JP3625544B2 - タンパク質結合磁気微粒子及びその製造方法 - Google Patents
タンパク質結合磁気微粒子及びその製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、タンパク質結合磁気微粒子及びその製造方法、並びにそれらに関連した新規遺伝子、遺伝子断片、融合ＤＮＡ配列、組み換えプラスミド、形質転換された磁性細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
磁気微粒子に固定化された酵素、抗体等の生理活性を有するタンパク質は、磁気的手段で誘導することができるため、従来困難であった局所的な位置への誘導が可能であり、磁気により集めたり、分離したりすることができるため、医療や発酵の分野を初めとする各種産業において利用が期待されている。
【０００３】
従来、磁気微粒子への生理活性物質の固定化は特公平６−１２９９４に示されるように磁性細菌より磁気微粒子をアルカリ処理で分離し、これをγ−アミノプロピルトリエトキシシランやグルタルアルデヒドで処理したのち、これに生理活性物質を化学的に固定化することが行われていた。また、酵素処理により、磁性菌から脂質から成る有機薄膜に被覆された状態で磁気微粒子を分離し、グルタルアルデヒド処理後にタンパクの固定化を行う方法も知られている。また、ＳＰＤＰを用いる化学的結合法により生理活性物質を磁気微粒子に固定化する方法も知られている（特開平５−２０９８８４）。
【０００４】
さらに、これらの方法で化学的に生理活性物質を固定化した磁気微粒子を用いて抗原抗体反応を行なわせる、抗原又は抗体の測定方法が提案されている（特開平４−２８５８５７、同５−２０９８８４、特開平５−９９９２６）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらはいずれも酵素、抗体等のタンパク質を化学的に磁気微粒子に結合させる必要があるため、固定化処理に長時間を要する、固定化処理によりタンパク質の生理活性が低下する、得られる固定化タンパク質の固定化量にロット間バラツキが大きくかつ活性のバラツキも大きい、固定化に用いられるタンパク質は一般に高価であるので固定化タンパク質は高コストにならざるを得ない、等の問題があった。
【０００６】
そこで、本発明の課題は、これらの問題を解決したタンパク質結合磁気微粒子等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、第一に、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したタンパク質をコードし、配列表に記載の配列番号１で示されるＤＮＡ配列からなる、単離、精製されたｍａｇＡ遺伝子を提供する。
【０００８】
また、本発明は、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したタンパク質であって、後述の配列表に記載の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、単離、精製されたｍａｇＡタンパク質を提供する。
【０００９】
本発明は、ｍａｇＡタンパク質の磁性細菌内に生成される磁気微粒子を被覆する有機膜との結合性に着目し、融合タンパク質の状態で別の有用タンパク質を磁気微粒子に固定する方法、磁気微粒子上に有用タンパク質を生成せしめる方法等を提供する。
ｍａｇＡ遺伝子
本発明者は、後述の配列表に記載の配列番号１で示される塩基配列で表されるＤＮＡ配列からなり、磁性細菌の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆するリン脂質を主成分とする有機膜に結合したタンパク質をコードするｍａｇＡ遺伝子を見いだした。
【００１０】
上記のｍａｇＡ遺伝子は、磁性細菌ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５８）から次のようにして見いだされ、単離、精製された。
【００１１】
磁性細菌ＡＭＢ−１に、薬剤耐性因子（Ｋｍ）を持った転移性の遺伝子であるトランスポゾンＴｎ５を導入することでゲノムに部位非特異的にミューテーションを生じさせ、磁気微粒子精製機能を欠損したミュータントを作製した。次に、薬剤耐性因子（Ｋｍ）を指標に磁気応答しない菌体を分離し、このミュータントからゲノムをＣｕｒｅｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの方法で抽出した。ＥｃｏＲＩ で切断後、サザンハイブリダイゼーションでトランスポゾンＴｎ５とのハイブリッドの形成を指標にｍａｇＡ遺伝子を含む遺伝子断片を単離し、ｐＵＣ１９にクローニンすることで精製を行った。遺伝子解析の結果、ｍａｇＡ遺伝子１．３ｋｂを見出した。
ｍａｇＡタンパク質
該ｍａｇＡ遺伝子の配列の上流にはプロモーター配列が隣接している。該タンパク質のアミノ酸配列は、後記の配列表の配列番号２に示す（前記塩基配列とともに表示）通りであり、Ｎ末端から第１〜第６アミノ酸残基の範囲が親水性領域であり、それに続く第７〜第３８０アミノ酸残基の範囲が疎水性領域であり、続く第３８１〜４３４アミノ酸残基の範囲が第二の親水性領域である。中央の長い疎水性領域が膜結合部位であり、両端の親水性領域は膜から露出した状態にある。詳細には、疎水性領域は短い親水性部分を約４箇所含んでおり、これらの部分は膜から一部露出しているものと推定される。
【００１２】
このタンパク質は次のようにして単離、精製された。磁性細菌ＡＭＢ−１を定常期まで培養し、遠心集菌後フレンチプレスより細胞を破砕した。この破砕物からサマリウムコバルト磁石で磁気微粒子を抽出し、精製した。次に１％Ｔｒｙｔｏｎ １０ｍＭ トリス緩衝液中で２時間攪拌し、磁気微粒子と膜を分離した。このように処理した抽出物についてタンパク電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行ったところ、前記ｍａｇＡ遺伝子からコードされるタンパク質の分子量として既知である、４６．８ｋＤａ のところにバンドが確認された。
【００１３】
ｍａｇＡタンパク質のホモロジー検索を行った結果、大腸菌のカリウムイオン流出機構を司るタンパク質と高いホモロジーを示した。これよりｍａｇＡタンパク質はカチオンイオンの流出に関与すると考えられる。そこでｍａｇＡ遺伝子を大腸菌内で発現させ、細胞外膜を除去した後に逆転膜リポソームを作製し、このリポソームの鉄イオン流出現象をラジオアイソトープ標識した鉄を用いて確認した。この結果、ｍａｇＡタンパク質は鉄イオンの排出を行っていることが分かった。
【００１４】
該ｍａｇＡタンパク質は前記のｍａｇＡ遺伝子によりコードされるものであるが、より一般的には、配列表に記載の配列番号３で示される塩基配列を融合するＤＮＡ配列によりコードされる。
【００１５】
本発明者は、ｍａｇＡタンパク質の疎水性領域が該タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合する機能を有し、両端の親水性領域は有機膜から露出することに着目し、親水性領域に別の有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列を融合すると、得られる融合ＤＮＡ配列は磁性細菌内で該有用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合した状態で生成することを見いだした。
ｍａｇＡ遺伝子断片
そこで、本発明は、第二に、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したｍａｇＡタンパク質のアミノ酸配列中の疎水性領域（配列表に記載の配列番号２の第７〜第３８０アミノ酸残基の領域）をコードする塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含むｍａｇＡ遺伝子断片を提供する。
【００１６】
該ｍａｇＡ遺伝子断片は融合タンパク質を有機膜に結合した状態で生成させるための、固定手段として有用である。
【００１７】
該ｍａｇＡ遺伝子断片は上記の疎水性領域を含むことを必須とするが、３’末端側又は５’末端側にｍａｇＡ遺伝子に存在する塩基配列の全部又は一部が存在してもよい。
融合ＤＮＡ配列
また、本発明は、第三に、（ａ） 該ｍａｇＡ遺伝子断片と、（ｂ） 該ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は両方の末端に融合された、一又は二の有用タンパク質をコードする一又は二のＤＮＡ配列と、からなる融合ＤＮＡ配列を提供する。
【００１８】
有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列はｍａｇＡ遺伝子断片の３’末端側及び５’末端側のいずれか一方に融合されてもよいし、両方に融合されてもよい。両方に融合される場合には、３’末端に導入されるＤＮＡ配列と５’末端に導入されるＤＮＡ配列とは同一のタンパク質をコードするものでもよいし、異なるタンパク質をコードするものでもよい。両方に融合する利点は、次のような場合に得られる。
１）両末端に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、磁気微粒子への該タンパク質の固定化量を向上させることができる。
２）５’末端と３’末端に２つの連続する複合酵素系又は酵素と補酵素再生酵素などのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、酵素系の反応を迅速に進めることができる。
３）５’末端と３’末端にサブユニットを形成するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、このサブユニットを迅速にかつ完全に形成させることができる。
【００１９】
