WO1997010345A1 - Promoteur/terminateur de gene de candida boidinii faisant office de formate deshydrogenase - Google Patents

Promoteur/terminateur de gene de candida boidinii faisant office de formate deshydrogenase Download PDF

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WO1997010345A1
WO1997010345A1 PCT/JP1996/002597 JP9602597W WO9710345A1 WO 1997010345 A1 WO1997010345 A1 WO 1997010345A1 JP 9602597 W JP9602597 W JP 9602597W WO 9710345 A1 WO9710345 A1 WO 9710345A1
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gene
seq
promoter
terminator
sequence type
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PCT/JP1996/002597
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Toshihiro Komeda
Hisako Suda
Yukio Tamai
Akihiro Iwamatsu
Nobuo Kato
Yasuyoshi Sakai
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Definitions

  • the present invention relates to a promoter and / or a terminator of a formate dehydrogenase gene of Candida boidinii, a gene expression cassette containing the promoter, a heterologous gene and a terminator, and the expression cassette.
  • the present invention relates to a vector containing the expression vector, a transformed cell containing the expression vector, and a method for producing a useful gene product using the transformed cell. Background art
  • Methanol-utilizing yeast is a yeast that can grow using methanol as its sole carbon source.
  • the first reaction of methanol metabolism in methanol-assimilating yeast is the formation of formaldehyde and hydrogen peroxide from methanol and oxygen by alcoholoxidase.
  • the produced hydrogen peroxide is decomposed into water and oxygen by catalase.
  • formaldehyde is oxidized to carbon dioxide by the action of formaldehyde dehydrogenase, S-formylglutathione hydrolase and formate dehydrogenase, and the resulting NADH is used as an energy source for cells.
  • formaldehyde is condensed with xylulose-5-phosphate by dihydroxyacetone synthase, converted to glyceraldehyde-3-phosphate and dihydroxyaceton, and then via the bentose phosphate pathway. It becomes a bacterial cell component.
  • the alcohol oxidase, dihydroxyacetone synthase and formate dehydrogenase mentioned here are produced in large quantities when methanol-assimilating yeast is cultured in the presence of methanol, and reach about 40% of the intracellular soluble protein.
  • methanol-assimilating yeast can be cultured in large amounts with inexpensive methanol, and it has a strong transcriptional activity that is not found in other yeasts. It is considered that the yeast is suitable as a heterologous gene expression system in that it has a motor.
  • Candida boidinii is a kind of methanol-assimilating yeast. Using the yeast, a method for expressing a heterologous gene using the regulatory region of the alcoholoxidase gene (A0D1) has been studied (JP-A-5-344895).
  • formate dehydrogenase is an enzyme that is produced in a significant amount like alcoholase.
  • This enzyme is an enzyme that exists downstream of methanol metabolism, and is expressed differently from alcoholase. Probably under control.
  • it is an enzyme that can be induced and expressed depending on culture conditions even in the presence of glucose that completely suppresses the expression of alcoholoxidase. Therefore, it is considered possible to establish a method for expressing a large amount of a heterologous gene different from when the alcohol oxidase promoter is used.
  • the present invention relates to a promoter and a Z or a terminator having a strong transcriptional activity for expressing a heterologous gene, an expression vector containing the promoter and the terminator, a transformant containing the expression vector, An object of the present invention is to provide a method for producing a heterologous gene expression product using the transformant.
  • the present inventors elucidated the expression system of the formate dehydrogenase gene possessed by the methanol-assimilating yeast Canidida boidini i and conducted intensive studies to achieve the effective expression of the heterologous gene.
  • the present inventors have found a promoter and Z or a terminator having a strong transcriptional activity for expressing, and completed the present invention.
  • the present invention provides a Candida ′ boizinii formate dehydrogenase substantially comprising a continuous nucleotide sequence of 190 bp or more selected from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to a promoter of a Candida voidinii formate dehydrogenase gene substantially comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 48, 49 or 50. Further, the present invention is a terminator of a Candida voidinii formate dehydrogenase gene substantially comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • nucleotide sequence means that the nucleotide represented by SEQ ID NO: 1, 48, 49, 50 or 2 is provided as long as the desired promoter and Z or terminator activity can be obtained. It means that mutation such as substitution, deletion or insertion may occur in the sequence. For example, even if the third "C” in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with "G", such a substituted sequence is also used in the present invention as long as the desired promoter activity of the present invention is obtained. Means that it is included.
  • heterologous gene is a gene to be expressed, and means any gene different from formate dehydrogenase derived from Candida's boilinii (Candi da boidinii).
  • heterologous gene include an acid phosphatase gene, a non-amylase gene, various interferon genes, an erythropoietin gene, and a granulocyte colony stimulating factor gene. Also, it may be obtained by any method.
  • the present invention relates to a recombinant expression vector containing the gene expression cassette. Further, the present invention relates to a transformant transformed by the recombinant expression vector.
  • the present invention is a method for producing a heterologous gene expression product, which comprises culturing the transformant in a medium and collecting the heterologous gene expression product from the obtained culture.
  • the medium include a medium containing a compound having an oxygen atom or a nitrogen atom and having at least one substituent having 1 carbon atom bonded to the atom.
  • the compound having an oxygen atom includes methanol or formic acid or a salt thereof
  • the compound having a nitrogen atom includes N-substituted such as methylamine, dimethylamine, trimethylamine, and coryne. Ammonium with methyl And at least one member selected from the group consisting of compound compounds.
  • the present inventors have (1) modified the nucleotide sequence of a formate dehydrogenase gene (hereinafter sometimes abbreviated as FDH) of Candida aboidinii into a promoter, terminus (2) A promoter and a terminator were isolated, and (3) an expression vector was constructed. Furthermore, (4) when a transformed cell is prepared using the present expression vector and a heterologous gene is expressed, the expression is induced by methanol or the like in the same manner as formate dehydrogenase from Candida boidinii. After confirmation, the present invention was completed.
  • FDH formate dehydrogenase gene
  • the formate dehydrogenase gene is first cloned.
  • yeast for example, Candida boidinii S2 AOU-1 strain is exemplified.
  • the closing step can be performed according to a known method (Molecular Cloning (1989), Methods in Enzymology 194 (1991)).
  • the extraction of the total DNA of the yeast is performed, for example, by preparing a yeast protoplast, and then performing a generally known DNA extraction method, an alcohol precipitation method after removing cell residues under a high salt concentration, and the like. It can be performed using a conventional method such as alcohol precipitation after extraction with phenol.
  • DNA can be extracted by cell disruption using glass beads or the like, but it is easy to prepare high molecular weight DNA. Therefore, it is preferable to carry out the above-mentioned protoplast method.
  • the obtained chromosomal DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme (Sau3AI, etc.). After ligating to a suitable vector, the resultant is transformed into an appropriate host to obtain a genomic library.
  • an appropriate restriction enzyme Sau3AI, etc.
  • the resultant is transformed into an appropriate host to obtain a genomic library.
  • a commercially available plasmid such as a pBR strain, a pUC strain, or a blue script strain, which is generally known as a known gene library preparation vector, is used. You can do it.
  • phage vectors or cosmids of Charon strain or EMBL strain can be widely used.
  • a host for performing transformation or transduction with the prepared vector for preparing a gene library a host suitable for the type of the above vector can be used.
  • clones having the desired formate dehydrogenase gene are cloned using a labeled probe containing a sequence specific to the formate dehydrogenase gene, using colony hybridization method, plaque hybridization method, etc. Can be selected and obtained.
  • the sequence specific to the formate dehydrogenase gene used for the probe is synthesized by synthesizing an oligonucleotide corresponding to the amino acid sequence of the formate dehydrogenase gene purified from Candida boidini i, and using the chromosomal DNA of Candida boidini i as type III.
  • the desired DNA fragment can be specifically amplified and obtained by PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989).
  • the synthesized oligonucleotide may be used as a probe.
  • the determination and confirmation of the nucleotide sequence of the desired gene obtained by the above method can be performed, for example, by the chemical modification method of Maxam-Gilbert (Maxam-Gilbert, Methods in Bnzymology, 65, 499 (1980)), dideoxynucleotide chain termination. (Messing, J. and Vieire, J., Gene, 19, 269 (1982)), or an automated modification thereof.
  • the nucleotide sequence is determined, it is then hybridized by chemical synthesis, by PCR using a primer synthesized from the determined nucleotide sequence, or by using a DNA fragment having the nucleotide sequence as a probe.
  • a desired gene can be obtained.
  • these regions can be chemically synthesized, and semi-synthetic promoters and terminators can be prepared by using the cloned DNA and restriction enzyme sites to chemically synthesize some regions. It is.
  • a promoter sequence is exemplified in SEQ ID NO: 1, it is not limited to this sequence as long as it essentially has a transcriptional activity, and its base sequence can be changed by deletion, insertion, substitution, addition or the like. It can be modified.
  • the modification of the nucleotide sequence can be performed by a known mutation introduction method (for example, a method using TAKARA LA PCR invitro Mu tagenes i kit from Takara Shuzo) or the like.
  • the promoter of the present invention substantially contains a continuous nucleotide sequence of 190 bp or more from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and expresses the formate dehydrogenase gene of Candi da biod inii. Is involved.
  • deletion of the 5'-side (1st to 600th) and 3'-side (901st to 1478th) regions of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 results in a 300 bp linked base sequence. It is possible to obtain a promoter containing substantially.
  • the promoter region is to be widely deleted as described above, for example, it is appropriate to prepare it by PCR using a commercially available kit for delanon (Kira Sequence's kilosequence delanyon kit).
  • the expression vector of the present invention can be obtained by inserting an FDH promoter, a heterologous structural gene, an FDH terminator, a marker gene, and a homologous region into an appropriate vector. It is. Therefore, examples of the vector used include Escherichia coli plasmid vectors such as the pBR strain, the pUC strain, and the Bruce Crypto strain. Insertion of the components of the expression vector into the vector can be easily performed by those skilled in the art by referring to the description in the Examples below or by a conventional technique. Those skilled in the art can easily determine the selection marker gene and the homologous region. Examples of the marker gene include an antibiotic resistance gene such as G-418 and an auxotrophic complement gene such as URA3 and LEU2.
  • Plasmids can be introduced into the yeast by applying a general method used for yeast transformation. That is, the protoplast method, the lithium method, the electroporation method, and modifications thereof can be applied.
  • the expression vector of the present invention can be stably integrated by integrating it into host chromosomal DNA.o
  • a known method Sakai, Y. et al., J. Bacteriol., 175, 3556 (1993)). Therefore, it can be present in a plasmid state.
  • the gene expression product is obtained by culturing the transformant obtained as described above and purifying the gene expression product from the obtained culture.
  • a culture medium containing a compound having an oxygen atom or a nitrogen atom and having at least one substituent having 1 carbon atom bonded to the atom can be added to the culture medium.
  • methanol or formic acid or a salt thereof can be added as a compound having an oxygen atom, and methylamine, dimethylamine, trimethylamine, and an ammonium compound having ⁇ -substituted methyl (for example, At least one selected from the group consisting of choline and the like can be added.
  • the conditions for inducing the expression with the above compound are as follows.
  • methanol When induced by medium, it contains methanol as a carbon source and one or more nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, meat extract, casamino acid, ammonium salt, etc., and phosphoric acid, sodium, potassium, and magnesium.
  • nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, meat extract, casamino acid, ammonium salt, etc.
  • phosphoric acid sodium, potassium, and magnesium.
  • Calcium, iron, Inorganic salts such as copper, manganese, and cobalt are added, and if necessary, trace nutrients such as various vitamins and nucleotides, and saccharide raw materials are conveniently added.
  • formic acid besides containing formic acid, one or more carbon sources such as glucose and glycerol, and one or more nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, meat extract, casamino acid, and ammonium salt, etc.
  • Add inorganic salts such as acid, sodium, potassium, magnesium, calcium, iron, copper, manganese, and cobalt, and if necessary
  • At least one of these compounds is contained as a nitrogen source, and at least one carbon source such as glucose and glycerol is used as a nitrogen source.
  • the pH of the medium is suitably adjusted to 5.5 to 6.5.
  • the culture temperature is 25 to 30 ° C, preferably around 28 ° C.
  • the cultivation time is about 24 to 1000 hours, and the cultivation can be performed by batch culture or continuous culture with standing, shaking, stirring, aeration or the like.
  • a gene product can be collected from the culture by using a conventional protein purification means or the like.
  • the gene product is extracted by ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, pressure crushing, etc., by a conventional method. Add protease inhibitors as needed.
  • the culture solution When produced in the culture supernatant, the culture solution itself can be used. Then, the solution is filtered, centrifuged, etc., to remove the solid portion, and if necessary, nucleic acid is removed by protamine treatment or the like.
  • the purified target gene product can be obtained. Can be obtained.
  • the above-described culture method and purification method are merely examples, and the present invention is not limited to these.
  • the amino acid sequence of the purified gene product can be confirmed by a known amino acid analysis, for example, an automatic amino acid sequencing method by Edman degradation.
  • Figure 1 shows a restriction map of a plasmid containing the formate dehydrogenase gene.
  • FIG. 2 is a construction diagram of a plasmid containing a promoter fragment of a formate dehydrogenase gene using PCR.
  • FIG. 3 is a construction diagram of a plasmid containing a terminator fragment of a formate dehydrogenase gene using PCR.
  • FIG. 4 is a diagram showing a method for constructing an expression plasmid pFexAG using a promoter and a terminator of a formate dehydrogenase gene.
  • FIG. 5 is a diagram showing a restriction map of a plasmid containing the actin gene.
  • FIG. 6 is a diagram showing a method for obtaining each fragment of a promoter and a terminator of an actin gene using PCR, and a method for constructing an expression plasmid using the promoter and the terminator.
  • FIG. 7 is a diagram showing a method for constructing the G418 resistance gene expression plasmid pAcNEOl using the actin gene promoter and terminator.
  • FIG. 8 is a diagram showing a construction method of plasmids pAcNE02 and pAcNE03.
  • FIG. 9 is a diagram showing a method for constructing plasmid pPUFl.
  • FIG. 10 shows the acid phosphatase activity controlled by the upstream deletion type FDH promoter. The relative values are shown with the acid phosphatase activity of a transformant of plasmid pPUF1 in which the promoter region is not deleted as 100.
  • the parent strain is Cand i da bo idinii ST25, which does not contain brassmid. The value of 15 shares.
  • the N-terminal amino acid sequence of the formate dehydrogenase of Candida boidini i was determined to be the sequence represented by SEQ ID NO: 3 by Gas Fade Peptide Sequencer model 120-A (Applied Biosystems).
  • the partial amino acid sequence was determined as shown in SEQ ID NOs: 4 to 16 according to the method of Iwamatsu (Biochemistry, 63, 139 (1990).
  • FDH-NT1 SEQ ID NO: 17
  • FDH-AP7 SEQ ID NO: 18
  • the primers FDH-NT1 and FDH-AP7 have, at the 5 'end, a base sequence of a restriction enzyme BamHI recognition site (fourth to ninth nucleotides of the sequences of SEQ ID NOS: 17 and 18; GGATCC).
  • Primer FDH-NT1 and FDH-AP7, and chromosomal DNA of Candida boidini i prepared based on the method of Cryer et al. (Cryer, D. et. Al., Methods Cell Biol., 12, 39 (1975)) And PCR was performed using rTaq polymerase (Takara Shuzo). PCR was performed for 1 cycle at 95 ° C, 1 minute at 58 ° C, and 3 minutes at 72 ° C. Kuru Peta.
