失う特性が ある。 これを利用して、 遺伝子の輸送を行うことができる。 リブレッサ一タンパ ク質の例としては L a c Iが举げられる。 L a c I とはラク ト一ス分解酵素の遺 伝子発現を制御するタンパク質で、 プロモータ一の下流城に結合することによつ て、 遺伝子の転写を抑制するリプレッサ一である。 この L a c Iはラク ト一スや、 I PTGなどの化学物質と結合することによって、 DNAとの結合能を失う。 つ まり、 分解する基質が存在するときに発現する仕組みになっているのである。 ま た、 L a c Iが結合する特定の DNAドメインがある。 DNAドメインを組み込 んだ遺伝子は L a c Iが結合することができる。
例えば、 この L a c Iを磁気微粒子表面で発現させることによって、 L a c I が DNAドメインを組み込んだ遺伝子と結合する。 一方、 L a c Iは、 I PTG という物質によって DN Aとの結合能を失う。 これを用いてある特定の場所から DNAを磁気輪送し、 I PTGの添加によって DNAを遊離させることができる。 こうして、 遣伝子を所要の場所へ輸送することができる。
したがって、 本発明の磁気微粒子は、 遺伝子治療における遺伝子移送担体など に応用することが考えられる。 例えば、 目的遺伝子の相補鎖からできるアンチセ ンス RN Aを発現させることによって、 その目的の遺伝子の発現を RN Aハイブ リッドの形成によって抑えるという治療法が現在盛んに研究されているが、 その アンチセンスの RN Aを発現する DN Aを運ぶ手段として用いることができる： また、 さらに、 金属結合性のタンパク質を磁気微粒子表面に発現させ、 これを 金属の回収、 または、 検出に用いることができる 3 回収、 検出は磁気回収によつ て行うことができる。
3)タンパク質生産システム
一般に分離精製が困難であると言われるタンパク質は、 磁気微粒子上に m p s タンパク質との融合タンパク質として発現させることで、 分離精製が容易になる。 即ち、 磁気微粒子表面で発現させたタンパク質は、 最後に磁気により容易に回収 できるからである。 磁性細菌から得られる磁気微粒子の単分散性の高さを考える と、 タンパク質によっては、 磁気微粒子に固定化された状態で使用可能なものも 多く存在すると考えられる。 例えばアルコ一ル発酵用の酵素などは磁気微粒子と 結合したままの状態でも酵素の活性さえあれば十分に使用可能であると考えられ る。
4)診断試薬
ルシフェラーゼ等のレポ一ター遺伝子を発現させた磁気微粒子に同時に抗体を 発現させるか、 またはプロテイン Aを発現させ、 抗体を結合させた磁気微粒子は 免疫測定用の試薬としての利用が可能である。 磁気微粒子を担体とすることで外 部磁界により撹袢することができ、 抗原抗体反応を促進することができる。 抗原 抗体反応による凝集によりリポーター遺伝子が立体的に阻害されルシフェラーゼ では発光阻害がおきる。 凝集度により発光阻害効果が異なるので抗原の定量が可 能となる。
5)抗原物質など標的物質の定量
有用タンパク質として結合性タンパク質と標識タンパク質とを結合させた磁気 微粒子、 及びこれを用いる前記の測定方法によれば、 ルシフェラ一ゼ等の発光性 機能タンパク質 （発光関連酵素） を結合させた磁気微粒子に、 同時に抗体を発現 させるか、 又はプロテイン Aを発現させ、 抗体を結合させた磁気微粒子を免疫測 定用の試薬として利用する。 すなわち、 磁気微粒子を担体とすることで外部磁界 により攪袢することができ、 抗原抗体反応を促進することができる。 また、 抗原 抗体反応による凝集により発光性機能タンパク質が立体的に阻害され、 ラーゼでは発光阻害がおきる。 凝集度により発光阻害効果が異なるので抗原の定 量が可能となる。 以下に示す配列表に示された塩基配列は、 左から右へ 5 ' 末端から 3 '末端の 方向である。 また、 各文字は次の塩基を表す。
A ：アデニン
G ： グァニン
C ： シトシン
T ：チミン
γ ： τζυまたは c
H： Aまたは C
N ： Aまたは Gまたは Cまたは TZU
R ： Gまたは A
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 317
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列：
ATG CAT ATC CTT GAA TTC GAA AAG CCC ATC GCC GAG CTC GAG GGC AAG 48 Met Hi s ILe Leu Glu Phe Glu Lys Pro ILe Ala Glu Leu Glu Gly Lys
5 10 15
ATT GAG GAG CTG AGG CAC CTG TCC GAT GGC GGC GAC GTC AAC ATC GCC 96 ILe Glu Glu Leu Arg His Leu Ser Asp Gly Gly Asp Val Asn ILe Ala
20 25 30
GAC GAG GTG TCC AAG CTC CAG GCC AAG GTC GAC AAG CTG CTG CGC TCG 144 Asp Glu Val Ser Lys Leu Gin Ala Lys Val Asp Lys Leu Leu Arg Ser
35 40 45
