WO1997010344A1 - Souches de levures genetiquement modifiees - Google Patents

Souches de levures genetiquement modifiees Download PDF

Info

Publication number
WO1997010344A1
WO1997010344A1 PCT/FR1996/001413 FR9601413W WO9710344A1 WO 1997010344 A1 WO1997010344 A1 WO 1997010344A1 FR 9601413 W FR9601413 W FR 9601413W WO 9710344 A1 WO9710344 A1 WO 9710344A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cytochrome
yeast
strain
human
promoter
Prior art date
Application number
PCT/FR1996/001413
Other languages
English (en)
Inventor
Aouatef Bellamine
Frédéric DELORME
Alain Perret
Denis Pompon
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S.A., Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority to JP51171597A priority Critical patent/JP4717967B2/ja
Priority to CA2229328A priority patent/CA2229328C/fr
Priority to EP96931123A priority patent/EP0876495B1/fr
Priority to AT96931123T priority patent/ATE311465T1/de
Priority to DE69635525T priority patent/DE69635525T2/de
Priority to US09/043,239 priority patent/US6117649A/en
Priority to SI9630725T priority patent/SI0876495T1/sl
Publication of WO1997010344A1 publication Critical patent/WO1997010344A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12N9/0042—NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)

Definitions

  • the present invention relates to new yeast strains expressing cytochrome P450 activity and their use. It relates in particular to yeast strains capable of producing a system of human cytochrome P450 enzymes and the plasmids used for their construction.
  • Cytochromes P450 constitute a super family of membrane enzymes. These are monooxygenases which are involved more particularly in the metabolism of xenobiotics and drugs.
  • the choice of eukaryotic hosts of the yeast type is very particularly advantageous: this organism makes it possible to set conditions close to those of human hepatic cells and leads to a high level of protein expression.
  • the yeast has in endogenous form all the enzymatic machinery necessary for the expression of membrane proteins, of the cytochrome P450 type, and their associated enzymes, thus it has a cytochrome b5 and a NADPH.
  • -cytochrome P450 reductase two enzymes whose presence is necessary for the functioning of cytochrome P450.
  • yeasts particularly studied for the expression of heterologous proteins there may be mentioned in particular Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida and Saccharomyces, the genome structure of which is well known.
  • Kluyveromyces Pichia
  • Hansenula Hansenula
  • Candida Saccharomyces
  • Different systems for expressing cytochrome P450 in yeasts have been described in the literature.
  • the cytochromes P450 were expressed from plasmids and used as endogenous yeast NADPH-cytochrome P450 reductase and cytochrome b5 as electron donors (Pompon, 1988; Cullin & Pompon, 1988).
  • a first improvement of this system gave rise to so-called second generation strains in which the yeast cytochrome P450 reductase was overexpressed (under the control of the GAL10-CYC1 promoter) and a human cytochrome b5 coexpressed (patent WO93 / 02200et Truan and al., 1993).
  • the existing systems are not entirely satisfactory: either they do not allow sufficient expression of the proteins, or the proteins obtained are not close enough to the human system.
  • the present invention specifically aims to provide a third generation strain not having the aforementioned drawbacks.
  • the Applicant has demonstrated that it is possible to simultaneously replace the NADPH cytochrome P450 reductase and the yeast cytochrome b5 with their human counterparts. This is all the more surprising since the simultaneous disruption of these two genes was known to be lethal in yeast and that until now it was not possible to obtain a viable strain having the two deleted genes.
  • yeast cytochrome P450 reductase and / or cytochrome b5 have been substituted by their human counterpart. This very advantageously allows the creation of a system very close to the hepatic cells, given that the entire multienzymatic system is then of the same nature.
  • This new system makes it possible to study the effect of the nature of the redox partners of the expressed P450 cytochromes as well as the stoichiometry necessary for cytochrome P450 activities comparable to those which exist in the liver.
  • the nucleic acids used to integrate into the strain the genes coding for human cytochrome b5 and human reductase are preferably cDNAs.
  • the cDNAs containing the entire coding sequence for these two proteins were isolated and sequenced (for human reductase see S Yamano et al. Mol. Pharmacol. 1989 vol. 36: 83-8, and for human cytochrome b5 see M Miyata et al. Pharmacol. Res. 1989 vol. 21: 513-20).
  • yeast chosen is Saccharomyces cerevisiae
  • inactivated genes a gene made incapable of coding for its natural protein.
  • the inability of said genes to code for their natural proteins can manifest itself either by the production of an inactive protein due to structural or conformational modifications, or by the absence of production, or by the production of the natural protein at a level mitigated.
  • the inactivation of native genes can be obtained by different methods:
  • deletion is meant any deletion of the gene considered. It may be part of the region coding for the protein and / or all or part of the promoter region of transcription. - one or more point mutations in the gene.
  • the mutations can be obtained by treatment with mutagenic, chemical agents (such as alkylating, bialkylating or intercalating agents) or physical mutagenic agents (X-rays J _g 1 _ ultraviolet), or by site-directed mutagenesis.
  • the gene disruption method is preferably used as described below.
  • a wild strain one of whose genes has been inactivated, can be transformed with a replicative plasmid containing the nucleic acid coding for the corresponding human protein.
  • the nucleic acid is not integrated into the yeast genome.
  • a nucleic acid in the form of a cDNA comprising the sequence coding for the human protein concerned, into the yeast genome.
  • the integration can be done either in a known locus on this genome corresponding to a marker gene, altering neither the reproductive properties of the yeast nor the viability thereof, or in the place occupied by the native gene inactivated.
  • nucleic acid coding for reductase as well as the nucleic acid coding for cytochrome b5 can therefore be introduced into the strain according to one of these methods.
  • the embodiment consisting in integrating the nucleic acid coding for human NADPH-cytochrome P450-reductase and / or l nucleic acid encoding human cytochrome b5 in the yeast genome, a preferred embodiment of the present invention being to integrate these nucleic acids in place of endogenous genes.
  • the gene coding for human cytochrome b5 is integrated into an intergenic site for a marker gene in particular into the intergenic site SPL1 / leu2.
  • Another characteristic of the invention resides in a strain characterized in that the nucleic acid coding for human cytochrome b5 is integrated into the genome.
  • a particular embodiment of the invention consists in making two copies of cytochrome b5 appear in the transformed strain.
  • yeast promoter constitutive means a promoter whose expression is constant under standard culture conditions. According to the present invention at least one of the human genes is under the control of a constitutive yeast promoter.
  • This promoter is chosen from known promoters.
  • CYC1 isocytochrome Cl
  • ADH1 alcohol dehydrogenase
  • TEZ factor of transcription elongation
  • GAPDH glyceraldehyde phosphodehydrogenase of yeast
  • PGK yeast phosphoglyceratekinase
  • the promoter is chosen from the promoter of the yeast glyceraldehyde phosphodehydrogenase gene, the promoter of the yeast phosphoglycerate kinase gene and the endogenous promoter of yeast cytochrome b5. It should be noted that in a particular embodiment of the invention, the gene coding for human cytochrome b5 is under the control of the endogenous promoter of Yb5.
  • the inducible promoter it is preferably chosen from the promoters GAL10 and CYC1-GAL10.
  • haploid strains exhibiting the characteristics which interest us, that is to say the inactivation of the abovementioned endogenous genes and their replacement by nucleic acids coding for the corresponding human genes. You had to stay in diploid form.
  • One of the advantages of the present invention is to be able to work with haploid yeasts, which makes it possible to have better stability and to avoid unwanted recombinations.
  • the strains are therefore characterized in that they are haploids.
  • the strains according to the invention have at least one nucleic acid coding for human cytochrome P450. Said nucleic acid will preferably be integrated into a plasmid.
  • the humanized yeast strains according to the invention can be transformed according to the usual techniques with any cytochrome P450 expression plasmid, provided that said plasmid is compatible at the level of its selection markers with the developed yeast strains.
  • such plasmids can be obtained by cloning according to the rules of the art the coding phase of a cDNA coding for any human cytochrome P450 in the cloning polylinker of the plasmid pYeDP60 (see materials and methods).
  • Cytochrome P450 can in particular be chosen from cytochromes
  • the humanized strains according to the present application have indisputable advantages, compared to wild yeasts and compared to the recombinant strains previously developed, for the expression
  • Another subject of the invention consists of a yeast strain according to the invention, in which the moncoxygenase activity of a human cytochrome P450 carried by a plasmid will be expressed.
  • Another embodiment of the invention consists in making the additional copy of the nucleic acid coding for cytochrome b5 previously described appear on a plasmid and in particular on that which already contains a copy of the nucleic acid coding for cytochrome P450.
  • it is in fact particularly advantageous to be able to carry out a relative molar stoichiometry at least equal to 1/1 between the expression levels of human cytochrome b5 and of human P450.
  • the genomic integration of a single copy of the cytochrome b5 gene may, under certain circumstances, prove to be insufficient in view of the high level of expression of P450, as it results from its expression from a multicopy plasmid. according to the invention.
  • the present invention thus makes it possible to further improve the efficiency of the system by describing the construction of a series of plasmids carrying both an expression cassette for cytochrome P450 of interest and an expression cassette for cytochrome b5.
  • the particular structure of these plasmids allows stable, high-level expression and adequate stoichiometry between the two cytochromes.
  • These plasmids are compatible with all of the strains described in the application. Their use can also be extended to other strains.
  • the present invention has the preferential objective of developing a yeast strain which meets all the characteristics described above. Several intermediaries are described to achieve this.
  • strains are crossed, then sporulated and the haploid W (hR, ⁇ B) strains are selected which are deleted for Yb5 and YRED and which express human reductase under the control of the GAL10-CYC1 promoter.
  • another object of the invention consists of a strain comprising a nucleic acid coding for human NADPH-cytochrome P450-reductase under the control of the promoter GAL10-CYC1 and whose genes coding for cytochrome b5 yeast and yeast NADPH-cytochrome P450-reductase were inactivated (strain W (hR, ⁇ B)).
  • Another preferred strain according to the invention consists of a strain identical to the previous one in which the inducible promoter GAL10-CYC1 has been replaced by the promoter GAPDH.
  • This replacement can be carried out by a transformation with the plasmid pAB2 (FIG. 4), constructed from pUP81 (FIG. 9), which contains a cDNA coding for HRED under the control of the constitutive promoter of GAPDH.
  • the transformants are selected according to the method described in patent WO94 / 01564.
  • the strain obtained is designated by W (GhR, ⁇ B) In this strain, the sequence coding for human reductase is under the control of the promoter constituting the yeast GAPDH and the yeast cytochrome b5 and YRED are inactivated.
  • Another subject of the invention consists of a strain characterized in that the nucleic acid coding for human NADPH-cytochrome P450-reductase is under the control of the promoter of the yeast glyceraldehyde phosphodehydrogenase gene.
  • Another preferred strain according to the invention is obtained from the strain W (hR ⁇ B) by transformation with the vector pAB3 (FIGS. 6 and 12) containing the sequence coding for human cytochrome b5.
  • W hR ⁇ B
  • pAB3 vector pAB3
  • the strain thus obtained is named W (hR, hb5).
  • This strain has the two sequences encoding human proteins.
  • the strain W (GhR, ⁇ B) is transformed with the plasmid pAB3, in the same manner as above.
  • a strain W (GhR, hb5) is thus obtained which has the properties of the previous two, namely that it expresses the gene coding for human reductase under the control of the yeast GAPDH promoter and that it can also express the coding gene for human cytochrome b5 under the control of the yeast promoter pYb5.
  • the applicant has constructed a strain from the strain W (hR, ⁇ B). This strain is transformed by the plasmid vector pAP1 (FIGS. 8 and 13) previously linearized by the action of a restriction enzyme.
  • the transformants are selected which have integrated the sequence coding for human cytochrome b5 under the control of the yeast PGK (phosphoglycerate kinase) promoter, carried by pAPl, at the intergenic site Ieu2 / SPL1 of the yeast chromosome (FIG. 14).
  • yeast PGK phosphoglycerate kinase
  • This strain carries in the applicant's nomenclature the name W (hR, Lhb5). It can express the sequence coding for human reductase under the control of the pGAL10-CYCl promoter and the sequence coding for cytochrome b5 under the control of the yeast PGK promoter.
  • Another subject of the invention relates to a yeast strain characterized in that it comprises at least one nucleic acid coding for human cytochrome b5 under the control of the promoter of the yeast phosphoglycerate kinase gene.
  • Clones which have integrated into the above chromosomal site Ieu2 / SPL1 the sequence coding for human cytochrome b5 under the control of the yeast PGK promoter.
  • a strain W (GhR, Lhb5) is then obtained containing the coding sequences for the two human genes under the control of two yeast constitutive promoters.
  • Another object of the invention is characterized in that, in a strain, we have both:
  • nucleic acid encoding human cytochrome b5 under the control of the promoter of the yeast phosphoglycerate kinase gene.
  • Another embodiment of the invention consists in starting from the strain W (R) and of transforming it by the vector pAP1, after selection a strain W (R, Lhb5, Yb5) is obtained.
  • a strain W (R, Lhb5, Yb5) is obtained.
  • the strain W (hR) which we will transform in the same way, after selection we obtain a strain W (hR, Lhb5, Yb5)
  • strains constructed according to the present invention allow the implementation of methods aimed at evaluating the toxicity of the metabolites originating from the degradation by the cytochrome P450 enzymatic system of new chemical molecules.
  • Another subject of the invention relates to a method for evaluating the toxicity of a compound, characterized in that:
  • - Said compound is placed in the presence of a yeast according to the invention or an enzyme preparation derived from such a yeast, and the metabolites produced are analyzed for their toxicity.
  • the present invention also makes it possible to have an enzymatic complex very close to that existing in human liver cells. This offers the possibility of working in vitro under good conditions for expression of human enzymes. Thus we can determine which metabolites will result, in humans, from the degradation of new chemical compounds by the cytochrome P450 complex.
  • Another subject of the invention relates to a method for the in vitro determination of human metabolites of a chemical compound, characterized in that:
  • - Said compound is placed in the presence of a yeast according to the invention or an enzymatic preparation derived from such yeast, and the metabolites produced are identified.
  • Figure 1 plasmid pUP81.
  • Figure 2 plasmid pPLIOO.
  • Figure 3 plasmid p ⁇ B1.
  • Figure 4 plasmid pAB2.
  • Figure 5 plasmid pLLP1.
  • Figure 6 plasmid pAB3.
  • Figure 7 plasmid pCD26.
  • Figure 8 plasmid pAP1.
  • Figure 9 construction of pAB2 from pUP81.
  • Figure 10 construction of the W strain (GhR, ⁇ B) with pAB2.
  • Figure 11 construction of the hb5 cassette.
  • Figure 12 construction of pAB3.
  • Figure 13 construction of pAPl.
  • Figure 14 construction of strain W (GhR, Lhb5).
  • Figure 15 Representation of the plasmids pYeDP60, pYeDPl / 10 / hb5 and pYeDPl 10.
  • Figure 16 Representation of the plasmids pAP2, pAP3, pVD1, pVD2, pVD3, pVD4.
  • Figure 17 Construction and structure of pAP4.
  • Figure 18 Construction of pVDl.
  • Figure 19 Construction of pVD2.