  • the chromosomal DNA of Candida boidini i was cut with Hind 111, and after agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 5 kb was recovered from the gel. The recovered DNA fragment was inserted into the HindIII cleavage site of pBluescript II SK + to prepare a HindIII plasmid library. Similarly, an EcoRI plasmid library was prepared.
  • Various deletion mutant plasmids were prepared from the plasmids pFdH2 and pFdEX prepared in the above (1-3) using a kit for kilosequencing (Takara Shuzo). Using these plasmids as type I, the base sequence was determined using a die primer cycle sequence kit and a die terminator cycle sequence kit (PerkinElmer). By joining the determined nucleotide sequences of the plasmids pFdH2 and pFdH2, the entire nucleotide sequence of the HincIl-XbaI region of about 3.6 kb in Fig. 1 was determined (SEQ ID NO: 19).
  • amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence matches the partial amino acid sequence of the purified enzyme (in the sequence of SEQ ID NO: 20, the -45th, 56-76, 86-103, 189 -201, 206-236, 241-246, 291-326 and 328-356 amino acid sequences).
  • amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is 82% that of the amino acid sequence (EP00299108, 18-JAN-1989) of the formate dehydrogenase of the methanol-assimilating yeast Hansenu la polymorpha. Shows the homology of In addition, no homology was found between the base sequences at the 5′-side upstream (promoter one region) and the 3′-side upstream (terminator one region) with those of Hansen la pol ymorpha described above.
  • the promoter region and the terminator region of the formate dehydrogenase gene were isolated by providing appropriate restriction enzyme cleavage sites before the translation initiation codon ATG and after the termination codon TAA.
  • the PCR shown in FIG. 4 was used to introduce restriction enzyme sites. PCR The following four oligonucleotides were synthesized as primers.
  • PfdhP5 SEQ ID NO: 21
  • PfdhP3 SEQ ID NO: 22
  • PfdhT5 SEQ ID NO: 23
  • Pf dhT3 SEQ ID NO: 24
  • PfdhP3 contains the same nucleotide sequence as the 3 ′ end of the FDH promoter, and has a Not 1 restriction enzyme cleavage site (the first to eighth sequences in SEQ ID NO: 22) at the 5 ′ end.
  • Pf dhT5 contains the same nucleotide sequence as the 5 ′ end of one FDH terminator, and has Not 1 and Sma 1 restriction enzyme cleavage sites (sequences 1 to 14 in SEQ ID NO: 23) at the 5 ′ end.
  • PfdhP5 has an Acc I restriction enzyme cleavage site (sequences 5 to 10 in SEQ ID NO: 21) located in the middle of the FDH promoter, and PfdhT3 has a Sac 1 restriction site located in the middle of one FDH terminator. It has an enzyme cleavage site (sequences 13 to 18 in SEQ ID NO: 24).
  • Plasmid pFdH2 containing one region of the FDH promoter was mixed with primers PfdhP5 and PfdhP3, and a PCR reaction using Ex Taq polymerase (Takara Shuzo) was performed ((1 minute at 94 ° C, 57.C at 57 ° C). 1 minute, 1 minute at 72 ° C) x 25 cycles).
  • the amplified DNA contains a region downstream of the Acc I restriction enzyme cleavage site in the FDH promoter motor region, and has a Not I restriction enzyme cleavage site at the 3 'end.
  • the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, and an amplified DNA fragment was recovered.
  • the recovered DNA fragment and the vector pT7BlueT-Vector (Novazyun) were ligated to prepare pFPl.
  • a plasmid pFdEX containing one region of the FDH terminator is mixed with primers PfdhT5 and PfdhT3 to perform a PCR reaction ((1 minute at 94 ° C, 1 minute at 57 ° C, 1 minute at 72 ° C) X25 cycles) to amplify a DNA fragment that includes the upstream region of the Sac1 restriction enzyme cleavage site in the FHD terminator region and has NotI and SmaI restriction enzyme cleavage sites at the 5 'end.
  • pFT7 in which pT7 Blue T-Vector was ligated.
  • the nucleotide sequence was determined using a die primer cycle sequence kit and a die terminator cycle sequence kit, and it was confirmed that the target region was correctly amplified.
  • a DNA fragment of 0.5 kb was separated by agarose electrophoresis.
  • the FDH promoter upstream of Acc1 is cut.
  • a 1 kb DNA fragment containing the evening region was isolated (Fig. 2).
  • pFdhPT has a promoter and a terminator region of the FDH gene, and can insert various structural genes (heterologous genes) into NotI and SmaI sites between the promoter and the terminator (FIG. 4).
  • the G418 resistance gene expressed by the Candida boidini i actin gene promoter and terminator was used as a marker gene, and the actin gene gene region was used as a homologous region.
  • chromosomal DNA is partially digested with the restriction enzyme Sau3AI, and centrifuged with a 10-40% sucrose gradient. DNA of ⁇ 20 kb fraction was prepared.
  • PUC118 was used as vector DNA. pUC118 was digested with restriction enzyme BamHI and then treated with Al lipophosphatase.
  • Candida boidini iactin gene was isolated by hybridization with a homologous Saccharomyces cerevisiae actin gene labeled with a radioisotope.
  • the PCR method was used to prepare the actin gene of Saccharomyces cerevisiae. According to the known nucleotide sequence of the actin gene of Saccharomyces cerevisiae (Gallwitz, D., Sures, I., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2546 (1980)), it is used as a primer for PCR. The following two types of oligonucleotides were synthesized using Type 394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems).
  • PScACl SEQ ID NO: 25
  • PScAC2 SEQ ID NO: 26
  • the primer PScACl PScAC2 has a nucleotide sequence corresponding to the N-terminal and C-terminal amino acid sequences of the exon 2 region of the actin gene of Saccharomyces cerevisiae, respectively.
  • Chromosomal DNA prepared from Saccharomyces cerevisiae S288C strain was mixed with primers P ScACl and PScAC2 to perform PCR reaction ((94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes) X 25 cycles).
  • the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the amplified DNA fragment was recovered. This DNA fragment was radioactively labeled with 32 P using a megaprimer DNA labeling system (Amersham).
  • the plasmid pAcl was digested with Kpn and Sma1, and a fragment carrying the actin gene of about 6 kb was inserted into the KpnI and SmaI sites of pBluescript II KS +. PActo 7 was prepared. A more detailed restriction map of this pAcl-7 was prepared (see FIG. 5).
  • Various deletion mutant plasmids were prepared from plasmids pAcl-7-10, pAcl-7-17, and pAcl-7 / Cla using a kit for kilosequencing (Shake Kit). Using these plasmids as type I, the nucleotide sequence was determined using a dye primer cycle sequence kit (PerkinElmer). By joining the nucleotide sequences of the determined plasmids pAc 7-10 and pAcl-7 / Cla, the entire nucleotide sequence of the approximately 5 kb Kpnt-C1aI region in FIG. 5 was determined (SEQ ID NO: 27). .
  • PT7T3 (SEQ ID NO: 37)
  • the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, and an amplified DMA fragment was recovered.
  • the recovered DNA fragment and the vector pT7 Blue T-Vector were ligated.
  • the nucleotide sequence was determined using a diprimer one-cycle sequence kit.
  • the nucleotide sequence of the longest clone started at position 1922 of SEQ ID NO: 27 and lacked the regions 1974 to 2508 and the regions 2524 to 2853. The missing region was intron, and the sequence of ATG (first position 1965 in SEQ ID NO: 27) that appeared first in the cDNA was considered to be the initiation codon.
  • the PCR method was used to isolate the promoter and terminator regions of the actin gene (Fig. 6).
  • the following four types of oligonucleotides were synthesized to extend the promoter region about 1 kb upstream of the translation initiation codon ATG and the terminator region about 0.5 kb downstream of the termination codon TAA.
  • PP5 and PP3 contain the base sequences at the 5 'end and 3' end of the promoter region, respectively.
  • the restriction site EcoRI recognition site for PP5 (the 3rd to The 8th sequence) and PP3 have the base sequence of the Sail recognition site (5th to 10th sequence of SEQ ID NO: 29).
  • PT5 and PT3 contain the nucleotide sequence at the 5 'end and 3' end of the terminator region, respectively, at the 5 'end of each oligonucleotide, and for PT5, the nucleotide sequence at the recognition site of the restriction enzymes Sail and Pstl (SEQ ID NO: PT3 has the base sequence of the recognition site of Hindlll and Pstl (the 1st to 12th sequences of SEQ ID NO: 31).
  • a plasmid pAcl-7 having a pactin gene was mixed with primers PP5 and PP3, and a PCR reaction using rTaq polymerase (Takara Shuzo) was performed ((30 seconds at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C, 1 minute at 72 ° C) x 25 cycles).
  • the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, and an amplified DNA fragment was recovered.
  • the recovered DNA fragment and the vector pT7 Blue T-Vector (Novadin) were ligated to produce pAcP containing the actin gene promoter region (FIG. 6).
  • the PCR reaction using PT5 and PT3 ((30 sec at 94 ° C, 1 min at 45 ° C, 1 min at 72 ° C) X25 cycle) contains the actin gene terminator region.
  • pAcT was prepared ( Figure 6).
  • nucleotide sequence was determined using the Dye Primer Cycle Sequence Kit and the Dye Terminator One Cycle Sequence Kit (PerkinElmer), and the promoter and terminator regions were accurately amplified. Confirmed that.
  • Plasmid pMAc has a promoter and terminator region of the actin gene between the EcoRl Hindlll of pUC118, and can insert various structural genes into the Sail and Pstl sites between the promoter and the terminator.
  • An expression plasmid was constructed in which the G418 resistance gene was inserted between the actin gene promoter and the terminator.
  • the G418 resistance gene derived from the transposon Tn5 was obtained from the plasmid ⁇ (Pharmacia) using the PCR method. Based on the report of Jorgensen et al. (Jorgensen, R. A. et al., Mol. Gen. Genet. 177, 65 (1979)), the following two types of primers were synthesized.
  • PGR5 SEQ ID NO: 32
  • PGR3 SEQ ID NO: 33
  • primers were mixed with pNEO, and PCR reaction was performed using rTaq polymerase ((30 seconds at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C, 1 minute at 72 ° C) X25 cycles).
  • the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, and an amplified DNA fragment was recovered.
  • the recovered DNA fragment and the vector pT7 Blue T-Vector were ligated to produce a plasmid pTA-NE0 (FIG. 7).
  • Plasmid pTA-NE0 was digested with Ndel-Smal, blunted with T4 polymerase, and G418 resistant gene fragment was recovered by agarose electrophoresis. This G418 resistance gene DNA fragment was ligated with pMAc which had been cut with SaH-Pstl and blunted with T4 DNA polymerase to produce pAcNEOl (FIG. 7).
  • the expression vector of the acid phosphatase gene derived from Saccharomyces cerevisiae using the promoter and terminator of formate dehydrogenase (FDH) derived from Candida boidinii S2 AOU-1 strain was used. This is an example in which it was prepared and transformed into Candida boidinii.
  • a plasmid was prepared that expressed a heterologous gene using the FDH promoter with the G418 resistance gene as the marker gene and the actin gene region as the homologous region.
  • pAcNEOl to G41 The DNA fragment containing the 8 resistance gene was separated by EcoRl digestion and inserted into the EcoRI site of pUC118 to produce the plasmid pAcNE02 (Fig. 8).
  • a 2 kb DNA fragment was separated from pAcl-7, a plasmid containing the actin gene, with Clal, blunted with T4 polymerase, and inserted into the Smal site of pAcNE02 to produce pAcNE03 (Fig. 8). .
  • a plasmid was prepared in which an acid phosphatase gene (PH05 gene) derived from Saccharomyces cerevisiae was introduced between the FDH promoter and the terminator of the above plasmid pFexAG.
  • PH05 gene acid phosphatase gene
  • the PH05 structural gene was obtained by PCR based on the report of Arima et al. (Arima, K. et al., Nucleic Acids Res., 11, 1657 (1983)). The following two types of oligonucleotides were synthesized as PCR primers.
  • PPH05 SEQ ID NO: 34
  • PPH03 SEQ ID NO: 35
  • PPH05 has a Not 1 restriction enzyme cleavage site (sequences 1 to 8 in SEQ ID NO: 34) before the start codon of the PH05 gene, and PPH03 has Sma after the stop codon of the PH05 gene. 1. Has a restriction enzyme cleavage site (sequences 1 to 6 in SEQ ID NO: 35).
  • Chromosomal DNA prepared from Saccharomyces cerevisiae S288C strain was mixed with primers PPH05 and PPH03 and subjected to PCR ((30 seconds at 94 ° C, 1 minute at 53 ° C, 2 minutes at 72 ° C) X 25 cycles).
  • the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, and an amplified DNA fragment was recovered.
  • the recovered DNA fragment and the vector pT7 Blue T_Vector were ligated to produce plasmid pTA-PH05.
  • Plasmid PTA-PH05 was cut with Not Smal to recover a PH05 gene DNA fragment. This PH05 gene DNA fragment was inserted between Not I and Sma I of plasmid pFexAG to prepare pF PhoAG.
  • Candida boidinii ATCC 48180 strain was transformed with plasmid pFPhoAG cut with Bgl11 to obtain transformed cells showing G418 resistance. Transformation method by Sakai The method was disclosed in detail (Sakai Y. et al., J. Bacteriol., 175, 3556 (1993)).
  • Transformed cells were selected on YPD plates containing 0.3 mg / ml G418, which cannot grow on host cells.
  • One of the transformed cells (300-1 strain) and the parent strain (ATCC48180 strain) were cultured in a medium supplemented with methanol or glucose as a carbon source, and the amount of cells and the acid phosphatase activity were measured.
  • the culture of methanol yeast used a pH 5.5 medium containing 1.5% of carbon source, 0.67% of Yeast Nitrigen Base (Difco) and 0.5% of Yeast Extract (Difco).
  • the acid phosphatase activity can be measured by following the method of Toh-e et al. (Toh-e, A. et al., J. Bacteriol., 113, 727 (1973)). Used as One unit of the enzyme activity was defined as the amount of the enzyme that produces linmole p-nitrophenol in one minute at 30 ° C.
  • 300-1 transformed cells were cultured in a medium containing 0.17% yeast nitrogen base and amino acids and ammonium sulfate (Difco) and a carbon source and a nitrogen source shown in Table 3 to obtain acid phosphatase activity.
  • Table 3 shows the specific activity when the specific activity of the acid phosphatase (unit Z0D610) is 100 when cultured with methanol as a carbon source and ammonium sulfate as a nitrogen source.
  • Induced expression of acid phosphatase was induced not only by methanol but also by formic acid, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, and corin.
  • Candida boidinii IFO 10035, Candida boidini i IFO 10240, and Candida boidin ii IFO 10574 were transformed with the plasmid pFPhoAG cut with Bgl11 to obtain transformed cells showing G418 resistance.
  • Each of the transformed cells was cultured in a medium supplemented with methanol or galactose as a carbon source, and the acid phosphatase activity was measured.
  • the cells were cultured in methanol. Acid phosphatase activity was detected only in the transformed cells. This indicates that the formate dehydrogenase promoter disclosed in the present invention functions in any Candida boidinii strain. (Example 5)
  • Candida boidini i FDH promoter having an upstream region deleted was prepared, and a region necessary for the function of the FDH promoter was identified by measuring an acid phosphatase activity controlled by an upstream deletion type FDH promoter. It is an example.
  • a plasmid having the obtained 2.6 kb Sal I-Pst1 fragment of the URA3 gene in pBluescript II SK- was named pCBU3.