該ｍａｇＡ遺伝子断片に前記有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列を融合させる位置は、融合部に生成する塩基配列がアミノ酸合成に適したものとなる限り制限されない。前記疎水性領域をコードするＤＮＡ配列に近接する形で有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列が導入されてもよいし、疎水性領域をコードするＤＮＡ配列と有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列との間に前記親水性領域をコードするＤＮＡ配列が部分的に存在してもよい。また、ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は両方の端に、都合のよい制限酵素切断部位が生じるように人工的に延長されたＤＮＡ配列が存在してもよい。特に５’末端側の親水性領域は短いので、これらは全て存在していてもよいし、必要に応じこの部分が延長されていてもよい。目的とする有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入する部位として有用な５’末端側の制限酵素切断部位としては、ｍａｇＡ遺伝子内に導入したＳｃａＩ切断部位があり、３’末端側の制限酵素切断部位としてはＳｐｈＩ切断部位、ＤｒａΙΙΙ切断部位がある。ＳｐｈＩ切断部位とＤｒａΙΙΙ切断部位はｍａｇＡ遺伝子の疎水性領域から僅かに下流側に寄った親水性領域内に存在するので、好都合な部位の一つである。
組み換えプラスミド
本発明は、第四に、上記の融合ＤＮＡ配列を発現させるのに用いる組み換えプラスミドを提供する。
【００２０】
即ち、本発明は、前記の融合ＤＮＡ配列を含有する組み換えプラスミドを提供する。
【００２１】
該組み換えプラスミドは、前記のｍａｇＡ遺伝子断片及び目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列からなる融合ＤＮＡ配列を公知の方法により適当なべクタープラスミドに導入することにより得られる。
【００２２】
組み換えプラスミドの調製に用いるベクターとしては、例えば、ｐＲＫ４１５の系統、ｐＫＴ２３０の系統のものを用いることができる。選択したベクターに遺伝子を組み込む。ベクターに最も効率よく、また遺伝子が目的の向きに並ぶように、遺伝子を組み込む順、用いる制限酵素を決定する。遺伝子を導入する手順が決定したなら、制限酵素によってＤＮＡを切断し、電気泳動を行うことにより導入する目的遺伝子断片を分離する。その後、リガーゼを用いてライゲーションを行いＤＮＡを連結する。遺伝子断片の連結部分が合わない場合は末端部分を平滑化処理し、ライゲーションを行う。制限酵素、リガーゼ、末端平滑化用の酵素などは全て市販のものを用いて行うことができる。最後に目的のプラスミドができているかどうか制限酵素の切断パターンを確認する。
【００２３】
この際、ｍａｇＡ遺伝子と融合させる、別のタンパク質をコードする遺伝子の種類は特に限定されるものではない。
形質転換された磁性細菌
本発明は、第五に、上記の組み換えプラスミドで形質転換された磁性細菌を提供する。
【００２４】
磁性細菌の上記プラスミドによる形質転換は公知の方法により行うことができる。宿主として用いる磁性細菌としては、例えば、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種の微生物（例：菌株ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５８），ＭＳ−１（ＩＦＯ １５２７２，ＡＴＣＣ ３１６３２，ＤＳＭ ３８５６），ＭＳＲ−１（ＩＦＯ １５２７２，ＤＳＭ ６３６１）、及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ種の微生物（例：菌株ＲＳ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２８３）が挙げられる。
【００２５】
こうして得られた磁性細菌を適切な条件下で培養することにより菌体内に目的とする有用タンパク質を有する磁気微粒子が生成する。具体的には、目的とするタンパク質は、ｍａｇＡ遺伝子断片によりコードされる膜結合性タンパク質と融合した状態で、その磁気微粒子を被覆している有機膜に結合した状態で得られる。
【００２６】
このタンパク質結合磁気微粒子は、該タンパク質が機能性タンパク質である場合に特に有用である。磁気により該磁気微粒子を所望の箇所へ移動し、その箇所でそのタンパク質が有する機能を発揮させることができるからである。
機能性タンパク質結合磁気微粒子
そこで、本発明は、第六に、磁気微粒子と、該磁気微粒子の表面を被覆している有機膜に結合している、前記の融合ＤＮＡ配列（但し前記有用タンパク質が機能性タンパク質である）でコードされた一又は二の機能性タンパク質を含有する融合タンパク質とを有する、機能性タンパク質結合磁気微粒子を提供する。
タンパク質結合磁気微粒子の製造方法
また、本発明は、第七に、上記の融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養することにより、前記融合ＤＮＡ配列を発現させ、有用タンパク質を含む融合タンパク質を、磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した状態で該菌体内に生成させることからなる、上記有用タンパク質結合磁気微粒子を製造する方法を提供する。
【００２７】
該有用タンパク質結合磁気微粒子は、培養により増殖した磁性細菌の菌体を通常の方法によって破砕又は溶解したのち磁気を利用して容易に集めることができる。
【００２８】
本発明によりｍａｇＡ遺伝子断片と融合される有用なタンパク質をコードする遺伝子も、それにより発現されるタンパク質も特に限定されない。医療、発酵を利用する産業等の目的に使用される場合には何らかの機能、例えば、生理活性を有するタンパク質が用いられよう。しかし、これに限定されるものではなく、通常の方法では分離、取得が困難であるタンパク質の製造に本発明を利用することができる。即ち、このようなタンパク質を融合タンパク質の形で磁気微粒子上に生成させ、磁気的に容易に分離し集めることができる。
【００２９】
有用タンパク質の内、機能性タンパク質としては、例えば、抗原、抗体、プロテインＡ等の免疫関連タンパク質、レクチン、アビジン等の結合能を有するタンパク質、補酵素、加水分解酵素、酸化還元酵素、異性化酵素、転移酵素、脱離酵素、制限酵素等の酵素類が挙げられる。
【００３０】
また、上記の有用タンパク質の製造方法は、そのタンパク質が機能性を有しない有用タンパク質である場合であっても、そのタンパク質が従来の製造方法によっては純粋な形で得ることが困難であるときには、該タンパク質の製造方法として有用である。この場合有用タンパク質は磁気微粒子に結合した状態で得られるが、上記の方法で磁石等を用いる磁気的方法で容易に他の細胞成分から分離、精製することができる。
利用可能性
本発明は、例えば、次のような利用可能性を有する。
１）酵素結合担体
一般に部位特異的に働くことが理想であると考えられる酵素はすべて磁気微粒子表面で発現させる価値がある。例えば、生化学反応において反応系の中で局所的にある酵素反応を行いたい場合にはこの酵素を発現させた磁気微粒子は有用である。また、ある酵素系の疾患においては器官に特異的にその酵素を投与したい場合磁気微粒子表面に発現させた酵素を磁気的に誘導することによって、治療することが可能である。
２）ＤＮＡ キャリア
ＤＮＡ やＲＮＡ との結合能を持つタンパク質、例えばリプレッサーなどのタンパク質の遺伝子をｍａｇＡ遺伝子断片と融合し、本発明により磁気微粒子に固定すると、この磁気微粒子を遺伝子の輸送を行うキャリアとして用いることが可能である。リプレッサーなどのタンパク質はある特定の物質の存在下で結合力を失う特性がある。これを利用して、遺伝子の輸送を行うことができる。リプレッサータンパク質の例としてはＬａｃＩが挙げられる。ＬａｃＩとはラクトース分解酵素の遺伝子発現を制御するタンパク質で、プロモーターの下流域に結合することによって、遺伝子の転写を抑制するリプレッサーである。このＬａｃＩはラクトースや、ＩＰＴＧなどの化学物質と結合することによって、ＤＮＡとの結合能を失う。つまり、分解する基質が存在するときに発現する仕組みになっているのである。また、ＬａｃＩが結合する特定のＤＮＡドメインがある。ＤＮＡドメインを組み込んだ遺伝子はＬａｃＩが結合することができる。
【００３１】
例えば、このＬａｃＩを磁気微粒子表面で発現させることによって、ＬａｃＩがＤＮＡドメインを組み込んだ遺伝子と結合する。一方、ＬａｃＩは、ＩＰＴＧという物質によってＤＮＡとの結合能を失う。これを用いてある特定の場所からＤＮＡを磁気輸送し、ＩＰＴＧの添加によってＤＮＡを遊離させることができる。こうして、遺伝子を所要の場所へ輸送することができる。
【００３２】
したがって、本発明の磁気微粒子は、遺伝子治療における遺伝子移送担体などに応用することが考えられる。例えば、目的遺伝子の相補鎖からできるアンチセンスＲＮＡを発現させることによって、その目的の遺伝子の発現をＲＮＡハイブリッドの形成によって抑えるという治療法が現在盛んに研究されているが、そのアンチセンスのＲＮＡを発現するＤＮＡを運ぶ手段として用いることができる。
【００３３】
また、さらに、金属結合性のタンパク質を磁気微粒子表面に発現させ、これを金属の回収、または、検出に用いることができる。回収、検出は磁気回収によって行うことができる。
３）タンパク質生産システム
一般に分離精製が困難であると言われるタンパク質は、磁気微粒子上にＭａｇＡタンパク質との融合タンパク質として発現させることで、分離精製が容易になる。即ち、磁気微粒子表面で発現させたタンパク質は、最後に磁気により容易に回収できるからである。磁性細菌から得られる磁気微粒子の分散性の高さを考えると、タンパク質によっては、磁気微粒子に固定化された状態で使用可能なものも多く存在すると考えられる。例えばアルコール発酵用の酵素などは磁気微粒子と結合したままの状態でも酵素の活性さえあれば十分に使用可能であると考えられる。
【００３４】
【実施例】
例１
Ｉ．組み換えプラスミドの調製
蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子、東洋インキ製）を磁性細菌内で発現させ、該遺伝子でコードされる発光タンパク質を磁気微粒子を被覆する有機膜上に生成させるため、ｍａｇＡ−ｌｕｃ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＬ、及びｍａｇＡ遺伝子を含まずｌｕｃ遺伝子のみを結合したプラスミドｐＫＰＬを図１に示す方法で作製した。