  • Figure 20 Construction of pVD3.
  • the sporulation medium is completed so as to complement the different auxotrophies according to the strains.
  • the yeast nitrogen base (YNB) without amino acids and without ammonium comes from GIBCO BRL. Ammonium sulfate from MERCK. The German agar from ROHSTOFF Gmbh. Adenine, L-histidine and L-tryptophan from SIGMA. L-leucine and uracil from CALBIOCHEM. D-glucose, D-galactose, glycerol and anhydrous potassium acetate from PROLABO. The bacteropeptone (B. peptone) and the yeast extract (YE) from DIFCO.
  • Liquid media have the same composition as solid media except that they do not contain agar.
  • W (N) a denotes W (N) Mat a and W (N) a denotes W (N) Mat a.
  • W ( ⁇ B) a denotes W ( ⁇ B) Mat a and W ( ⁇ B) a denotes W ( ⁇ B) Mat a.
  • W (hR) a denotes W (hR) Mat a and W (hR) a denotes W (hR) Mat a
  • E. coli DH5-1 supE44, hddR17, recAl, gyrA96, thi-1, relAl.
  • Plasmid pUP ⁇ l the coding phase of the human cytochrome P450 reductase gene obtained by PCR with primers NI and N2, is cut by BamWl and Bgtll, then cloned into the integration vector DPI 10 at its BamHl site, l 'ATG from the promoter GAL10-CYC1 (Urban et al., 1993).
  • NI primer 5'-GCggatccATGGGAGACAGTCACGTGG-3 '(SEQ ID No.
  • bases 1 to 2 form a GC clamp
  • bases 3 to 8 lowercase letters
  • bases 9 to 17 and 21 to 27 are respectively homologous to nucleotides 1 to 9 and 13 to 19 of the sequence of the open reading phase of the human reductase gene
  • bases 18 to 20 in bold characters
  • This mutation makes it possible to destroy the fork structure of the RNA transcribed in the first 20 base pairs, responsible for the inhibition of translation in yeast (Baim et al., 1988).
  • Primer N2 5'-CGgaattcAGATCTAGCTCCACACGTCCAGG-3 '(SEO ID n ° 2), bases 1 to 2 form a GC clamp, bases 3 to 8 (lowercase letters) correspond to the EcoRI site, bases 9 to 14 (letters underlined ) correspond to the Bgfll site, bases 14 to 16 (bold characters) correspond to the stop codon (complementary strand) and bases 13 to 31 are complementary to nucleotides 2018 to 2034 of the open reading phase of the human reductase gene.
  • ADE2 / pFL Stotz & Linder
  • the yeast ADE2 gene was modified to construct the vector pPLIOO.
  • the internal Bgftt site of the gene is destroyed by mutating adenosine at position 593, from ATG, into guanine. This mutation does not change either the amino acid sequence or the protein activity.
  • a BglI site is introduced into the 5 ′ region of the ADE2 gene at position -373 from the initiation codon.
  • the gene has a Bgf11 site at position 1862 from the ATG.
  • the 2241 bp BglII fragment is cloned into the vector pFL36 at the Bgf11 site (Bonneaud et * al., 1991).
  • - "Blue-Script" plasmid is described in the "pCR-Script TM SK (+) cloning kit” kit (Stratagene).
  • the haploid strains of opposite signs are cultivated separately in complete YPGA medium.
  • the cells are then diluted in Ringer to approximately 10 5 cells / ml.
  • a mixture of 500 ml of each of the two suspensions of haploid cells is prepared. From the mixture, 50 ml of suspension are spread over YPGA solid medium. After 8 h of growth, the cells are subionized on a selective medium which only complements the auxotrophies present simultaneously in both parents. This allows the growth of the diploid from the cross, but not the original haploids. After two days of growth, the diploid clones which appear are subcultured on the same selective medium.
  • the diploid cells are subcultured on a solid sporulation medium supplemented by diploid auxotrophy markers. After 3 days of sporulation, the spores are dissected.
  • the so-called yrac technique the spores are diluted in 1.5 ml Eppendorff tubes, at 5.10 8 cells / ml, in water containing zymolyase 10,000 (Seikagaku Kogyo Co., Tokyo, Japan) to 100 mg / ml , then incubated for 30 min at 28 ° C. A 500 ml aliquot is centrifuged at 10,000 rpm for 1 min. The cell pellet is taken up in 1 ml of water, centrifuged and taken up in 100 ml of water. The cells are vortexed for 2 min. The tube is rinsed with water by inverting it 2 to 3 times.
  • the spores which are hydrophobic, adhere to the walls of the tube, while the diploid vegetative cells remain in suspension and are eliminated by rinsing.
  • the spores are then resuspended in a solution of 0.01% (v / v) Nonidet P-40 (Sigma).
  • the detergent is removed after centrifugation.
  • the purified spores are taken up in Ringer and spread on a selective solid medium.
  • the spores are incubated in a solution (55% glycerol) of cytohelicase (Biosepra) at 0.5 g / l for 15 min at 22 ° C, then spread on a piece of agar previously cut and placed on a coverslip. The coverslip is then placed upside down on a microdissection chamber. The four spores, contained in a tetrad, are separated under a microscope using the micromanipulator. The station, supporting the tetrads thus dissected, is deposited on a box of YPGalA complete medium.
  • cytohelicase Biosepra
  • Amplification by PCR The promoter DNA of the yeast glyceraldehyde phosphodehydrogenase gene was cloned by the PCR technique from 100 ng of genomic DNA of S. cerevisiae W (N) prepared according to the method described (Bellamine et al., 1994), using as primers 50 ng primers N3 (SEQ ID No. 3) and N4 (SEQ ID No. 4) (Fig 9). The amplification is done with 2.5 U of Pfu native DNA polymerase (Stratagene).
  • the polymerization reaction takes place in 50 ml of a 20 mM Tris-HCl solution, 10 mM KC1, 6 mM (NH4) 2S ⁇ 4, 2 mM MgCl2 0.1% Triton X-100, 10 mg / ml of "alr ⁇ imin serum "nuclease-free and 200 mM from each of the four deoxynucleotidetriphosphates (dNTP).
  • the PCR conditions are as follows:
  • the primer sequences are:
  • the size of the amplified DNA is 691 bp. 26 ml of 7.5 M ammonium acetate and 4 ml of water are added to the 50 ml of the PCR product. The mixture is precipitated with 80 ml of ethanol for 10 min at 22 ° C. The precipitated DNA is centrifuged at 10,000 rpm for 10 min. The pellet is washed with 70% ethanol (v / v), dried, and taken up in 20 ml of water.
  • the vector pAB1 thus linearized (fragment of 3652 bp) is then cut, at its 5 ′ end by BamHI then cloned into the vector pUP81 between the EcoRV and BamHI sites.
  • the HindIII site made blunt end, adapts to the EcoRV site which is blunt end, while the two BamHI half-sites of the pGAPDH fragment and of the integration vector pUP81, bind together.
  • the EcoRV site was chosen to disrupt the URA3 gene at the same time (Fig 9).
  • the clones are sorted by enzymatic restriction with the enzymes Pstl and BamHI. Those which give DNA fragments of 600 and 800 bp in addition to fragments 60, 104, 197, 385, 440 and 2564 bp (fragments which exist in the vector pUB81), represent the vectors pUP81 containing the DNA of the promoter GAPDH . This construction is called pAB2. Three clones containing the plasmid pAB2 are verified by sequencing on 100 bp with the primer N3 (SEQ ID No. 3) from the 5 ′ end of the DNA of the promoter of the GAPDH gene.
  • PCR 1 the 353 bp of the 3 ′ end of the promoter of the yeast cytochrome b5 gene (Yb5), were amplified using the primers N5 (SEQ ID No. 5) and N6 (SEQ ID n ° 6) and the yeast genomic DNA W (N): - Primer N5: 5 , -ggatccGAGCGGGTAATAGCCTGGAGTTTCC-3 '(SEQ ID n ° 5), has a BamHI site from its 5' end (in letters lower case).
  • This primer is homologous, from base 7 to 31, to nucleotides -331 to -306 of the open phase of the promoter of the yeast cytochrome b5 gene.
  • Primer N6 5'-ccgactgctctgccatGATTGTTTGATATTTTATGTTGTAGTTGATTG-
  • 3 '(SEQ ID No. 6) comprises from its 5' end: base 1 to 16 the sequence complementary to the first 16 nucleotides of the 5 'end of the open reading phase of the human cytochrome b5 gene (letters lower case), base 17 to 49 the sequence complementary to nucleotides -1 to -32 of the promoter of the yeast cytochrome b5 gene.
  • the amplified fragment is 375 bp.
  • 5'-cctamcatggcagaggactgaATTCTTTTTCTTCCAGAATAGCCCACAC- 3 '(SEQ ID No. 7), comprises from its 5' end: base 1 to 22: sequence homologous to nucleotides 383 to 405 of the open phase of the human cytochrome b5 gene (lowercase letters) , base 23 to 50 the sequence homologous to nucleotides 1 to 28 of the terminator from the stop codon.
  • Primer N8 5'-GGagatctGTGACATACTTCTATGCGATATAG-3 '(SEQ ID n ° 8), comprises from base 1 to 2 a GC clamp and a Bgl ⁇ l site from base 3 to 8 (in lower case letters).
  • This primer is complementary, from base 9 to 32, to nucleotides 1 to 147 of the open phase of the terminator of the yeast YCYB5 gene from the stop codon.
  • the amplified fragment is 180 bp.
  • PCR 1 and 2 the genomic DNA of the yeast W (N) is used as a template.
  • PCR 3 In a third PCR (PCR 3), 4 primers are used:
  • the product of this PCR is then amplified by the primers N5 (SEQ ID No. 5) and N8 (SEQ ID No. 8), this made it possible to have the integration cassette in greater quantity.
  • the fusion product is treated after amplification with Pfu polymerase in the presence of 0.2 mM dNTP for 30 min at 76 ° C. The fragment obtained makes 917 bp.
  • Amplifications are made with Taq polymerase (Appligen).
  • the PCR programs used are as follows:
  • the integration cassette thus constructed (CIH), is cloned into the vector pCRScript at the Sfr1 site.
  • the clone obtained pLIP1 is controlled by sequencing on 200 bp at the two junctions: the promoter and the terminator of the yeast YCYB5 gene and the coding phase of the human cytochrome b5 gene.
  • a new integration cassette comprising the coding phase of the human cytochrome b5 gene and the entire promoter and terminator of the YCYB5 yeast gene was constructed from the 917 bp BamHI / Bglll fragment of the vector pLIPl.
  • the vector YCYB5 / YEP352 which contains the entire yeast YCYB5 gene (Truan et al., 1994), is cut at a single ClaI site. This linearized fragment is cotransformed in the strain W (N) a with the BamHI / Bgill fragment of 917 bp of the vector pLLP1.
  • the selection of the recombinants is done by recircularization of the expression vector (Bellamine et al., 1994).
  • the new vector pAB3 is recovered from yeast and then amplified in the E. coli bacterium according to the method described (Bellamine et al., 1994).
  • a cassette for integrating the human cytochrome b5 gene in the immediate vicinity of the L ⁇ U2 gene in the intergenic region with 500 bp of the SPL1 gene was constructed in two stages: - Construction of the vector pCD26: from the vector pFL26 (Bonneaud et al., 1991) carrying both the LEU2 gene and 500 bp of the SPL1 gene, a NotI site was introduced in three PCRs (Figl3).
  • the 704 bp of the 3'- part of the LEU2 gene are amplified using the primers N9 (SEQ LD n ° 9) and N10 (SEQ LD n ° 10):
  • Primer N9 5'-TTGAAGGTTCAACATCAATTGATTG-3 (SEQ ID No. 9) 'is homologous to nucleotides 2190 to 2214 of the vector pFL26 which correspond to the end of the open phase of the LEU2 gene (the numbering, at the level of the vector pFL26, is made from nucleotide 1 placed 417 bp upstream of the BamHI site).
  • - Primer N10 5'-GTGTGgcggccgcCTCCTTGTCAATATTAATGTTAAAG-
  • the last 347 bp of the 3 ′ part of the SPL1 gene are amplified using the primers NI 1 (SEQ ID No. 1 1) and NI 2 (SEQ ID No. 12):
  • Primer Nil 5'-CAAGGAGgcggccgcCACACAAAAAGTTAGGTGT-3 '(SEQ ID No. ll), has at its 5' end, seven bases complementary to nucleotides 2875 to 2881 of the vector sequence pFL26, a Notl site of base 8 to 15 and a sequence homologous to nucleotides 2889 to 2908 of pFL26, from base 16 to 34.
  • - Primer N12 5'-TCTGCTTCCCTAGAACCTTCTTATG-3 '(SEQ ID No. 12) is complementary to nucleotides 3198 to 3222 of the 3' end of the strand coding for the open phase of the SPL1 gene in the vector pFL26.
  • PCRs (having 20 bp overlap which contain the NotI site), are used as template and primers N9 and N12 as primers.
  • the amplified 1031 bp are cloned into the vector pFL26 at the NsIl and BstXl sites to give the vector pCD26.
  • the amplifications are carried out with Taq polymerase Applig necessarily.
  • the first two PCRs use the same program as PCRs 1 and 2 of paragraph 8, the
  • PCR 3 uses the following program: 30 cycles.
  • the plasmid pYeDP60 is a shuttle vector (bacteria, yeast) of 9265 bp having the origins of replication ori E. coli and ori 2 ⁇ ⁇ _ the bla gene which codes for resistance to ampicillin, the URA3 and ADE 2 genes which are markers of auxotrophy complementations, a hybrid promoter GAL10-CYC1 inducible in the presence of galactose and the transcription terminator of the PGK gene.
  • a polylinker comprising inter alia the BamHI, KpnI, EcoRI restriction sites is inserted between promoter and transcription terminator at the end of cloning of a cDNA to be expressed.
  • Plasmids 1A1 / V60 and 3A4 / V60 correspond to the vector V60 in which the coding phases of the cDNAs coding respectively for human cytochrome P450 1A1 and 3 A4 were inserted under the control of the promoter GAL10-CYC1 and the transcription terminator PGK.
  • the yeasts are transformed with the plasmids 1A1 / V60 or 3A4 / V60 according to the standard method known as "lithium chloride".
  • the transformants are selected on a culture medium of synthetic yeast glucose devoid of adenine and uracil (SW6) to which is added the nutrients necessary to complement the residual auxotrophies according to the strain used (see genotype of the strains).
  • SW6 synthetic yeast glucose devoid of adenine and uracil
  • a high proportion of the primary transformants selected on the miheu glucose do not grow on a minimum galactose culture medium. Only the clones which develop correctly on galactose medium are preserved
  • the selected clones are subcultured on minimum medium which is non-glucose inducing selective for the plasmid (generally medium SW6), then incubated overnight at 28 ° C. in 20 ml of the same liquid medium.
  • YPGE medium 250 ml of YPGE medium are seeded with the preculture and incubated with shaking at 28 ° C until a cell density between 8 and 9.6 10? cells / ml.
  • Galactose is then added at a concentration of 20 g / l, and the culture is incubated at 28 ° C overnight, so as to obtain a cell density of 2 10 ° cells / ml.
  • the presence of galactose allows the induction of cytochrome P450 and other genes dependent on the GAL10-CYC1 promoter.
  • the cells are centrifuged and washed in TE buffer pH 7.4 (Tris-HCl, 50 mM; EDTA 1 mM); 0.1 M KCl, and resuspended in TE buffer pH 7.4;
  • Sorbitol 0.6 M In order to break the cells, glass beads are added and the tubes are vigorously shaken from bottom to top for 5 min at 4 ° C. The following steps are carried out at 4 ° C. The suspension of broken cells is recovered and the beads are washed several times with the same buffer. In order to remove the cellular debris, the nuclei and the mitochondrial fraction, two centrifugations respectively of 3 min at 3500 rpm and 10 min at 15000 rpm are carried out. To precipitate the microsomes, the supernatant is incubated in the presence of NaCl (0.15 M final) and PEG
  • microsome preparation 10,000 rpm the pellet of microsomes is recovered in TE buffer pH 7.4; 20% glycerol. The microsome preparation is aliquoted and stored at -80 ° C.
  • the concentration of cytochrome P450 in the microsomal fractions is determined spectrally.
  • the cytochrome P450 to be assayed is diluted in TE buffer pH 7.4 (approximately 1 mg of microsomal proteins per ml) and reduced by a few grains of sodium dithionite.
  • TE buffer pH 7.4 approximately 1 mg of microsomal proteins per ml
  • a few CO bubbles are added to the measurement cell and the differential spectrum is measured between 400 and 500 nm.
  • CO forms a stable complex with reduced iron from cytochrome P450, this complex has a maximum characteristic absorption at 450 nm.
  • the absorption coefficient _ ⁇ M (450-490 nm) is 91 mM " 1. cm" 1 .
  • Cytochrome P450 1A1 catalyzes the O-desethylation of 7-ethoxyresorufin.
  • the amount of resorufin formed per unit of time corresponds to the rate of accumulation of resorufin.
  • the incubation mixture includes:
  • microsomal fractions are previously incubated in the cold in the presence of an excess of purified cytochrome.
  • Testosterone is a steroid hormone hydroxylated in position 66 by cytochrome 3 A4.
  • the incubation medium comprises 100 ⁇ g of microsomal proteins in 0.25 ml of 50 mM Tris buffer, 1 mM EDTA pH 7.4 or 50 mM sodium phosphate pH 7.4, containing 50 ⁇ M NADPH, 80 ⁇ M testosterone ( from a 5 mM stock solution in ethanol), in the absence or in the presence of an excess of cytochrome b5.
  • Incubations take place for 10 min at 28 ° C or 37 ° C.
  • the reaction is stopped by adding 10 ⁇ l of 50% TFA in water.
  • the extraction procedure is as follows:
  • the dry residue is taken up with 20 ⁇ l of methanol, then 20 ⁇ l of water are added.
  • Half is injected into a reverse phase HPLC column SPHERI-5RP-18.5 ⁇ m (100 x2, l mm) using as eluent acetonitrile at 1 ml / min.
  • the acetonitrile composition of the elution gradient varies from 10% (vol / vol) at 0 min to 60% at 8 min. Detection is carried out at 254 nm.
  • the elution times are 6 min 20 s for ⁇ -hydrOxytestosterone and 8 min for testosterone.
  • the strain W ( ⁇ B) a (which grows on medium W0ABLF) and the strain W (hR) a (which grows on medium W0ADIF) are crossed between them and the diploid is selected on glucose medium W0AIF.
  • This medium is lethal for each of the haploids and not for the diploid W (hR / YR, Yb5 / ⁇ Yb5).