ACC TAC GCC AAG CTC ACG CCG TGG CAA AAG ACG CAG GTG GCC CGC CAC 192 Thr Tyr Ala Lys Leu Thr Pro Trp Gin Lys Thr Gin Val Ala Arg His
50 55 60
CCG GAG CGT CCG CAC ACG CTG GCC TAT ATC TCG ACG CTG ATC GAG GAC 240 Pro Glu Arg Pro His Thr Leu Ala Tyr ILe Ser Thr Leu ILe Glu Asp 65 70 75 80 TTC ACG CCG CTG GCC GGA GAC CGC GCC TTC GCC GAG GAC GAG GCC ATC 288 Phe Thr Pro Leu Ala Gly Asp Arg Ala Phe Ala Glu Asp Glu Ala ILe
85 90 95
ATC GGC GGC CTG GGC CGT TTC CGC GCG GCT TCG GTG ATG ATC ATC GGC 336 ILe Gly Gly Leu Gly Arg Phe Arg Ala Ala Ser Val Met ILe ILe Gly
100 105 110
CAC GAG AAG GGC CAC GAC ACC GAA ACC CGG CTG AAG CAC AAT TTC GGC 384 His Glu Lys Gly His Asp Thr Glu Thr Arg Leu Lys His Asn Phe Gly
115 120 125
ATG GCC AAG CCC GAG GGC TAT CGC AAG GCC AAG CGC CTG ATG GAA ATG 432 Met Ala Lys Pro Glu Gly Tyr Arg Lys Ala Lys Arg Leu Met Glu Met
130 135 140
GCC GAC CAT TTC CAG GTG CCC ATC ATC ACC CTG GTG GAC ACT GCC GGC 480 Ala Asp His Phe Gin Val Pro ILe ILe Thr Leu Val Asp Thr Ala Gly 145 150 155 160
GCC TAT CCC GGC GTC GAC GCC GAG GCG CGG GGC CAG GCG GAG GCC ATC 528 Ala Tyr Pro Gly Val Asp Ala Glu Ala Arg Gly Gin Ala Glu Ala ILe
165 170 175
GCC CGC TCC ATC GAG ACC TGC CTG AAC GTT CGC GTG CCG CTG GTC TCG 576 Ala Arg Ser ILe Glu Thr Cys leu Asn Val Arg Val Pro し eu Val Ser
180 185 190 GTG ATC ATC GGC GAA GGC GGC TCG GGC GGC GCC ATC GCC CTG GCC ACC 624
Val ILe ILe Gly Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ala ILe Ala Leu Ala Thr
195 200 205
GGC AAT ACC GTC CTG ATG CTC GAA CAC GCC ATC TAT TCG GTG ATC AGC 672
Gly Asn Thr Val Leu Met Leu Glu His Ala ILe Tyr Ser Val ILe Ser
210 215 220
CCC GAG GGC TGC GCC TCG ATC CTG TGG CGC TCG GCC GAG AAC GCC AAG 720
Pro Glu Gly Cys Ala Ser ILe Leu Trp Arg Ser Ala Glu Asn Ala Lys
225 230 235 240
GAC GCC GCC GAA CAG CTG CGC CTT ACC GCC CAG GAC CTG CAC AAG CTC 768
Asp Ala Ala Glu Gin し eu Arg Leu Thr Ala Gin Asp し eu His Lys Leu
245 250 255
AGC ATC ATC GAT TCG GTG GTG CCC GAG CCC ATG GGC GGC GCC CAT CGC 816
Ser ILe ILe Asp Ser Val Val Pro Glu Pro Met Gly Gly Ala His Arg
260 265 270
AAT CCC GAC CTG ATG ATG CAA ACC CTG TCC ATG GCG CTG GAT TCG GCG 864
Asn Pro Asp Leu Met Met Gin Thr Leu Ser Met Ala Leu Asp Ser Ala
275 280 285
CTG CGC GAC CTG TCG GGC CTG GAC GGC GGC GTG CTG CGC GCC CGC CGT 912
Leu Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Gly Gly Val Leu Arg Ala Arg Arg