（１） ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５（Ｎ．Ｔ．Ｎｅｅｎ，Ｓ．Ｔａｍａｋｉ，Ｄ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄＤ．Ｔｒａｌｌｉｎｇｅｒ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７０：１９１−１９７）を用いた。ｐＲＫ４１５にｌｕｃ遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＬＣを作製した。プラスミドｐＫＬＣをｌｕｃ遺伝子の上流部に存在するＢａｍＨＩで切断し、ブランティングキット（Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ）（宝酒造製）で平滑末端化した。
（２） ＡＭＢ−１のクロモゾームをＥｃｏＲＩで切断し、λＤＮＡであるλＺＡＰＩＩにランダムに組み込んでλＺＡＰＩＩジーンバンクを作製した。これはファージ粒子中にパッケージし、大腸菌に感染させることによって、プラークの形でジーンバンクを作製している。ｐＵＭ５ＡはλＺＡＰＩＩジーンバンクより分離したｍａｇＡ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ遺伝子断片をｐＵＣ１９にクローニングして得た（図２）。分離の際にはプラークサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００３５】
次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子断片を分離し、同様に平滑末端化し、プラスミドｐＫＬＣと接続し、プラスミドｐＫＭＬを作製した。こうしてｍａｇＡの読み訳とずれることなくｌｕｃ遺伝子は翻訳され融合タンパク質を生産することが出来る。
（３） プラスミドｐＵＭ５ＡからＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩで切断し、プロモーターの配列のみを分離したものを、同様に平滑末端化したプラスミドｐＫＬＣに接続しプラスミドｐＫＰＬを作製した。
【００３６】
以上の操作によりプロモーター領域のみをｌｕｃ遺伝子と結合したプラスミドｐＫＰＬとｍａｇＡ−ｌｕｃ融合遺伝子を結合したｐＫＭＬの２種を作製した。ｐＫＭＬの制限酵素切断部位地図を図３に示す。
ＩＩ． 接合伝達体の作製
次に、Ｉで得られた二種の組み換えプラスミドを接合伝達により野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体の作製を行った。接合伝達における供与菌体として用いたＥ． ｃｏｌｉ Ｓ１７−１ はｔｒａ遺伝子を有しているため、接合伝達を行う際、ヘルパープラスミドなしで接合伝達が可能である。接合伝達にはＭＳＧＭ培地で培養した対数期中期から後期の磁性細菌約８×１０７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌを用い、供与菌体は前日にプラスミドを導入し発生したコロニーをかき取って１０９ から１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁して用いた。１：５０（磁性細菌：大腸菌）で菌を混合し、寒天プレート上にスポットし、メイティングを行った。６時間後スポットをメスで切り取り５ｍｌ程度のＭＳＧＭ培地を用い菌体を回収した。この懸濁液をテトラサイクリン２．５μｇ／ｍｌを添加したＭＳＧＭ培地に植菌した。２５℃で培養し、増殖した細胞を接合伝達体とした。この際、大腸菌はＭＳＧＭ培地では増殖しない。
【００３７】
次に接合伝達後ＭＳＧＭ培地で培養した磁性細菌より磁気微粒子の分離を行った。磁性細菌を遠心分離により集菌後１０ｍＭトリスバッファーで２回洗浄後、菌体濃度０．１ｇ ｗｅｔ ｃｅｌｌ／ｍｌを超えない濃度で懸濁し、出力１２０Ｗ、３０秒間５回の超音波破砕を行った。細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しながらＮｄ−Ｃｏ磁石を容器外壁面に当てて３０分処理し、磁気微粒子を懸濁液中から分離した。さらに懸濁液を５，０００Ｇ、１５分遠心分離することで細胞膜成分を分離し、１００，０００Ｇ、１．５時間超遠心する事で細胞質を分離した。
【００３８】
磁気微粒子、細胞膜及び細胞質の各分画のルシフェーラーゼ活性をピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定することで行い、導入したルシフェラーゼ遺伝子の発現及び発現量を測定した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
表１に示すように、プロモーター領域の配列のみをｌｕｃ遺伝子と結合したｐＫＰＬ遺伝子を導入した磁性細菌は細胞質分画の発光量が高く、磁気微粒子表面でのタンパク質の発現効率が低いのに対し、ｍａｇＡ−ｌｕｃ融合遺伝子を結合したｐＫＭＬを導入した磁性細菌では磁気微粒子分画と細胞膜分画で高い発光量が得られた。即ち、膜結合性タンパク質であるｍａｇＡ融合タンパク質が磁気微粒子分画でも発現しており、磁気微粒子を被覆する有機膜上でのｌｕｃタンパク質の生産及び分離が示された。
例２
抗ウサギＩｇＧ抗体の抗原認識部位をコードした遺伝子（ｉｇｇ遺伝子、ファルマシア社）を該遺伝子でコードされる抗体タンパク質を磁気微粒子を被覆するリン脂質を主成分とする有機膜上に生成させるため、ｍａｇＡ−ｉｇｇ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＧを図４に示す方法で作成した。
【００４０】
即ち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。ｐＲＫ４１５をＥｃｏＲＩで切断し平滑末端化しｉｇｇ遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＧＣを作製した。
【００４１】
次に、磁性細菌ＡＭＢ−１のクロモゾームをＥｃｏＲＩで切断し、λＤＮＡであるλＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にランダムに組み込みλＺＡＰＩＩジーンバンクを作製した。これはファージ粒子中にパッケージし、大腸菌に感染させることでプラークの形でジーンバンクを作製した。λＺＡＰＩＩジーンバンクより分離したｍａｇＡ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ遺伝子断片をｐＵＣ１９にクローニングしｐＵＭ５Ａを作製した。
【００４２】
次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子を分離し、平滑末端化し、プラスミドｐＫＧＣと接続しプラスミドｐＫＭＧを作製した。ｐＫＭＧの制限酵素切断部位地図を図５に示す。
【００４３】
このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１ に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養し、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を回収した。この磁気微粒子を用いて、ウサギＩｇＧ を抗原としたイムノアッセイを行った。イムノアッセイはアルカリフォスファターゼ標識した抗ウサギＩｇＧ 抗体を２次抗体として用いたサンドイッチ法を用い、検出はアルカリフォスファターゼと、ＡＭＰＰＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ） との反応による発光をルミノメーターで測定した。この結果、抗原を検出することが可能であった。この実験により、接合伝達体の磁気微粒子に抗体がＭａｇＡ融合タンパク質として結合することによって、抗体固定化操作なしに抗原検出システムに用いることが可能な磁気微粒子を生産することができた。
例３
プロテインＡ遺伝子（ＰｒｏｔｅｉｎＡ ｇｅｎｅ、ファルマシア社製ｐＥＺＺ１８より分離）を該遺伝子でコードされるタンパク質を磁気微粒子を被覆するリン脂質を主成分とする有機膜上に生成させるため、ｍａｇＡ−プロテインＡ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＡを図６に示す方法で作製した。
【００４４】
即ち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。ｐＲＫ４１５をＥｃｏＲＩで切断しプロテインＡ遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＡＣを作製した。
【００４５】
次に、磁性細菌ＡＭＢ−１のクロモゾームをＥｃｏＲＩで切断し、λＤＮＡであるλＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にランダムに組み込みλＺＡＰＩＩジーンバンクを作製した。これはファージ粒子中にパッケージし、大腸菌に感染させることでプラークの形でジーンバンクを作製した。λＺＡＰＩＩジーンバンクより分離したｍａｇＡ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ遺伝子断片をｐＵＣ１９にクローニングしｐＵＭ５Ａを作製した。
【００４６】
次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子を分離し、平滑末端化したプラスミドｐＫＡＣと接続しプラスミドｐＫＭＡを作製した。ｐＫＭＡの制限酵素切断部位地図を図７に示す。
【００４７】
このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１ に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養し、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を回収した。この磁気微粒子に対し、プロテインＡのＩｇＧ との結合能に注目し、抗杉花粉、抗小麦、抗卵ＩｇＧ と混合した。混合した粒子は洗浄し、抗体固定化量を測定したところ、従来用いられてきたＳＰＤＰを用いる化学結合法（特開平５−２０９８８４）と同程度の固定化が可能であることが示された。また、実施例１と同様に、抗原検出実験を行った結果、３種の抗原はどれも検出可能であった。このようにプロテインＡのｍａｇＡ融合タンパク質を用いて様々なＩｇＧ を磁気微粒子表面に簡便に結合させることが可能であり、従来の化学結合に劣らない抗原検出が可能であることが示された。
例４
蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子）をｍａｇＡ遺伝子の５’末端側に導入し、ｌｕｃ−ｍａｇＡ融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＮＥＬＭを図８に示す方法で作製した。
（１） ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子をもつプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。このｐＲＫ４１５のＮｃｏΙ切断部位とＥｃｏＮΙ切断部位を平滑末端化処理により欠損させ、プラスミドｐＲＫ４１５ＮＥを作製した。ｐＲＫ４１５ＮＥをＳａｃＩで切断し、ｍａｇＡプロモータ−ｌｕｃ融合遺伝子を組み込んだプラスミドｐＮＥＰＬを生成した。
（２） 次に、ｍａｇＡ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＭ５ＡにＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを用い、ＰＣＲによりｍａｇＡ遺伝子を増幅させＳｃａＩで切断し、ＥｃｏＮＩで切断後平滑末端化したプラスミドｐＮＥＰＬと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭを作製した。ｐＮＥＰＬの制限酵素切断部位地図を図９に示す。
（３） このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養して増殖させ、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を磁石を用いて回収した。この磁気微粒子のルシフェラーゼ活性を、ピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定した。結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
次に、磁気微粒子上におけるｍａｇＡタンパク質のＣ末端及びＮ末端の露出方向を確認するために、ｍａｇＡ遺伝子の３’末端にｌｕｃ遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＬを保持する接合伝達体由来の磁気微粒子と、ｍａｇＡ遺伝子の５’末端にｌｕｃ遺伝子を結合したプラスミドｐＮＥＬＭを保持する接合伝達体由来の磁気微粒子において、抗ルシフェラーゼＩｇＧ及びアルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧを用いてイムノアッセイを行った。検出はアルカリホスファターゼとＡＭＰＰＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）との反応による発光をルミノメーターで測定した。結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
この実験により、ｍａｇＡタンパク質のＮ末端及びＣ末端は磁気微粒子を被覆する有機膜の外側に露出していることが明らかとなった。従って機能性タンパク質の性質に応じてｍａｇＡタンパク質のＮ末端に融合した融合タンパク質として生成させるかＣ末端に融合した融合タンパク質として生成させるかを選択することができる。
例５
蛍ルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を磁気微粒子上に同時発現させるため、ｌｕｃ−ｍａｇＡ−ｃａｔ融合ＤＮＡ配列を含む遺伝子であるプラスミドｐＮＥＬＭＣを図１０に示す方法で作製した。
【００５０】
すなわち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子をもつプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。このｐＲＫ４１５のＮｃｏΙ切断部位とＥｃｏＮΙ切断部位を平滑末端化処理により欠損させ、プラスミドｐＲＫ４１５ＮＥを生成した。ｐＲＫ４１５ＮＥをＳａｃＩで切断し、ｍａｇＡプロモーター−ｌｕｃ融合遺伝子を組み込んだプラスミドｐＮＥＰＬを作製した。
【００５１】
次に、ｍａｇＡ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＭ５ＡにＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを用い、ＰＣＲによりｍａｇＡ遺伝子を増幅させＳｃａＩで切断し、ＥｃｏＮＩで切断後平滑末端化したプラスミドｐＮＥＰＬと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭを作製した。
【００５２】
次に、ｃａｔ遺伝子に該遺伝子のＳＤ配列を削除しＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを用い、ＰＣＲによりｃａｔ遺伝子を増幅させた。これをＤｒａＩＩＩで切断後平滑末端化したプラスミドｐＮＥＬＭと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭＣを作製した。ｐＮＥＬＭＣの制限酵素切断部位地図を図１１に示す。
このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体を生成した。接合伝達体を培養して増殖させ、細胞を回収、破砕を行い、磁石で磁気微粒子を回収した。この磁気微粒子のルシフェラーゼ活性を、ピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定したところｐＮＥＬＭと同等のルシフェラーゼ活性を示した。
【００５３】
次に、この磁気微粒子のＣＡＴアッセイを行った結果、ＣＡＴ活性が検出された。ＣＡＴアッセイは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼとクロラムフェニコールとの反応によるクロラムフェニコールアセチル化体を薄層クロマトグラフィーにより検出することで行った。この結果、ｍａｇＡ遺伝子タンパク質の両末端に接続したそれぞれのタンパク質は、該タンパク質を単独で接続したときと同等の活性を示した。この実験より、ｍａｇＡ遺伝子タンパク質の両末端に機能の異なるタンパク質をコードする遺伝子を接続した融合遺伝子を構築することで、磁気微粒子上に同時発現することが可能になり、これより多数の機能を有する磁気微粒子を生産することができた。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、固定化等の処理を行う必要がなく、形質転換された磁性細菌を培養し、菌体内に生成した磁気微粒子を分離するだけで酵素、抗体その他の有用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合した状態で安定して得ることができる。有用タンパク質が機能性タンパク質である場合には、磁気微粒子に固定化された機能性タンパク質を磁気的に制御することができるので、所要の局所へ効率的にその機能を発揮させることができる。
【００５５】
また、所要のタンパク質をコードする遺伝子を本発明のプラスミドに導入し、磁性細菌を形質転換することでどのようなタンパク質も磁気微粒子上に生成させることができる。
【００５６】
高価な酵素、抗体等のタンパク質を用意する必要はなく、同じ菌株を維持し培養するだけで所要のタンパク質結合磁気微粒子を半永久的に製造することができ、製造ロット間のタンパク質含有量や活性にバラツキがなく、しかも低コスト化のメリットも大きい。しかも、こうして得られる磁気微粒子は、常に同一活性を有するタンパク質を同一の量で含有するものである。
【００５７】
さらに、タンパク質を磁気微粒子上に生産するため目的とするタンパク質を磁気的に短時間で分離回収でき、効率的な分離精製が出来る。
【００５８】
【配列表】
【配列表】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】例１で調製したプラスミドｐＫＰＬ及びｐＫＭＬの調製方法の説明図である。
【図２】例１で調製したプラスミドｐＵＭ５Ａの調製方法の説明図である。
【図３】プラスミドｐＫＭＬの制限酵素切断部位地図である。
【図４】例２で調製したプラスミドｐＫＭＧの調製方法の説明図である。
【図５】プラスミドｐＫＭＧの制限酵素切断部位地図である。
【図６】例３で調製したプラスミドｐＫＭＡの調製方法の説明図である。
【図７】プラスミドｐＫＭＡの制限酵素切断部位地図である。
【図８】例４で調製したｐＮＥＬＭの調製方法の説明図である。
【図９】プラスミドｐＮＥＬＭの制限酵素切断部位地図である。
【図１０】例５で調製したｐＮＥＬＭＣの調製方法の説明図である。
【図１１】プラスミドｐＮＥＬＭＣの制限酵素切断部位地図である。
【発明の技術分野】
本発明は、タンパク質結合磁気微粒子及びその製造方法、並びにそれらに関連した新規遺伝子、遺伝子断片、融合ＤＮＡ配列、組み換えプラスミド、形質転換された磁性細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
磁気微粒子に固定化された酵素、抗体等の生理活性を有するタンパク質は、磁気的手段で誘導することができるため、従来困難であった局所的な位置への誘導が可能であり、磁気により集めたり、分離したりすることができるため、医療や発酵の分野を初めとする各種産業において利用が期待されている。
【０００３】