  • the KST25 strain was identified based on Barnett's "YEASTS: Characteristics and identification.
  • the URA3 gene and the KST2515 strain were obtained by known methods (Sakai Y. et al., J. Bacteriol., 173, 7458 (1991)).
  • Candida boidini i strain KST2515 was used, and even if another Candida boidini i strain, for example, IFO 10035 strain, was used, it can be easily carried out according to a known method. .
  • pPUFl is a PH05 expression plasmid generated by the FDH promoter using the URA3 gene as the marker gene.
  • the FDH promoter deleted from the upstream region of the PH05 expression plasmid governed by the upstream deletion type FDH promoter was prepared by using a kilosequence drain kit (Takara Shuzo) and PCR. Plasmid pPUFl was cut with Apa I-Xho1, treated with a kilosequence deleon kit, and used to express the PH05 expression plasmids pPUF15, pPUF24, pPUF44, pPUF54, pPUF56, pPUF79, pPUF308, pPUF310 and pPUF320 were obtained.
  • plasmids pPUF15, pPUF24, pPUF44, pPUF54 , PPUF56, pPUF79, pPUF308 and pPUF310 were confirmed to have an FDH promoter region of 1215 bp, 1000 bp, 839 bp, 690 bp, 756 bp, 403 bp, 228 bp and 115 bp, respectively.
  • PRV3 (SEQ ID NO: 47)
  • PCR was performed using any one of the above oligonucleotide primers PF819, PF80U PF779, PF668, PF642, PF622. 1 minute at C, 1 minute at 72 ° C) x 20 cycles) o
  • PPUF779 has a 779 bp PH05 expression plasmid
  • 668bP has a promoter region obtained from primer PF668
  • pPUF668 has a PH05 expression plasmid
  • 642 bp has a promoter region obtained from primer PF642.
  • the plasmid is named pPUF602, the PH05 expression plasmid with a promoter region of 194 bp from primer PF194 is pPUF194, and the PH05 expression plasmid with 161 bp of the promoter region from primer PF161 is pPUF161. did.
  • Example (5-2) 5 g of the plasmid DNA obtained in the above Example (5-2) was digested with BamHI and transformed into Candida boidinii strain KST2515. Pick up several colonies of the resulting transformed cells into each plasmid, and use a pH 5.5 medium containing 1.5% methanol (0.67% yeast nitrogen base) and 0.5% yeast extract (hereinafter referred to as “ME medium”) or glucose. The cells were cultured in a pH 5.5 medium (hereinafter referred to as “GF medium”) containing 1.0% glucose, 0.5% sodium formate and 0.67% yeast nitrogen base, and the acid phosphatase activity was measured.
  • GF medium pH 5.5 medium
  • the promoter region must be 194 bp (for example, containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 48) or more, preferably 839 bp (for example, It is necessary to have a promoter region of at least 194 bp (for example, containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 48), preferably 642 bp ( (For example, one containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 49)).
  • a promoter having a strong transcriptional activity for expressing a heterologous gene Terminator and Z or terminator are provided. By culturing a transformant transformed with an expression vector containing the promoter, the terminator and the heterologous gene of interest, a highly expressed heterologous gene product can be obtained.
  • ATTTTCTTAA CTTGAAAACT ATAATTGCTA TAACAATTCT TCAATTTCTC TTTTTCTTCC 60 TTTTTTTGAA GAATTTTTAA CAATCAAAAT TTTGACTCTT TGATTTCCCG CAATCTCTGA 120 GCTCAGCATA CTCATTATTA TTTTATTATTATTATTATTA TTACTTTTAT TATTATTATA 180 TTTTTTCTTC TTTAACGATA TCGTTTGTGT TTTATCTTTTTT ATGATTTAAA TTATACGA 240 ATTTATGAAT ACAACAAAAT ATTTAAGTTT ACACAATGTA GTAAATTAAA AGTTAATCAG 300 TAAAATGTAT TGTAAGTTAC ATATATCATA TATCAGTGTC TTGATATATA TAAAGAAAAC 360 GTTGCTTATG TAATCAGGCA CACGTTGACA GCGTGGTGCC CTGAACAGCA ACCGCAATTT 420 TGACCACGCA CGGGCGGTCT TATCTCCAGC
  • Lys lie Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Organism name Candida boidinii
  • GAAGAC CG CCGCCTCAAAGAA T AATTTTTTTTATTTCAATTC TGAGC
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Candida boidini i
  • GGT AAA TTT GAT TAC AGA CCA CAA GAT ATT ATC TTA TTA AAT GGT GAA 1056
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Candida boidini i
  • 3obsli VV3311 S3VV31V1 li1 31VV311lvv 31VV11 V 6 S / 96 ⁇ £ 01 / VV3V031 131 3v31V V31V3311V0V1VV1V111 1
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: single strand
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Candida boidini i
  • Organism name Candida boidini i
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Candida da boi nii (Cand i da bo i d i n i i)

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Description

明 細 書 カンジダ ' ボイジニイのギ酸脱水素酵素遺伝子のプロモーター/ターミネ一夕
技術分野
本発明は、 カンジダ ' ボイジニイ （Cand i da bo i d i n i i ) のギ酸脱水素酵素遺伝 子のプロモータ一及び/又はターミネータ一、 並びに該プロモーター、 異種遺伝 子及びターミネータ一を含む遺伝子発現カセッ ト、 該発現カセッ 卜を含むベクタ 一、 該発現ベクターを含有する形質転換細胞並びに該形質転換細胞を用いた有用 遺伝子産物の製造法に関する。 背景技術
メタノ一ル資化性酵母は、 メタノールを唯一の炭素源として生育することがで きる酵母である。 メ タノール資化性酵母におけるメタノール代謝は、 最初の反応 として、 アルコールォキシダーゼによりメタノールと酸素からホルムアルデヒ ド と過酸化水素を生成する。
生成した過酸化水素はカタラーゼにより水と酸素に分解される。 一方、 ホルム アルデヒ ドは、 ホルムアルデヒ ド脱水素酵素、 S-ホルミルグルタチオンヒ ドロラ —ゼ及びギ酸脱水素酵素の作用により、 二酸化炭素まで酸化され、 その際に生じ る NADHは細胞のエネルギー源として利用される。 それと同時に、 ホルムアルデヒ ドはジヒ ドロキシアセ トンシンターゼによりキシルロース- 5-リ ン酸と縮合し、 グリセルアルデヒ ド- 3-リ ン酸とジヒ ドロキシァセ 卜ンへと変換され、 その後べ ントースリ ン酸経路を経て菌体構成成分となる。
ここで挙げたアルコールォキシダーゼ、 ジヒ ドロキシアセ トンシンタ一ゼ及び ギ酸脱水素酵素は、 メタノール資化性酵母をメタノール存在化で培養すると、 著 量生産され、 菌体内可溶性蛋白質の約 40%に達する。
前述のごとく、 メタノ一ル資化性酵母は安価なメ夕ノールで大量培養が可能で あるうえに、 他の酵母にはみられない強力な転写活性を示すメ夕ノール代謝プロ モータ一を有するという点で、 異種遗伝子発現系として適した酵母であると考え れる。
カンジダ ' ボイジニイ （Candida boidinii) は、 メタノール資化性酵母の一種 である。 そして、 該酵母を利用して、 アルコールォキシダーゼ遺伝子 （A0D1) の 調節領域を用いた異種遺伝子の発現方法が研究されている （特開平 5-344895号公 報） 。
—方、 ギ酸脱水素酵素はアルコールォキシダ一ゼと同様に著量生産される酵素 である力^ 該酵素はメタノール代謝の下流に存在する酵素であり、 アルコールォ キシダ一ゼとは異なった発現制御を受けていると考えられる。 例えば、 本発明で 明らかにされたように、 アルコールォキシダーゼ発現を完全に抑制するグルコ一 ス存在下でも、 培養条件によっては誘導発現可能な酵素である。 それゆえ、 アル コールォキシダーゼプロモーターを用いた時とは異なつた異種遺伝子の大量発現 法の確立が可能であると考えられる。
しかしながら、 現在のところ、 Candida boidini iのギ酸脱水素酵素の発現制御 に関する知見は全く得られていない。 ギ酸脱水素酵素の発現制御の解明、 及び強 力な転写活性を用いた異種遺伝子の効率的発現の点から、 当該酵素のプロモー夕 一の提供が求められている。 発明の開示
本発明は、 異種遺伝子を発現させるのに強力な転写活性を有するプロモーター 及び Z又はターミネ一夕一、 並びに該プロモーター及びタ一ミネーターを含む発 現ベクター、 該発現べクタ一を含む形質転換体並びに該形質転換体を用いた異種 遺伝子発現産物の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 メタノール資化性酵母 Canidida boidini iが持つギ酸脱水素酵 素遺伝子の発現系を解明し、 異種遺伝子の効果的発現を達成すベく鋭意研究を行 なった結果、 異種遺伝子を発現させるのに強力な転写活性を有するプロモーター 及び Z又はターミネーターを見い出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 配列番号 1で表される塩基配列から選ばれる 190 b p以 上の連続的な塩基配列を実質的に含む、 カンジダ ' ボイジニイのギ酸脱水素酵素
_ 9 _ 遺伝子のプロモーターである。
さらに、 本発明は、 配列番号 1、 48、 49又は 50で表される塩基配列を実質的に 含む、 カンジダ · ボイジニイのギ酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターである。 さらに、 本発明は、 配列番号 2で表される塩基配列を実質的に含む、 カンジダ • ボイジニイのギ酸脱水素酵素遺伝子のターミネーターである。
ここで、 「塩基配列を実質的に含む」 とあるのは、 目的とするプロモーター及 び Z又はターミネータ一活性が得られる限り、 配列番号 1、 48、 49若しくは 50又 は 2で表される塩基配列に、 置換、 欠失又は挿入等の変異が生じてもよいことを 意味する。 例えば、 配列番号 1で表される塩基配列の第 3番目の 「C」 が 「G」 に置換されても、 本発明の目的とするプロモーター活性が得られる限り、 かかる 置換された配列も本発明に含まれることを意味する。
さらに、 本発明は、 前記プロモーター、 異種遺伝子及び前記ターミネータ一を 含む遺伝子発現カセッ トである。 本発明において、 「異種遺伝子」 とは、 発現の 対象となる遺伝子であり、 カンジダ ' ボイジニイ （Candi da bo i di ni i ) 由来のギ 酸脱水素酵素とは異なる任意の遺伝子を意味する。 異種遺伝子としては、 例えば 、 酸性フォスファターゼ遺伝子、 な一アミラーゼ遺伝子、 各種イ ンターフヱロン 遺伝子、 エリスロポエチン遺伝子、 顆粒球コロニー刺激因子遺伝子等が挙げられ る。 また、 いかなる手法によって得られるものでもよい。
さらに、 本発明は、 前記遺伝子発現カセッ トを含む組換え発現ベクターである さらに、 本発明は、 前記組換え発現ベクターによって形質転換された形質転換 体である。
さらに、 本発明は、 前記形質転換体を培地に培養し、 得られる培養物から異種 遺伝子の発現産物を採取することを特徴とする異種遺伝子の発現産物の製造方法 である。 ここで、 前記培地としては、 酸素原子又は窒素原子を有し、 かつ該原子 に結合する炭素数 1の置換基を少なく とも 1つ有する化合物を含むものが挙げら れる。 例えば、 前記酸素原子を有する化合物としてはメ タノール又はギ酸若しく はその塩が挙げられ、 窒素原子を有する化合物としてはメチルァミ ン、 ジメチル ァ ミ ン、 卜 リメチルァミ ン、 及びコリ ン等の N—置換メチルを有するアンモニゥ ム化合物からなる群から選ばれる少なく とも一種が挙げられる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明者らは上記課題を解決するために、 （1) カンジダ * ボイジニイ （Candid a boidinii) が有するギ酸脱水素酵素遺伝子 （以下 FDHと略称する場合がある） の塩基配列をそのプロモーター、 ターミネ一ターと共に解明し、 （2)プロモータ 一、 ターミネータ一を単離し、 （3)発現ベクターを構築した。 さらに（4)本発現べ クタ一を用いて形質転換細胞を作製し、 異種遺伝子を発現させた時、 Candida bo idinii由来のギ酸脱水素酵素と同様にその発現がメタノール等によって誘導され ることを確認し、 本発明を完成するに至った。
(1) ギ酸脱水素酵素遺伝子のクロ一ニング
本発明の遺伝子を取得するため、 まずギ酸脱水素酵素遺伝子のクローニングを 行う。 その出発材料としては、 酵母、 例えば Candida boidinii S2 AOU- 1株が例 示される。
本発明において、 クロ一ニング工程は、 公知の方法 （Molecular Cloning (198 9)， Methods in Enzymology 194 (1991)) に従って行なうことが出来る。
すなわち、 （a)上記酵母の全 DNAを抽出し、 当該 DNAに由来する DNA断片を組み 込んだ遺伝子導入用ベクターを宿主に導入して上記酵母の遺伝子ライブラリーを 作製する。 （b)ついで、 かかる遺伝子ライブラリ一から所望のクローンを選択し て、 当該クローンを増幅することにより上記のクローニング工程を実施すること が出来る。
(a) 上記酵母の遺伝子ライブラリ一の調製
上記酵母の全 DNAの抽出は、 例えば酵母のプロ トプラストを調製して、 当該プ 口 卜プラス トから、 通常公知の DNA抽出法、 高塩濃度下での細胞残さ除去後のァ ルコール沈殿法、 フヱノ一ルゃクロロホルム抽出後のアルコール沈殿法等の常法 を用いて行なうことが出来る。 なお、 上記の予めプロ トプラス トを調製する方法 の他に、 ガラスビーズ等による細胞破砕法等によっても DNAの抽出を行なうこと が出来るが、 高分子量の DNAを調製することが容易であるという点から上記プロ 卜プラス ト法を行なうのが好ましい。
