CA2386419A1

CA2386419A1 - Procede de preparation de steroides modifies par fermentation de levures

Info

Publication number: CA2386419A1
Application number: CA002386419A
Authority: CA
Inventors: Gilles Cauet; Eric Degryse; Pedro Vico; Richard Lathe
Original assignee: Individual
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1999-10-05
Filing date: 2000-10-04
Publication date: 2001-04-12
Also published as: US7033779B1; AU7672600A; WO2001025469A3; JP2004500340A; EP1218516A2; AU780186B2; WO2001025469A2; FR2799206A1

Abstract

La présente invention concerne un procédé de production de stéroïde hydroxyl é et/ou acétylé comprenant les étapes selon lesquelles: on cultive des levures sur un milieu comprenant au moins un précurseur de tels stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés, puis on isole les stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés du milieu après bioconversion, ledit procédé étant caractérisé en ce que lesdit es levures sont des levures transformées de façon à exprimer le produit du gène Cyp7b. L'invention concerne aussi les souches de levures modifiées.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE STEROIDES MODIFIES PAR
FERMENTATION DE LEVURES
La présente invention concerne un nouveau procédé de production de stéroïdes hydroxylés ou/et acétylés par fermentation de levures.
Les stéroïdes, notamment les stéroïdes dérivés du cholestérol, sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques parmi lesquels on peut citer la régulation des taux de glucides et cholestérol dans la circulation sanguine, le maintien et développement de la masse musculaire, le développement du système nerveux central.
Parmi les inconvénients observés en cas de dérèglement des taux de stéroïdes circulants, on peut citer le déclenchement éventuel de maladies auto-immunes, telles le lupus, de certains cancers, par exemple le cancer du sein, de maladies cardiovasculaires, par exemple l'athérosclérose. Des problèmes de régulation de stéroïdes sont également soupçonnés dans le cas du déclenchement de certaines maladies neurologiques tels les maladies de Parkinson ou d'Alzheimer.
Les études réalisées, notamment par le Professeur Baulieu, sur la déhydroépiandrostérone ou DHEA ont montré l'importance des stéroïdes, notamment des neurostéroïdes, dans le développement du système nerveux central mais également l'impact possible de ce type de stéroïdes dans tous les processus connexes, y compris le phénomène de vieillissement (Baulieu et Robel , 1998, Proc. Natl. Acad.
Sci., 95, 4089-4091 ).
Il est donc particulièrement intéressant de pouvoir disposer de nouveaux dérivés stéroïdiques, notamment de la famille des neurostéroïdes, qui sont impliqués dans un très grand nombre de processus physiologiques.
C'est précisément l'un des objets de la présente invention, à savoir la mise au point d'un procédé permettant l'accès à de nouveaux dérivés stéroïdiques, notamment des neurostéroïdes, et ce par des méthodes de fermentation qui autorisent des spécificités élevées, de même que des rendements de production importants.
Les procédés selon la présente invention peuvent d'ailleurs être utilisés afin d'obtenir des stéroïdes dont la structure est également connue mais qui, jusqu'ici, étaient difficilement accessibles par des procédés commercialement acceptables.
La présente invention repose sur la mise en évidence du fait que les levures sont capables de convertir biologiquement, ou bioconvertir, des stéroïdes précurseurs en produisant des stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés divers, lesquels peuvent bien

2 entendu, si cela est nécessaire, être ensuite modifiés sur de telles fonctions particulièrement réactives.
C'est pourquoi la présente invention concerne notamment un procédé de production de stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés comprenant les étapes selon lesquelles ~ on cultive des levures sur un milieu comprenant au moins un précurseur de tels stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés, puis ~ on isole les stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés du milieu après bioconversion, ledit procédé étant caractérisé en ce que lesdites levures sont des levures transformées de façon à exprimer le produit du gène Cyp7b.
La levure possède naturellement une activité enzymatique d'acétylation codée par le gène atfl, et une activité enzymatique de déshydrogénation codée par le gène yill24w.
L'enzyme codée par le gène atfl (dont la séquence et l'activité sont décrites dans Cauet et a 1., 1999, Eur. J. Biochem., 261, 317-324 et dans la demande de brevet français FR2774393 ou à l'adresse http://~enome-www.stanford.edu/
Saccharomyces) est l'acétyle coenzyme-A-pregnénolone-acétyle transférase, ci-après dénommée « APAT ». Cette enzyme permet l'estérification, et plus particulièrement l'acétylation, d'un précurseur stéroïdien tel que par exemple un OS - ou 04 -3~3-hydroxystéroide, tel que la pregnénolone, la 17-hydroxy pregnénolone, la déhydroépiandrostérone (DHEA), ou la 4-pregnene-3(3o1-20-one, par exemple. De manière préférée, cette estérification est réalisée au niveau de la fonction OH en position 3 d'undit précurseur.
L'expression de cette activité dans les levures permet par conséquent l'obtention de dérivés de précurseurs stéroïdiens acétylés, en tout ou en partie. De même il est possible de protéger chimiquement tout ou partie des fonctions OH du précurseur incorporé au milieu de culture de manière à ce que la réaction d'acétylation ne puisse pas se produire sur tout ou partie desdites fonctions. De telles méthodes de protection sont bien connues et consistent par exemple en l'addition de silane, en la modification en fonction ester,...
Toutefois, selon un mode de réalisation particulier de la présente invention décrit ci-après, il est également possible d'utiliser des souches de levure dépourvue de l'activité enzymatique APAT, telles que notamment celles décrites dans Cauet et al.