  • the diploid clones are subcloned on the same selective medium. After sporulation, the tetrads are dissected either by microdissection or by bulk dissection.
  • the spores cultivated on YPGalA medium are then subcultured on different selective media containing galactose as a carbon source, in order to test the auxotrophies of the different spores.
  • the yeast clones which grow on galactose medium and which are prototrophic for uracil and histidine correspond to the strain W (hR, ⁇ B). These yeasts no longer grow when the galactose is replaced by glucose on the same medium because, under these conditions, human reductase is not expressed.
  • These strains then being deficient both in reductase and in yeast b5 (whose gene is disrupted), do not grow because the double impairment is lethal (Truan et al., 1994).
  • Four clones are retained for the rest: Spl and Sp2 obtained by microdissection, and Cl and C2 obtained by bulk dissection.
  • the integration vector of the promoter GAPDH pAB2 cut by NotI is used to transform the strain W (hR, ⁇ B) a.
  • the vector pPLIOO is used as a cotransformation marker (10 to 15 ng of DNA from the vector pPLIOO for 2 mg of DNA from the vector pAB2).
  • the transformants are selected on WOBDIF medium.
  • the clones obtained are subcultured on solid N3 medium in order to test their respiratory phenotype.
  • the three clones do not grow on N3. They are therefore negative breathing phenotypes.
  • these clones are crossed with a strain of phenotype positive breathing W ( hR) a.
  • the diploid obtained W (GhR / hR, ⁇ B / Yb5) is selected on WOAIF medium.
  • the genomic DNA of the haploids is prepared and then a PCR using the primers N13 (SEQ LD No. 13) and N14 (SEQ ID No. 14) is carried out on this DNA.
  • bases 1 to 30 are homologous to the 30 nucleotides of the 5'-end of the reading phase of the yeast YCYB5 gene.
  • bases 1 to 42 are complementary to nucleotides 321 to 363 of the strand coding for yeast b5.
  • three clones have an amplified band at 363 bp (the coding phase of the yeast cytochrome b5 gene), the other three clones have a band of 2063 bp which corresponds to the sum of the size of the HIS3 gene (1700 bp) and the size of the open phase of yeast b5 (363 bp).
  • These clones are subcloned on solid WOABIF medium to test their auxotrophy with respect to histidine. All the clones grow in the absence of histidine whereas 50% of them (those which have the PCR band amplified to 363 bp) are supposed to be auxotrophic to histidine.
  • the 4 clones SP1, SP2, Cl and C2 are cultured in complete liquid YPGalA medium and transformed by the Pvull fragment of 2022 bp from the vector pAB3 (FIG. 12).
  • the transformants are spread on YPGA medium.
  • the selection of integrants is made on the capacity of human cytochrome b5 to save the W strain (hR, ⁇ B) from h lethality on glucose medium.
  • the clones which have grown are grouped together in batches. Genomic DNA of each batch is prepared. A PCR using primers N5 (SEQ ID No. 5) and N15 (SEQ ID No. 15) is carried out (same conditions as PCRs 1 and 2 in paragraph 8).
  • bases 1 to 2 GC clamp, bases 3 to 8 correspond to the EcoRI site (lowercase letters), bases 9 to 14 correspond to the Bell site , bases 12 to 14 correspond to the stop codon and bases 15 to 33 are complementary to nucleotides 386 to 405 of the open reading phase of the human cytochrome b5 gene.
  • Clones B1 and B2 are cultured in complete liquid YPGA medium and transformed by the 2022 bp Pvull fragment of the vector pAB3, as well as by the vector pPLIOO as marker for cotransformation. The transformants are selected on solid W0BDIF medium. The growing clones are then grouped together in batches and analyzed by PCR using the primers N3 (SEQ ID No. 3) and N13 (SEQ ID No. 13). In the same way as in the previous paragraph, the individual clones are verified by PCR.
  • the integration vector pAP1 is cut by Xbal.
  • the 4 clones SP1, SP2, Cl and C2 are transformed by this linearized fragment.
  • the transformants are spread on YPGA medium.
  • the expression cassette for human cytochrome b5 under the control of the promoter and the terminator of the PGK gene, integrates into the intergenic site Ieu2 / SPL1 (FIG. 14). This recombination makes it possible at the same time to replace the leu2-3 gene inactive in the genome by wild LEU2 carried by the vector pAP1.
  • a first selection of the transformants is done on the restitution of the LEU2 gene, that is to say the prototrophy of the transformants with respect to leucine (selection medium W0AI).
  • a second selection is made by DNA PCR genomics of the transformants using primers N9 (SEQ ID No. 9) and N16 (SEQ LD No. 16), and the PCR conditions described in paragraph 9.
  • the clones which present a PCR band at 1495 bp have integrated the cassette of expression of hb5.
  • - Primer N16 5'-GCCCAGATCTATGGCAGAGCAGTCGGACG-3 '(SEQ ID No. 16), comprises from base 1 to 4 a GC clamp sequence, from base 5 to 10 a Bglll site and from base 11 to 29 a homologous sequence at nucleotides 1 to 19 (from ATG) of the open phase of the human cytochrome b5 gene.
  • this strain is made in the same way as the strain W (hR, Lhb5) but starting from W (GhR, ⁇ B).
  • the selection of the transformants is made directly on WOABI medium and then by PCR analysis on the genomic DNA.
  • the strain W (R) is cultured in complete liquid YGPA medium and transformed by the vector pAP1 linearized by Xbal.
  • a first selection of transformants is made on the restitution of the LEU2 gene, ie the prototrophy of the transformants with respect to leucine (WOAI selection medium).
  • a second selection is made by PCR on the genomic DNA of the transformants using the primers N9 (SEQ ID No. 9) and N16 (SEQ ID No. 16), and the PCR conditions described in paragraph 9 (equipment and methods).
  • the clones which display a 1495 bp PCR band integrated the hb5 expression cassette.
  • This strain overexpresses yeast reductase in the presence of galactose and expresses human cytochrome b5 under the control of the PGK promoter.
  • the expression of endogenous b5 is unchanged compared to the normal strain.
  • Example No. 8 Construction of the strain W (hR, Lhb5, Yb5):
  • the construction is identical to that of the strain W (R, Lhb5, Yb5) but the strain W (R) is replaced by the strain W (hR).
  • Example No. 9 Level of expression of cytochrome P450 in the yeast strains according to the invention.
  • the expression levels of two P450 cytochromes in the different strains are shown in Tables II and III.
  • the level of expression of cytochrome P450 is significantly increased in equivalent culture conditions in humanized strains. It is noted that the activity per mg of protein is increased in proportion to both the level of expression and the value of turnover
  • Table II Expression of human cytochrome P450 1A1 in humanized yeast microsomes.
  • cytochrome P450 spectral determination
  • cytochrome P450 spectral determination
  • Example 10 Effect of reductase and cytochrome b5 on the enzymatic characteristics of cytochromes P450 1A1 and 3 A4 produced in yeast.
  • 1A1 is optimal in the haploid strain W (R, LHb5) which overproduces yeast reductase and produces human cytochrome b5.
  • the addition of rabbit cytochrome b5 nevertheless produced a slight additional increase in activity which reached a turnover of 27 pmole of metabolite / pmole of cytochrome P450 per min.
  • the catalytic efficiency of cytochrome P450 3A4 is preferentially increased in yeast strains expressing human reductase.
  • the W strain (GhR, hb5) shows an optimal catalytic efficiency.
  • the presence of the cDNA coding for cytochrome b5 in the genome of the strains results in an increase in catalytic efficiency (by a factor of 2 to 20).
  • the deletion of the endogenous cytochrome b5 gene appears to be a highly favorable factor, particularly in the presence of expressed human b5.
  • human reductase the disruption of endogenous cytochrome b5 and the expression of human b5 in the same strain of haploid yeast constitutes a group particularly favorable for the expression of certain human cytochrome P450, in particular cytochrome P450 3A4.
  • Example 11 Construction of plasmids allowing the co-expression of a cytochrome P450 and human microsomal cytochrome b5.
  • This example describes the construction of plasmids which can be used to optimize the P450 activity of the yeast strains according to the invention. These plasmids allow expression simultaneous cytochrome P450 and human microsomal cytochrome b5. All the plasmids in the series contain the original set of the following common characteristics:
  • the P450 expression cassette is preferably under the transcriptional control of the inducible promoter GAL10-CYC1.
  • the cytochrome b5 expression cassette is preferably under the transcriptional control of one of the following three promoters: GAL10-CYC1, GAPDH or PGK.
  • Two selection markers are present, one of which is preferably the yeast ADE2 gene.
  • the two expression cassettes are separated on the plasmid on one side by the origin of yeast replication, on the other side by the marker ADE2.
  • these promoters have reversed orientations on the plasmid (with respect to a rotation of the plasmid).
  • Two different transcription terminators are used, preferably those of the PGK genes and of the yeast P450 reductase. The object of all of these properties is to obtain stable plasmids, in particular with respect to the phenomena of homologous recombination.
  • the plasmids of the series differ in the nature of the promoter used for the expression of cytochrome b5. This property makes it possible to modulate the relative levels of expression and to optimize them for different culture conditions or applications.
  • the vector described in FIG. 15, pYeDPl / 10 / Hb5, contains the POL (open reading phase) of human cytochrome b5 bordered immediately upstream of the initiation codon by a BglII site and immediately downstream of the STOP codon by a EcoRI site.
  • the BglII-EcoRI cassette being included in the expression vector pYeDPl / 10 (Cullin and Pompon, Gene. 65 (1988) 203-217). This vector is digested with BamHI and Hindlll.
  • the 2310 bp fragment which contains the promoter sequences and of the PGK gene terminator and the sequence coding for human cytochrome b5 is recovered and then treated with the Klenow fragment of DNA polymerase in order to make the ends blunt.
  • the vector pYeDP60 is digested with the restriction enzyme EcoRV and the fragment of 5819 bp recovered. This contains the origins of replication for yeast and E. coli. This fragment is recircularized on itself and gives the vector pAP2.
  • This vector is digested with Pvull and the 2310 bp fragment derived from the vector pYeDP1 / 10 / Hb5 is inserted therein in the orientation giving the vector pAP3, the expression cassette of which is in accordance with FIG. 17.
  • This vector is digested BglI.
  • the 7012 bp fragment is recovered.
  • the vector pYeDP60 is linearized by Pvull and the band which corresponds to the linearized plasmid is purified.
  • a yeast culture derived from a clone of the strain W (N) is cotransformed by the linear plasmid and the 7012 bp fragment and prototrophic clones for uracil and adenine are selected.
  • the cytochrome b5 expression cassette under the control of the promoter and the terminator of the PGK gene replaces the Pvull site of the vector pYeDP60 and gives the final vector pAP4 (FIGS. 16 and 17).
  • the plasmid DNA corresponding to the vector pAP4 is recovered from the yeast and used to transform E. coli (Amp 1 " ). After selection, amplification and control of the structure of the plasmid by restriction, the POL of the cytochrome P450 of interest is inserted in the vector pAP4 in the multiple cloning zone situated between the promoter G AL 10-CYCl and the terminator of the PGK gene. The resulting plasmid is used to transform, by selection of prototrophic clones for adenine and uracil, the strain of receptor yeast preferably chosen from those described in this patent.
  • Example 11.2 Construction of the plasmid pVD2 allowing the expression of a P450 under the control of the GAL10-CYC1 promoter and of human b5 under the GAPDH promoter.
  • the vector pYeDP1 / 10 / Hb5 is digested with BglII and EcoRI to leave the band coding for human cytochrome b5.
  • the band of 417 bp corresponding to the POL of b5 is purified and then cloned into pAB2 digested with BamHI and EcoRI.
  • the EcoRI site is then destroyed by digestion with EcoRI and then filling of the site using the DNA polymerase klenow fragment and then recircularization with the ligase.
  • This plasmid of 4993 bp is called pVD1 (FIGS. 16 and 18).
  • the pVD1 expression cassette is then amplified by PCR using the primers N17 (SEQ ID No. 17) and N18 (SEQ ID No. 18) as primers.
  • the amplified band is 1753 bp.
  • the primers are designed to add, at the two ends of the expression cassette, feet of homologous recombinations to the region situated around the unique Pvull site of pYeDP60.
  • homologous recombination see example 11.1. And FIG. 17 between pYeDP60 linearized at the Pvull site and dephosphorylated by alkaline phosphatase, and the expression cassette amplified by PCR, the vector pVD2 in accordance with FIGS. 16 and 19 is then obtained.
  • the structure of the vector is verified after shuttle in yeast (cotransformation) then E. coli (selection and amplification) by digestion with PstI and Hindlll.
  • the desired plasmid with a 10994 bp digestion band is called pVD2 ( Figure 19).
  • the different junctions of the expression cassette are verified by sequencing using the primers NI 9 (SEQ ID No. 19) and N20 (SEQ ID No. 20).
  • Example 1.3 Construction of the plasmid pVD3 allowing the expression of a P450 under the control of the GAL10-CYC1 promoter and of human b5 under the GAL10-CYC1 promoter.
  • the POL of human cytochrome b5 is obtained from pYeDP1 / 10 / hb5 in the form of a BglII-EcoRI fragment.
  • This POL is introduced by ligation between the BamHI and EcoRI sites of the plasmid pYeDPHO, described in FIG. 15, which contains a sequence block consisting of (i) sequences located immediately upstream of the promoter region of the gene for the
  • Yeast P450 reductase (ii) of the URA3 gene, (iii) of the GAL10-CYC1 promoter, (iv) of the transcription terminator of the yeast P450 reductase gene.
  • the EcoRI site of the plasmid resulting from the ligation is destroyed by cutting-filling-ligation to give a plasmid of 5551 bp called pVD3.
  • GAL10-CYC1 is then amplified by PCR using primers N17 and N18 in a similar manner to example 12.
  • the amplified band of 2365 bp is purified and then introduced as before by homologous recombination instead of the Pvull site of pYeDP60 (idem as in FIG. 19 by substituting the GAPDH promoter with GAL10-CYC1).
  • the nature of the recombination foot sequences introduced by PCR imposes an opposite orientation of the two GAL10-CYC1 cassettes present on the recombinant plasmid as indicated in the description of the general structure of the plasmids of the invention.
  • the 11595 bp plasmid, called pVD4 and in accordance with FIG. 16 is then selected after yeast-Ecoli shuttle.
  • the junction between the promoter GAL10-CYC1 and the cytochrome b5 gene is verified by sequencing using the primer N21 (SEQ LD n ° 21).
  • N2 5'-CGGAATTCAGATCTAGCTCCACACGTCCAGG-3 '.
  • N6 5'-CCGACTGCTCTGCCATGATTGTTTGATATTTTATGTTGTAGTTGATTG-3.
  • N7 5'-CCTATACATGGCAGAGGACTGAATTCTTTTTCTTCCAGAATAGCCCACAC-3 '
  • N10 5'-GTGTGGCGGCCGCCTCCTTGTCAATATTAATGTTAAAG-3 '.
  • N 14 3'-CGGATTCTGCAGTTATTCGTTCAAC AAATAATAAGC AACACC-3 '.
  • SEQ LD n ° 15 N15: 5'-CCGAATTCTGATCAGTCCTCTGCCATGTATAGG-3 '.
  • SEQ LD n ° 16 N16: 5'-GCCCAGATCTATGGCAGAGCAGTCGGACG-3 '.
  • SEQ ID # 17 N17: 5'-ggcgttacccaacttaatcgccttgcacatccccctttcgcc GGAACGTGCTGCTACTCATCCTAGTCC
  • the first 42 bases are homologous to the region between bases 4069 and 4113 of pYeDP60.
  • bases 43-69 the nucleotides of the primer are homologous to the region of pUB81 between bases 5772 and 5799 which correspond to a region of the URA3 gene.
  • the first 43 bases are homologous to the complementary strand of the region of pYeDP60 comprised between bases 4114 and 4157.
  • Bases 44 to 71 are homologous to the region of pUB81 comprised between bases 2507 and 2538.
  • This primer is homologous to the region between 4102 to 4125 of pVD2 corresponding to the end of the open reading phase of the URA3 gene close to the cassette for integrating human cytochrome b5 under the promoter GAPDH.
  • This primer for sequencing is homologous to the part of pVD2 between bases 4835 and 4860 corresponding to the end of the GAPDH promoter. (SEQ ID n ° 21) N21: 5'- ggcatgcatgtgctctgtatg
  • This primer for sequencing is homologous to the promoter region
  • GAL10-CYC1 located -120 bp from the junction between the GAL10-CYC1 promoter and
  • Xenobiotic metabolism in humanized yeast engenieered yeast cells producing human NADPH- cytochrome P450 reductase, cytochrome b5, epoxide hydrolase and cytochrome P450s, Biochem Soc Transact 21, 1028 -1033.
  • NAME RHONE POULENC RORER S.A.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention concerne des souches de levures exprimant des gènes humains codant pour des enzymes régulant l'expression du cytochrome P450, leur procédé de fabrication ainsi que leurs applications.