得られた染色体 DNAを適当な制限酵素 （Sau3AI等） によって部分消化し、 適当 なベクターに連結した後、 適当な宿主に形質転換することによってゲノ ミ ツクラ イブラリーを得ることが出来る。 この際用いられるベクタ一としては、 通常公知 の遺伝子ライブラリー調製用ベクターとして知られる、 pBR系統、 pUC系統、 ブル ースクリブ卜（Blue Script)系統等の一般に市販されている入手可能なプラスミ ドを用いることも出来る。 また、 Charon系統や EMBL系統のファージベクター又は コスミ ド等も広く用いることが出来る。
調製した遺伝子ライブラリ一作製用ベクターで形質転換又は形質導入を行なう 宿主は、 上記ベクターの種類に応じたものを採用することが出来る。
(b) クローンの選択
上記遺伝子ライブラリ一から、 所望のギ酸脱水素酵素遺伝子を有するクローン をギ酸脱水素酵素遺伝子に特有の配列を含む標識プローブを用いてコロニー ·ハ イブリダィゼーション法、 プラーク 'ハイブリダィゼーション法等により選択し 、 得ることが出来る。 プローブに用いるギ酸脱水素酵素遺伝子に特有の配列は、 Candida boidini iから精製したギ酸脱水素酵素遺伝子のァミノ酸配列に対応する オリゴヌクレオチドを合成し、 Candida boidini iの染色体 DNAを铸型とする PCR ( PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989)) により所望する DN A断片を特異的に増幅し、 得ることが出来る。 なお、 合成したオリゴヌクレオチ ドをプローブとして用いてもよい。
上記方法により得られる所望の遺伝子の塩基配列の決定及び確認は、 例えばマ クサム · ギルバー 卜の化学修飾法 （Maxam- Gilbert, Methods in Bnzymology, 65 , 499 (1980))、 ジデォキシヌクレオチド鎖終結法（Messing, J. and Vieire, J. , Gene, 19， 269 (1982)) 又はこれらの自動化された変法等により行ない得る。 塩基配列が一旦決定されると、 その後は、 化学合成によって、 又は決定された 当該塩基配列から合成したプライマーを用いた P CRによって、 あるいは該塩基 配列を有する DN A断片をプローブとしてハイプリダイズさせることによって、 所望の遺伝子を得ることが出来る。
(2) プロモーター領域、 ターミネータ一領域の単離
プロモーター領域、 ターミネータ一領域を取り出すには、 制限酵素を用いて切 り出すことも可能でもあるが、 一般的に都合の良い制限酵素部位が適切な位置に 存在するとは限らない。 そこで、 コーディ ング領域の制限酵素部位からエン ド型
DNA 分解酵素によってプロモーターの方向に削って行き、 適当なところまで削れ たクローンを探す方法がある。 最近では予め制限酵素認識部位を末端に設けたプ ライマーを用い、 PCR で所望のプロモーター領域、 ターミネ一ター領域を增幅し 取得することが容易である。
また、 これらの領域を化学合成することも可能であるし、 一部の領域を化学合 成しクローン化した DNAと制限酵素部位を利用して半合成のプロモーターやター ミネーターを作製することも可能である。
配列番号 1にプロモーター配列を例示するが、 本質的に転写活性を坦持する配 列であればこの配列に限定されるものではなく、 欠失、 挿入、 置換、 付加などに よってその塩基配列を改変することが可能である。
なお、 塩基配列の改変は、 公知の突然変異導入法 （例えば宝酒造社の TAKARA L A PCR i n v i t ro Mu tagenes i s k i tを用いた方法） 等により行うことが出来る。 また、 本発明のプロモーターは、 配列番号 1で表される塩基配列から 190 bp以 上の連続する塩基配列を実質的に含むものであり、 Cand i da b i od i n i iのギ酸脱水 素酵素遺伝子の発現に関与するものである。 この場合、 配列番号 1で表される塩 基配列において連続する 190 bp以上の配列を含む限り、 5 ' 側又は 3 ' 側の一定 領域が欠失しても、 あるいは 5 ' 側及び 3 ' 側の両領域が欠失してもよい。 例え ば、 配列番号 1で表される塩基配列の 5 ' 側 （ 1〜836 番目） の領域を欠失させ ると、 配列番号 49で表される塩基配列 （642bp ) を実質的に含むプロモーターが 得られる。 同様に、 配列番号 1で表される塩基配列の 5 ' 側 （ 1〜600 番目） 及 び 3 ' 側 （901 〜1478番目） の領域を欠失させると、 300 bpの連铳する塩基配列 を実質的に含むプロモーターを得ることが出来る。
なお、 このようにプロモーター領域を広範囲に欠失させる場合は、 例えば、 巿 販のデレーンヨン用キッ ト （宝酒造社のキロシークェンス用デレーンヨンキッ 卜 ) を用いて、 P C Rにより調製するのが適当である。
(3) 発現ベクターの構築
本発明の発現ベクターは、 FDHプロモーター、 異種構造遺伝子、 FDHターミネ一 タ一、 マーカー遺伝子、 相同領域を適当なベクターに挿入することによって得ら れる。 そのため使用されるべクタ一としては、 前記 pBR系統、 pUC系統、 ブルース クリブト系統等の大腸菌プラスミ ドベクターが例示される。 発現ベクターの構成 成分をベクターに挿入することは、 後記実施例の記載を参照して、 あるいは慣用 の技術により当業者が容易に実施することが可能である。 選択マーカー遺伝子、 相同領域は当業者が容易に決めることが出来る。 マーカ遺伝子として、 G- 418等 の抗生物質耐性遺伝子、 URA3、 LEU2等の栄養要求性相捕遺伝子が例示される。
(4) 形質転換
当該酵母へのプラスミ ドの導入は、 酵母の形質転換に用いられてきた一般的な 方法を応用することが可能である。 すなわち、 プロ 卜プラスト法、 リチウム法、 エレク トロポレーション法、 およびそれらの変法が適用することが出来る。 本発 明の発現ベクターは宿主染色体 DNAに組み込まれ安定に存在させることが出来る o なお、 公知の方法 （Sakai , Y. e t al.，J. Bacter i ol . , 175, 3556(1993)) に従 い、 プラスミ ド状態で存在させることも可能である。
(5) 遺伝子発現産物の製造
次に、 遺伝子発現産物の製造方法について説明する。
本発明において、 遺伝子発現産物は、 上記のようにして得られた形質転換体を 培養し、 得られる培養物から遺伝子発現産物を精製することにより得られる。 上記培養培地には、 酸素原子又は窒素原子を有し、 かつ該原子に結合する炭素 数 1の置換基を少なく とも 1つ有する化合物を含むものを添加することが出来る 。 例えば、 酸素原子を有する化合物としてメタノール又はギ酸若しくはその塩を 添加することができ、 窒素原子を有する化合物としてメチルァミ ン、 ジメチルァ ミ ン、 トリメチルァミ ン、 及び Ν—置換メチルを有するアンモニゥ厶化合物 （例 えばコリン等） からなる群から選ばれる少なく とも一種を添加することが出来る 上記菌株を培養する培地において、 上記化合物によって誘導発現させるための 条件はそれぞれ以下の通りである。
メ夕ノールによって誘導発現させる際には炭素源としてメタノールを含む他、 酵母エキス、 卜リプトン、 肉エキス、 カザミノ酸、 アンモニゥム塩等の一種以上 の窒素源に、 リ ン酸、 ナトリウム、 カリウム、 マグネシウム、 カルシウム、 鉄、 銅、 マンガン、 コバルト等の無機塩類を添加し、 更に必要により各種ビタミ ン、 ヌクレオチド等の微量栄養素、 糖質原料を便宜添加したものが挙げられる。 ギ酸によって誘導発現させる際にはギ酸を含む他、 グルコース、 グリセロール 等の一種以上の炭素源と、 酵母エキス、 トリプトン、 肉エキス、 カザミノ酸、 ァ ンモニゥム塩等の一種以上の窒素源に、 リ ン酸、 ナトリウム、 カリウム、 マグネ シゥ厶、 カルシウム、 鉄、 銅、 マンガン、 コバルト等の無機塩類を添加し、 更に 必要により各種ビタ ミ ン、 ヌ ク レオチ ド等の微量栄養素、 糖質原料を便宜添加し たものが挙げられる。
メチルァミ ン、 ジメチルァミ ン、 卜 リメチルァミ ン又はコ リ ン等によって誘導 発現させる際には、 窒素源としてこれらの化合物を少なく とも一種含む他、 グル コース、 グリセロール等の一種以上の炭素源に、 リ ン酸、 ナ ト リウム、 カ リウム
、 マグネシウム、 カルシウム、 鉄、 銅、 マンガン、 コバルト等の無機塩類を添加 し、 更に必要により各種ビタミ ン、 ヌクレオチド等の微量栄養素、 糖質原料を便 宜添加したものが挙げられる。
培地の pHは、 5. 5〜6. 5に調整するのが適当である。 また、 培養温度は 25〜30°C 、 好ましくは 28°C前後である。 培養時間は、 24~ 1000時間程度であり、 培養は静 置、 振とう、 攪拌、 通気下の回分培養または連続培養等により実施することが出 来 O。
培養終了後、 該培養物より遺伝子産物を採取するには、 通常のタンパク質精製 手段等を用いて得ることが出来る。 例えば、 形質転換細胞内に生産された場合は 、 常法により菌体を超音波破壊処理、 磨砕処理、 加圧破砕等により遺伝子産物を 抽出する。 必要に応じてプロテアーゼ阻害剤を添加する。
又、 培養上清に生産された場合は、 培養液そのものを用いることが出来る。 そして、 この溶液を濾過、 遠心分離等を行い固形部分を除去し、 必要によりプ ロ トタミ ン処理等により核酸を除去する。
次いで、 これに硫安、 アルコール、 アセ トン等を添加して分画し、 沈殿物を採 取し、 粗タンパク質溶液を得る。 該タンパク質溶液を各種クロマ 卜グラフィ一、 電気泳動等にかけて精製酵素標品を得る。 例えば、 セフアデックス、 ウルトロゲ ル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過、 イオン交換体ク口マトグラフィー、 ポリアクリルアミ ドゲル等を用いる電気泳動法、 ァフィ二テイク口マトグラフィ 一、 逆相クロマトグラフィー等を用いる分画法を適宜選択し、 又はこれらを組合 わせることにより、 精製された目的の遺伝子産物を得ることが出来る。 しかし、 上記培養法、 精製法は一例であって、 これに限定されるものではない。
なお、 精製された遺伝子産物が有するアミノ酸配列の確認は、 公知のアミノ酸 分析、 例えばェドマン分解法による自動ァミノ酸配列決定法等により行うことが 出来る。 図面の簡単な説明
図 1は、 ギ酸脱水素酵素遺伝子を含むプラスミ ドの制限酵素地図を示した図で あ
図 2は、 PCRを用いたギ酸脱水素酵素遺伝子のプロモーター断片を含むプラス ミ ドの構築図である。
図 3は、 PCRを用いたギ酸脱水素酵素遣伝子のターミネーター断片を含むブラ スミ ドの構築図である。
図 4は、 ギ酸脱水素酵素遺伝子のプロモータ一及びターミネーターを利用した 発現プラスミ ド pFexAGの構築法を示した図である。
図 5は、 ァクチン遺伝子を含むプラスミ ドの制限酵素地図を示した図である。 図 6は、 PCRを用いたァクチン遺伝子のプロモーター及びターミネーター各断 片の取得法並びに当該プロモーター及びターミネーターを利用した発現プラスミ ドの構築法を示した図である。
図 7は、 ァクチン遺伝子のプロモータ一及びターミネーターを利用した G418耐 性遺伝子発現プラスミ ド pAcNEOlの構築法を示した図である。
図 8は、 プラスミ ド pAcNE02及び pAcNE03の構築法を示した図である。
図 9は、 プラスミ ド pPUFlの構築法を示した図である。
図 10は、 上流欠失型 FDHプロモーターにより支配される酸性フォスファターゼ 活性を示したものである。 なおプロモーター領域が欠失していないプラスミ ド pP UF1の形質転換体が示す酸性フォスファタ一ゼ活性を 100としたときの相対値を 示している。 また親株とはブラスミ ドを導入していない Cand i da bo i d i n i i ST25 15株の値である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例に限定されない。
〔実施例 1〕 Candida boidini iの FDH遗伝子のクローニング
Candida boidinii S2 AOU-1 (Tani, Y.et al. , Agri. Biol. C em. , 49, 2699( 1985)) よりギ酸脱水素酵素遺伝子の取得、 及びその塩基配列決定を行なった例 である。 なお、 当該株は Candida boidinii SAM1958と命名され、 工業技術院生命 工学工業技術研究所に、 受託番号： FERM BP-3766として 1992年 2月 25日に寄託さ れている。
(1-1) プローブの作製
Candida boidini iのギ酸脱水素酵素の N末端アミノ酸配列は、 ガスフェード . ペプチ ドシーケンサー model 120- A (アプライ ドバイオシステム社） によって、 配列番号 3で表される配列であると決定した。 また、 部分アミノ酸配列を岩松の 方法 （生化学， 63, 139(1990) に従い、 配列番号 4〜16のように決定した。 配列番号 3で表される N末端アミノ酸配列の第 8番目 （チロシン） から第 14番 目 （ァラニン） のアミノ酸に相当するオリゴヌクレオチド （FDH- NT1) 及び配列 番号 8で表されるアミノ酸配列の第 5番目 （グリシン） から第 12番目 （チロシン ) のァミ ノ酸配列に相当する以下のオリゴヌクレオチド （FDH- AP7) を、 394型 DN A/RNAシンセサイザー （アプライ ドバイオシステム社） を用いて合成した。
FDH-NT1 ： 配列番号 17
FDH-AP7 ： 配列番号 18
プライマー FDH- NT1及び FDH- AP7は、 5'末端に制限酵素 BamHI認識部位の塩基配 列 （配列番号 17及び 18の配列の第 4〜 9番目 ； GGATCC) を有する。 上記プライマ 一 FDH-NT1及び FDH- AP7と、 Cryerらの方法 （Cryer, D. et. al. , Methods Cell B iol. , 12, 39 (1975)) にもとづいて調製した Candida boidini iの染色体 DNAとを 混合し、 rTaq ポリメラーゼ （宝酒造社） を用いた PCR反応を行なった。 PCRは、 95°Cで 1分、 58°Cで 1分及び 72°Cで 3分の反応を 1サイクルとしてこれを 30サイ クル ί亍つた。
増幅された約 900bpの DNA断片を BamHI切断した後、 pBluescript I1.SK+にクロ 一二ングした。 ダイブライマーサイクルシーケンスキッ ト （パーキンエルマ—社
) を用いて両方方向から塩基配列を決定したところ、 プライマーに用いたァミ ノ 酸配列と一致し、 FDH遺伝子の一部を増幅したことが確認された。
(1-2) ライブラリーの作製及びスクリーニング
Candida boidini iの染色体 DNAを種々の制限酵素で切断した後、 前記 (1-1) で 得られた DNA断片をプローブとしたサザンハイプリダイゼーションを行なった。 プローブの放射性標識はメガプライマー DNAラベリングシステム （アマシャム社 ) を用いて行ない、 ハイブリダィゼーシヨ ンは、 常法 （Molecular cloning 2nd edn. , ed. Sambrook, J.， et al. , Cold Spring Harbor Laboratory U.S. A.，1989 ) に従って行なった。
その結果、 約 3kbの EcoRI断片、 約 5kbの Hind 111断片にシグナルが認められた 。 そこで、 これら DNA断片をクローニングするため、 ライブラリーを作製した。
Candida boidini iの染色体 DNAを Hind 111で切断し、 ァガロース電気泳動後、 5 kb付近の DNA断片をゲルから回収した。 回収した DNA断片を pBluescript II SK+の Hind III切断部位に挿入し、 Hind IIIプラスミ ドライブラリーを作製した。 同様 にして EcoRIプラスミ ドライブラリ一を作製した。
これらライブラリーをコロニーハイブリダイゼ一シヨンによりスクリーニング した。 オートラジオグラフィ一によって、 Hind IIIプラスミ ドライブラリーから pFDK EcoRIプラスミ ドライブラリーから pFD3を保持するクローンが陽性クロー ンとして選抜された。
(1-3) サブクローニング
プラスミ ド pFDl及び pFD3の制限酵素地図を作製した （図 1 ) 。 サザンハイプリ ダイゼーシヨ ンによる解析の結果、 図 1の HincIIから Xba I (Hindi, Xba I は 四角で囲んで示している） までの約 3.6kbの領域に FDH遺伝子があると考えられ た。 塩基配列決定のため、 pFDlの 2kbの HincH-Hindlll断片、 pFD3の 2.5kbの EcoR I - Xbal断片をそれぞれ pBluescript II SK-に揷入し、 PFdH2、 pFdEXを作製した (図 1 ) 。 ( 1-4) 塩基配列決定
前記 （1-3) で作製したプラスミ ド pFdH2、 pFdEXからキロシーケンス用デレー シヨンキッ ト （宝酒造社） を用いて種々の欠失変異プラスミ ドを作製した。 これ らのプラスミ ドを铸型としてダイプライマーサイクルシーケンスキッ ト及びダイ ターミーネーターサイクルシーケンスキッ ト （パーキンエルマ一社） を用いて塩 基配列を決定した。 決定したブラスミ ド pFdH2、 pFdH2の塩基配列をつなぎ合わせ ることにより、 図 1の約 3. 6kbの Hi nc I l - Xba I領域の全塩基配列が決定された (配列番号 19) 。
配列番号 19の塩基配列には、 1479番目の ATGから始まり、 2573番目の TAAで終わ る 1， 095塩基対からなるオープンリ一ディ ングフレームが存在する。 このオーブ ンリーディ ングフレーム （配列番号 20) が目的のギ酸脱水素酵素遺伝子であるこ とは、 以下の点で明らかである。
i )塩基配列から推定されるアミノ酸配列が、 精製酵素の部分ァミノ酸配列と一 致する （配列番号 20の配列中、 第 〜 45番目、 第 56〜76番目、 第 86〜103番目、 第 189〜201番目、 第 206〜236番目、 第 241〜246番目、 第 291~326番目及び第 328 〜356番目のァミノ酸配列） 。
i i ) SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により推定される酵素の分子量 （41k Da) が、 塩基配列から計算される分子量 （40, 368) と一致する。