3 (1999, Eur. J. Biochem., 261, 317-324) ou dans la demande de brevet français FR2774393, dont les contenus sont incorporés par référence dans la présente demande.
Le gène yi1124w a été décrit lors du projet de séquençage du génome de la levure, toutefois sa fonction n'avait alors pas été déterminée. Il est localisé sur le chromosome IX, aux coordonnées 126204 à 127097. Sa séquence est aisément accessible à l'homme de l'art dans la base de données du génome de Saccharomyces située, par exemple, à l'adresse http://~enome-www.stanford.edu/. Dans le cadre des travaux de la présente invention, il a été montré que la protéine codée par le gène yill24w possède une activité déshydrogénase comparable à l'activité de la 17(3-hydroxystéroïde déshydrogénase précédemment décrite chez les mammifères (17BDH ; Wu et al., 1993, J. Biol. Chem., 268, 12964-12969). Cette activité
dirige plus spécifiquement la réduction en alcool de la fonction cétone située, naturellement ou après modification chimique, en position 17 de certains précurseurs stéroïdiens tels que la DHEA, par exemple. Plus particulièrement, dans le cas du substrat DHEA, l'activité enzymatique de la protéine codée par le gène yill24w conduit à la réduction de la fonction cétone de ce stéroïde et à la formation d'un 3, 17-diol, auquel on référera ci-après comme « Diol ». En outre, lorsque le cas l'impose, la séquence du gène yi1124w étant connue, il est aisé à l'homme du métier, familier des techniques de mutagénèse dans la levure, de produire une souche de levure dans lesquelles le gène yi1124w est inactivé. Par exemple, conformément aux exemples qui suivent, il est possible d'obtenir des souches de levure pour lesquelles la séquence codante du gène yill24w est interrompue (technique Knock-out) et l'activité enzymatique supprimée.
Le gène Cyp7b est connu, il a déjà été décrit par Stapleton et al., (1995, J.
Biol.
Chem., 270, 29739-29745) ou Rose et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4930). Sa séquence est notamment décrite dans la demande de brevet W09612820 et est accessible auprès de Institute for Fermentation Osaka (IFO) sous le code d'accès IFO 2031. Les contenus de ces documents sont incorporés par référence à la présente demande. Toutefois, rien ne laissait supposer que ce gène de mammifère pouvait être exprimé, et plus particulièrement exprimé sous sa forme active, par une levure. En outre, rien ne permettait d'envisager qu'une telle levure serait capable d'utiliser un stéroïde comme substrat. En effet, le gène Cyp7b est un gène isolé chez les mammifères, notamment le rat, la souris et l'homme, chez lesquels l'enzyme codée par ce gène appartient à la famille des enzymes communément appelées « cytochromes

4 P450 », dont la forme active renferme de l'hème (Poulos, 1988, Pharm. Res., 5, 67-75) et qui sont impliquées dans les voies métaboliques des stéroïdes (voir Rose et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4925-4930). La protéine Cyp7b est une hydroxylase , et plus particulièrement une 7-hydroxylase permettant d'obtenir des stéroïdes 7-hydroxylés, et plus particulièrement des stéroïdes 7a-hydroxylés.
Néanmoins, il est possible d'envisager le cas particulier pour lequel le substrat stéroïdien est un équivalent des composés stéroïdiens connus, dans lequel par modification de la structure de l'un des cycles la « position naturellement 7 » soit transformée en un « équivalent position 6 ». Dans ce cas précis, la protéine Cyp7b permettrait d'obtenir des stéroïdes 6-hydroxylés.
Selon un cas préféré de l'invention, l'action sur le composé « Diol » décrit plus haut de l'enzyme Cyp7b exprimée dans les levures utilisées permet la formation d'un 3, 7, 17- triol, ci-après dénommé « Triol ». En outre, lorsque la fonction 30H
dudit diol ou dudit triol est acétylée, on parlera respectivement d'« acétyl-diol »
ou d' « acétyl-triol ».
La nature des stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés produits selon le procédé de l'invention dépend par conséquent de la possibilité pour la levure d'exprimer ou non les fonctions d'acétylation codée par le gène atfZ, et/ou de déshydrogénation, codée par le gène yi1124w , en combinaison avec la possibilité pour ladite levure d'exprimer l'enzyme d'hydroxylation Cyp7b.
De préférence, les composés que l'on souhaitera produire selon la présente invention seront des composés hydroxylés, dans la mesure où, pour un grand nombre de stéroïdes, il a été montré que le dérivé hydroxylé était plus actif que le dérivé
acétylé. Néanmoins, à cet égard, il convient de noter que la fonction acétyle est susceptible d'être progressivement hydrolysée in vivo et peut donc constituer une forme retard de la forme hydroxylée (c'est à dire que le composé tel qu'administré au patient n'est pas la forme active mais que cette forme active est obtenue in vivo, après métabolisation naturelle du composé acétylé). C'est pourquoi la présente invention concerne tout aussi bien un procédé de production de stéroïdes comportant des fonctions OH libres, que protégées par un radical acétyle.
En tout état de cause, selon le mode de réalisation préféré pour lequel on cherche à produire des dérivés stéroïdiens hydroxylés, il est souhaitable que l'activité