290 295 300 CGC GAG AAA TTC CTG GAG ATG GGG CGG GCG GGC CTG TCG TGA 954 Arg Glu Lys Phe Leu Glu Met Gly Arg Ala Gly Leu Ser
305 310 315 配列番号： 2
配列の長さ ： 1302
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
ハイポセティカル配列： Yes
アンチセンス ： No
配列：
ATG CAY ATH YTN GAR TTY GAR AAR CCN ATH GCN GAR YTN GAR GGN 45 AAR ATH GAR GAR YTN MGN CAY YTN WSN GAY GGN GGN GAY GTN AAY 90 ATH GCN GAY GAR GTN WSN AAR YTN CAR GCN AAR GTN GAY AAR YTN 135 YTN MGN WSN ACN TAY GCN AAR YTN ACN CCN TGG CAR AAR ACN CAR 180 GTN GCN MGN CAY CCN GAR MGN CCN CAY ACN YTN GCN TAY ATH WSN 225 ACN YTN ATH GAR GAY TTY ACN CCN YTN GCN GGN GAY MGN GCN TTY 270 GCN GAR GAY GAR GCN ATH ATH GGN GGN YTN GGN MGN TTY MGN GCN 315 GCN WSN GTN ATG ATH ATH GGN CAY GAR AAR GGN CAY GAY ACN GAR 360 ACN MGN YTN AAR CAY AAY TTY GGN ATG GCN AAR CCN GAR GGN TAY 405 MGN AAR GCN AAR MGN YTN ATG GAR ATG GCN GAY CAY TTY CAR GTN 450 CCN ATH ATH ACN YTN GTN GAY ACN GCN GGN GCN TAY CCN GGN GTN 495 GAY GCN GAR GCN MGN GGN CAR GCN GAR GCN ATH GCN MGN WSN ATH 540 GAR ACN TGY YTN AAY GTN MGN GTN CCN YTN GTN WSN GTN ATH ATH 585 GGN GAR GGN GGN WSN GGN GGN GCN ATH GCN YTN GCN ACN GGN AAY 630 ACN GTN YTN ATG YTN GAR CAY GCN ATH TAY WSN GTN ATH WSN CCN 675
GAR GGN TGY GCN WSN ATH YTN TGG MGN WSN GCN GAR AAY GCN AAR 720
GAY GCN GCN GAR CAR YTN MGN YTN ACN GCN CAR GAY YTN CAY AAR 765
YTN WSN ATH ΛΤΗ GAY WSN GTN GTN CCN GAR CCN ATG GGN GGN GCN 810
CAY MGN AAY CCN GAY YTN ATG ATG CAR ACN YTN WSN ATG GCN YTN 855
GAY WSN GCN YTN MGN GAY YTN WSN GGN YTN GAY GGN GGN GTN YTN 900
MGN GCN MGN MGN MGN GAR AAR TTY YTN GAR ATG GGN MGN GCN GGN 945
YTN WSN TRR 954 配列番号： 3
配列の長さ ： 1302
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
ハイポセティカル配列： No
アンチセンス ：
起源：
生物名 ：マグネトスピルラム属 dagnetospirullwn)
株名 ： AMB-1 (FERM BP-5458)
配列：
ATG CAT ATC CTT GAA TTC GAA AAG CCC ATC GCC GAG CTC GAG GGC AAG 48 ATT GAG GAG CTG AGG CAC CTG TCC GAT GGC GGC GAC GTC AAC ATC GCC 96 GAC GAG GTG TCC AAG CTC CAG GCC AAG GTC GAC AAG CTG CTG CGC TCG 144 ACC TAC GCC AAG CTC ACG CCG TGG CM AAG ACG CAG GTG GCC CGC CAC 192 CCG GAG CGT CCG CAC ACG CTG GCC TAT ATC TCG ACG CTG ATC GAG GAC 240 TTC ACG CCG CTG GCC GGA GAC CGC GCC TTC GCC GAG GAC GAG GCC ATC 288 ATC GGC GGC CTG GGC CGT TTC CGC GCG GCT TCG GTG ATG ATC ATC GGC 336 CAC GAG AAG GGC CAC GAC ACC GAA ACC CGG CTG AAG CAC AAT TTC GGC 384
ATG GCC AAG CCC GAG GGC TAT CGC AAG GCC AAG CGC CTG ATG GAA ATG 432