i i i )塩基配列から推定されるアミノ酸配列が、 メタノ一ル資化性酵母ハンセヌ ラ · ポリモルファ （Hansenu la po l ymorpha) のギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列 （ EP00299108, 18-JAN-1989) と 82%の相同性を示す。 なお、 5'側上流 （プロモー 夕一領域） 及び 3'側上流 （ターミネータ一領域） の塩基配列には、 上述の Hansen u la po l ymorphaのそれらとの相同性は全く認められなかった。
〔実施例 2〕 異種遺伝子発現カセッ 卜の作製
(2-1) プロ一モーター、 ターミネータ一領域の単離
ギ酸脱水素酵素遺伝子のプロモーター領域、 ターミネーター領域の単離は翻訳 開始コ ドン ATGの前、 及び終止コ ドン TAAの後に適当な制限酵素切断部位を設ける ことによって行なった。 制限酵素部位の導入は図 4に示した PCRを用いた。 PCRの プライマーとして以下に示す 4種類のォリゴヌクレオチドを合成した。
PfdhP5 : 配列番号 21
PfdhP3 : 配列番号 22
PfdhT5 : 配列番号 23
Pf dhT3 : 配列番号 24
PfdhP3は、 FDHプロモーターの 3'末端と同一の塩基配列を含み、 5'末端に No t 1 制限酵素切断部位 （配列番号 22中、 第 1〜8番目の配列） を有する。 Pf dhT5は、 FDHターミネータ一の 5'末端と同一の塩基配列を含み、 5'末端に Not 1、 Sma 1制 限酵素切断部位 （配列番号 23中、 第 1〜14番目の配列） を有する。 PfdhP5は、 FD Hプロモーターの途中に存在する Acc I制限酵素切断部位 （配列番号 21中、 第 5〜 10番目の配列） を有し、 PfdhT3は、 FDHターミネータ一の途中に存在する Sac 1制 限酵素切断部位 （配列番号 24中、 第 13〜18番目の配列） を有する。
FDHプロモータ一領域を含むプラスミ ド pFdH2と、 プライマ一 Pf dhP5及び PfdhP3 とを混合し、 Ex Taqポリメラーゼ （宝酒造社） を用いた PCR反応を行なった （ （ 94°Cで 1分、 57。Cで 1分、 72°Cで 1分） X 25サイクル） 。
増幅した DNAは FDHプ口モータ一領域の Acc I制限酵素切断部位より下流領域 を含み、 3'末端に No t I制限酵素切断部位を有する。 反応生成物をァガロースゲル 電気泳動し、 増幅 DNA断片を回収した。 回収した DNA断片とベクター pT7 Bl ue T -Vector (ノバジユン社） を結合し、 pFPlを作製した。
同様に、 FDHターミネータ一領域を含むプラスミ ド pFdEXと、 プライマー Pfdh T5及び Pf dhT3とを混合して PCR反応 （ （94°Cで 1分、 57°Cで 1分、 72°Cで 1分） X 25サイクル） を行ない、 FHDターミネータ一領域の Sac 1制限酵素切断部位よ り上流領域を含み、 5'末端に No t I、 Sma I制限酵素切断部位を有する DNA断片 を増幅し、 この DNA断片と、 pT7 Blue T-Vectorを結合した pFTlを作製した。
これらのプラスミ ドを铸型として、 ダイプライマーサイクルシーケンスキッ 卜 及びダイターミネーターサイクルシーケンスキッ 卜を用いて塩基配列を決定し、 目的領域が正確に増幅されていることを確認した。 プラスミ ド pFPlを Acc I - o t Iで切断した後、 ァガロース電気泳動で 0, 5kbの DNA断片を分離した。 また、 ブラ スミ ド pFdH2を Xho 卜 Acc 1で切断することにより、 Acc 1より上流の FDHプロモー 夕一領域を含む 1 kbの DNA断片を分離した （図 2) 。 この 2種類の DNA断片を pBlu escript II SK-の Xho 卜 Not 1間に挿入し、 FDHプロモータ一領域を有する pFdhP を作製した （図 2 ) 。 同様に、 プラスミ ド pFTlの 0.15kbの Not ！ -Sac 1断片と、 プラスミ ド pFdEXの 0.85kbの Sac I-Xba 1断片とを pBluescript II SK-の Not I-Xb a I間に挿入し、 FDHタ一ミネ一ター領域を有する pFdhTを作製した （図 3 ) 。
次に、 プラスミ ド pFdhPを Xho I-Not Iで切断し、 得られた FDHプロモータ一領 域の DNA断片と、 プラスミ ド pFdhTを Not 1-Xba Iで切断し、 得られた FDH夕一ミネ 一ター領域の DNA断片とを pBluescript II KS+の Xho I-Xba 1間に挿入し、 pFdhPT を作製した （図 4 ) 。 pFdhPTは、 FDH遺伝子のプロモーター及びターミネータ一 領域を持ち、 プロモーターとターミネータ一との間の Not I及び Sma I部位に種々 の構造遺伝子 （異種遺伝子） を挿入することができるものである （図 4 ) 。
〔実施例 3〕 マーカー遺伝子及び相同領域の作製
マーカ一遗伝子として、 Candida boidini iのァクチン遣伝子のプロモーター及 びターミネーターで発現させた G418耐性遺伝子を用い、 相同領域としてァクチン 遗伝子領域を用いた。
(3-1) Candida boidini iのァクチン遺伝子の単離
(3-1-1) Candida boidini iのゲノム DNAライブラリーの作製
YPD培地 （酵母エキス 1 %、 ペプトン 2 %、 グルコース 2 %、 pH6.0) で培養し た Candida boidini i ATCC48180株の菌体より、 酢酸カリウム法 （Methods Enzymo 1.， 65， 404 (1980)) に基づき染色体 DNAを調製した。
Frischaufらの力法 (Methods in Enzymology, 152, 183， Academic press 198 7) に従い、 染色体 DNAを制限酵素 Sau3AIを用いて部分分解し、 10〜40%ショ糖密 度勾配遠心分離を行なつて 15~20kb画分の DNAを調製した。
ベクター DNAとして PUC118を用いた。 pUC118は制限酵素 BamHI切断の後、 アル力 リフォスファターゼで処理した。
100ngの Sau3Alで部分分解した Candida boidini i ATCC48180株の染色体 DNA断片 と、 50ngの BamHI切断した pUC118とを混合した後、 DNAライゲーシヨ ンキッ ト （宝 酒造社製） を用いて 16°C、 30分間の反応により連結した。 Hanahanの方法 （Gene, 10, 63 (1980)) に基づき、 形質転換細胞として調製し た大腸菌 DH5a株に上記組換えプラスミ ドを形質転換したところ、 約 20 000個の 形質転換体が得られた。
(3-1-2) ァクチン遗伝子の単離
Candida boidini iァクチン遺伝子は、 放射性同位元素で標識した相同的なサッ カロミセス ·セレヒシェ (Saccharomyces cerevisiae) のァクチン遺伝子との イブリダイズにより単離された。
Saccharomyces cerevisiaeのァクチン遺伝子の調製には PCR法を用いた。 既知 の Saccharomyces cerevisiaeのァクチン遺伝子 (Gal lwi tz, D. , Sures, I. , Pro c.Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 2546 (1980)) の塩基配列に従って、 PCR法のプ ライマ一として下記の 2種類のォリゴヌクレオチドを、 394型 DNA/RNAシンセサイ ザ一 （アプライ ドバイオシステム社） を用いて合成した。
PScACl ：配列番号 25
PScAC2：配列番号 26
プライマー PScACl PScAC2は、 それぞれ Saccharomyces cerevisiaeのァクチン 遺伝子のェクソン 2領域の N末端側、 C末端側のアミノ酸配列に相当する塩基配列 乙"のる。
Saccharomyces cerevisiae S288C株から調製された染色体 DNAと、 プライマー P ScACl及び PScAC2とを混合し、 PCR反応を行なった （ （94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 2分） X 25サイクル） 。
反応生成物をァガロースゲル電気泳動し、 増幅された DNA断片を回収した。 この DNA断片をメガプライマー DNAラベリ ングシステム （アマシャム社） を用いて32 Pで放射性標識した。
イブ'リダィゼーシヨンは、 常法 (Molecular cloning 2nd edn. , ed. Sambroo k J. et al. , Cold Spring Harbor Laboratory U.S.A. 1989) に従い、 65°Cで 16時間行ない、 フィルターを 0.1%SDSを含む 2 xSSPE緩衝液で 2回、 0.1%SDSを 含む 1 XSSPE緩衝液で 1回洗浄した後、 オートラジオグラフィ一によつて陽性ク ローンを検出した。
得られた 4個の陽性クローンによりアルカリ抽出法 （Molecular cloning 2nd edn. , ed. Sambrook, J., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory U.S. A. , 1989 ) に従って、 プラスミ ド DNAを単離した。 得られたプラスミ ド DNA、 及び Candida boidini i ATCC48180株の染色体 DNAを種々の制限酵素で切断し、 サザンハイブリ ダイゼーションを行い、 ハイプリダイズしたバンドの大きさを比較したところ、 ブラスミ ド pAclを有するク口一ンがァクチン遺伝子領域を含むものと考えられた
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(3-1-3) サブクローニング
ァクチン遺伝子の制限酵素地図を作製するために、 プラスミ ド pAclを制限酵素 Kpn し Sma 1切断し、 約 6 kbのァクチン遺伝子を担持する断片を pBluescript II KS+の Kpn I、 Sma I部位に挿入したプラスミ ド pAc卜 7を作製した。 この pAcl- 7に ついて更に詳細な制限酵素地図を作製した （図 5参照） 。
サザンハイブリダィゼーシヨンによって解析したところ、 約 5kbの Kpn 卜 Cla 1領域にァクチン遺伝子があると考えられた。 塩基配列決定のため、 更にサブク ローニングを行なった。 まず、 pAcl-7を Kpn I-Hind 111切断し、 約 3.4kbの断片 を抽出し、 T4 DNAポリメラーゼで平滑化した後、 pBluescript II KS+の Sma 1部 位に挿入した pAcl- 7-10、 及び方向が逆向きに挿入された pAcl- 7-17を作製した。 次に、 pAcl- 7を制限酵素 Cla 1で切断して得られた約 2 kbの断片を pBluescript I 1 KS+の Cla 1部位に揷入したプラスミ ド pAcl- 7/Claを作製した （図 5 ) 。
(3-1-4) 塩基配列決定
プラスミ ド pAcl- 7- 10、 pAcl-7-17, 及び pAcl-7/Claからキロシーケンス用デレ —シヨンキッ ト （宝酒造社） を用いて種々の欠失変異プラスミ ドを作製した。 こ れらのプラスミ ドを铸型としてダイプライマーサイクルシーケンスキッ ト （パー キンエルマ一社） を用いて塩基配列を決定した。 決定したプラスミ ド pAc卜 7- 10 、 pAcl- 7/Claの塩基配列をつなぎ合わせることにより、 図 5の約 5kbの Kpn t— C1 a I領域の全塩基配列が決定された （配列番号 27) 。
この配列から、 ァクチン遺伝子のコーディ ング領域を決定した。 TimeSaver cD A Synthesis Kit、 Directional Cloning Toolbox (フアルマシア社） を用いて 、 Candida boidini i ATCC48180株より、 mRNAの 5'末端の EcoRl突出末端、 3'末端 に Notl突出末端を有する cDNAを合成した。 合成した cDNAは、 Phagemid Direction
一 l 6 — al Cloning Vector (フアルマシア社） を用いて、 プラスミ ド pT7T3Dの EcoRI - No tl部位に結合し、 これを cDNAライブラリ一とした。 Saccharomyces cerevisiaeの ァクチン遺伝子と高い相同性を示した配列番号 27の 2858bpから 3558bpの領域の塩 基配列からオリゴヌクレオチドプライマ一 PCBA (：、 ベクター pT7T3Dの EcoRI部位 上流の塩基配列からォリゴヌクレオチドプライマ一 PT7T3を合成した。
PCBAC ： (配列番号 36)
PT7T3 ： (配列番号 37)
上記 cDNAライブラリ一とプライマー PCBAC及び PT7T3を混合し、 rTaqポリメラ ーゼ （宝酒造社） を用いた PCR反応を行なった （ （94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72 °Cで 30秒） X25サイクル） 。
反応生成物をァガロースゲル電気泳動し、 増幅 DMA断片を回収した。 回収した DNA断片とベクター pT7 Blue T- Vectorを結合した。 これらのプラスミ ドを铸型 として、 ダイプライマ一サイクルシーケンスキッ 卜を用いて塩基配列を決定した 。 もっとも長いクローンの塩基配列は配列番号 27の 1922番目から開始し、 1974番 目から 2508番目の領域と 2524番目から 2853番目の領域を欠いていた。 欠いている 領域はィントロンであり、 cDNAにおいて最初に現れる ATGの配列 （配列番号 27の 1965番目） が開始コ ドンであると考えられた。 推定される遺伝子産物のアミ ノ酸 酉己列について Saccharomyces cerevisiaeのァクチン遺伝子とのホモ口ジーを調べ た結果、 互いに 96%のホモロジ一を示したことから、 取得した遺伝子が Candida boidiniiのァクチン遺伝子であり、 またコーディ ング領域は、 1965番目の塩基配 列から始まることを断定した。
(3-2) 優性マーカー遺伝子発現カセッ 卜の作製
(3-2-1) プロ一モーター、 ターミネータ一領域の単離
ァクチン遺伝子のプロモーター領域、 ターミネータ領域の単離は PCR法を用い た （図 6 ) 。 プロモーター領域として翻訳開始コ ドン ATG上流約 1 kb、 ターミネ 一夕領域として終止コ ドン TAAの下流約 0.5kbを增幅するために、 以下に示す 4種 類のオリゴヌクレオチドを合成した。
PP5 ： 配列番号 28 PP3 ： 配列番号 29
PT5 ： 配列番号 30
PT3 ： 配列番号 31
PP5及び PP3は、 それぞれプロモーター領域の 5'末端及び 3'末端の塩基配列を含 み、 それぞれのオリゴヌクレオチドの 5'末端に、 PP5については制限酵素 EcoRI認 識部位 （配列番号 28の第 3〜8番目の配列） 、 PP3については Sail認識部位の塩 基配列 （配列番号 29の第 5〜10番目の配列） を有する。 PT5及び PT3は、 それぞれ ターミネータ—領域の 5'末端、 3'末端の塩基配列を含み、 それぞれのオリゴヌク レオチドの 5'末端に、 PT5については制限酵素 Sailと Pstlの認識部位の塩基配列 (配列番号 30の第 1〜12番目の配列） 、 PT3については Hindlllと Pstlの認識部位 の塩基配列 （配列番号 31の第 1〜12番目の配列） を有する。
ァクチン遺伝子を有するプラスミ ド pAcl-7と、 プライマー PP5及び PP3とを混合 し、 rTaqポリメラーゼ （宝酒造社） を用いた PCR反応を行なった （ （94°Cで 30秒 、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分） X 25サイクル） 。
反応生成物をァガロースゲル電気泳動し、 増幅 DNA断片を回収した。 回収した DNA断片とベクター pT7 Blue T- Vector (ノバジヱン社） を結合し、 ァクチン遺 伝子のプロモーター領域を含んでいる pAcPを作製した （図 6 ) 。 同様に、 PT5及 び PT3を用いた PCR反応 （ （94°Cで 30秒、 45°Cで 1分、 72°Cで 1分） X25サイク ル） によりァクチン遺伝子のターミネータ一領域を含んでいる pAcTを作製した （ 図 6 ) 。
これらのプラスミ ドを铸型として、 ダイプライマーサイクルシーケンスキッ ト 及びダイターミネータ一サイクルシーケンスキッ ト （パーキンエルマ一社） を用 いて塩基配列を決定し、 プロ一モーター及びターミネーター領域が正確に増幅さ れていることを確認した。
(3-2-2) 発現カセッ 卜の作製
プラスミ ド pAcPを EcoR卜 Sailで切断した後、 ァガロース電気泳動で 1. Okbのァ クチン遺伝子プロモーター領域を分離した。 同様に、 プラスミ ド pAcTを Sal卜 Hin dillで切断することにより 0.5kbのァクチン遺伝子ターミネーター領域を分離し た。 この 2種類の DNA断片を pUC118の EcoR卜 Hindlll間に挿入し、 pMAcを作製した (図 6 ) 。
プラスミ ド pMAcは、 pUC118の EcoR卜 Hindlll間にァクチン遺伝子のプロモータ 一及びターミネーター領域を持ち、 プロモーターとターミネーターとの間の Sail 及び Pstl部位に種々の構造遺伝子を挿入することが出来るものである。
(3-2-3) G418耐性遺伝子発現プラスミ ドの作製
ァクチン遺伝子のプロモーターとターミネーターとの間に G418耐性遺伝子を揷 入した発現プラスミ ドを構築した。 トランスポゾン Tn5由来の G418耐性遺伝子は 、 プラスミ ド ρΝΕΟ (フアルマシア社） より PCR法を用いて取得した。 Jorgensenら (Jorgensen, R. A. et al. , Mol. Gen. Genet. 177, 65(1979)) の報告に基づい て、 下に示す 2種類のプライマーを合成した。
PGR5：配列番号 32
PGR3：配列番号 33
これらのプライマーと pNEOを混合し、 rTaqポリメラ一ゼを用いた PCR反応を行 なった （ （94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分） X25サイクル） 。