APAT de la levure mise en oeuvre dans le procédé de l'invention soit faible ou nulle.
Pour ce faire, il existe différentes possibilités .
Selon une première variante, il est possible d'utiliser des souches de levures dans lesquelles le gène atJ2 est naturellement absent ou, à tout le moins, est peu ou non

5 exprimé. Ainsi, Nagasawa et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1852-1857, 1998) mentionnent qu'une souche IF02031 (Sacccharomyces bayanus) est exempte du gène atfl.
Selon une autre variante, il est possible d'utiliser des conditions de culture dans lesquelles la capacité des levures à acétyler le ou les précurseurs stéroïdiens présents dans le milieu de culture est fortement réduite, voire éliminée. En particulier, la demanderesse a mis en évidence le fait que les souches possédant l'activité
atf2+
effectuent des réactions d'acétylation plus limitées en conditions oxydatives, notamment par croissance sur des sources de carbone non fermentescibles, telles que par exemple le glycérol ou l'acétate.
Selon une troisième variante, il est également possible d'utiliser des souches de levure présentant, naturellement ou après manipulation génétique, une activité
désacétylase. Cette activité a été décrite comme agissant sur les esters d'alcools à
chaîne courte (rEF). L'utilisation d'un tel système permettrait de désacétyler les produits obtenus par l'activité APAT.
Enfin, il est possible d'utiliser des souches atf2', c'est-à-dire dans lesquelles le gène ne s'exprime pas ou dans lesquelles le produit de ce gène est inactif.
Plus particulièrement, l'homme du métier est capable, par des expériences de routine, de préparer des souches de levure dépourvues de l'activité enzymatique APAT, telles que notamment celles décrites dans Cauet et a 1. ( 1999, Eur. J. Biochem., 261, 317-324) ou dans la demande de brevet français FR2774393 dont les contenus sont incorporés par référence dans la présente demande.
De même, il peut être intéressant de n'induire l'activité du gène atf2 qu'à un certain moment du procédé de l'invention, par exemple séquentiellement à
l'expression du gène Cyp7b. Ainsi, certains promoteurs ont été décrits chez la levure, qui ne sont actifs qu'en présence d'une stimulation extérieure (Guarente et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 7410-7414) ou lorsque les levures sont en phase stationnaire (Panaretou et al., 1992, Eur. J. Biochem., 206, 635-640). L'utilisation d'un gène atf2

6 placé sous contrôle d'un tel promoteur permet par conséquent de contrôler l'activité
APAT chez la levure renfermant un tel gène recombiné.
De la même façon, la présence chez la levure utilisée dans le procédé de l'invention d'une activité endogène similaire à l'activité 17BDH des mammifères (codée par le gène yill24w) mène à la formation de composés réduits qui peuvent apporter une valeur ajoutée par rapport au produit non modifié. Inversement, il peut également être souhaitable de disposer de souches de levure ou des conditions de culture pour lesquelles l'activité du gène yill24w est réduite ou supprimée.
Ainsi, il est possible de faire appel à des conditions de culture en milieu oxydatif ou à
l'utilisation de souches de levures dans lesquelles le gène yill24w a été inactivé.
Bien entendu, selon des cas préférés de l'invention pour lesquels il est intéressant d'obtenir des composés réduits, il est possible de disposer de souches de levure capables de surexprimer le gène yill24w ou d'exprimer l'activité 17BDH
à un moment privilégié de la bioconversion, par exemple par l'utilisation de souches pour lesquelles le gène yill24w est placé sous le contrôle d'un promoteur inductible tel que ceux décrits plus haut.
Il est bien entendu possible de modifier en outre la fonction acétyle obtenue après l'action de l'activité APAT lors du procédé de l'invention mettant en a.uvre une souche de levure atf2+, par exemple en transformant ladite souche de levure afin qu'elle exprime en outre une activité enzymatique réagissant sur ce substrat.
On peut ainsi obtenir des dérivés stéroïdiens méthylés, lorsque le gène en question code pour une enzyme à activité méthylase.
Parmi les substrats précurseurs de stéroïdes utilisables dans la présente invention, il faut citer les stéroïdes ou précurseurs de stéroïdes possédant une position