Description

SOUCHES DE LEVURES GENETIQUEMENT MODIFIEES
La présente invention concerne de nouvelles souches de levures exprimant une activité cytochrome P450 et leur utilisation. Elle se rapporte en particulier à des souches de levures capables de produire un système d'enzymes cytochromes P450 humaines et les plasmides utilisés pour leur construction.
Les cytochromes P450 constituent une super famille d'enzymes membranaires. Ce sont des monooxygénases qui interviennent plus particulièrement dans le métabolisme des xénobiotiques et des médicaments.
Elles sont notamment utilisées dans :
- le diagnostic in vitro de la formation de métabolites toxiques ou mutagènes par le métabolisme hépatique humain de molécules xénobiotiques naturelles ou artificielles (polluants médicaments ou additifs ). Ce diagnostic est primordial pour le développement de nouvelles molécules pharmaceutiques,
- l'identification et la destruction de molécules toxiques ou polluantes de l'environnement et
- la production de métabolites.
Du fait de leur implication, à la fois dans ces processus de détoxication et ces phénomènes de toxicité, ces protéines ont été largement étudiées (Guenguerich, 1988).
Toutefois, ces études se sont heurtées rapidement à des difficultés telle que l'étude de formes individuelles de cytochromes P450. Pour pallier à ces problèmes, les systèmes d'expression hétérologues ont alors été développés.
L'utilisation des cellules mammifères comme hôtes d'expression hétérologue a été développée depuis 1986 (Zuber et al., 1986). Ces systèmes ont l'avantage d'être proches des cellules hépatiques (localisation majoritaire des cytochromes P450), mais souffrent malheureusement de bas niveaux d'expression. En ce qui concerne les hôtes procaryotes, tels que les bactéries, ils permettent certes d'avoir des quantités importantes de cytochrome P450 correctement repliés
(Bames et al., 1991), mais avec ce type d'hôtes on observe des modifications incontournables de la partie 5'terminale exprimée de l'ADN (Doehmer & Greim, 1992).
En revanche le choix d'hôtes eucaryotes de type levure est tout particulièrement avantageux : cet organisme permet de se mettre dans des conditions proches de celles des cellules hépatiques humaines et conduit à un niveau d'expression en protéines élevé. En outre la levure possède sous forme endogène toute la machinerie enzymatique nécessaire à l'expression des protéines membranaires, du type cytochrome P450, et de leurs enzymes associés, c'est ainsi qu'elle dispose d'un cytochrome b5 et d'une NADPH-cytochrome P450 réductase, deux enzymes dont la présence est nécessaire au fonctionnement du cytochrome P450.
La levure offre donc une solution avantageuse aux différents problèmes (Oeda K. et al., 1985; Pompon, 1988), puisque avec cet organisme :
- les protéines exprimées n'ont pas besoin d'être modifiées au niveau de leur séquence N-terminale (comme pour l'expression dans la bactérie)
- on obtient des quantités raisonnables de cytochrome P450 hétérologues pour différentes études biochimiques et structurales, - un système d'enzymes associés y existe déjà.
Parmi les levures particulièrement étudiées pour l'expression de protéines hétérologues, on peut citer notamment Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida et Saccharomyces dont on connaît bien la structure du génome. Différents systèmes d'expression de cytochrome P450 dans des levures ont été décrits dans la littérature.
Dans les souches dites de première génération les cytochromes P450 ont été exprimés à partir de plasmides et utilisent comme donneurs d'électrons la NADPH- cytochrome P450 réductase et le cytochrome b5 endogènes de levure (Pompon, 1988; Cullin & Pompon, 1988). Une première amélioration de ce système a donné lieu à des souches dites de deuxième génération où la cytochrome P450 réductase de la levure a été surexprimée (sous le contrôle du promoteur GAL10-CYC1) et un cytochrome b5 humain coexprimé (brevet WO93/02200et Truan et al., 1993). Ces souches ont ainsi permis d'obtenir des activités enzymatiques du cytochrome P450 recombinant 5 à 60 fois plus importantes selon risoforme que dans la souche de départ
Toutefois les systèmes existants ne donnent pas entièrement satisfaction : soit ils ne permettent pas d'avoir une expression suffisante des protéines, soit les protéines obtenues ne sont pas assez proches du système humain. La présente invention à précisément pour objectif de proposer une troisième génération de souche ne présentant pas les inconvénients précités. De manière inattendue, la demanderesse a mis en évidence qu'il était possible de remplacer simultanément la NADPH cytochrome P450 réductase et le cytochrome b5 de levure par leurs homologues humains. Ceci est d'autant plus surprenant que la disruption simultanée de ces deux gènes était connue pour être létale chez la levure et que jusqu'à présent il n'était pas possible d'obtenir une souche viable ayant les deux gènes délétés.
Dans les souches revendiquées, la cytochrome P450 réductase et/ou le cytochrome b5 de levure ont été substitués par leur homologue humain. Ceci permet très avantageusement la création d'un système très proche des cellules hépatiques, étant donné que tout le système multienzymatique est alors de même nature.
Ce nouveau système, permet d'étudier l'effet de la nature des partenaires rédox des cytochromes P450 exprimés ainsi que les stoechiométries nécessaires à des activités cytochrome P450 comparables à celles qui existent dans le foie.
Le premier objet de l'invention réside donc dans une souche de levure génétiquement modifiée caractérisée en ce que:
1° Les gènes codant pour le cytochrome b5 endogène et pour la NADPH-cytochrome P450- réductase endogène ont été inactives,
2° Elle contient un acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine, 3° Elle contient un acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain.
Les acides nucléiques utilisés pour intégrer dans la souche les gènes codant pour le cytochrome b5 humain et la réductase humaine sont préférentiellement des ADNc. Les ADNc contenant la totalité de la séquence codante pour ces deux protéines ont été isolés et séquences (pour la réductase humaine voir S Yamano et al. Mol. Pharmacol. 1989 vol. 36 : 83-8, et pour le cytochrome b5 humain voir M Miyata et al. Pharmacol. Res. 1989 vol. 21 : 513-20).
Tout aussi préférentiellement la levure choisie est Saccharomyces cerevisiae
Au sens de la présente invention, on entend par gènes inactivés, un gène rendu incapable de coder pour sa protéine naturelle. L'incapacité desdits gènes à coder pour leurs protéines naturelles peut se manifester soit par la production d'une protéine inactive en raison de modifications structurales ou conformationnelles, soit par l'absence de production, soit par la production de la protéine naturelle à un niveau atténué.
L inactivation des gènes natifs peut être obtenue selon différentes méthodes:
- une délétion totale ou partielle du gène. Par délétion on entend toute suppression du gène considéré. Il peut s'agir d'une partie de la région codant pour la protéine et/ou de tout ou partie de la région promotrice de la transcription. - une ou plusieurs mutations ponctuelles dans le gène. Les mutations peuvent être obtenues par un traitement à l'aide d'agents mutagènes, chimiques (comme les agents alkylants, bialkylants ou intercalants ) ou d'agents mutagènes physiques (rayons XJ_g1_ultraviolet), ou par mutagenèse dirigée.
- une insertion mutationelle par action d'enzymes de restriction qui vont interrompre le cadre de lecture du gène et l'inactiver et/ou,
- une disruption génique par exemple selon le protocole initialement décrit par Rothstein [Meth. Enzymol. (1983)202]. Dans ce cas, l'intégralité de la séquence codante sera perturbée pour permettre le remplacement par recombinaison homologue de la séquence sauvage par une séquence codant pour la protéine humaine correspondante. Selon la présente invention, on utilise préférentiellement la méthode de disruption génique comme décrit ci-après.
Pour la transformation des souches revendiquées en vu de leur faire exprimer des enzymes humains selon l'invention, différentes solutions sont envisageables ; d'une part on peut transformer une souche sauvage, dont l'un des gènes a été inactivé, par un plasmide réplicatif contenant l'acide nucléique codant pour la protéine humaine correspondante. Dans ce cas l'acide nucléique n'est pas intégré dans le génome de la levure.
D'autre part on peut intégrer un acide nucléique, sous la forme d'un ADNc comprenant la séquence codant pour la protéine humaine concernée, dans le génome de la levure. Dans ce cas, l'intégration peut se faire soit dans un locus connu sur ce génome correspondant à un gène marqueur, n'altérant ni les propriétés de reproduction de la levure ni la viabilité de celle-ci, soit à la place occupée par le gène natif inactivé.
L'acide nucléique codant pour la réductase de même que l'acide nucléique codant pour le cytochrome b5, peuvent donc être introduits dans la souche selon l'une de ces méthodes.
Selon la présente invention, pour améliorer la stabilité de la souche et se placer dans des conditions plus favorables, on choisit de préférence le mode de réalisation consistant à intégrer l'acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine et/ou l'acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain dans le génome de la levure, un mode préférentiel de réalisation de la présente invention étant d'intégrer ces acides nucléiques en lieu et place des gènes endogènes.
Selon un autre mode préféré de réalisation de la présente invention on intègre le gène codant pour le cytochrome b5 humain dans un site intergénique pour un gène marqueur en particulier dans le site intergénique SPLl/leu2.
Une autre caractéristique de l'invention réside dans une souche caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain est intégré dans le génome. Un mode de réalisation particulier de l'invention consiste à faire figurer deux copie du cytochrome b5 dans la souche transformée.
Un autre problème rencontré par la demanderesse est celui de l'expression des gènes humains dans la levure a un taux suffisant II est avantageux pour cela que ces gènes soit mis sous le contrôle d'un promoteur de levure qui permet que ceux-ci soient exprimés. Ces promoteurs de levure peuvent, soit être inductibles, soit être constitutifs. Dans la présente demande on entends par promoteur constitutif un promoteur dont l'expression est constante dans les conditions standard de culture. Selon la présente invention l'un au moins des gènes humains est sous le contrôle d'un promoteur constitutif de levure.
Ce promoteur est choisi parmi les promoteurs connus. On peut par exemple utiliser les promoteurs des gènes de l'isocytochrome Cl (CYC1), de l'alcool déshydrogénase (ADH1), du facteur d'élongation de la transcription (TEF), de la glyceraldéhyde phosphodéhydrogénase de levure (ci-après GAPDH) et de la phosphoglyceratekinase de levure (ci-après PGK).
Préférentiellement le promoteur est choisi parmi le promoteur du gène de la glyceraldéhyde phosphodéhydrogénase de levure, le promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase de levure et le promoteur endogène du cytochrome b5 de levure. Il est à signaler que dans un mode particulier de réalisation de l'invention le gène codant pour le cytochrome b5 humain est sous contrôle du promoteur endogène de Yb5.
En ce qui concerne le promoteur inductible, il est choisi préférentiellement parmi les promoteurs GAL10 et CYC1-GAL10.
Jusqu'à présent on ne pouvait pas obtenir de souches haploïdes présentant les caractéristiques qui nous intéressent c'est à dire les inactivations des gènes endogènes précités et leur remplacement par des acides nucléiques codant pour les gènes humains correspondant. Il fallait rester sous forme diploïde. L'un des avantage de la présente invention est de pouvoir travailler avec des levures haploïdes ce qui permet d'avoir une meilleure stabilité et d'éviter les recombinaisons non désirées. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention les souches sont donc caractérisées en ce qu'elles sont haploïdes.
Les souches selon l'invention possèdent au moins un acide nucléique codant pour le cytochrome P450 humain. Le dit acide nucléique sera de préférence intégré sur un plasmide. Les souches de levures humanisées selon l'invention peuvent être transformées selon les techniques habituelles par un plasmide d'expression de cytochrome P450 quelconque, pourvu que le dit plasmide soit compatible au niveau de ses marqueurs de sélection avec les souches de levure développées. En particulier de tels plasmides peuvent être obtenus en clonant selon les règles de l'art la phase codante d'un ADNc codant pour un cytochrome P450 humain quelconque dans le polylinker de clonage du plasmide pYeDP60 (voir matériels et méthodes).
Le cytochrome P450 peut être en particulier choisi parmi les cytochromes
P450 humains 1A1, 1A2, 1B1, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2E1, 3A4, 3A5. Les souches humanisées selon la présente demande présentent des avantages incontestables, par rapport aux levures sauvages et par rapport aux souches recombinantes préalablement développées, pour l'expression
Un autre objet de l'invention consiste en une souche de levure selon l'invention, dans laquelle on fera s'exprimer, en outre, l'activité moncoxygénase d'un cytochrome P450 humain porté par un plasmide.
Un autre mode de réalisation de l'invention consiste à faire figurer la copie supplémentaire de l'acide nucléique codant pour le cytochrome b5 précédement décrite, sur un plasmide et notamment sur celui qui contient déjà une copie de l'acide nucléique codant pour le cytochrome P450. Pour l'obtention d'une activité optimale des P450, il est en effet particulièrement avantageux de pouvoir réaliser une stoechiométrie molaire relative au moins égale à 1/1 entre les niveaux d'expression du cytochrome b5 humain et du P450 humain. L'intégration genomique d'une seule copie du gène du cytochrome b5 peut, dans certaines circonstances, s'avérer insuffisante au regard du niveau élevé d'expression du P450, tel qu'il résulte de son expression à partir d'un plasmide multicopie selon l'invention. La présente invention permet ainsi d'améliorer encore l'efficacité du système en décrivant la construction d'une série de plasmides portant à la fois une cassette d'expression pour le cytochrome P450 d'intérêt et une cassette d'expression pour le cytochrome b5. La structure particulière de ces plasmides permet une expression stable, de haut niveau et de stoechiométrie adéquate entre les deux cytochromes. Ces plasmides sont compatibles avec l'ensemble des souches décrites dans la demande. Leur usage peut également être étendu à d'autres souches.
La présente invention a pour objectif préférentiel de mettre au point une souche de levure répondant à toutes les caractéristiques précédemment décrites. Plusieurs intermédiaires sont décrits pour y parvenir.
Dans la présente invention on part préférentiellement de souches telles que décrites dans la littérature, et notamment :
- de la souche W(ΔB), décrite par Truant al, dont le gène codant pour le cytochrome b5 de levure (ci-après Yb5) a été disrupté. Pour ce faire on construit un vecteur ayant le gène marqueur HIS3 intégré au niveau d'un site de restriction du gène du cytochrome b5. Ce vecteur est utilisé pour transformer une souche HIS3" diploïde. Les recombinants sont sélectionnés,
- de la souche W(R) dont le gène codant pour réductase de levure n'a pas été inactivé,
- et de la souche W(hR), obtenue à partir d'une souche W(RΔ), par transformation par le vecteur pUP81 (fig 1 ). Dans cette souche le gène codant pour la réductase de levure (ci-après YRED) inactivé a été remplacé, par insertion d'une cassette contenant le promoteur inductible et la séquence codant pour la réductase humaine (ci-après HRED).
Ces souches sont croisées, puis sporulées et l'on sélectionne les souches W(hR,ΔB) haploïdes qui sont delétées pour Yb5 et YRED et qui expriment la réductase humaine sous contrôle du promoteur GAL10-CYC1.
A cet égard un autre objet de l'invention consiste en une souche comprenant un acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine sous contrôle du promoteur GAL10-CYC1 et dont les gènes codant pour le cytochrome b5 de levure et la NADPH-cytochrome P450-réductase de levure ont été inactivés (souche W(hR, ΔB)).
Une autre souche préférée selon l'invention consiste en une souche identique à la précédente dans laquelle le promoteur inductible GAL10-CYC1 a été remplacé par le promoteur GAPDH.
Ce remplacement peut être effectué, par une transformation par le plasmide pAB2 (fig 4 ), construit à partir de pUP81 (fig 9 ), qui contient un ADNc codant pour la HRED sous le contrôle du promoteur constitutif de la GAPDH. Les transformants sont sélectionnés selon la méthode décrite dans le brevet WO94/01564. La souche obtenue est désignée par W(GhR,ΔB) Dans cette souche, la séquence codant pour la réductase humaine est sous le contrôle du promoteur constitutif de la GAPDH de levure et le cytochrome b5 et la YRED de levure sont inactivés.
Un autre objet de l'invention consiste en une souche caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine est sous contrôle du promoteur du gène de la glyceraldéhyde phosphodéhydrogénase de levure.
Une autre souche préférée selon l'invention est obtenue à partir de la souche W(hRΛB)par transformation par le vecteur pAB3 (fig 6 et 12 ) contenant la séquence codant pour le cytochrome b5 humain. On sélectionne les levures ayant intégré celle-ci. La souche ainsi obtenue est nommée W(hR,hb5). Cette souche possède les deux séquences codant pour les protéines humaines.
Pour construire une souche particulièrement avantageuse selon l'invention on transforme la souche W(GhR,ΔB) par le plasmide pAB3, de la même manière que précédemment. On obtient ainsi une souche W(GhR,hb5) qui a les propriétés des deux précédentes à savoir qu'elle exprime le gène codant pour la réductase humaine sous contrôle du promoteur de la GAPDH de levure et qu'elle peut aussi exprimer le gène codant pour le cytochrome b5 humain sous contrôle du promoteur pYb5 de levure. De manière tout aussi préférentielle la demanderesse a construit une souche à partir de la souche W(hR,ΔB). Cette souche est transformée par le vecteur plasmidique pAPl (fig 8 et 13 ) préalablement linéarisé par l'action d'un enzyme de restriction. On sélectionne les transformants qui ont intégré la séquence codant pour le cytochrome b5 humain sous le contrôle du promoteur PGK (phosphoglycérate kinase) de levure, portés par pAPl, au niveau du site intergénique Ieu2/SPL1 du chromosome de la levure (fig 14 ).
Cette souche porte dans la nomenclature de la demanderesse le nom W(hR, Lhb5). Elle peut exprimer la séquence codant pour la réductase humaine sous contrôle du promoteur pGALlO-CYCl et la séquence codant pour le cytochrome b5 sous le contrôle du promoteur PGK de levure.