反応生成物をァガロースゲル電気泳動し、 増幅 DNA断片を回収した。 回収した DNA断片とベクター pT7 Blue T- Vectorとを結合し、 プラスミ ド pTA- NE0を作製し た （図 7 ) 。 プラスミ ド pTA- NE0を Ndel-Smalで切断し、 T4ポリメラーゼで平滑化 した後、 ァガロース電気泳動で G418耐性遣伝子 DNA断片を回収した。 この G418耐 性遺伝子 DNA断片と、 SaH-Pstlで切断し、 T4 DNAポリメラーゼで平滑化した p MAcとを結合し、 pAcNEOlを作製した （図 7 ) 。
〔実施例 4〕 FDHプロモーターによる異種遣伝子の発現
本実施例は、 Candida boidinii S2 AOU- 1株由来のギ酸脱水素酵素 （FDH) のプ ロモ一ター、 ターミネータ一部分を禾 'J用した Saccharomyces cerevi siae由来の酸 性フォスファタ一ゼ遺伝子の発現ベクターを作製し、 Candida boidiniiに形質転 換した例である。
(4-1) 発現カセッ 卜の作製
マーカ一遺伝子を G418耐性遺伝子、 相同領域をァクチン遺伝子領域とした FDH プロモーターで異種遺伝子を発現させるプラスミ ドを作製した。 pAcNEOlから G41 8耐性遺伝子を含む DNA断片を EcoRl切断により分離し、 pUC118の EcoRI部位に揷入 してプラスミ ド pAcNE02を作製した （図 8) 。 ァクチン遗伝子を有するプラスミ ド pAcl-7から Clalで 2 kbの DNA断片を分離し、 T4ポリメラーゼで平滑化した後、 プラスミ ド pAcNE02の Smal部位に揷入して pAcNE03を作製した （図 8 ) 。
pFdhPTから FDHプロモーター及びターミネーター領域を含む 2.6kbの DNA断片を 分離し、 pAcNE03 の Sal I-Xba I間に挿入して pFexAGを作製した （図 4 ) 。
(4-2) 酸性フォスファターゼ発現プラスミ ドの作製
上記プラスミ ド pFexAGの FDHプロモーターとターミネーターとの間に Saccharom yces cerevisiae由来の酸性フォスファターゼ遺伝子 （PH05遺伝子） を導入した プラスミ ドを作製した。
PH05構造遺伝子は Arimaらの報告 （Arima, K. et al. , Nucleic Acids Res.， 1 1, 1657(1983)) に基づいて PCRにて取得した。 PCRのプライマーとして以下の 2 種類のォリゴヌクレオチドを合成した。
PPH05 ： 配列番号 34
PPH03 ： 配列番号 35
PPH05は、 PH05遺伝子の開始コ ドンの前に Not 1制限酵素切断部位 （配列番号 34 中、 第 1〜第 8番目の配列） を有し、 PPH03は、 PH05遺伝子の終止コ ドンの後に S ma 1制限酵素切断部位 （配列番号 35中、 第 1〜第 6番目の配列） を有している。
Saccharomyces cerevisiae S288C株から調製された染色体 DNAと、 プライマー P PH05及び PPH03とを混合し、 PCRを行なった （ （94°Cで 30秒、 53°Cで 1分、 72°Cで 2分） X 25サイクル） 。
反応生成物をァガロースゲル電気泳動し、 増幅 DNA断片を回収した。 回収した DNA断片とベクタ一 pT7 Blue T_Vectorとを結合し、 プラスミ ド pTA-PH05を作製 した。 プラスミ ド PTA-PH05を Not 卜 Smalで切断し、 PH05遺伝子 DNA断片を回収し た。 この PH05遺伝子 DNA断片をプラスミ ド pFexAGの Not I-Sma I間に挿入し、 pF PhoAGを作製した。
(4-3) 形質転換
Candida boidinii ATCC 48180株を Bgl 11で切断したプラスミ ド pFPhoAGで形質 転換し、 G418耐性を示す形質転換細胞を取得した。 形質転換法は Sakaiによって 詳しく開示されている方法 （Sakai Y. et al.， J. Bacteriol. , 175, 3556(1993 )) に従った。
形質転換細胞を、 宿主細胞では生育することのできない 0.3mg/mlの G418を含む YPD平板培地で選抜した。
(4-4) PH05遺伝子の発現確認
形質転換細胞の内の 1株 （300-1) 株及び親株 （ATCC48180株） を、 炭素源とし てメタノール又はグルコースを添加した培地で培養し、 菌体量及び酸性フォスフ ァターゼ活性を測定した。
メタノール酵母の培養は、 炭素源 1.5%、 Yeast Nitrigen Base (ディフコ社） 0 .67%、 Yeast Extract (ディフコ社） 0.5%を含む pH5.5の培地を用いた。 また、 酸性フォスファターゼ活性の測定法は、 Toh- eらの方法 （Toh- e， A. et al. , J. Bacteriol. , 113, 727 (1973)) に従い、 洗浄菌体懸濁液をそのまま酵素として 用いた。 1単位の酵素活性は、 30°Cで 1分間に linmoleの p-ニ トロフヱノールを生 成する酵素量とした。
表 1に示す通り、 親株及びグルコースで培養した形質転換細胞では活性は検出 されなかったが、 メタノールで培養した形質転換細胞から活性が検出された。 こ のことは、 Candida boidini iのギ酸脱水素酵素と同様に、 PH05遺伝子の発現がメ タノ一ルによって誘導されることを示している。
表 1. 親株及び形質転換株の酸性フォスファターゼ活性 炭 茶 源 菌体量 培養液 1 mlの活性
(OD610) (unit) 親 株 グルコース（1.5¾， w/v) 10.7 検出されず
メタノール（1.5¾, v/v) 5.9 検出されず 形質転換株 グルコース（1.5¾， w/v) 10.6 検出されず
メタノール（1.5¾， v/v) 5.9 0.70 上述の形質転換細胞 300- 1株を、 炭素源としてグルコース、 エタノール、 メタ ノールまたはグリセロールを添加した培地で培養し、 菌体量及び酸性フォスファ ターゼ活性を測定した。 表 2に示す通り、 PH05遺伝子はメタノールによってのみ 強力に誘導されていた。 表 2. 形質転換株の酸性フォスファターゼ遣伝子発現に対する炭素源の効果
Figure imgf000024_0001
また形質転換細胞 300- 1株を、 0.17%の Yeast Nitrogen Base w/o amino acid s and ammonium sulfate (ディフコ社） 並びに表 3に示す炭素源及び窒素源を含 む培地で培養し、 酸性フォスファターゼ活性を測定した。 炭素源としてメタノー ル、 窒素源として硫酸アンモニゥムで培養したときの酸性フォスファターゼ比活 性 （ュニッ 卜 Z0D610) を 100としたときの比活性を表 3に示す。 酸性フォスフ ァタ一ゼの誘導発現はメタノールのみならず、 ギ酸、 メチルァミ ン、 ジメチルァ ミ ン、 トリメチルァミ ン、 コリ ンによっても誘導されていた。 ギ酸、 メチルアミ ン、 ジメチルァミ ン、 ト リ メチルァミ ン、 コリ ンは培地中にグルコースが存在し ていても、 誘導効果を示した。 このことから、 ギ酸脱水素酵素遺伝子プロモータ 一は、 グルコースによつて完全に抑制されるアルコールォキシダ一ゼ遺伝子プ口 モーターとは異なつた制御をうけていることが示された。 表 3. 形質 換株の,フォスファタ一ゼ遺伝子発現に対する炭素源、 窒素源の効果 培 地 PH05活性 メタノール (1,5%, w/v) + Sf¾アンモニゥ厶（0.5%, w/v) 100
グルコース（1.5%. w/v) 丄 硫酸アンモニゥム (0.5%, w/v) 検出されず グリセロール（1.5%, w/v) 一 硫酸アンモニゥム（0.5%. w/v) 検出されず グルコース（1.5%. w/v) + ギ ナトリウム（0.5%, w/v) 8.7
+ 硫酸アンモニゥム（0.5%, w/v)
グリセロール（1.5%, w/v) τ ギ酸ナトリウム（0.5%. w/v) 21
+ 赚アンモニゥム (0.5%. w/v)
グルコース（1.5%, w/v) + 塩酸メチルァミ ン（0.5%, w/v) 4.8 グリセロール（1.5%, w/v) 塩酸メチルァミン（0.5%, w/v) 23
グルコース（1.5%, w/v) + 塩酸ジメチルァミン（0.5%, w八） 7.0 グリセロール（1.5%, w/v) ÷ 塩酸ジメチルァミン（0.5%, w/v) 29
グルコース（1.5%, w/v) + ^卜リメチルァミ ン（0.5%, w/v) 6.5 グリセロール（1.5%, w/v) ÷ 塩酸卜リメチルァミン（0.5%. w/v) 32
グルコース（1.5%， w/v) ÷ 塩化コリン（0·5%， w/v) 20
グリセロール（1.5%, w/v) ÷ 塩化コリン（0.5%. w/v) 49
(4-5)
Candida boidinii IFO 10035、 Candida boidini i IFO 10240、 Candida boidin ii IFO 10574について、 Bgl 11で切断したプラスミ ド pFPhoAGで形質転換し、 G4 18耐性を示す形質転換細胞を取得した。 それぞれの形質転換細胞をメタノールま たはゴルコースを炭素源として添加した培地で培養し、 酸性フォスファターゼ活 性を測定したところ、 実施例 （4-4) の結果と同様に、 メタノールで培養した形 質転換細胞のみから酸性フォスファターゼ活性が検出された。 このことは本発明 で開示されたギ酸脱水素酵素プ口モーターはあらゆる Cand ida bo i d i n i i株で機能 することを示している。 〔実施例 5〕
本実施例は、 上流領域を欠失した Candida boidini i FDHプロモーターを作製し 、 上流欠失型 FDHプロモーターにより支配される酸性フォスファターゼ活性を測 定することにより FDHプロモーターの機能に必要な領域を同定した例である。
(5-1) 発現プラスミ ドの作製
Candida boidini i S2 AOU-1 由来のプロモーターを含む発現プラスミ ドを構築 するため、 まず、 土壌より単離した Candida boidini i KST25株より、 URA3遺伝子 及び URA3遺伝子の変異株である KST2515株を取得した。
取得した URA3遺伝子の 2.6kbの Sal I-Pst 1断片を pBluescript II SK-に有し ているプラスミ ドを pCBU3と命名した。 KST25株の同定は Barnettの 「YEASTS: Characteristics and identi f icationj に基づいた。 URA3遺伝子及び KST2515株 の取得は公知の方法 (Sakai Y. et al. , J. Bacteriol. , 173， 7458(1991)) に 従った。 なお、 本実施例では Candida boidini i KST2515株を用いている力く、 他の Candida boidini i株、 例えば IFO 10035株を用いても、 公知の方法に従えば容易 に実施可能である。
プラスミ ド pFdhPを Kpn 卜 Not 1で切断して得られた 1.5kbの DNA断片と、 pF PhoAGを Not I- Eco T22Iで切断して得られた 2. Okbの DNA断片と、 pCBU3を Sal I-Pst iで切断して得られた 2.6kbの DNA断片とを、 pUC19の Κρπ 卜 Sal 1間に 挿入し、 pPUFlを作製した （図 9) 。 pPUFlは、 マーカー遺伝子を URA3遺伝子と する、 FDHプロモータ一による PH05発現プラスミ ドである。
(5-2) 上流欠失型 FDHプロモーターにより支配される PH05発現プラスミ ドの 上流領域を欠失した FDHプロモーターは、 キロシークェンス用デレーンョンキ ッ ト （宝酒造社） 及び PCRにて作製した。 プラスミ ド pPUFlを Apa I-Xho 1で切 断し、 キロシークェンス用デレーンヨンキッ 卜を用いて処理し、 上流欠失型 FDH プロモーターにより支配される PH05発現プラスミ ド pPUF15、 pPUF24、 pPUF44、 pP UF54、 pPUF56、 pPUF79、 pPUF308、 pPUF310及び pPUF320を取得した。 これらの プラスミ ドを铸型としてダイプライマーサイクルシークェンシングキッ トを用い て塩基配列を決定した。 その結果、 プラスミ ド pPUF15、 pPUF24、 pPUF44、 pPUF54 、 pPUF56, pPUF79、 pPUF308及び pPUF310は、 FDHプロモーター領域をそれぞれ 1215bp、 1000bp、 839bp、 690bp、 756bp、 403bp、 228bp、 115bp有している ことを確認した。
PCRにて上流領域を欠失した FDHプロモーターを作製するために、 以下のォリ ゴヌクレオチドプライマ一を合成した。
PF819 ： (配列番号 38)
PF801 ： (配列番号 39)
PF779 ： (配列番号 40)
PF668 ： (配列番号 41)
PF642 ： (配列番号 42)
PF622 ： (配列番号 43)
PF602 ： (配列番号 44)
PF194 ： (配列番号 45)
PF161 ： (配列番号 46)
PRV3 ： (配列番号 47)
上記オリゴヌクレオチドプライマー PF819、 PF80U PF779, PF668、 PF642 、 PF622. PF602、 PF194及び PF161のいずれかと PRV3とを用いて、 pPUFlを铸 型とした PCRを行った （ （94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分） x 20サイクル ) o
それぞれの増幅 DNA断片を pT7 Blue T-Vectorにクローニングした後、 Xho I - No t Iで切り出し、 pPUFlの Xho I -Not Iに挿入した。 プライマー PF819から得 たプロモーター領域を 819bp有している PH05発現プラスミ ドを pPUF819、 プライ マー PF801から得たプロモーター領域を 801bp有している PH05発現ブラスミ ドを PPUF80U プライマ一 PF779から得たプロモータ一領域を 779bp有している PH05 発現プラスミ ドを pPUF779、 プライマー PF668から得たプロモーター領域を 668b P有している PH05発現プラスミ ドを pPUF668、 プライマー PF642から得たプロモ 一ター領域を 642bp有している PH05発現プラスミ ドを pPUF642、 プライマー PF62 2から得たプロモータ一領域を 622bp有している PH05発現ブラスミ ドを pPUF622 、 プライマ一 PF602から得たプロモーター領域を 602bp有している PH05発現ブラ スミ ドを pPUF602、 プライマー PF194から得たプロモータ一領域を 194bp有して いる PH05発現プラスミ ドを pPUF194、 そしてプライマー PF161から得たプロモ一 ター領域を 161bp有している PH05発現プラスミ ドを pPUF161と命名した。
(5-3) 形質転換
上記実施例 （5-2) で得たプラスミ ド DNA 5 gを Bam HIで切断し、 Candida boidinii KST2515株に形質転換した。 得られた形質転換細胞のコロニーを各ブラ スミ ドにっき数個拾い、 メタノール 1.5% Yeast Nitrogen Base 0.67%及び Ye ast Extract 0.5%を含む pH5.5の培地 （以下 「ME培地」 という） 、 又はグルコ ース 1.0%、 ギ酸ナ ト リウム 0.5%及び Yeast Nitrogen Base 0.67%を含む pH5. 5の培地 （以下 「GF培地」 という） で培養し酸性フォスファターゼ活性を測定し o
公知の文献 （Sakai Y. et al. , J. Bacterid. , 173, 7458(1991)) によると 、 URA3をマーカーとした形質転換体では、 形質転換細胞の約半分がプラスミ ドが 1 コピー組み込まれたものであることから、 各プラスミ ドからの形質転換細胞の 酸性フォスファタ一ゼ活性の値の分布の最も大きい値を 1 コピー挿入形質転換細 胞の酸性フォスファタ一ゼ活性の値とした。 また、 これら形質転換細胞が実際プ ラスミ ドが 1 コピー組み込まれていることをサザン解析によって確認した。 pPUF 1が示す酸性フォスファターゼ比活性 （ュニッ ト/ OD610) を 100としたときの 各プラスミ ドからの形質転換細胞が示す酸性フォスファターゼ比活性を図 10に示 す。 図 10の結果から、 メタノールによって誘導するには、 プロモーター領域を 19 4 bp (例えば配列番号 48で表される塩基配列を含むもの） 以上、 好ましくは 839 bp (例えば配列番号 50で表される塩基配列を含むもの） 以上を有していることが 必要であり、 ギ酸によって誘導するにはプロモーター領域を 194 bp (例えば配列 番号 48で表される塩基配列を含むもの） 以上、 好ましくは 642 bp (例えば配列番 号 49で表される塩基配列を含むもの） 以上を有していることが必要であることが 明らかとなった。 産業上の利用可能性
本発明により、 異種遺伝子を発現させるのに強力な転写活性を有するプロモー ター及び Z又はターミネータ一が提供される。 該プロモーター、 ターミネータ一 及び目的の異種遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養す ることにより、 高度に発現された異種遺伝子産物が得られる。
(本頁以下余白）
Figure imgf000030_0001
VV1!31Visvlso 3VV33lvl 11111V3VV vl 1 V1V31V1111V3V1V1 vgv1 13D1111ν1ν3ΰ1131VVV1VV3V33vvi 1V1ν VLL vlvlv lvllvvVVV TACTTAATTC CCTTTACTTT TCATTTTTAC AACCGCTTTG GTATTTACCC CCAGAGTGTT 1140
TTAATTGCAA TTGAATTCTT ATTTTAATTT CCATTACTTT CTTTGTACCA TAATGAAATT 1200
GCCGAGTTGT CCCTCCTTTG AATTTAAATC ATTCTCTAAT ATTTAACTTT AATTTTAATA 1260
TTTTAGTTAT TTATTTGAAT TAAAGTAAAT TCAACTAAAA ATTGAACTAT TTAAACACTA 1320
TGATTTCCTT CAATTATATT AAAATCAATT TCATATTTCC TTACTTCTTT TTGCTTTATT 1380