7- hydroxylable, c'est à dire accessible et susceptible d'être hydroxylée par une enzyme présentant une activité hydroxylase. Des exemples de telles positions hydroxylables consistent notamment en un carbone, un soufre, un azote.
Parmi les substrats précurseurs de stéroïdes utilisables dans la présente invention, il faut citer plus particulièrement les stéroïdes 3-hydroxylés et notamment les stéroïdes 3-(3-hydroxylés, ou possédant une fonction 3-céto.
Plus particulièrement, sans que cette liste ne soit limitative; dans cette invention on considèrera un précurseur sélectionné parmi le groupe consistant en les stéroïdes à
structure de type androstanique, androsténique, prégnanique, prégnénique, cholanique, cholénique, cholestérique, ergostanique, ergostènique, testostéronique ou stigmamique, par exemple la DHEA, la testostérone, la pregnénolone, la prégnanolone, le 25-hydroxy-cholestérol, le 5-a.-androstane-3~3-17(3-diol, ou le 5-a.-androstène-3(3-17(3-diol.
Bien entendu, ces composés peuvent également être obtenus sous forme acétylée. La fonction cétone 17 des précurseurs en possédant une peut aussi subir une réduction, comme cela a été décrit précédemment.
L'invention peut être mise en couvre en utilisant des levures de différents genres qui peuvent être, sans que cette liste ne soit limitative, sélectionnés parmi Candida, Yarrovia, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis, Pichia, Hansenula.
Une réalisation préférée de l'invention mettra en couvre des levures du genre Saccharomyces, par exemple S. cerevisiae.
Les conditions dans lesquelles ces levures peuvent être cultivées sont connues de l'homme du métier, il suffit d'ajouter au milieu de culture un substrat précurseur des stéroïdes souhaités pour mettre en oeuvre le procédé selon la présente invention.
Les exemples proposés ci-dessous montrent que certains milieux sont plus favorables que d'autres à la production de stéroïdes hydroxylés, il s'agit là
d'un paramètre qui peut être aisément optimisé par l'homme du métier.
Parmi les milieux, il faut citer : YPD, YPG, YNBD et YNBG contenant notamment du glycérol et/ou du glucose (voir également Sherman, 1991, Methods Enzymol., 194, 3-21). De même, il est possible d'adapter la composition du milieu en cours de procédé ou de sélectionner le milieu en fonction du promoteur sélectionné
pour diriger l'expression du gène Cyp7b (par exemple, le milieu minimum YNBD
sera choisi dans le cas du promoteur CYC1 et le milieu riche YPG sera sélectionné
dans le cas du promoteur TEF 1 ).
Les conditions additionnelles de culture sont les conditions habituelles mais peuvent être optimisées.
Les quantités de précurseur ajoutées au milieu de culture dans le cadre du procédé de l'invention seront choisies de manière à obtenir une concentration dans le milieu de bioconversion comprise entre 10 et 200 pg/ml, préférentiellement comprise entre 20 et 100 pg/ml.

8 Les levures utilisées dans le cadre de l'invention sont des souches transformées de façon à exprimer le produit du gène Cyp7b. Cela signifie que lesdites souches ont été préalablement modifiées de façon à introduire le gène Cyp7b dans les levures et permettre son expression. Pour ce qui concerne la transformation des levures afin d'exprimer le gène Cyp7b, il est possible introduire ce gène soit dans le génome de la levure, soit de façon à ce qu'il ait une localisation extrachromosomale. A ces effets, on peut utiliser des systèmes de type plasmidique, circulaires ou linéaires.
Parmi les plasmides comportant des origines de réplication de la levure, on peut citer les plasmides dérivés du plasmide 2p, de Saccharomyces, lequel comportera de préférence comme marqueur de sélection, soit un marqueur de sélection de résistance aux antibiotiques, par exemple le gène G418R, soit au moins un marqueur d'auxotrophie tel que URA3, URA3d LEU2. De telles techniques de transformation sont bien décrites dans la littérature et ne présentent pas de difficulté particulière.
Pour ce qui concerne le gène Cyp7b, sa séquence nucléique (Institute for Fermentation Osaka (IFO), code d'accès IFO 2031 ou SEQ ID NO l ) peut être clonée sous le contrôle d'un promoteur de levure tel que CYC1 (Degryse et al. Yeast (1995), 11, pp. 629-640 ), TEF1 (Cotrelle et al., 1985, J. Biol. Chem., 260, 3090-3096) ou TDH3 (Bitter and Egan, 1984, Gene, 32, 263-274) afin de permettre son expression dans les levures transformées.
Le procédé de l'invention comporte en outre une étape selon laquelle les stéroïdes produits sont isolés du milieu. Une telle étape ne constitue pas un élément crucial dudit procédé et peut mettre en oeuvre différentes techniques généralement utilisées dans le domaine de la purification des stéroïdes (chromatographie, HPLC,...).
L'invention concerne, en outre, les nouveaux stéroïdes hydroxylés qui peuvent être ou qui sont obtenus par le procédé décrit précédemment ainsi que leur utilisation dans le cadre d'applications thérapeutique ou prophylactique, notamment à
titre de neurostéroïdes, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal.
Elle concerne également des compositions, notamment pharmaceutiques, refermant de tels nouveaux stéroïdes hydroxylés. Ces compositions pharmaceutiques renferment en outre un ou plusieurs support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Un tel support est préférentiellement isotonique, hypotonique ou faiblement hypertonique et présente une force ionique relativement faible, tel que par