GCC GAC CAT TTC CAG GTG CCC ATC ATC ACC CTG GTG GAC ACT GCC GGC 480
GCC TAT CCC GGC GTC GAC GCC GAG GCG CGG GGC CAG GCG GAG GCC ATC 528
GCC CGC TCC ATC GAG ACC TGC CTG AAC GTT CGC GTG CCG CTG GTC TCG 576
GTG ATC ATC GGC GAA GGC GGC TCG GGC GGC GCC ATC GCC CTG GCC ACC 624
GGC AAT ACC GTC CTG ATG CTC GAA CAC GCC ATC TAT TCG GTG ATC AGC 672
CCC GAG GGC TGC GCC TCG ATC CTG TGG CGC TCG GCC GAG AAC GCC AAG 720
GAC GCC GCC GAA CAG CTG CGC CTT ACC GCC CAG GAC CTG CAC AAG CTC 768
AGC ATC ATC GAT TCG GTG GTG CCC GAG CCC ATG GGC GGC GCC CAT CGC 816
AAT CCC GAC CTG ATG ATG CAA ACC CTG TCC ATG GCG CTG GAT TCG GCG 864
CTG CGC GAC CTG TCG GGC CTG GAC GGC GGC GTG CTG CGC GCC CGC CGT 912
CGC GAG AAA TTC CTG GAG ATG GGG CGG GCG GGC CTG TCG TGA 960 配列番号： 4
配列の長さ ： 434
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列：
ATG GAA CTG CAT CAT CCC GAA CTG ACC TAT GCC GCC ATC GTC GCC CTG 48
Met Glu Leu His His Pro Glu Leu Thr Tyr Ala Ala lie Val Ala Leu
δ 10 15
GCC GCC GTG CTG TGC GGC GGG ATG ATG ACG CGC CTG AAG CAG CCG GCC 96
Ala Ala Val Leu Cys Gly Gly Met Met Thr Arg Leu Lys Gin Pro Ala
20 25 30 GTC GTC GGC TAC ATC CTG GCG GGG GTG GTG CTG GGA CCC AGC GGC TTC 144
Val Val Gly Tyr l ie Leu Ala Gly Val Val Leu Gly Pro Ser Gly Phe
35 40 45
GGG CTG GTG AGC AAC CGC GAC GCC GTG GCC ACC CTG GCC GAG TTC GGC 192
Gly Leu Val Ser Asn Arg Asp Ala Val Ala Thr Leu Ala Glu Phe Gly
50 55 60
GTG CTG ATG CTG CTG TTC GTC ATC GGC ATG AAG CTG GAC ATC ATC CGC 240
Val Leu Met Leu Leu Phe Val l ie Gly Met Lys Leu Asp I le l ie Arg
65 70 75 80
TTT CTC GAA GTG TGG AAG ACG GCC ATC TTC ACC ACG GTT CTG CAG ATC 288
Phe Leu Glu Val Tr し ys Thr Ala l ie Phe Thr Thr Val し eu Gin l ie
85 90 95
GCC GGC AGC GTG GGC ACG GCC CTG CTG CTG CGT CAC GGC CTG GGC TGG 336
Ala Gly Ser V l Gly Thr Ala Leu Leu Leu Arg His Gly Leu Gly Trp
100 105 110
AGC CTG GGG CTG GCG GTG GTG CTG GGC TGT GCC GTG GCG GTG TCG TCC 384
Ser Leu Gly Leu Ala Val Val Leu Gly Cys Ala Val Ala Val Ser Ser
115 120 125
ACC GCC GTA GTG ATC AAG GTG CTG GAA TCC TCG GAC GAG CTG GAC ACG 432
Thr Ala Val Val l ie Lys Val Leu Glu Ser Ser Asp Glu Leu Asp Thr
130 135 140 CCG GTC GGC CGC ACC ACC CTT GGC ATC CTG ATC GCC CAG GAC ATG GCG 480
Pro Val Gly Arg Thr Thr Leu Gly l ie Leu l ie Ala Gin Asp Met Ala
145 150 155 160
GTG GTG CCC ATG ATG CTG GTG CTG GAA TCC TTC GAG ACC AAG GCG CTG 528
Val Val Pro Met Met Leu Val Leu Glu Ser Phe Glu Thr し ys Ala Leu