Un autre objet de l'invention concerne une souche de levure caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain sous contrôle du promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase de levure.
Tout particulièrement on préfère la souche suivante. On part soit de la souche
W(GhR,ΔB) que l'on transforme par le vecteur pAPl linéarisé. On sélectionne les clones qui ont intégré au site chromosomique précité Ieu2/SPL1 la séquence codant pour le cytochrome b5 humain sous le contrôle du promoteur PGK de levure.
On obtient alors une souche W(GhR, Lhb5) contenant les séquences codantes pour les deux gènes humains sous contrôle de deux promoteurs constitutifs de levure. Un autre objet de l'invention est caractérisé en ce que, dans une souche, on a à la fois :
- L'acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine sous contrôle du promoteur du gène de la glyceraldéhyde phosphodéhydrogénase de levure.
- Et l'acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain sous contrôle du promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase de levure.
Un autre mode de réalisation de l'invention consiste à partir de la souche W(R) et de la transformer par le vecteur pAPl, après sélection on obtient une souche W(R, Lhb5,Yb5) Préférentielement on part de la souche W(hR) que l'on transformera de la même manière, après sélection on obtient une souche W(hR, Lhb5, Yb5)
Les souches construites selon la présente invention permettent la mise en oeuvre de procédés visant à l'évaluation de la toxicité des métabolites provenant de la dégradation par le système enzymatique cytochrome P450 de nouvelles molécules chimiques.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'évaluation de la toxicité d'un composé caractérisé en ce que :
- Le dit composé est mis en présence d'une levure selon l'invention ou d'une préparation enzymatique dérivée d'une telle levure, et on analyse les métabolites produits quant à leur toxicité.
La présente invention permet de plus d'avoir un complexe enzymatique très proche de celui existant dans les cellules hépatiques humaines. Ceci offre la possibilité de travailler in vitro dans de bonnes conditions d'expression des enzymes humains. Ainsi on peut déterminer quels seront les métabolites résultant, chez l'homme, de la dégradation par le complexe cytochrome P450, de nouveau composés chimiques.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de détermination in vitro des métabolites humain d'un composé chimique caractérisée en ce que :
- Le dit composé est mis en présence d'une levure selon l' invention ou d'une préparation enzymatique dérivée d'une telle levure, et on identifie les métabolites produits.
La présente invention est décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
DESCRIPTIONS DES FIGURES
Figure 1: plasmide pUP81. Figure 2: plasmide pPLIOO. Figure 3: plasmide p \B1. Figure 4: plasmide pAB2. Figure 5: plasmide pLLPl. Figure 6: plasmide pAB3.
Figure 7: plasmide pCD26.
Figure 8: plasmide pAPl.
Figure 9: construction de pAB2 à partir de pUP81. Figure 10: construction de la soucheW(GhR,ΔB) avec pAB2.
Figure 11: construction de la cassette hb5.
Figure 12: construction de pAB3.
Figure 13: construction de pAPl.
Figure 14: construction de la souche W(GhR, Lhb5). Figure 15: Représentation des plasmides pYeDP60, pYeDPl/10/hb5 et pYeDPl 10.
Figure 16: Représentation des plasmides pAP2, pAP3, pVDl, pVD2, pVD3, pVD4.
Figure 17: Construction et structure de pAP4.
Figure 18: Construction de pVDl.
Figure 19: Construction de pVD2. Figure 20: Construction de pVD3.
MATERIELS ET METHODES:
1- Milieux:
Voir tableau I page suivante.
Figure imgf000015_0001
Le milieu de sporulation est complété de manière à complementer les différentes auxotrophies suivant les souches.
(1) Le yeast nitrogen base (YNB) sans acides aminés et sans ammonium provient de chez GIBCO BRL. Le sulfate d'ammonium de chez MERCK. L'agar allemand de chez ROHSTOFF Gmbh. L'adénine, le L-histidine et le L-tryptophane de chez SIGMA. La L-leucine et l'uracile de chez CALBIOCHEM. Le D-glucose, le D- galactose, le glycérol et l'acétate de potassium anhydre de chez PROLABO. Le bactopeptone(B. peptone) et le yeast extract (YE) de chez DIFCO.
Le N3 est tamponné avec un tampon phosphate à pH=6.2 obtenu en dissolvant 89 g de Na2HPO4> 272 g de KH2PO4 et 1 g de specilline dans 5 1 d'eau.
Les milieux liquides ont la même composition que les milieux solides sauf qu'ils ne contiennent pas d'agar.
Ringer: 0,9 % NaCl dans de l'eau.
2- Souches:
- Levure : S. cerevisiae:
W(N): MATa et a, Ieu2-3,U2, ΛisJ-11, ade2Λ, trplΛ, ura3Λ. W(N)a désigne W(N) Mat a et W(N)a désigne W(N) Mat a.
W(ΔB): MATa et a, leu2-3,112, ade2Λ, trplΛ , ura3A, Yb5: HIS3. W(ΔB)a désigne W(ΔB) Mat a et W(ΔB)a désigne W(ΔB) Mat a. W(hR): MATa et a_ Ieu2-3,112, his3-U, ade2-\, trplΛ, YRED: [GAL10-
CYC1 ::HRED]. W(hR)a désigne W(hR) Mat a et W(hR)a désigne W(hR) Mat a
- Bactérie:
E. coli DH5-1: supE44, hddR17, recAl, gyrA96, thi-1, relAl.
3- Les vecteurs:
- Plasmide pUPδl : la phase codante du gène de la cytochrome P450 réductase humaine obtenue par PCR avec les primers NI et N2, est coupée par BamWl et Bgtll, puis clonée dans le vecteur d'intégration DPI 10 au niveau de son site BamHl, l'ATG du côté du promoteur GAL10-CYC1 (Urban et al., 1993). Primer NI: 5'-GCggatccATGGGAGACAGTCACGTGG-3'(SEQ ID n°l), les bases 1 à 2 forment un GC clamp, les bases 3 à 8 (lettres minuscules) correspondent au site BamHl ajouté, les bases 9 à l7 et 21 à 27 sont respectivement homologues aux nucleotides 1 à 9 et 13 à 19 de la séquence de la phase ouverte de lecture du gène de la réductase humaine, les bases 18 à 20 (en caractères gras) permettent de muter les nucleotides TCC en position 10 à 12 à partir de l'ATG de la séquence codante de la réductase humaine. Cette mutation permet de détruire la structure en fourche de l'ARN transcrit dans les 20 premières paires de bases, responsable de l'inhibition de la traduction chez la levure (Baim et al., 1988). Primer N2: 5'-CGgaattcAGATCTAGCTCCACACGTCCAGG-3'(SEO ID n°2), les bases 1 à 2 forment un GC clamp, les bases 3 à 8 (lettres minuscules) correspondent au site EcoRI, les bases 9 à 14 (lettres soulignées) correspondent au site Bgfll, les bases 14 à 16 (caractères gras) correspondent au codon stop (brin complémentaire) et les bases 13 à 31 sont complémentaires aux nucleotides 2018 à 2034 de la phase ouverte de lecture du gène de la réductase humaine.
- Plasmide pFL26 (Bonneaud et al., 1991).
- Plasmide pPLIOO: ADE2/pFL (Stotz & Linder). Le gène ADE2 de levure a été modifié afin de construire le vecteur pPLIOO. Le site Bgftt interne du gène est détruit en mutant l'adénosine en position 593, à partir de l'ATG, en guanine. Cette mutation ne change ni la séquence en acides aminés ni l'activité proteique. Un site Bglîï est introduit dans la région 5'- du gène ADE2 en position -373 à partir du codon d'initiation. Le gène possède un site Bgfll en position 1862 à partir de l'ATG. Le fragment Bglïl de 2241 pb est clone dans le vecteur pFL36 au site Bgfll (Bonneaud et * al.,1991). - Plasmide "Blue-Script" est décrit dans le kit "pCR-Script™ SK(+) cloning kit" (Stratagène).
4- Croisement:
Les souches haploïdes de signes opposés (a ou a), sont cultivées séparément en milieu complet YPGA. Les cellules sont ensuite diluées dans du Ringer à 105 cellules/ml environ. Un mélange de 500 ml de chacune des deux suspensions de cellules haploïdes est préparé. A partir du mélange, 50 ml de suspension sont étalés sur milieu solide YPGA. Au bout de 8 h de croissance, les cellules sont sous-cionées sur un milieu sélectif qui ne complémente que les auxotrophies présentes simultanément dans les deux parents. Ceci permet la croissance du diploïde issu du croisement, mais pas des haploïdes d'origine. Au bout de deux jours de croissance, les clones diploïdes qui apparaissent sont repiqués sur le même milieu sélectif.
5- Sporulation:
Les cellules diploïdes sont repiquées sur un milieu de sporulation solide complémente par les marqueurs d'auxotrophie du diploïde. Au bout de 3 jours de sporulation, les spores sont disséquées.
6- Dissection des spores:
Technique dite en yrac: les spores sont diluées dans des tubes Eppendorff de 1,5ml, à 5.108 cellules/ml, dans de l'eau contenant de la zymolyase 10.000 (Seikagaku Kogyo Co., Tokyo, Japan) à 100 mg/ml, puis incubées pendant 30 min à 28°C. Un aliquot de 500 ml est centrifugé à 10.000 rpm pendant 1 min. Le culot cellulaire est repris dans 1 ml d'eau, centrifugé et repris dans 100 ml d'eau. Les cellules sont agitées au vortex pendant 2 min. Le tube est rincé à l'eau en le retournant 2 à 3 fois. Au bout de 5 rinçages, les spores qui sont hydrophobes, adhèrent aux parois du tube, alors que les cellules végétatives diploïdes restent en suspension et sont éliminées par rinçage. Les spores sont ensuite resuspendues dans une solution de 0.01 % (v/v) Nonidet P-40 (Sigma). Le détergent est éliminé après centrifugation. Les spores purifiées sont reprises dans du Ringer et étalées sur milieu sélectif solide.
Microdissection:
Les spores sont incubées dans une solution (à 55 % glycérol) de cytohélicase (Biosepra) à 0,5 g/l pendant 15 min à 22°C, puis étalées sur un morceau d'agar préalablement découpé et déposé sur une lamelle. La lamelle est ensuite déposée à l'envers sur une chambre de microdissection. Les quatres spores, contenues dans une tétrade, sont séparées sous microscope à l'aide du micromanipulateur. L'agar, supportant les tétrades ainsi disséquées, est déposée sur une boite de milieu complet YPGalA.
7- Clonage du promoteur GAPDH:
Amplification par PCR: L'ADN du promoteur du gène de la glyceraldéhyde phosphodéshydrogénase de levure a été clone par la technique de la PCR à partir de 100 ng d'ADN genomique de S. cerevisiae W(N) préparés suivant la méthode décrite (Bellamine et al., 1994), en utilisant comme amorces 50 ng des primers N3 (SEQ ID n°3) et N4 (SEQ ID n°4) (Fig 9 ). L'amplification est faite avec 2,5 U de Pfu ADN polymérase native (Stratagène). La réaction de polymérisation a lieu dans 50 ml d'une solution 20 mM Tris-HCl, 10 mM KC1, 6 mM (NH4)2Sθ4, 2 mM MgCl2 0,1 % Triton X-100, 10 mg/ml de "sérum alrΛimin" sans nucléase et 200 mM de chacun des quatre désoxynucléotidetriphosphates (dNTP). Les conditions de PCR sont les suivantes:
2 précycles: 95°C 10 sec 40°C 50 sec
60°C 5 sec
74°C 2 min
25 cycles: 95°C 5 sec
48°C 50 sec 65°C 5 sec
74°C 2 min
Les séquences des primers sont:
- Primer N3: 5'-CCaagcttGAGTTTATCATTATCAATACTCG-3'(SEQ ID n°3), les deux premières bases forment un GC clamp, les lettres en minuscules correspondent au site Hinàlll, les bases allant de 9 à 31 sont homologues aux nucleotides -673 à -650 de la séquence du promoteur du gène GAPDH.
- Primer N4: 5'-CggatccTATTTATGTGTGTTTATTCG AAACTAAGTTCTTGG-3' (SEQ ID n°4), les lettres en minuscules correspondent au site BamHl, les bases allant de 8 à 42 sont complémentaires aux nucleotides -6 à -48.
La taille de l'ADN amplifié est de 691 pb. 26 ml d'acétate d'ammonium 7,5 M et 4 ml d'eau sont rajoutés au 50 ml du produit PCR. Le mélange est précipité par 80 ml d'éthanol pendant 10 min à 22°C. L'ADN précipité est centrifugé à 10.000 rpm pendant 10 min. Le culot est lavé à l'ethanol 70 % (v/v), séché, et repris dans 20 ml d'eau.
Un aliquot de 10 ng de cet ADN est clone au site Srfl du vecteur Blue Script du kit "pCR-Script™ SK(+) cloning kit" suivant les recommandations du vendeur (Stratagène). Les clones sont triés par restriction Pvull. Ceux qui donnent des fragments Pvull à 2513 et 1139 pb, sont séquences sur 100 pb au niveau de la jonction entre l'ADN clone et le vecteur Blue-Script avec le kit: Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit U. S. B. (Amersham). Ces constructions sont appelées pABl. Clonage du promoteur GAPDH dans le vecteur d'intégration pUB81 : le clone pABl est coupé par Hindlll. Cette coupure génère un site bout collant qui est rempli grâce au fragment de Klenow de la DNA polymérase (Biolabs). Le vecteur pABl ainsi linéarisé (fragment de 3652 pb) est ensuite coupé, à son extrémité 5'par BamHl puis clone dans le vecteur pUP81 entre les sites EcoRV et BamHl. Lors de la ligation, le site Hindlll rendu bout franc, s'adapte au site EcoRV qui est bout franc, alors que les deux demi-sites BamHl du fragment pGAPDH et du vecteur d'intégration pUP81 , se lient entre eux. Le site EcoRV a été choisi pour disrupter en même temps le gène URA3 (Fig 9 ). Les clones sont triés par restriction enzymatique avec les enzymes Pstl et BamHl. Ceux qui donnent des fragments d'ADN de 600 et 800 pb en plus des fragments 60, 104, 197, 385, 440 et 2564 pb (fragments qui existent dans le vecteur pUB81), représentent les vecteurs pUP81 contenant l'ADN du promoteur GAPDH. Cette construction est appelée pAB2. Trois clones contenant le plasmide pAB2 sont vérifiés par séquençage sur 100 pb avec le primer N3(SEQ ID n°3) à partir de l'extrémité 5'de l'ADN du promoteur du gène GAPDH.
8- Construction de la cassette d'intégration du cytochrome b5 humain au locus YCYB5: Cette construction a été faite en trois PCR différentes.
Dans la première PCR (PCR 1), les 353 pb de l'extrémité 3'du promoteur du gène du cytochrome b5 de levure (Yb5), ont été amplifiées en utilisant les primers N5 (SEQ ID n°5) et N6 (SEQ ID n°6) et l'ADN genomique de levure W(N): - Primer N5: 5,-ggatccGAGCGGGTAATAGCCTGGAGTTTCC-3'(SEQ ID n°5), comporte un site BamHl à partir de son extrémité 5'(en lettres minuscules). Ce primer est homologue, de la base 7 à 31, aux nucleotides -331 à -306 de la phase ouverte du promoteur du gène du cytochrome b5 de levure.
- Primer N6: 5'-ccgactgctctgccatGATTGTTTGATATTTTATGTTGTAGTTGATTG-
3' (SEQ ID n°6), comporte à partir de son extrémité 5': base 1 à 16 la séquence complémentaire aux 16 premiers nucleotides de l'extrémité 5' de la phase ouverte de lecture du gène du cytochrome b5 humain (lettres minuscules), base 17 à 49 la séquence complémentaire aux nucleotides -1 à -32 du promoteur du gène du cytochrome b5 de levure.
Le fragment amplifié fait 375pb.
Dans la deuxième PCR (PCR 2), les 147 dernières pb de la partie 5'du terminateur du gène du cytochrome b5 de levure ont été amplifiées par les primers N7 (SEQ ID n°7) et N8 (SEQ ID n°8): - Primer N7:
5'-cctamcatggcagaggactgaATTCTTTTTCTTCCAGAATAGCCCACAC- 3'(SEQ ID n°7), comporte à partir de son extrémité 5': base 1 à 22: séquence homologue aux nucleotides 383 à 405 de la phase ouverte du gène du cytochrome b5 humain (lettres minuscules), base 23 à 50 la séquence homologue aux nucleotides 1 à 28 du terminateur à partir du codon stop.
- Primer N8: 5'-GGagatctGTGACATACTTCTATGCGATATAG-3'(SEQ ID n°8), comporte de la base 1 à 2 un GC clamp et un site Bglïl de la base 3 à 8 (en lettres minuscules). Ce primer est complémentaire, de la base 9 à 32, aux nucleotides 1 à 147 de la phase ouverte du terminateur du gène YCYB5 de levure à partir du codon stop.
Le fragment amplifié fait 180 pb. Dans les PCR 1 et 2, l'ADN genomique de la levure W(N) est utilisé comme matrice.
Dans une troisième PCR (PCR 3), 4 amorces sont utilisées:
- Deux cents nanogramme des produits des deux premières PCR (375 et 180 pb) sont utilisés comme amorces et 100 ng d'ADN de la phase codante du cytochrome b5 humain comme matrice (Fig 11 ). Ceci permet d'avoir la cassette d'intégration du b5 humain (CLH) mais en faible quantité.
- Le produit de cette PCR est ensuite amplifié par les amorces N5 (SEQ ID n°5) et N8 (SEQ ID n°8), ceci a permis d'avoir la cassette d'intégration en plus grande quantité. Le produit de fusion est traité après amplification à la Pfu polymérase en présence de dNTP 0,2 mM pendant 30 min à 76°C. Le fragment obtenu fait 917 pb. Les amplifications sont faites à la Taq polymérase (Appligène). Les programmes PCR utilisés sont les suivants:
PCR 1 et PCR 2:
2 précycles 88°C 3 sec
95°C 10 sec
42°C 2 min
60°C 3 sec
74°C 2 min 30 sec
30 cycles 88°C 3 sec
95°C 5 sec
50°C 1 min
65°C 3 sec
74°C 2 min.
PCR 3:
3 précycles 88° 3 sec
95°C 10 sec
40°C 5 min
60°C 3 sec 74°C 3 min
15 cycles 88°C 3 sec
95°C 5 sec
45°C 2 min 65°C 3 sec
74°C 2 min.
La cassette d'intégration ainsi construite (CIH), est clonée dans le vecteur pCRScript au niveau du site Sfrl. Le clone obtenu pLIPl est contrôlé par séquençage sur 200 pb au niveau des deux jonctions: du promoteur et du terminateur du gène YCYB5 de levure et de la phase codante du gène du cytochrome b5 humain . Afin de ralonger les pieds de recombinaison pour que l'intégration de la cassette d'intégration du b5 humain se fasse correctement, une nouvelle cassette d'intégration comportant la phase codante du gène du cytochrome b5 humain et la totalité du promoteur et du terminateur du gène YCYB5 de levure a été construite à partir du fragment BamHl/Bglll de 917 pb du vecteur pLIPl. Le vecteur YCYB5/YEP352 qui contient la totalité du gène YCYB5 de levure (Truan et al., 1994), est coupé à un site unique Clal. Ce fragment linéarisé est cotransformé dans la souche W(N)a avec le fragment BamHl/Bgill de 917 pb du vecteur pLLPl. La linéarisation du vecteur YCYB5/YEP352, étant au niveau de la phase codante du gène YCYB5, le cytochrome b5 de levure sera substitué par le cytochrome b5 humain à la suite d'une recombinaison homologue dans la levure (Fig 12 ). La sélection des recombinants se fait grâce à la recircularisation du vecteur d'expression (Bellamine et al., 1994). Le nouveau vecteur pAB3 est récupéré à partir de la levure puis amplifié dans la bactérie E. coli selon la méthode décrite (Bellamine et al., 1994).
9- Construction de la cassette d'intégration du cytochrome b5 humain au site intergénique leu2D/SPLl:
Une cassette permettant d'intégrer le gène du cytochrome b5 humain à proximité immédiate du gène LΕU2 dans la région intergénique avec 500 pb du gène SPL1 a été construite en deux étapes: - Construction du vecteur pCD26: à partir du vecteur pFL26 (Bonneaud et al., 1991) portant à la fois le gène LEU2 et 500 pb du gène SPL1, un site Notl a été introduit en trois PCR (Figl3).
Dans la première PCR, les 704 pb de la partie 3'- du gène LEU2 sont amplifiées en utilisant les primers N9 (SEQ LD n°9) et N10 (SEQ LD n°10) :
- Primer N9: 5'-TTGAAGGTTCAACATCAATTGATTG-3(SEQ ID n°9)'est homologue aux nucleotides 2190 à 2214 du vecteur pFL26 qui correspondent à la fin de la phase ouverte du gène LEU2 (la numérotation, au niveau du vecteur pFL26, est faite à partir du nucléotide 1 placé à 417 pb en amont du site BamHl). - Primer N10: 5'-GTGTGgcggccgcCTCCTTGTCAATATTAATGTTAAAG-
3' (SEQ ID n°10), comporte à son extrémité 5'-, cinq bases complémentaires aux nucleotides 2890 à 2894 du vecteur pFL26, un site Notl de la base 6 à 13 et une séquence complémentaire des nucleotides 2857 à 2881 de la base 14 à 38.
Dans la deuxième PCR, les 347 dernières pb de la partie 3 'du gène SPL1 sont amplifiées en utilisant les primers NI 1 (SEQ ID n°l 1) et NI 2 (SEQ ID n°12):