従来、磁気微粒子への生理活性物質の固定化は特公平６−１２９９４に示されるように磁性細菌より磁気微粒子をアルカリ処理で分離し、これをγ−アミノプロピルトリエトキシシランやグルタルアルデヒドで処理したのち、これに生理活性物質を化学的に固定化することが行われていた。また、酵素処理により、磁性菌から脂質から成る有機薄膜に被覆された状態で磁気微粒子を分離し、グルタルアルデヒド処理後にタンパクの固定化を行う方法も知られている。また、ＳＰＤＰを用いる化学的結合法により生理活性物質を磁気微粒子に固定化する方法も知られている（特開平５−２０９８８４）。
【０００４】
さらに、これらの方法で化学的に生理活性物質を固定化した磁気微粒子を用いて抗原抗体反応を行なわせる、抗原又は抗体の測定方法が提案されている（特開平４−２８５８５７、同５−２０９８８４、特開平５−９９９２６）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらはいずれも酵素、抗体等のタンパク質を化学的に磁気微粒子に結合させる必要があるため、固定化処理に長時間を要する、固定化処理によりタンパク質の生理活性が低下する、得られる固定化タンパク質の固定化量にロット間バラツキが大きくかつ活性のバラツキも大きい、固定化に用いられるタンパク質は一般に高価であるので固定化タンパク質は高コストにならざるを得ない、等の問題があった。
【０００６】
そこで、本発明の課題は、これらの問題を解決したタンパク質結合磁気微粒子等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、第一に、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したタンパク質をコードし、配列表に記載の配列番号１で示されるＤＮＡ配列からなる、単離、精製されたｍａｇＡ遺伝子を提供する。
【０００８】
また、本発明は、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したタンパク質であって、後述の配列表に記載の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、単離、精製されたｍａｇＡタンパク質を提供する。
【０００９】
本発明は、ｍａｇＡタンパク質の磁性細菌内に生成される磁気微粒子を被覆する有機膜との結合性に着目し、融合タンパク質の状態で別の有用タンパク質を磁気微粒子に固定する方法、磁気微粒子上に有用タンパク質を生成せしめる方法等を提供する。
ｍａｇＡ遺伝子
本発明者は、後述の配列表に記載の配列番号１で示される塩基配列で表されるＤＮＡ配列からなり、磁性細菌の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆するリン脂質を主成分とする有機膜に結合したタンパク質をコードするｍａｇＡ遺伝子を見いだした。
【００１０】
上記のｍａｇＡ遺伝子は、磁性細菌ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５８）から次のようにして見いだされ、単離、精製された。
【００１１】
磁性細菌ＡＭＢ−１に、薬剤耐性因子（Ｋｍ）を持った転移性の遺伝子であるトランスポゾンＴｎ５を導入することでゲノムに部位非特異的にミューテーションを生じさせ、磁気微粒子精製機能を欠損したミュータントを作製した。次に、薬剤耐性因子（Ｋｍ）を指標に磁気応答しない菌体を分離し、このミュータントからゲノムをＣｕｒｅｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの方法で抽出した。ＥｃｏＲＩ で切断後、サザンハイブリダイゼーションでトランスポゾンＴｎ５とのハイブリッドの形成を指標にｍａｇＡ遺伝子を含む遺伝子断片を単離し、ｐＵＣ１９にクローニンすることで精製を行った。遺伝子解析の結果、ｍａｇＡ遺伝子１．３ｋｂを見出した。
ｍａｇＡタンパク質
該ｍａｇＡ遺伝子の配列の上流にはプロモーター配列が隣接している。該タンパク質のアミノ酸配列は、後記の配列表の配列番号２に示す（前記塩基配列とともに表示）通りであり、Ｎ末端から第１〜第６アミノ酸残基の範囲が親水性領域であり、それに続く第７〜第３８０アミノ酸残基の範囲が疎水性領域であり、続く第３８１〜４３４アミノ酸残基の範囲が第二の親水性領域である。中央の長い疎水性領域が膜結合部位であり、両端の親水性領域は膜から露出した状態にある。詳細には、疎水性領域は短い親水性部分を約４箇所含んでおり、これらの部分は膜から一部露出しているものと推定される。
【００１２】
このタンパク質は次のようにして単離、精製された。磁性細菌ＡＭＢ−１を定常期まで培養し、遠心集菌後フレンチプレスより細胞を破砕した。この破砕物からサマリウムコバルト磁石で磁気微粒子を抽出し、精製した。次に１％Ｔｒｙｔｏｎ １０ｍＭ トリス緩衝液中で２時間攪拌し、磁気微粒子と膜を分離した。このように処理した抽出物についてタンパク電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行ったところ、前記ｍａｇＡ遺伝子からコードされるタンパク質の分子量として既知である、４６．８ｋＤａ のところにバンドが確認された。
【００１３】
ｍａｇＡタンパク質のホモロジー検索を行った結果、大腸菌のカリウムイオン流出機構を司るタンパク質と高いホモロジーを示した。これよりｍａｇＡタンパク質はカチオンイオンの流出に関与すると考えられる。そこでｍａｇＡ遺伝子を大腸菌内で発現させ、細胞外膜を除去した後に逆転膜リポソームを作製し、このリポソームの鉄イオン流出現象をラジオアイソトープ標識した鉄を用いて確認した。この結果、ｍａｇＡタンパク質は鉄イオンの排出を行っていることが分かった。
【００１４】
該ｍａｇＡタンパク質は前記のｍａｇＡ遺伝子によりコードされるものであるが、より一般的には、配列表に記載の配列番号３で示される塩基配列を融合するＤＮＡ配列によりコードされる。
【００１５】
本発明者は、ｍａｇＡタンパク質の疎水性領域が該タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合する機能を有し、両端の親水性領域は有機膜から露出することに着目し、親水性領域に別の有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列を融合すると、得られる融合ＤＮＡ配列は磁性細菌内で該有用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合した状態で生成することを見いだした。
ｍａｇＡ遺伝子断片
そこで、本発明は、第二に、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したｍａｇＡタンパク質のアミノ酸配列中の疎水性領域（配列表に記載の配列番号２の第７〜第３８０アミノ酸残基の領域）をコードする塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含むｍａｇＡ遺伝子断片を提供する。
【００１６】
該ｍａｇＡ遺伝子断片は融合タンパク質を有機膜に結合した状態で生成させるための、固定手段として有用である。
【００１７】
該ｍａｇＡ遺伝子断片は上記の疎水性領域を含むことを必須とするが、３’末端側又は５’末端側にｍａｇＡ遺伝子に存在する塩基配列の全部又は一部が存在してもよい。
融合ＤＮＡ配列
また、本発明は、第三に、（ａ） 該ｍａｇＡ遺伝子断片と、（ｂ） 該ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は両方の末端に融合された、一又は二の有用タンパク質をコードする一又は二のＤＮＡ配列と、からなる融合ＤＮＡ配列を提供する。
【００１８】
有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列はｍａｇＡ遺伝子断片の３’末端側及び５’末端側のいずれか一方に融合されてもよいし、両方に融合されてもよい。両方に融合される場合には、３’末端に導入されるＤＮＡ配列と５’末端に導入されるＤＮＡ配列とは同一のタンパク質をコードするものでもよいし、異なるタンパク質をコードするものでもよい。両方に融合する利点は、次のような場合に得られる。
１）両末端に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、磁気微粒子への該タンパク質の固定化量を向上させることができる。
２）５’末端と３’末端に２つの連続する複合酵素系又は酵素と補酵素再生酵素などのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、酵素系の反応を迅速に進めることができる。
３）５’末端と３’末端にサブユニットを形成するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、このサブユニットを迅速にかつ完全に形成させることができる。
【００１９】
該ｍａｇＡ遺伝子断片に前記有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列を融合させる位置は、融合部に生成する塩基配列がアミノ酸合成に適したものとなる限り制限されない。前記疎水性領域をコードするＤＮＡ配列に近接する形で有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列が導入されてもよいし、疎水性領域をコードするＤＮＡ配列と有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列との間に前記親水性領域をコードするＤＮＡ配列が部分的に存在してもよい。また、ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は両方の端に、都合のよい制限酵素切断部位が生じるように人工的に延長されたＤＮＡ配列が存在してもよい。特に５’末端側の親水性領域は短いので、これらは全て存在していてもよいし、必要に応じこの部分が延長されていてもよい。目的とする有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入する部位として有用な５’末端側の制限酵素切断部位としては、ｍａｇＡ遺伝子内に導入したＳｃａＩ切断部位があり、３’末端側の制限酵素切断部位としてはＳｐｈＩ切断部位、ＤｒａΙΙΙ切断部位がある。ＳｐｈＩ切断部位とＤｒａΙΙΙ切断部位はｍａｇＡ遺伝子の疎水性領域から僅かに下流側に寄った親水性領域内に存在するので、好都合な部位の一つである。