165 170 175
CTG CCC GCC GAC ATG GCC CGG GTG GTG CTG TCG GTG CTG TTC CTG GTG 576
Leu Pro Ala Asp Met Ala Arg Val Val Leu Ser Val Leu Phe Leu Val
180 185 190
CTG CTG TTC TGG TGG CTG TCC AAG CGC CGC ATC GAC CTG CCG ATC ACC 624
Leu Leu Phe Trp Trp Leu Ser し ys Arg Arg He Asp Leu Pro lie Thr
195 200 205
GCC CGG CTT TCC CGC GAT TCT GAC CTT GCC ACC CTG TCG ACC CTG GCC 672
Ala Arg Leu Ser Arg Asp Ser Asp Leu Ala Thr Leu Ser Thr Leu Ala
210 215 220
TGG TGT TTC GGC ACC GCC GCC ATC TCC GGC GTG CTG GAC TTG TCG CCG 720
ΓΓΡ Cys Phe Gly Thr Ala Ala l ie Ser Gly Val Leu Asp Leu Ser Pro
225 230 235 240
GCC TAT GGC GCC TTC CTG GGC GGC GTG GTG CTG GGC AAT TCC GCC CAG 768
Ala Tyr Gly Ala Phe Leu Gly Gly Val Val Leu Gly Asn Ser Ala Gin
245 250 255 CGC GAC ATG CTG TTG AAG CGT GCC CAG CCC ATC GGC AGC GTG CTG CTG 816
Arg Asp Met Leu Leu Lys Arg Ala Gin Pro l ie Gly Ser Val Leu Leu
260 265 270
ATG GTG TTC TTC CTG TCC ATC GGG CTG CTG CTC GAC TTC AAG TTC ATC 864
Met Val Phe Phe Leu Ser l ie Gly Leu Leu Leu Asp Phe Lys Phe l ie
275 280 285
TGG AAG AAT CTG GGC ACC GTT CTC ACC CTG CTG GCC ATG GTG ACC CTG 912
Trp Lys Asn Leu Gly Thr Val Leu Thr Leu Leu Ala Met Val Thr Leu
290 295 300
TTC AAG ACG GCG CTG AAC GTC ACG GCG CTG CGC CTG GCG CGG CAG GAC 960
Phe Lys Thr Ala Leu Asn Val Thr Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gin Asp
305 310 315 320
TGG CCC AGC GCC TTC CTG GCC GGC GTG GCC CTG GCC CAG ATC GGC GAG 1008
Trp Pro Ser Ala Phe Leu Ala Gly Val Ala Leu Ala Gin l ie Gly Glu
325 330 335
TTC TCG TTC CTG CTG GCC GAG ACC GGC AAG GCG GTC AAG CTG ATC AGC 1056
Phe Ser Phe Leu Leu Ala Glu Thr Gly Lys Ala Val Lys Leu l ie Ser
340 345 350
GCC CAG GAG ACC AAG CTG GTG GTG GCG GTC ACC GTG CTG TCC CTG GTG 1104
Ala Gin Glu Thr Lys Leu Val Val Ala Val Thr Val Leu Ser Leu Val
355 360 365 CTG TCG CCG TTC TGG CTG TTC ACC ATG CGG CGC ATG CAC CGG GTG GCG 1 152 Leu Ser Pro Phe Trp Leu Phe Thr Met Arg Arg Met His Arg Val Ala
370 375 380
GCG GTG CAT GTC CAT TCG TTC CGC GAT CTG GTC ACG CGG CTG TAT GGC 1200 Ala Val His Val His Ser Phe Arg Asp し eu Val Thr Arg Leu Tyr Gly 385 390 395 400
GAC GAG GCC CGC GCT TTC GCC CGC ACC GCG CGG CGG GCC CGT GTG CTG 1248 Asp Glu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Thr Ala Arg Arg Ala Arg Val Leu
405 410 415
GTG CGG CGT GGT TCC TGG AGG GAT GAC CCC AAT GCC GGA CCT GGC TCT 1296 Val Arg Arg Gly Ser Trp Arg Asp Asp Pro Asn Ala Gly Pro Gly Ser