9 PCT/FR00/02753 exemple une solution de sucrose. Par ailleurs, un tel support peut renfermer tout solvant, ou liquide aqueux ou partiellement aqueux tel que de l'eau stérile non pyrogène. Le pH de la formulation est en outre ajusté et tamponné afin de répondre aux exigences d'utilisation in vivo. La formulation peut également inclure un diluant, un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique, de même que des agents de solubilisation, de stabilisation, de préservation. Pour une administration injectable, on préfère une formulation en solution aqueuse, non-aqueuse ou isotonique. Elle peut être présentée en dose unique ou en multidose sous forme liquide ou sèche (poudre, lyophilisât...) susceptible d'être reconstituée de manière extemporanée par un diluant approprié.
Les exemples ci-après permettront de comprendre les méthodes de construction des vecteurs et de transformation des levures mais il s'agit là, pour l'essentiel, de technologies qui sont déjà connues de l'homme du métier. Les vecteurs sont décrits dans Degryse et al. (Yeast (1995), 11, pp. 629-640 ).
II est entendu que les résultats ci dessous ne sont donnés qu' à titre d' exemples.
Ainsi, les taux obtenus, par exemple dans les manipulations de bioconversion, ne sont donnés qu'à titre indicatif, et ne représentent aucunement une revendication de la capacité maximale du système en conditions optimisées.
EXEMPLE 1 : Construction des vecteurs d'expression pour l'ADNc de cyp7b L'ADNc de cyp7b est amplifié en utilisant l'oligo de séquence SEQ ID
N° 1, en introduisant ainsi un site SaII (souligné) et une séquence de 4A avant le codon ATG
et une seconde amorce de séquence SEQ ID N° 2 introduisant un site MIuI
après le codon stop.
Le premier produit de PCR est sous-cloné après une restriction SaII MIuI dans le site SaII MIuI du vecteur équivalent à pTG10164 ( Degryse et al., Yeast (1995), 1 l, pp. 629-640 ). Ceci conduit à un vecteur pTG14010 contenant le gène Cyp7b sous contrôle du promoteur CYC1 (Degryse et al. Yeast (1995), 11, pp. 629-640) dans un environnement 2p, et avec le gène G418R (neo).
Ensuite, le promoteur TEFl (Cotrelle et al., 1985, J. Biol. Chem., 260, 3090-3096) est cloné par échange CIaI SaII, ce qui conduit au vecteur pTG14011, les plasmides correspondants sont décrits dans l'article de Yeast pré- cité.

Par la méthode de recombinaison déjà décrite dans l'article de Yeast, le bloc d'expression NotI contenant le promoteur CYC1 (respectivement, TEF1) a été
introduit dans le plasmide basé sur le 2 micron pTG 10042 (respectivement, pTG10092) contenant le gène URA3d pour donner le plasmide pTG14012 5 (respectivement, pTG14014). Le plasmide pTG14015 a été construit de la même façon que pTG14014, à partir de pTG10220, qui porte le gène URA3, comme gène de sélection.
Le gène URA3d a été choisi parce qu'il conduit à une sélection pour un très grand nombre de copies en milieu minimum. Le gène URA3 produit un nombre moyen

10 de copies, et la pression de sélection est raisonnable en milieu minimum.
Les plasmides pTG14012, pTG14014 et pTG14015 ont été introduits par transformation dans la souche FY1679-28c, les transformants sélectionnés sur un milieu minimal approprié puis stockés.
On trouvera ci-après un résumé des vecteurs d'expression pour cyp7b PLASMIDE PROMOTEUR MARQUEUR DE
SELECTION

pTG 14011 TEF 1 6418 R

pTG14012 CYC 1 URA3d pTG 14014 TEF 1 URA3 d pTG 1401 S TEF 1 URA3 Tous les vecteurs contiennent le réplicon d'E. coli et l'origine de réplication du plasmide 2~ de levure.
Les levures utilisées sont FY1679-28c (Mata ura3-52 trpl - 63 leu2 - 1 his3- 200 GAL fenl), un ségréguant Mata de FY 1679.
TGY202 et TGY206 sont des dérivés TRP 1 obtenus après transformation des souches, respectivement, F1679-28c et TGY186.
Dans TGY156, une partie du gène atfl a été inactivée et remplacée par URA3.
TGY186 est un dérivé de TGY156 dans lequel le gène URA3 au locus atf2 a été
remplacé par TEF1 : :PGK1 sous forme de bloc d'expression.