組み換えプラスミド
本発明は、第四に、上記の融合ＤＮＡ配列を発現させるのに用いる組み換えプラスミドを提供する。
【００２０】
即ち、本発明は、前記の融合ＤＮＡ配列を含有する組み換えプラスミドを提供する。
【００２１】
該組み換えプラスミドは、前記のｍａｇＡ遺伝子断片及び目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列からなる融合ＤＮＡ配列を公知の方法により適当なべクタープラスミドに導入することにより得られる。
【００２２】
組み換えプラスミドの調製に用いるベクターとしては、例えば、ｐＲＫ４１５の系統、ｐＫＴ２３０の系統のものを用いることができる。選択したベクターに遺伝子を組み込む。ベクターに最も効率よく、また遺伝子が目的の向きに並ぶように、遺伝子を組み込む順、用いる制限酵素を決定する。遺伝子を導入する手順が決定したなら、制限酵素によってＤＮＡを切断し、電気泳動を行うことにより導入する目的遺伝子断片を分離する。その後、リガーゼを用いてライゲーションを行いＤＮＡを連結する。遺伝子断片の連結部分が合わない場合は末端部分を平滑化処理し、ライゲーションを行う。制限酵素、リガーゼ、末端平滑化用の酵素などは全て市販のものを用いて行うことができる。最後に目的のプラスミドができているかどうか制限酵素の切断パターンを確認する。
【００２３】
この際、ｍａｇＡ遺伝子と融合させる、別のタンパク質をコードする遺伝子の種類は特に限定されるものではない。
形質転換された磁性細菌
本発明は、第五に、上記の組み換えプラスミドで形質転換された磁性細菌を提供する。
【００２４】
磁性細菌の上記プラスミドによる形質転換は公知の方法により行うことができる。宿主として用いる磁性細菌としては、例えば、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種の微生物（例：菌株ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５８），ＭＳ−１（ＩＦＯ １５２７２，ＡＴＣＣ ３１６３２，ＤＳＭ ３８５６），ＭＳＲ−１（ＩＦＯ １５２７２，ＤＳＭ ６３６１）、及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ種の微生物（例：菌株ＲＳ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２８３）が挙げられる。
【００２５】
こうして得られた磁性細菌を適切な条件下で培養することにより菌体内に目的とする有用タンパク質を有する磁気微粒子が生成する。具体的には、目的とするタンパク質は、ｍａｇＡ遺伝子断片によりコードされる膜結合性タンパク質と融合した状態で、その磁気微粒子を被覆している有機膜に結合した状態で得られる。
【００２６】
このタンパク質結合磁気微粒子は、該タンパク質が機能性タンパク質である場合に特に有用である。磁気により該磁気微粒子を所望の箇所へ移動し、その箇所でそのタンパク質が有する機能を発揮させることができるからである。
機能性タンパク質結合磁気微粒子
そこで、本発明は、第六に、磁気微粒子と、該磁気微粒子の表面を被覆している有機膜に結合している、前記の融合ＤＮＡ配列（但し前記有用タンパク質が機能性タンパク質である）でコードされた一又は二の機能性タンパク質を含有する融合タンパク質とを有する、機能性タンパク質結合磁気微粒子を提供する。
タンパク質結合磁気微粒子の製造方法
また、本発明は、第七に、上記の融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養することにより、前記融合ＤＮＡ配列を発現させ、有用タンパク質を含む融合タンパク質を、磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した状態で該菌体内に生成させることからなる、上記有用タンパク質結合磁気微粒子を製造する方法を提供する。
【００２７】
該有用タンパク質結合磁気微粒子は、培養により増殖した磁性細菌の菌体を通常の方法によって破砕又は溶解したのち磁気を利用して容易に集めることができる。
【００２８】
本発明によりｍａｇＡ遺伝子断片と融合される有用なタンパク質をコードする遺伝子も、それにより発現されるタンパク質も特に限定されない。医療、発酵を利用する産業等の目的に使用される場合には何らかの機能、例えば、生理活性を有するタンパク質が用いられよう。しかし、これに限定されるものではなく、通常の方法では分離、取得が困難であるタンパク質の製造に本発明を利用することができる。即ち、このようなタンパク質を融合タンパク質の形で磁気微粒子上に生成させ、磁気的に容易に分離し集めることができる。
【００２９】
有用タンパク質の内、機能性タンパク質としては、例えば、抗原、抗体、プロテインＡ等の免疫関連タンパク質、レクチン、アビジン等の結合能を有するタンパク質、補酵素、加水分解酵素、酸化還元酵素、異性化酵素、転移酵素、脱離酵素、制限酵素等の酵素類が挙げられる。
【００３０】
また、上記の有用タンパク質の製造方法は、そのタンパク質が機能性を有しない有用タンパク質である場合であっても、そのタンパク質が従来の製造方法によっては純粋な形で得ることが困難であるときには、該タンパク質の製造方法として有用である。この場合有用タンパク質は磁気微粒子に結合した状態で得られるが、上記の方法で磁石等を用いる磁気的方法で容易に他の細胞成分から分離、精製することができる。
利用可能性
本発明は、例えば、次のような利用可能性を有する。
１）酵素結合担体
一般に部位特異的に働くことが理想であると考えられる酵素はすべて磁気微粒子表面で発現させる価値がある。例えば、生化学反応において反応系の中で局所的にある酵素反応を行いたい場合にはこの酵素を発現させた磁気微粒子は有用である。また、ある酵素系の疾患においては器官に特異的にその酵素を投与したい場合磁気微粒子表面に発現させた酵素を磁気的に誘導することによって、治療することが可能である。
２）ＤＮＡ キャリア
ＤＮＡ やＲＮＡ との結合能を持つタンパク質、例えばリプレッサーなどのタンパク質の遺伝子をｍａｇＡ遺伝子断片と融合し、本発明により磁気微粒子に固定すると、この磁気微粒子を遺伝子の輸送を行うキャリアとして用いることが可能である。リプレッサーなどのタンパク質はある特定の物質の存在下で結合力を失う特性がある。これを利用して、遺伝子の輸送を行うことができる。リプレッサータンパク質の例としてはＬａｃＩが挙げられる。ＬａｃＩとはラクトース分解酵素の遺伝子発現を制御するタンパク質で、プロモーターの下流域に結合することによって、遺伝子の転写を抑制するリプレッサーである。このＬａｃＩはラクトースや、ＩＰＴＧなどの化学物質と結合することによって、ＤＮＡとの結合能を失う。つまり、分解する基質が存在するときに発現する仕組みになっているのである。また、ＬａｃＩが結合する特定のＤＮＡドメインがある。ＤＮＡドメインを組み込んだ遺伝子はＬａｃＩが結合することができる。
【００３１】
例えば、このＬａｃＩを磁気微粒子表面で発現させることによって、ＬａｃＩがＤＮＡドメインを組み込んだ遺伝子と結合する。一方、ＬａｃＩは、ＩＰＴＧという物質によってＤＮＡとの結合能を失う。これを用いてある特定の場所からＤＮＡを磁気輸送し、ＩＰＴＧの添加によってＤＮＡを遊離させることができる。こうして、遺伝子を所要の場所へ輸送することができる。
【００３２】
したがって、本発明の磁気微粒子は、遺伝子治療における遺伝子移送担体などに応用することが考えられる。例えば、目的遺伝子の相補鎖からできるアンチセンスＲＮＡを発現させることによって、その目的の遺伝子の発現をＲＮＡハイブリッドの形成によって抑えるという治療法が現在盛んに研究されているが、そのアンチセンスのＲＮＡを発現するＤＮＡを運ぶ手段として用いることができる。
【００３３】
また、さらに、金属結合性のタンパク質を磁気微粒子表面に発現させ、これを金属の回収、または、検出に用いることができる。回収、検出は磁気回収によって行うことができる。
３）タンパク質生産システム
一般に分離精製が困難であると言われるタンパク質は、磁気微粒子上にＭａｇＡタンパク質との融合タンパク質として発現させることで、分離精製が容易になる。即ち、磁気微粒子表面で発現させたタンパク質は、最後に磁気により容易に回収できるからである。磁性細菌から得られる磁気微粒子の分散性の高さを考えると、タンパク質によっては、磁気微粒子に固定化された状態で使用可能なものも多く存在すると考えられる。例えばアルコール発酵用の酵素などは磁気微粒子と結合したままの状態でも酵素の活性さえあれば十分に使用可能であると考えられる。
【００３４】
【実施例】
例１
Ｉ．組み換えプラスミドの調製
蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子、東洋インキ製）を磁性細菌内で発現させ、該遺伝子でコードされる発光タンパク質を磁気微粒子を被覆する有機膜上に生成させるため、ｍａｇＡ−ｌｕｃ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＬ、及びｍａｇＡ遺伝子を含まずｌｕｃ遺伝子のみを結合したプラスミドｐＫＰＬを図１に示す方法で作製した。
（１） ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５（Ｎ．Ｔ．Ｎｅｅｎ，Ｓ．Ｔａｍａｋｉ，Ｄ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄＤ．Ｔｒａｌｌｉｎｇｅｒ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７０：１９１−１９７）を用いた。ｐＲＫ４１５にｌｕｃ遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＬＣを作製した。プラスミドｐＫＬＣをｌｕｃ遺伝子の上流部に存在するＢａｍＨＩで切断し、ブランティングキット（Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ）（宝酒造製）で平滑末端化した。