- Primer Nil: 5'-CAAGGAGgcggccgcCACACAAAAAGTTAGGTGT-3'(SEQ ID n°ll), comporte à son extrémité 5', sept bases complémentaires des nucleotides 2875 à 2881 de la séquence du vecteur pFL26, un site Notl de la base 8 à 15 et une séquence homologue aux nucleotides 2889 à 2908 du pFL26, de la base 16 à 34. - Primer N12: 5'-TCTGCTTCCCTAGAACCTTCTTATG-3'(SEQ ID n°12) est complémentaire des nucleotides 3198 à 3222 de l'extrémité 3'du brin codant pour la phase ouverte du gène SPL1 dans le vecteur pFL26.
Dans la troisième PCR, 100 ng des deux fragments issus des deux premières
PCR (ayant 20 pb de chevauchement qui contiennent le site Notl), sont utilisés comme matrice et les primers N9 et N12 comme amorces. Les 1031 pb amplifiées sont clonées dans le vecteur pFL26 aux sites Nsîl et BstXl pour donner le vecteur pCD26.
Les amplifications sont faites à la Taq polymérase Appligène. Les deux premières PCR utilisent le même programme que les PCR 1 et 2 du paragraphe 8, la
PCR 3 utilise le programme suivant : 30 cycles.
95°C 10 sec
60°C 5 sec
45°C 1 min
65°C 5 sec
74°C 2 min
- Construction du vecteur d'intégration pAPl: A partir du plasmide pUP12 préalablement construit (Urban et al., 1990), la cassette d'expression du cytochrome b5 humain sous le contrôle du promoteur et du terminateur du gène PGK (phosphoglycérate kinase) de levure, est récupérée grâce à une coupure BamHl/Hindlll. Ce fragment de 2400 pb est rendu bouts francs grâce à la Mung Bean nucléase (Biolaps), puis clone dans le vecteur pCD26 coupé au site Notl rendu bout franc grâce au fragment de Klenow de la DNA polymérase (Fig 13 ). Les clones qui donnent des fragments de restriction Pstl de 5154 et 2904 pb dénommés pAPl sont utilisés pour l'intégration.
10- Vecteurs de transformation par cytochrome P450
Le plasmide pYeDP60 est un vecteur navette (bactérie, levure) de 9265 pb possédant les origines de réplication ori E. coli et ori 2 μ^_ le gène bla qui code pour la résistance à l'ampicilline, les gènes URA3 et ADE 2 qui sont des marqueurs de complémentations d'auxotrophie, un promoteur hybride GAL10-CYC1 inductible en présence de galactose et le terminateur de transcription du gène PGK. Un polylinker comprenant entre autres les sites de restriction BamHl, Kpnl, EcoRI est inséré entre promoteur et terminateur de transcription à fin de clonage d'un ADNc à exprimer.
Les plasmides 1A1/V60 et 3A4/V60 correspondent au vecteur V60 dans lequel les phase codante des ADNc codant respectivement pour les cytochromes P450 1A1 et 3 A4 humains ont été insérés sous contrôle du promoteur GAL10-CYC1 et du terminateur de transcription PGK.
11- Milieu de culture pour la transformation des souches de levure. Milieu YPGE
- extrait de levure 10 g/l
- bactopeptone 10 g/l
- glucose 5 g/l
- éthanol 30 ml/1
Milieu SW6:
- base azotée de levure (Dif co) 7g/l
- Glucose 20 g/l
- Casaminoacide (Difco) lg/1 - Tryptophane 20 mg/1
-Agar 15 g/l (pour les milieux solides uniquement).
Pour le milieu galactose correspondant (SW5) le glucose est remplacé par le galactose à la même concentration.
12- Préparations des fractions microsomales.
12.1 Transformation.
Les levures sont transformées par les plasmides 1A1/V60 ou 3A4/V60 selon la méthode standard dite au "chlorure de lithium". Les transformants sont sélectionnés sur un milieu de culture de levure glucose synthétique dépourvu d'adénine et d'uracile (SW6) auquel est additionné les nutriments nécessaires pour complementer les auxotrophies résiduelles selon la souche utilisée (voir génotype des souches). Une forte proportion des transformants primaires sélectionnés sur le miheu glucose ne poussent pas sur un milieu minimum de culture galactose. Seuls les clones qui se développent correctement sur milieu galactose sont conservés
12.2 Préculture:
les clones sélectionnés sont repiqués sur milieu minimum non inducteur glucose sélectif pour le plasmide ( généralement milieu SW6), puis incubés une nuit à 28 °C, dans 20 ml du même milieu liquide. 12.3 Culture:
250 ml de milieu YPGE sont ensemencés avec la préculture et incubés sous agitation à 28 °C jusqu'à obtenir une densité cellulaire comprise entre 8 et 9,6 10? cellules/ ml. Du galactose est ensuite rajouté à une concentration de 20 g/l, et la culture est incubée à 28°C pendant la nuit, de façon à obtenir une densité cellulaire de 2 10° cellules/ml. La présence de galactose permet l'induction du cytochrome P450 et des autres gènes dépendant du promoteur GAL10-CYC1.
12.4 Fractionnement des cellules:
les cellules sont centrifugées et lavées dans du tampon TE pH 7,4 (Tris-HCl, 50 mM; EDTA 1 mM); KCl 0,1 M, et remises en suspension dans du tampon TE pH 7,4;
Sorbitol 0,6 M. Afin de casser les cellules, des billes de verre sont ajoutées et les tubes sont vigoureusement agités de bas en haut pendant 5 min à 4°C. Les étapes suivantes sont effectuées à 4°C. La suspension de cellules cassées est récupérée et les billes sont lavées plusieurs fois avec le même tampon. Afin d'éliminer les débris cellulaires, les noyaux ainsi que la fraction mitochondriale, deux centrifugations respectivement de 3 min à 3500 rpm et 10 min à 15 000 rpm sont effectuées. Pour précipiter les microsomes, le surnageant est incubé en présence de NaCl (0,15M final) et de PEG
4000 (10% final) pendant 15 min dans la glace. Après une centrifugation de 10 min à
10000 rpm le culot de microsomes est récupéré dans du tampon TE pH 7,4 ; 20 % glycérol. La préparation de microsomes est aliquotée et stockée à -80°C.
13- Dosage du cytochrome P450
La concentration en cytochrome P450 dans les fractions microsomales est déterminée spectralement. Le cytochrome P450 à doser est dilué dans du tampon TE pH 7,4 (environ 1 mg de protéines microsomales par ml) et réduit par quelques grains de dithionite de sodium. Après enregistrement de la ligne de base (cytochrome P450 réduit contre cytochrome P450 réduit), quelques bulles de CO sont ajoutées à la cuve de mesure et le spectre différentiel est mesuré entre 400 et 500 nm. Le CO forme un complexe stable avec le fer réduit du cytochrome P450, ce complexe présente un maximum d'absorption caractéristique à 450 nm. Le coefficient d'absoφtion _εM (450-490 nm) est de 91 mM"1. cm"1.
14- Dosage des protéines microsomales
Le dosage des protéines totales est réalisé avec le kit de dosage PIERCE-BCA dans les conditions données par le fabricant La sérum albumine bovine est utilisée comme standard.
15- Activités catalytiques des cytochromes P450
15.1 Tests d'activité EROD sur microsomes
Le cytochrome P450 1A1 catalyse la O-deséthylation de la 7-ethoxyrésorufine. Le produit de la réaction, la résorufine (7-hydroyphénoxasine), après excitation à 530 nm, fluoresce à 586 nm. La quantité de résorufine formée par unité de temps correspond à la vitesse d'accumulation de la résorufine. Le mélange d'incubation comprend:
- 2 μl d'une suspension microsomale (entre 20 et 50 μg de protéines microsomales) dans 1 ml de tampon TE pH 7,4, contenant du NADPH 50 μM et 2,5 μM de 7-éthoxyrésorufine. Pour déterminer l'effet du cytochrome b5 de lapin sur l'efficacité catalytique, les fractions microsomales sont préalablement incubées au froid en présence d'un excès de cytochrome purifié.
15.2 Test d'activité THL sur microsomes: 6β-hvdroxylation de la testostérone
La testostérone est une hormone stéroïde hydroxylée en position 66 par le cytochrome 3 A4. Le milieu d'incubation comprend 100 μg de protéines microsomales dans 0,25 ml de tampon Tris 50 mM, 1 mM EDTA pH 7,4 ou phosphate de sodium 50 mM pH 7.4, contenant du NADPH 50 μM, de la testostérone 80 μM (à partir d'une solution mère 5 mM dans l'ethanol), en absence ou en présence d'un excès de cytochrome b5. Les incubations ont lieu pendant 10 min à 28°C ou 37°C. La réaction est arrêtée par addition de 10 μl de TFA 50% dans l'eau. La procédure d'extraction est la suivante:
-addition de 500 μl de dichloromethane -agitation au vortex à la vitesse maximale pendant 1 min
-centrifugation pendant 5 min à 10 OOOrpm
-élimination de la phase aqueuse supérieure
-évaporation de la phase organique sous flux d'azote.
Le résidu sec est repris avec 20 μl de methanol, puis 20 μl d'eau sont ajoutés. La moitié est injectée dans une colonne HPLC de phase inverse SPHERI-5RP-18.5 μm (100 x2,l mm) en utilisant comme éluant l'acétonitrile à 1 ml/min. La composition en acétonitrile du gradient d'élution varie de 10% (vol/vol) à 0 min jusqu'à 60% à 8 min. La détection est effectuée à 254 nm. Les temps d'élution sont 6 min 20s pour la β- hydrOxytestostérone et 8 min pour la testostérone.
EXEMPLES
Exemple n°l : Construction de la souche W(hR, ΔB):
La souche W(ΔB)a (qui pousse sur milieu W0ABLF) et la souche W(hR)a (qui pousse sur milieu W0ADIF) sont croisées entre elles et le diploïde est sélectionné sur milieu glucose W0AIF. Ce milieu est létal pour chacun des haploïdes et non pour le diploïde W(hR/YR, Yb5/ΔYb5). Les clones diploïdes sont sous-clonés sur le même milieu sélectif. Après sporulation, les tétrades sont disséquées soit par microdissection soit par dissection en vrac. Les spores cultivées sur milieu YPGalA sont ensuite repiquées sur différents milieux sélectifs contenant du galactose comme source de carbone, afin de tester les auxotrophies des différentes spores. Les clones de levure qui poussent sur milieu galactose et qui sont prototrophes pour l'uracile et l'histidine correspondent à la souche W(hR, ΔB). Ces levures ne poussent plus quand on remplace sur le même milieu le galactose par le glucose car, dans ces conditions, la réductase humaine ne s'exprime pas. Ces souches étant alors déficientes à la fois en réductase et en b5 de levure (dont le gène est disrupté) , ne poussent pas car la double déficience est létale (Truan et al., 1994). Quatre clones sont retenus pour la suite: Spl et Sp2 obtenus par microdissection, et Cl et C2 obtenus par dissection en vrac.
Exemple n°2 : Construction de la souche W(GhR, ΔB):
Le vecteur d'intégration du promoteur GAPDH pAB2 coupé par Notl, est utilisé pour transformer la souche W(hR, ΔB)a. Le vecteur pPLIOO est utilisé comme marqueur de cotransformation (10 à 15 ng d'ADN du vecteur pPLIOO pour 2 mg d'ADN du vecteur pAB2). Les transformants sont sélectionnés sur milieu WOBDIF.
Les clones passent par 3 séries de cribles:
- Une sélection de l'auxotrophie à l'uracile: les transformants sont repiqués sur milieu WOABDLF, puis sur milieu WOADIF pour repérer les clones qui ne poussent pas en absence d'uracile. La perte du gène URA3 suggère que le promoteur GAPDH a remplacé le promoteur GAL10-CYC1, car l'intégration du promoteur GAPDH à la place du promoteur GAL10-CYC1 inactive en même temps le gène URA3 qui est en amont du promoteur. 25% des transformants ne poussent pas en absence d'uracile (Fig 10 ).
- La deuxième sélection: pour vérifier l'activité de la réductase humaine exprimée sous le contrôle du promoteur GAPDH, la résistance au kétokonazole des clones W(GhR, ΔB) a été évaluée (Brevet n°WO94/01564). Trois clones différents ont une résistance au kétokonazole de 20 mg/ml alors que la souche W(hR), dans laquelle la réductase humaine est exprimée sous le contrôle du promoteur GAL10-CYC1, a une résistance de 1 à 5 mg/ml dans les mêmes conditions .
- Troisième sélection: afin d'estimer le niveau d'expression de la réductase humaine dans la souche W(GhR, ΔB), la réduction du cyctochrome c par la réductase contenue dans les fractions microsomales des trois clones étudiés est mesurée (Truan et al., 1993). Suivant les conditions de culture, la réduction du cytochrome c est de 1,5 à 3 fois plus importante que la souche W(hR).
- Test de respiration: les clones obtenus sont repiqués sur milieu solide N3 afin de tester leur phénotype respiratoire. Les trois clones ne poussent pas sur N3. Us sont donc phénotype respiration négative. Pour les rendre [respiration positive], ces clonεε sont croisés avec une souche de phénotype respiration positive W(hR)a. Le diploïde obtenu W(GhR/hR, ΔB/Yb5) est sélectionné sur milieu WOAIF. Après sporulation et dissection en vrac, l'ADN genomique des haploïdes est préparé puis une PCR utilisant les primers N13 (SEQ LD n°13) et N14 (SEQ ID n°14) est effectuée sur cet ADN.
- Primer N13: 5'-CAGATCTGCATGCCTAAAGTTTACAGTTACC-3'(SEQ ID n°13), les bases 1 à 30 sont homologues aux 30 nucleotides de l'extrémité 5'- de la phase de lecture du gène YCYB5 de levure.
- Primer N14:
5'-CGGATTCTGCAGTTATTCGTTCAACAAATAATAAGCAACACC- 3' (SEQ ID n°14), les bases 1 à 42 sont complémentaires des nucleotides 321 à 363 du brin codant pour le b5 de levure.
Parmi six clones analysés, trois clones ont une bande amplifiée à 363 pb (la phase codante du gène du cytochrome b5 de levure), les trois autres clones ont une bande de 2063 pb qui correspond à la somme de la taille du gène HIS3 (1700 pb) et la taille de la phase ouverte du b5 de levure (363 pb). Ces clones sont sous-clonés sur milieu solide WOABIF pour tester leur auxotrophie vis-à-vis de l'histidine. Tous les clones poussent en absence d'histidine alors que 50 % d'entre eux (ceux qui ont la bande PCR amplifiée à 363 pb) sont sensés être auxotrophes à l'histidine. Dans la souche d'origine W(N), le gène his3-\\ est muté. Lors de la construction de la souche W(ΔB) (Truan et al., 1993), la disruption du gène YCYB5 de levure par intégration du gène HIS3 dans la phase codante du YCYB5 s'est probablement accompagnée par une deuxième intégration du gène HIS3 à un autre locus. Ceci aurait conduit à la construction d'une souche (W(ΔB)) qui contient deux copies fonctionnelles du gène HIS3. La ségrégation du gène HIS3 ne serait plus du type 2/2. Ceci pourrait expliquer le résultat obtenu. Deux de ces clones sont retenus pour la suite (Bl et B2).
Exemple n°3 : Construction de la souche W(hR, hb5):
Les 4 clones SP1, SP2, Cl et C2 sont cultivés en milieu complet liquide YPGalA et transformés par le fragment Pvull de 2022pb du vecteur pAB3 (Fig 12 ). Les transformants sont étalés sur milieu YPGA. La sélection des intégrants se fait sur la capacité du cytochrome b5 humain à sauver de h létalité la souche W(hR, ΔB) sur milieu glucose. Les clones qui ont poussé sont regroupés par lots. L'ADN genomique de chaque lot est préparé. Une PCR utilisant les primers N5 (SEQ ID n°5) et N15 (SEQ ID n°15) est effectuée (mêmes conditions que les PCR 1 et 2 du paragraphe 8). Les lots qui donnent une bande amplifiée à 758 pb, sont analysés individuellement par PCR. Un clone ayant intégré la cassette d'expression du cytochrome b5 humain au locus YCYB5, W(hR, hb5) , est obtenu à partir du clone initial W(hR, ΔB) Spl .
- Primer N15: 5'-CCgaattcTGATCAGTCCTCTGCCATGTATAGG-3'(SEQ ID n°15), bases 1 à 2: GC clamp, les bases 3 à 8 correspondent au site EcoRI (lettres minuscules), les bases 9 à 14 correspondent au site Bell, les bases 12 à 14 correspondent au codon stop et les bases 15 à 33 sont complémentaires des nucleotides 386 à 405 de la phase ouverte de lecture du gène du cytochrome b5 humain.
Exemple n°4 : Construction de la souche W(GhR, hb5):
Les clones Bl et B2 sont cultivés en milieu complet YPGA liquide et transformés par le fragment de 2022 pb Pvull du vecteur pAB3, ainsi que par le vecteur pPLIOO comme marqueur de cotransf ormation. Les transformants sont sélectionnés sur milieu W0BDIF solide. Les clones qui poussent sont ensuite regroupés par lots et analysés par PCR en utilisant les primers N3 (SEQ ID n°3) et N13 (SEQ ID n°13). De la même façon qu'au paragraphe précédent, les clones individuels sont vérifiés par PCR.
Exemple n°5 : Construction de la souche W(hR, Lhb5):
Le vecteur d'intégration pAPl est coupé par Xbal. Les 4 clones SP1 , SP2, Cl et C2 sont transformés par ce fragment linéarisé. Les transformants sont étalés sur milieu YPGA. Par recombinaison homologue dans la levure, la cassette d'expression du cytochrome b5 humain sous la dépendance du promoteur et du terminateur du gène PGK, s'intègre au site intergénique Ieu2/SPL1 (Fig. 14 ). Cette recombinaison permet en même temps de remplacer le gène leu2-3 inactif dans le génome par LEU2 sauvage porté par le vecteur pAPl. Une première sélection des transformants se fait sur la restitution du gène LEU2, c'est à dire la prototrophie des transformants vis-à-vis de la leucine (milieu de sélection W0AI). Une deuxième sélection se fait par PCR sur l'ADN genomique des transformants en utilisant les primers N9 (SEQ ID n°9) et N16 (SEQ LD n°16), et les conditions PCR décrites au paragrape 9. Les clones qui présentent une bande PCR à 1495 pb ont intégré la cassette d'expression du hb5.
- Primer N16: 5'-GCCCAGATCTATGGCAGAGCAGTCGGACG-3'(SEQ ID n°16), comporte de la base 1 à 4 une séquence GC clamp, de la base 5 à 10 un site Bglll et de la base 11 à 29 une séquence homologue aux nucleotides 1 à 19 (à partir de l'ATG) de la phase ouverte du gène du cytochrome b5 humain.
Exemple n°6 : Construction de la souche W(GhR, Lhb5):
La construction de cette souche est faite de la même façon que la souche W(hR, Lhb5) mais à partir de W(GhR, ΔB). La sélection des transformants est faite directement sur milieu WOABI puis par analyse PCR sur l'ADN genomique.
Exemple n°7 : Construction de la souche W(R, Lhb5, Yb5):
La souche W(R) est cultivée en milieu complet YGPA liquide et transformée par le vecteur pAPl linéarisé par Xbal. Une première sélection des transformants se fait sur la restitution du gène LEU2, c'est à dire la prototrophie des transformants vis- à-vis de la leucine (milieu de sélection WOAI). Une deuxième sélection se fait par PCR sur l'ADN genomique des transformants en utilisant les primers N9 (SEQ ID n°9) et N16 (SEQ ID n°16), et les conditions PCR décrites au paragraphe 9 (matériel et méthodes). Les clones qui présentent une bande PCR à 1495 pb ont intégré la cassette d'expression du hb5. Cette souche surexprime la réductase de levure en présence de galactose et exprime le cytochrome b5 humain sous le contrôle du promoteur PGK. L'expression du b5 endogène est inchangé par rapport à la souche normale.
Exemple n°8 : Construction de la souche W(hR, Lhb5, Yb5):
La construction est identique à celle de la souche W(R, Lhb5, Yb5) mais on remplace la souche W(R) par la souche W(hR).
Exemple n°9 : Niveau d'expression des cytochromes P450 dans les souches de levure selon l'invention. Les niveaux d'expression de deux cytochromes P450 dans les différentes souches sont indiqués dans les tableaux II et III. De manière surprenante, le niveau d'expression des cytochromes P450 est à conditions de culture équivalente significativement augmenté dans les souches humanisées. On note que l'activité par mg de protéine est accrue proportionnellement à la fois au niveau d'expression et à la valeur du turnover
Tableau II : expression du cytochrome P450 1A1 humain dans les microsomes de levure humanisée.
Figure imgf000034_0001
a concentration en cytochrome P450 (détermination spectrale) de la suspension de microsomes.
^concentration en protéines totales de la solution de microsomes.