11 Les souches sont transformées en utilisant la procédure à l'acétate de lithium (Ito, et a1.,1983, J. Bact. 153, 163-168) ou par électroporation (Nacken et al., 1994, Nucleic Acids Res, 22, 1509-10) et sélectionnées sur un milieu solide YNBG
contenant les acides aminés appropriés.
EXEMPLE 2 : BIOCONVERSION
Les cellules sont mises en croissance sur un milieu solide YNBG supplémenté
avec les acides aminés appropriés. Une préculture est effectuée pendant 24 heures à
28°C dans un milieu ayant la même composition que le milieu de culture à tester. Le milieu minimal (YNB et la source de carbone) est supplémenté avec 0,5% de casamino acides (en plus des nutriments nécessaires pour la souche).
Lorsque le milieu de croissance contient du glycérol (2%), le glucose est également présent à 0,1 % pour faire démarrer la culture.
Un aliquote de la préculture est utilisé pour inoculer 10 ml de milieu de culture avec une densité optique à 600 nm de 0,1 et la DHEA est solubilisée dans un mélange tergitol/éthanol 50/50 à 10 mg/ml (ou ajoutée au moment indiqué). A différents intervalles de temps un aliquote de 500 p,1 du milieu de culture est pris et on extrait les stéroïdes afin de les doser.
On ajoute au milieu de culture 4 ml de dichlorométhane, le mélange est passé
au vortex pendant 10 minutes et centrifugé durant 3 minutes à 3 000 tours/minute. La phase organique est séchée sous un flux d'azote à 50°C. On ajoute au résidu 500 u1 de dichlorométhane, l'échantillon est passé au vortex rapidement puis séché comme précédemment. Le résidu est repris dans un mélange isopropanol/eau 90/10 et transféré
dans des tubes à injection qui sont scellés. L'échantillon est analysé par HPLC contre des standards composés de DHEA, 7-hydroxy DHEA et acétyle DHEA. Quelques standards contiennent en plus la 5-androstène-3~i-17(3-diol.
Les différents milieux de culture qui ont été utilisés sont YPG, YNBD (glucose à 2%) et YNBG (glycérol à 2%, glucose à 0,1 %).
Les résultats obtenus sont rassemblés dans les exemples ci-après ;

12 EXEMPLE 3 : Mise en évidence d'une activité intrinsèque 17-déshydro~énase chez la ~a~nwa L'incubation de TGY202 et de l'acétyl-DHEA pendant 49 heures dans le YNBD a permis d'isoler l'acétyl-diol, indiquant une activité déshydrogénase chez la levure.
La caractérisation du produit obtenu a permis de déterminer que cette activité
est similaire à celle de la 17(3-hydroxystéroïde déshydrogénase des mammifères (17BDH) .
EXEMPLE 4 : Identification du gène yill24w codant pour l'activité 17BDH de la levure Saccharomvces cer-evisiae Le gène yi1124w a été amplifié par PCR en utilisant les amorces de séquences SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 4 qui introduisent respectivement des sites de restriction SaII et MIuI. Le produite de l'amplification après restriction par les enzymes SaII et MIuI a été sous-cloné dans le vecteur de levure pTG 10851 pour donner le vecteur pTG14491. le gène yill24w est ainsi sous le contrôle du promoteur de levure TEF1 et du terminateur de levure PGK1. L'origine de réplication est le 2-micron et le marqueur de sélection est le gène de résistance au 6418.
Après transformation de TGY206 par pTG14491, on effectue une bioconversion pendant 24 heures dans le milieu YNBD, en utilisant la DHEA en tant que substrat. Les stéroïdes présents dans le milieu de culture sont analysés DHEA Diol TGY206-pTG 14491 27 52 les valeurs sont exprimées en p.g/ml du stéroïde extrait du milieu de culture Ces résultats confirment l'activité 17BDH du gène yill24w, et montrent que sa surexpression permet de produire des dérivés stéroïdiens réduits.
EXEMPLE 5 : Génération d'un mutant Knock-Outpour le gène yill24w Le plasmide pTG 14491 a été restreint par PstI et NcoI (sites de restriction uniques dans la séquence codante de yill24w) et les bouts cohésifs ont été
rendus francs par l'ADN polymérase de T4. Le gène URA3, est alors cloné dans ce plasmide,

13 afin que la séquence codante de yill24w soit interrompue par ce marqueur de sélection URA3. Le plasmide résultant pTG14584 contient le gène URA3 dans le même sens de traduction que le gène TIL124w. Après restriction de pTG14584 par SaII et MIuI, le fragment libéré contenant yi1124w interrompu par URA3 est introduit dans les souches TGY202 et TGY206, et les colonies recombinantes sont sélectionnées sur YNBD +
LH, la sélection étant pour une prototrophie pour l'uracile. Sont ainsi obtenues respectivement les souches TGY279 et TGY282.
Les souches TGY206 et TGY282 sont incubées en présence de DHEA ou acétyl-DHEA dans le milieu YNBD pendant 24h et les produits obtenus sont mesurés.
Produits DHEA actyl-DHEA Diol actyl-diol Substrat DHEA