420 425 430
GGA ATT
Gly l ie 配列番号： 5
配列の長さ ： 1302
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
ハイポセティカル配列： No
アンチセンス ： No
起源： 生物名 ：マグネトスピゾレラム属 ( Magnetospirullum )
株名 ： AMB- 1 (FE BP- 5458)
配列：
ATG GAA CTG CAT CAT CCC GAA CTG ACC TAT GCC GCC ATC GTC GCC CTG 48
GCC GCC GTG CTG TGC GGC GGG ATG ATG ACG CGC CTG AAG CAG CCG GCC 96 GTC GTC GGC TAC ATC CTG GCG GGG GTG GTG CTG GGA CCC AGC GGC TTC 144 GGG CTG GTG AGC AAC CGC GAC GCC GTG GCC ACC CTG GCC GAG TTC GGC 192
GTG CTG ATG CTG CTG TTC GTC ATC GGC ATG AAG CTG GAC ATC ATC CGC 240
TTT CTC GAA GTG TGG AAG ACG GCC ATC TTC ACC ACG GTT CTG CAG ATC 288
GCC GGC AGC GTG GGC ACG GCC CTG CTG CTG CGT CAC GGC CTG GGC TGG 336
AGC CTG GGG CTG GCG GTG GTG CTG GGC TGT GCC GTG GCG GTG TCG TCC 384
ACC GCC GTA GTG ATC AAG GTG CTG GAA TCC TCG GAC GAG CTG GAC ACG 432
CCG GTC GGC CGC ACC ACC CTT GGC ATC CTG ATC GCC CAG GAC ATG GCG 480
GTG GTG CCC ATG ATG CTG GTG CTG GAA TCC TTC GAG ACC AAG GCG CTG 528
CTG CCC GCC GAC ATG GCC CGG GTG GTG CTG TCG GTG CTG TTC CTG GTG 576
CTG CTG TTC TGG TGG CTG TCC AAG CGC CGC ATC GAC CTG CCG ATC ACC 624
GCC CGG CTT TCC CGC GAT TCT GAC CTT GCC ACC CTG TCG ACC CTG GCC 672
TGG TGT TTC GGC ACC GCC GCC ATC TCC GGC GTG CTG GAC TTG TCG CCG 720
GCC TAT GGC GCC TTC CTG GGC GGC GTG GTG CTG GGC AAT TCC GCC CAG 768
CGC GAC ATG CTG TTG AAG CGT GCC CAG CCC ATC GGC AGC GTG CTG CTG 816
ATG GTG TTC TTC CTG TCC ATC GGG CTG CTG CTC GAC TTC AAG TTC ATC 864
TGG AAG AAT CTG GGC ACC GTT CTC ACC CTG CTG GCC ATG GTG ACC CTG 912
TTC AAG ACG GCG CTG AAC GTC ACG GCG CTG CGC CTG GCG CGG CAG GAC 960
TGG CCC AGC GCC TTC CTG GCC GGC GTG GCC CTG GCC CAG ATC GGC GAG 1008
TTC TCG TTC CTG CTG GCC GAG ACC GGC AAG GCG GTC AAG CTG ATC AGC 1056
GCC CAG GAG ACC AAG CTG GTG GTG GCG GTC ACC GTG CTG TCC CTG GTG 1104
CTG TCG CCG TTC TGG CTG TTC ACC ATG CGG CGC ATG CAC CGG GTG GCG 1 152
GCG GTG CAT GTC CAT TCG TTC CGC GAT CTG GTC ACG CGG CTG TAT GGC 1200 GAC GAG GCC CGC GCT TTC GCC CGC ACC GCG CGG CGG GCC CGT GTG CTG 1248
GTG CGG CGT GGT TCC TGG AGG GAT GAC CCC ΑΛΤ GCC GGA CCT GGC TCT 1296
GGA ATT 1302 配列番号： 6
配列の長さ ： 1302
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
酉己列の種類： Genomic DNA
酉己歹 IJ：
ATG GAR YTN CAY CAY CCN GAR YTN ACN TAY GCN GCN ATH GTN GCN YTN 48
GCN GCN GTN YTN TGY GGN GGN ATG ATG ACN MGN YTN AAR CAR CCN GCN 96 GTN GTN GGN TAY ATH YTN GCN GGN GTN GTN YTN GGN CCN WSN GGN TTY 144 GGN YTN GTN WSN AAY MGN GAY GCN GTN GCN ACN YTN GCN GAR TTY GGN 192