Tableau III : expression du cytochrome P450 3A4 humain dans les microsomes de levure humanisée
Figure imgf000034_0002
a concentration en cytochrome P450 (détermination spectrale) de la suspension de microsomes.
Dconcentration en protéines totales de la solution de microsomes.
Exemple n°10 : Effet de la réductase et du cytochrome b5 sur les caractéristiques enzymatiques des cytochromes P450 1A1 et 3 A4 produit chez la levure.
Les résultats obtenus indiquent que l'efficacité catalytique du cytochrome P450
1A1 est optimale dans la souche haploïde W(R, LHb5) qui surproduit la réductase de levure et produit le cytochrome b5 humain. L'adjonction de cytochrome b5 de lapin produit néanmoins une légère augmentation supplémentaire de l'activité qui atteint un turnover de 27 pmole de métabolite/ pmole de cytochrome P450 par min.
A l'inverse des résultats obtenus avec le cytochrome P450 1A1, l'efficacité catalytique du cytochrome P450 3A4 est préférentiellement accrue dans les souches de levures exprimant la réductase humaine. La souche W(GhR, hb5) montre une efficacité catalytique optimale. Quelle que soit la nature et le niveau de la réductase, la présence de l'ADNc codant pour le cytochrome b5 dans le génome des souches se traduit par une augmentation de l'efficacité catalytique (d'un facteur 2 à 20). La délétion du gène endogène du cytochrome b5 apparaît comme un facteur fortement favorable particulièrement en présence de b5 humain exprimé. L'expression de la réductase humaine, la disruption du cytochrome b5 endogène et l'expression du b5 humain dans une même souche de levure haploïde constitue un ensemble particulièrement favorable à l'expression de certains cytochrome P450 humains, en particulier le cytochrome P450 3A4.
Exemple 11 : Construction de plasmides permettant la co-expression d'un cytochrome P450 et du cytochrome b5 microsomal humain.
Cet exemple décrit la construction de plasmides utilisables pour optimiser l'activité P450 des souches de levure selon l'invention. Ces plasmides permettent l'expression simultanée d'un cytochrome P450 et du cytochrome b5 microsomal humain. Tous les plasmides de la série comportent l'ensemble original des caractères communs suivants:
(i) La cassette d'expression du P450 est préférentiellement sous le contrôle transcriptionnel du promoteur inductible GAL10-CYC1.
(ii) La cassette d'expression du cytochrome b5 est préférentiellement sous le contrôle transcriptionnel d'un des trois promoteurs suivants: GAL10-CYC1, GAPDH ou PGK.
(iii) Deux marqueurs de sélection sont présents dont l'un est préférentiellement le gène ADE2 de levure.
(iv) Les deux cassettes d'expression sont séparées sur le plasmide d'un côté par l'origine de réplication levure, de l'autre coté par le marqueur ADE2. Dans le cas où deux promoteurs identiques de type GAL10-CYC1 sont utilisés pour l'expression du b5 et du P450, ces promoteurs ont des orientations inversées sur le plasmide (par rapport à une rotation du plasmide). Deux terminateurs de transcription différents sont utilisés, préférentiellement ceux des gènes PGK et de la P450 réductase de levure. L'ensemble de ces propriétés a pour objet l'obtention de plasmides stables en particulier par rapport aux phénomènes de recombinaison homologue.
Les plasmides de la série diffèrent par la nature du promoteur utilisé pour l'expression du cytochrome b5. Cette propriété permet de moduler les niveaux relatifs d'expression et de les optimiser pour différentes conditions de culture ou applications.
Exemple 11.1. Construction du plasmide pAP4 permettant l'expression d'un
P450 sous le contrôle du promoteur GAL10-CYC1 et du b5 humain sous promoteur PGK.
Le vecteur, décrit dans la figure 15, pYeDPl/10/Hb5, contient la POL (phase ouverte de lecture) du cytochrome b5 humain bordée immédiatement en amont du codon d'initiation par un site BglII et immédiatement en aval du codon STOP par un site EcoRI. La cassette BglII-EcoRI étant incluse dans le vecteur d'expression pYeDPl/10 (Cullin et Pompon, Gène. 65 (1988) 203-217). Ce vecteur est digéré υ«u BamHl et Hindlll. Le fragment de 2310 pb qui contient les séquences du promoteur et du terminateur du gène PGK et la séquence codant pour le cytochrome b5 humain est récupéré puis traité par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase afin de rendre les extrémités bouts francs. Le vecteur pYeDP60 est digéré par l'enzyme de restriction EcoRV et le fragment de 5819 pb récupéré. Celui-ci contient les origines de réplication pour la levure et E. Coli. Ce fragment est recircularisé sur lui-même et donne le vecteur pAP2. Ce vecteur est digéré par Pvull et le fragment de 2310 pb issu du vecteur pYeDPl/10/Hb5 y est inséré dans l'orientation donnant le vecteur pAP3 dont la casette d'expression est conforme à la figure 17. Ce vecteur est digéré BglI. Le fragment de 7012 pb est récupéré. Le vecteur pYeDP60 est linéarisé par Pvull et la bande qui correspond au plasmide linéarisé est purifiée. Une culture de levure issue d'un clone de la souche W(N) est cotransformée par le plasmide linéaire et le fragment de 7012 pb et des clones prototrophes pour l'uracile et l'adénine sont sélectionnés. Par recombinaison homologue dans la levure, la cassette d'expression du cytochrome b5 sous le contrôle du promoteur et du terminateur du gène PGK se substitue au site Pvull du vecteur pYeDP60 et donne le vecteur final pAP4 (figures 16 et 17). L'ADN plasmidique correspondant au vecteur pAP4 est récupéré de la levure et utilisé pour transformer E. coli (Amp1"). Après sélection, amplification et contrôle de la structure du plasmide par restriction, la POL du cytochrome P450 d'intérêt est insérée dans le vecteur pAP4 dans la zone de clonage multiple située entre le promoteur G AL 10- CYCl et le terminateur du gène PGK. Le plasmide résultant est utilisé pour transformer, par sélection de clones prototrophes pour l'adénine et l'uracile, la souche de levure réceptrice choisie préférentiellement parmi celles décrites dans le présent brevet.
Exemple 11.2. Construction du plasmide pVD2 permettant l'expression d'un P450 sous le contrôle du promoteur GAL10-CYC1 et du b5 humain sous promoteur GAPDH.
Le vecteur pYeDPl/10/Hb5 est digéré par BglII et EcoRI pour sortir la bande codant pour le cytochrome b5 humain. La bande de 417 pb correspondant à la POL du b5 est purifiée puis clonée dans pAB2 digéré par BamHl et EcoRI. Dans le vecteur obtenu, le site EcoRI est alors détruit par digestion par EcoRI puis remplissage du site à l'aide du fragment de klenow de la DNA polymérase puis recircularisation par la ligase .Ce plasmide de 4993 pb, est appelé pVDl (figures 16 et 18).
La cassette d'expression de pVDl est ensuite amplifiée par PCR en utilisant les primers N17 (SEQ ID n° 17) et N18 (SEQ ID n° 18) comme amorces. La bande amplifiée est de 1753 pb. Les primers sont conçus pour ajouter aux deux extrémités de la cassette d'expression des pieds de recombinaisons homologues à la région située autour du site unique Pvull de pYeDP60. Par recombinaison homologue (voir exemple 11.1. et Figure 17) entre pYeDP60 linéarisé au site Pvull et déphosphorylé par la phosphatase alcaline, et la cassette d'expression amplifiée par PCR, le vecteur pVD2 conforme aux figures 16 et 19 est alors obtenu. La structure du vecteur est vérifiée après navette chez la levure (cotransformation) puis E. coli (sélection et amplification) par digestion par PstI et Hindlll. Le plasmide souhaité présentant une bande de digestion à 10994 pb est appelé pVD2 (Figure 19). Les différentes jonctions de la cassette d'expression sont vérifiées par séquençage à l'aide des primers NI 9 (SEQ ID n°19) et N20 (SEQ ID n°20).
Exemple 1.3. Construction du plasmide pVD3 permettant l'expression d'un P450 sous le contrôle du promoteur GAL10-CYC1 et du b5 humain sous promoteur GAL10-CYC1.
De même que dans la construction précédente, la POL du cytochrome b5 humain est obtenue à partir de pYeDPl/10/hb5 sous forme de fragment BglII-EcoRI.
Cette POL est introduite par ligation entre les sites BamHl et EcoRI du plasmide pYeDPHO, décrit figure 15, qui contient un bloc de séquence constitué (i) de séquences situées immédiatement en amont de la région promotrice du gène de la
P450 réductase de levure, (ii) du gène URA3, (iii) du promoteur GAL10-CYC1, (iv) du terminateur de transcription du gène de la P450 réductase de levure. Comme précédemment le site EcoRI du plasmide résultant de la ligation est détruit par coupure-remplissage-ligation pour donner un plasmide de 5551 pb appelé pVD3
(Figure 20). La cassette d'expression du cytochrome b5 humain sous le promoteur
GAL10-CYC1 est alors amplifiée par PCR grâce aux amorces N17 et N18 de manière similaire à l'exemple 12. La bande amplifiée de 2365 pb est purifiée puis introduite comme précédemment par recombinaison homologue en lieu du site Pvull de pYeDP60 (idem que la figure 19 en substituant le promoteur GAPDH par GAL10- CYC1). La nature des séquences des pieds de recombinaison introduits par PCR impose une orientation inverse des deux cassettes GAL10-CYC1 présentent sur le plasmide recombiné comme indiqué dans la description de la structure générale des plasmides de l'invention. Le plasmide de 11595 pb, appelé pVD4 et conforme à la figure 16 est alors sélectionné après navette levure- Ecoli La jonction entre le promoteur GAL10-CYC1 et le gène du cytochrome b5 est vérifiée par séquençage grâce à l'amorce N21 (SEQ LD n°21).
Nomenclature des souches obtenues:
W(GhR, ΔB): MATa, leu2-3,\\2, αde2Λ, trpl-l. urtύ-l. W(hR, ΔB): MATa, leu2-3,\\2, αde2-\, trpl-1. W(hR, hb5): MATa, leu2-3,\\2, αde2Λ, trpl-1. W(GhR, hb5): MATa, Ieu2-3,U2, αde2Λ, trplΛ, urα3-\. V/(hR, Lhb5): MATa, αde2-l, trpl-l.
W(GhR, Lhb5): MATa, αde2-\, trp J-l, urα3-l. W(R, Lhb5, Yb5) W(hR, Lhb5, Yb5)
Séquences des primers utilises : (SEQ LD n°l) NI: 5'GCGGATCCATGGGAGACAGTCACGTGG3'.
(SEQ ID n°2) N2: 5'-CGGAATTCAGATCTAGCTCCACACGTCCAGG-3'.
(SEQ LD n°3) N3: 5'-CCAAGCTTGAGTTTATCATTATCAATACTCG-3'.
(SEQ ID n°4) N4: 5'-CGGATCCTATTTATGTGTGTTTATTCGAAACTAAGTTCTTGG-3'.
(SEQ LD n°5) N5: 5'-GGATCCGAGCGGGTAATAGCCTGGAGTTTCC-3'. (SEQ LD n°6)
N6: 5'-CCGACTGCTCTGCCATGATTGTTTGATATTTTATGTTGTAGTTGATTG-3,.
(SEQ ID n°7)
N7: 5'-CCTATACATGGCAGAGGACTGAATTCTTTTTCTTCCAGAATAGCCCACAC-3'
(SEQ LD n°8) N8: 5'-GGAGATCTGTGACATACTTCTATGCGATATAG-3'. (SEQ LD n°9) N9: 5'-TTGAAGGTTCAACATCAATTGATTG-3'.
(SEQ ID n°10)
N10:5'-GTGTGGCGGCCGCCTCCTTGTCAATATTAATGTTAAAG-3'.
(SEQIDn°ll)Nil:5'-CAAGGAGGCGGCCGCCACACAAAAAGTTAGGTGT-3'. (SEQ LD n°12) N12: 5'-TCTGCTTCCCTAGAACCTTCTTATG-3'. (SEQ LD n°13) N13: 5'-CAGATCTGCATGCCTAAAGTTTACAGTTACC-3'. (SEQ LD n°14)
N 14: 3'-CGGATTCTGCAGTTATTCGTTCAAC AAATAATAAGC AACACC-3'. (SEQ LD n°15) N15: 5'-CCGAATTCTGATCAGTCCTCTGCCATGTATAGG-3'. (SEQ LD n°16) N16: 5'-GCCCAGATCTATGGCAGAGCAGTCGGACG-3'. (SEQ ID n°17) N17: 5'-ggcgttacccaacttaatcgccttgcacatccccctttcgcc GGAACGTGCTGCTACTCATCCTAGTCC
Les 42 premières bases sont homologues à la région comprise entre les bases 4069 et 4113 de pYeDP60. En majuscules, bases 43-69, les nucleotides du primer sont homologues à la région de pUB81 comprise entre les bases 5772 et 5799 qui correspondent à une région du gène de URA3.
(SEQ ID n°18) N18: 5'- gggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctGG
CCGATTCATTAATGCAGCTGGGCGG Les 43 premières bases sont homologues au brin complémentaire de la région de pYeDP60 comprise entre les bases 4114 et 4157. Les bases 44 à 71 sont homologues à la région de pUB81 comprise entre les bases 2507 et 2538.
(SEQ LD n°19) N19: 5'-cccccctttcgccagggaacgtgc
Ce primer est homologue de la région entre 4102 à 4125 de pVD2 correspondant à la fin de la phase ouverte de lecture du gène URA3 voisin de la cassette d'intégration du cytochrome b5 humain sous le promoteur GAPDH.
(SEQ LD n°20) N20: 5'- cggtaggtattgattgtaattctg
Cette amorce pour le séquençage est homologue de la partie de pVD2 comprise entre les bases 4835 et 4860 correspondant à la fin du promoteur GAPDH. (SEQ ID n°21 ) N21 : 5'- ggcatgcatgtgctctgtatg
Cette amorce pour le séquençage est homologue à la région du promoteur
GAL10-CYC1 située à -120 pb de la jonction entre le promoteur GAL10-CYC1 et la
POL du cytochrome b5 humain. REFERENCES:
- Baim, S. B. & Scherman, F. (1988) mRNA structures influencing translation in the yeast S. cerevisae , Mol. Cell. Biol. 8, 1591-1601.
- Barnes, H. J. Arlotto, M. P. & Waterman, M. R. (1991) Expression and enzymatic activity of recombinant cytochrome P450 17a-hydroxylase in Escherichia coli Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5597-5601.
- Bellamine, A. Gautier, J. C. Urban, P. & Pompon, D. (1994) Chimeras of the human cytochrome P450 IA famiiy produced in yeast: Accumulation in microsomal membranes, enzyme kinetics and stability, Eur. J. Biochem. 225, 1005- 1013.
- Bonneaud, N. Ozier-Kalogeropoulos, O. Li, G. Labrousse, M. Minvielle- Sebastia, L. & Lacroute, F. (1991) A famiiy of low and high copy replicative, integrative and single strand S.cerevisiaelE. coli shuttle vectors, Yeast 7, 609-615.
- Cullin, C. & Pompon, D. (1988) Synthesis of functional mouse cytochrome P450 PI and chimeric cytochrome P450 P3-1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae,
Gène (Amst.) 65, 203-217.
- Doehmer, J. & Greim, H. Cytochromes P450 in genetically engineered cell cultures: the gène technological approch in Cytochrome P450, Handbook of expérimental pharmacology, 105; Eds Schenkman, J. B. & Greim, H. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York (1992), 3-13.
- Guengerich, F. P. (1988) Rôles of cytochrome P450 enzymes in chemical carcinogenesis and cancer chemotherapy, Cancer Res. 48, 2946-2954.
- Oeda, K. Sakaki, T. & Ohkawa, H. (1985) Expression of rat liver cytochrome P-450MC cDNA in Saccharomyces cerevisiae, DNA 4, 203-210. - Pompon, D. (1988) cDNA cloning and functional expression in yeast Saccharomyces cerevisiae of b-naphtoflavone-induced rabbit liver cytochromes P-450 LM4 and LM6, Eur. J. Biochem. 177, 285-293.
- Stotz, A. & Linder, P. (1990) The ADE2 gène from Saccharomyces cerevisiae: séquence and new vectors, Gène (Amst.) 95, 91-98.
- Truan, G. Cullin, C. Reisdorf, P. Urban, P. & Pompon, D. (1993) Enhanced in vivo monooxygenase activities of mammalian cytochrome P450s in engineered yeast cells producing high levels of NADPH-cytochrome P450 réductase and human cytochrome b5, Gène (Amst) 125, 49-55. - Truan, G. Epinat, J. C. Rougeulle, C. Cullin, C. & Pompon, D. (1994)
Cloning and charactherization of yeast cytochrome b5-encoding gène wich supresses kétokonazole hypersensivity in a NADPH-P-450 réductase-deficient strain, Gène (Amst.) 149, 123-127.
- Urban, P. Cullin, C. & Pompon, D. (1990) Maximizing the expression of mammalian cytochrome P-450 monooxygenase activities in yeast cells, Biochimie
(Paris) 72, 463-472.
- Urban, P. Truan, G. Gautier, J. C. & Pompon D (1993) Xenobiotic metabolism in humanized yeast: engenieered yeast cells producing human NADPH- cytochrome P450 réductase, cytochrome b5, epoxide hydrolase and cytochrome P450s, Biochem Soc Transact 21 ,1028-1033.
- Zuber, M. X. Simpson, E. R. & Waterman, M. R. (1986) Expression of bovine 17a-hydroxylase cytochrome P-450s cDNA in nonsteroidogenic (COS1) cells, Science 234, 1258-1261.
- Brevet n° WO 93/02200: Souches de levure avec intégration stable de gènes hétérologues.
- Brevet n° WO 94/01564: Souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 de plante et d'une NADPH- cytochrome P450-réductaseendogène ou hétérologue et son utilisation à des fins de bioconversion. LISTE DE SEQUENCES
(1 ) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANTS:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: (1) 40.91.69.22 (H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.91 (A) NOM: C.N.R.S
(B) RUE: 3, Rue Michel Ange
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75016 (G) TELEPHONE: (1) 44 96 40 00
(H) TELECOPIE: (1) 44 96 50 00
(il) TITRE DE L' INVENTION: SOUCHES DE LEVURES EXPRIMANT DES GENES HUMAINS LEUR MODE DE PREPARATION AINSI QUE LES SOUCHES INTERMEDIAIRES.
(m) NOMBRE DE SEQUENCES: 21
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 27 bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ni) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 : GCGGATCCAT GGGAGACAGT CACGTGG 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 bases
(B) -..PE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (11) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON
Figure imgf000044_0001
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: CGGAATTCAG ATCTAGCTCC ACACGTCCAG G 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CCAAGCTTGA GTTTATCATT ATCAATACTC G 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 42 bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: CGGATCCTAT TTATGTGTGT TTATTCGAAA CTAAGTTCTT GG 42
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 31 bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ni) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GGATCCGAGC GGGTAATAGC CTGGAGTTTC C 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CCGACTGCTC TGCCATGATT GTTTGATATT TTATGTTGTA GTTGATTG 48
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 50 bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON
Figure imgf000045_0001
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: CCTATACATG GCAGAGGACT GAATTCTTTT TCTTCCAGAA TAGCCCACAC 50
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 31 bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: GGAGATCTGT GACATACTTCT ATGCGATATA G 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc !ιιι) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 38 bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 34 bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 34
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ni) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 31 bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: CAGATCTGCA TGCCTAAAGT TTACAGTTAC C 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
CGGATTCTGC AGTTATTCGT TCAACAAATA ATAAGCAACA CC 42
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CCGAATTCTG ATCAGTCCTC TGCCATGTAT AGG 33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: GCCCAGATCT ATGGCAGAGC AGTCGGACG 29
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17: (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 69 bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ni) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
GGCGTTACCC AACTTAATCG CCTTGCACAT CCCCCTTTCG CCGGAACGTG 50
CTGCTACTCA TCCTAGTCC 69
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 70 bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC TATTACGCCA GCTGGCCGAT 50
TCATTAATGC AGCTGGGCGG 70
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (in) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: CCCCCCTTTC GCCAGGGAAC GTGC 24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: CGGTAGGTAT TGATTGTAAT TCTG 24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21 : GGCATGCATG TGCTCTGTAT G 21