ATACATCAAT AACTCAATTA ACTCATTGAT TATTTGAAAA AAAAAAACAT TTATTAACTT 1440
AACTCCCCGA TTATATATTA TATTATTGAC TTTACAAA 1478 配列番号.： 2
配列の長さ ： 9 8 9
配列の型 ：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： Genomi c DNA
起源
生物名 ： 力ンジダ · ボイジニイ （Cand i da bo i d i n i i )
株名 ： S2 A0U-1
配列 ：
ATTTTCTTAA CTTGAAAACT ATAATTGCTA TAACAATTCT TCAATTTCTC TTTTTCTTCC 60 TTTTTTTGAA GAATTTTTAA CAATCAAAAT TTTGACTCTT TGATTTCCCG CAATCTCTGA 120 GCTCAGCATA CTCATTATTA TTTTATTATT ATTATTATTA TTACTTTTAT TATTATTATA 180 TTTTTTCTTC TTTAACGATA TCGTTTGTGT TTTATCTTTT ATGATTTAAA TTTTATACGA 240 ATTTATGAAT ACAACAAAAT ATTTAAGTTT ACACAATGTA GTAAATTAAA AGTTAATCAG 300 TAAAATGTAT TGTAAGTTAC ATATATCATA TATCAGTGTC TTGATATATA TAAAGAAAAC 360 GTTGCTTATG TAATCAGGCA CACGTTGACA GCGTGGTGCC CTGAACAGCA ACCGCAATTT 420 TGACCACGCA CGGGCGGTCT TATCTCCAGC CGGCTGCTTT CAGTCTCCAA GCGATAAGGC 480 CACAATAGCA ATGGCAATCA CAGCCACAGC CACGCCAGCC ATCTACTTAC GCTCTCTCTT 540 CCTGCTGAGG CTATCGGTAC TCGCACTACT ATTAGCCCTT CCCTATTCTT CCTCTTATCA 600 GCTTCATCTC TTGAGTCTTA CCCCATGCAT TCATCCTATC CTATCCTTCG ATTGCCACCT 660 CTCATCTCAT CTGCCGTTCT TGACTGTCAA TCTATCCAAA ATAGACGACT AACGGAGTTG 720
GTGGTTTAAT TTATGGATAC CATATAGTTC ATACCATTGA ATCACCACCA CCACCATCAA 780
TGTCTCTTTG TTACAATCGT ATATTACAAT TAACTCTTTG TGGCTTGAAA TGTGTATTGT 840
ATGCACTCTC ATTTCTAGTT CCTCTGTTTC CTTGCTAATT CTAAATTGAC CAAACCCTTG 900
AACTGTCTTG ACTTTATATC ATTTTAGTTC AATTAAATTC AATTAAATTA AATTCAATTC 960
AATTCAATTT TTCTTTAAAA CAATCTAGA 989 配列番号： 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Met Lys lie Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp
1 5 10 15
Glu Glu Lys Leu
20 配列番号： 4
配列の長さ ： 9
配列の型： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： ぺプチド
配列
Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys
1 5 配列番号： 5
配列の長さ ： 6 配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
し ys Glu leu Leu Ser lys
1 5 配列番号： 6
配列の長さ ： 1 1
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ぺプチド
配列
Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys 1 5 10 配列番号： Ί
配列の長さ ： 1 1
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ぺプチド
配列
Lys Asp Gin Gly His Glu Leu lie Thr Thr Ser 1 5 10 配列番号： 8
配列の長さ ： 2 6
配列の型： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類：ぺプチド
配列
Lys Tyr Gly Ala Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Leu Asp Ala Gin Thr Arg Tyr Ala Glu Gly
20 25 配列番号： 9
配列の長さ ： 1 3
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ぺプチド
配列
Lys Glu Leu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gin Ala Leu Pro Lys
1 5 10 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 1 8
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ペプチド
配列
Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp His He Asp Leu Asp
1 10 15
Tyr lie 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 1 1
配列の型 ： アミノ酸 トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ぺプチド
配列
Lys lie Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys
1 5 10 配列番号： 1 2
配列の長さ ： 1 9
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ぺプチド
配列
Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gin Asp lie lie Leu Leu Asn Gly Glu Tyr
10 15
Val Thr Lys 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 2 1
配列の型： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： ペプチド
配列
Lys His lie Pro Asp Ala Asp lie lie lie Thr Thr Pro Phe His Pro
1 5 10 15
Ala Tyr lie Thr Lys
20 配列番号： 1 4
配列の長さ ： 9 配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Lys Leu Gly I le Ala Asn Trp Leu Lys
1 5 配列番号： 1 5
配列の長さ ： 3 1
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Lys Val Gly Ala Arg Arg Val Glu Asn He Glu Glu Leu Val Ala Gin
1 5 10 15
Ala Asp He Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys
20 25 30 配列番号： 1 6
配列の長さ ： 1 1
配列の型： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： ぺプチド
配列
Lys Asn He Leu Glu Ser Phe Phe Thr Glv Lys
10 配列番号： 1 7
配列の長さ ： 3 1 配列の型 ：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 ：
CGCGGATCCT AYGATGCWGG WAARCAYGCW G 31 配列番号： 1 8
配列の長さ ： 3 2
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 ：
CGCGGATCCT ARTGWGGWGT CATWGCRTTW CC 32 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 3 5 6 2
配列の型 ：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名 ： カ ンジダ · ボイジニイ （Candida boidinii)
株名 ： S2 A0U-01
配列：
GTCAACAAAT CAATCAGCCA ATCTACCAAT CAATTAAAAA TACACTGAAG TGATATAGTT 60 TAGTCTAATC AAAGTTGAAT AACCCCAGAC ATGGTTGAAA TCTTAGAAGC CACAAATATC 120 AACAGGCCAA ATCGGCTCTC GGAGAATCTT TTCTGGCTTC CAGTGTATGG GCTGTTACGC 180 D
Figure imgf000038_0001
S≤3VV335lvv51VL31 lvll VV T3
T5
A AAC G TC ATATTTTTTTA
3>
AT TTTT TTC AA TT JTCAA TTATA. A TTT -3 —3 —3
CD CG CC CGCT TTT TT ATTCTAT.TGATTTTAT 3 c G TTAA 。 3>
ATACCC T¾TAT AATTTTGTGGC AAGTGTTACAATAATTGA TTAT TG T ACT 3AT
CG AGGATATA TTCCCAT TGAC wATTTATAATAATACCAA T AT -3 -3 3> -H
>
CGG CCCCG TTT TT ATCAT JG ACT ATTATTGTTAAA TTG¾ CD O
TACC ATGTCCCATCT CTCGGTC TCAT ATCCTATCC TCGAT CCTTATTT CACTCG ACA CTTCCC CCCTTAT AGGCTATCGG TTATTTATTTTTCTTA TCAGC CACAGCGCG GCCCGTGCTG GCGGCA T A ACACATCTACT TACTCTCT CTCCAATAT CCCC6 GGGCGGTTAT CGGTGC TTTCAGCC CAAGCG GGAATA 30 TTTATAACCA
—3
-9 CCCCGG GCG GAAGACA 300 GTTCCT ACA ATT TTTT
- <T3 CT2
3» ACATATATCCAGT GCG AGTGCTT940 TGAG T ATATATTTTATATTATAAAAA AACCT 2ATTTATi
GATATTTAAG TCAAT GTAG AAAAGAAAT 2880 AATACAACAA ATTACATAAATTTTAAT CAGTA
—9 73
CCJG TC AT ATTTTG TGATCT TTTATG AAATTTA CG TATTTTTAATTTTATTTTTA TATTTTATTT ATACTCAT TT ATTATTA TTATTACTTT TATTATTATT ATATT
GAAGAC CG CCGCCTCAAAGAA T AATTTTTTTTATTTCAATTC TGAGC
TAACTGA CTCAAT TCTC CTCTTTTTCXTTTTTT.ATAATAATTTT TCTT 3
r r i>
t — —
ro CT o ^ ACGGC CC c TATTAAATTT ACATT ACGGTAACGATGTTTTTAAAAAAAAA TAAAT- vo ^ oo
o
AAAAATCGGT CGTATTTT TTTACTA AATTTGATTAAACCACAA G
TGACTCCT CTACTCT T ACCTTAG AGC AAGATACGC GG¾,TATTCTCAAATAA
CGCC GGATATCACCT A TGGAGATAGG ATATGGTGC GGTAAA TAAAATAAT
CAGCGGACTT AAATCTGGATT CAGG GGACAAATTAATTACGGGG TATGTTGG TTCCCTT
AGAAAAGGGTGTGTC TTAGTCGCA GT¾T AATACCAAGGTGCT TT¾GG GGAATTTCTAA
C ATGCC AACGCGGGATAGT ACAAATT TAATTTA TCTAA G GTGCTA ATTGAGAAAT AGAAT TA 33A¾TATTAA ¾TAC
CAATT AATACTC GC CCGGGAATTATTTTACAAA AAAGCG iTTT
CCGTACATTCTGGG AG TTAGA ATTG¾TACA GAGCTTGAATATTACC CTAATC040 TCTTT 2
ACGAGTTGG GTTGCGCCG TATCGTT ATCGCGAAGGTAAGTCTTAGT ACTATTG AAAA 配列番号： 2 0
配列の長さ ： 1 0 9 5
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名 ： カンジダ · ボイ ジニイ （Candida boidini i)
株名 ： S2 AOU-1
配列：
ATG AAG ATC GTT TTA GTC TTA TAT GAT GCT GGT AAG CAC GCT GCT GAT 48 Met Lys lie Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp
1 5 10 15
GAA GAA AAA TTA TAT GGT TGT ACT GAA AAT AAA TTA GGT ATT GCT AAT 96 Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly He Ala Asn
20 25 30
TGG TTA AAA GAT CAA GGT CAT GAA CTA ATT ACT ACT TCT GAT AAA GAA 144 Trp Leu Lys Asp Gin Gly His Glu Leu lie Thr Thr Ser Asp Lys Glu
35 40 45
GGT GAA ACA ACT GAA TTG GAT AAA CAT ATC CCA GAT GCT GAT ATT ATC 192 Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His lie Pro Asp Ala Asp lie He
50 55 60
ATC ACC ACT CCT TTC CAT CCT GCT TAT ATC ACT AAG GAA AGA CTT GAC 240 He Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr lie Thr Lys Glu Arg Leu Asp 65 70 75 80
AAG GCT AAG AAC TTA AAA TTA GTC GTT GTC GCT GGT GTT GGT TCT GAT 288 Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp
85 90 95
CAC ATT GAT TTA GAT TAT ATT AAT CAA ACA GGT AAG AAA ATC TCA GTC 336 - -
9S2 0S2
JiU usv ΙΒΛ nan dj丄 ¾iv s q sAq aqd sAq Jas ngq n3q sAq
89 33V IVV 010 Vil 001100109 VVV VVV III VVV 101 VII Vil VVO OVV On 9SS 0 Z 922 usv 811 131 ^10 sAi Jiu io ¾iv S!H na OJd ¾iv usy 1¾Λ JM1 ϊ¾Λ OS丄 IVV LLV Vli 100 VVV V3V 100 VOO OVO V丄丄 D3 100 IVV 110 VOV丄丄!）
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Ala Arg Gly Ala lie Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu
260 265 270
TCT GGT CAA TTA ACA GGT TAC GGT GGT GAT GTT TGG TTC CCA CAA CCA 864
Ser Gly Gin Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gin Pro
275 280 285
GCT CCA AAG GAT CAC CCA TGG AGA GAT ATG AGA AAT AAA TAT GGT GCT 912
Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala
290 295 300
GGT AAT GCC ATG ACT CCT CAC TAC TCT GGT ACT ACT TTA GAT GCT CAA 960
Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gin
305 310 315 320
ACA AGA TAC GCT GAA GGT ACT AAA AAT ATC TTG GAA TCA TTC TTT ACT 1008
Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn He Leu Glu Ser Phe Phe Thr
325 330 335
GGT AAA TTT GAT TAC AGA CCA CAA GAT ATT ATC TTA TTA AAT GGT GAA 1056
Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gin Asp lie lie Leu Leu Asn Gly Glu
340 345 350
TAC GTT ACT AAA GCT TAC GGT AAA CAC GAT AAG AAA TAA 1095
Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys
355 360 配列番号： 2 1
配列の長さ ： 2 5
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 ： TAAGGTATAC TACATTTTAT CATAC 25 配列番号： 2 2
配列の長さ ： 3 8
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
酉己歹リ ：
GCGGCCGCTT TGTAAAGTCA ATAATATAAT ATATAATC 38 配列番号： 2 3
配列の長さ ： 4 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
酉己歹 IJ ：
GCGGCCGCCC CGGGATTTTC TTAACTTGAA AACTATAATT G 41 配列番号： 2 4
配列の長さ ： 2 6
配列の型： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
酉己歹り ：
AATGAGTATG CTGAGCTCAG AGATTG 26 配列番号： 2 5
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ：
GAGGTTGCTG CTTTGGTTAT T 21 配列番号： 2 6
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
酉己歹リ ：
GAAACACTTG TGGTGAACGA T 21 配列番号： 2 7
配列の長さ ： 4 8 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名 ： カンジダ · ボイジニイ （Candida boidini i)
株名 ： ATCC 48180
配列：
CATATAACGG ATCCCACTTA TATGACTGTA AGGCAAAGAA AGGGATTGCA AAAATTGAAA 60
Figure imgf000045_0001
3V3
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GCTCCAGAAG CTTTATTCCA CCCATCTGTC TTAGGTTTAG AAGCCTCTGG TATTGATCAA 3660
ACCACTTTCA ACTCCATCAT GAAGTGTGAT GTTGATGTCC GTAAGGAATT ATACGGTAAC 3720
ATTGTTATGT CTGGTGGTAC TACCATGTTC CCAGGTATTG CTGAACGTAT GCAAAAGGAA 3780
ATTACTGCTT TAGCTCCATC TTCCATGAAG GTCAAGATCA TTGCTCCACC AGAAAGAAAG 3840
TACTCCGTTT GGATTGGTGG TTCTATCTTA GCTTCCTTAT CTACTTTCCA ACAAATGTGG 3900
ATTTCAAAGC AAGAATACGA CGAATCAGGA CCATCAATTG TCCACCTCAA GTGTTTCTAA 3960
GGAATTTAAT CATTTTCAAC ATAAAATCTT GTCAATTTTT ATTAAAGTCA TTTTTCATTA 4020
ATCTTTTAAT GTATTCTTTT ATTTGATTTT TCAATATTTC TTGATAAATA AATTTGTTGT 4080
TGAATTTCAT TGATTATTTA TATTTCTTAG ATTTTAAAAA AATATTTTCC TCTTTTTTTA 4140
TTTTCCTTTG TTTTTCAAAT TTAAAATGAT AGAATGAAAG AATAAAAATA TATATATTAT 4200
TATTATTATT ATTACTGTCA AACGTTTAAA AAGAAGTAGT ATTAAACTTA ACACTCTTCT 4260
GAGTTATAAT GGTAATAACA GTGATTTAAT ATACCTTTTT TTTCCAAATT TTTTTCAATT 4320
ATTCATTTTG GTATTTGGTT AATTATGGTG AATAAAAAAA AAGAAAAATT TCTTGTTTCT 4380
TTTGTTGTTT ATTCTTGTTT TAATTTTTTT TTGTATCAAT CTTTAAATTT AGTTTTAAAT 4440
TTTTTATTAT TATTCTAATT TTAAATTATT AATTGTTGTA ATTAAATTAT TAATTAATTT 4500
CTAATTTTTT TGAACAAAAC GTTTTTATAA TTTTAGAATA TTTAATTAAT TTATTAAATT 4560
TGTTTAAATT GGTATACCAT TTTTTTTTTA CTCTATTTAC CTATTTAATT TTATTATATT 4620
ATTATCGAAA AAAACCTTAA AAAGGACTTC GTAAATTTTA TTGTAATAAA CGCAAAAATG 4680
ACATATATAA GAAAAAAAAT AAAAAGAAAT AAAAAAAACA AGTGGTTGAT TTTACTTTTA 4740
ACTAAGTCAA AGTCTAATAA ATTTCTATTT TTTTTTAAGG AAGAATTAAC TAGATTTATC 4800
AAGTAATCTT TTATCGAT 4818 配列番号： 2 8
配列の長さ ： 2 9
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 酉己歹' j ：
CTGAATTCAA TAAGACTGTG ATTATATAC 29 配列番号： 2 9
配列の長さ ： 2 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列：
CACCGTCGAC TTTTGTAATA TATATTAAA 29 配列番号： 3 0
配列の長さ ： 3 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列：
GTCGACCTGC AGGGAATTTA ATCATTTTCA AC 32 配列番号： 3 1
配列の長さ ： 3 2
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ：
AAGCTTGAAT TCTAAAAAAA AAATGGTATA CC 32 配列番号： 3 2
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ：
ATGATTGAAC AAGATGGATT GC 22 配列番号： 3 3
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ：
TCAGAAGAAC TCGTCAAGAA GG 22 配列番号： 3 4
配列の長さ ： 3 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ：
GCGGCCGCAT GTTTAAATCT GTTGTTTATT CA 32 配列番号： 3 5 配列の長さ ： 3 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列：
CCCGGGTTAT TGTTTTAATA GGGTATCATT 30 配列番号： 3 6
配列の長さ 1 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ：
GGATTCATTG GGGCTTCAG 19 配列番号： 3 7
配列の長さ ： 2 6
配列の型：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジ一：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ：
TGATTACGAA TTTAATACGA CTCACT 26 配列番号： 3 8
配列の長さ ： 3 3
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列：
CCCCTCGAGG AAATAGATAC ATTACCCAGT GTC 33 配列番号： 3 9
配列の長さ ： 3 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ：
CCCCTCGAGT GTCATCGATA TTATGCCCCG CC 32 配列番号： 4 0
配列の長さ ： 3 6
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ：
CCCCTCGAGG CCTTTTTCAC TTGAAACAAT AACTAT 36 配列番号： 4 1
配列の長さ ： 3 8
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列：
CCCCTCGAGT AATACTAGTC AGATGTTATA ATTATATC 38
配列番号： 4 2
配列の長さ ： 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 ：
CCCCTCGAGT ATCTTTACCA CTATCCAATT AAAATCC 37 配列番号： 4 3
配列の長さ ： 3 3
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
酉己歹リ ：
CCCCTCGAGT AAAATCCATG GATCAGACGG TAG 33 配列番号： 4 4
配列の長さ ： 3 5
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 ： CCCCTCGAGT AGTTTTTATA TCTGTAACAT CTTAC 35 配列番号： 4 5
配列の長さ ： 4 6
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列：
CCCCTCGAGT AAATTCAACT AAAAATTGAA CTATTTAAAC ACTATG 46
. 配列番号： 4 6
配列の長さ ： 4 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列：
CCCCTCGAGA TGATTTCCTT CAATTATATT AAAATCAATT TC 42 配列番号： 4 7
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列：
CAATGAGCCG TTGAATTGAC GAGTG 25
一 5 l 配列番号： 4 8
配列の長さ ： 1 9 4
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名 ： カンジダ · ボイジニイ （Candida boidini i)
株名 ： S2 A0U-1
配歹 ij ：
GTAAATTCAA CTAAAAATTG AACTATTTAA ACACTATGAT TTCCTTCAAT TATATTAAAA 60 TCAATTTCAT ATTTCCTTAC TTCTTTTTGC TTTATTATAC ATCAATAACT CAATTAACTC 120 ATTGATTATT TGAAAAAAAA AAACATTTAT TAACTTAACT CCCCGATTAT ATATTATATT 180 ATTGACTTTA CAAA 194 配列番号： 4 9
配列の長さ ： 6 4 2
配列の型 ：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名 ： カンジダ · ボイジニイ （Candida boidini i)
株名 ： S2 A0U-1
配列：
TATCTTTACC ACTATCCAAT TAAAATCCAT GGATCAGACG GTAGTTTTTA TATCTGTAAC 60 ATCTTACTAC TACCACTACT ACTACCACTA CTACTACCAC TACTACTACC ACTACTACTA 120 CTGATAATAA GGTATACTAC ATTTTATCAT ACGTGAAATG TAACGCGTAG ATTAAACATT 180 TTTTTAAAAT TACTGATCAG TACTTTCCAC AATAAGCACT TATTAATATG TGCCTCTTTA 240 AAATTACTTA ATTCCCTTTA CTTTTCATTT TTACAACCGC TTTGGTATTT ACCCCCAGAG 300
TGTTTTAATT GCAATTGAAT TCTTATTTTA ATTTCCATTA CTTTCTTTGT ACCATAATGA 360
AATTGCCGAG TTGTCCCTCC TTTGAATTTA AATCATTCTC TAATATTTAA CTTTAATTTT 420
AATATTTTAG TTATTTATTT GAATTAAAGT AAATTCAACT AAAAATTGAA CTATTTAAAC 480
ACTATGATTT CCTTCAATTA TATTAAAATC AATTTCATAT TTCCTTACTT CTTTTTGCTT 540
TATTATACAT CAATAACTCA ATTAACTCAT TGATTATTTG AAAAAAAAAA ACATTTATTA 600
ACTTAACTCC CCGATTATAT ATTATATTAT TGACTTTACA AA 642 配列番号： 5 0
配列の長さ ： 8 3 9
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomi c DNA
起源
生物名 ： カンジダ · ボイジニイ （Cand i da bo i d i n i i )
株名 ： S2 A0U-1
配列 ：
CTTACATACA TATAGAGTTT GAAATAGATA CATTACCCAG TGTCATCGAT ATTATGCCCC 60 GCCTTTTTCA CTTGAAACAA TAACTATTAT TACTACTATT ATTATTTCTA TTCATATATC 120 CTAAAAATTA TATTAAAATT GGCTCTTTTA TGCAAAAAAT GTACATTTAT GGTAATACTA 180 GTCAGATGTT ATAATTATAT CTTTACCACT ATCCAATTAA AATCCATGGA TCAGACGGTA 240 GTTTTTATAT CTGTAACATC TTACTACTAC CACTACTACT ACCACTACTA CTACCACTAC 300 TACTACCACT ACTACTACTG ATAATAAGGT ATACTACATT TTATCATACG TGAAATGTAA 360 CGCGTAGATT AAACATTTTT TTAAAATTAC TGATCAGTAC TTTCCACAAT AAGCACTTAT 420 TAATATGTGC CTCTTTAAAA TTACTTAATT CCCTTTACTT TTCATTTTTA CAACCGCTTT 480 GGTATTTACC CCCAGAGTGT TTTAATTGCA ATTGAATTCT TATTTTAATT TCCATTACTT 540 TCTTTGTACC ATAATGAAAT TGCCGAGTTG TCCCTCCTTT GAATTTAAAT CATTCTCTAA 600 TATTTAACTT TAATTTTAAT ATTTTAGTTA TTTATTTGAA TTAAAGTAAA TTCAACTAAA 660 3
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Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号 1で表される塩基配列から選ばれる 190 b p以上の連続的な塩基配 列を実質的に含む、 カンジダ ' ボイジニイのギ酸脱水素酵素遺伝子のプロモー ター。
2 . 配列番号 1、 48、 49又は 50で表される塩基配列を実質的に含む、 カンジダ * ボイジニイのギ酸脱水素酵素遺伝子のプロモーター。
3 . 配列番号 2で表される塩基配列を実質的に含む、 カンジダ ' ボイジニイのギ 酸脱水素酵素遺伝子のターミネ一ター。
4 . 請求項 1又は 2記載のプロモーター、 異種遺伝子及び請求項 3記載のターミ ネーターを含む遺伝子発現カセッ 卜。
5 . 異種遺伝子が酸性フォスファターゼ遺伝子である請求項 4記載の遺伝子発現 カセッ ト。
6 . 請求項 4又は 5記載の遺伝子発現カセッ トを含む組換え発現ベクター。
7 . 請求項 6記載の組換え発現べクタ一によつて形質転換された形質転換体。
8 . 請求項 7記載の形質転換体を培地に培養し、 得られる培養物から異種遺伝子 の発現産物を採取することを特徴とする異種遺伝子の発現産物の製造方法。
9 . 異種遺伝子の発現産物が酸性フォスファターゼである請求項 8記載の発現産 物の製造方法。
10. 培地が、 酸素原子又は窒素原子を有し、 かつ該原子に結合する炭素数 1の置 換基を少なく とも 1つ有する化合物を含むものである請求項 8又は 9記載の発 現産物の製造方法。
1 1. 酸素原子を有する化合物がメタノール又はギ酸若しくはその塩である請求項 10記載の発現産物の製造方法。
12. 窒素原子を有する化合物がメチルァミ ン、 ジメチルァ ミ ン、 トリメチルアミ ン及び N—置換メチルを有するアンモニゥム化合物からなる群から選ばれる少 なく とも一種である請求項 10記載の発現産物の製造方法。
13. N—置換メチルを有するアンモニゥム化合物がコリ ンである請求項 12記載の 発現産物の製造方法。
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DE69626494T DE69626494T2 (de) 1995-09-12 1996-09-12 Promotor/terminator des formatdehydrogenase-gens von candida boidinii
AT96930366T ATE233820T1 (de) 1995-09-12 1996-09-12 Promotor/terminator des formatdehydrogenase-gens von candida boidinii
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JP23413395 1995-09-12
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JP8/42536 1996-02-29

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