GTN YTN ATG YTN YTN TTY GTN ATH GGN ATG AAR YTN GAY ATH ATH MGN 240
TTY YTN GAR GTN TGG AAR ACN GCN ATH TTY ACN ACN GTN YTN CAR ATH 288
GCN GGN WSN GTN GGN ACN GCN YTN YTN YTN MGN CAY GGN YTN GGN TGG 336
WSN YTN GGN YTN GCN GTN GTN YTN GGN TGY GCN GTN GCN GTN WSN WSN 384
ACN GCN GTN GTN ATH AAR GTN YTN GAR WSN WSN GAY GAR YTN GAY ACN 432
CCN GTN GGN MGN ACN ACN YTN GGN ATH YTN ATH GCN CAR GAY ATG GCN 480
GTN GTN CCN ATG ATG YTN GTN YTN GAR WSN TTY GAR ACN AAR GCN YTN 528
YTN CCN GCN GAY ATG GCN MGN GTN GTN YTN WSN GTN YTN TTY YTN GTN 576
YTN YTN TTY TGG TGG YTN WSN AAR MGN MGN ATH GAY YTN CCN ATH ACN 624
GCN MGN YTN WSN MGN GAY WSN GAY YTN GCN ACN YTN WSN ACN YTN GCN 672
TGG TGY TTY GGN ACN GCN GCN ATH WSN GGN GTN YTN GAY YTN WSN CCN 720
GCN TAY GGN GCN TTY YTN GGN GGN GTN GTN YTN GGN AAY WSN GCN CAR 768
MGN GAY ATG YTN YTN AAR MGN GCN CAR CCN ATH GGN WSN GTN YTN YTN 816 8fr
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Claims

請 求 の 範 囲
1 . 磁性細菌の菌体内に生成する磁気微粒子と、 該磁気微粒子を被覆する有機 膜に結合したハイプリッドタンパク質とからなり、 該ハイブリツドタンパク質が 本来的に該有機膜に結合して生成する膜タンパク質の少なくとも膜結合部分を含 むポリペプチド鎖と、 少なくとも一種の他の有用タンパク質とが生物学的に結合 してなるハイプリッドタンパク質である、 有用タンパク質結合磁気微粒子。
2 . 前記磁生細菌が、 Magnetospiri l lum種又は Desul fovibrio 種の微生物であ る、 請求項 1に記载の有用タンパク質結合磁気微粒子。
3 . 前記磁性細菌が AM B— 1である、 請求項 1に記載の有用タンパク質結合 磁気微粒子。
4 . 前記磁性細菌が AM B— 1であり、 前記の膜タンパク質が後記の配列表の 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する m p sタンパク質である、 請求項 1 に記載の有用タンパク質結合磁気微粒子。
5 . 前記少なくとも一種の他の有用タンパク質が生理活性を有するものである、 請求項 1に記載の有用タンパク質結合磁気微粒子。
6 . 前記の生理活性を有するタンパク質が、 免疫関連タンパク質、 結合能を有 するタンパク質、 又は酵素である、 請求項 5に記載の磁気微粒子。
7 . 前記有用タンパク質が結合性タンパク質と標識タンパク質であり 、 これらが相互に近接した状態で前記ポリペプチ ド鎖に結合している、 請求項 1 に記載の磁気微粒子。
8 . 前記ポリぺプチ ド鎖に含まれる膜結合部分が配列番号 1で表さ れるアミノ酸配列を有する m p sタンパク質由来のものである請求項 7記載の磁 気微 fei子。
9 . 前記ポリべプチ ド鎖に含まれる膜結合部分が配列番号 4で表さ れるアミノ酸配列を有する m a g Aタンパク質由来のものである請求項 7記載の 磁気微粒子。
1 0 . 本来的に有機膜に結合して生成する膜タンパク質の少なくとも膜結合部 分をコ一ドする遺伝子断片と該有用タンパク質をコードする D N A配列との融合 DN A配列を含む組換えプラスミ ドにより形質転換された磁性細菌を培養するこ とにより、 前記融合 DN A配列を発現させ、 該有用タンパク質を含む融合タンパ ク質を、 磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した状態で該菌体内に生成させるこ とからなる、 請求項 1に記載された有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方法。
1 1 . 前記の融合 D N A配列が、 （a)磁性細菌 AMB— 1の菌体内に生 成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合して生成する mp sタンパク質のアミ ノ酸配列中の前記有機膜への結合部分をコードする D N A配列を含む遺伝子断片 と、 （b) 該遺伝子断片の一方又は両方の末端に融合された、 一又は二以上の有用 タンパク質をコードする一又は二以上の D N A配列と、 からなる融合 D N A配列 である請求項 1 0の製造方法。