（２） ＡＭＢ−１のクロモゾームをＥｃｏＲＩで切断し、λＤＮＡであるλＺＡＰＩＩにランダムに組み込んでλＺＡＰＩＩジーンバンクを作製した。これはファージ粒子中にパッケージし、大腸菌に感染させることによって、プラークの形でジーンバンクを作製している。ｐＵＭ５ＡはλＺＡＰＩＩジーンバンクより分離したｍａｇＡ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ遺伝子断片をｐＵＣ１９にクローニングして得た（図２）。分離の際にはプラークサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００３５】
次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子断片を分離し、同様に平滑末端化し、プラスミドｐＫＬＣと接続し、プラスミドｐＫＭＬを作製した。こうしてｍａｇＡの読み訳とずれることなくｌｕｃ遺伝子は翻訳され融合タンパク質を生産することが出来る。
（３） プラスミドｐＵＭ５ＡからＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩで切断し、プロモーターの配列のみを分離したものを、同様に平滑末端化したプラスミドｐＫＬＣに接続しプラスミドｐＫＰＬを作製した。
【００３６】
以上の操作によりプロモーター領域のみをｌｕｃ遺伝子と結合したプラスミドｐＫＰＬとｍａｇＡ−ｌｕｃ融合遺伝子を結合したｐＫＭＬの２種を作製した。ｐＫＭＬの制限酵素切断部位地図を図３に示す。
ＩＩ． 接合伝達体の作製
次に、Ｉで得られた二種の組み換えプラスミドを接合伝達により野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体の作製を行った。接合伝達における供与菌体として用いたＥ． ｃｏｌｉ Ｓ１７−１ はｔｒａ遺伝子を有しているため、接合伝達を行う際、ヘルパープラスミドなしで接合伝達が可能である。接合伝達にはＭＳＧＭ培地で培養した対数期中期から後期の磁性細菌約８×１０７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌを用い、供与菌体は前日にプラスミドを導入し発生したコロニーをかき取って１０９ から１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁して用いた。１：５０（磁性細菌：大腸菌）で菌を混合し、寒天プレート上にスポットし、メイティングを行った。６時間後スポットをメスで切り取り５ｍｌ程度のＭＳＧＭ培地を用い菌体を回収した。この懸濁液をテトラサイクリン２．５μｇ／ｍｌを添加したＭＳＧＭ培地に植菌した。２５℃で培養し、増殖した細胞を接合伝達体とした。この際、大腸菌はＭＳＧＭ培地では増殖しない。
【００３７】
次に接合伝達後ＭＳＧＭ培地で培養した磁性細菌より磁気微粒子の分離を行った。磁性細菌を遠心分離により集菌後１０ｍＭトリスバッファーで２回洗浄後、菌体濃度０．１ｇ ｗｅｔ ｃｅｌｌ／ｍｌを超えない濃度で懸濁し、出力１２０Ｗ、３０秒間５回の超音波破砕を行った。細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しながらＮｄ−Ｃｏ磁石を容器外壁面に当てて３０分処理し、磁気微粒子を懸濁液中から分離した。さらに懸濁液を５，０００Ｇ、１５分遠心分離することで細胞膜成分を分離し、１００，０００Ｇ、１．５時間超遠心する事で細胞質を分離した。
【００３８】
磁気微粒子、細胞膜及び細胞質の各分画のルシフェーラーゼ活性をピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定することで行い、導入したルシフェラーゼ遺伝子の発現及び発現量を測定した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
例２
抗ウサギＩｇＧ抗体の抗原認識部位をコードした遺伝子（ｉｇｇ遺伝子、ファルマシア社）を該遺伝子でコードされる抗体タンパク質を磁気微粒子を被覆するリン脂質を主成分とする有機膜上に生成させるため、ｍａｇＡ−ｉｇｇ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＧを図４に示す方法で作成した。
【００４０】
即ち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。ｐＲＫ４１５をＥｃｏＲＩで切断し平滑末端化しｉｇｇ遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＧＣを作製した。
【００４１】
次に、磁性細菌ＡＭＢ−１のクロモゾームをＥｃｏＲＩで切断し、λＤＮＡであるλＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にランダムに組み込みλＺＡＰＩＩジーンバンクを作製した。これはファージ粒子中にパッケージし、大腸菌に感染させることでプラークの形でジーンバンクを作製した。λＺＡＰＩＩジーンバンクより分離したｍａｇＡ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ遺伝子断片をｐＵＣ１９にクローニングしｐＵＭ５Ａを作製した。
【００４２】
次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子を分離し、平滑末端化し、プラスミドｐＫＧＣと接続しプラスミドｐＫＭＧを作製した。ｐＫＭＧの制限酵素切断部位地図を図５に示す。
【００４３】
このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１ に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養し、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を回収した。この磁気微粒子を用いて、ウサギＩｇＧ を抗原としたイムノアッセイを行った。イムノアッセイはアルカリフォスファターゼ標識した抗ウサギＩｇＧ 抗体を２次抗体として用いたサンドイッチ法を用い、検出はアルカリフォスファターゼと、ＡＭＰＰＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ） との反応による発光をルミノメーターで測定した。この結果、抗原を検出することが可能であった。この実験により、接合伝達体の磁気微粒子に抗体がＭａｇＡ融合タンパク質として結合することによって、抗体固定化操作なしに抗原検出システムに用いることが可能な磁気微粒子を生産することができた。
例３
プロテインＡ遺伝子（ＰｒｏｔｅｉｎＡ ｇｅｎｅ、ファルマシア社製ｐＥＺＺ１８より分離）を該遺伝子でコードされるタンパク質を磁気微粒子を被覆するリン脂質を主成分とする有機膜上に生成させるため、ｍａｇＡ−プロテインＡ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＡを図６に示す方法で作製した。
【００４４】
即ち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。ｐＲＫ４１５をＥｃｏＲＩで切断しプロテインＡ遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＡＣを作製した。
【００４５】
次に、磁性細菌ＡＭＢ−１のクロモゾームをＥｃｏＲＩで切断し、λＤＮＡであるλＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にランダムに組み込みλＺＡＰＩＩジーンバンクを作製した。これはファージ粒子中にパッケージし、大腸菌に感染させることでプラークの形でジーンバンクを作製した。λＺＡＰＩＩジーンバンクより分離したｍａｇＡ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ遺伝子断片をｐＵＣ１９にクローニングしｐＵＭ５Ａを作製した。
【００４６】
次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子を分離し、平滑末端化したプラスミドｐＫＡＣと接続しプラスミドｐＫＭＡを作製した。ｐＫＭＡの制限酵素切断部位地図を図７に示す。
【００４７】
このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１ に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養し、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を回収した。この磁気微粒子に対し、プロテインＡのＩｇＧ との結合能に注目し、抗杉花粉、抗小麦、抗卵ＩｇＧ と混合した。混合した粒子は洗浄し、抗体固定化量を測定したところ、従来用いられてきたＳＰＤＰを用いる化学結合法（特開平５−２０９８８４）と同程度の固定化が可能であることが示された。また、実施例１と同様に、抗原検出実験を行った結果、３種の抗原はどれも検出可能であった。このようにプロテインＡのｍａｇＡ融合タンパク質を用いて様々なＩｇＧ を磁気微粒子表面に簡便に結合させることが可能であり、従来の化学結合に劣らない抗原検出が可能であることが示された。
例４
蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子）をｍａｇＡ遺伝子の５’末端側に導入し、ｌｕｃ−ｍａｇＡ融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＮＥＬＭを図８に示す方法で作製した。
（１） ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子をもつプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。このｐＲＫ４１５のＮｃｏΙ切断部位とＥｃｏＮΙ切断部位を平滑末端化処理により欠損させ、プラスミドｐＲＫ４１５ＮＥを作製した。ｐＲＫ４１５ＮＥをＳａｃＩで切断し、ｍａｇＡプロモータ−ｌｕｃ融合遺伝子を組み込んだプラスミドｐＮＥＰＬを生成した。