Substrat actyl-DHEA

Résultats exprimés en p.g/ml extrait du milieu de culture.
Il apparaît donc clairement que la souche TGY282 n'est plus capable de réduire le DHEA ou l'acétyle-DHEA en resp. diol ou acétyl-diol. Ceci confirme l'inactivation du gène yi1124w, ainsi que de sa fonction 17-déshydrogénase.
Par ailleurs, il est possible d'observer que la levure possède une activité
intrinsèque de désacétylation de l'acétyl-DHEA en DHEA. Ainsi, l'identification du gène responsable et sa sur-expression par rapport à l'activité APAT permettra de produire des stéroïdes sans utiliser des mutants du gène art.
EXEMPLE 6 : Mise en oeuvre du procédé selon la présente invention pour obtenir la 7-~droxy-DHEA à partir de la DHEA, en utilisant la souche TGY202 transformée avec les plasmides d'expression de cyp7b.
La souche TGY202 transformée avec les plasmides pTG 14012, pTG 14014 ou pTG14015 est incubée en présence de DHEA (40pg/ml) dans un milieu YPG, pendant

14 48 heures, et la présence de 7-hydroxy-DHEA (7aH0-DHEA) est évaluée dans le milieu.
Les résultats sont rassemblés au tableau ci-après pTG 14012 4,2 pTG 14014 6,4 pTG 14015 3,1 La présence de 7aH0-DHEA dans le milieu indique que le gène cyp7b est exprimé sous une forme active permettant la bioconversion de la DHEA en 7aH0-DHEA par la levure. Ainsi, tout substrat potentiel de Cyp7b peut être hydroxylé in vivo par une souche de levure exprimant cyp7b.
Par ailleurs, ces résultats indiquent que le promoteur TEFI est plus efficace que CYCI, et que le marqueur de sélection URA3d donne de meilleurs résultats que le marqueur URA3.
EXEMPLE 7 : Augmentation de la production de 7aH0-DHEA par bioconversion par la modulation des conditions de fermentation TGY202-pTG14012 et TGY202-pTG14014 sont incubées dans les milieux YNBD et YNBG pendant 48 heures, en présence de DHEA (40pg/ml) ajoutée au milieu immédiatement après inoculation, ou après 8 heures d'incubation.

Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant (en % de produit accumulé).
DHEA (40pg/ml) ajoute t 0 Milieu YNBD YNBG

pTG 14012 pTG 14014 pTG 14012 pTG 14014 actyl-DHEA 20,1 9,6 65,2 55,8 actyl-diol actyl-triol DHEA 0 0 5,7 1,1 Diol 0 2,9 0 0 7aH0-DHEA 52,3 35,6 25,1 37,2 Triol 27,5 51,9 4,0 5,4 DHEA (40pg/ml) ajoute t 0 +
8 heures actyl-DHEA 3,0 2,0 25,1 0 actyl-diol actyl-triol DHEA 0 0 17,3 3,4 Diol 1,5 0 7,4 0 7aHO-DHEA 40,6 53,1 36,9 81,5 Triol 54,9 44,9 13,3 15,1 un constate ainsi une mtluence du milieu de fermentation et du moment de l'apport du substrat DHEA pour la production sélective de 7aH0-DHEA, une 5 inoculation tardive donnant en général de meilleurs résultats, et le milieu YNBG étant supérieur aux autres milieux .
EXEMPLE 8 : Production préférentielle de 7aH0-DHEA en l'absence de dérivés acétylés par l'utilisation de souches KO pour l'activité APAT
10 TGY206-pTG 14014 est incubée dans du YNBD en présence de DHEA
(100pg/ml) pendant 49 heures.

L'analyse des produits obtenus indique que l'on récupère 100% de 7aH0-DHEA (91,7~.g/ml).
Lorsque le milieu de culture est YNBG, on obtient un mélange de 7aH0-DHEA (89%, 73,8~g/ml), Triol (6%, S~g/ml) et DHEA (5,3%, 4,4~g/ml).
Ces observations indiquent qu'en l'absence d'activité APAT, on évite la production de dérivés acétylés. En revanche, la présence de l'activité
intrinsèque 17BDH mène à une présence contaminante des Diol ou Triol.
EXEMPLE 9 : Production préférentielle du Triol L'incubation de TGY206-pTG14014 en présence de Diol (100~g/ml) pendant 48 heures mène à la production de 26,4 ~g/ml Triol (36%) des produits finaux, 74% de Diol restant) dans le YNBG. L'utilisation de YNBD donne un taux de bioconversion de 100%.
Ces résultats montrent qu'en changeant le milieu de fermentation, on peut canaliser la production de métabolites à partir d'un substrat. En particulier, on peut aisément concevoir que la surexpression du gène yi1124w permet une accumulation rapide et/ou complète de dérivés réduits. En couplant cette surexpression avec celle de cyp7b, on peut ainsi aboutir à une conversion quasi-totale en Triol, à partir de DHEA
comme substrat de départ.
EXEMPLE 10: Production préférentielle de l'acétyl-DHEA par l'utilisation d'une souche de levure KO pour l'activité 17BDH
Les souches TGY202 et TGY279 ont été incubées avec le DHEA pendant 24 heures dans le milieu de culture YPD, et les stéroïdes produits mesurés.
DHEA Ac-DHEA Diol Ac-Diol Résultats exprimés en pourcentage du total des stéroïdes extraits du milieu de culture Il apparaît clairement que la souche TGY279 transforme quasi totalement le DHEA en acétyl-DHEA, en l'absence de l'activité 17BDH.