1 2. (a)磁性細菌 AMB— 1の菌体內に生成する磁気微粒子を被覆する有機 膜に結合して生成する mp sタンパク質のアミノ酸配列中の前記有機膜への結合 部分をコードする DN A配列を含む遺伝子断片と、 （b) 該遺伝子断片の一方又は 両方の末端に融合された、 一又は二以上の有用タンパク質をコ一ドする一又は二 以上の DNA配列と、 からなる融合 DNA配列を含有する組換えプラスミ ド。
1 3. 宿主磁性細菌に請求項 1 2に記載の組換えプラスミ ドが導入されてなる 形質転換磁性細菌。
14. 前記宿主磁性細菌力 SMagnetospirilium種の微生物又は Desulfov ibrio 種の微生物である、 請求項 1 3 に記載の形質転換磁性細菌。
1 5. 試料中の標的物質を測定する方法であって、 （A) 前記標的 物質に特異的に結合する結合性タンパク質と標識タンパク質とが結 合された磁気微粒子を前記試料に加え、 これによ り前記標的物質が 試料に存在する場合にはこれと前記結合性タンパク質とが反応して 磁気微粒子が凝集するよ う にし ；
(B) 次に、 凝集後の前記標識タンパク質に基づく 信号を測定し ：
(C) (B) で得られた信号強度を、 標準試料から得られる信号強度 と比較するこ とによ り 、 試料中の標的物質を検定する ； こ とを含む、 標的物質の測定方法において、
前記の結合性タンパク質と標識タンパク質とが、 磁性細菌の菌体 内に生成する磁気微粒子を被覆している有機膜に結合して生成する 膜タンパク質の少なく と も膜結合部分を含むポリペプチ ド鎖に、 相 互に近接した状態で、 生物学的結合によ り結合したものであるこ と を特徴とする、
標的物質の測定方法。
1 6 . 請求項 1 5に記載の方法であって、 前記結合性タンパク質 が前記ポリぺプチ ド鎖の一末端に結合し、 前記標識タンパク質が該 ポリペプチ ド鎖の他末端に結合している ものである方法。
1 7 . 請求項 1 5 に記載の方法であって、 前記の結合性タンパク 質及び標識タンパク質の少なく と も一方が、 前記膜タンパク質に融 合によ り結合しているこ とを特徴とする方法。
1 8 . 請求項 1 5に記載の方法であって、 前記結合性タンパク質 又は前記標識タンパク質が前記ポリペプチ ド鎖の一末端に融合し、 この融合したタンパク質に直列に残る他方の標識タンパク質又は結 合性タンパク質が融合しているものである方法。
1 9 . 請求項 1 5 に記載の方法であって、 前記の結合性タ ンパク 質及び標識タンパク質の少なく と も一方が、 前記膜タンパク質に融 合によ り結合している別のタンパク質に生物学的に結合しているこ とを特徴とする方法
2 0 . 請求項 1 5 に記載の方法であって、 前記の有機膜に結合し て生成するタンパク質が、 m a g Aタンパク質又は m p s タンパク 質の膜結合部分によ り該有機膜に結合している ものである方法。
2 1 . 請求項 1 5 に記載の方法であって、 膜タンパク質の少なく と も膜結合部分を含むポリペプチ ド鎖の一末端にプロテイ ン Aが融 合し、 該プロテイン Aに結合性タンパク質である抗 I g G抗体が結 合し、 該ポリペプチ ド鎖の他末端に標識タンパク質が融合している 方法。
2 2 . 請求項 1 5 に記載の方法であって、 標的物質が抗原、 抗体, リ ガン ドと してタンパク質に特異的に結合しう る物質、 多糖類 ' 複 合糖類、 及びピオチンから選ばれ、 結合性タンパク質が該標的物質 に対応して抗体、 抗原と して作用するタンパク質、 上記のリ ガン ド と結合するタンパク質、 プロテイ ン A、 レクチン及びアビジン類か ら選ばれる方法。
2 3 . 請求項 1 5 に記載の方法であって、 前記標識タンパク質が 蛍光性タンパク質、 蛍光色素結合タンパク質又は酵素である方法。
2 4 . 請求項 2 3 に記載の方法であって、 前記酵素が発光関連酵 素、 補酵素、 加水分解酵素、 酸化還元酵素、 異性化酵素、 転移酵素, 脱離酵素、 又は制限酵素である方法。
2 5 . 請求項 2 4記載の方法であって、 前記の発光関連酵素が、 ルシフェ ラーゼ、 アルカ リ ホス ファ ターゼ、 ペルォキシダ一ゼ、 /3 一 D—ガラ ク トシダ一ゼ、 グルコースォキシダ一ゼ又はグルコース - 6 - リ ン酸脱水素酵素である方法。
2 6 . 磁性細菌 AM B— 1の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に 結合した状態で生成する、 後記の配列表の配列番号 1 にで示されるア ミ ノ酸配列からなる、 単離、 精製された m p s タンパク質。
2 7 . 請求項 2 6に記載の m p sタンパク質をコ一ドする m p s構造遣伝子。
2 8 . 請求項 2 7に記載の m p s遺伝子であって、 配列表に記載の配列番号 3 で示される D N A配列からなる、 単離、 精製された m p S構造遣伝子。
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