（２） 次に、ｍａｇＡ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＭ５ＡにＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを用い、ＰＣＲによりｍａｇＡ遺伝子を増幅させＳｃａＩで切断し、ＥｃｏＮＩで切断後平滑末端化したプラスミドｐＮＥＰＬと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭを作製した。ｐＮＥＰＬの制限酵素切断部位地図を図９に示す。
（３） このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養して増殖させ、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を磁石を用いて回収した。この磁気微粒子のルシフェラーゼ活性を、ピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定した。結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
例５
蛍ルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を磁気微粒子上に同時発現させるため、ｌｕｃ−ｍａｇＡ−ｃａｔ融合ＤＮＡ配列を含む遺伝子であるプラスミドｐＮＥＬＭＣを図１０に示す方法で作製した。
【００５０】
すなわち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子をもつプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。このｐＲＫ４１５のＮｃｏΙ切断部位とＥｃｏＮΙ切断部位を平滑末端化処理により欠損させ、プラスミドｐＲＫ４１５ＮＥを生成した。ｐＲＫ４１５ＮＥをＳａｃＩで切断し、ｍａｇＡプロモーター−ｌｕｃ融合遺伝子を組み込んだプラスミドｐＮＥＰＬを作製した。
【００５１】
次に、ｍａｇＡ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＭ５ＡにＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを用い、ＰＣＲによりｍａｇＡ遺伝子を増幅させＳｃａＩで切断し、ＥｃｏＮＩで切断後平滑末端化したプラスミドｐＮＥＰＬと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭを作製した。
【００５２】
次に、ｃａｔ遺伝子に該遺伝子のＳＤ配列を削除しＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを用い、ＰＣＲによりｃａｔ遺伝子を増幅させた。これをＤｒａＩＩＩで切断後平滑末端化したプラスミドｐＮＥＬＭと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭＣを作製した。ｐＮＥＬＭＣの制限酵素切断部位地図を図１１に示す。
このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体を生成した。接合伝達体を培養して増殖させ、細胞を回収、破砕を行い、磁石で磁気微粒子を回収した。この磁気微粒子のルシフェラーゼ活性を、ピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定したところｐＮＥＬＭと同等のルシフェラーゼ活性を示した。
【００５３】
次に、この磁気微粒子のＣＡＴアッセイを行った結果、ＣＡＴ活性が検出された。ＣＡＴアッセイは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼとクロラムフェニコールとの反応によるクロラムフェニコールアセチル化体を薄層クロマトグラフィーにより検出することで行った。この結果、ｍａｇＡ遺伝子タンパク質の両末端に接続したそれぞれのタンパク質は、該タンパク質を単独で接続したときと同等の活性を示した。この実験より、ｍａｇＡ遺伝子タンパク質の両末端に機能の異なるタンパク質をコードする遺伝子を接続した融合遺伝子を構築することで、磁気微粒子上に同時発現することが可能になり、これより多数の機能を有する磁気微粒子を生産することができた。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、固定化等の処理を行う必要がなく、形質転換された磁性細菌を培養し、菌体内に生成した磁気微粒子を分離するだけで酵素、抗体その他の有用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合した状態で安定して得ることができる。有用タンパク質が機能性タンパク質である場合には、磁気微粒子に固定化された機能性タンパク質を磁気的に制御することができるので、所要の局所へ効率的にその機能を発揮させることができる。
【００５５】
また、所要のタンパク質をコードする遺伝子を本発明のプラスミドに導入し、磁性細菌を形質転換することでどのようなタンパク質も磁気微粒子上に生成させることができる。
【００５６】
高価な酵素、抗体等のタンパク質を用意する必要はなく、同じ菌株を維持し培養するだけで所要のタンパク質結合磁気微粒子を半永久的に製造することができ、製造ロット間のタンパク質含有量や活性にバラツキがなく、しかも低コスト化のメリットも大きい。しかも、こうして得られる磁気微粒子は、常に同一活性を有するタンパク質を同一の量で含有するものである。
【００５７】
さらに、タンパク質を磁気微粒子上に生産するため目的とするタンパク質を磁気的に短時間で分離回収でき、効率的な分離精製が出来る。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】例１で調製したプラスミドｐＫＰＬ及びｐＫＭＬの調製方法の説明図である。
【図２】例１で調製したプラスミドｐＵＭ５Ａの調製方法の説明図である。
【図３】プラスミドｐＫＭＬの制限酵素切断部位地図である。
【図４】例２で調製したプラスミドｐＫＭＧの調製方法の説明図である。
【図５】プラスミドｐＫＭＧの制限酵素切断部位地図である。
【図６】例３で調製したプラスミドｐＫＭＡの調製方法の説明図である。
【図７】プラスミドｐＫＭＡの制限酵素切断部位地図である。
【図８】例４で調製したｐＮＥＬＭの調製方法の説明図である。
【図９】プラスミドｐＮＥＬＭの制限酵素切断部位地図である。
【図１０】例５で調製したｐＮＥＬＭＣの調製方法の説明図である。
【図１１】プラスミドｐＮＥＬＭＣの制限酵素切断部位地図である。
Claims (13)
- 磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したタンパク質をコードし、配列表に記載の配列番号１で示されるＤＮＡ配列からなる、単離、精製されたｍａｇＡ遺伝子。
- 磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したタンパク質であって、配列表に記載の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、単離、精製されたｍａｇＡタンパク質。
- 磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したｍａｇＡタンパク質のアミノ酸配列中の疎水性領域（配列表に記載の配列番号２の第７〜第３８０アミノ酸残基の領域）をコードする塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含むｍａｇＡ遺伝子断片。
- (a) 磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したｍａｇＡタンパク質のアミノ酸配列中の疎水性領域（配列表に記載の配列番号２の第７〜第３８０アミノ酸残基の領域）をコードする塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含むｍａｇＡ遺伝子断片と、(b) 該ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は両方の末端に融合された、一又は二のタンパク質をコードする一又は二のＤＮＡ配列と、からなる融合ＤＮＡ配列。
- 前記の一又は二のタンパク質が機能性タンパク質である、請求項4 に記載の融合ＤＮＡ配列。
- 請求項4 に記載の融合ＤＮＡ配列を含有する組み換えプラスミド。
- 宿主磁性細菌に請求項6 に記載の組み換えプラスミドが導入されてなる、形質転換磁性細菌。
- 請求項7 に記載の宿主磁性細菌が、Magnetospirillum種又はDesulfovibrio 種の微生物である、形質転換磁性細菌。
- 磁気微粒子と、該磁気微粒子の表面を被覆している有機膜に結合している、請求項4 に記載の融合ＤＮＡ配列でコードされた一又は二の機能性タンパク質を含有する融合タンパク質とを有する、機能性タンパク質結合磁気微粒子。
- 請求項9 の機能性タンパク質結合磁気微粒子であって、前記の一又は二の機能性タンパク質が生理活性を有するものである磁気微粒子。
- 請求項10の磁気微粒子であって、前記の生理活性を有するタンパク質が、免疫関連タンパク質、結合能を有するタンパク質、又は酵素である磁気微粒子。
- 請求項4 に記載の融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養することにより、前記融合ＤＮＡ配列を発現させ、請求項 4 に記載の一又は二のタンパク質を含む融合タンパク質を、磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した状態で該菌体内に生成させることからなる、タンパク質結合磁気微粒子の製造方法。
- 前記一又は二のタンパク質が機能性タンパク質である、請求項12に記載の製造方法。
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