Claims

REVENDICATIONS
1) Souche de levure génétiquement modifiée caractérisée en ce que :
1° Les gènes codant pour le cytochrome b5 endogène et pour la cytochrome P450 réductase endogène ont été inactivés, 2° Elle contient un acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome
P450-réductase humaine,
3° Elle contient un acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain.
2) Souche selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un ADNc.
3) Souche selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'un au moins des ADNc humains est sous contrôle d'un promoteur de levure constitutif ou inductible.
4) Souche selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un promoteur constitutif, choisi parmi le promoteur du gène de la glyceraldéhyde phosphodéhydrogénase, le promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase et le promoteur endogène du cytochrome b5.
5) Souche selon la revendication 3 caractérisée en ce que le promoteur inductible est choisi parmi les promoteurs GAL10 et CYCl -G ALI 0
6) Souche selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine est intégré dans le génome de la levure.
7) Souche selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain est intégré dans le génome de la levure.
8) Souche selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un acide nucléique codant pour un cytochrome P450 humain. 9) Souche selon la revendication 8 caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le cytochrome P450 humain est intégré sur un plasmide.
10) Souche selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une copie supplémentaire de l'acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain sur ledit plasmide ou intégré dans le génome.
11) Souche selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle est haploïde.
12) Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisée en ce que la levure est une souche de Saccharomyces cerevisiae.
13) Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 11 et 12 caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche W(hR, hb5) qui comprend un acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain et un acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine.
14) Souche selon la revendication 13 caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine y est sous contrôle du promoteur du gène de la glyceraldéhyde phosphodéhydrogénase de levure ( souche W(GhR,hb5)) .
15) Souche selon la revendication 13 caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain y est sous contrôle du promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase de levure ( souche W(hR,Lhb5)).
16) Souche selon l'une des revendications 13, 14 ou 15 caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain y est sous contrôle du promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase de levure et l'acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine y est sous contrôle du promoteur du gène de la glyceraldéhyde phosphodéhydrogénase de levure (souche W(GhR, Lhb5)). 17) Souche selon les revendications 13 à 16 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un acide nucléique codant pour un cytochrome P450 humain.
18) Souche selon la revendication 17 caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le cytochrome P450 humain est intégré sur un plasmide.
19) Souche de levure génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche W(hR, Lhb5, Yb5) qui comprend un acide nucléique codant pour le cytochrome b5 humain sous contrôle du promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase de levure, un acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450- réductase humaine et un acide nucléique codant pour le cytochrome b5 de levure.
20) Souche de levure génétiquement modifiée comprenant un acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine et dont les gènes codant pour le cytochrome b5 de levure et la NADPH-cytochrome P450-réductase de levure ont été inactivés (souche W(hR, ΔB)).
21) Souche selon la revendication 20 caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase humaine est sous contrôle du promoteur du gène de la glyceraldéhyde phosphodéhydrogénase de levure ( souche W(GhR,ΔB)).
22) Procédé d'obtention des souches W(hRα hb5), W(hR,Lhb5) caractérisé en ce qu'il met en oeuvre la souche W(hR, ΔB)
23) Procédé d'obtention des souches W(GhR,hb5) et W(GhR, Lhb5) caractérisé en ce qu'il met en oeuvre la souche W(GhR, ΔB).
24) Procédé d'évaluation de la toxicité d'un composé caractérisé en ce que :
- le dit composé est mis en présence d'une levure selon l'une des revendications 1 à 18 ou d'une préparation enzymatique dérivée d'une telle levure et
- on analyse les métabolites produits quant à leur toxicité. 97/10344 PC17FR96/01413
51
25) Méthode de détermination in vitro des métabolites humain d'un composé chimique caractérisée en ce que :
- le dit composé est mis en présence d'une levure selon l'une des revendications 1 à 18 ou d'une préparation enzymatique dérivée d'une telle levure et - on analyse les métabolites produits.
26) Plasmide caractérisé en ce qu'il permet l'expression simultanée d'un cytochrome P450, de préférence humain, et du cytochrome b5 microsomal humain.
27) Plasmide selon la revendication 26 caractérisé en ce que:
(i) la cassette d'expression du P450 comprend préférentiellement le promoteur GAL10-CYC1,
(ii) la cassette d'expression du b5 comprend préférentiellement l'un des promoteurs GAL10-CYC1, PGK ou GAPDH, et,
(iii) lorsque le même promoteur est utilisé deux fois, les deux copies sont présentes dans des orientations inversées sur le plasmide.
28) Plasmide selon la revendication 27 caractérisé en ce que les deux cassettes d'expression sont séparées sur le plasmide d'un côté par l'origine de réplication levure, de l'autre côté par au moins un marqueur de sélection levure.
29) Souche de levure transformée par un plasmide selon l'une des revendications 26 à 28.
30) Souche de levure selon la revendication 29 dépourvue du gène endogène du cytochrome b5 microsomal.
PCT/FR1996/001413 1995-09-15 1996-09-13 Souches de levures genetiquement modifiees WO1997010344A1 (fr)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP51171597A JP4717967B2 (ja) 1995-09-15 1996-09-13 遺伝子改変酵母株
CA2229328A CA2229328C (fr) 1995-09-15 1996-09-13 Souches de levures genetiquement modifiees
EP96931123A EP0876495B1 (fr) 1995-09-15 1996-09-13 Souches de levures genetiquement modifiees
AT96931123T ATE311465T1 (de) 1995-09-19 1996-09-13 Gentechnisch hergestellte hefestämme
DE69635525T DE69635525T2 (de) 1995-09-15 1996-09-13 Gentechnisch hergestellte hefestämme
US09/043,239 US6117649A (en) 1995-09-15 1996-09-13 Genetically engineered yeast strains
SI9630725T SI0876495T1 (sl) 1995-09-19 1996-09-13 Genetsko modificirani kvasni soji

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR95/10826 1995-09-15
FR9510826A FR2738840B1 (fr) 1995-09-19 1995-09-19 Souches de levures genetiquement modifiees

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09/495,901 Division US6579693B1 (en) 1995-09-15 2000-02-02 Genetically engineered yeast strains

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997010344A1 true WO1997010344A1 (fr) 1997-03-20

Family

ID=9482581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1996/001413 WO1997010344A1 (fr) 1995-09-15 1996-09-13 Souches de levures genetiquement modifiees

Country Status (11)

Country Link
US (2) US6117649A (fr)
EP (1) EP0876495B1 (fr)
JP (1) JP4717967B2 (fr)
AT (1) ATE311465T1 (fr)
CA (1) CA2229328C (fr)
DE (1) DE69635525T2 (fr)
DK (1) DK0876495T3 (fr)
ES (1) ES2252758T3 (fr)
FR (1) FR2738840B1 (fr)
SI (1) SI0876495T1 (fr)
WO (1) WO1997010344A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001096555A1 (fr) * 2000-06-14 2001-12-20 Aventis Pharma S.A. Banques combinatoires ameliorees par recombinaison dans la levure et procede d'analyse
EP1180546A1 (fr) * 1999-04-27 2002-02-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Lignee cellulaire humaine presentant une expression stable des cytochromes p450

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
JP2004532014A (ja) * 2001-03-09 2004-10-21 ユニバーシティ・オブ・ケンタッキー・リサーチ・ファウンデーション チトクロームｐ４５０類及びその使用
US20030059888A1 (en) * 2001-08-22 2003-03-27 Shengfeng Li Compositions and methods for generating antigen-binding units
GB0216203D0 (en) * 2002-07-12 2002-08-21 Imp Cancer Res Tech Mondulation of cytochrome P450 reductase activity
WO2010134095A2 (fr) 2009-05-19 2010-11-25 Premas Biotech Pvt. Ltd Souche de levure exprimant le cytochrome p450 réductase humain modifié et/ou un gène du cytochrome p450
WO2010134096A2 (fr) 2009-05-19 2010-11-25 Premas Biotech Pvt. Ltd Souche de levure exprimant le cytochrome p450 réductase humain modifié et/ou un gène du cytochrome p450
CA3113642A1 (fr) * 2018-09-20 2020-03-26 Washington University Microorganismes modifies et procedes de fabrication et d'utilisation associes
CA3242184A1 (fr) * 2021-12-24 2023-06-29 The Regents Of The University Of California Production de saponine dans levure
DE102023102366A1 (de) 2023-01-31 2024-08-01 BRANDENBURGISCHE TECHNISCHE UNIVERSITÄT COTTBUS-SENFTENBERG, Körperschaft des öffentlichen Rechts Testsystem aufweisend stabil CYP-transfizierte oder transduzierte Säugetierzellen

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2679249B1 (fr) * 1991-07-15 1993-11-26 Centre Nal Recherc Scientifique Souches de levure avec integration stable de genes heterologues.

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM.SOC.TRANS., vol. 21, no. 4, 1993, pages 1028 - 1034 *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 112, no. 19, 7 May 1990, Columbus, Ohio, US; abstract no. 173291, YAMANO, SHIGERU ET AL: "Human NADPH-P450 oxidoreductase: complementary DNA cloning, sequence and vaccinia virus-mediated expression and localization of the CYPOR gene to chromosome 7" XP002005492 *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 112, no. 3, 15 January 1990, Columbus, Ohio, US; abstract no. 17111, MIYATA, MASAAKI ET AL: "Isolation and characterization of human liver cytochrome b5 cDNA" XP002005493 *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 114, no. 11, 18 March 1991, Columbus, Ohio, US; abstract no. 96211, RENAUD, JEAN PAUL ET AL: "Expression of human liver cytochrome P450 IIIA4 in yeast. A functional model for the hepatic enzyme" XP002005491 *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 115, no. 1, 8 July 1991, Columbus, Ohio, US; abstract no. 147, GUENGERICH, F. PETER ET AL: "Oxidation of dihydropyridine calcium channel blockers and analogs by human liver cytochrome P-450 IIIA4" XP002005490 *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 117, no. 9, 31 August 1992, Columbus, Ohio, US; abstract no. 85812, PEYRONNEAU, MARIE ANNE ET AL: "Optimization of yeast -expressed human liver cytochrome P450 3A4 catalytic activities by coexpressing NADPH - cytochrome P450 reductase and cytochrome b5" XP002005489 *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 119, no. 19, 8 November 1993, Columbus, Ohio, US; abstract no. 199224e, URBAN,PHILIPPE ET AL.: "Xenobiotic metabolism in humanized yeast:Engineered yeast cells producing human NADPH-cytochrome P-450 reductase,cytochrome b5,epoxide hydrolase and P-450s." page 464; XP002005494 *
EUR. J. BIOCHEM. (1990), 194(3), 889-96 CODEN: EJBCAI;ISSN: 0014-2956 *
EUR. J. BIOCHEM. (1992), 207(1), 109-16 CODEN: EJBCAI;ISSN: 0014-2956 *
J. MED. CHEM. (1991), 34(6), 1838-44 CODEN: JMCMAR;ISSN: 0022-2623 *
MOL. PHARMACOL. (1989), 36(1), 83-8 CODEN: MOPMA3;ISSN: 0026-895X, 1989 *
PHARMACOL. RES. (1989), 21(5), 513-20 CODEN: PHMREP, 1989 *
TRUAN, GILLES ET AL: "Enhanced in vivo monooxygenase activities of mammalian P450s in engineered yeast cells producing high levels of NADPH -P450 reductase and human cytochrome b5", GENE (1993), 125(1), 49-55 CODEN: GENED6;ISSN: 0378-1119, XP002005488 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1180546A1 (fr) * 1999-04-27 2002-02-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Lignee cellulaire humaine presentant une expression stable des cytochromes p450
EP1180546A4 (fr) * 1999-04-27 2002-07-31 Takeda Chemical Industries Ltd Lignee cellulaire humaine presentant une expression stable des cytochromes p450
US6756229B1 (en) 1999-04-27 2004-06-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Human cell line showing stable expression of cytochromes P450
WO2001096555A1 (fr) * 2000-06-14 2001-12-20 Aventis Pharma S.A. Banques combinatoires ameliorees par recombinaison dans la levure et procede d'analyse
FR2810339A1 (fr) * 2000-06-14 2001-12-21 Hoechst Marion Roussel Inc Banques combinatoires ameliorees par recombinaison dans la levure et procede d'analyse

Also Published As

Publication number Publication date
DE69635525D1 (de) 2006-01-05
JP4717967B2 (ja) 2011-07-06
ES2252758T3 (es) 2006-05-16
EP0876495A1 (fr) 1998-11-11
US6117649A (en) 2000-09-12
SI0876495T1 (sl) 2006-04-30
EP0876495B1 (fr) 2005-11-30
US6579693B1 (en) 2003-06-17
FR2738840A1 (fr) 1997-03-21
FR2738840B1 (fr) 1997-10-31
JPH11513241A (ja) 1999-11-16
ATE311465T1 (de) 2005-12-15
DE69635525T2 (de) 2006-08-10
CA2229328A1 (fr) 1997-03-20
DK0876495T3 (da) 2006-04-03
CA2229328C (fr) 2012-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pompon et al. [6] Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments
Urban et al. Characterization of recombinant plant cinnamate 4‐hydroxylase produced in yeast: Kinetic and spectral properties of the major plant P450 of the phenylpropanoid pathway
EP0876495B1 (fr) Souches de levures genetiquement modifiees
CA2113477C (fr) Souches de levure avec integration stable de genes heterologues
Stasyk et al. Sterol glucosyltransferases have different functional roles inPichia pastoris and Yarrowia lipolytica
JP6522551B2 (ja) （−）−ロタンドンの製造方法
EP0727489B1 (fr) Séquence d'ADN codant pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol, delta-7 réductase, protéine delta-7-Red, procédé de production, souches de levures transformées, applications
Nthangeni et al. The use of Yarrowia lipolytica for the expression of human cytochrome P450 CYP1A1
Cabello‐Hurtado et al. Optimized expression and catalytic properties of a wheat obtusifoliol 14α‐demethylase (CYP51) expressed in yeast: Complementation of erg11Δ yeast mutants by plant CYP51
Lambkin et al. Yarrowia lipolytica cells mutant for the peroxisomal peroxin Pex19p contain structures resembling wild-type peroxisomes
EP0994192B1 (fr) Cassette de transformation de la levure
DE69729097T2 (de) Cytochrom p450 expression in enterobakterien
Cheng et al. Establishment of a yeast system that stably expresses human cytochrome P450 reductase: application for the study of drug metabolism of cytochrome P450s in vitro
EP0349435A1 (fr) Procédé de préparation d'une protéine par des levures utilisant un système inductible, vecteurs et souches transformées correspondantes
FR2689905A1 (fr) Procédé de clonage d'une séquence d'ADN codant pour une NADPH cytochrome P450 réductase et séquences d'ADN codant pour une NADPH-cytochrome P450 réductase, notamment de plantes.
CA2418370C (fr) Levures modifiees et utilisations, notamment pour la production de derives steroidiens
JP3610410B6 (ja) 異種遺伝子を安定に組み込んだ酵母菌株
FR2810339A1 (fr) Banques combinatoires ameliorees par recombinaison dans la levure et procede d'analyse
WO1985003946A1 (fr) Cellules hybrides productrices d'un polypeptide determine
AU2002355486B2 (en) Chimeric proteins comprising a haem domain of a mammalian or plant cytochrome P450 and a scaffold-reductase domain from P450 BM3 of bacillus megaterium and uses thereof
WO1993008260A1 (fr) Levures contenant des cytochromes multiples de mammifere pour degrader des melanges chimiques complexes
EP0301954A2 (fr) Procédé de clonage et d'expression de gènes codant pour des protéines constituant des édifices fonctionnels organisés
Ding et al. An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome b gene to facilitate studying the role of cytochrome b in the formation of reactive oxygen species
CA2386419A1 (fr) Procede de preparation de steroides modifies par fermentation de levures
JP2002543842A (ja) 酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼと相互作用する新規なタンパク質をコードするヒマから単離された遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2229328

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2229328

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1996931123

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 1997 511715

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09043239

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1996931123

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1996931123

Country of ref document: EP