EXEMPLE 11 : Production exclusive de 7aH0-DHEA~ar l'utilisation de la souche TGY282, KO pour les activités APAT et 17BDH, et exprimant cyp7b Les souches TGY279 et TGY282 sont transformées avec le plasmide pTG14011 et sélectionnées sur YPG + 6418. L'incubation des souches transformées dans le milieu YPD pendant 24 heures, en utilisant le DHEA en tant que substrat, permet de mesurer les taux des stéroïdes produits par ces souches.
DHEA Ac-DHEA Diol Ac-Diol 7aH0-DHEA

TGY279-pTG 140113 49 1 0 47 TGY282-pTG 1401131 0 1 0 68 Késultats expnmés en pourcentage du total des stéroïdes extraits du milieu de culture Bien que la bioconversion ne soit pas allé au bout dans cette expérience, on voit que la souche TGY282-pTG14011 produit exclusivement du 7aH0-DHEA à
partir du DHEA, alors qu'une souche contenant également l'activité APAT
produit, non seulement du 7aH0-DHEA, mais aussi de l'acétyl-DHEA.

LISTE DE SÉQUENCES
<110> TRANSGENE SA
<120> PROCÉDÉ DE PRÉPARATION DE STEROIDES MODIFIES PAR
FERMENTATION DE LEVURES
<130> D18217 <150> FR 99 12410 <151> 1999-10-05 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 35 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: Amorce pour amplifier cyp7b <400> 1 gatcgtcgac aaaaatgtct ggagccacga cccta 35 <210> 2 <211> 25 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: Amorce pour amplifier cyp7b <400> 2 gatcacgcgt tttcagcttc tccaa 25 <210> 3 <211> 36 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: Amorce pour isoler le Bene yi1124w de saccharomyces cerevisiae <400> 3 gactgtcgac aagtatgtcg gagttacagt cacaac 36 <210> 4 <211> 30 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: Amorce WO 01/25469 _ PCT/FR00/02753 pour isoler le gene yi1124w de saccharomyces cerevisiae <400> 4 ctacacgcgt ggtgtacaaa ctatacggaa 30

Claims

REVENDICATIONS

1) Procédé de production de stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés comprenant les étapes selon lesquelles:
~ on cultive des levures sur un milieu comprenant au moins un précurseur de tels stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés, puis ~ on isole les stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés du milieu après bioconversion, ledit procédé étant caractérisé en ce que lesdites levures sont des levures transformées de façon à exprimer le produit du gène Cyp7b.

2) Procédé selon la revendication 1 de production de stéroïde hydroxylé, caractérisé en ce lesdites levures ont une activité APAT faible ou nulle et/ou en ce que l'on cultive lesdites levures dans des conditions oxydatives.

3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit précurseur contient une position 7 susceptible d'être hydroxylée.

4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit précurseur est un stéroïde 3-hydroxylé, de préférence 3 .beta.-hydroxylé, ou possédant une fonction 3-céto.

5) Procédé selon la revendication 1 à 4, caractérisé en ce que ledit précurseur est choisi parmi les stéroïdes à structure de type androstanique, androstènique, prégnanique, prégnènique, cholanique, cholénique, cholestérique, ergostanique, ergostènique, testostéronique ou stigmamique.

6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le précurseur est choisi parmi le groupe consistant en la DHEA, la testostérone, la pregnénolone, la prégnanolone, le 25-hydroxy-cholestérol, le 5-.alpha.-androstane-3.beta.-17.beta.-diol, et le 5-.alpha.-androstène-3.beta.-17.beta.-diol.

7) Procédé selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que l'activité APAT de la levure a été rendue faible ou nulle par inactivation du gène atf2 ou par utilisation d'un mutant atf2-.

8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la levure porte également une activité déshydrogénase.

9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'activité
déshydrogénase est une 17-déshydrogénase qui conduit à un dérivé 17-hydroxylé.

10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'activité 17-déshydrogénase est portée par le gène yill24w.

11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'activité 17-déshydrogénase de la levure a été rendue faible ou nulle, en particulier par inactivation du gène yill24w ou utilisation d'un mutant yill24W.

12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la levure est du genre Saccharomyces.

13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le gène Cyp7b est sous le contrôle d'un promoteur levure choisi parmi CYC1, TEF1 et TDH3.

14) Stéroïde hydroxylé et/ou acétylé caractérisé en ce qu'il peut être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 13.

15) Souche de levure possédant une activité 17-déshydrogénase nulle par inactivation du gène yill24w.

16) Souche de levure transformée avec un plasmide comprenant une cassette d'expression exprimant le gène Cyp7b.

17) Utilisation d'un stéroïde selon la revendication 14, pour la préparation d'un médicament pour le traitement de maladies du système nerveux central.